CN1662818A

CN1662818A - 使用磺酸化合物和硝基化合物的测定方法

Info

Publication number: CN1662818A
Application number: CN03813822.0A
Authority: CN
Inventors: 米原聪; 石丸香; 平井香
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2002-06-14
Filing date: 2003-04-28
Publication date: 2005-08-31
Anticipated expiration: 2023-04-28
Also published as: US7354732B2; JPWO2003107011A1; AU2003235974A1; CN100394187C; ATE445844T1; JP4061366B2; WO2003107011A1; EP1515144B1; EP1515144A4; EP1515144A1; DE60329679D1; EP1515144B2; US20050221415A1

Abstract

本发明提供了一种通过使用氧化还原反应测量样品中分析物的方法，其给出非常可靠的值。在氧化还原反应前，在样品中加入磺酸化合物和硝基化合物中的至少一种以消除样品中所含有的作为还原性物质的血红蛋白和任何血红蛋白的降解产物的影响。随后，产生衍生自分析物的还原性或氧化性物质，其量通过氧化还原反应进行测量。分析物的量由该测量值而确定。磺酸化合物可以是十二烷基硫酸钠，而硝基化合物可以是4－硝基苯酚等。

Description

使用磺酸化合物和硝基化合物的测定方法

技术领域

本发明涉及一种通过使用氧化还原反应测定样品中分析物的方法。

背景技术

在传统上，使用氧化还原反应测定样品中分析物的量具有广泛的应用。例如，这种测定方法已经应用在生化分析、临床检查等用来测定糖化蛋白(glycated proteins)。

例如，血液中的糖化蛋白，特别是红细胞中的糖化血红蛋白是糖尿病的诊断、治疗等的重要指标，因为它们反映了病人血糖水平的过去史。这种红细胞中的糖化蛋白可以用上述的氧化还原反应检测，例如以下述的方式。

首先，使红细胞溶血以准备样品。用果糖基氨基酸氧化酶(在文中以FAOD表示)处理溶血的样品，以使得FAOD作用于糖化蛋白的糖化部分，由此产生过氧化氢。过氧化氢形成的量与糖化蛋白的量相对应。然后，过氧化物酶(在文中以POD表示)和通过氧化而显色的底物(发色的底物)进一步加入到样品中，以使得氧化还原反应在过氧化氢和显色底物之间发生，其中POD作为催化剂。在此时，由于底物在被氧化时显色，过氧化氢的量可以通过测定显色程度来测定。作为结果，红细胞中糖化蛋白的量得以测定。

然而，在血液中通常存在有各种各样的还原性物质(reducingsubstance)如抗坏血酸(AsA)和胆红素。而且，各种各样的还原性物质如谷胱甘肽(GSH)在红细胞中存在。这些还原性物质可以例如减少过氧化氢；可以抑制氧化还原反应；或可以减少显色后的还原剂，这可以导致颜色的降解。因此存在一个问题，即在红细胞中精确测定糖化蛋白的量是很困难的。

同时存在另一个问题，即测定的准确度可以退化，因为在每个样品中所含的还原性物质的浓度不是恒定的。

为避免这些问题，例如，在样品中加入各种氧化剂(oxidizing agent)。例如，JP 56(1981)-151358 A公开了一种使用卤素氧化物例如碘酸或高碘酸作为氧化剂。JP 57(1982)-13357 A，JP 57(1982)-161650 A，JP 59(1984)-193354 A，JP 62(1987)-169053 A和JP 3(1991)-30697 A也公开了使用钴、铁、铈等的金属络合物作为氧化剂的方法。

发明内容

然而，在这些传统的方法中，测定的准确度有时不会根据样品显著地提高。同时，正如先前提到的，因为血液中的糖化蛋白是糖尿病的诊断、治疗等的重要指标，所以期望使用氧化还原反应测定它的方法能够达到一个准确度更高的测定水平。

因此，本发明的目的是提供一种高度可靠的通过使用氧化还原反应测定样品中分析物的方法。

为达到上述的目的，本发明的测定方法是一种通过使用氧化还原反应测定含有血红蛋白或血红蛋白降解产物的样品中的分析物的方法，包括向样品中加入磺酸化合物和硝基化合物中的至少一种，以消除样品中所含有的血红蛋白或血红蛋白降解产物的影响。

