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CN110023503A - 血红蛋白的糖化率测定方法 - Google Patents

血红蛋白的糖化率测定方法 Download PDF

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CN110023503A
CN110023503A CN201780074037.0A CN201780074037A CN110023503A CN 110023503 A CN110023503 A CN 110023503A CN 201780074037 A CN201780074037 A CN 201780074037A CN 110023503 A CN110023503 A CN 110023503A
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glycosylated hemoglobin
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hemoglobin
ratio
acid
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CN201780074037.0A
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松尾美穗
前原志穗里
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Toyobo Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种糖化血红蛋白比率的测定方法，其包括以下的工序：使具有磺基的化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触的工序；使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样，生成过氧化氢的工序；使上述工序中生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物接触，生成显色色素的工序；测定上述工序中得到的显色色素的显色量的工序；和，将上述工序中得到的显色量代入校准曲线而计算糖化血红蛋白比率的工序，所述校准曲线是利用以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品预先制作的、糖化血红蛋白比率与显色量的校准曲线。

Description

血红蛋白的糖化率测定方法
技术领域
本发明涉及血红蛋白的糖化率的测定方法。更详细而言，涉及利用酶反应测定血液等生物试样中的糖化血红蛋白的比例的方法、和用于该方法的组合物。
背景技术
作为糖尿病的标志物之一，正在利用HbA1c等糖化血红蛋白。HbA1c是在血红蛋白的β链N末端的缬氨酸的氨基上键合有葡萄糖的糖化血红蛋白。在使用糖化血红蛋白作为糖尿病标志物时，算出血红蛋白的糖化率、即糖化血红蛋白浓度相对于总血红蛋白浓度的比率(后文也记作“糖化血红蛋白比率”。)并在诊断中使用。例如，HbA1c浓度相对于总血红蛋白浓度的比率(后文也记作“HbA1c比率”。)与血中的葡萄糖量相比，其量不会剧烈变动且与1～2个月前的血糖值相关性良好，因此作为糖尿病的指标是优异的。
目前，作为糖化血红蛋白比率的测定方法，高效液相色谱(HPLC)法、胶乳凝集免疫比浊法已经普及。HPLC法存在色谱柱价格高昂、另外处理能力低的问题。另外，胶乳凝集免疫比浊法存在会污染测定中所用的分析装置的反应槽、维护费工夫的问题。因此，解决了这些问题的酶法近年来得到关注、普及。
在测定糖化血红蛋白比率时，作为酶法的代表性方法为下述方法：通过非酶反应测定总血红蛋白浓度，另行通过酶反应测定糖化血红蛋白浓度后，由计算式算出糖化血红蛋白比率。
作为总血红蛋白浓度的测定方法，可列举作为国际标准法的氰化高铁血红蛋白法、氯化血红素法、碱性血红素法、氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法、Hb·red测量法或HbCO测量法等。
总血红蛋白浓度如下算出：使用浓度已知且总血红蛋白浓度不同的2种校准品制作总血红蛋白浓度的校准曲线，接着测定试样中的总血红蛋白量，使用上述校准曲线算出总血红蛋白浓度。
另一方面，糖化血红蛋白浓度测定方法为下述比色定量法：使氧化还原酶与糖化血红蛋白或其分解产物反应而生成过氧化氢，再使该过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物反应而测定显色量(专利文献1)。
糖化血红蛋白浓度如下算出：使用浓度已知且糖化血红蛋白浓度不同的2种校准品制作糖化血红蛋白浓度的校准曲线，接着测定试样中的糖化血红蛋白量，使用上述校准曲线算出糖化血红蛋白浓度。
例如，在选择HbA1c作为糖化血红蛋白的情况下，糖化HbA1c比率可以通过将上述反应中得到的总血红蛋白浓度、糖化血红蛋白浓度代入以下的计算式而算出。
HbA1c(NGSP)值
＝0.0915×HbA1c浓度(mmol/L)/总Hb浓度(mol/L)+2.15
HbA1c(JDS)值＝0.980×HbA1c(NGSP)值-0.245
因此，将基于酶法的HbA1c比率测定方法应用于自动分析仪的情况下，需要测定总血红蛋白的通道和测定HbA1c的通道这2通道，因此需要2通道量的试剂，变得烦杂。另外，由于进行2种测定，HbA1c比率的测定处理速度比使用1通道进行1种测定的方法低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4427137号
发明内容
发明要解决的问题
本发明是以所述现有技术的课题为背景作出的。即，本发明的目的在于，提供使用酶法测定糖化血红蛋白比率的方法的改进，使其更简便、更迅速和/或更准确；和/或，用于上述测定方法的校准品、试剂组合物等。
用于解决问题的方案
本发明人们进行了深入研究，结果发现，通过以下所示的手段可以解决上述课题，从而完成了本发明。虽然不希望被理论约束，但是推测：在本发明中，通过使具有磺基的化合物与血红蛋白接触从而使血红蛋白分子中所含的2价的铁离子被部分氧化，还原能力以规定的比例减弱，该还原能力减弱的血红蛋白会与其量相适应地使糖化氨基酸氧化酶等对于糖化血红蛋白的酶反应中所产生的过氧化氢的浓度降低，从而通过在过氧化物酶存在下的过氧化氢与显色底物的反应所得到的显色量、与糖化血红蛋白比率之间产生强相关关系。并且本发明人们还发现：对于该强相关关系而言，通过使用2个水平以上的以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品作为校准品、并且使它们的总血红蛋白浓度达到规定的比率，从而相关关系可进一步提高。
即，本发明包含以下的构成。
[项1]
一种糖化血红蛋白比率的测定方法，其包括以下的工序(1)～(5)：
工序(1)，使具有磺基的化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触；
工序(2)，使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样，生成过氧化氢；
工序(3)，使工序(2)中生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物接触，生成显色色素；
工序(4)，测定工序(3)中得到的显色色素的显色量；和，
工序(5)，将工序(4)中得到的显色量代入校准曲线，算出糖化血红蛋白比率，所述校准曲线是利用以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品预先制作的、糖化血红蛋白比率与显色量的校准曲线。
[项2]
根据项1所述的测定方法，其中，作为所述工序(5)中使用的糖化血红蛋白校准品，使用以2个水平以上的糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品，将测定结束时的反应液中的总血红蛋白浓度最低者设为1时，其他者的总血红蛋白浓度为其1倍～6倍的浓度。
[项3]
根据项1或2的测定方法，其还包括以下的工序(6)：
工序(6)，通过蛋白酶的作用，将糖化血红蛋白分解成糖化血红蛋白分解物。
[项4]
根据项1～3中任一项所述的测定方法，其还包括以下的工序(7)：
工序(7)，使包含糖化血红蛋白的试样溶血。
[项5]
根据项1～4中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(1)中使用的具有磺基的化合物为选自由苯磺酸、烷基磺酸、萘磺酸、磺基琥珀酸、苯并噻唑啉磺酸、蒽醌磺酸、樟脑磺酸、苯并噁二唑磺酸、和它们的衍生物、以及它们的盐组成的组中的至少1种化合物。
[项6]
根据项1～5中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(1)中使用的具有磺基的化合物为选自由十二烷基苯磺酸、3-氨基苯磺酸、烷基二苯基醚磺酸、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸、4-氨基-4’-硝基茋-2,2’-二磺酸、4,4’-二偶氮茋-2,2’-二磺酸、对氨基苯磺酸、5-磺基间苯二甲酸、5-氨基-2-氯甲苯-4-磺酸、烷基萘磺酸、2-萘磺酸、8-氨基-1-萘磺酸、十二烷基萘磺酸、磺基琥珀酸二-2-乙基己酯、二烷基磺基琥珀酸、和它们的盐组成的组中的至少1种化合物。
[项7]
根据项1～6中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为隐色型色原体。
[项8]
