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WO2018101389A1 - ヘモグロビンの糖化率測定方法 - Google Patents

ヘモグロビンの糖化率測定方法 Download PDF

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Publication number
WO2018101389A1
WO2018101389A1 PCT/JP2017/042994 JP2017042994W WO2018101389A1 WO 2018101389 A1 WO2018101389 A1 WO 2018101389A1 JP 2017042994 W JP2017042994 W JP 2017042994W WO 2018101389 A1 WO2018101389 A1 WO 2018101389A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glycated hemoglobin
acid
glycated
ratio
hemoglobin
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/042994
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
美穂 松尾
志穂里 前原
Original Assignee
東洋紡株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 東洋紡株式会社 filed Critical 東洋紡株式会社
Priority to ES17875135T priority Critical patent/ES3011710T3/es
Priority to CN201780074037.0A priority patent/CN110023503A/zh
Priority to EP17875135.0A priority patent/EP3550030B1/en
Priority to JP2018554232A priority patent/JP7056577B2/ja
Publication of WO2018101389A1 publication Critical patent/WO2018101389A1/ja

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the glycation rate of hemoglobin. More specifically, the present invention relates to a method for measuring the proportion of glycated hemoglobin in a biological sample such as blood using an enzymatic reaction and a composition therefor.
  • glycated hemoglobin such as HbA1c is used.
  • HbA1c is glycated hemoglobin in which glucose is bound to the amino group of valine at the N-terminal of the ⁇ chain of hemoglobin.
  • the glycation rate of hemoglobin that is, the ratio of the glycated hemoglobin concentration to the total hemoglobin concentration (hereinafter also referred to as “glycated hemoglobin ratio”) is used for diagnosis.
  • the ratio of the HbA1c concentration to the total hemoglobin concentration does not change abruptly compared with the blood glucose level, Because it correlates well, it is said to be an excellent indicator of diabetes.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • latex agglutination immunoturbidimetry are widely used as methods for measuring the glycated hemoglobin ratio.
  • the HPLC method has a problem that the column price is high and the throughput is low.
  • the latex agglutination immunoturbidimetric method has a problem that it contaminates the reaction tank of the analyzer used for the measurement and takes time and effort for maintenance. Thus, enzymatic methods that have solved these problems have attracted attention in recent years and have become widespread.
  • a typical method as an enzymatic method is to measure the total hemoglobin concentration by non-enzymatic reaction, and separately measure the glycated hemoglobin concentration by enzymatic reaction, and then calculate the glycated hemoglobin ratio from the calculation formula. is there.
  • the method for measuring the total hemoglobin concentration include the cyanmethemoglobin method, the hematin hydrochloride method, the alkali hematin method, the oxyhemoglobin method, the SLS-hemoglobin method, the Hb / red measurement method, or the HbCO measurement method, which are international standard methods.
  • glycated hemoglobin concentration is measured by reacting glycated hemoglobin or its degradation product with oxidoreductase to produce hydrogen peroxide, and then reacting the hydrogen peroxide with a chromogenic substrate in the presence of peroxidase to reduce the amount of color development. This is a colorimetric method for measuring (Patent Document 1).
  • the glycated hemoglobin concentration is determined by creating a calibration curve for the glycated hemoglobin concentration using two types of calibrators with known concentrations and different glycated hemoglobin concentrations, then measuring the amount of glycated hemoglobin in the sample, and using the calibration curve. calculate. For example, when HbA1c is selected as the glycated hemoglobin, the glycated HbA1c ratio can be calculated by applying the total hemoglobin concentration or glycated hemoglobin concentration obtained by the above reaction to the following calculation formula.
  • an object of the present invention is to improve a method for measuring a glycated hemoglobin ratio using an enzymatic method to be simpler, faster, and / or more accurate and / or to be used for the measurement method. It is to provide a calibrator, a reagent composition, and the like.
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by the following means, and have reached the present invention.
  • divalent iron ions contained in the hemoglobin molecule are partially oxidized to reduce the reduction ability.
  • the hemoglobin that has been weakened at a reduced rate and reduced in reducing ability reduces the concentration of hydrogen peroxide generated by enzymatic reactions such as glycated amino acid oxidase to glycated hemoglobin, depending on the amount.
  • this invention consists of the following structures.
  • a method for measuring a glycated hemoglobin ratio comprising the following steps (1) to (5): (1) contacting a compound having a sulfo group with a sample containing glycated hemoglobin; (2) a step of generating hydrogen peroxide by allowing a glycated amino acid oxidase to act on a sample containing glycated hemoglobin; (3) A step of bringing the hydrogen peroxide produced in step (2) into contact with a chromogenic substrate in the presence of peroxidase to produce a chromogenic dye, (4) a step of measuring the color development amount of the coloring dye obtained in step (3), and (5) Calculate the glycated hemoglobin ratio by applying the glycated hemoglobin ratio and the color development amount calibration curve prepared in advance using the glycated hemoglobin calibrator valued by the glycated hemoglobin ratio to the calibration curve of the color development amount.
  • the measurement method according to any one of Items 1 to 3, further comprising the following step (7): (7) A step of hemolyzing a sample containing glycated hemoglobin.
  • the compound having a sulfo group used in the step (1) is benzenesulfonic acid, alkylsulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, sulfosuccinic acid, benzothiazolinesulfonic acid, anthraquinonesulfonic acid, camphorsulfonic acid, benzoxadiazolesulfonic acid, Item 5.
  • the chromogenic substrate used in the step (3) is 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt, 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) )
  • At least one phenothiazine-based leuco chromogen selected from the group consisting of -10H-phenothiazine and 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine The measuring method according to any one of 1 to 8.
  • a kit for measuring a glycated hemoglobin ratio comprising the following reagents (a) to (e): (A) a reagent containing a compound having a sulfo group, (B) a reagent containing a glycated amino acid oxidase, (C) a reagent containing peroxidase, (D) a reagent containing a chromogenic substrate that forms a chromogenic dye upon contact with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase, and (E) A glycated hemoglobin calibrator priced with a glycated hemoglobin ratio.