本发明的发明人发现(i)如上所述的传统方法只是消除了低分子量还原性物质如AsA和GSH的影响，但不能消除高分子量还原性物质如蛋白质等的影响；(ii)用四唑化合物处理样品不仅能消除低分子量还原性物质的影响，而且能消除高分子量还原性物质的影响，特别是作为氧化还原底物的血红蛋白和血红蛋白降解产物的影响(下文中，两者一起总称为“血红蛋白”)。根据这些发现，申请人递交了另一份申请。然而，由于上述提及的四唑化合物的溶解度很低，因此很难使其对应于样品中含有的高浓度的血红蛋白。因为四唑化合物本身是氧化性的，就存在一个问题，即当其作用于底物时，可以通过氧化反应显色，因此产生错误的显色。在这种情况下，本发明的发明人设计了敏锐的研究，用来在不影响测定系统的情况下消除血红蛋白的影响。结果是，发明人发现通过用磺酸化合物和硝基化合物处理样品，可以在不影响测定系统的情况下防止血红蛋白的影响，由此产生了本发明。通过本发明的这样一种测定方法，进行更为精确的测定方法是可能的，这对于上述临床医学中的各种测定很有用。

实行本发明的最好模式

如上所述，根据本发明的测定方法是通过氧化还原反应用来测定样品中分析物的方法，包括向样品中加入磺酸化合物和硝基化合物中的至少一种，由此降低测定系统中的样品所包含的血红蛋白的影响。

更特别的，优选的是在氧化还原反应之前，加入所述磺酸化合物和硝基化合物中的至少一种，以减少样品中血红蛋白和血红蛋白降解产物的影响，其后，该方法进一步包括形成衍生自分析物的氧化性物质(oxidizing substance)或还原性物质；通过氧化还原反应测量所形成的衍生自分析物的物质的量；以及由代表所形成物质的量的测量数值来确定所述分析物的量。

在本发明中，所加入的用于消除血红蛋白影响的物质可以是如磺酸化合物或硝基化合物的其中一种。但是，更优选的是两种化合物都加到样品中，因为这样可以进一步清除影响。当磺酸化合物和硝基化合物两者均加入时，它们不需要以特别的顺序加入，可以在同一时间或不同时期加入。

在本发明中，磺酸化合物可以是例如，由如下通式所代表的化合物：R-SO₃X。

在上述通式中，X例如是Na，K，Li，H等，R优选是疏水基团，例如，CH₃(CH₂)n-，CH₃(CH₂)n-C₆H₄-，C₆H₅-，C₆H₅-N＝N-C₆H₄-，C₆H₅-CH＝CH-C₆H₄-等。例如，在上述R中，n的范围是1到20。在上述R中，“H”可以由酰基、硝基、亚硝基、苯基、烷基、烷基醚等取代。

磺酸化合物的具体的例子包括，例如，十二烷基硫酸钠(下文中指定为“SLS”)、十二烷基苯磺酸钠盐(下文中指定为“SDBS”)、十二烷基硫酸锂(下文中指定为“LiLS”)、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸钠盐(下文中指定为“ABSA”)、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二钠盐(下文中指定为“ANDS”)，4，4’-二叠氮基茋-2，2’-二磺酸二钠盐(下文中指定为“DADS”)，N-环己基-2-氨基乙烷磺酸，N-环己基-3-氨基丙烷磺酸，哌嗪-1，4-二(2-乙烷磺酸)，红菲绕啉磺酸等，磺酸化合物更优选是SLS、SDBS或LiLS。

在本发明中，硝基化合物不特别限定但可以是如硝基苯化合物或二硝基苯化合物。这些化合物的苯环优选不仅含有硝基基团而且含有一个取代剂如-NH₂、-OH、-COOH、-SO₃或-(CH₂)_nCH₃(n＝2到9)，并且，在它们中，优选地含有一个亲水基团作为取代物。该取代物可以例如是卤素基团、醚基团或苯基。

硝基化合物的具体的例子包括，例如，2，4-二硝基苯酚(2，4-DNP)，2，5-二硝基苯基、2，6-二硝基苯基、4，6-二硝基-2-甲基苯酚，2-氨基-4-硝基苯酚，2-氨基-5-硝基苯酚，p-硝基苯酚(p-NP)，2，4-二硝基苯胺(2，4-DNA)，p-硝基苯胺(p-NA)，亚硝酸钠(NaNO₂)，亚硝酸钾(KNO₂)、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二钠盐(下文中指定为“ANPS”)，硝基苯等。

当磺酸化合物和硝基化合物均使用时，对于它们的组合没有特别的限定。

因为这些磺酸化合物和硝基化合物比例如上述提到的四唑化合物具有较高的溶解度，所以当样品中血红蛋白浓度较高时它们可以被容易的处理。同时，从价格不贵的角度看，磺酸化合物和硝基化合物是非常有用的。

在根据本发明的测定方法中，所加入的磺酸化合物和硝基化合物的量没有特别的限定，而可以根据样品的种类、样品中所含的血红蛋白的量、样品中所含的其他的还原性物质等被适宜的测定。特别的例子如下。

对于加入所述的磺酸化合物或硝基化合物之一的情况，在1微升的样品中所加入的该化合物的量的范围优选地为0.01-1000μmol，更优选地为0.03-200μmol，且特别优选地为0.05-40μmol。