根据项1～7中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为吩噻嗪系的隐色型色原体。
[项9]
根据项1～8中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为选自由10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐、10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪、和10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪组成的组中的至少1种吩噻嗪系的隐色型色原体。
[项10]
根据项1～9中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐。
[项11]
根据项1～10中任一项所述的测定方法，其以1通道实施。
[项12]
一种糖化血红蛋白比率的测定试剂盒，其包含以下的试剂(a)～(e)：
试剂(a)，其含有具有磺基的化合物；
试剂(b)，其含有糖化氨基酸氧化酶；
试剂(c)，其含有过氧化物酶；
试剂(d)，其含有在过氧化物酶存在下与过氧化氢接触而生成显色色素的显色底物；和，
糖化血红蛋白校准品(e)，其以糖化血红蛋白比率定值。
[项13]
根据项12所述的测定试剂盒，其中，所述(e)的糖化血红蛋白校准品为以2个水平以上的糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品，且将测定结束时的反应液中的总血红蛋白浓度最低者设为1时，其他者的总血红蛋白浓度为其1倍～6倍的浓度。
[项14]
根据项12或13所述的测定试剂盒，其还包含以下的试剂(f)：
试剂(f)，其含有蛋白酶。
发明的效果
根据本发明，不再需要分别测定总血红蛋白浓度和糖化血红蛋白浓度并算出值、利用酶法测定糖化血红蛋白比率时在通用的自动分析仪中仅需要1通道就能进行更简便、更迅速和/或更准确的测定。
附图说明
图1示出实施例1中的、本发明的方法(应用校准曲线A的情况)与HPLC法的相关性数据。
图2示出实施例1中的、本发明的方法(应用校准曲线B的情况)与HPLC法的相关性数据。
图3示出实施例1中的、本发明的方法(应用校准曲线C的情况)与HPLC法的相关性数据。
图4示出实施例1中的、本发明的方法(应用校准曲线D的情况)与HPLC法的相关性数据。
图5示出实施例2中的、本发明的方法(使用表2记载的试剂A的情况)与HPLC法的相关性数据。
图6示出实施例2中的、本发明的方法(使用表2记载的试剂B的情况)与HPLC法的相关性数据。
图7示出实施例2中的、本发明的方法(使用表2记载的试剂C的情况)与HPLC法的相关性数据。
图8示出实施例2中的、本发明的方法(使用表2记载的试剂D的情况)与HPLC法的相关性数据。
图9示出实施例2中的、本发明的方法(使用表2记载的试剂E的情况)与HPLC法的相关性数据。
图10示出比较例1的方法(使用表2记载的试剂F的情况)与HPLC法的相关性数据。
图11示出比较例1的方法(使用表2记载的试剂G的情况)与HPLC法的相关性数据。
图12示出实施例3中的、本发明的方法(应用校准曲线E的情况)与HPLC法的相关性数据。
图13示出实施例3中的、本发明的方法(应用校准曲线F的情况)与HPLC法的相关性数据。
图14示出实施例3中的、本发明的方法(应用校准曲线G的情况)与HPLC法的相关性数据。
图15示出实施例3中的、本发明的方法(应用校准曲线H的情况)与HPLC法的相关性数据。
具体实施方式
关于本发明的实施方式，详细的说明如以下所述，但本发明不限定于此。需要说明的是，本说明书中记载的非专利文献及专利文献全部作为参考援引到本说明书中。另外，本说明书中的“～”表示“以上、以下”，例如说明书中记载为“★～☆”时表示“★以上、☆以下”。另外，本说明书中的“和/或”表示任一者或两者。
在本发明中，关于酶的活性，如果说明书中未记载，作为原则，关于市售品若在容器、随附的说明书·手册等中有测定方法、单位的记载则遵循该记载。另外，如果文献中有记载，则遵循该文献中记载的活性测定方法。
在活性的定义(测定方法)未知的情况、测定所需的试剂的获得存在限制的情况等中，基于本领域技术人员的常识合理地选择适宜底物并确定测定条件的基础上进行测定。
[1.糖化血红蛋白比率的测定方法]
本发明的实施方式之一为糖化血红蛋白比率的测定方法，其包括以下的工序(1)～(5)。
工序(1)，使具有磺基的化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触；
工序(2)，使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样，生成过氧化氢；
工序(3)，使工序(2)中生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物接触，生成显色色素；
工序(4)，测定工序(3)中得到的显色色素的显色量；
工序(5)，将工序(4)中得到的显色量代入校准曲线，算出糖化血红蛋白比率，所述校准曲线是利用以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品预先制作的糖化血红蛋白比率与显色量的校准曲线。
本发明的糖化血红蛋白比率的测定方法不需要分别测定总血红蛋白浓度和糖化血红蛋白浓度。因此，在通用的自动分析仪中仅需要1通道，能够进行更简便、更迅速、更准确的测定。
[1-1.关于测定对象、试样等]
成为本发明的糖化血红蛋白比率测定方法的测定对象的试样没有特别限定。例如，除了可以应用于全血、血浆、血清、血细胞等以外，还可以应用于尿、脊髓液等生物试样(即，由生物体收集的试样)、果汁等饮料、酱油、沙司等食品类等的试样。
成为本发明的测定方法的对象的糖化血红蛋白没有特别限定。例如，将在血红蛋白的β链上键合有糖类的物质称为血红蛋白A1，根据糖的种类进一步分级为A1a1、A1a2、A1b、A1c。一般将在血红蛋白的β链上键合有果糖1-6二磷酸的物质称为血红蛋白A1a1(HbA1a1)、将键合有葡萄糖-6-磷酸的物质称为血红蛋白A1a2(HbA1a2)、将键合有丙酮酸的物质称为血红蛋白A1b(HbA1b)、将键合有葡萄糖的物质称为血红蛋白A1c(HbA1c)。这些级分中，最多的是A1c分级(HbA1c)，被广泛作为糖尿病标志物使用。本发明中可以以上述的分级中的任一者为测定对象，优选为HbA1c。
本发明的方法可以用于糖尿病的诊断，因此对于上述中的全血试样、血细胞试样特别有用。并无特别限定，但是，在测定红细胞内的糖化血红蛋白的情况下，可以对全血直接进行溶血或对从全血中分离的红细胞进行溶血，将该溶血试样作为测定用的试样。
在制备测定用试样时，可以进行稀释操作。对于稀释液，可以使用纯化水，也可以使用Good’s缓冲液、磷酸盐缓冲液等缓冲液。可以包含氨基酸、酸化合物、皂甙、环糊精等糖类来作为稳定剂。此外，可以使用包含叠氮化钠、ProClin等防腐剂、EDTA等螯合剂、聚氧乙烯烷基醚类、月桂基三甲基铵盐、烷基甜菜碱等表面活性剂等任意成分的液体。
试样广义上也包含校准品。
作为校准品，并无特别限定，可列举全血、血细胞、将全血溶解于纯化水或试剂的液体、将血细胞溶解于纯化水或试剂的液体等。作为用于上述溶解的试剂，可以使用上述的出于制备测定用试样的目的而例示的纯化水或稀释液。这些优选进行冷藏或冷冻保存，其中优选冷冻保存。通过冷冻保存而冻结的校准品在使用时解冻来使用即可。
另外，作为校准品，还可以使用将上述的全血、血细胞、溶解液等冷冻干燥而得的产物。经冷冻干燥的校准品在使用时再溶解来使用即可。在上述再溶解时，可以使用例如上述的出于制备测定用试样的目的而例示的纯化水或稀释液。
[1-2.关于工序(7)、溶血等]
本发明的糖化血红蛋白比率的测定方法可以还包含以下的工序(7)。
工序(7)，使包含糖化血红蛋白的试样溶血
当包含糖化血红蛋白的试样包含全血或血细胞时，优选使用工序(7)。
例如，如前所述，工序(7)可以在工序(1)～(5)之前、在制备测定用的试样时实施。另外，工序(7)也可以在工序(2)～(5)之前与工序(1)同时进行。另外，也可以在实施工序(7)之后、且工序(2)～(5)之前进行工序(1)。
当考虑应用于自动分析仪时，也可以在制备测定用试样时不进行工序(7)、而是在添加试剂时进行工序(7)。这种情况下，优选在由最初的试剂添加开始的第一步骤中进行。
溶血是指红细胞膜被破坏的现象。正常的全血、使红细胞悬浮在生理盐水等等渗液的情况下不发烧溶血，而是观察到红色不透明的悬浮液，但是一旦发生溶血则血红蛋白漏出、变为红色透明的溶液。
溶血方法没有特别限制，可列举例如：将全血、血细胞悬浮于蒸馏水、低渗液来利用渗透压差破坏红细胞膜的方法；悬浮于包含表面活性剂的试剂而使红细胞膜溶解的方法；利用超声波的方法；利用冻结解冻的方法等。其中，从操作的简便性等理由出发，优选使用表面活性剂的方法或利用渗透压的差异的方法。
作为使用表面活性剂的上述溶血方法中所使用的表面活性剂，没有特别限定，可以使用例如聚氧乙烯-对叔辛基苯基醚(Triton系表面活性剂等)、聚氧乙烯-失水山梨醇-烷基酯(Tween系表面活性剂等)、聚氧乙烯-烷基醚(Brij系表面活性剂等)等非离子型表面活性剂，具体而言，可列举例如商品名TritonX-100、商品名Tween-20、商品名Brij35等。另外，还可以使用CHAPSO、CHAPS等两型表面活性剂、胆酸钠、脱氧胆酸钠等阴离子型表面活性剂、苄索氯铵等阳离子型表面活性剂。关于上述利用表面活性剂时的处理条件，通常，在处理溶液中的血细胞浓度为0.5～10体积％时，以上述处理溶液中的浓度为0.05～5重量％的方式添加上述表面活性剂并在室温下搅拌5秒～1分钟左右即可。
另外，在上述利用渗透压的差异的情况下，例如添加相对于全血的体积为2～100倍体积量的纯化水而使其溶血。
[1-3.关于工序(1)、具有磺基的化合物等]
