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ES2802253T3 - Péptido de penetración celular, conjugado que comprende el mismo y composición que comprende el conjugado - Google Patents

Péptido de penetración celular, conjugado que comprende el mismo y composición que comprende el conjugado Download PDF

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ES2802253T3
ES2802253T3 ES13838181T ES13838181T ES2802253T3 ES 2802253 T3 ES2802253 T3 ES 2802253T3 ES 13838181 T ES13838181 T ES 13838181T ES 13838181 T ES13838181 T ES 13838181T ES 2802253 T3 ES2802253 T3 ES 2802253T3
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Sang Jae Kim
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GemVax and Kael Co Ltd
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Abstract

Un conjugado de un péptido vehículo de penetración celular y un principio activo, en el que el péptido vehículo es un péptido que consiste en SEQ ID NO: 48, un péptido compuesto por 30 o menos aminoácidos y que tiene al menos un 80 % de homología con el péptido anteriormente mencionado o un fragmento de uno cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados, en el que el péptido que tiene al menos un 80 % de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de SEQ ID NO: 48 y en el que el principio activo no es una proteína ni un péptido.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptido de penetración celular, conjugado que comprende el mismo y composición que comprende el conjugado
Campo de la invención
La presente invención se refiere a conjugados de un péptido de penetración celular derivados de la enzima telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT) y a principios activos y a composiciones que comprenden el conjugado.
Antecedentes
Aunque las sustancias de bajo peso molecular, ácidos nucleicos, proteínas, nanopartículas, etc., tienen grandes potenciales como sustancias terapéuticas a nivel molecular, sus usos son limitados debido a la incompetencia para penetrar en los tejidos y la membrana celular. El desarrollo de un sistema para suministrar tales sustancias a la célula ha sido el área activa de investigación en las últimas dos décadas. El transporte de las sustancias dentro de la célula ha sido un tema de conversación en un tratamiento de procedimiento molecular. Las sustancias de bajo peso molecular, los ácidos nucleicos o las nanopartículas se transportaron dentro de la célula por varios reactivos, electroporación o choque térmico. Sin embargo, fue difícil encontrar un procedimiento adecuado de suministro de proteínas dentro de la célula sin interrumpir la actividad y la integridad de las proteínas. En la década de 1980, en la investigación realizada sobre el estudio de la capacidad de penetración celular del VIH, se descubrió que la proteína VIH-TAT que consiste en 11 aminoácidos específicos juega un papel importante en un proceso de transporte dentro de la célula. Por lo tanto, en la década de 1990, los estudios sobre cómo encontrar el procedimiento correcto para transportar proteínas dentro de la célula han sido el área intensa de investigación.
Se sabe que un telómero es una secuencia repetitiva de material genético encontrado en los extremos de cromosomas que evita que los cromosomas se dañen o se unan a otros cromosomas. La longitud del telómero se acorta en cada división celular y, después de un determinado número de divisiones celulares, la longitud del telómero se acorta extremadamente en la medida que la célula deja de dividirse y muere. Por otro lado, se sabe que el alargamiento de los telómeros amplía el lapso de vida de una célula. Por ejemplo, las células cancerosas excretan una enzima denominada telomerasa, que evita el acortamiento de los telómeros, dando como resultado de esta manera la proliferación de células cancerosas.
El documento US 2010/003229 A1 describe una variante de la telomerasa transcriptasa inversa humana (S16hTERT) y desvela los 20 aminoácidos N-terminales de hTERT. Los últimos también se desvelan en el N.° de registro de EBI USPOP:AFQ83719.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un conjugado que se conjugan un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición cosmética funcional que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición de alimentación saludable que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un agente de contraste que comprende un conjugado de un principio activo y un péptido de penetración celular.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un conjugado de un péptido vehículo de penetración celular y un principio activo, en el que el péptido vehículo es un péptido que consiste en SEQ ID NO: 48, un péptido que tiene al menos un 80 % de homología con el péptido anteriormente mencionado o un fragmento de uno cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente, en el que el péptido que tiene al menos un 80 % de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de SEQ ID NO: 48 y en el que el principio activo no es una proteína o un péptido.
En una realización, el péptido vehículo consiste en SEQ ID NO: 48.
En una realización, el péptido vehículo y el principio activo están conjugados a través de (a) un enlace covalente, opcionalmente mediado por un enlazador; o (b) un enlace no covalente.
En una realización, el principio activo es un agente de contraste.
En una realización, el agente de contraste se selecciona de un grupo que consiste en agente de contraste radioopaco, agente de contraste paramagnético, agente de contraste superparamagnético y agente de contraste CT.
En una realización, el agente de contraste se basa en hierro, opcionalmente un carboxilato de ferroceno.
La presente invención también se refiere al conjugado para su uso en contrastar una célula, opcionalmente una célula madre.
La presente invención también se refiere a una composición que comprende el conjugado de acuerdo con el primer aspecto, que es una composición farmacéutica, una composición cosmética o una composición de alimentos saludables que comprende un conjugado de un vehículo de penetración celular y un principio activo, en el que el péptido vehículo es un péptido que consiste en SEQ ID NO: 48, un péptido que tiene al menos un 80 % de homología con el péptido anteriormente mencionado o un fragmento de uno cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados, en el que el péptido que tiene al menos un 80 % de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de SEQ iD NO: 48.
La presente invención también se refiere a la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad.
La presente invención también se refiere a la composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neuronal degenerativa o cáncer.
La presente invención también se refiere a un procedimiento para administrar un principio activo en una célula, opcionalmente en mitocondrias dentro de una célula, que comprende administrar el conjugado a una célula in vitro, en el que el péptido vehículo es un péptido que consiste en SEQ ID NO: 48, un péptido que tiene al menos un 80 % de homología con el péptido anteriormente mencionado o un fragmento de uno cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados, en el que el péptido que tiene al menos un 80 % de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de SEQ iD NO: 48 y en el que el péptido vehículo es un péptido de penetración celular que logra la administración del principio activo en la célula.
En una realización de la composición, la composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, o el método de acuerdo con la invención, el péptido vehículo consiste en SEQ ID NO: 48.
En una realización de la composición, la composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, o el método de acuerdo con la invención, el principio activo es (a) al menos uno seleccionado de una proteína, un ácido nucleico, un péptido, un lípido, un glucolípido, un mineral, un azúcar, una nanopartícula, un producto biológico, un agente de contraste, un fármaco y un compuesto químico; (b) una proteína o un péptido: o (c) una citocina, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima terapéutica, un receptor soluble o un ligando.
En una realización de la composición, la composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, o el método de acuerdo con la invención, el péptido vehículo y el principio activo se conjugan a través de (a) un enlace covalente, opcionalmente mediado por un enlazador; o (b) un enlace no covalente.
En una realización de la composición, la composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, o el método de acuerdo con la invención, el principio activo es un agente de contraste.