对于所述的磺酸化合物和硝基化合物均加入的情况，在1微升的样品中所加入的该磺酸化合物的量的范围优选地为0.005-20μmol，而该硝基化合物的量的范围优选地为0.005-25μmol，且前者更优选地为0.02-4μmol，而后者更优选地为0.01-5μmol。

在本发明中，优选的氧化还原反应是一种显色反应，其中通过一种氧化酶还原衍生自分析物的氧化性物质并氧化一种经氧化反应而显色的底物(一种发色底物)，该氧化性物质的量通过测定在显色反应过程中显色的程度而测定。显色的程度通过，例如，测量在用于检测该底物的波长处的吸光度而测量。

显色的底物可以是，例如，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲氨基)二苯胺钠盐(在文中指定为“DA-64”)，一种Trinder试剂和4-氨基安替比林的组合、N，N，N’，N’，N”，N”-六(3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷六钠盐(在文中指定为“TPM-PS”)、N，N，N’，N’，N”，N”-六(2-羟基-3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷六钠盐(在文中指定为“TPM-OS”)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-二(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐(在文中指定为“DA-67”)、10-(甲氨基羰基)-3，7-二(二甲氨基)-吩噻嗪(在文中指定为“MCDP”)、10-(羧氨基甲基-4-苯基氨基羰基)-3，7-二(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐(在文中指定为“MMX”)等。在以上这些中，基于三苯基甲烷的显色底物如TPM-PS和TPM-OS是优选的，特别是基于三氨基三苯基甲烷的显色底物是优选的。

Trinder试剂可以是例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺或萘胺衍生物。与Trinder试剂组合的化合物可以不仅是上述提到的4-氨基安替比林，而且可以是例如氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑酮腙(benzothiazolinone hydrazone MBTH)、磺化甲基苯并噻唑酮腙(SMBTH)等。

上述所说明的显色底物通常在400nm或更长的波长处具有吸收(absorbance)。因此，由于上述四唑化合物在400nm或更长的波长处也具有吸收，四唑化合物的存在会导致测量值的误差。另一方面，上述磺酸化合物或硝基化合物在400nm或更长的波长处没有吸收，因此，既便当使用这些显色底物时，也不必担心吸光度测量中导致的误差。

尽管对于这些显色底物和磺酸化合物及硝基化合的组合没有特别的限制，例如下述的组合对于产生精确的显色反应是优选的。顺便提及的是，这些显色底物和磺酸化合物及硝基化合的组合提高显色反应精度的原因是未知的。

在显色底物是DA-64或Trinder试剂与4-氨基安替比林的组合时，优选向样品中加入磺酸化合物和硝基化合物两者。例如，磺酸化合物优选是SLS、SDBS或LiLS；而硝基化合物优选是2，4-DNA、2，4-DNP、PNA或PNP。

另一方面，在显色底物是TPM-PS、TPM-OS、DA-67、MCDP或MMX的情况下，优选向试剂中加入磺酸化合物，更优选是向试剂中加入磺酸化合物和硝基化合物两者。

在本发明中，优选衍生自分析物的氧化性物质是过氧化氢。此外，优选的氧化酶是过氧化物酶。

在本发明的测定方法中，样品的种类不是特别限定的。除血液样品如全血、血浆、血清和血细胞外，样品可以例如是生物学样品如尿、脊髓液和唾液，饮品如果汁，或食物如酱油和伍斯特郡酱油(Worcestershiresauce)。

在本发明的测定方法中，只要是应用氧化还原反应，分析物不特别限定于，但可以是例如，全血中的组分、红细胞中的组分、血浆中的组分、血清中的组分等，优选是红细胞中的组分。更特别的，分析物可以是，例如，糖化蛋白如糖化血红蛋白和糖化白蛋白、糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、尿酸、胆固醇、肌酐、肌氨酸、甘油等。在这些中，糖化蛋白是更加优选的。例如，当红细胞中的组分被测定时，全血本身可以被溶血以制备样品，或红细胞从全血中分离、溶血以制备样品。

在本发明的测定方法中，当分析物是糖化蛋白时，优选的是将FAOD作用于糖化蛋白使得过氧化氢产生，并作为来自分析物的氧化性物质。糖化蛋白的糖化部分被FAOD氧化并分解，由此产生过氧化氢。同时，当分析物是如糖化多肽或糖化氨基酸等糖化胺时，优选分析物类似地接受FAOD的作用。而且，在FAOD处理以前，优选的是糖化蛋白和糖化多肽必要时可以蛋白酶进行处理。

作为FAOD，所采用的FAOD催化的反应优选以如下反应式(1)所代表：

(1)