工序(1)中，使具有磺基的化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触。
作为具有磺基的化合物，没有特别限定，可列举例如烷基磺酸和其盐或它们的衍生物、苯磺酸和其盐或它们的衍生物、萘磺酸和其盐或它们的衍生物、磺基琥珀酸和其盐或它们的衍生物、苯并噻唑啉磺酸和其盐或它们的衍生物、蒽醌磺酸和其盐或它们的衍生物、樟脑磺酸和其盐或它们的衍生物、苯并噁二唑磺酸和其盐或它们的衍生物等。在本发明中，从可以更加有效地得到糖化血红蛋白比率的观点出发，优选为使用苯磺酸、萘磺酸、磺基琥珀酸、和它们的衍生物、以及它们的盐，更优选使用苯磺酸及其衍生物、以及它们的盐。在此，盐的种类没有限定，可以列举例如钠盐、钾盐等，优选为钠盐。
烷基磺酸、其盐或它们的衍生物没有特别限定，作为具体的例子，可列举月桂基硫酸钠、月桂基硫酸锂等。
苯磺酸、其盐或它们的衍生物没有特别限定，作为具体的例子，可列举十二烷基苯磺酸钠、3-氨基苯磺酸、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸钠、4-氨基-4’-硝基茋-2,2’-二磺酸二钠、4,4’-二偶氮茋-2,2’-二磺酸二钠、对氨基苯磺酸、5-磺基间苯二酸一钠、5-氨基-2-氯甲苯-4-磺酸、烷基二苯基醚磺酸钠等。优选的是，苯磺酸、其衍生物、或它们的盐为十二烷基苯磺酸、3-氨基苯磺酸、烷基二苯基醚磺酸、和它们的衍生物、以及它们的盐。
萘磺酸、其盐或它们的衍生物没有特别限定，作为具体的例子，可列举：烷基萘磺酸钠、2-萘磺酸钠、8-氨基-1-萘磺酸、十二烷基萘磺酸钠等。优选烷基萘磺酸、及其衍生物、以及它们的盐。
磺基琥珀酸、其盐或它们的衍生物没有特别限定，作为具体的例子，可列举磺基琥珀酸二-2-乙基己酯钠、二烷基磺基琥珀酸钠等作为优选的例子。
樟脑磺酸、其盐或它们的衍生物没有特别限定，作为具体的例子，可列举(±)-10-樟脑磺酸。
苯并噁二唑磺酸、其盐或它们的衍生物没有特别限定，作为具体的例子，可列举4-氯-7-氯磺酰基-2,1,3-苯并噁二唑。
上述中，特别优选月桂基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、磺基琥珀酸二-2-乙基己酯钠、烷基二苯基醚磺酸钠，其中优选烷基二苯基醚磺酸钠。
上述化合物的添加浓度没有特别限定，在处理溶液中的血细胞浓度为0.01～10体积％时，优选按照上述处理溶液中的浓度为0.05～5重量％的方式来添加。
例如，在同时进行工序(1)与工序(7)的情况下，可以用包含0.25～1体积％的上述化合物的试剂来进行。另外，例如在同时进行工序(1)与工序(2)的情况下，可以用包含0.1～3体积％的上述化合物的试剂来进行。
工序(1)中，使上述化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触的方法没有特别限定。例如，可以在制备试样时向包含糖化血红蛋白的试样中添加添加剂。
这种情况下，工序(1)既可以与工序(7)同时进行，也可以接着工序(7)而进行。另外，可使工序(1)和工序(2)同时进行。
当考虑应用于自动分析仪时，工序(1)所需的试剂成分可以与使工序(3)所需的试剂成分全部备齐的试剂添加步骤同时、或通过更靠前的试剂添加步骤而备齐。例如，在应用于能够设定2阶段的试剂添加步骤的自动分析仪时，工序(1)所需的试剂成分可以通过由最初的试剂添加开始的第一步骤来供给。
[1-4.关于工序(2)、糖化氨基酸氧化酶等]
工序(2)中，使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样，生成过氧化氢。
本说明书中，糖化氨基酸氧化酶是指：可催化将Amadori化合物氧化而生成过氧化氢的反应的酶。糖化氨基酸氧化酶有时也被称为果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶、Amadori酶、酮胺氧化酶、糖化六肽氧化酶、糖化血红蛋白氧化酶等。
作为上述的Amadori化合物，可列举例如：作为糖化蛋白质的一种的糖化血红蛋白、作为糖化血红蛋白分解物的一种的糖化二肽(例如已知有α-果糖基缬氨酰组氨酸。)、作为糖化血红蛋白分解物的一种的糖化六肽(例如已知有α-果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸。)、作为糖化血红蛋白分解物的一种的糖化氨基酸等。
本发明的方法中使用的糖化氨基酸氧化酶没有特别限定。例如，作为公知的糖化氨基酸氧化酶，可以使用来自锥毛毛壳(Achaetomiella)属、无毛毛壳(Achaetomium)属、梭孢壳(Thielavia)属、毛壳(Chaetomium)属、五谷麻孢壳(Gelasinospora)属、小囊菌(Microascus)、锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢菌(Pyrenochaeta)属、节菱孢菌(Arthrinium)属、弯孢菌(Curvularia)属、新赤壳菌(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、翘孢霉(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌(Fusarium)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、蛇孢腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、闭毛孢壳(Coniochaetidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、节杆菌(Arthrobacter)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属的酶及其改变体等。
作为糖化六肽会反应的糖化氨基酸氧化酶，没有特别限定，可列举WO08/108385中作为糖化六肽氧化酶示出的酶。
另外，作为与糖化蛋白质反应的糖化氨基酸氧化酶，没有特别限定，可列举WO2015/005257、WO2015/005258中作为糖化血红蛋白氧化酶而例示的酶、WO2015/060429中作为Amadori酶而例示的酶等。
另外，市售的酶中，可以使用FPO-301(商标)(东洋纺)、FPOX-CE(商标)(KIKKOMAN)、FPOX-EE(商标)(KIKKOMAN)等。
需要说明的是，即使是现在不能用于本申请发明的糖化氨基酸氧化酶，将来通过基因工程学或化学等方法加以改变从而具有上述特性的改良酶也可以用于本申请发明。或者，将来新得到的具有上述特性的糖化氨基酸氧化酶也可以用于本申请发明。并且，使用这类糖化氨基酸氧化酶构建的糖化血红蛋白比率的测定体系也包含在本申请发明的技术思想中。
使糖化氨基酸氧化酶进行作用的条件只要是所使用的糖化氨基酸氧化酶作用于测定对象的糖化肽、糖化血红蛋白、它们的分解产物并生成过氧化氢的条件，则可以为任意条件。
所使用的糖化氨基酸氧化酶的量根据试样中所含的测定对象物的含量或处理条件等适当选择。例如，作为一例，按照测定结束时反应液中的浓度为0.1KU/L以上(优选为1KU/L以上、进一步优选为2KU/L以上、进一步优选为3KU/L以上)且测定结束时反应液中的浓度为100KU/L以下(优选为50KU/L以下、进一步优选为20KU/L以下、进一步优选为10KU/L以下、进一步优选为5KU/L以下)的方式添加糖化氨基酸氧化酶。
使糖化氨基酸氧化酶进行作用时的pH可以不进行调节，也可以调节为所使用的酶适合作用的pH，例如，可以用适当的pH调节剂、例如盐酸、乙酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾等调节到反应液中的pH为2以上(优选为3以上、进一步优选为4以上、进一步优选为5以上)且反应液中的pH为9以下(优选为8.5以下、进一步优选为8以下)。
关于使糖化氨基酸氧化酶进行作用的温度，例如，可以在反应液中按照为20℃以上(优选为30℃以上、进一步优选为35℃以上)且在反应液中按照为70℃以下(优选为60℃以下、进一步优选为50℃以下、进一步优选为40℃以下)的方式来进行。
此时的作用时间只要为足以作用于测定对象的糖化肽、糖化血红蛋白、其分解产物而生成过氧化氢的时间即可，例如可以按照为5秒以上(优选为1分钟以上、进一步优选为3分钟以上)且180分钟以下(优选为60分钟以下、进一步优选为10分钟以下)的方式来进行。
另外，在使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样时，可以出于为了提高作用性等目的而使表面活性剂等改性剂共存。
工序(2)中，使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样的方法没有特别限定。例如，可以向包含糖化血红蛋白的试样添加糖化氨基酸氧化酶。
这种情况下，可以如工序(1)的说明所述那样同时进行工序(1)和工序(2)。因此，工序(2)可以与工序(7)同时进行，也可以接着工序(7)而进行。
当考虑应用于自动分析仪时，工序(2)所需的试剂成分可以与使工序(3)所需的试剂成分全部备齐的试剂添加步骤同时、或通过更靠前的试剂添加步骤而备齐。例如在应用于能够设定2阶段的试剂添加步骤的自动分析仪时，工序(2)所需的试剂成分可以按照通过由最初的试剂添加开始的第一步骤备齐的方式供给(例如在构建后述的“消除体系”时优选该方式。)，也可以按照通过第二步骤备齐的方式供给。在按照通过第二步骤备齐的方式供给的情况下，工序(2)所需的试剂成分可以分成第一步骤和第二步骤而供给。
另外，例如在应用于仅能设定1阶段的试剂添加步骤的自动分析仪时，可以将工序(2)所需的试剂成分和工序(3)所需的试剂成分通过同一步骤供给。