Aplicabilidad industrial
Los principios activos que son difíciles de transportar dentro de una célula pueden transportarse fácilmente dentro de una célula usando el péptido o el conjugado del péptido y los principios activos, desvelados en la presente invención. Esto significa que la efectividad de los principios activos puede aumentarse y por lo tanto la dosificación puede reducirse. Como resultado, los efectos secundarios debidos a la administración de fármacos pueden minimizarse y puede aumentarse la eficacia del tratamiento. Especialmente, como se administran los fármacos localmente en las mitocondrias, pueden mejorarse las enfermedades o los trastornos relacionados con las mitocondrias y puede aumentarse la eficacia de la profilaxis y el tratamiento de enfermedades. En un caso de cosméticos, con una pequeña cantidad de principios activos, puede crear un efecto excepcional. Al conjugar un péptido con una sustancia de contraste, puede usarse como sustancia de contraste para monitorizar un procedimiento de trasplante celular o células trasplantadas en un tratamiento celular. Especialmente, puede usarse eficazmente como sustancia de contraste para las células madre inyectadas dentro de un cuerpo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 a la Figura 23 representan e ilustran que la captación celular de los números de células de una célula HeLa tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de SEQ: 1 a SEQ ID NO: 156 y se analizó por FACS. Las células de control se trataron solo con FITC.
La Figura 24 a la Figura 43 representan e ilustran que la captación celular de los números de células de una célula Hur7 tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de SEQ: 1 a SEQ ID NO: 156 y se analizó por FACS. Las células de control se trataron solo con FITC.
La Figura 44 a la Figura 58 representan e ilustran que la captación celular de los números de células de una línea celular humana de linfocitos T (Jurkat) tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de SEQ: 1 a SEQ ID NO: 156 y se analizó por FACS. Las células de control se trataron solo con FITC.
La Figura 59 a la Figura 72 representan e ilustran que el resultado de la toxicidad y la viabilidad celular de una célula HeLa tratada después de que FITC se fusionó con el péptido de SEQ: 1 a SEQ ID NO: 156 y se analizó por citometría de flujo (Citometría de flujo). Las células de control se trataron solo con FITC.
Descripción detallada de la invención
Las proteínas, los ácidos nucleicos, los péptidos o los virus, etc. tienen un gran potencial para usarse como sustancias terapéuticas. Sin embargo, sus usos son limitados porque no pueden penetrar en los tejidos y la membrana celular debido a los tamaños del nivel molecular. Aunque, el tamaño de las moléculas es pequeño, no pueden penetrar la bicapa lipídica debido a la estructura o características de las moléculas. Por lo tanto, mediante el uso de electroporación, choque térmico, etc., hubo intentos de transportar proteínas, ácidos nucleicos, péptidos o virus dentro de la célula; fue difícil transferirlos sin dañar la membrana celular ni mantener los estados activos de las moléculas anteriores. Se han realizado muchos estudios ya que la proteína TAT (el activador Trans-Activador de la Transcripción) derivada del VIH (virus de inmunodeficiencia humana) ha demostrado funcionar como péptido penetrador celular que puede transportar enormes sustancias activas dentro de la célula. Específicamente, se han realizado estudios sobre sustancias que pueden transportar moléculas enormes tales como proteínas, ácidos nucleicos, péptidos o virus dentro de la célula sin provocar ninguna toxicidad, a diferencia de la proteína TAT que provoca toxicidad dentro de la célula. Por lo tanto, la presente invención se completó ya que los presentes inventores han descubierto que los péptidos derivados de la telomerasa tienen una efectividad sobresaliente como péptido de penetración celular sin una toxicidad notable.
Los péptidos se desvelan en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 156 mostrados en la Tabla 1 a continuación. La SEQ ID NO: 8 es una secuencia de longitud completa de la proteína de la telomerasa humana. El "nombre" en la Tabla 1 a continuación se usó para la distinción de los péptidos. En una realización específica diferente de la presente divulgación más de un péptido de los péptidos mencionados en SEQ ID NO: 1 a s Eq ID NO: 156 puede comprender un "péptido sintético", un péptido sintetizado de áreas seleccionadas de la telomerasa. En la presente memoria descriptiva, el término "pep" en el presente documento se refiere a un péptido que tiene una cualquiera de las secuencias de aminoácidos entre la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 156 o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos por encima del 80 % de homología con las secuencias anteriormente mencionadas o un fragmento peptídico de los péptidos anteriormente mencionados.
[TABLA 1]
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De acuerdo con la presente divulgación, un polinucleótido puede codificar un péptido que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 156, un péptido que tiene más del 80 % de homología con las secuencias anteriormente mencionadas o un péptido siendo un fragmento de los péptidos anteriormente mencionados. El polinucleótido anteriormente mencionado permite la producción de los péptidos en grandes cantidades. Por ejemplo, el cultivo de vectores que incluyen péptidos que codifican polinucleótidos permite la producción de péptidos en grandes cantidades.
Los péptidos desvelados en el presente documento pueden incluir un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos por encima del 80 %, por encima del 85 %, por encima del 90 %, por encima del 95 %, por encima del 96%, por encima del 97%, por encima del 98% o por encima del 99% de homología. Además, los péptidos desvelados pueden incluir un péptido que comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos entre la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 6 o sus fragmentos y un péptido con más de 1 aminoácido transformado, más de 2 aminoácidos transformados, más de 3 aminoácidos transformados, más de 4 aminoácidos transformados, más de 5 aminoácidos transformados, más de 6 aminoácidos transformados o más de 7 aminoácidos transformados.
En una realización de la presente invención, los cambios en la secuencia de aminoácidos pertenecen a la modificación de las características físicas y químicas del péptido. Por ejemplo, la transformación de aminoácidos puede realizarse mejorando la estabilidad térmica del péptido, alterando la especificidad del sustrato y cambiando el pH óptimo.
El término "aminoácido" en el presente documento incluye no solamente los 22 aminoácidos convencionales que se integran de forma natural en el péptido sino también los isómeros D y los aminoácidos transformados. Por lo tanto, en una realización específica de la presente invención, un péptido en el presente documento incluye un péptido que tiene D-aminoácidos. Por otro lado, un péptido puede incluir aminoácidos no convencionales tales como los que se han modificado post-traduccionalmente. Los ejemplos de modificación post-traduccional incluyen fosforilación, glucosilación, acilación (incluyendo acetilación, miristoilación, palmitoilación), alquilación, carboxilación, hidroxilación, glicación, biotinilación, ubicuitinilación, transformación en propiedades químicas (por ejemplo, desimidación por retirada de p, desamidación) y transformación estructural (por ejemplo formación de puentes disulfuros). Además, se incluyen cambios de aminoácidos y los cambios de aminoácidos se producen debido a una reacción química durante el procedimiento de combinación con reticuladores para la formación de un conjugado peptídico.
Un péptido desvelado en el presente documento puede ser un péptido de tipo silvestre que se ha identificado y aislado de fuentes naturales. Por otro lado, cuando se compara con los fragmentos peptídicos de una cualquiera de entre la secuencia amino SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 156, los péptidos desvelados en el presente documento pueden ser mutantes artificiales que comprenden uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados y/o insertados. La alteración de aminoácidos en el polipéptido de tipo silvestre - no solo en mutantes artificiales - comprende la sustitución conservativa de aminoácidos que no influyen en el plegamiento y o la activación de proteínas. Los ejemplos de sustitución conservativa pertenecen al grupo que consiste en aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparaginas), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina, valina y metionina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina y treonina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica de la presente invención. Las alteraciones más comunes producidas son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly y las alteraciones opuestas. Otro ejemplo de sustituciones conservativas se muestra en la siguiente Tabla 2.