在式(1)中，R¹代表一个羟基或糖化前衍生自糖的残基(即糖残基)。当糖在糖化前是醛糖时，糖残基(R¹)是醛糖残基，在糖化前是酮糖时，糖残基是酮糖残基。例如，当糖在糖化前是葡萄糖时，其在糖化后通过Amadori重排产生果糖结构。在这种情况下，糖残基(R¹)变成葡萄糖残基(一种醛糖残基)。糖残基(R¹)例如可以由

-[CH(OH)]_n-CH₂OH代表，

其中n是0到6的整数。

在式(1)中，R²不是特别限定的。但是，例如当底物是糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白时，在α-氨基被糖化的情况和除α-氨基以外的其他氨基被糖化的情况之间是存在差别的。

在式(1)中，当α-氨基被糖化时，R²是一个由如下式(2)表示的氨基酸残基或肽残基：

-CHR³-CO-R⁴ (2)

在式(2)中，R³表示氨基酸侧链基团，R⁴表示羟基，氨基酸残基或肽残基可以由例如下面的式(3)所代表，在式(3)中，n是一个0或更大的整数，R³表示如上所提到的氨基酸侧链基团。

-(NH-CHR³-CO)_n-OH (3)

在上述式(1)中，当除α-氨基以外的氨基被糖化时(即，一个氨基酸侧链基团被糖化时)，R²可以由如下的式(4)所代表：

-R⁵-CH(NH-R⁶)-CO-R⁷ (4)

在式(4)中，R⁵表示在氨基酸侧链基团中除了糖化氨基以外的部分。例如，当糖化氨基酸是赖氨酸时，R⁵是：

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-

在另外一个例子，当糖化氨基酸是精氨酸时，R⁵是：

-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH(NH₂)-

在式(4)中，R⁶表示氢、氨基酸残基或肽残基，并可以由例如如下的式(5)所代表。在式(5)中，n表示0或更大的整数，而R³是如上提及的氨基酸侧链基团：

-(CO-CHR³-NH)_n-H (5)

在上述式(4)中，R⁷表示羟基、氨基酸残基或肽残基，并可以由例如如下的式(6)所代表。在式(6)中，n表示0或更大的整数，R³是如上提及的氨基酸侧链基团：

-(NH-CHR³-CO)_n-OH (6)

(第一个具体实施方式)

在下面，本发明的测定方法将会参照实施例进行描述，其中测定的是血细胞中的糖化蛋白。

首先，将全血本身进行溶血，或将血细胞的部分从全血中以通常的方式离心然后溶血，以制备溶血样品。导致溶血的方法不特别限定但可以是例如，使用表面活性剂的方法，使用超声波的方法，使用渗透压差别的方法等。在这些方法中，优选使用表面活性剂的方法，因为它操作简便。

作为表面活性剂，例如，可以使用非离子的表面活性剂如聚氧乙烯-p-t-辛基苯基酯(如Triton系列表面活性剂)，聚氧乙烯山梨聚糖烷基酯(如Tween系列表面活性剂)，聚氧乙烯烷基酯(如Brij系列表面活性剂)等。其特别的例子如Triton X-100、Tween-20、Brij 35等。使用表面活性剂处理的条件通常如下：当要处理的血细胞在溶液中的浓度是1到10vol％，加入的表面活性剂的浓度范围是在0.01到5wt％之间，在室温搅拌大约几秒钟(大约5秒钟)到10分钟。

然后，将磺酸化合物和硝基化合物中的至少一种加入到溶血的样品中，以进行溶血的样品的预处理。

尽管可以加入磺酸化合物和硝基化合物中的之一或两种，但优选的是根据如上所述的后期的步骤所用的显色底物的种类做出适宜的决定。

在加入磺酸化合物和硝基化合物其中之一的情况下，加入的量不是特别限定的但是可以是以上所述的加入比率。更特别的，当血细胞在需预处理的溶液中的浓度是1vol％时，硝基化合物的浓度是例如在0.05到500mmol/L之间，优选是从0.2到100mmol/L。同时，当血细胞在需预处理的溶液中的浓度是1vol％时，磺酸化合物的浓度是例如在0.05到200mmol/L之间，优选是从0.2到40mmol/L。

同时，在向样品中加入磺酸化合物和硝基化合物两者时，所加的量不是特别限定但可以是上述加入比率。更特别的，血细胞在需预处理的溶液中的浓度是1vol％时，磺酸化合物的浓度是例如在0.05到200mmol/L之间，而硝基化合物是在例如0.05到250mmol/L之间，前者优选是在0.2到40mmol/L，后者优选是在0.1到50mmol/L之间。当磺酸化合物和硝基化合物均加入时，它们如上所述不需要以特定的次序加入，并可以同时加入。