  • the glycated hemoglobin calibrator of (e) is a glycated hemoglobin calibrator valued at a glycated hemoglobin ratio of two or more levels, and the one having the lowest total hemoglobin concentration in the reaction solution at the time of completion of the measurement is taken as 1.
  • Item 13 The measurement kit according to Item 12, which is a glycated hemoglobin calibrator in which the total hemoglobin concentration is 1 to 6 times its concentration.
  • Item 14 Item 14. The measurement kit according to Item 12 or 13, further comprising the following reagent (f): (F) A reagent containing a protease.
  • the present invention it is not necessary to calculate the total hemoglobin concentration and the glycated hemoglobin concentration separately, and to calculate the glycated hemoglobin ratio by the enzymatic method, only one channel is required in a general-purpose automatic analyzer, which is simpler. Faster, and / or more accurate measurements.
  • the correlation data of the method of the present invention (when calibration curve A is applied) and the HPLC method in Example 1 are shown.
  • the correlation data of the method of the present invention (when calibration curve B is applied) and the HPLC method in Example 1 are shown.
  • the correlation data of the method of this invention (when the calibration curve C is applied) and the HPLC method in Example 1 are shown.
  • the correlation data of the method of the present invention (when the calibration curve D is applied) and the HPLC method in Example 1 are shown.
  • the correlation data of the method of this invention in Example 2 (when the reagent A of Table 2 is used) and HPLC method are shown.
  • the correlation data of the method of this invention in Example 2 (when the reagent B of Table 2 is used) and the HPLC method are shown.
  • the correlation data of the method of this invention (when using the reagent C of Table 2) and HPLC method in Example 2 are shown.
  • the correlation data of the method of this invention in Example 2 (when the reagent D of Table 2 is used) and HPLC method are shown.
  • the correlation data of the method of this invention (when using the reagent E of Table 2) and HPLC method in Example 2 are shown.
  • the correlation data of the method in the comparative example 1 (when the reagent F of Table 2 is used) and HPLC method are shown.
  • the correlation data of the method in the comparative example 1 (when the reagent G of Table 2 is used) and the HPLC method are shown.
  • the correlation data of the method of this invention (when the calibration curve E is applied) and the HPLC method in Example 3 are shown.
  • the correlation data of the method of the present invention (when the calibration curve F is applied) and the HPLC method in Example 3 are shown.
  • the correlation data of the method of this invention (when the calibration curve G is applied) and the HPLC method in Example 3 are shown.
  • the correlation data of the method of this invention (when the calibration curve H is applied) and the HPLC method in Example 3 are shown.
  • the enzyme activity is not described in the specification, and as a general rule, for commercially available products, the measurement method or unit is described in the container, the attached manual or pamphlet, if any. Moreover, if it is described in literature, it follows the activity measuring method described in the literature. In cases where the definition of activity (measurement method) is not known or there are restrictions on the availability of reagents necessary for measurement, etc., the substrate should be reasonably selected based on common knowledge of those skilled in the art, and the measurement conditions determined. Measure with
  • One embodiment of the present invention is a method for measuring a glycated hemoglobin ratio, comprising the following steps (1) to (5).
  • a step of bringing a compound having a sulfo group into contact with a sample containing glycated hemoglobin (2)
  • a step of causing glycated amino acid oxidase to act on a sample containing glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide (3)
  • Producing in step (2) (4)
  • a glycated hemoglobin ratio Applying the color development amount obtained in step (4) to the calibration curve of the glycated hemoglobin ratio and the color development amount prepared in advance using the glycated hemoglobin calibrator, and calculating the glycated hemoglobin ratio
  • the sample to be measured by the method for measuring a glycated hemoglobin ratio of the present invention is not particularly limited.
  • biological samples such as urine and cerebrospinal fluid (ie samples collected from the living body), drinking water such as juice, samples such as foods such as soy sauce and sauce It can also be applied to.
  • the glycated hemoglobin that is the target of the measurement method of the present invention is not particularly limited.
  • a saccharide bound to the ⁇ chain of hemoglobin is called hemoglobin A1, and is further fractionated into A1a1, A1a2, A1b, and A1c depending on the type of sugar.
  • hemoglobin A1a1 (HbA1a1) is obtained by binding fructose 1-6 diphosphate to the ⁇ chain of hemoglobin
  • hemoglobin A1a2 (HbA1a2) is obtained by binding glucose-6-phosphate
  • hemoglobin is bound by pyruvic acid.
  • A1b (HbA1b) which is bound with glucose, is called hemoglobin A1c (HbA1c).
  • the most common of these fractions is the A1c fraction (HbA1c), which is often used as a diabetes marker.
  • any of the above-mentioned fractions may be measured, but HbA1c is preferable.
  • the method of the present invention can be applied to diabetes diagnosis, it is particularly useful for whole blood samples and blood cell samples.
  • whole blood is lysed as it is, or erythrocytes separated from whole blood are lysed, and this hemolyzed sample is used as a sample for measurement. And it is sufficient.
  • a dilution operation may be performed.
  • purified water may be used, or a buffer solution such as a Good buffer solution or a phosphate buffer solution may be used.
  • a buffer solution such as a Good buffer solution or a phosphate buffer solution
  • stabilizers amino acids, acid compounds, saccharides such as saponins and cyclodextrins may be included.
  • a liquid containing a certain component such as a preservative such as sodium azide or procrine, a chelating agent such as EDTA, a surfactant such as polyoxyethylene alkyl ethers, lauryltrimethylammonium salt, or alkylbetaine may be used.
  • the sample includes a calibrator in a broad sense.
  • the calibrator is not particularly limited, and examples thereof include whole blood, blood cells, a solution obtained by dissolving whole blood in purified water or a reagent, and a solution obtained by dissolving blood cells in purified water or a reagent.
  • the reagent for dissolution purified water or a diluted solution exemplified for the purpose of preparing the measurement sample may be used. These are preferably stored refrigerated or frozen, and among these, frozen storage is preferred.
  • a calibrator frozen by freezing may be thawed before use.
  • a calibrator obtained by freeze-drying the whole blood, blood cells, lysate, or the like can also be used.
  • the lyophilized calibrator may be redissolved before use. In the re-dissolution, for example, purified water or a diluted solution exemplified for the purpose of preparing the measurement sample can be used.