需要说明的是，关于应用于能够设定3阶段以上的试剂添加步骤的自动分析仪，考虑上述原则确定适当的试剂供给方法即可。
[1-5.关于工序(6)、蛋白酶等]
工序(2)中使用的上述糖化氨基酸氧化酶对糖化蛋白质的反应性弱或几乎无反应性时，可以还包括以下的工序(6)。
工序(6)，通过蛋白酶的作用，将糖化血红蛋白分解成糖化血红蛋白分解物。
本说明书中，蛋白酶是指能够作用于糖化血红蛋白、催化分解为糖化血红蛋白分解物的反应的酶。蛋白酶有时也被称为肽酶、蛋白水解酶等。
作为上述的糖化血红蛋白分解物，只要是糖化血红蛋白被蛋白酶碎片化为糖化氨基酸和/或糖化肽的产物则没有特别限定。碎片的大小也没有特别限定。可列举例如糖化二肽(例如α-果糖基缬氨酰组氨酸)、糖化六肽(例如α-果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸)或糖化氨基酸等。
本发明的方法中使用的蛋白酶没有特别限定，可例示氨肽酶、二肽酶、二肽基肽酶、三肽基肽酶、肽基二肽酶、丝氨酸羧肽酶、脯氨酸羧肽酶、丙氨酸羧肽酶、金属蛋白酶、半胱氨酸羧肽酶、ω-肽酶(日语：オメガペプチターゼ)、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、苏氨酸内肽酶等。
这些蛋白酶可以直接使用市售品，也可以使用按照公知文献的记载而制造的该文献中记载的蛋白酶。还可以将这些蛋白酶中的2种以上组合使用。
从稳定性、反应速度(比活性)、入手的容易性等出发，本发明中使用的蛋白酶优选为以下蛋白酶。
可以使用金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸羧肽酶、蛋白水解酶K、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来自猪胰脏的胰蛋白酶、来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)的蛋白酶、来自米曲霉(Aspegillus oryzae)的蛋白酶、来自斋藤曲霉(Aspegillus saitoi)的蛋白酶、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶等。
作为市售品，可列举例如：蛋白酶A“Amano”G(Amano Enzyme)、蛋白酶M“Amano”G(Amano Enzyme)、蛋白酶S“Amano”G(Amano Enzyme)、蛋白酶N“Amano”(Amano Enzyme)、肽酶R(Amano Enzyme)、木瓜蛋白酶M-40(Amano Enzyme)、嗜热菌蛋白酶(大和化成)、Thermoase PC10(大和化成)、Toyo Team(东洋纺)、链霉蛋白酶(罗氏)、来自芽孢杆菌的蛋白酶(Sigma-Aldrich)、来自灰色链霉菌的XIV型蛋白酶(Sigma-Aldrich)、来自灰色链霉菌的XXI型蛋白酶(Sigma-Aldrich)、Actinase E(科研制药)、蛋白内切酶Glu-C(罗氏)。
需要说明的是，即使是现在不能用于本申请发明的蛋白酶，将来通过基因工程学或化学等方法加以改变从而具有上述特性的改良酶也可以用于本申请发明。或者，将来新得到的具有上述特性的蛋白酶也可以用于本申请发明。并且，使用这类蛋白酶构建的糖化血红蛋白比率的测定体系也包含在本申请发明的技术思想中。
使蛋白酶作用于糖化血红蛋白的条件只要是所使用的蛋白酶作用于测定对象的糖化血红蛋白并分解为糖化血红蛋白分解物的条件，则可以为任意条件。
所使用的蛋白酶的量根据试样中所含的测定对象物的含量或处理条件等适当选择，例如，作为一例，按照测定结束时反应液中的浓度为0.01KU/L以上、一般为0.1KU/L以上、更一般为50KU/L以上(优选为100KU/L以上、进一步优选为300KU/L以上、进一步优选为500KU/L以上)且测定结束时反应液中的浓度为2000KU/L以下(优选为1800KU/L以下、进一步优选为1500KU/L以下、进一步优选为1300KU/L以下)的方式添加蛋白酶。
使蛋白酶进行作用时的pH可以不进行调节，也可以调节为所使用的蛋白酶适合进行作用的pH，例如，可以用适当的pH调节剂、例如盐酸、乙酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾等调节到反应液中的pH为2以上(优选为3以上、进一步优选为4以上、进一步优选为5以上)且反应液中的pH为9以下(优选为8.5以下、进一步优选为8以下)。
关于使蛋白酶进行作用的温度，例如，可以在反应液中按照为20℃以上(优选为30℃以上、进一步优选为35℃以上)且在反应液中按照为70℃以下(优选为60℃以下、进一步优选为50℃以下、进一步优选为40℃以下)的方式来进行。
此时的处理时间只要为足以作用于测定对象的糖化血红蛋白而分解为糖化血红蛋白分解物的时间即可，例如可以按照为5秒以上(优选为1分钟以上、进一步优选为3分钟以上)且为180分钟以下(优选为60分钟以下、进一步优选为10分钟以下)的方式来进行。
工序(6)中，使蛋白酶作用于糖化血红蛋白的方法没有特别限定。例如，可以向包含糖化血红蛋白的试样中添加蛋白酶。
当考虑应用于自动分析仪时，构建消除体系和不构建消除体系的情况下，工序(6)的实施步骤的设定的考虑方式是不同的，所述消除体系是指如下测定体系(以下记作“消除体系”)：为了排除与测定对象共存的作为非测定对象物的糖化氨基酸的影响，预先添加糖化氨基酸氧化酶而消除作为非测定对象物的糖化氨基酸(消除反应)，然后开始进行作为测定对象物的糖化血红蛋白的主反应。
在不构建消除体系的情况下，工序(6)所需的试剂成分可以与使工序(2)所需的试剂成分全部备齐的试剂添加步骤同时、或通过更靠前的试剂添加步骤而备齐。例如，在应用于能够设定2阶段的试剂添加步骤的自动分析仪时，工序(6)所需的试剂成分可以通过由最初的试剂添加开始的第一步骤备齐的方式供给，也可以按照通过第二步骤备齐的方式供给。在按照通过第二步骤备齐的方式供给的情况下，工序(6)所需的试剂成分可以分成第一步骤和第二步骤而供给。
另外，例如在应用于仅能设定1阶段的试剂添加步骤的自动分析仪时，可以将工序(6)所需的试剂成分和工序(2)所需的试剂成分通过同一步骤供给。
另一方面，在构建消除体系的情况下，在应用于能够设定2阶段的试剂添加步骤的自动分析仪时，在第一步骤中进行消除反应，在第二步骤中进行主反应，因此工序(6)所需的试剂成分的备齐是在第二步骤，此时，将工序(6)所需的试剂成分和工序(2)所需的试剂成分两者全部备齐即可。另外，这种情况下，工序(6)所需的试剂成分可以分成第一步骤和第二步骤而供给，另外，工序(2)所需的试剂成分可以分成第一步骤和第二步骤而供给。
需要说明的是，关于应用于能够设定3阶段以上的试剂添加步骤的自动分析仪，考虑上述原则确定适当的试剂供给方法即可。
[1-6.关于工序(3)、过氧化物酶、显色底物等]
工序(3)中，使工序(2)中生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物接触，生成显色色素。
作为本发明的方法中使用的过氧化物酶，只要是能够使过氧化氢与显色底物接触而生成显色色素的过氧化物酶则没有特别限定，作为优选的过氧化物酶，可列举来自辣根、微生物等的过氧化物酶。其中优选来自辣根的过氧化物酶。上述过氧化物酶可以通过商业手段获得高纯度且价格低廉的产品。
作为上述显色底物，只要是在过氧化物酶的存在下与过氧化氢反应单独生成色素的色原体则没有特别限定。作为这样的色原体，可列举隐色型色原体、三苯基甲烷衍生物、吩噻嗪衍生物、二苯基胺衍生物等。优选使用隐色型色原体，更优选使用吩噻嗪系的隐色型色原体。
具体可列举：N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠盐(简称为DA-64。)、10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐(简称为DA-67。)、10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(简称为CCAP。)、10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(简称为MCDP。)、4,4’-双(二甲氨基)二苯基胺、双〔3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基〕胺(简称为BCMA。)、N,N,N’,N’,N”,N”-六-3-磺丙基-4,4’,4”-三氨基三苯基甲烷(简称为TPM-PS。)、4,4’-亚苄基双(N,N-二甲基苯胺)等。
从不易受到来自被检体的共存物的影响的角度出发，优选DA-64，从灵敏度方面出发，优选DA-67。在本发明中，从可以更加有效地得到糖化血红蛋白比率的观点出发，较佳的是优选使用DA-67(10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐)、CCAP(10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪)、MCDP(10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪)等的吩噻嗪系的隐色型色原体，其中，较佳的是优选使用DA-67(10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐)。
所使用的显色底物的量根据试样中所含的测定对象物的含量或处理条件等适当选择，例如，作为一例，按照测定结束时反应液中的浓度为0.001mmol/L以上(优选为0.003mmol/L以上、进一步优选为0.005mmol/L以上)且测定结束时反应液中的浓度为10mmol/L以下(优选为1mmol/L以下、进一步优选为0.1mmol/L以下、进一步优选为0.05mmol/L以下)的方式添加10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐。在使用其它显色底物时、特别是使用吩噻嗪系的隐色型色原体作为显色底物的情况下，也可以以与上述同样的浓度来使用。