[TABLA 2]
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La transformación sustancial de las propiedades biológicas de los péptidos se realiza seleccionando una sustitución significativamente diferente en las siguientes efectividades: (a) la efectividad en el mantenimiento de la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de sustitución, tales como láminas o estructuras helicoidales tridimensionales, (b) la efectividad en el mantenimiento de la carga eléctrica o la hidrofobicidad de la molécula en el área diana o (c) la efectividad en el mantenimiento de la mayor parte de la cadena lateral. Los restos naturales se dividen en grupos por las propiedades generales de la cadena lateral como las siguientes:
(1) hidrofobicidad: Norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrofilidad neutra: cys, ser, thr;
(3) acidez: asp, glu;
(4) basicidad: asn, gln, his, lys arg;
(5) resto que afecta la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6) aromaticidad: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas pueden realizarse intercambiando un miembro de las clases anteriores por diferentes clases. Cualquier resto de cisteína que no esté relacionado con el mantenimiento de la estructura tridimensional adecuada del péptido puede sustituirse típicamente por serina, aumentando de esta manera la estabilidad oxidativa de la molécula y evitando la reticulación inapropiada. Por el contrario, puede lograrse una mejora de la estabilidad añadiendo enlace o enlaces cisteína al péptido.
Los tipos alterados de variantes de aminoácidos de los péptidos son aquellos que cambiaron el patrón de glucosilación de anticuerpos. El término "cambio" en el presente documento se refiere a la eliminación de al menos un resto de carbohidrato que se encuentra en un péptido y/o la adición de al menos un resto glucosilado que no existe dentro de un péptido.
La glucosilación en péptidos está típicamente conectada a N o conectada a O. La expresión "conectado a N" en el presente documento se refiere a que los restos de carbohidratos están unidos a la cadena lateral de los restos de asparagina. Como secuencias de tripéptidos, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina (en las que la X es cualquier aminoácido excepto prolina) son la secuencia de reconocimiento para unir enzimáticamente el resto de carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Por lo tanto, con la presencia de una de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido, se crean los posibles sitios de glucosilación. "Glucosilación conectada a O" significa unir uno de azúcar N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a aminoácidos de hidroxilo. Los aminoácidos de hidroxilo son más típicamente serina o treonina, pero pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición del sitio de glucosilación a un péptido se realiza convenientemente cambiando la secuencia de aminoácidos para que contenga la secuencia de tripéptidos mencionada anteriormente (para sitios de glucosilación enlazada a N). Estos cambios pueden realizarse mediante la adición de al menos un resto de serina o treonina a la primera secuencia de anticuerpos o mediante sustitución con esos restos (para sitios de glucosilación enlazados a O).
Un péptido que consiste en SEQ ID NO: 48, un fragmento del péptido mencionado anteriormente o un péptido que tiene una homología superior al 80 % con la secuencia mencionada anteriormente, es seguro y tiene una efectividad sobresaliente como péptido de penetración celular. Por lo tanto, el péptido puede conjugarse con un fármaco para transportar el fármaco dentro de la célula.
En una realización de la presente invención, se proporciona un conjugado de un péptido y un principio activo para transportarse, en el que el péptido consiste en s Eq ID NO: 48, el péptido es un fragmento del péptido anteriormente mencionado o el péptido está compuesto por 30 o menos aminoácidos y tiene más de un 80 % de homología con el péptido mencionado anteriormente, en la que el péptido que tiene al menos un 80 % de homología de secuencia y el fragmento retienen la actividad de penetración celular de SEQ ID NO: 48 y en la que el principio activo no es una proteína o un péptido. En una realización de la presente invención, un principio activo puede ser al menos uno seleccionado de ácidos nucleicos, lípidos, glucolípidos, minerales, azúcares, sustancias de contraste, fármacos y compuestos químicos.
Un péptido de penetración celular desvelado en el presente documento significa un péptido que puede transportar carga desde in vitro y/o in vivo hacia el interior de la célula. Una "carga" desvelada en el presente documento comprende todas las sustancias que pueden transportarse dentro de la célula a través de conjugación con un péptido de penetración celular, por ejemplo, todas las sustancias que desean aumentar la efectividad de penetración celular, específicamente fármacos, cosméticos o principios activos de alimentos saludables, más específicamente sustancias que no pueden transportarse dentro de la célula por la vía general, más específicamente, azúcares, nanopartículas, formulación biológica, virus, sustancias de contraste u otros compuestos químicos que pueden tener proteínas, ácidos nucleicos, un péptido, minerales, glucosa como un ejemplo, pero no limitado a esos. Un "fármaco" desvelado en el presente documento es un concepto amplio que incluye una sustancia que se transportará para el alivio, la profilaxis, el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades, heridas o un síntoma específico.
Un "péptido vehículo" desvelado en el presente documento es un péptido que puede transportar principios activos a un sitio diana a través de la conjugación con principios activos.
En una realización de la composición o el procedimiento de la presente invención, la proteína o el péptido como carga comprenden uno o más de hormonas, análogo hormonal, enzima, inhibidores enzimáticos, proteínas (o péptidos) de transferencia de señal, anticuerpo y vacuna, pero no limitado a esos. En una realización de la presente invención, un ácido nucleico es una molécula que pueden ser moléculas de ADN o de ARN espontáneas o artificiales, ya sean monocatenarias o bicatenarias. La molécula de ácido nucleico puede ser una o más ácidos nucleicos del mismo tipo (por ejemplo, que tienen una misma secuencia de nucleótidos) o ácidos nucleicos de diferentes tipos. Las moléculas de ácido nucleico comprenden uno o más ADN, ADNc, ADN señuelo, ARN, ARNip, miARN ARNhp, ARNtp, ARNnop, ARNnp PNA, oligómero antisentido, plásmidos y otros ácidos nucleicos modificados, pero no limitado a esos. En una realización de la presente invención, el virus comprende el virus entero o el núcleo del virus que incluye los ácidos nucleicos del virus. En una realización de la presente invención, una sustancia química es una indicación amplia que comprende una sustancia natural o sintética que puede actuar como un fármaco.
En una realización de la presente invención, el fármaco a administrar dentro de las células por un péptido permeable a células son liposomas, micelas, nanopartículas o puntos cuánticos como una administración de fármacos.
La expresión "sustancia de contraste" desvelada en el presente documento es una indicación amplia que comprende todas las sustancias usadas para contrastar estructuras o fluidos dentro del cuerpo en formaciones de imágenes médicas. Una sustancia de contraste apropiada comprende agente de contraste radioopaco, un agente de contraste paramagnético, un agente de contraste superparamagnético, CT (tomografía computarizada) y otras sustancias de contraste, pero no limitado a esos. Por ejemplo, un agente de contraste radioopaco (para formación de imágenes de rayos X) comprenderá un compuesto de yodo inorgánico y un compuesto de yodo orgánico (por ejemplo, diatrizoato), metales radiopacos y sus sales (por ejemplo, plata, oro, platino, etc.) y otros compuestos radioopacos (por ejemplo, sales de calcio, sales de bario tales como sulfato de bario, tántalo y tántalo oxidado). Una sustancia de contraste paramagnético apropiada (para formación de imágenes de RM) comprende ácido gadolinio dietilen triaminopentaacético (Gd-DTPA) y sus derivados, otro gadolinio, manganeso, hierro, disprosio, cobre, europio, erbio, cromo, complejo de níquel y cobalto, por ejemplo, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N',N",N'"-tetraacético (DOTA), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,-N',N"-triacético (DO3A), ACIDO 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N"-TRIACÉTICO (NOTA), ácido 1,4,8,10-tetraazaciclotetradecano-N,N',N",N"'-tetraacético (TETA), ácido hidroxibenciletilendiamina diacético (HBED). Una sustancia de contraste superparamagnética apropiada (para formación de imágenes de RM) comprende magnetita, óxido de hierro súper paramagnético (SPIO), óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño (USPIO) y óxido de hierro monocristalino. Otras sustancias de contraste apropiadas son agentes de contraste CT yodados, no yodados, iónicos y no iónicos, una sustancia de contraste como etiqueta rotativa o agente eficaz para el diagnóstico.