  • the method for measuring a glycated hemoglobin ratio of the present invention may further include the following step (7).
  • Step (7) Step of hemolyzing a sample containing glycated hemoglobin Step (7) is preferably used when the sample containing glycated hemoglobin contains whole blood or blood cells.
  • Step (7) can be performed, for example, when preparing a measurement sample prior to steps (1) to (5) as described above. Further, step (7) may be performed simultaneously with step (1) prior to steps (2) to (5). Further, step (1) may be performed prior to steps (2) to (5) after performing step (7).
  • step (7) can be performed not only when the measurement sample is prepared but also when the reagent is added. In this case, it is preferable to carry out in the first step starting from the first reagent addition.
  • Hemolysis refers to a phenomenon in which the red blood cell membrane is destroyed.
  • erythrocytes When erythrocytes are suspended in normal whole blood or an isotonic solution such as physiological saline, it is observed as a red opaque suspension without hemolysis, but when hemolysis occurs, hemoglobin leaks and a red transparent solution To change.
  • the hemolysis method is not particularly limited.
  • whole blood or blood cells are suspended in distilled water or a hypotonic solution, and the erythrocyte membrane is disrupted using an osmotic pressure difference.
  • the erythrocyte is suspended in a reagent containing a surfactant. Examples include a method for dissolving a film, a method using ultrasonic waves, a method using freezing and thawing. Among them, a method using a surfactant or a method using a difference in osmotic pressure is preferable for reasons such as ease of operation.
  • the surfactant used in the hemolysis method using a surfactant is not particularly limited.
  • polyoxyethylene-pt-octylphenyl ether Triton surfactant, etc.
  • polyoxyethylene sorbitan alkyl ester Nonionic surfactants such as Tween surfactants
  • Brij surfactants polyoxyethylene alkyl ethers
  • trade name Triton X-100, trade name Tween- 20, brand name Brij35 etc. are mentioned.
  • amphoteric surfactants such as CHAPSO and CHAPS
  • anionic surfactants such as sodium cholate and sodium deoxycholate
  • cationic surfactants such as benzethonium chloride
  • the treatment conditions with the surfactant are usually such that when the blood cell concentration in the treatment solution is 0.5 to 10% by volume, the concentration in the treatment solution is 0.05 to 5% by weight. And stirring at room temperature for about 5 seconds to 1 minute.
  • step (1) a compound having a sulfo group is brought into contact with a sample containing glycated hemoglobin.
  • the compound having a sulfo group is not particularly limited, and examples thereof include alkylsulfonic acid, a salt thereof or a derivative thereof, benzenesulfonic acid, a salt or derivative thereof, naphthalenesulfonic acid, a salt or derivative thereof, or sulfosuccinic acid.
  • the alkyl sulfonic acid, its salt or derivatives thereof are not particularly limited, but specific examples include sodium lauryl sulfate, lithium lauryl sulfate and the like.
  • Benzenesulfonic acid, a salt thereof or a derivative thereof is not particularly limited, but specific examples include sodium dodecylbenzenesulfonate, 3-aminobenzenesulfonic acid, 4-aminoazobenzene-4′-sodium sulfonate, 4-amino -4'-nitrostilbene-2,2'-disulfonic acid disodium, 4,4'-diazostilbenzene-2,2'-disulfonic acid disodium, sulfanilic acid, 5-sulfoisophthalic acid monosodium, 5-amino Examples include -2-chlorotoluene-4-sulfonic acid and sodium alkyldiphenyl ether sulfonate.
  • benzenesulfonic acid, a derivative thereof, or a salt thereof is dodecylbenzenesulfonic acid, 3-aminobenzenesulfonic acid, alkyldiphenyl ether sulfonic acid, or a derivative thereof, or a salt thereof.
  • the naphthalene sulfonic acid, its salt or derivatives thereof are not particularly limited, but specific examples include sodium alkyl naphthalene sulfonate, sodium 2-naphthalene sulfonate, 8-amino-1-naphthalene sulfonic acid, dodecylnaphthalene sulfonic acid. Sodium etc. are mentioned.
  • Alkyl naphthalene sulfonic acid and its derivatives, and salts thereof are preferable.
  • Sulfosuccinic acid, a salt thereof or a derivative thereof is not particularly limited, but specific examples include di-2-ethylhexyl sodium sulfosuccinate, sodium dialkylsulfosuccinate and the like.
  • the camphorsulfonic acid, its salt or derivatives thereof are not particularly limited, and specific examples include ( ⁇ ) -10-camphorsulfonic acid.
  • the benzooxadiazole sulfonic acid, a salt thereof or a derivative thereof is not particularly limited, and specific examples include 4-chloro-7-chlorosulfonyl-2,1,3-benzooxadiazole.
  • sodium lauryl sulfate, sodium dodecylbenzenesulfonate, di-2-ethylhexyl sodium sulfosuccinate and sodium alkyldiphenyl ether sulfonate are particularly preferable, and sodium alkyldiphenyl ether sulfonate is particularly preferable.
  • the concentration of the above compound is not particularly limited, but when the blood cell concentration in the treatment solution is 0.01 to 10% by volume, the concentration in the treatment solution should be 0.05 to 5% by weight. Is preferred.
  • step (1) when step (1) is performed simultaneously with step (7), it can be performed with a reagent containing 0.25 to 1% by volume of the compound.
  • step (1) when step (1) is performed simultaneously with step (2), it can be performed with a reagent containing 0.1 to 3% by volume of the compound.
  • the method for contacting the compound with a sample containing glycated hemoglobin in step (1) is not particularly limited.
  • an additive may be added to a sample containing glycated hemoglobin when preparing the sample.
  • the step (1) may be performed simultaneously with the step (7) or may be performed after the step (7).
  • the reagent components necessary for the step (1) are prepared at the same time as the reagent addition step in which all of the reagent components necessary for the step (3) are prepared, or at an earlier reagent addition step. Just do it.
  • the reagent components necessary for the step (1) may be supplied in the first step started by the first reagent addition.
  • Step (2) Saccharified Amino Acid Oxidase etc.
  • glycated amino acid oxidase is allowed to act on a sample containing glycated hemoglobin to generate hydrogen peroxide.
