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CN103620052A - 糖化血红蛋白的测定方法、测定试剂和测定试剂盒 - Google Patents

糖化血红蛋白的测定方法、测定试剂和测定试剂盒 Download PDF

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CN103620052A CN201280029249.4A CN201280029249A CN103620052A CN 103620052 A CN103620052 A CN 103620052A CN 201280029249 A CN201280029249 A CN 201280029249A CN 103620052 A CN103620052 A CN 103620052A
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Abstract

本发明提供不受血红蛋白的影响、准确且高灵敏度地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的方法。一种含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样、然后使用果糖基肽氧化酶进行作用的反应中，在卤素氧化物存在下进行该反应，并且对生成的过氧化氢进行测定。根据本发明，提供含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其可用于对糖尿病的诊断有用的糖化血红蛋白的测定等。

Description

糖化血红蛋白的测定方法、测定试剂和测定试剂盒
技术领域
本发明涉及糖化血红蛋白的测定方法、测定试剂和测定试剂盒。背景技术
糖化血红蛋白是在血红蛋白上结合葡萄糖而成的糖化物。血红蛋白具有由α链、β链构成的四聚体结构，将β链的N末端糖化后的血红蛋白称为血红蛋白A1c(以下也记作HbA1c)，血糖值越高越增加，因此，作为糖尿病标志物而在临床检查中进行测定。
作为糖化血红蛋白的测定方法，已知HPLC法等色谱法、电泳法、胶乳免疫凝集法等利用抗体的免疫测定法、使用作用于糖化蛋白的酶和作用于糖化肽和/或糖化氨基酸的酶的酶测定法等。
作为糖化血红蛋白的酶测定法，已知如下方法(吸光度法)等：首先，利用变性剂使含有血红蛋白的试样中的血红蛋白变性，使蛋白质分解酶作用于变性后的血红蛋白，接着使糖化肽氧化酶作用于生成的糖化肽，使生成的过氧化氢在过氧化物酶等过氧化活性物质存在下与氧化显色型色原体反应而生成色素，由生成的色素的吸光度测定糖化血红蛋白。
但是，利用该吸光度法的糖化血红蛋白的测定中，大量存在于试样中的血红蛋白的影响成为问题。作为针对该问题的解决方法，已知例如：使用阳离子型表面活性剂和/或两性表面活性剂的方法(专利文献I)、使用砜化合物和/或硝基化合物的方法(专利文献2、专利文献3)、使用四唑
Figure BDA0000437521480000011
化合物的方法(专利文献4)、使用聚氧乙烯烷基醚硫酸盐类等特定的阴离子系表面活性剂的方法(专利文献5)等。
但是，这些方法中，也未必能够避免血红蛋白的影响，因而需要不受血红蛋白影响的、准确地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的方法。
另外，基于氧化还原反应的底物和酶的测定方法中，已知为了避免还原剂、特别是抗坏血酸的妨碍而使用碘酸盐的方法(专利文献6)。但是，还不知道为了避免血红蛋白的影响而使用碘酸盐等卤素氧化物的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平3-010696号公报
专利文献2：WO2003/107011小册子
专利文献3：日本特开2007-147630号公报
专利文献4：日本特开2000-210100号公报
专利文献5：WO2005/049858小册子
专利文献6：日本特开昭56-151358号公报
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供用于不受血红蛋白的影响、准确且高灵敏度地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的方法和试剂。
用于解决问题的方法
本发明人进行了深入的研究，结果发现了如下见解：在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样、然后使用果糖基肽氧化酶进行作用的反应中，在卤素氧化物存在下进行该反应，并对生成的过氧化氢进行测定，由此，能够不受血红蛋白的影响、准确且高灵敏度地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下[1]～[18]项。
[1]一种含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样、然后使用果糖基肽氧化酶进行作用的反应中，在卤素氧化物存在下进行该反应，并对生成的过氧化氢进行测定。
[2]如[1]所述的方法，其中，卤素氧化物为选自由碘酸或其盐、溴酸或其盐和高碘酸或其盐组成的组中的卤素氧化物。
[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，表面活性剂为阳离子型表面活性剂。
[4]如[3]所述的方法其中，阳离子型表面活性剂为选自由下述通式(I)表示的吡啶
Figure BDA0000437521480000031
盐、下述通式(II)表示的
Figure BDA0000437521480000032
盐和下述通式(III)表示的季铵盐组成的组中的阳离子型表面活性剂，
Figure BDA0000437521480000033
式(I)中，R1表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，Ra表示氢原子、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，n表示1～5的整数，X-表示一价的阴离子，
Figure BDA0000437521480000034
式(II)中，R2～R5相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子，
Figure BDA0000437521480000035
式(III)中，R6～R9相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Z-表示一价的阴离子。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，过氧化氢的测定使用过氧化氢测定试剂进行。
[6]如[5]所述的方法，其中，过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。
[7]一种糖化血红蛋白测定试剂，用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白，其特征在于，含有蛋白质分解酶、果糖基肽氧化酶、卤素氧化物和表面活性剂。
[8]如[7]所述的试剂，其中，卤素氧化物为选自由碘酸或其盐、溴酸或其盐和高碘酸或其盐组成的组中的卤素氧化物。
[9]如[7]或[8]所述的试剂，其中，表面活性剂为阳离子型表面活性剂。
[10]如[9]所述的试剂，其中，阳离子型表面活性剂为选自由下述通式(I)表示的吡啶
Figure BDA0000437521480000041