Otros ejemplos de sustancias de contraste comprenden p-galactosidasa, Proteína Verde Fluorescente, Proteína Cian Fluorescente, luciferasa, pero no limitado a esos, y un gen marcador que codifica proteínas que pueden detectarse fácilmente cuando se expresan dentro de las células. Pueden usarse varios marcadores tales como radionúclidos, harina, enzima, enzima-sustrato, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, ligandos (especialmente hapteno).
En un ejemplo de la presente invención, una sustancia de contraste es el ácido ferrocenocarboxílico de la fórmula química 2 a continuación. La estructura del ferroceno se muestra en la fórmula química 1.
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En un ejemplo de la presente invención, un conjugado de péptido de penetración celular y una sustancia de contraste es Ferrocenocarboxílico-pep (Ferrocenocarboxílico-pep) que se muestra en la fórmula química 3 a continuación.
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En una realización de la presente invención, un péptido o composición puede fusionarse con uno o más marcadores detectables. Los marcadores pueden ser compuestos que pueden detectarse en respuestas químicas, físicas o enzimáticas, o compuestos que generan señales directa o indirectamente en las respuestas. El marcaje y la detección después de eso pueden realizarse de acuerdo con el procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo, Sambrook, J. y Russel, D.W.(2001); y Lottspeich, F. y Zorbas H. (1998) Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlín, Alemania). Los marcadores comprenden marcador fluorescente, marcador enzimático, marcador cromogénico, marcador luminiscente, marcador de radiación, hapteno, biotina, complejo de metal, oro metal y coloidal, pero no limitado a esos. Todas las formas de estos marcadores son bien conocidas en este campo de trabajo, pueden obtenerse comercialmente de diversos proveedores.
En una realización de la presente invención, una carga puede combinarse directamente con el péptido. En otra realización de la presente divulgación, una carga puede combinarse con el péptido a través de diversos tipos de enlaces tales como enlaces covalentes o no covalentes. Una carga, por ejemplo, puede combinarse con el N-terminal o C-terminal del péptido. Por ejemplo, una carga puede estar unida al péptido mediante enlaces disulfuro o enlaces covalentes. Los enlaces covalentes son los enlaces que una carga puede unirse a la a-amina del glutamato N-terminal, o la amina de los restos de lisina C-terminales. Además, un péptido y una carga pueden combinarse mediante un enlace no covalente, que puede tener un péptido o una carga puede encapsular al otro en forma de cápsula.
En otra realización de la presente invención, un péptido puede combinarse con una carga a través de un enlazador. Por ejemplo, un péptido puede combinarse con una carga uniendo una carga a un conector después de introducir un conector tales como el conector Hynic (ácido 6-hidrazinopiridin-3-carboxílico), a la a-amina del glutamato N-terminal, o la amina de los restos de lisina C-terminales.
En otra realización de la presente invención, cuando una carga es ADN o ARN, el grupo SH (grupo tiol) se introduce en el péptido y el grupo maleimida se introduce en el ADN o ARN, después, el grupo SH del péptido y el grupo maleimida de ADN o ARN se combinan, creando así un enlace entre la carga y el péptido.
En otra realización de la composición o el procedimiento de la presente invención, cuando una carga es un péptido o proteína, el ADN que expresa una carga se combina con el ADN que expresa un péptido vehículo, y al expresar esto, una carga y un péptido pueden combinarse como una forma de proteína de fusión. Los ejemplos específicos de combinación por una proteína de fusión son los siguientes: cuando se fabrica el cebador para la producción de proteína de fusión, un nucleótido que codifica un péptido vehículo se une en frente de un nucleótido que expresa una carga y el nucleótido obtenido se inserta en un vector tales como el vector pET usando una enzima de restricción y el nucleótido se expresa mediante transformación en una célula tales como BL-21 (DE3). En este momento, una proteína de fusión debe expresarse eficazmente al tratarla con un agente inductor de la expresión como IPTG (isopropil-1-tio-S-D-galactopiranósido). Después, la proteína de fusión expresada se purifica mediante purificación con etiqueta His y se dializa con PBS y se añade a un kit para concentrarla mediante centrifugación en tal condición durante 5 a 20 minutos a 2.000 a 4.000 rpm.
En una realización de la presente invención, un péptido vehículo se combina con sustancias de tinción, sustancias fluorescentes, específicamente FITC (isotiocianato de fluoresceína) o GFP (proteína fluorescente verde). En una realización de la presente invención, FITC se combina con el grupo amino (NH3+) de lisina en el N-terminal o C-terminal de un péptido vehículo. En el caso de un péptido, en el que la lisina no existe en su extremo, el péptido puede combinarse con FITC a través de un conector que incluye lisina.
El péptido vehículo desvelado en el presente documento que es el péptido que consiste en una SEQ ID NO: 48 o el péptido que tiene más del 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el péptido mencionado anteriormente o un fragmento del péptido mencionado anteriormente, puede combinarse con una carga en una fracción molar de 1:1, pero puede combinarse en una fracción molar distinta de 1:1. Por ejemplo, una fracción molar de CPP y una carga puede ser más de 2:1, específicamente, más de 2:1, más de 3:1, más de 4:1, más de 5:1, más de 6:1, más de 7:1, más de 8:1, más de 9:1 o más de 10:1. Esto significa que numerosas moléculas de péptidos vehículo pueden combinarse con una molécula de carga. Las numerosas moléculas de péptidos vehículo pueden combinarse en serie o en paralelo. "Combinado en serie" significa que un péptido vehículo y una molécula de carga han de combinarse en los aminoácidos terminales. "Combinado en paralelo" significa que han de combinarse en un sitio distinto de los aminoácidos terminales. Por otro lado, la fracción molar de un péptido vehículo y una carga puede ser más de 1:2.
Esto significa que una molécula de péptido vehículo puede combinarse con numerosos números de una molécula de carga. Por ejemplo, una fracción molar de un péptido vehículo y una carga puede ser 1:2, específicamente, más de 1:2, más de 1:3, más de 1:4, más de 1:5, más de 1:6, más de 1:7, más de 1:8, más de 1:9 o más de 1:10.
Puede encontrar fácilmente una vía de movimiento del péptido combinado con isotiocianato de fluoresceína. Por lo tanto, un péptido vehículo en una realización de la presente invención se usará para obtener imágenes celulares o detectar una ruta de suministro de fármacos dentro de una célula.
En una realización de la presente divulgación, se proporciona un uso del péptido como un vehículo de administración de fármacos para transportar más de un principio activo, en el que el péptido comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 156 o el péptido es un fragmento del péptido mencionado anteriormente, o el péptido tiene más del 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el péptido mencionado anteriormente. El uso puede indicar un uso terapéutico o no terapéutico.
En una realización de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento para administrar fármacos dentro de una célula de un sujeto que comprende una etapa de administrar una composición que comprende un fármaco; y el péptido; en el que el péptido comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 156 o el péptido es un fragmento del péptido mencionado anteriormente, o el péptido tiene más del 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el péptido mencionado anteriormente.
En una realización de la presente divulgación, se proporciona un procedimiento para detectar la ruta de administración del fármaco que comprende una etapa de aplicar el péptido y una sustancia de contraste a un sujeto; en el que el péptido comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 156 o el péptido es un fragmento del péptido mencionado anteriormente, o el péptido tiene más del 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el péptido mencionado anteriormente.