  • glycated amino acid oxidase means an enzyme that can catalyze a reaction in which an Amadori compound is oxidized to produce hydrogen peroxide.
  • the glycated amino acid oxidase is sometimes called fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, fructosylamine oxidase, amadoriase, ketoamine oxidase, glycated hexapeptide oxidase, glycated hemoglobin oxidase and the like.
  • Examples of the Amadori compound include glycated hemoglobin which is a kind of glycated protein, glycated dipeptide which is a kind of glycated hemoglobin degradation product (for example, ⁇ -fructosylvalylhistidine is known), and glycated hemoglobin degradation product.
  • glycated hexapeptides for example, ⁇ -fructosyl valyl histidyl leucyl threonyl prolyl glutamic acid is known
  • glycated amino acids which are a kind of glycated hemoglobin degradation product, and the like.
  • the saccharified amino acid oxidase used in the method of the present invention is not particularly limited.
  • the glycated amino acid oxidase with which the glycated hexapeptide reacts is not particularly limited, and examples thereof include those shown as glycated hexapeptide oxidase in WO08 / 108385.
  • the glycated amino acid oxidase that reacts with glycated protein is not particularly limited, and examples thereof include those shown as glycated hemoglobin oxidase in WO2015 / 005257 and WO2015 / 005258, and those shown as amadoriase in WO2015 / 060429.
  • FPOX-301 (trademark) (Toyobo)
  • FPOX-CE trademark
  • FPOX-EE trademark
  • glycated amino acid oxidase that cannot be used in the present invention at the present time will be modified by genetic engineering or chemical methods in the future and modified to have the above characteristics. Can be used. Alternatively, a saccharified amino acid oxidase newly obtained in the future and having the above characteristics can be used in the present invention. And the measurement system of the glycated hemoglobin ratio constructed
  • the conditions for causing the glycated amino acid oxidase to act may be any conditions as long as the glycated amino acid oxidase used acts on the glycated peptide to be measured, glycated hemoglobin and their degradation products to generate hydrogen peroxide.
  • the amount of the glycated amino acid oxidase to be used is appropriately selected depending on the content of the measurement object contained in the sample or the processing conditions.
  • glycated amino acid oxidase has a concentration of 0.1 KU / L or more (preferably 1 KU / L or more, more preferably 2 KU / L or more, more preferably 3 KU / L or more) in the reaction solution at the completion of measurement.
  • the concentration in the reaction solution at the completion of the measurement is 100 KU / L or less (preferably 50 KU / L or less, more preferably 20 KU / L or less, more preferably 10 KU / L or less, more preferably 5 KU / L).
  • the pH at which the saccharified amino acid oxidase is allowed to act may be unadjusted.
  • an appropriate pH adjuster such as hydrochloric acid, acetic acid, sulfuric acid, sodium hydroxide, water is used so that the pH is suitable for the action of the enzyme used.
  • the pH in the reaction solution is 2 or more (preferably 3 or more, more preferably 4 or more, more preferably 5 or more), and the pH in the reaction solution is 9 or less (preferably 8). .5 or less, more preferably 8 or less).
  • the temperature at which the saccharified amino acid oxidase acts is, for example, 20 ° C. or higher (preferably 30 ° C. or higher, more preferably 35 ° C. or higher) in the reaction solution, and 70 ° C. or lower (preferably 60 ° C. or higher). Or less, more preferably 50 ° C. or less, and still more preferably 40 ° C. or less.
  • the action time at this time may be a time sufficient to act on the glycated peptide to be measured, glycated hemoglobin or its degradation product and generate hydrogen peroxide, for example, 5 seconds or more (preferably 1 minute or more, More preferably 3 minutes or more) and 180 minutes or less (preferably 60 minutes or less, more preferably 10 minutes or less).
  • a denaturing agent such as a surfactant may be allowed to coexist for the purpose of enhancing the activity.
  • the method for allowing glycated amino acid oxidase to act on a sample containing glycated hemoglobin is not particularly limited.
  • glycated amino acid oxidase may be added to a sample containing glycated hemoglobin.
  • the step (1) and the step (2) can be performed simultaneously. Therefore, the step (2) may be performed simultaneously with the step (7) or may be performed after the step (7).
  • the reagent components necessary for the step (2) are prepared at the same time as the reagent addition step in which all the reagent components necessary for the step (3) are prepared, or at an earlier reagent addition step. Just do it.
  • the reagent components necessary for step (2) are supplied so as to be aligned in the first step that is started by the first reagent addition. (For example, this mode is preferable when an “erasing system” described later is constructed), but it may be supplied so as to be aligned in the second step.
  • the reagent component required for a process (2) may be supplied separately in a 1st step and a 2nd step.
  • the reagent component necessary for the step (2) and the reagent component necessary for the step (3) may be supplied in the same step. .
  • a reagent supply method may be appropriately determined in consideration of the above principle.
  • Step (6) Protease, etc.
  • the reactivity of the glycated amino acid oxidase used in step (2) to glycated protein is weak or almost absent, it may further include the following step (6).
  • (6) Step of degrading glycated hemoglobin into glycated hemoglobin degradation product by the action of protease
  • protease means an enzyme capable of catalyzing a reaction that acts on glycated hemoglobin and decomposes into glycated hemoglobin degradation products.
  • Proteases are sometimes called peptidases, proteinases and the like.
  • the glycated hemoglobin degradation product is not particularly limited as long as glycated hemoglobin is fragmented into glycated amino acids and / or glycated peptides by protease.
  • the size of the fragment is not particularly limited.
  • a glycated dipeptide for example, ⁇ -fructosyl valyl histidine
  • a glycated hexapeptide for example, ⁇ -fructosyl valyl histidyl leucyl threonyl prolyl glutamic acid
  • a glycated amino acid can be mentioned.
  • the protease used in the method of the present invention is not particularly limited, and aminopeptidase, dipeptidase, dipeptidyl peptidase, tripeptidyl peptidase, peptidyl dipeptidase, serine carboxypeptidase, proline carboxypeptidase, alanine carboxypeptidase, metal protease, Examples include cysteine carboxypeptidase, omega peptidase, serine endopeptidase, cysteine protease, aspartic protease, neutral protease, threonine endopeptidase and the like. As these proteases, commercially available ones may be used as they are, or those produced by publicly known literature according to the description may be used. Two or more of these proteases may be used in combination.