工序(3)中，使过氧化物酶进行作用的条件只要是所使用的过氧化物酶作用于过氧化氢及显色底物而生成显色色素的条件，则可以为任意条件。
所使用的过氧化物酶的量根据试样中所含的测定对象物的含量或处理条件等适当选择，例如，作为一例，按照测定结束时反应液中的浓度为0.1KU/L以上(优选为1KU/L以上、进一步优选为2KU/L以上、进一步优选为3KU/L以上)且测定结束时反应液中的浓度为100KU/L以下(优选为50KU/L以下、更优选为30KU/L以下、进一步优选为20KU/L以下、进一步优选为10KU/L以下)的方式添加过氧化物酶。
使过氧化物酶进行作用时的pH可以不进行调节，也可以调节为所使用的过氧化物酶适合进行作用的pH，例如，可以用适当的pH调节剂、例如盐酸、乙酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾等调节到反应液的pH为2以上(优选为3以上、进一步优选为4以上、进一步优选为5以上)且反应液的pH为9以下(优选为8.5以下、进一步优选为8以下)。
关于使过氧化物酶进行作用的温度，例如，可以在反应液中按照为20℃以上(优选为30℃以上、进一步优选为35℃以上)且在反应液中为70℃以下(优选为60℃以下、进一步优选为50℃以下、进一步优选为40℃以下)的方式来进行。
此时的处理时间只要为足以使过氧化物酶作用于过氧化氢及显色底物而生成显色色素的时间即可，例如可以按照为5秒以上(优选为1分钟以上、进一步优选为3分钟以上)且为180分钟以下(优选为60分钟以下、进一步优选为10分钟以下)的方式来进行。
工序(3)中，使过氧化物酶作用于过氧化氢及显色底物而生成显色色素的方法没有特别限定。例如，可以向通过工序(2)的反应而生成了(或预期生成了)过氧化氢的反应液中添加过氧化物酶。
当考虑应用于自动分析仪时，工序(3)所需的试剂成分可以与使工序(2)所需的试剂成分全部备齐的试剂添加步骤同时、或通过靠后的试剂添加步骤而备齐。例如在应用于能够设定2阶段的试剂添加步骤的自动分析仪时，工序(3)所需的试剂成分可以按照通过由最初的试剂添加开始的第一步骤备齐的方式供给，也可以按照通过第二步骤备齐的方式供给。在按照通过第二步骤备齐的方式供给的情况下，工序(3)所需的试剂成分可以分成第一步骤和第二步骤而供给。
另外，例如在应用于仅能设定1阶段的试剂添加步骤的自动分析仪时，可以将工序(3)所需的试剂成分和工序(2)所需的试剂成分通过同一步骤供给。
需要说明的是，关于应用于能够设定3阶段以上的试剂添加步骤的自动分析仪，考虑上述原则确定适当的试剂供给方法即可。
[1-7.关于工序(4)、显色量的测定等]
工序(4)，测定工序(3)中得到的显色色素的显色量。
关于显色量的测定，在工序(3)开始后的适当的时间范围内，对起因于使过氧化物酶作用于过氧化氢及显色底物而显色的色素量的吸光度变化量进行测定。
吸光度的测定波长没有特别限定，适合于测定的波长根据色素而不同。例如在使用10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐作为显色底物时，优选从600nm至700nm的范围中选择。作为一例，可以测定660nm的吸光度。
在使用N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠盐作为显色底物时，优选从650nm至750nm的范围中选择。作为一例，可以测定727nm的吸光度。
在使用10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪作为显色底物时，优选从600nm至700nm的范围中选择。作为一例，可以测定660nm的吸光度。
在使用10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪作为显色底物时，优选从600nm至700nm的范围中选择。作为一例，可以测定660nm的吸光度。
在使用4,4’-双(二甲氨基)二苯基胺、双〔3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基〕胺作为显色底物时，优选从700nm至800nm的范围中选择。作为一例，可以测定750nm的吸光度。
在使用N,N,N’,N’,N”,N”-六-3-磺丙基-4,4’,4”-三氨基三苯基甲烷作为显色底物时，优选从550nm至650nm的范围中选择。作为一例，可以测定591nm的吸光度。
在使用4,4’-亚苄基双(N,N-二甲基苯胺)作为显色底物时，优选从550nm至650nm的范围中选择。作为一例，可以测定617nm的吸光度。
在使用4,4’-双(二甲氨基)二苯基胺作为显色底物时，优选从650nm至750nm的范围中选择。作为一例，可以测定700nm的吸光度。
在能够设定2阶段的试剂添加步骤的自动分析仪的情况下，例如可以通过测定运行第二步骤期间的任一时间范围内的吸光度变化量来进行测定。作为上述时机，没有特别限定，例如，可以在第二试剂刚添加后和第二试剂添加起经过一定时间后(例如经过60秒时起至经过600秒时的期间的任意时机、优选为300秒后)的时刻分别测定吸光度，由其差求出吸光度变化量。此外，还可以使用各种公知的吸光度变化量测定法(例如1点终点法、2点终点法、速率法等)。这些方法可以按照各自动分析仪的操作说明书适当设定。
[1-8.关于工序(5)、校准品、校准方法等]
工序(5)中，将工序(4)中得到的显色量代入校准曲线，算出糖化血红蛋白比率，所述校准曲线是利用以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品预先制作的糖化血红蛋白比率与显色量的校准曲线。作为典型的校准曲线，可列举x轴取糖化血红蛋白比率、y轴取显色量的方式。
校准是指如下手段：使用作为目标的测定项目值(例如本发明中为上述糖化血红蛋白比率)与测定值(例如本发明中为上述显色量)的关系已知的校准品预先制作标准曲线(校准曲线)，将试样的测定值代入该标准曲线而得到该试样的测定项目值。校准品有时也被称为标准试剂、标准液、校正用试剂。
本发明中使用的校准品的基础组成没有特别限定。例如，可以使用来自人血液的成分，也可以使用人工制作的成分。如果为来自人血液的物质，则可以使用全血，也可以分离出血细胞等部分成分而使用。
另外，这些校准品的形态可以是冷冻干燥、液态、冷冻等，在不损害各功能的范围内没有特别限定。
本发明中使用的校准品的溶剂没有特别限定，可以使用蒸馏水、缓冲液。可列举例如Good’s缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液等、酒石酸盐缓冲液等。
本发明中使用的校准品中，可以根据需要使用各种抗菌剂及防腐剂。作为防腐剂，可列举各种ProClin(注册商标、Supelco公司)、叠氮化物、螯合剂、抗生素、抗菌剂等。作为螯合剂，可列举乙二胺四乙酸及其盐等。作为抗生素，可列举庆大霉素、卡那霉素、氯霉素等。作为抗菌剂，可列举哌拉西林、咪唑烷基脲等。
本发明中使用的校准品中，可以根据需要(例如作为稳定剂)使用各种糖类、盐类、蛋白质类。
作为盐类，没有特别限定，可列举氯化钠、乙酸钠、氢氧化钠、氯化钾、乙酸钾、氢氧化钾、氯化铝、乙酸铝、氢氧化铝、氯化钙、乙酸钙、氢氧化钙等。
作为糖类，没有特别限定，可列举蔗糖、海藻糖、环糊精、甘油、葡糖酸盐、氨基酸等。
作为蛋白质类，没有特别限定，可以添加血清白蛋白类、球蛋白类或纤维蛋白类等非活性蛋白质。优选的蛋白质为牛血清白蛋白。
本发明中使用的校准品中，可以根据需要(例如出于避免来自试样的还原物质的影响、血红蛋白的高铁化、促进蛋白酶反应等的目的)添加亚铁氰化钾等亚铁氰化物、亚硝酸钠等亚硝酸盐类，也可以不添加。
本发明中使用的校准品中，可以根据需要使用表面活性剂。本发明中可以使用的表面活性剂没有特别限定。例如，可以使用非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂和/或阳离子型表面活性剂和/或阴离子型表面活性剂。
作为非离子表面活性剂，没有特别限定，可列举例如：聚氧乙烯烷基醚、脂肪酸失水山梨醇酯、烷基聚葡糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺、烷基单甘油醚等。
作为两性离子表面活性剂，没有特别限定，可列举例如：烷基二甲基胺氧化物、烷基羧基甜菜碱等。
作为阳离子型表面活性剂，没有特别限定，可列举：苯扎氯铵、二硬脂基二甲基氯化铵、椰油胺乙酸盐、硬脂胺乙酸盐等。
作为阴离子型表面活性剂，没有特别限定，可列举烯基琥珀酸二钾等。
本发明中使用的校准品中可以使用的添加剂中的一部分还可以同时具有作为阴离子型表面活性剂的功能。
上述各成分(存在于试剂中的酶、显色底物、表面活性剂及其它成分)的浓度·条件等可以根据所使用的试剂·酶等的种类、并且考虑反应性和/或稳定性等适当确定。
上述确定并非必需为最优解，只要根据目的、状况而关于糖化血红蛋白比率的测定可确保实用上充分的性能就没问题。
本发明中使用的校准品已用糖化血红蛋白比率定值。通常使用将人血液集中、并且利用各种测定方法进行了糖化血红蛋白比率的定值的校准品，也可以将血红蛋白等蛋白质、氨基酸的人工糖化物、其分解产物添加到上述混合血清(pooled serum)等中来调整糖化血红蛋白比率。
本发明中使用的校准品的糖化血红蛋白比率的定值可以使用IFCC、NGSP等标准物质通过HPLC法、酶法、胶乳免疫法等各种测定方法进行。
血红蛋白浓度可以通过氰化高铁血红蛋白法、氯化血红素法、碱性血红素法、氧合血红蛋白法、SLS-血红蛋白法等、Hb·red测量法、HbCO测量法等各种测定方法来测定。