盐、下述通式(II)表示的
Figure BDA0000437521480000042
盐和下述通式(III)表示的季铵盐组成的组中的阳离子型表面活性剂，
Figure BDA0000437521480000043
式(I)中，R1表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，Ra表示氢原子、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，n表示1～5的整数，X-表示一价的阴离子，
Figure BDA0000437521480000044
式(II)中，R2～R5相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子，
式(III)中，R6～R9相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Z-表示一价的阴离子。
[11]如[7]～[10]中任一项所述的试剂，其中，还含有过氧化氢测定试剂。
[12]如[11]所述的试剂，其中，过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。
[13]一种糖化血红蛋白测定试剂盒，用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白，其特征在于，包含含有蛋白质分解酶、卤素氧化物和表面活性剂的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶的第二试剂。
[14]一种糖化血红蛋白测定试剂盒，用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白，其特征在于，包含含有蛋白质分解酶和表面活性剂的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶和卤素氧化物的第二试剂。
[15]如[13]或[14]所述的试剂盒，其中，卤素氧化物为选自由碘酸或其盐、溴酸或其盐和高碘酸或其盐组成的组中的卤素氧化物。
[16]如[13]～[15]中任一项所述的试剂盒，其中，表面活性剂为阳离子型表面活性剂。
[17]如[16]所述的试剂盒，其中，阳离子型表面活性剂为选自由下述通式(I)表示的吡啶
Figure BDA0000437521480000051
盐、下述通式(II)表示的
Figure BDA0000437521480000052
盐和下述通式(III)表示的季铵盐组成的组中的阳离子型表面活性剂，
Figure BDA0000437521480000053
式(I)中，R1表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，Ra表示氢原子、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，n表示1～5的整数，X-表示一价的阴离子，
Figure BDA0000437521480000054
式(II)中，R2～R5相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子，
Figure BDA0000437521480000061
式(III)中，R6～R9相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Z-表示一价的阴离子。
[18]如[13]～[17]中任一项所述的试剂盒，其中，在第一试剂和第二试剂中或者在第二试剂和第一试剂中还分别含有过氧化物酶和无色型色原体。
发明效果
根据本发明，提供用于不受血红蛋白的影响、准确且高灵敏度地测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的方法、试剂和试剂盒。
附图说明
图1是表示使用实施例1～3和比较例1的试剂盒的样本中的HbA1c的测定中血红蛋白浓度与反应吸光度的关系的图。◆表示使用比较例1的试剂盒的测定，○表示使用实施例1的试剂盒的测定，▲表示使用实施例2的试剂盒的测定，□表示使用实施例3的试剂盒的测定，纵轴表示反应吸光度(×10-4Abs)，横轴表示血红蛋白浓度(mg/mL)。
图2是表示使用实施例4和比较例2的试剂盒的样本中的HbA1c的测定中血红蛋白浓度与反应吸光度的关系的图。◆表示使用比较例2的试剂盒的测定，□表示使用实施例4的试剂盒的测定，纵轴表示反应吸光度(×10-4Abs)，横轴表示血红蛋白浓度(mg/mL)。
图3是表示使用实施例5和比较例3的试剂盒的样本中的HbA1c的测定中血红蛋白浓度与反应吸光度的关系的图。◆表示使用比较例3的试剂盒的测定，□表示使用实施例5的试剂盒的测定，纵轴表示反应吸光度(×10-4Abs)，横轴表示血红蛋白浓度(mg/mL)。
图4是表示使用实施例6和比较例4的试剂盒的样本中的HbA1c的测定中血红蛋白浓度与反应吸光度的关系的图。◆表示使用比较例4的试剂盒的测定，○表示使用实施例6的试剂盒的测定，纵轴表示反应吸光度(×10-4Abs)，横轴表示血红蛋白浓度(mg/mL)。
具体实施方式
(1)含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法
本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法为如下方法：在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白、然后使用果糖基肽氧化酶进行作用的反应中，在卤素氧化物存在下进行该反应，并对生成的过氧化氢进行测定。卤素氧化物可以存在于使用果糖基肽氧化酶进行作用的反应中，也可以存在于使用蛋白质分解酶进行作用的反应和使用果糖基肽氧化酶进行作用的反应这两个反应中。
具体而言，可以例示包括以下步骤的测定方法。
<测定方法1>
(1)在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的步骤；
(2)在卤素氧化物存在下使果糖基肽氧化酶作用于步骤(1)中得到的反应产物而生成过氧化氢的步骤；
(3)测定步骤(2)中生成的过氧化氢的步骤；和
(4)基于使用已知浓度的糖化血红蛋白预先制作的、表示过氧化氢量与糖化血红蛋白浓度的关系的标准曲线，由步骤(3)中测定的过氧化氢量确定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白浓度的步骤。
<测定方法2>
(1)在卤素氧化物和表面活性剂的存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的步骤；
(2)使果糖基肽氧化酶与步骤(1)中得到的反应产物反应而生成过氧化氢的步骤；
(3)测定步骤(2)中生成的过氧化氢的步骤；和
(4)基于使用已知浓度的糖化血红蛋白预先制作的、表示过氧化氢量与糖化血红蛋白浓度的关系的标准曲线，由步骤(3)中测定的过氧化氢量确定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白浓度的步骤。
另外，本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法也包含计算含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量相对于总血红蛋白(即，血红蛋白与糖化血红蛋白合并而成的总血红蛋白)量的比例的方法。该情况下，本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法具体为包括以下步骤的测定方法。