  • the proteases used in the present invention are preferably the following from the viewpoints of stability, reaction rate (specific activity), availability, and the like.
  • Metalloprotease, serine protease, serine carboxypeptidase, proteinase K, bromelain, papain, porcine pancreatic trypsin, Bacillus subtilis-derived protease, Aspergillus oryzae-derived protease, Aspergillus saitoi-derived protease, Streptomyces griseus-derived protease, etc. can be used.
  • protease A “Amano” G (Amano Enzyme), protease M “Amano” G (Amano Enzyme), protease S “Amano” G (Amano Enzyme), protease N “Amano” (Amano Enzyme), Peptidase R (Amano Enzyme), Papain M-40 (Amano Enzyme), Thermolysin (Daiwa Kasei), Samoaze PC10 (Daiwa Kasei), Toyoteam (Toyobo), Pronase (Roche), Protease Bacillus sp.
  • proteases that cannot be used in the present invention at this time can be used in the present invention if they have been modified by genetic engineering or chemical methods in the future so as to have the above properties. .
  • a protease newly obtained in the future and having the above properties can be used in the present invention.
  • assembled using such protease is also included by the technical idea of this invention.
  • the conditions for causing the protease to act on the glycated hemoglobin may be any conditions as long as the protease used acts on the glycated hemoglobin to be measured and decomposes into a glycated hemoglobin degradation product.
  • the amount of the protease to be used is appropriately selected depending on the content of the measurement object contained in the sample or the processing conditions.
  • the protease is used at a concentration of 0.01 KU / L or more, generally 0.1 KU / L or more, more generally 50 KU / L or more (preferably 100 KU / L or more, more preferably 300 KU / L or more, more preferably 500 KU / L or more).
  • the concentration in the reaction solution at the completion of the measurement is 2000 KU / L or less (preferably 1800 KU / L or less, more preferably 1500 KU / L or less, more preferably 1300 KU / L or less).
  • the pH when the protease is allowed to act may be unadjusted.
  • an appropriate pH adjuster such as hydrochloric acid, acetic acid, sulfuric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide is used so that the pH is suitable for the action of the protease used.
  • Etc. so that the pH in the reaction solution is 2 or more (preferably 3 or more, more preferably 4 or more, more preferably 5 or more), and the pH in the reaction solution is 9 or less (preferably 8.5).
  • the temperature at which the protease is allowed to act is, for example, 20 ° C. or more (preferably 30 ° C. or more, more preferably 35 ° C. or more) in the reaction solution, and 70 ° C. or less (preferably 60 ° C. or less) in the reaction solution. And more preferably 50 ° C. or lower, and further preferably 40 ° C. or lower).
  • the treatment time at this time may be a time sufficient for acting on the glycated hemoglobin to be measured and decomposing it into a glycated hemoglobin degradation product, for example, 5 seconds or more (preferably 1 minute or more, more preferably 3 minutes). ) And 180 minutes or less (preferably 60 minutes or less, more preferably 10 minutes or less).
  • the method for allowing protease to act on glycated hemoglobin is not particularly limited.
  • a protease may be added to a sample containing glycated hemoglobin.
  • the setting of the execution procedure of step (6) is to add glycated amino acid oxidase in advance in order to eliminate the influence of glycated amino acids that are non-measurement objects coexisting with the measurement object.
  • a measurement system hereinafter referred to as “elimination system” that starts the main reaction of glycated hemoglobin, which is the measurement target, after eliminating the non-measurement target glycated amino acid (deletion reaction)
  • the way of thinking is different.
  • the reagent components necessary for the step (6) may be prepared at the same time as the reagent addition step in which all of the reagent components necessary for the step (2) are prepared, or at an earlier reagent addition step.
  • the reagent components necessary for the step (6) are supplied so as to be aligned in the first step started by the first reagent addition. However, it may be supplied so as to be aligned in the second step.
  • the reagent component required for a process (6) may be supplied separately in a 1st step and a 2nd step.
  • the reagent component necessary for the step (6) and the reagent component necessary for the step (2) may be supplied in the same step.
  • the elimination reaction is performed in the first step, and this reaction is performed in the second step. Therefore, it is the second step that the reagent components necessary for the step (6) are prepared, and at this time, both the reagent components necessary for the step (6) and the reagent components necessary for the step (2) are all prepared.
  • the reagent components necessary for the step (6) may be supplied separately in the first step and the second step, and the reagent components necessary for the step (2) may be supplied in the first step and the second step. It may be supplied separately in two steps.
  • a reagent supply method may be appropriately determined in consideration of the above principle.
  • step (3) peroxidase, chromogenic substrate, etc.
  • the hydrogen peroxide produced in step (2) is brought into contact with a chromogenic substrate in the presence of peroxidase to produce a chromogenic dye.
  • the peroxidase used in the method of the present invention is not particularly limited as long as hydrogen peroxide can be brought into contact with a chromogenic substrate to produce a chromogenic dye.
  • Preferred examples include those derived from horseradish and microorganisms. To do. Of these, horseradish-derived peroxidase is preferable.
  • the peroxidase is commercially available with high purity and low cost.
  • the chromogenic substrate is not particularly limited as long as it is a chromogen that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to generate a dye alone.
  • a chromogen that reacts with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase to generate a dye alone.
  • Examples thereof include leuco chromogens, triphenylmethane derivatives, phenothiazine derivatives, diphenylamine derivatives and the like.
  • a leuco chromogen is used, and more preferably, a phenothiazine leuco chromogen is used.
  • N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt abbreviated as DA-64
  • 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7 -Bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt abbreviated as DA-67
  • 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine abbreviated as CCAP
  • 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine abbreviated as MCDP
  • BCMA 4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine, bis [3-bis (4-chlorophenyl) ) Methyl-4-dimethylaminophenyl] amine
  • BCMA 4,4′-bis (dimethylamin
  • DA-64 is preferable in that it is not easily affected by the coexisting substance derived from the specimen, and DA-67 is preferable in terms of sensitivity.