本说明书中，优选按照使用Drabkin试剂的氰化高铁血红蛋白法进行。具体而言为下述方法：制备Drabkin试剂(将铁氰化钾200mg，氰化钾50mg及碳酸氢钠1.0g溶解于蒸馏水并定容到1L而成)，然后向试管中加入Drabkin试液4.5ml和样品0.5ml，混和后在室温下放置20分钟，在540nm下测定生成的氰基高铁血红蛋白的吸光度。
本发明中使用的校准品的定值水平数只要为2个水平以上(即，糖化血红蛋白比率不同的2种以上)则没有特别限定。优选为2个水平，但也可以为3个水平以上的多水平(优选为5个水平以下)。例如，在使用2个水平的经定值的校准品的情况下，校准时，除了该校准品以外还可以使用纯化水、缓冲液等不含糖化血红蛋白的试样代替校准品，而进行包括校准品的2个水平在内的3个水平的校准。
优选2个水平的理由在于，水平越多则所使用的试剂量越增加，也费工夫。
当本发明中使用的校准品的糖化血红蛋白比率为2个水平时，则成为低浓度和高浓度这2种，期望低浓度为3％～7％、高浓度为8％～20％，更期望低浓度为3％～6％、高浓度为8％～20％。进一步期望低浓度为3％～6％、高浓度为10％～20％，进一步更期望低浓度为3％～5.5％、高浓度为10％～20％，其中期望低浓度为3％～5％、高浓度为10％～20％，尤其期望低浓度为3％～5％、高浓度为10％～18％。
优选本发明中使用的校准品为2个水平以上的以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品、并且将测定结束时的反应液中的总血红蛋白浓度最低者设为1时，其它者(其余全部)的总血红蛋白浓度为其1倍～6倍左右，更优选为其1倍～5倍左右，进一步优选为其1～4倍左右，进一步优选为其1～3.5倍左右，尤其优选为其1～3倍左右。进一步优选为1倍～2.5倍左右，进一步优选为1倍～2倍左右，进一步优选为1倍～1.5倍左右，特别优选1倍(等浓度)左右。
需要说明的是，总血红蛋白浓度的高低顺序与糖化血红蛋白比率的高低顺序可以无关。例如，在糖化血红蛋白比率为低浓度、中浓度、高浓度的3个水平的校准品时，其总血红蛋白浓度最高者可以是任一者，最低者也可以是任一者。从得到更良好的相关关系的倾向高的观点出发，优选使糖化血红蛋白比率低者的总血红蛋白浓度也低、使糖化血红蛋白比率高者的总血红蛋白浓度也高。
本发明中使用的校准品，可以使用按照在使用时可稀释为满足上述总血红蛋白浓度的比率的方式制作的校准品。
本发明中使用的校准品的总血红蛋白浓度的绝对值没有特别限定，优选可以设定为使测定结束时反应液中的浓度为0.1μmol/L以上(优选为1μmol/L以上、进一步优选为3μmol/L以上)且使测定结束时反应液中的浓度为50μmol/L以下(优选为10μmol/L以下、进一步优选为8μmol/L以下)。
本发明中使用的校准品，可以使用按照在使用时可稀释为满足上述总血红蛋白浓度的绝对值的方式制作的校准品。
作为校准品单独的总血红蛋白浓度，没有特别限定，作为一例，可以设为10μmol/L～900μmol/L左右，优选可以设为20μmol/L～700μmol/L左右，更优选可以设为30μmol/L～500μmol/L左右，进一步优选可以设为40μmol/L～300μmol/L左右，进一步更优选可以设为50μmol/L～250μmol/L左右。另外可以直接使用例如50μmol/L～200μmol/L的校准品，也可以将2mmol/L～5mmol/L的校准品用水、前处理液稀释来使用。
本发明中使用的校准品的糖化血红蛋白浓度的绝对值没有特别限定，可以优选设定为使测定结束时反应液中的浓度为0.01μmol/L以上(优选为0.05μmol/L以上、进一步优选为0.03μmol/L以上)且使测定结束时反应液中的浓度为15μmol/L以下(优选为10μmol/L以下、进一步优选为1μmol/L以下)即可。
本发明中使用的校准品，可以使用按照在使用时可稀释为满足上述糖化血红蛋白浓度的绝对值的方式制作的校准品。
作为校准品单独的糖化血红蛋白浓度，没有特别限定，作为一例，可以使用1μmol/L～40μmol/L左右的校准品，优选可以使用1μmol/L～30μmol/L左右的校准品。另外，例如可以直接使用1μmol/L～20μmol/L的校准品，也可以将100μmol/L～500μmol/L的校准品用水、前处理液稀释来使用。
[1-9.关于糖化血红蛋白比率的测定方法、其它事项]
本发明中，反应优选在缓冲液中进行。作为上述缓冲液，没有特别限定，可列举例如Good’s缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液等、酒石酸盐缓冲液等。
本发明中，可以根据需要使用各种抗菌剂及防腐剂。作为防腐剂，可列举各种ProClin(注册商标、Supelco公司)、叠氮化物、螯合剂、抗生素、抗菌剂等。作为螯合剂，可列举乙二胺四乙酸及其盐等。作为抗生素，可列举庆大霉素、卡那霉素、氯霉素等。作为抗菌剂，可列举哌拉西林、咪唑烷基脲等。
本发明中，可以根据需要(例如作为酶稳定剂)使用各种糖类、盐类、蛋白质类。
作为盐类，没有特别限定，可列举氯化钠、乙酸钠、氢氧化钠、氯化钾、乙酸钾、氢氧化钾、氯化铝、乙酸铝、氢氧化铝、氯化钙、乙酸钙、氢氧化钙等。
作为糖类，没有特别限定，可列举蔗糖、海藻糖、环糊精、甘油、葡糖酸盐、氨基酸等。
作为蛋白质类，没有特别限定，可以添加血清白蛋白类、球蛋白类或纤维蛋白类等非活性蛋白质。优选的蛋白质为牛血清白蛋白。优选的蛋白质为牛血清白蛋白。优选的非活性蛋白质不含会导致酶分解的蛋白酶杂质。
本发明中，可以根据需要(例如出于避免来自试样的还原物质的影响、血红蛋白的高铁化、促进蛋白酶反应等的目的)添加亚铁氰化钾等亚铁氰化物、亚硝酸钠等亚硝酸盐类，也可以不添加。
本发明中，可以根据需要使用表面活性剂。本发明中可以使用的表面活性剂没有特别限定。例如，可以使用非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂和/或阳离子型表面活性剂和/或阴离子型表面活性剂。
作为非离子表面活性剂，没有特别限定，可列举例如：聚氧乙烯烷基醚、脂肪酸失水山梨醇酯、烷基聚葡糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺、烷基单甘油醚等。
作为两性离子表面活性剂，没有特别限定，可列举例如：烷基二甲基胺氧化物、烷基羧基甜菜碱等。
作为阳离子型表面活性剂，没有特别限定，可列举：苯扎氯铵、二硬脂基二甲基氯化铵、椰油胺乙酸盐、硬脂胺乙酸盐等。
作为阴离子型表面活性剂，没有特别限定，可列举烯基琥珀酸二钾等。
本发明中可以使用的添加剂中的一部分还可以同时具有作为阴离子型表面活性剂的功能。
上述各成分(存在于试剂中的酶、显色底物、表面活性剂及其它成分)的浓度·条件等可以根据所使用的试剂·酶等的种类、并且考虑反应性和/或稳定性等适当确定。
此时，优选也考虑试剂中存在的各成分彼此干渉而对糖化血红蛋白的测定、试剂的稳定性等造成影响的可能性。例如，在应用于能够设定2阶段的试剂添加步骤的自动分析仪时，当在第二步骤中蛋白酶与糖化氨基酸氧化酶共存时，可以适当地确定条件使得尽可能地活用两种酶的特性。
上述确定并非必需为最优解，只要根据目的、状况而关于糖化血红蛋白的测定可确保实用上充分的性能，就没有问题。
[2.糖化血红蛋白比率的测定试剂盒]
本发明的实施方式之一为包含以下的试剂(a)～(e)的糖化血红蛋白比率的测定试剂盒。
试剂(a)，其含有具有磺基的化合物。
试剂(b)，其含有糖化氨基酸氧化酶。
试剂(c)，其含有过氧化物酶。
试剂(d)，其含有在过氧化物酶存在下与过氧化氢接触而生成显色色素的显色底物。
糖化血红蛋白校准品(e)，其以糖化血红蛋白比率定值。
本发明的试剂盒中，可以还包含以下的(f)。
试剂(f)，其含有蛋白酶。
本发明的糖化血红蛋白比率的测定试剂盒的构成没有特别限定。可以含有例如：糖化氨基酸氧化酶、缓冲液、蛋白酶、过氧化物酶、显色底物、用于捕捉妨碍酶反应的离子的螯合试剂、用于消除会干扰过氧化氢的定量的干扰物质即抗坏血酸的抗坏血酸氧化酶、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、抗菌剂、防腐剂及在纸等记录介质上记载有本发明的测定方法的处理说明书等。
本发明的糖化血红蛋白比率的测定试剂盒可用于本发明的糖化血红蛋白比率的测定方法。因此，本发明的试剂盒可以由本发明的测定方法的实施中所使用的物品构成。关于上述物品的说明，可以援引本发明的测定方法部分的说明。
本发明的试剂盒可以配合自动分析仪的形态而由若干个部分构成。例如，在可以适用于能够设定2阶段的试剂添加步骤的自动分析仪的试剂盒的情况下，可以由第一试剂及第二试剂这2个部分构成。
在考虑试剂盒的保存稳定性的情况下，可以使试剂盒构成为：包含超过2个的部分、并且在即将使用前可以准备第一试剂及第二试剂这两者。
在应用于能够设定2阶段的试剂添加步骤的自动分析仪时，在构建消除体系的情况下，本发明的糖化血红蛋白比率测定试剂盒优选由2个部分构成且第一试剂包含糖化氨基酸氧化酶、第二试剂包含蛋白酶。在这种形态的试剂中，第一试剂中可以还包含过氧化氢酶、过氧化物酶及色素中的任意1种以上。
本发明的试剂盒除了上述构成以外，可以还包含试样的前处理剂。前处理剂的形态没有特别限定。前处置的目的没有特别限定，可列举稀释、溶血等。可以使前处理剂包含具有磺基的化合物，从而在前处理时进行使具有磺基的化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触的工序(工序(1))。
关于上述所说明的试剂盒，将具有磺基的化合物、糖化氨基酸氧化酶、过氧化物酶、在过氧化物酶存在下与过氧化氢接触而生成显色色素的显色底物及蛋白酶在前处理剂、第一试剂及第二试剂中的分配例子例示于表1。
表中，A表示具有磺基的化合物，B表示糖化氨基酸氧化酶，C表示过氧化物酶，D表示在过氧化物酶存在下与过氧化氢接触而生成显色色素的显色底物，F表示蛋白酶。