<测定方法3>
(1)确定含有血红蛋白的试样中的总血红蛋白(即，血红蛋白与糖化血红蛋白合并而成的总血红蛋白)量的步骤；
(2)在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的步骤；
(3)在卤素氧化物存在下使果糖基肽氧化酶作用于步骤(2)中得到的反应产物而生成过氧化氢的步骤；
(4)测定步骤(3)中生成的过氧化氢的步骤；和
(5)基于使用已知量的糖化血红蛋白预先制作的、表示过氧化氢量与糖化血红蛋白量的关系的标准曲线，由步骤(4)中测定的过氧化氢量确定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量的步骤；和
(6)由步骤(1)中确定的总血红蛋白量和步骤(5)中确定的糖化血红蛋白量计算含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量相对于总血红蛋白量的比例的步骤。
上述步骤(1)的总血红蛋白量的确定也可以在步骤(2)之后进行。
<测定方法4>
(1)确定含有血红蛋白的试样中的总血红蛋白(即，血红蛋白与糖化血红蛋白合并而成的总血红蛋白)量的步骤；
(2)在卤素氧化物和表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的步骤；
(3)使果糖基肽氧化酶作用于步骤(2)中得到的反应产物而生成过氧化氢的步骤；
(4)测定步骤(3)中生成的过氧化氢的步骤；和
(5)基于使用已知量的糖化血红蛋白预先制作的、表示过氧化氢量与糖化血红蛋白量的关系的标准曲线，由步骤(4)中测定的过氧化氢量确定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量的步骤；和
(6)由步骤(1)中确定的总血红蛋白量和步骤(5)中确定的糖化血红蛋白量计算含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白量相对于总血红蛋白量的比例的步骤。
上述步骤(1)的总血红蛋白量的确定也可以在步骤(2)之后进行。
本发明的测定方法中的含有血红蛋白的试样只要是含有血红蛋白且能够应用本发明的糖化血红蛋白的测定方法的试样则没有特别限制，可以列举例如全血、血细胞、血细胞中混合有血浆的试样、对这些试样进行溶血处理后的试样等。作为溶血处理，只要是使全血、血细胞、血细胞中混合有血浆的试样发生溶血的处理则没有特别限制，可以列举例如物理方法、化学方法、生物学方法等。作为物理方法，可以列举例如使用蒸馏水等低渗液的方法、使用超声波的方法等。作为化学方法，可以列举例如使用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂的方法、使用聚氧乙烯类表面活性剂的方法等。作为生物学方法，可以列举例如使用抗体、补体的方法等。
本发明中的糖化血红蛋白是在血红蛋白上结合葡萄糖等糖而生成的，可以列举血红蛋白A1a、血红蛋白A1b、血红蛋白A1c等，优选血红蛋白A1c。
作为本发明中的卤素氧化物，只要是可实现本发明的糖化血红蛋白的测定方法的卤素氧化物则没有特别限制，可以列举例如碘酸或其盐、溴酸或其盐、高碘酸或其盐等。作为盐，可以列举例如锂盐、钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、镁盐等。
作为卤素氧化物的具体例(产品)，可以列举例如碘酸、碘酸钠、碘酸钾、溴酸、溴酸钠、溴酸钾、高碘酸、高碘酸钠、高碘酸钾等。
本发明的糖化血红蛋白的测定方法中，作为卤素氧化物在反应液中的浓度，只要是可实现本发明的糖化血红蛋白的测定方法的浓度则没有特别限制，通常为0.005～20mmol/L，优选0.01～10mmol/L。
作为本发明中的表面活性剂，只要是可实现本发明的糖化血红蛋白的测定方法的表面活性剂则没有特别限制，可以列举阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性表面活性剂、非离子型表面活性剂等，优选阳离子型表面活性剂。
作为阳离子型表面活性剂，可以列举例如吡啶
Figure BDA0000437521480000101
盐、
Figure BDA0000437521480000102
盐、咪唑
Figure BDA0000437521480000103
盐、季铵盐、异喹啉盐等，优选吡啶
Figure BDA0000437521480000105
盐、
Figure BDA0000437521480000106
盐、季铵盐。
作为吡啶
Figure BDA0000437521480000107
盐，使用下述通式(I)表示的吡啶
Figure BDA0000437521480000108
盐[以下称为化合物(I)]。
式中，R1表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，Ra表示氢原子、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，n表示1～5的整数，X-表示一价的阴离子。
R1中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如碳原子数1～20的直链烷基、碳原子数3～20的支链烷基等。作为碳原子数1～20的直链烷基，可以列举例如甲基、乙基、丙基、丁基、戍基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。作为碳原子数3～20的支链烷基，可以列举例如异丙基、异丁基、异戊基、异己基、异庚基、异辛基、异壬基、异癸基、异十一烷基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基、异十五烷基、异十六烷基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二十烷基、辛基十二烷基等。
R1中，作为取代或未取代的烯基中的烯基，可以列举例如碳原子数2～20的烯基等。作为碳原子数2～20的烯基，可以列举例如乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戍烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一烯基、十二烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、十七烯基、十八烯基、油烯基、十九烯基、二十烯基等。
R1中，作为取代烷基和取代烯基中的取代基，可以列举例如苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为卤素原子，可以列举例如氯原子、溴原子、碘原子等。
Ra中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如碳原子数1～20的直链烷基、碳原子数3～20的支链烷基等。作为碳原子数1～20的直链烷基，可以列举例如上述的碳原子数1～20的直链烷基等。作为碳原子数3～20的支链烷基，可以列举例如上述的碳原子数3～20的支链烷基等。
Ra中，作为取代或未取代的烯基中的烯基，可以列举例如碳原子数2～20的烯基等。作为碳原子数2～20的烯基，可以列举例如上述的碳原子数2～20的直链烯基等。
Ra中，作为取代烷基和取代烯基中的取代基，可以列举例如苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如氯原子、溴原子、碘原子等。