  • DA-67 (10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt) is preferable from the viewpoint that a glycated hemoglobin ratio can be obtained more effectively.
  • CCAP 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine
  • MCDP 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine
  • the phenothiazine leuco chromogen is preferably used, and DA-67 (10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt) is preferably used. Good.
  • the amount of the chromogenic substrate to be used is appropriately selected depending on the content of the measurement object contained in the sample or the processing conditions. For example, 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) is used as an example.
  • Measurement of phenothiazine sodium salt so that the concentration in the reaction solution at the completion of measurement is 0.001 mmol / L or more (preferably 0.003 mmol / L or more, more preferably 0.005 mmol / L or more).
  • the concentration in the reaction solution at the time of completion is 10 mmol / L or less (preferably 1 mmol / L or less, more preferably 0.1 mmol / L or less, more preferably 0.05 mmol / L or less).
  • a chromogenic substrate particularly when a phenothiazine-based leuco chromogen is used as the chromogenic substrate, it can be used at the same concentration as described above.
  • the conditions for allowing peroxidase to act in step (3) may be any conditions as long as the peroxidase used acts on hydrogen peroxide and a chromogenic substrate to produce a chromogenic dye.
  • the amount of peroxidase to be used is appropriately selected depending on the content of the measurement object contained in the sample or the processing conditions. For example, peroxidase is measured at a concentration of 0.1 KU / L in the reaction solution at the completion of the measurement. Or more (preferably 1 KU / L or more, more preferably 2 KU / L or more, more preferably 3 KU / L or more), and the concentration in the reaction solution at the completion of the measurement is 100 KU / L or less (preferably 50 KU).
  • the pH at which the peroxidase is allowed to act may be unadjusted.
  • an appropriate pH adjusting agent such as hydrochloric acid, acetic acid, sulfuric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide may be used so that the pH is suitable for the action of the peroxidase used.
  • Etc. so that the pH in the reaction solution is 2 or more (preferably 3 or more, more preferably 4 or more, more preferably 5 or more), and the pH in the reaction solution is 9 or less (preferably 8.5).
  • the temperature at which peroxidase acts is, for example, 20 ° C. or higher (preferably 30 ° C. or higher, more preferably 35 ° C. or higher) in the reaction solution, and 70 ° C. or lower (preferably 60 ° C. or lower) in the reaction solution. And more preferably 50 ° C. or lower, and further preferably 40 ° C. or lower).
  • the treatment time at this time may be a time sufficient for peroxidase to act on hydrogen peroxide and the chromogenic substrate to produce a chromogenic dye, for example, 5 seconds or more (preferably 1 minute or more, more preferably 3 minutes). ) And 180 minutes or less (preferably 60 minutes or less, more preferably 10 minutes or less).
  • a method for producing a coloring pigment by causing peroxidase to act on hydrogen peroxide and a coloring substrate is not particularly limited.
  • peroxidase may be added to the reaction solution in which hydrogen peroxide is generated (or is supposed to be generated) by the reaction in step (2).
  • the reagent components necessary for step (3) are prepared at the same time as the reagent addition step in which all of the reagent components necessary for step (2) are prepared, or at a later reagent addition step. Just do it.
  • the reagent components necessary for the step (3) are supplied so as to be aligned in the first step started by the first reagent addition. However, it may be supplied so as to be aligned in the second step.
  • the reagent component required for a process (3) may be supplied separately in a 1st step and a 2nd step.
  • the reagent component necessary for the step (3) and the reagent component necessary for the step (2) may be supplied in the same step. .
  • a reagent supply method may be appropriately determined in consideration of the above principle.
  • step (4) measurement of color development amount, etc.
  • step (4) the color development amount of the color developing dye obtained in step (3) is measured.
  • the amount of color development is measured in a suitable time range after the start of step (3) by measuring the amount of change in absorbance caused by the amount of dye developed by causing peroxidase to act on hydrogen peroxide and the color development substrate.
  • the wavelength for measuring the absorbance is not particularly limited, but the wavelength suitable for measurement varies depending on the dye. For example, when 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt is used as the chromogenic substrate, it is preferably selected from the range of 600 nm to 700 nm. As an example, the absorbance at 660 nm may be measured.
  • N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt is used as the chromogenic substrate, it is preferably selected from the range of 650 nm to 750 nm. As an example, the absorbance at 727 nm may be measured.
  • 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine is used as a chromogenic substrate, it is preferably selected from the range of 600 nm to 700 nm. As an example, the absorbance at 660 nm may be measured.
  • 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine is used as the chromogenic substrate, it is preferably selected from the range of 600 nm to 700 nm. As an example, the absorbance at 660 nm may be measured.
  • 4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine or bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine is used as the chromogenic substrate, select from the range of 700 nm to 800 nm. Is preferred. As an example, the absorbance at 750 nm may be measured.
  • the absorbance at 591 nm may be measured.
  • 4,4′-benzylidenebis N, N-dimethylaniline
  • the absorbance at 617 nm may be measured.
  • 4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine is used as the chromogenic substrate, it is preferably selected from the range of 650 nm to 750 nm. As an example, the absorbance at 700 nm may be measured.
  • an automatic analyzer capable of setting a two-step reagent addition step for example, by measuring the amount of change in absorbance in any time range while the second step is being performed, the measurement is performed. can do.
  • the timing is not particularly limited. For example, immediately after the addition of the second reagent and after a certain time has elapsed after the addition of the second reagent (for example, an arbitrary timing between 60 seconds and 600 seconds, preferably 300 seconds). Absorbance is measured at each time point, and the amount of change in absorbance can be determined from the difference.
  • various known methods for measuring changes in absorbance for example, the 1-point end method, the 2-point end method, the rate method, etc. may be used. These methods can be appropriately set according to the instruction manual of each automatic analyzer.
  • step (5) the color development amount obtained in step (4) is applied to the calibration curve of the glycated hemoglobin ratio and color development amount prepared in advance using a glycated hemoglobin calibrator valued by the glycated hemoglobin ratio, and glycated hemoglobin is applied. Calculate the ratio.
  • a typical calibration curve includes a mode in which the glycated hemoglobin ratio is taken on the x-axis and the color development amount is taken on the y-axis.