[表1]
本发明不受以上所说明的各构成限定，可以在权利要求书所示的范围进行各种变更，关于在不同的实施方式、实施例中分别公开的技术特征适当组合而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的全部文献均作为参考而援引于此。
以下，通过实施例具体说明本发明，但本发明不受以下实施例限定。
实施例
[实施例1]
通过以下方法求出HbA1c比率。
1.试剂
第一试剂(R1)
第二试剂(R2)
MES缓冲液(pH6.5) 100mM
糖化氨基酸氧化酶 5KU/L
DA-67 16mg/L
2.试样
血细胞10个被检体
测定前用纯化水稀释30倍
3.测定参数
测定设备日立7180
分析法/测定要点2点终点(10)16-34
使用该参数的情况下，测定所需要的时间为总计约600秒，其中，第一反应约300秒，第二反应约300秒。
测定波长(nm)(副/主)800/660
液量比试样/R1/R2 10μL/120μL/40μL(S：R1：R2＝1：12：4)
反应温度37℃
ABS LIMIT 32000增加
校准以0.0-10000吸光度算出
将上述测定结果与以下的校准曲线A～D(x轴：HbA1c比率、y轴：显色量)进行对比，求出HbA1c比率。这里，HbA1c比率是作为NGSP值算出的值。
校准曲线A是使用校准品1(血红蛋白(以下记作Hb)66.0μmol/L、HbA1c 2.93μmol/L、HbA1c比率6.2％)和校准品2(Hb 66.0μmol/L、HbA1c 7.34μmol/L、HbA1c比率12.3％)制作的。
校准曲线B是使用校准品3(Hb 78.8μmol/L、HbA1c 3.49μmol/L、HbA1c比率6.2％)和校准品4(Hb 78.8μmol/L、HbA1c 8.75μmol/L、HbA1c比率12.3％)制作的。
校准曲线C是使用校准品5(Hb 56.9μmol/L、HbA1c 2.52μmol/L、HbA1c比率6.2％)和校准品6(Hb 56.9μmol/L、HbA1c 6.32μmol/L、HbA1c比率12.3％)制作的。
校准曲线D是使用校准品7(Hb 50.0μmol/L、HbA1c 2.21μmol/L、HbA1c比率6.2％)和校准品8(Hb 97.6μmol/L、HbA1c 10.83μmol/L、HbA1c比率12.3％)制作的。
[HPLC法(对照)]
使用ARKRAY,Inc.制HA8170按照常规方法实施测定。
图1～图4中示出本发明的方法与HPLC法的相关性数据。使用上述校准曲线A～D时的、与HPLC法的相关性方程分别为下述的(1)～(4)。
(1)Y＝1.042X+0.3072、R2＝0.995
(2)Y＝0.9721X+0.6083、R2＝0.995
(3)Y＝1.1162X-0.0156、R2＝0.995
(4)Y＝0.8716X+1.4123、R2＝0.995
从而，本发明的方法与HPLC法的相关性非常好。
[实施例2][比较例1]
通过以下方法求出HbA1c比率。
1.试剂
第一试剂(R1)
第二试剂(R2)
HEPES缓冲液(pH7.3) 100mM
糖化氨基酸氧化酶 5KU/L
DA-67 16mg/L
2.试样
血细胞10个被检体
测定前用纯化水稀释30倍
3.测定参数
按照实施例1记载的方法来实施。
将上述测定结果与用实施例1记载的校准品1及校准品2制作的校准曲线、以及使用表2记载的试剂A～E制作的校准曲线进行对比，求出HbA1c比率。
作为比较例，将用实施例1记载的校准品1及校准品2制作的校准曲线与用试剂F、G制作的校准曲线进行对比，求出HbA1c比率。
这些中，HbA1c比率是作为NGSP值算出的值。
[表2]
[HPLC法(对照)]
使用ARKRAY,Inc.公司制HA8170，按照常规方法实施测定。
图5～图11示出本发明的方法与HPLC法的相关性数据。使用上述试剂A～G时的、与HPLC法的相关性方程分别为下述的(5)～(11)。
(5)Y＝0.9733X+1.9127、R2＝0.9886
(6)Y＝1.0011X+0.9045、R2＝0.9982
(7)Y＝0.9947X+0.8175、R2＝0.9874
(8)Y＝1.0562X+0.2332、R2＝0.9781
(9)Y＝1.1719X-0.3999、R2＝0.9830
(10)Y＝-0.1805X+6.456、R2＝0.0692
(11)Y＝0.593X+1.7699、R2＝0.3080
从而，本发明的方法与HPLC法的相关性非常好((5)～(9))。另一方面，比较例中未确认到相关性((10)～(11))。
[实施例3]
通过以下方法求出HbA1c比率。
1.试剂
第一试剂(R1)
第二试剂(R2)
MES缓冲液(pH6.5) 100mM
糖化氨基酸氧化酶 5KU/L
过氧化物酶 3.7KU/L
2.试样
血细胞30个被检体
测定前用纯化水稀释30倍
3.测定参数
测定设备日立7180
分析法/测定要点2点终点(10)16-34
使用该参数的情况下，测定所需要的时间总计为约600秒，其中，第一反应约300秒，第二反应约300秒。
测定波长(nm)(副/主)800/660
液量比试样/R1/R2 10μL/120μL/40μL(S：R1：R2＝1：12：4)
反应温度37℃
ABS LIMIT 32000增加
校准以0.0-10000吸光度算出
将上述测定结果与以下的校准曲线E～H(x轴：HbA1c比率、y轴：显色量)对比，求出HbA1c比率。这里，HbA1c比率是作为NGSP值算出的值。
校准曲线E是使用校准品9(血红蛋白(以下记作Hb)210.5μmol/L、HbA1c 7.0μmol/L、HbA1c比率5.2％)和校准品10(Hb 210.5μmol/L、HbA1c 19.3μmol/L、HbA1c比率10.5％)制作的。
校准曲线F是使用校准品11(Hb 421.1μmol/L、HbA1c 14.0μmol/L、HbA1c比率5.2％)和校准品12(Hb 210.5μmol/L、HbA1c 19.3μmol/L、HbA1c比率10.5％)制作的。
校准曲线G是使用校准品13(Hb 634.9μmol/L、HbA1c 21.2μmol/L、HbA1c比率5.2％)和校准品14(Hb 210.5μmol/L、HbA1c 19.3μmol/L、HbA1c比率10.5％)制作的。
校准曲线H是使用校准品15(Hb 833.3μmol/L、HbA1c 27.8μmol/L、HbA1c比率5.2％)和校准品16(Hb 210.5μmol/L、HbA1c 19.3μmol/L、HbA1c比率10.5％)制作的。
[HPLC法(对照)]
使用ARKRAY,Inc.制HA8170按照常规方法实施测定。
图12～图15示出本发明的方法与HPLC法的相关性数据。使用上述校准曲线E～H时的、与HPLC法的相关性方程分别为下述的(12)～(15)。
(12)Y＝1.015X-0.338、R2＝0.9945
(13)Y＝0.9747X+0.0577、R2＝0.9945
(14)Y＝0.9143X+0.6517、R2＝0.9945
(15)Y＝0.7958X+1.8157、R2＝0.9945
从而，本发明的方法与HPLC法的相关性非常好。可知其中的糖化血红蛋白校准品的总血红蛋白浓度比率为1：1～3左右时，显示特别高的相关性。
需要说明的是，上述公开的实施方式及实施例均为例示，而非限制性的。另外，将实施方式及实施例中公开的内容组合而成的实施方式及实施例也包含在本发明的范围内。本发明的技术范围通过权利要求书来主张，且包含与权利要求书的记载同等的含义及范围内的所有的变更·修正·替换等。
产业上的可利用性
本发明有助于作为糖尿病标记物等有用的糖化血红蛋白比率的测定等，从而有助于诊断、医疗等领域。

Claims (14)

1.一种糖化血红蛋白比率的测定方法，其包括以下的工序(1)～(5)：
工序(1)，使具有磺基的化合物与包含糖化血红蛋白的试样接触；
工序(2)，使糖化氨基酸氧化酶作用于包含糖化血红蛋白的试样，生成过氧化氢；
工序(3)，使工序(2)中生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下与显色底物接触，生成显色色素；
工序(4)，测定工序(3)中得到的显色色素的显色量；和，
工序(5)，将工序(4)中得到的显色量代入校准曲线，算出糖化血红蛋白比率，所述校准曲线是利用以糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品预先制作的、糖化血红蛋白比率与显色量的校准曲线。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，作为所述工序(5)中使用的糖化血红蛋白校准品，使用以2个水平以上的糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品，将测定结束时的反应液中的总血红蛋白浓度最低者设为1时，其他者的总血红蛋白浓度为其1倍～6倍的浓度。
3.根据权利要求1或2的测定方法，其还包括以下的工序(6)：
工序(6)，通过蛋白酶的作用，将糖化血红蛋白分解成糖化血红蛋白分解物。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其还包括以下的工序(7)：