在吡啶环上具有2个以上的取代基的情况下，取代基可以相同也可以不同。化合物(I)中的X-表示一价的阴离子。作为一价的阴离子，可以列举例如卤素离子、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-等阴离子。作为卤素离子，可以列举例如Cl-、Br-、I-等。
作为化合物(I)的具体例(产品)，可以列举例如1-十二烷基吡啶
Figure BDA0000437521480000124
氯化物(以下记作C12py；东京化成公司制造)、1-鲸蜡基吡啶
Figure BDA0000437521480000126
氯化物(以下记作C16py；东京化成公司制造)、1-鲸蜡基-4-甲基吡啶氯化物(东京化成公司制造)、N-十八烷基-4-苯乙烯基吡啶溴化物(东京化成公司制造)等。
作为
Figure BDA0000437521480000121
盐，使用下述通式(II)表示的
Figure BDA0000437521480000122
盐[以下称为化合物(II)]。
Figure BDA0000437521480000123
式中，R2～R5相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子。
R2中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如碳原子数8～20的直链烷基、碳原子数8～20的支链烷基等。作为碳原子数8～20的直链烷基，可以列举例如辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鲸蜡基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基等。作为碳原子数8～20的支链烷基，可以列举例如异辛基、异壬基、异癸基、异十一烷基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基、异十五烷基、异十六烷基、异十七烷基、异十八烷基、异十九烷基、异二十烷基、辛基十二烷基等。作为取代烷基中的取代基，可以列举例如苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如氯原子、溴原子、碘原子等。
R3～R5中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如碳原子数1～20的直链烷基、碳原子数3～20的支链烷基等。作为碳原子数1～20的直链烷基，可以列举例如上述的碳原子数1～20的直链烷基等。作为碳原子数3～20的支链烷基，可以列举例如上述的碳原子数3～20的支链烷基等。作为取代烷基中的取代基，可以列举例如苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如氯原子、溴原子、碘原子等。
Y-表示一价的阴离子。作为一价的阴离子，可以列举例如卤素离子、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-、B(C6H5)4 -、苯并三唑阴离子等阴离子。作为卤素离子，可以列举例如Cl-、Br-、I-等。
作为化合物(II)的具体例(产品)，可以列举例如三丁基十二烷基溴化
Figure BDA0000437521480000131
(以下记作C12TBP；东京化成公司制造)、三丁基十六烷基溴化(东京化成公司制造)、四辛基溴化
Figure BDA0000437521480000133
(东京化成公司制造)、三丁基辛基溴化
Figure BDA0000437521480000134
(东京化成公司制造)等。
作为季铵盐，使用下述通式(III)表示的季铵盐[以下称为化合物(III)]。
Figure BDA0000437521480000141
式中，R6～R9相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Z-表示一价的阴离子。
R6中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如碳原子数8～20的直链烷基、碳原子数8～20的支链烷基等。作为碳原子数8～20的直链烷基，可以列举例如上述的碳原子数8～20的直链烷基等。作为碳原子数8～20的支链烷基，可以列举例如上述的碳原子数8～20的支链烷基等。作为取代烷基中的取代基，可以列举例如苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如氯原子、溴原子、碘原子等。
R7～R9中，作为取代或未取代的烷基中的烷基，可以列举例如碳原子数1～20的直链烷基、碳原子数3～20的支链烷基等。作为碳原子数1～20的直链烷基，可以列举例如上述的碳原子数1～20的直链烷基等。作为碳原子数3～20的支链烷基，可以列举例如上述的碳原子数3～20的支链烷基等。作为取代烷基中的取代基，可以列举例如苯基、羟基、磺基、氰基、卤素原子等。作为苯基取代的烷基，可以列举例如苄基、1-苯基乙基等。作为卤素原子，可以列举例如氯原子、溴原子、碘原子等。
Z-表示一价的阴离子。作为一价的阴离子，可以列举例如卤素离子、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-、B(C6H5)4 -、苯并三唑阴离子等阴离子。作为卤素离子，可以列举例如Cl-、Br-、I-等。
作为化合物(III)的具体例(产品)，可以列举例如癸基三甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵(以下记作C14TMA)、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基二甲基氯化铵、十二烷基二甲基溴化铵、双十二烷基二甲基氯化铵、双十二烷基二甲基溴化铵(均为东京化成公司制造)等。
作为阴离子型表面活性剂，可以列举例如硫酸酯盐、羧酸盐、磺酸盐、磷酸酯盐、磺基琥珀酸盐、N-甲基牛磺酸盐、N-烷酰基-N-甲基牛磺酸盐等。
作为两性表面活性剂，可以列举例如叔胺氧化物、烷基羧基甜菜碱等。
作为非离子型表面活性剂，可以列举例如聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯烯基胺、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烯基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、乙二胺四聚氧乙烯、聚甘油脂肪酸酯等。
总血红蛋白量可以通过公知的方法、例如氰化高铁血红蛋白法、氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法等来确定。通过应用氰化高铁血红蛋白法、氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法，不仅可以确定含有血红蛋白的试样本身的总血红蛋白量，而且还可以确定在含有血红蛋白的试样中添加卤素氧化物和/或表面活性剂而得到的试样、在含有血红蛋白的试样中添加卤素氧化物和/或表面活性剂及蛋白质分解酶而得到的试样的总血红蛋白量。