En una realización la presente invención permite el conjugado de la invención para su uso en un procedimiento para detectar la ruta de administración del fármaco que comprende una etapa de aplicación del conjugado del péptido y una sustancia de contraste a un sujeto.
En una realización la presente invención permite un kit para la administración de fármacos a una célula de un sujeto que contiene la composición e instrucciones, en el que la composición comprende un conjugado de un péptido de la invención y un fármaco para administración, en el que el péptido comprende una cualquiera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 156 o el péptido es un fragmento del péptido mencionado anteriormente, o el péptido tiene más del 80 % de homología de secuencia de aminoácidos con el péptido mencionado anteriormente, en el que las instrucciones incluyen al menos una dosis de administración, la ruta de administración, la frecuencia de administración y la indicación de la composición.
En otra realización de la presente invención, se proporciona la composición cosmética o alimenticia que comprende un conjugado del péptido y principios activos; en la que el péptido consiste en SEQ ID NO: 48, el péptido está compuesto por 30 o menos aminoácidos y tiene una homología superior al 80 % de la secuencia de aminoácidos con la secuencia mencionada anteriormente o el péptido es un fragmento de los péptidos mencionados anteriormente, en el que el péptido que tiene al menos un 80 % de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de SEQ ID NO: 48.
En una realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, cosmética o alimentaria con una capacidad sobresaliente para transportar principios activos dentro de una célula, que comprende un conjugado del péptido y un principio activo; en el que el péptido consiste en SEQ ID NO: 48, el péptido está compuesto por 30 o menos aminoácidos y tiene una homología superior al 80 % de la secuencia de aminoácidos con la secuencia mencionada anteriormente o el péptido es un fragmento de los péptidos mencionados anteriormente, en el que el péptido que tiene al menos un 80 % de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de SEQ ID NO: 48.
La mitocondria, como un orgánulo central en el metabolismo energético de una célula eucariota, es un primer orgánulo intracelular que se sabe que está relacionado con enfermedades humanas (Luft R, Ikkos D, Palmieri G, Ernster L, Afzelius B: A case of severe hypermetabolism of non thyroid origin with a defect in the maintenance of mitochondrial respiratory control: a correlated clinical, biochemical, and morphological study, J Clin Invest 41: 1776-804, 1962).
Dado que las mitocondrias juegan un papel importante en el control del metabolismo energético de las células y la apoptosis, actúan como una diana principal para diversos fármacos terapéuticos. Además, este orgánulo está implicado en el control de la concentración de calcio dentro de la célula, la cadena respiratoria mitocondrial actúa como un sistema de transporte de electrones que es importante en la producción de energía y provoca la producción de especies reactivas de oxígeno. Como resultado, la función mitocondrial anormal tiene una estrecha relación con enfermedades de adultos tales como la diabetes, cardiomiopatía, infertilidad, ceguera, enfermedades renales/hepáticas y accidente cerebrovascular (Modica-Napolitano k S, Singh KK: April mitochondria as targets for detection and treatment of cancer. Expert Rev Mol Med 11:1-19, 2002). Además, se está sugiriendo que las mutaciones genéticas mitocondriales estén implicadas en el estallido del envejecimiento, enfermedad neuronal degenerativa y cáncer, etc.
El sistema de administración dirigido a las mitocondrias puede proporcionarse de acuerdo con la realización de la presente invención que puede comprender uno cualquiera de los conjugados mencionados anteriormente, en el que el péptido vehículo se mueve localmente hacia las mitocondrias intracelulares y desempeña un papel de administración de los principios activos mencionados a las mitocondrias intracelulares locales, en donde el péptido compuesto por 30 o menos aminoácidos y que tiene más del 80 % de homología de la secuencia de aminoácidos con la secuencia mencionada anteriormente y el fragmento de la misma son los péptidos que mantienen el sistema de suministro dirigido a las mitocondrias, el péptido dirigido a mitocondrias mencionado anteriormente puede ser el péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.
Puede proporcionarse la composición de ajuste de la actividad mitocondrial, en la que la composición comprende un conjugado de un péptido y un péptido transportado para el suministro, en el que el péptido vehículo se mueve localmente hacia las mitocondrias intracelulares y desempeña un papel de administración de los principios activos mencionados a las mitocondrias intracelulares locales, en el que el péptido compuesto por 30 o menos aminoácidos y que tiene más del 80 % de homología de la secuencia de aminoácidos con la secuencia mencionada anteriormente y el fragmento de la misma son los péptidos que mantienen el sistema de suministro dirigido a las mitocondrias, el péptido dirigido a mitocondrias mencionado anteriormente puede ser la composición que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.
La composición de ajuste de la actividad mitocondrial de acuerdo con una realización de la presente invención, en la que la composición para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con las mitocondrias, la prevención, la inhibición del progreso o el alivio de los síntomas como una composición farmacéutica, en la que el principio activo se tratará para una enfermedad o trastorno relacionado con las mitocondrias, la prevención, la inhibición del progreso o el alivio de los síntomas.
Las "enfermedades relacionadas con las mitocondrias" desveladas en el presente documento comprenden enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, MELAS (Encefalomiopatía mitocondrial con acidemia láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares); MERRF (mioclono, epilepsia y miopatía con fibras rojas irregulares; NARP/MILS (debilidad muscular neurogénica, ataxia, retinitis pigmentosa/síndrome de Leigh heredado de la madre); LHON (neuropatía óptica hereditaria de Lebers); KSS (Síndrome de Kearns-Sayre); PMPS (Síndrome de médula ósea-páncreas de Pearson); CPEO (oftalnoplegia externa progresiva crónica); Síndrome de Reye; Síndrome de Alper; Síndrome de deleción de ADNmt múltiple; síndrome de agotamiento de ADNmt; Deficiencia del complejo I; Deficiencia del complejo II (SDH); Deficiencia del complejo III; Deficiencia de citocromo c oxidasa (COX, complejo IV); Deficiencia de complejo V; Deficiencia de translocador de nucleótidos de adenina (ANT); Deficiencia de piruvato deshidrogenasa (p Dh ); Aciduria del ácido etilmalónico con acidemia de ácido láctico; Aciduria de ácido 3-metil glutacónico con acidemia de ácido láctico; epilepsia refractaria que representa una disminución durante la infección; Síndrome de Asperger que representa una disminución durante la infección; Autismo que representa una disminución durante la infección; trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH); Parálisis cerebral que representa una disminución durante la infección; Alexia que representa una disminución durante la infección; Trombocitopenia hereditaria materna; Leucemia; MNGIE (miopatía mitocondrial, neuropatía periférica y autonómica, disfunción gastrointestinal y epilepsia); Síndrome de MARIAHS (ataxia mitocondrial, infección recrudescente, afasia, hipouricemia/hipomielinización, convulsiones y aciduria de ácido dicarboxílico); Distonía ND6; Síndrome de vómitos cíclicos que representa una disminución durante la infección; Aciduria de ácido 3-hidroxiisobutírico que tiene acidemia de ácido láctico; Diabetes con acidemia de ácido láctico; Síndrome neural reactivo de uridina (URNS); Necrosis del estriado bilateral familiar (FBSN); Pérdida auditiva relacionada con aminoglucósidos; Miocardiopatía relajada; Linfoma de bazo; Síndrome de Wolframs; Síndrome de deleciones de ADN de mitocondrias múltiples; y Síndrome de acidosis tubular renal/diabetes/ataxia, pero no limitado a esos.