尽管磺酸化合物和硝基化合物可以以其本身使用，但优选的是将其在溶剂中溶解，并以磺酸化合物和硝基化合物的溶液使用，以简化操作和提高处理效率。这些溶液单个的浓度可以根据其种类来确定。磺酸化合物的溶液浓度例如是从5到1000mmol/L之间，优选是从5到400mmol/L之间。硝基化合物溶液例如是从0.5到100mmol/L之间，优选是从1到50mmol/L。作为溶剂，可以使用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等。其中缓冲液可以是如下所列的这些。顺便提及的是，上述两种化合物均可以是单独的或者是两种或更多的组合。

预处理通常是在缓冲液中进行。缓冲液的例子包括胺的缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和Good’s缓冲液如MOPS缓冲液、CHES缓冲液、CAPS缓冲液、CAPSO缓冲液等。胺缓冲液中缓冲组分的例子包括甘氨酸、乙胺、二乙胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、三(羟甲基)氨基甲烷、三乙醇胺、甘氨酰胺等。

上述缓冲液的pH优选在7到12之间，更优选是在8到11之间，特别优选是在8到10之间。

预处理的条件不是特别限定的。但是，预处理通常是在温度在10℃到37℃之间，时间是10秒到60分钟。

在使用上述的十二烷基硫酸钠等作为磺酸化合物进行预处理时，加入单一物质(十二烷基硫酸钠等)同时进行上述的溶血也是可能的，因为十二烷基硫酸钠本身具有表面活性剂的功能。

然后，预处理的溶血样品经蛋白酶处理，进行该处理是使得FAOD在随后的处理中可以更加容易作用于分析物。

蛋白酶的种类不是特别限定的，例如可以使用蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、氨基肽酶、金属蛋白酶等。蛋白酶处理的条件适当的根据使用的蛋白酶种类、作为分析物的糖化蛋白的种类和浓度等来确定的。

更特别的，当预处理的溶血样品使用蛋白酶K作为蛋白酶进行处理时，通常，蛋白酶在反应溶液中的浓度在10到30,000mg/L之间，反应溶液中的血细胞的浓度在0.05到15vol％之间，反应温度是在15℃到37℃之间，反应的时间是从1分钟到24小时，pH是在6到12之间。蛋白酶的处理通常是在缓冲液中进行。对于缓冲液，可以使用与预处理中类似的缓冲液。

然后，经蛋白酶处理的降解产物进一步用FAOD处理，FAOD的处理催化了上述式(1)中的反应。

优选的是FAOD的处理是在如上述蛋白酶处理的溶液中进行。FAOD处理的条件是适当地根据使用的FAOD的种类、作为分析物的糖化蛋白的种类和浓度等确定。

更特别的，条件如下所示：FAOD在反应溶液中的浓度是在50到50000U/L，血细胞在反应溶液中的浓度是0.01到1vol％，反应温度是在15℃到37℃之间，反应的时间是从1到60分钟，pH是在6到9之间。而且，缓冲液的种类不是特别限定的。例如，可以使用与蛋白酶类似的缓冲液。

然后，在FAOD处理中形成的过氧化氢通过使用POD和显色底物的氧化还原反应测定。

氧化还原反应通常是在缓冲液中进行。反应的条件可以适当的根据产生的过氧化氢的浓度等决定。条件通常如下：POD在反应溶液中的浓度在10到100000IU/L之间，显色底物的浓度在0.005到30mmol/L之间，反应温度在15℃到37℃之间，反应的时间是从0.1到30分钟，pH是从5到9。而且，缓冲液的种类不是特别限定的，例如，可以使用与蛋白酶处理和FAOD处理类似的那些缓冲液。

在氧化还原反应中，例如，当使用显色底物时，过氧化氢的量可以通过使用分光光度计在反应溶液中测量显色的程度来测定。然后，例如使用过氧化氢的浓度和校正曲线等，样品中糖化蛋白的量可以得到测定。

过氧化氢的量不仅可以通过上述使用POD的酶的方法等测定，而且可以通过例如电的方法测定。

在测定的方法中，使用磺酸化合物和硝基化合物的预处理的步骤不是特别限定的，只要其在上述的实际发生的氧化还原反应前进行。然而，因为过氧化氢在FAOD处理后形成，优选的预处理步骤是在FAOD处理前进行。而且，尽管每个处理步骤可以如上述分开进行，一些处理步骤可以同时进行，例如，以如下的组合：