对于在上述表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的反应而言，只要是能够在上述表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于糖化血红蛋白的条件，则可以在任意条件下进行。含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反应优选在水性介质中进行。作为水性介质，可以列举后述的水性介质等。含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反应中的反应温度通常为10～50℃，优选为20～40℃，反应时间通常为1分钟～3小时，优选为2.5分钟～1小时。作为蛋白质分解酶的浓度，只要是使含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反应进行的浓度，则没有特别限制，通常为50～25000kU/L，优选为250～10000kU/L。
作为蛋白质分解酶，只要是作用于含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白而由糖化血红蛋白生成糖化肽的酶，则没有特别限制，可以列举例如丝氨酸蛋白酶(糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等)、半胱氨酸蛋白酶(木瓜蛋白酶、半胱天冬酶等)、天冬氨酸蛋白酶(胃蛋白酶、组织蛋白酶D等)、金属蛋白酶(嗜热菌蛋白酶等)、N-末端苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶等。本发明中，也可以使用市售的蛋白质分解酶，作为市售品，可以列举例如蛋白酶P“アマノ”3G、蛋白酶K“アマノ”(以上为天野酶公司制造)、链霉蛋白酶AS、链霉蛋白酶E(以上为科研制药公司制造)、嗜热菌蛋白酶(大和化成公司制造)、スミチームMP(新日本化学工业公司制造)等。
作为使用上述蛋白质分解酶进行作用的反应中的表面活性剂的浓度，只要是使含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反应进行的浓度，则没有特别限制，通常为0.0001～10%，优选为0.0005～5%。
通过含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白与蛋白质分解酶的反应，生成含有糖化肽的反应产物。接着，使果糖基肽氧化酶与该反应产物中的糖化肽反应，生成过氧化氢。糖化肽与果糖基肽氧化酶的反应优选在水性介质中进行。作为水性介质，可以列举后述的水性介质等。
糖化肽与果糖基肽氧化酶的反应中的反应温度通常为10～50℃，优选为20～40℃，反应时间通常为1分钟～3小时，优选为2.5分钟～1小时。作为果糖基肽氧化酶的浓度，只要是使糖化血红蛋白与果糖基肽氧化酶的反应进行的浓度，则没有特别限制，通常为0.1～30kU/L，优选为0.2～15kU/L。
作为果糖基肽氧化酶，只要是作用于糖化肽而生成过氧化氢的酶，则没有特别限制，可以列举例如来自丝状菌的果糖基肽氧化酶、来自酵母的果糖基肽氧化酶、来自放线菌的果糖基肽氧化酶、来自细菌的果糖基肽氧化酶、来自古细菌的果糖基肽氧化酶等。本发明中，也可以使用市售的果糖基肽氧化酶，作为市售品，可以列举例如FPOX-CE(龟甲万公司制造)、FPOX-EE(龟甲万公司制造)、FPOX-CET(龟甲万公司制造)等。
作为生成的过氧化氢的测定方法，可以列举例如使用电极的方法、使用过氧化氢测定用试剂的方法等，优选使用过氧化氢测定用试剂的方法。过氧化氢测定用试剂是用于将过氧化氢转变成能够检测的物质的试剂。作为能够检测的物质，可以列举例如色素、光(发光)、荧光等，优选色素。
在能够检测的物质为色素的情况下，过氧化氢测定用试剂可以列举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和氧化显色型色原体的试剂等。作为氧化显色型色原体，可以列举氧化耦合型色原体、无色型色原体等，优选无色型色原体。作为无色型色原体，可以列举例如吩噻嗪类色原体、三苯基甲烷类色原体、二苯胺类色原体、邻苯二胺、羟基丙酸、二氨基联苯胺、四甲基联苯胺等，优选吩噻嗪类色原体。作为吩噻嗪类色原体，可以列举例如10-N-羧甲基氨甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)等。吩噻嗪类色原体中，特别优选10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪钠盐(DA-67)。作为三苯基甲烷类色原体，可以列举例如N,N,N’,N’,N”,N”-六(3-磺丙基)-4,4’,4”-三氨基三苯基甲烷(TPM-PS)等。作为二苯胺类色原体，可以列举例如N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(DA-64)、4,4’-双(二甲氨基)二苯胺、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)等。
在能够检测的物质为光(发光)的情况下，过氧化氢测定用试剂可以列举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和化学发光物质的试剂等。作为化学发光物质，可以列举例如鲁米诺、异鲁米诺、光泽精、吖啶酯等。
在能够检测的物质为荧光的情况下，过氧化氢测定用试剂可以列举含有过氧化物酶等过氧化活性物质和荧光物质的试剂等。作为荧光物质，可以列举例如4-羟基苯乙酸、3-(4-羟基苯基)丙酸、香豆素等。
(2)含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂
本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂是含有蛋白质分解酶、果糖基肽氧化酶、卤素氧化物和表面活性剂的试剂，在本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法中使用。本发明的测定试剂可以还含有过氧化氢测定试剂。
作为本发明的测定试剂中的蛋白质分解酶、果糖基肽氧化酶、卤素氧化物、表面活性剂和过氧化氢测定试剂，可以分别列举例如上述的蛋白质分解酶、果糖基肽氧化酶、卤素氧化物、表面活性剂和过氧化氢测定试剂等。
本发明的测定试剂中的蛋白质分解酶的浓度通常为50～25000kU/L，优选为250～10000kU/L。本发明的测定试剂中的果糖基肽氧化酶的浓度通常为0.1～30kU/L，优选为0.2～15kU/L。
本发明的测定试剂中的卤素氧化物的浓度通常为0.005～20mmol/L，优选为0.01～10mmol/L。
本发明的测定试剂中的表面活性剂的浓度通常为0.0001～10%，优选为0.0005～5%。
本发明的测定试剂中，可以根据需要含有水性介质、稳定剂、防腐剂、盐类、干涉物质消除剂、有机溶剂等。
作为水性介质，可以列举例如去离子水、蒸馏水、缓冲液等，优选缓冲液。
水性介质的pH例如为pH4～10。在使用缓冲液作为水性介质的情况下，优选使用与设定的PH相适应的缓冲剂。作为缓冲液中使用的缓冲剂，可以列举例如三(羟甲基)氨基甲烷缓冲剂、磷酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、Good’s缓冲剂等。