Se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos mencionados anteriormente. Las moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, tienen secuencias de bases de GAA GCG CGC CCG GCG CTG CTG ACC AGC CGC CTG CGC TTT ATT Cc G AAA (SECUENCIA NO: 181). Los ácidos nucleicos pueden introducirse en la célula hospedadora de acuerdo con un procedimiento conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, los procedimientos conocidos pueden ser el procedimiento de transformación por el procedimiento de fosfato de calcio, liposoma, electroporación, poniendo en contacto un virus y una célula o microinyección directamente en la célula, etc. La célula hospedadora es una célula eucariota superior, por ejemplo, células de mamífero, o células eucariotas inferiores, tales como una célula de levadura, o células procariotas, tales como una célula bacteriana. Las células hospedadoras procariotas apropiadas para la transformación pueden ser las especies que pertenecen a E. coli, Bacillus subtillis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces y especies de microbacterias, como ejemplos.
El vector que incluye las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente es generalmente un vector de expresión recombinante y comprende, el origen de replicación que permite una transformación de la célula hospedadora y un marcador seleccionable (por ejemplo, dihidrofolato reductasa para el cultivo de células eucariotas o tolerancia a neomicina, tolerancia a tetraciclina o a ampicilina en E. coli o el gen TRP1 de S.cerevisiae) y el promotor para controlar la transcripción de secuencias de recubrimiento de proteínas. Los vectores de expresión disponibles son, por ejemplo, plásmidos bacterianos conocidos tales como SV40, derivados de pcDNA y plásmidos bacterianos conocidos tales como colE1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith, y col., Gene 67:31-40(1988)), plásmidos tales como pMB9 y su derivado RP4, ADN de fago que es lo mismo que numerosos derivados del fago I tales como NM989, ADN de fago tales como M13 y ADN de fago monocatenario de tipo filamento; plásmido de levadura, por ejemplo, ADN o vector de fago inducido a partir de una combinación de plásmido modificado para usar secuencias de supresión de expresión y ADN de fago. Los vectores de expresión de mamíferos comprenden el origen de replicación, un promotor apropiado y un potenciador. Además, pueden comprender sitios obligatorios de unión a ribosomas, sitios de poliadenilación, donador de empalme y parte del receptor, secuencias de terminación de la transcripción y secuencias no transcripcionales de entablado 5'. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender un promotor inducible, por ejemplo, un vector que contiene el promotor de dihidrofolato reductasa, cualquier vector de expresión que contenga casete de expresión DHFR o vector de coamplificación DHFR/metotrexato tales como pED (Randal J, kaufman, 1991, Randal J. Kaufman, Current Protocols in Molycular Biology, 16, 12(1991)). O, el vector de co-amplificación de glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, por ejemplo, pEE14 (Celltech), Virus Epstein-Barr (VEB) o un vector que dirige la expresión episómica bajo el control del antígeno nuclear (EBNA), por ejemplo, pueden usarse pREP4 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMEP4 (Invitrogen), pREP8 (Invitrogen), pREP9 (Invitrogen) y pEBVHis (Invitrogen). Los vectores de expresión de mamíferos seleccionables son Rc/CMV (Invitrogen) y pRc/RSV (Invitrogen), etc. Los vectores de expresión de mamíferos del virus vacuna que pueden usarse en la presente invención son pSC11, pMJ601, pTKgptF1S, etc.
El sistema de vector de expresión de levadura que se usará es el vector pYES2 sin fusión (Invitrogen), pYESHisA, B, C de fusión (Invitrogen), vector pRS, etc.
Los vectores mencionados anteriormente pueden introducirse en diversas células, tales como células de mamíferos que son especialmente las células derivadas de humanos, o bacterias, levaduras, hongos, insectos, nematodos y células vegetales. Los ejemplos de células apropiadas son células VERO, células HeLa, por ejemplo, N.° de ATCC CCL2, línea celular Ch O, por ejemplo, N.° de a Tc C CCL61, células COS, por ejemplo célula Co S-7 y célula N.° de ATCC CRL 1650, W138, BHK, HepG2, 3T3, por ejemplo, N.° de ATCC CRL6361, A549, PC12, célula K562, célula 293, célula Sf9, por ejemplo, N.° de ATCC CRL1711 y célula Cv1, tales como N.° de ATCC CCL70, etc.
Otras células apropiadas para su uso son cepas de células hospedadoras procariotas, por ejemplo, las cepas pertenecientes a E. coli (por ejemplo, cepa DH5-a), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.
En una realización de la presente invención, la composición puede contener 0,1 jg/mg a 1 mg/mg, específicamente 1 |jg/mg a 0,5 mg/mg, más específicamente 10 jg/mg a 0,1 mg/mg del péptido. Cuando el péptido está contenido en el intervalo mencionado anteriormente, toda la seguridad y estabilidad de la composición puede satisfacerse y ser apropiada en términos de rentabilidad.
En una realización de la presente invención, la composición puede tener aplicación con todos los animales incluyendo humano, perro, pollo, cerdo, vaca, oveja, cobaya y mono.
En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica puede administrarse a través de vía oral, rectal, transdérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, en la médula ósea, por medios epidurales o subcutáneos.
Las formas de administración oral pueden ser, pero no se limitan a, comprimidos, píldoras, cápsulas blandas o duras, gránulos, polvos, solución o emulsión. Las formas de administración no oral pueden ser, pero no se limitan a, inyecciones, goteos, lociones, pomadas, geles, cremas, suspensiones, emulsiones, supositorio, parche o pulverizador.
En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica, si es necesario, puede contener aditivos, tales como diluyentes, excipientes, lubricantes, aglutinantes, disgregantes, tampones, dispersantes, tensioactivos, agentes colorantes, aromáticos o edulcorantes. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica puede fabricarse por procedimientos convencionales de la industria en la técnica.
En una realización de la presente invención, el principio activo de la composición médica puede variar de acuerdo con la edad del paciente, el sexo, el peso, la patología y el estado, la vía de administración o el juicio del prescriptor. La dosificación basada en estos factores se determina dentro de los niveles de los expertos en la materia y la dosis diaria, por ejemplo, puede ser, pero no se limita a, 0,1 jg/kg/día a 1 g/kg/día, específicamente 1 jg/kg/día a 10 mg/kg/día, más específicamente 10 jg/kg/día a 1 mg/kg/día, más específicamente los 50 jg/kg/día a 100 jg/kg/día. En una realización de la presente invención, la composición farmacéutica puede administrarse, pero no se limita a, 1 a 3 veces al día.
En una realización de la presente invención, la composición cosmética puede proporcionarse en todas las formas apropiadas para aplicaciones tópicas. Por ejemplo, las formas pueden proporcionarse como soluciones, emulsiones obtenidas por dispersión de fase oleaginosa en agua, emulsión obtenida por dispersión de agua en fase oleaginosa, suspensión, sólido, gel, polvo, pasta, espuma o aerosol. Estas formas pueden fabricarse por procedimientos convencionales de la industria en la técnica.