1：溶血处理+预处理

2：溶血处理+预处理+蛋白酶处理

3：蛋白酶处理+FAOD处理

4：FAOD处理+POD氧化还原处理

5：蛋白酶处理+FAOD处理+POD氧化还原处理

而且，加入磺酸化合物和硝基化合物的顺序以及加入FAOD、POD和显色底物的顺序也不是特别限定的。

用这种方法，通过将样品与磺酸化合物和硝基化合物接触，不仅可能清除低分子量还原性物质如GSH、AsA、二硫苏糖醇、半胱氨酸和N-乙酰半胱氨酸的影响，而且特别是血红蛋白和血红蛋白降解产物作为还原性物质的影响。随后，可以进行高度精确的测定，例如不对氧化还原反应和测定吸光度产生影响。

而且，在本发明的测定方法的预处理步骤中，例如，也可以进一步联合使用除了所述磺酸化合物和硝基化合物以外的氧化剂和酶。氧化剂的例子包括EDTA-Fe和氧化卤素，如碘醋酸钠、碘酸和高碘酸。酶的例子包括抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶。加入的这种氧化剂的量例如，对于1μl的样品，在0.001到0.1mg之间。

在本发明的测定方法中，只要应用氧化还原反应，分析物不是特别限定的。除了糖化蛋白外分析物的例子包括如上所述的糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、胆固醇、尿酸、肌酐、肌氨酸和甘油。

当上述的各种分析物的量是通过形成过氧化氢来测定时，可以适当的方式形成过氧化氢，例如，分别通过葡萄糖氧化酶对葡萄糖的作用；胆固醇氧化酶对胆固醇的作用；尿酸酶对尿酸的作用；肌氨酸氧化酶对肌酐的作用；肌氨酸氧化酶对肌氨酸的作用；或甘油氧化酶对甘油的作用。过氧化氢的量可以通过与上述类似的方式测定。而且，糖化肽和糖化氨基酸可以例如以与上述糖化蛋白的测定类似的方式进行测定。

而且，在样品中的血红蛋白和血红蛋白降解产物用磺酸化合物和硝基化合物处理后，在形成衍生自分析物的还原性物质的情况下，通过氧化还原反应测定还原性物质的量，然后从测量值确定分析物的量，测量例如可以以下述的方式进行。

当分析物是葡萄糖时，例如，在存在NAD⁺、NADP⁺等的条件下，使用葡萄糖脱氢酶形成还原性物质如NADH或NADPH。然后，作为衍生自分析物的还原性物质的NADH或NADPH，通过使用例如心肌黄酶(diaphorase)和经还原反应显色的底物的氧化还原反应测定。然后，如上所述，样品中分析物的量可以通过使用衍生自该分析物的还原性物质的浓度和校正曲线等测定。而且，例如，当分析物是胆固醇时，可以使用胆固醇脱氢酶，当分析物是肌氨酸时，可以使用肌氨酸脱氢酶。

作为通过还原反应显色的底物，尽管不是特别限定的，例如，可以使用以上提到的显色四唑化合物、2，6-二氯靛酚(dichlorophenolindophenol)等。

实施例

下文中，一起描述实施例与对比例。

实施例1

在实施例1中，使用TPM-PS作为显色底物，包含果糖基缬氨酸(在下文中指定为FV)的血红蛋白样品用磺酸化合物和硝基化合物处理，因而测定FV的量。这里所用到的样品和试剂以及方法如下所述：

(制备待测定的样品)

冻干的血红蛋白溶解在纯净的水中，而制备得到50g/L的血红蛋白溶液。另一方面，FV根据JP2(1990)-69644 A制备，并溶解在纯净水中，而制备得到1mM FV溶液。然后，37μl的血红蛋白溶液，60μl的FV溶液和203μl的纯净水混合，以便制备待测定的样品。

(第一试剂)

磺酸化合物 3.2mM，6.4mM，或12.8mM

表明活性剂(聚氧乙烯(9)十二烷基醚) 1.85g/L

CHES-CHES·Na缓冲液(pH9.4) 40mM

MOPS-MOPS·Na缓冲液(pH9.4) 15mM

作为第一试剂中的磺酸化合物，单独使用SLS(由Nacalai Tesque，Inc.制造)、SDBS(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)、ABSA(由Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.制造)、ANDS(由Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.制造)和DADS(由Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.制造)。

(第二试剂)

硝基化合物 0mM或6.4mM

(2，4-DNA；由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)

金属蛋白酶(由ARKRAY，INC.制造) 2.0MU/L

CaCl₂ 2.5mM

NaCl 50mM

MOPS-MOPS·Na缓冲液(pH6.5) 1.0mM

(第三试剂)

FAOD(由ARKRAY，INC.制造) 18KU/L

POD(由Kikkoman Corporation制造) 67KU/L

CaCl₂ 2.5mM

TPM-PS(由DOJINDO LABORATORIES制造) 0.25mM

ADA缓冲液(pH7.0) 300mM

(方法)