  • Calibration refers to a calibration curve in advance using a calibrator whose relationship between the value of the target measurement item (for example, the glycated hemoglobin ratio in the present invention) and the measured value (for example, the color development amount in the present invention) is known.
  • (Calibration curve) is prepared, and the measurement value of the sample is adapted to the calibration curve to obtain the value of the measurement item of the sample.
  • the calibrator is sometimes called a standard reagent, a standard solution, or a calibration reagent.
  • the base composition of the calibrator used in the present invention is not particularly limited.
  • human blood-derived components may be used, or artificially prepared components may be used.
  • whole blood may be used, or some components such as blood cells may be separated and used.
  • shape of these calibrators is not particularly limited as long as the respective functions such as lyophilization, liquid and freezing are not impaired.
  • the solvent of the calibrator used in the present invention is not particularly limited, but distilled water or buffer can be used. Examples thereof include Good buffer solution, carbonate buffer solution, phosphate buffer solution, citrate buffer solution, acetate buffer solution, borate buffer solution, and tartaric acid buffer solution.
  • various antibacterial agents and preservatives can be used as necessary.
  • preservatives include various types of procrine (registered trademark, Superco), azides, chelating agents, antibiotics, antibacterial agents, and the like.
  • chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid and its salt.
  • Antibiotics include gentamicin, kanamycin, chloramphenicol and the like.
  • Antibacterial agents include piperacillin and imidazolidinyl urea.
  • various sugars, salts, and proteins can be used as necessary (for example, as a stabilizer).
  • the salt is not particularly limited, but sodium chloride, sodium acetate, sodium hydroxide, potassium chloride, potassium acetate, potassium hydroxide, aluminum chloride, aluminum acetate, aluminum hydroxide, calcium chloride, calcium acetate, calcium hydroxide, etc. Can be mentioned.
  • the saccharide is not particularly limited, and examples thereof include sucrose, trehalose, cyclodextrin, glycerol, gluconate, amino acids and the like.
  • Proteins are not particularly limited, but inactive proteins such as serum albumins, globulins or fibrous proteins can be added.
  • a preferred protein is bovine serum albumin.
  • the calibrator used in the present invention includes ferrocyanides such as potassium ferrocyanide and nitrous acid as necessary (for example, for the purpose of avoiding the influence of a reducing substance derived from a sample, methemoglobin hemoglobin and promoting the reaction of a protease).
  • ferrocyanides such as potassium ferrocyanide and nitrous acid as necessary (for example, for the purpose of avoiding the influence of a reducing substance derived from a sample, methemoglobin hemoglobin and promoting the reaction of a protease).
  • Nitrites such as sodium may or may not be added.
  • a surfactant can be used as necessary.
  • the surfactant that can be used in the present invention is not particularly limited.
  • nonionic surfactants and / or zwitterionic surfactants and / or cationic surfactants and / or anionic surfactants can be used.
  • the nonionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include polyoxyethylene alkyl ether, fatty acid sorbitan ester, alkyl polyglucoside, fatty acid diethanolamide, and alkyl monoglyceryl ether.
  • the zwitterionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include alkyldimethylamine oxide and alkylcarboxybetaine.
  • cationic surfactant examples include, but are not limited to, benzalkonium chloride, distearyldimethylammonium chloride, coconutamine acetate, stearylamine acetate and the like.
  • anionic surfactant examples include, but are not limited to, dipotassium alkenyl succinate.
  • additives that can be used in the calibrator used in the present invention can be used in combination with the function as an anionic surfactant.
  • concentration and conditions of each of the above components may vary depending on the type of reagents and enzymes used, such as reactivity and / or stability. It can be appropriately determined in consideration.
  • the above-mentioned determination does not necessarily need to be an optimal solution, and it does not matter if a practically sufficient performance is ensured for the measurement of the glycated hemoglobin ratio depending on the purpose and situation.
  • the calibrator used in the present invention is priced by the glycated hemoglobin ratio.
  • human blood is pooled and glycated hemoglobin ratios are priced by various measurement methods.
  • artificially glycated proteins and amino acids such as hemoglobin and their degradation products are used as the pooled serum. It can also be added to adjust the glycated hemoglobin ratio.
  • the pricing of the glycated hemoglobin ratio of the calibrator used in the present invention can be performed by various measurement methods such as HPLC method, enzyme method, latex immunization method using standard substances such as IFCC and NGSP.
  • the hemoglobin concentration can be measured by various measurement methods such as the cyanmethemoglobin method, the hematin hydrochloride method, the alkali hematin method, the oxyhemoglobin method, the SLS-hemoglobin method, the Hb / red measurement method, and the HbCO measurement method.
  • Drabkin reagent potassium ferricyanide 200 mg, potassium cyanide 50 mg and sodium bicarbonate 1.0 g dissolved in distilled water to 1 L
  • add 4.5 ml of Drabkin reagent and 0.5 ml of sample is allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and the absorbance of the produced cyanomethemoglobin is measured at 540 nm.
  • the number of pricing levels of the calibrator used in the present invention is not particularly limited as long as it is 2 or more (that is, 2 or more types having different glycated hemoglobin ratios). Preferably, it is 2 levels, but it may be 3 levels or more (preferably 5 levels or less).
  • a sample that does not contain glycated hemoglobin, such as purified water or buffer is used in place of the calibrator at the time of calibration. 3 levels of calibration can be performed.
  • the reason why the level 2 is preferable is that as the level increases, the amount of reagent to be used increases, which takes time.
  • the low concentration is 3% to 7% and the high concentration is 8% to 20%. It is more desirable that the low concentration is 3% to 6% and the high concentration is 8% to 20%. More preferably, the low concentration is 3% to 6%, the high concentration is 10% to 20%, and even more preferably, the low concentration is 3% to 5.5%, and the high concentration is 10% to 20%.
  • the low concentration is 3% to 5%, the high concentration is 10% to 20%, particularly preferably the low concentration is 3% to 5%, and the high concentration is 10% to 18%.