工序(7)，使包含糖化血红蛋白的试样溶血。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(1)中使用的具有磺基的化合物为选自由苯磺酸、烷基磺酸、萘磺酸、磺基琥珀酸、苯并噻唑啉磺酸、蒽醌磺酸、樟脑磺酸、苯并噁二唑磺酸、和它们的衍生物、以及它们的盐组成的组中的至少1种化合物。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(1)中使用的具有磺基的化合物为选自由十二烷基苯磺酸、3-氨基苯磺酸、烷基二苯基醚磺酸、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸、4-氨基-4’-硝基茋-2,2’-二磺酸、4,4’-二偶氮茋-2,2’-二磺酸、对氨基苯磺酸、5-磺基间苯二甲酸、5-氨基-2-氯甲苯-4-磺酸、烷基萘磺酸、2-萘磺酸、8-氨基-1-萘磺酸、十二烷基萘磺酸、磺基琥珀酸二-2-乙基己酯、二烷基磺基琥珀酸、和它们的盐组成的组中的至少1种化合物。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为隐色型色原体。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为吩噻嗪系的隐色型色原体。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为选自由10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐、10-N-羧甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪、和10-N-甲基氨基甲酰基-3,7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪组成的组中的至少1种吩噻嗪系的隐色型色原体。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的测定方法，其中，所述工序(3)中使用的显色底物为10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪钠盐。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的测定方法，其以1通道实施。
12.一种糖化血红蛋白比率的测定试剂盒，其包含以下的试剂(a)～(e)：
试剂(a)，其含有具有磺基的化合物；
试剂(b)，其含有糖化氨基酸氧化酶；
试剂(c)，其含有过氧化物酶；
试剂(d)，其含有在过氧化物酶存在下与过氧化氢接触而生成显色色素的显色底物；和，
糖化血红蛋白校准品(e)，其以糖化血红蛋白比率定值。
13.根据权利要求12所述的测定试剂盒，其中，所述(e)的糖化血红蛋白校准品为以2个水平以上的糖化血红蛋白比率定值的糖化血红蛋白校准品，且将测定结束时的反应液中的总血红蛋白浓度最低者设为1时，其他者的总血红蛋白浓度为其1倍～6倍的浓度。
14.根据权利要求12或13所述的测定试剂盒，其还包含以下的试剂(f)：
试剂(f)，其含有蛋白酶。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115704749A (zh) * 2021-08-11 2023-02-17 深圳市帝迈生物技术有限公司 用于制备糖化血红蛋白质控品的试剂盒及制备方法
WO2024140721A1 (zh) * 2022-12-27 2024-07-04 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 用于检测糖化血红蛋白的试剂、检测方法及应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113329690B (zh) * 2019-02-15 2022-11-22 美国西门子医学诊断股份有限公司 用于测定患者的液体测试样品中的糖化血红蛋白百分比的校准物和对照
KR102762206B1 (ko) * 2019-03-01 2025-02-07 아바 라이프사이언스 게엠베하 유세포분석 측정방법 및 이를 수행하기 위한 키트
JP7645237B2 (ja) 2020-03-26 2025-03-13 キヤノンメディカルダイアグノスティックス株式会社 異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
US20230266337A1 (en) * 2020-07-10 2023-08-24 Sekisui Medical Co., Ltd. Composition containing tarc, and method for improving storage stability of tarc
TW202217313A (zh) * 2020-07-10 2022-05-01 日商積水醫療股份有限公司 含有tarc之組成物及tarc之保存穩定性之提升方法
WO2022009973A1 (ja) * 2020-07-10 2022-01-13 積水メディカル株式会社 Ｔａｒｃを含有する組成物、及びｔａｒｃの保存安定性向上方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1662818A (zh) * 2002-06-14 2005-08-31 爱科来株式会社 使用磺酸化合物和硝基化合物的测定方法
CN1668760A (zh) * 2002-07-17 2005-09-14 爱科来株式会社 使用磺酸化合物降解蛋白质的方法
WO2008013874A1 (en) * 2006-07-25 2008-01-31 General Atomics Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin
CN101363042A (zh) * 2008-09-23 2009-02-11 宁波美康生物科技有限公司 酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6352835B1 (en) * 1998-11-17 2002-03-05 Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd. Method of measuring substance in sample using a redox reaction
JP4427137B2 (ja) 1999-08-23 2010-03-03 積水メディカル株式会社 フルクトシルバリンの生産方法
EP2236618A3 (en) * 2001-01-31 2011-06-08 Asahi Kasei Pharma Corporation Compositions for assaying glycoprotein
JP2007147630A (ja) * 2002-06-14 2007-06-14 Arkray Inc スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
JP5442432B2 (ja) * 2007-03-05 2014-03-12 キッコーマン株式会社 糖化ヘキサペプチドの測定方法
JP5870919B2 (ja) * 2010-04-09 2016-03-01 東洋紡株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法
EP3020810B1 (en) 2013-07-09 2019-04-10 Kyowa Medex Co., Ltd. Glycated hexapeptide oxidase and use thereof
EP3020825B1 (en) 2013-07-09 2020-02-19 Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co., Ltd. Method for measuring glycated hemoglobin
WO2015060429A1 (ja) 2013-10-25 2015-04-30 キッコーマン株式会社 ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法および測定キット

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1662818A (zh) * 2002-06-14 2005-08-31 爱科来株式会社 使用磺酸化合物和硝基化合物的测定方法
CN1668760A (zh) * 2002-07-17 2005-09-14 爱科来株式会社 使用磺酸化合物降解蛋白质的方法
WO2008013874A1 (en) * 2006-07-25 2008-01-31 General Atomics Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin
CN101484809A (zh) * 2006-07-25 2009-07-15 通用原子公司 用于测定糖化血红蛋白百分比的方法
CN101363042A (zh) * 2008-09-23 2009-02-11 宁波美康生物科技有限公司 酶法检测糖化血红蛋白的试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐岐山: "《内分泌疾病实验室检查与准备》", 31 October 2014 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115704749A (zh) * 2021-08-11 2023-02-17 深圳市帝迈生物技术有限公司 用于制备糖化血红蛋白质控品的试剂盒及制备方法
WO2024140721A1 (zh) * 2022-12-27 2024-07-04 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 用于检测糖化血红蛋白的试剂、检测方法及应用

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