在0.14μl待测样品中加入8.26μl的第一试剂，然后加入75.6μl第二试剂，混合并在37℃放置5分钟。然后，将18.9μl的第三试剂加入该混合物中，并在37℃温育，以利于显色反应。其吸光度在5分钟后由商标名是JCA-BM8(JEOL.Ltd.)测定。测定波长的设定是主要波长在571nm，次要波长在805nm。另一方面，在对比例中，吸光度通过与上述例1类似的方法测定，除了在第一试剂中不加磺酸化合物和在第二试剂中不加硝基化合物。当第一试剂和第二试剂混合到样品中后，对于1μl样品，所加入的磺酸化合物的量是0.189μmol、0.378μmol和0.755μmol，所加入的硝基化合物的量是3.46μmol。

(表1)

磺酸化合物硝基化合物吸光度

(mM) (mM) (mAbs)

实施例 1-1 SLS(3.2) 2，4-DNA(0.9) 149

1-2 SLS(6.4) 2，4-DNA(0.9) 154

1-3 SLS(12.8) 2，4-DNA(0.9) 160

1-4 SDBS(6.4) 2，4-DNA(0.9) 121

1-5 SLS(6.4) - 154

1-6 ABSA(6.4) - 132

1-7 ANDS(6.4) - 113

1-8 DADS(6.4) - 124

对比例1 - - 30

如表1所示，在实施例1中，当加入各种磺酸化合物或其与硝基化合物的组合时，与对比例比，代表样品中FV的量的吸光度增加了。这些结果示出，根据实施例1，磺酸化合物和硝基化合物消除了样品中血红蛋白的影响。

实施例2

在实施例2中，使用DA-64作为显色底物，包含FV的血红蛋白样品用磺酸化合物和硝基化合物处理，然后测定FV的量。所用的样品和试剂以及方法如下所描述。

(制备待测的样品)

将60μl实施例中制备的血红蛋白溶液，37μl FV溶液和203μl纯净水混合在一起以制备待测样品。

(第一试剂)

磺酸化合物(SLS：由Nacalai Tesque，Inc.制造) 6.4mM

表面活性剂(聚氧乙烯(9)十二烷基基醚) 1.85g/L

CHES-CHES·Na缓冲液(pH9.4) 40mM

MOPS-MOPS·Na缓冲液(pH9.4) 15mM

(第二试剂)

硝基化合物 0.9mM

金属蛋白酶(由ARKRAY，INC.制造) 2.0MU/L

CaCl₂ 2.5mM

NaCl 50mM

MOPS-MOPS·Na缓冲液(pH6.5) 1.0mM

作为硝基化合物，分别使用2，4-DNA(由Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造)，p-NA(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)，p-NP(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)，NaNO₂(由NacalaiTesque，Inc.制造)和2，4-DNH(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)。在加入两种硝基化合物时，一共加入1.8mM(每种0.9mM)。

(第三试剂)

FAOD(由ARKRAY，INC.制造) 17.5KU/L

FOD(由Kikkoman Corporation制造) 67KU/L

DA-64(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造) 70μM

Tris-HCl缓冲液(pH7.0) 300mM

(方法)

在0.14μl待测样品中加入8.26μl第一试剂后，进而加入75.6μl第二试剂，并使之在37℃放置5分钟。然后，将18.9μl第三试剂加入该混合物中，并在37℃温育，以发生显色反应。5分钟后，样品的吸光度通过商品名是JCA-BM8分光光度计来测定(由JEOL.Ltd.)。吸收波长的主波长设定在751nm，次波长设定在805nm。另一方面，在对照样品中，吸光度与如上述实施例2类似的方法测定，除了不加入第一试剂中的磺酸化合物和第二试剂中的硝基化合物。结果如下表2所示：

(表2)

磺酸化合物硝基化合物吸光度

(mM) (mM) (mAbs)

实施例 2-1 SLS(6.4) 2，4-DNA(0.9) 51.3

2-2 SLS(6.4) p-NA(0.9) 41.0

2-3 SLS(6.4) p-NP(0.9) 41.5

2-4 SLS(6.4) NaNO₂(0.9) 41.5

2-5 SLS(6.4) 2，4-DNA(0.9) 277.0

p-NP(0.9)

2-6 SLS(6.4) 2，4-DNA(0.9) 279.0

p-NA(0.9)

2-7 SLS(6.4) p-NP(0.9) 267.0

p-NA(0.9)

2-8 SLS(6.4) 2，4-DNA(0.9) 257.0

NaN₃(0.9)

对比例1 - - 2.1

如表2中所示，在实施例2中，当加入磺酸化合物与各种硝基化合物的组合时，与对比例相比，表示样品中FV量的吸光度增加了。而且，通过加入2倍的硝基化合物，吸光度进一步增加了。结果表明，根据实施例2，磺酸化合物和硝基化合物消除了样品中血红蛋白的影响。