作为Good’s缓冲剂，可以列举例如2-吗啉代乙烷磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N,-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、3-N-吗啉基-2-羟基丙烷磺酸(MOPSO)、N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、3-吗啉代丙烷磺酸(MOPS)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸(TES)、2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸(HEPES)、3-[N,N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙烷磺酸(DIPSO)、N-[三(羟甲基)甲基]-2-羟基-3-氨基丙烷磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N’-双(2-羟基丙烷磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-羟基丙烷磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、N-环己基-2-氨基乙烷磺酸(CHES)、N-环己基-3-氨基-2-羟基丙烷磺酸(CAPSO)、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸(CAPS)等。
缓冲液的浓度通常为0.001～2.0mol/L，优选为0.005～1.0mol/L。
作为稳定剂，可以列举例如乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化钙、乙酸钙、亚铁氰化钾、牛血清白蛋白(BSA)、聚氧乙烯类表面活性剂等。作为聚氧乙烯类表面活性剂，可以列举例如聚氧乙烯烷基苯基醚[市售品：ノニオンHS-240(日油公司制造)、トリトンX-405(西格玛奥德里奇公司制造)]等。作为防腐剂，可以列举例如叠氮化钠、抗生素等。作为盐类，可以列举例如氯化钠、硝酸钠、硫酸钠、碳酸钠、氯化钾、硝酸钾、硫酸钾、碳酸钾等。作为干涉物质消除剂，可以列举例如用于消除抗坏血酸的影响的抗坏血酸氧化酶等。作为有机溶剂，可以列举例如用于辅助无色型色原体在水性介质中溶解的二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二氧杂环己烷、丙酮、甲醇、乙醇等。
(3)含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂盒
本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂可以以试剂盒的形式保存、流通和使用。本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂盒在本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法中使用。作为本发明的测定试剂盒，可以列举例如双试剂型试剂盒、三试剂型试剂盒等，优选双试剂型试剂盒。
本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定试剂盒只要是能够实现本发明的含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白测定方法的试剂盒，则没有特别限制，在双试剂型试剂盒的情况下，可以列举例如包含含有蛋白质分解酶的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶、卤素氧化物和表面活性剂的第二试剂的试剂盒；包含含有蛋白质分解酶、卤素氧化物和表面活性剂的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶的第二试剂的试剂盒等。
此外，作为本发明的糖化血红蛋白测定试剂盒，可以列举在上述试剂盒的第一试剂、第二试剂中的任意一者或两者中含有过氧化氢测定试剂的试剂盒。特别是在使用含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂作为过氧化氢测定试剂的情况下，优选过氧化物酶和无色型色原体分别包含在各试剂中。即，优选过氧化物酶和无色型色原体分别包含在第一试剂和第二试剂中或者分别包含在第二试剂和第一试剂中。
构成本发明的测定试剂盒的试剂中的蛋白质分解酶的浓度通常为100～30000kU/L，优选为500～10000kU/L。构成本发明的测定试剂盒的试剂中的果糖基肽氧化酶的浓度通常为0.5～100kU/L，优选为1～50kU/L。
构成本发明的测定试剂盒的试剂中的卤素氧化物的浓度通常为0.005～20mmol/L，优选为0.01～10mmol/L。
构成本发明的测定试剂盒的试剂中的表面活性剂的浓度通常为0.0001～40%，优选为0.0005～20%。
以下，通过实施例更详细地对本发明进行说明，但这些实施例不对本发明的范围进行任何限定。
另外，本实施例、比较例和试验例中，使用下述制造商的试剂和酶。
ACES(同仁化学研究所公司制造)、ADA(同仁化学研究所公司制造)、乙酸钙一水合物(和光纯药工业公司制造)、氯化钠(和光纯药工业公司制造)、DA-67(和光纯药工业公司制造)、1-十二烷基吡啶
Figure BDA0000437521480000211
氯化物(C12py)[化合物(I)；东京化成公司制造]、1-鲸蜡基吡啶
Figure BDA0000437521480000212
氯化物(C16py)[化合物(I)；东京化成公司制造]、三丁基十二烷基溴化
Figure BDA0000437521480000213
(C12TBP)[化合物(II)；东京化成公司制造]、十四烷基三甲基氯化铵(C14TMA)[化合物(III)；东京化成公司制造]、碘酸钾(卤素氧化物；东京化成公司制造)、溴酸钾(卤素氧化物：东京化成公司制造)、高碘酸钾(卤素氧化物；东京化成公司制造)、ノニオンHS-240(聚氧乙烯烷基苯基醚；日油公司制造)、サーモリシン(蛋白质分解酶：大和化成公司制造)、FPOX-CE(果糖基肽氧化酶；龟甲万公司制造)、FPOX-CET(果糖基肽氧化酶：龟甲万公司制造)、过氧化物酶(东洋纺织公司制造)。
实施例1
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
Figure BDA0000437521480000222
实施例2
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
Figure BDA0000437521480000223
Figure BDA0000437521480000231
第二试剂
Figure BDA0000437521480000232
实施例3
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
Figure BDA0000437521480000233
第二试剂
Figure BDA0000437521480000234
实施例4
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
Figure BDA0000437521480000241
第二试剂
Figure BDA0000437521480000242
实施例5
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
Figure BDA0000437521480000244
Figure BDA0000437521480000251
实施例6
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
Figure BDA0000437521480000252
第二试剂
Figure BDA0000437521480000253
实施例7
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