En una realización de la presente invención, la composición cosmética puede incluir, dentro de niveles que no dañarán el efecto principal, otros ingredientes que pueden aumentar deseablemente el efecto principal. En una realización de la presente invención, la composición cosmética puede incluir adicionalmente humectante, agentes emolientes, tensioactivos, absorbentes de UV, conservantes, fungicidas, antioxidantes, agente de ajuste de pH, pigmentos orgánicos o inorgánicos, aromáticos, agente refrigerante o antitranspirante. Los expertos en la materia pueden decidir la proporción de formulación de los ingredientes mencionados anteriormente dentro de niveles que no perjudiquen el fin y los efectos de la presente invención, y la proporción de formulación basada en el peso total de la composición cosmética puede ser del 0,01 al 5 % en peso, específicamente del 0,01 al 3 % en peso.
En una realización de la presente invención, la composición alimentaria no se limita a las formas, pero por ejemplo pueden ser gránulos, polvo, formas líquidas y sólidas. Cada forma puede formarse con ingredientes comúnmente usados en la industria elegidos apropiadamente por los expertos en la materia, además del principio activo, y puede aumentar el efecto con otros ingredientes.
La decisión de dosificación sobre el principio activo mencionado anteriormente está dentro del nivel de los expertos en la materia y la dosificación diaria por ejemplo puede ser de 1 pg/kg/día a 10 mg/kg/día, más específicamente 10 pg/kg/día a 1 mg/kg/día, más específicamente 50 pg/kg/día a 100 pg/kg/día, pero no se limita a estos números y puede variar de acuerdo con la edad, el estado de salud, complicaciones y otros diversos factores.
Los términos usados en el presente documento pretenden usarse para describir las realizaciones, no para limitar la presente invención. Los términos sin números delante no son para limitar la cantidad, sino para mostrar que puede haber más de una cosa del término usado. Las expresiones "que incluye", "que tiene" y "que comprende" se interpretarán abiertamente (es decir, "incluyendo pero no limitado a").
Se usa la mención del intervalo de números en lugar de indicar números separados dentro del intervalo, así que a menos que se indique explícitamente, cada número puede leerse como números separados integrados en el presente documento. Los valores finales de todos los intervalos se incluyen en el intervalo y pueden combinarse de forma independiente.
A menos que se indique lo contrario o se contradiga claramente en contexto, todos los procedimientos mencionados en el presente documento pueden realizarse en el orden apropiado. El uso de una realización cualquiera y todas las realizaciones o lenguaje ejemplar (por ejemplo, que usa "como ~"), a menos que esté incluido en las reivindicaciones, se usa para describir más claramente la presente invención, no para limitar el ámbito de la presente invención. Cualquier lenguaje en el presente documento fuera de las reivindicaciones no debe interpretarse como una necesidad de la presente invención. A menos que se defina de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen un significado normalmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.
Las realizaciones preferidas de la presente invención son el mejor modo conocido por los inventores para realizar la presente invención. Puede resultar claro para los expertos en la materia después de leer las declaraciones antes de las variaciones en las realizaciones preferidas. Los presentes inventores esperan que aquellos expertos en la materia puedan usar las variaciones adecuadamente y que la presente invención se lleve a cabo de otras maneras distintas a las listadas en el presente documento. Por lo tanto, la presente invención, según lo permitido por la ley de patentes, incluye equivalentes y variaciones de los mismos, de los puntos clave de la invención establecidos en las reivindicaciones adjuntas. Además, todas las variaciones posibles dentro de cualquier combinación de los componentes anteriormente mencionados se incluyen en la presente invención, salvo que se indique explícitamente de otra manera o contradiciendo el contexto.
Ejemplo 1: Síntesis de péptido
Los péptidos de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 156 se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento existente de síntesis de péptidos en fase sólida. En detalle, los péptidos se sintetizaron acoplando cada aminoácido del C-terminal a través de la síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc, SPPS, usando ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon ROK). Los péptidos con su primer aminoácido en el C-terminal uniéndose a la resina se usaron de la siguiente manera:
Resina NH2-Lys(Boc)-2-cloro-tritilo
Resina NH2-Ala-2-cloro-tritilo
Resina NH2-Arg(Pbf)-2-cloro-tritilo
Todos los materiales de aminoácidos para sintetizar el péptido estaban protegidos por Fmoc en el N-terminal y los restos de aminoácidos estaban protegidos por Trt, Boc, t-Bu (t-butiléster), Pbf (2,2,4,6,7-pentametil dihidro-benzofuran-5-sulfonilo) que pueden disolverse en ácido. Tales como:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, ácido Trt-Mercaptoacético.
HBTU[2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetametilaminio hexafluorofosfato]/HOBt [N-hidroxibenzotriazol]/NMM[4-metilmorfolina] se usaron como reactivos de acoplamiento. En el 20 % de DMF, se usó piperidina para retirar Fmoc. Para retirar la protección del resto o para separar el péptido sintetizado de la resina, se usó cóctel de escisión [TFA (ácido trifluoroacético)/TIS (triisopropilsilano)/EDT (etanoditiol)/H2O = 92,5/2,5/2,5/2,5].
Los péptidos se sintetizaron usando el armazón de fase sólida añadiendo cada aminoácido con los procedimientos secuenciales como sigue; protección de aminoácidos, reacción de acoplamiento, lavado y desprotección. Después de cortar el péptido sintetizado de la resina, se purificó por HPLC y se verificó la síntesis por MS y después se secó por congelación.
El procedimiento de síntesis de péptidos específico se describe mediante lo siguiente con el ejemplo de Pep1 de SEQ ID NO: 164 (EARPALLTSRLRFIPK):
1) Acoplamiento
El aminoácido (8 equivalentes) protegido con Resina NH2-Lys(Boc)-2-cloro-tritilo se fundió en el agente de acoplamiento HBTU (8 equiv.)/HOBt (8 equiv.)/NMM (16 equiv.) y tras la adición de DMF, la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.
2) Desprotección de Fmoc
Después de la adición de piperidina al 20 % en DMF, la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos 2 veces, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.
3) Fabricar el marco básico del péptido repitiendo las reacciones 1 y 2 repetidamente.
4) Escisión: Añadir el Cóctel de Escisión al péptido completamente sintetizado y separar el péptido de la resina.
5) Añadir éter dietílico pre-enfriado a la mezcla y después centrifugar la mezcla de reacción para precipitar los péptidos.
6) Después de la purificación por Prep-HPLC, comprobar el peso molecular por CL/EM y liofilizar para obtener los péptidos en forma de polvo.
Ejemplo 2: Preparación de conjugado pep(CPP)-FITC
(1) Preparación del conjugado FITC-CPP
Un conjugado de los péptidos con SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 156 combinado con FITC se fabricó como sigue, por ejemplo, un conjugado de pep1 (SEQ ID NO: 157) y FITC, en otras palabras, se fabricó FITC-enlazador-pep1 como sigue.
El marco básico del péptido, (Resina NH2-enlazador-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-cloro-Tritilo) que se obtuvo de acuerdo con los procedimientos de fabricación descritos en el Ejemplo 1, se hizo reaccionar con FITC. Específicamente, FITC (fluoresceína-5-isotiocianato) (8 equivalentes) y DIPEA (N, N-diisopropiletilamina) (16 equivalentes) se fundieron en DMF. Se añadió la solución de DMF y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF. Como resultado, se obtuvo la resina FITC-enlazador-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-clorotritilo. El enlazador en el presente documento es ácido 6-aminohexanoico, Ahx. Se añadió TFA/TIS/H2O = 95/2,5/2,5 al péptido fabricado sobre la resina y el conjugado se separó de la resina. Se añadió un éter dietílico pre-enfriado a la mezcla obtenida y se usó centrifugación para precipitar los conjugados peptídicos. Después de la purificación por Prep-HPLC, la pureza se confirmó con la HPLC analítica y el peso molecular se determinó por CL/EM. El péptido sintetizado como se describió anteriormente se verificó como FITC-pep1 mediante la confirmación del peso molecular por CL/EM. Después los conjugados se liofilizaron. SEQ ID NO: 1 a s Eq ID NO: 156 de péptidos fusionados FITC con conjugado también se prepararon de la misma manera que pep 1 de SEQ ID NO: 157.