工业实用性

如上所述，在根据本发明的测定方法中，通过向样品中加入磺酸化合物和硝基化合物，可以消除样品中作为还原性物质的血红蛋白的影响，因而产生高度可靠的测定。因此，本发明的测定方法可以用来测定临床医学中的各种分析物，如红细胞中的糖化血红蛋白，其对于糖尿病的诊断非常有意义。

Claims

1.一种通过使用氧化还原反应测量含有血红蛋白或血红蛋白降解产物的样品中的分析物的方法，包含：

向样品中加入磺酸化合物和硝基化合物中的至少一种，以消除样品中所含有的血红蛋白或血红蛋白降解产物的影响。

2.根据权利要求1的方法，其中，在进行氧化还原反应之前，向样品中加入磺酸化合物和硝基化合物中的至少一种，以消除样品中所含有的血红蛋白或血红蛋白降解产物的影响，然后，该方法进一步包含：

形成衍生自所述分析物的氧化性物质或还原性物质；

通过氧化还原反应测量所形成的衍生自分析物的物质的量；和

由表示所形成的物质的量的测量值来确定所述分析物的量。

3.根据权利要求1的方法，其中将磺酸化合物和硝基化合物两者均加入到样品中。

4.根据权利要求1的方法，其中所述磺酸化合物是选自十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠盐、十二烷基硫酸锂、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸钠盐、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二钠盐或4，4’-二叠氮基茋-2，2’-二磺酸二钠盐中的至少一种。

5.根据权利要求1的方法，其中所述硝基化合物是选自2，4-二硝基苯酚、p-硝基苯酚、2，4-二硝基苯胺，p-硝基苯胺，亚硝酸钠，亚硝酸钾、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二钠盐或硝基苯中的至少一种。

6.根据权利要求2的方法，其中所述氧化还原反应是一种显色反应，该显色反应通过一种氧化酶还原所述衍生自分析物的氧化性物质并氧化一种经氧化可显色的底物，并通过测量在显色反应中显色的程度来测量所述氧化性物质的量。

7.权利要求6的方法，其中通过测量在用于检测该底物的波长处的吸光度来测量显色的程度。

8.根据权利要求2的方法，其中所述衍生自分析物的氧化性物质是过氧化氢。

9.根据权利要求6的方法，其中的氧化酶是过氧化物酶。

10.根据权利要求2的方法，其中所述的分析物是选自糖化蛋白、糖化肽或糖化氨基酸中的至少一种，且通过果糖基氨基酸氧化酶作用于所述分析物形成过氧化氢作为所述衍生自分析物的氧化性物质。

11.根据权利要求10的方法，其中将磺酸化合物和硝基化合物中的至少一种在使得果糖基氨基酸氧化酶作用于所述分析物前加入到样品中。

12.根据权利要求1的方法，其中通过氧化而显色的底物是选自N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲氨基)二苯胺钠盐、Trinder试剂和4-氨基安替比林的组合、N，N，N’，N’，N”，N”-六(2-羟基-3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷六钠盐、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-二(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐、10-(甲氨基羰基)-3，7-二(二甲氨基)-吩噻嗪或10-(羧氨基甲基-4-苯基氨基羰基)-3，7-二(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐中的至少一种化合物，且将所述磺酸化合物和硝基化合物两者均加入到样品中。

13.根据权利要求1的方法，其中通过氧化而显色的底物是选自N，N，N’，N’，N”，N”-六(3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷六钠盐、N，N，N’，N’，N”，N”-六(2-羟基-3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷六钠盐、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-二(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐、10-(甲氨基羰基)-3，7-二(二甲氨基)-吩噻嗪或10-(羧氨基甲基-4-苯基氨基羰基)-3，7-二(二甲氨基)-吩噻嗪钠盐中的至少一种的化合物，且至少将所述磺酸化合物加入到样品中。

14.根据权利要求1的方法，其中所述分析物是选自糖化蛋白、糖化肽或糖化氨基酸中的至少一种。

15.根据权利要求14的方法，其中糖化蛋白是糖化血红蛋白。

16.根据权利要求1的方法，其中的样品是通过红细胞溶血得到的溶血样品。

17.根据权利要求16的方法，其中将所述磺酸化合物加入到样品中，以使得当样品中血细胞的浓度是1vol％时，所述磺酸化合物的浓度是0.05到200mmol/L。

18.根据权利要求16的方法，其中将所述硝基化合物加入到样品中，以使得当样品中血细胞的浓度是1vol％时，所述硝基化合物的浓度是0.05到500mmol/L。

19.根据权利要求16的方法，其中将所述磺酸化合物和硝基化合物加入到样品中，以使得当样品中血细胞的浓度是1vol％时，所述磺酸化合物和硝基化合物的浓度分别是0.05到200mmol/L和0.05到250mmol/L。