Figure BDA0000437521480000261
第二试剂
Figure BDA0000437521480000262
实施例8
使用实施例1的试剂盒作为HbA1c测定试剂盒，使用来源于疑似患有糖尿病的10名受试者的全血作为试样，按照以下步骤确定各试样中的HbA1c浓度(量)相对于总血红蛋白浓度(量)的比例[HbA1c(%)]。
(1)用于确定总血红蛋白浓度的标准曲线的制作
使用总血红蛋白测定用试剂盒血红蛋白B-test wako(SLS-血红蛋白法)(和光纯药工业公司制造)作为测定试剂盒，使用血红蛋白B-testwako附带的标准品(血红蛋白浓度：15.3mg/mL)作为样本，制作表示血红蛋白浓度与吸光度的关系的标准曲线。
(2)用于确定HbA1c浓度的标准曲线的制作
由胶乳免疫凝集法和血细胞组分的总血红蛋白值，对于HbA1c浓度值为2.77μmol/L、6.33μmol/L的两个血细胞组分，使用实施例1的HbA1c测定试剂盒对各血细胞组分的吸光度进行测定。使用生理盐水代替该血细胞组分来测定吸光度，将从对该血细胞组分的各吸光度中减去对生理盐水的吸光度而算出的值作为对该血细胞组分的空白校正吸光度。根据对该血细胞组分的空白校正吸光度和对生理盐水的空白校正吸光度(0Abs)，制作表示HbA1c浓度(μmol/L)与吸光度之间的关系的标准曲线。
(3)各血细胞组分中的血红蛋白浓度的确定
对于各试样，在25℃下以3000rpm进行5分钟的离心分离，得到血细胞组分。对于各血细胞组分，使用血红蛋白B-test wako测定吸光度，由所得到的测定值和(1)的标准曲线确定各血细胞组分中的血红蛋白浓度(μmol/L)。
(4)各血细胞组分中的HbA1c浓度的确定
对于各血细胞组分，使用实施例1的测定试剂盒测定吸光度，由所得到的测定值和(2)的标准曲线确定各血细胞组分中的HbA1c浓度。
(5)HbA1c(%)(=HbA1c浓度相对于血红蛋白浓度的比例)的确定
通过下式由上述(3)中确定的各血细胞组分中的血红蛋白浓度(μmol/L)和上述(4)中确定的各血细胞组分中的HbA1c浓度(μmol/L)计算日本糖尿病学会(Japan Diabetes Society；JDS)值的HbA1c(%)。
HbA1c(%)=
[HbA1c浓度(μmol/L)]/[血红蛋白浓度(μmol/L)]×0.0963+1.62
(6)相同血细胞组分中的HbA1c(%)的通过免疫测定法的确定
使用与上述(5)中的HbA1c(%)的确定中使用的血细胞组分相同的血细胞组分，通过使用デタミナーL HbA1c(协和梅迪克斯公司制造)的免疫测定法，按照デタミナーL HbA1c的附带资料中记载的方法确定各血细胞组分中的HbA1c(%)。
(7)本发明的测定方法与免疫测定法的相关性
由使用本发明的测定方法在上述(5)中确定的HbA1c(%)和使用免疫测定法在上述(6)中确定的HbA1c(%)，验证本发明的测定方法与免疫测定法之间的相关关系，确定相关系数。
同样地，使用实施例2～7的测定试剂盒代替实施例1的测定试剂盒，确定与使用デタミナーL HbA1c(协和梅迪克斯公司制造)的测定之间的相关系数。将其结果示于表1中。
表1
试剂盒 相关系数
实施例1 0.979
实施例2 0.983
实施例3 0.977
实施例4 0.999
实施例5 0.996
实施例6 0.996
实施例7 0.996
如表I所示，确认到使用实施例1～7的测定试剂盒的本发明的测定方法与免疫测定法之间具有良好的相关关系。因此可知，通过使用实施例1～7的测定试剂盒的本发明的测定方法，能够准确且高灵敏度地测定试样中的HbA1c。
[比较例1]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
Figure BDA0000437521480000281
第二试剂
Figure BDA0000437521480000291
[比较例2]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
Figure BDA0000437521480000292
第二试剂
Figure BDA0000437521480000293
[比较例3]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
Figure BDA0000437521480000294
Figure BDA0000437521480000301
第二试剂
[比较例4]
制备由以下的第一试剂和第二试剂构成的HbA1c测定试剂盒。
第一试剂
第二试剂
Figure BDA0000437521480000304
[试验例1]卤素氧化物的效果～抑制血红蛋白浓度的影响
(1)溶血样本的制备
对于将人血液离心分离而得到的血细胞组分，使用血红蛋白测定试剂ネスコートヘモ试剂盒-N(Alfresa制药公司制造)测定吸光度，确定该血细胞组分的血红蛋白浓度。接着，将具有该值的该血细胞组分用纯水进行稀释而使其溶血，制备血红蛋白浓度为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL和10mg/mL的各溶血样本。
(2)溶血样本中的HbA1c(%)的确定
使用实施例1的试剂盒作为试剂盒，使用上述⑴中制备的溶血样本作为样本来进行测定，基于所得到的测定值，由实施例8的(2)中制作的表示HbA1c浓度(μmol/L)与吸光度之间的关系的标准曲线确定各样本中的HbA1c浓度(μmol/L)。
另一方面，对于相同的溶血样本，使用血红蛋白B-test wako测定吸光度，由所得到的测定值和实施例8的(1)中制作的标准曲线确定各样本中的血红蛋白浓度(μmol/L)。
通过下式由确定的各样本中的HbA1c浓度(μmol/L)和血红蛋白浓度(μmol/L)算出日本糖尿病学会(Japan Diabetes Society；JDS)值的HbA1c(%)。
HbA1c(%)=
[HbA1c浓度(μmol/L)]/[血红蛋白浓度(μmol/L)]×0.0963+1.62
使用实施例2～7和比较例1～4的各试剂盒代替实施例1的试剂盒作为试剂盒进行同样的测定，对于各试剂盒，测定各样本中的HbA1c(%)。将血红蛋白浓度为6mg/mL的样本中的HbA1c(%)作为基准0，计算各样本的HbA1c(%)与该基准的差值[△HbA1c(%)]。将其结果示于表2中。
表2
Figure BDA0000437521480000321
测定中使用的溶血样本由同一人血液制备得到，因此，HbA1c相对于总血红蛋白的比例(%)恒定而不依赖于血红蛋白浓度。因此，HbA1c(%)越接近于0，HbA1c测定方法越不受血红蛋白浓度的影响。由表2可知，与不含卤素氧化物的比较例的试剂盒相比，含有卤素氧化物的本发明的试剂盒不受血红蛋白浓度的影响。
[试验例2]卤素氧化物的效果(2)～高灵敏度测定
使用实施例1～3和比较例1的各试剂盒作为试剂盒，使用试验例1的(1)中制备的溶血样本作为样本，通过与试验例1同样的方法对于各试剂盒测定对各样本的反应吸光度。将其结果示于图1中。
同样地，使用实施例4和比较例2的各试剂盒作为试剂盒，使用试验例1的(1)中制备的溶血样本作为样本，通过与试验例1同样的方法对于各试剂盒测定对各样本的反应吸光度。将其结果示于图2中。
同样地，使用实施例5和比较例3的各试剂盒作为试剂盒，使用试验例1的(1)中制备的溶血样本作为样本，通过与试验例1同样的方法对于各试剂盒测定对各样本的反应吸光度。将其结果示于图3中。
同样地，使用实施例6和比较例4的各试剂盒作为试剂盒，使用试验例1的(1)中制备的溶血样本作为样本，通过与试验例1同样的方法对于各试剂盒测定对各样本的反应吸光度。将其结果示于图4中。