(2) Preparación de un conjugado CPP-FITC
El marco básico del péptido, (Resina NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-cloro-Tritilo) se generó de acuerdo con los procedimientos de fabricación descritos en el Ejemplo 2 1. (1). Para introducir selectivamente FITC al C-terminal del péptido, el N-terminal del péptido estaba protegido de Boc. Después, el di-ferc-dicarbonato de butilo (30 equivalentes) y DIPEA (30 equivalentes) se fundieron en DMF. La solución de DMF se añadió al péptido y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas y el péptido se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF. Como resultado, se obtuvo la resina Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Dde)-2-cloro-tritilo. Se usó hidrazina en 2 % de DMF para retirar Dde, que es el grupo protector del resto Lys C-terminal para añadir FITC al C-terminal de Lys. Después, FITC (8 equivalentes) y DIPEA (16 equivalentes) se fundieron en DMF que se añadió a la mezcla de reacción peptídica y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas, después se lavó secuencialmente con DMF, MeOH, DMF. Como resultado, se obtuvo la resina Boc-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(FITC)-2-cloro-tritilo. Se añadió TFA/TIS/H2O = 95/2,5/2,5 para separar el péptido de la resina. Se añadió éter dietílico preenfriado a la mezcla, y se usó centrifugación para precipitar los péptidos. Después de la purificación por Prep-HPLC, La pureza se confirmó con la HPLC analítica y el peso molecular se confirmó con CL/e M. Las sustancias obtenidas se verificaron como pep1-FITC mediante la confirmación del peso molecular por CL/EM. Después los conjugados se liofilizaron. SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 156 de conjugados péptido-FITC también se prepararon de la misma manera que pep1-FITC descrito anteriormente.
Ejemplo 3: Penetración celular experimental del conjugado pep(CPP)-FITC
(1) Penetración celular experimental de la línea celular HeLa
Cultivo celular
La línea celular de adenocarcinoma de cuello uterino de Homo sapiens como líneas celulares HeLa se adquirieron de ATCC (American Type Cell Culture). Las células se cultivaron en MEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen, EE.UU.), sales de Earle, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico y 100 pg/ml de penicilina y 10 unidades/ml de estreptomicina y se cultivaron a 37 °C, en una incubadora de CO2 al 5 %.
Análisis de citometría de flujo y microscopía confocal de penetración celular
La citometría de flujo y el análisis de microscopio confocal se realizaron para comparar el grado de captación celular de las células que se trataron con la SEQ ID NO: 1 con la SEQ ID NO: 156, pep (CPP) y control.
La línea celular se dividió en una placa de 6 pocillos y se cultivó en un medio que contenía suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen, EE.UU.), 100 pg/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina a 37 °C, incubadora al 5 % de CO2 durante 12 horas. Después de lavar la línea celular con PBS, se indujeron ayunas en Medio Esencial Mínimo durante una hora. Se trataron 20 uM de cada péptido vehículo y se cultivaron a 37 °C durante una hora. Después de repetir la etapa de lavar las células con PBS tres veces, se trató con tripsina-EDTA durante 10 minutos a 37 °C para separar el péptido vehículo en el exterior de la célula. Las células se recogieron con PBS refrigerado y se realizó una centrifugación para repetir la etapa de lavar las células tres veces. Después de eso, las células se suspendieron en 0,5 ml de PBS que contenía 4 % de paraformaldehído y se analizó la fluorescencia de las células usando FACS Calibur (Becton Dickinson). Se comparó el aspecto de la captación celular del control y diversos péptidos combinados con FITC y se analizó por IFM (Intensidad de fluorescencia media).
Los resultados son como se muestra en las Figuras 1 a 23. Los resultados del análisis mostrado en la Figura 1 a la Figura 23 se dan con detalle en la Tabla 3 a continuación.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de un péptido vehículo de penetración celular y un principio activo,
en el que el péptido vehículo es un péptido que consiste en SEQ ID NO: 48,
un péptido compuesto por 30 o menos aminoácidos y que tiene al menos un 80 % de homología con el péptido anteriormente mencionado o un fragmento de uno cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados, en el que el péptido que tiene al menos un 80 % de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de SEQ ID NO: 48 y
en el que el principio activo no es una proteína ni un péptido.
2. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido vehículo consiste en SEQ ID NO: 48.
3. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido vehículo y el principio activo están conjugados a través de
a) un enlace covalente, opcionalmente mediado por un enlazador; o
b) un enlace no covalente.
4. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el principio activo es un agente de contraste.
5. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el agente de contraste se selecciona del grupo que consiste en agente de contraste radioopaco, agente de contraste paramagnético, agente de contraste superparamagnético y agente de contraste CT.
6. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el agente de contraste se basa en hierro, opcionalmente un carboxilato de ferroceno.
7. El conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para su uso en el contraste de una célula, opcionalmente una célula madre.
8. Una composición que es una composición farmacéutica, una composición cosmética o una composición de alimentos saludables, comprendiendo la composición un conjugado de un vehículo de penetración celular y un principio activo, en el que el péptido vehículo es un péptido que consiste en SEQ ID NO: 48,
un péptido compuesto por 30 o menos aminoácidos y que tiene al menos un 80 % de homología con el péptido anteriormente mencionado o un fragmento de uno cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados, en el que el péptido que tiene al menos un 80 % de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de SEQ ID NO: 48.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad.
10. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la enfermedad es una enfermedad neuronal degenerativa o cáncer.
11. Un procedimiento para administrar un principio activo en una célula, opcionalmente en mitocondrias dentro de una célula, que comprende administrar a una célula in vitro un conjugado de un péptido vehículo de penetración celular y el principio activo,
en el que el péptido vehículo es un péptido que consiste en SEQ ID NO: 48,
un péptido compuesto por 30 o menos aminoácidos y que tiene al menos un 80 % de homología con el péptido anteriormente mencionado o un fragmento de uno cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados, en el que el péptido que tiene al menos un 80 % de homología y el fragmento retienen la capacidad de penetración celular de SEQ ID NO: 48 y
en el que el péptido vehículo es un péptido de penetración celular que logra la administración del principio activo en la célula.
12. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10 o el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en los que el péptido vehículo consiste en SEQ ID NO: 48.
13. La composición de acuerdo con la reivindicación 8 o 12; la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 9, 10 o 12; o el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en los que el principio activo es
a) al menos uno seleccionado de una proteína, un ácido nucleico, un péptido, un lípido, un glucolípido, un mineral, un azúcar, una nanopartícula, un producto biológico, un agente de contraste, un fármaco y un compuesto químico; b) una proteína o un péptido; o
c) una citocina, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una enzima terapéutica, un receptor soluble o un ligando.
14. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, 12 o 13; la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 9, 10, 12 o 13; o el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, 12 o 13, en los que el péptido vehículo y el principio activo se conjugan a través de
a) un enlace covalente, opcionalmente mediado por un enlazador; o
b) un enlace no covalente.
15. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, 12, 13 o 14; la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 9, 10, 12, 13 o 14; o el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, 12, 13 o 14, en los que el principio activo es un agente de contraste.
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