由图1～图4可知，对于本发明的试剂盒和比较例的试剂盒中的任意一种试剂盒而言，反应吸光度均与血红蛋白浓度成比例地上升，但在使用含有卤素氧化物的本发明的试剂盒的情况下，与使用不含卤素氧化物的比较例的试剂盒的情况相比，在相同浓度的血红蛋白的样本(即相同浓度的HbA1c的样本)中，反应吸光度更高。
如上所述，测定中使用的溶血样本由同一人血液制备得到，因此，HbA1c浓度依赖于血红蛋白浓度而升高，在相同浓度的HbA1c的样本中，反应吸光度越高，测定的灵敏度越高。
在使用实施例1～3的试剂盒的情况下，与使用比较例1的试剂盒的情况相比，在相同浓度的HbA1c的样本中，得到更高的反应吸光度。同样地，在使用实施例4、5、6的试剂盒的情况下，分别与使用比较例2、3、4的试剂盒的情况相比，在相同浓度的HbA1c的样本中，得到更高的反应吸光度。因此判明，使用含有卤素氧化物的本发明的试剂盒的测定方法与使用不含卤素氧化物的比较例的试剂盒的测定方法相比，能够进行高灵敏度的HbA1c测定。
产业上的可利用性
根据本发明，提供含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法、测定试剂和测定试剂盒，其可用于对糖尿病的诊断有用的糖化血红蛋白的测定等。

Claims (18)

1.一种含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白的测定方法，其特征在于，在表面活性剂存在下使蛋白质分解酶作用于含有血红蛋白的试样、然后使用果糖基肽氧化酶进行作用的反应中，在卤素氧化物存在下进行该反应，并对生成的过氧化氢进行测定。
2.如权利要求1所述的方法，其中，卤素氧化物为选自由碘酸或其盐、溴酸或其盐和高碘酸或其盐组成的组中的卤素氧化物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，表面活性剂为阳离子型表面活性剂。
4.如权利要求3所述的方法，其中，阳离子型表面活性剂为选自由下述通式(I)表示的吡啶
Figure FDA0000437521470000011
盐、下述通式(II)表示的
Figure FDA0000437521470000012
盐和下述通式(III)表示的季铵盐组成的组中的阳离子型表面活性剂，
Figure FDA0000437521470000013
式(I)中，R1表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，Ra表示氢原子、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，n表示1～5的整数，X-表示一价的阴离子，
Figure FDA0000437521470000014
式(II)中，R2～R5相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子，
Figure FDA0000437521470000021
式(III)中，R6～R9相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Z-表示一价的阴离子。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，过氧化氢的测定使用过氧化氢测定试剂进行。
6.如权利要求5所述的方法，其中，过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。
7.一种糖化血红蛋白测定试剂，用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白，其特征在于，含有蛋白质分解酶、果糖基肽氧化酶、卤素氧化物和表面活性剂。
8.如权利要求7所述的试剂，其中，卤素氧化物为选自由碘酸或其盐、溴酸或其盐和高碘酸或其盐组成的组中的卤素氧化物。
9.如权利要求7或8所述的试剂，其中，表面活性剂为阳离子型表面活性剂。
10.如权利要求9所述的试剂，其中，阳离子型表面活性剂为选自由下述通式(I)表示的吡啶
Figure FDA0000437521470000022
盐、下述通式(II)表示的盐和下述通式(III)表示的季铵盐组成的组中的阳离子型表面活性剂，
Figure FDA0000437521470000024
式(I)中，R1表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，Ra表示氢原子、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，n表示1～5的整数，X-表示一价的阴离子，
Figure FDA0000437521470000031
式(II)中，R2～R5相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子，
Figure FDA0000437521470000032
式(III)中，R6～R9相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Z-表示一价的阴离子。
11.如权利要求7～10中任一项所述的试剂，其中，还含有过氧化氢测定试剂。
12.如权利要求11所述的试剂，其中，过氧化氢测定试剂为含有过氧化物酶和无色型色原体的试剂。
13.一种糖化血红蛋白测定试剂盒，用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白，其特征在于，包含含有蛋白质分解酶、卤素氧化物和表面活性剂的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶的第二试剂。
14.一种糖化血红蛋白测定试剂盒，用于测定含有血红蛋白的试样中的糖化血红蛋白，其特征在于，包含含有蛋白质分解酶和表面活性剂的第一试剂以及含有果糖基肽氧化酶和卤素氧化物的第二试剂。
15.如权利要求13或14所述的试剂盒，其中，卤素氧化物为选自由碘酸或其盐、溴酸或其盐和高碘酸或其盐组成的组中的卤素氧化物。
16.如权利要求13～15中任一项所述的试剂盒，其中，表面活性剂为阳离子型表面活性剂。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其中，阳离子型表面活性剂为选自由下述通式(I)表示的吡啶
Figure FDA0000437521470000041
盐、下述通式(II)表示的
Figure FDA0000437521470000042
盐和下述通式(III)表示的季铵盐组成的组中的阳离子型表面活性剂，
式(I)中，R1表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，Ra表示氢原子、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基，n表示1～5的整数，X-表示一价的阴离子，
Figure FDA0000437521470000044
式(II)中，R2～R5相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Y-表示一价的阴离子，
Figure FDA0000437521470000045
式(III)中，R6～R9相同或不同，表示取代或未取代的烷基，Z-表示一价的阴离子。
18.如权利要求13～17中任一项所述的试剂盒，其中，在第一试剂和第二试剂中或者在第二试剂和第一试剂中还分别含有过氧化物酶和无色型色原体。
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