  • the calibrator used in the present invention is a glycated hemoglobin calibrator valued at a ratio of glycated hemoglobin of two or more levels, and when the one having the lowest total hemoglobin concentration in the reaction solution at the time of completion of measurement is taken as 1 (
  • the total hemoglobin concentration of all the remaining) is preferably about 1 to 6 times, more preferably about 1 to 5 times, more preferably about 1 to 4 times,
  • the ratio is more preferably about 1 to 3.5 times, and particularly preferably about 1 to 3 times. More preferably, it is about 1 to 2.5 times, more preferably about 1 to 2 times, still more preferably about 1 to 1.5 times, and particularly preferably about 1 time (equal concentration).
  • the order of increasing and decreasing the total hemoglobin concentration may be unrelated to the order of increasing and decreasing the glycated hemoglobin ratio.
  • the total hemoglobin concentration may be the highest or any may be the lowest. From the viewpoint that a better correlation is likely to be obtained, it is preferable that a low glycated hemoglobin ratio has a low total hemoglobin concentration and a high glycated hemoglobin ratio has a high total hemoglobin concentration.
  • the calibrator used in the present invention may be a calibrator prepared so as to be diluted to satisfy the ratio of the total hemoglobin concentration.
  • the absolute value of the total hemoglobin concentration of the calibrator used in the present invention is not particularly limited, but preferably the concentration in the reaction solution upon completion of the measurement is 0.1 ⁇ mol / L or more (preferably 1 ⁇ mol / L or more, more preferably 3 ⁇ mol / L). And the concentration in the reaction solution upon completion of the measurement may be set to 50 ⁇ mol / L or less (preferably 10 ⁇ mol / L or less, more preferably 8 ⁇ mol / L or less).
  • the calibrator used in the present invention may be a calibrator that is prepared so as to be diluted to satisfy the absolute value of the total hemoglobin concentration.
  • the total hemoglobin concentration of the calibrator alone is not particularly limited.
  • it can be about 10 ⁇ mol / L to 900 ⁇ mol / L, preferably about 20 ⁇ mol / L to 700 ⁇ mol / L, and more preferably 30 ⁇ mol. / L to about 500 ⁇ mol / L, more preferably about 40 ⁇ mol / L to about 300 ⁇ mol / L, and even more preferably about 50 ⁇ mol / L to about 250 ⁇ mol / L.
  • a calibrator of 50 ⁇ mol / L to 200 ⁇ mol / L may be used as it is, or a calibrator of 2 mmol / L to 5 mmol / L may be diluted with water or a pretreatment solution.
  • the absolute value of the glycated hemoglobin concentration of the calibrator used in the present invention is not particularly limited, but preferably the concentration in the reaction solution at the completion of the measurement is 0.01 ⁇ mol / L or more (preferably 0.05 ⁇ mol / L or more, more preferably 0.03 ⁇ mol / L) and the concentration in the reaction solution at the completion of the measurement is set to 15 ⁇ mol / L or less (preferably 10 ⁇ mol / L or less, more preferably 1 ⁇ mol / L or less). It only has to be.
  • the calibrator used in the present invention may be a calibrator prepared so as to be diluted to satisfy the absolute value of the glycated hemoglobin concentration.
  • the glycated hemoglobin concentration of the calibrator alone is not particularly limited, but as an example, a calibrator of about 1 ⁇ mol / L to 40 ⁇ mol / L can be used, and preferably a calibrator of about 1 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L is used. Can do. Furthermore, for example, a calibrator of 1 ⁇ mol / L to 20 ⁇ mol / L may be used as it is, or a calibrator of 100 ⁇ mol / L to 500 ⁇ mol / L may be diluted with water or a pretreatment liquid.
  • the reaction is preferably performed in a buffer solution.
  • the buffer solution is not particularly limited, and examples thereof include Good buffer solution, carbonate buffer solution, phosphate buffer solution, citrate buffer solution, acetate buffer solution, borate buffer solution, and tartaric acid buffer solution.
  • antibacterial agents and preservatives can be used as necessary.
  • preservatives include various types of procrine (registered trademark, Superco), azides, chelating agents, antibiotics, antibacterial agents, and the like.
  • chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid and its salt.
  • Antibiotics include gentamicin, kanamycin, chloramphenicol and the like.
  • Antibacterial agents include piperacillin and imidazolidinyl urea.
  • various sugars, salts, and proteins can be used as necessary (for example, as an enzyme stabilizer).
  • the salt is not particularly limited, but sodium chloride, sodium acetate, sodium hydroxide, potassium chloride, potassium acetate, potassium hydroxide, aluminum chloride, aluminum acetate, aluminum hydroxide, calcium chloride, calcium acetate, calcium hydroxide, etc. Can be mentioned.
  • the saccharide is not particularly limited, and examples thereof include sucrose, trehalose, cyclodextrin, glycerol, gluconate, amino acids and the like.
  • Proteins are not particularly limited, but inactive proteins such as serum albumins, globulins or fibrous proteins can be added.
  • a preferred protein is bovine serum albumin.
  • Preferred inactive proteins are those that do not contain protease impurities that cause enzymatic degradation.
  • a ferrocyanide such as potassium ferrocyanide or a nitrite such as sodium nitrite is used as necessary (for example, for the purpose of avoiding the influence of a reducing substance derived from a sample, methemoglobin hemoglobin or promoting the reaction of a protease).
  • a ferrocyanide such as potassium ferrocyanide or a nitrite such as sodium nitrite is used as necessary (for example, for the purpose of avoiding the influence of a reducing substance derived from a sample, methemoglobin hemoglobin or promoting the reaction of a protease).
  • a nitrite such as sodium nitrite
  • a surfactant can be used as necessary.
  • the surfactant that can be used in the present invention is not particularly limited.
  • nonionic surfactants and / or zwitterionic surfactants and / or cationic surfactants and / or anionic surfactants can be used.
  • the nonionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include polyoxyethylene alkyl ether, fatty acid sorbitan ester, alkyl polyglucoside, fatty acid diethanolamide, and alkyl monoglyceryl ether.
  • the zwitterionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include alkyldimethylamine oxide and alkylcarboxybetaine.
  • cationic surfactant examples include, but are not limited to, benzalkonium chloride, distearyldimethylammonium chloride, coconutamine acetate, stearylamine acetate and the like.
  • anionic surfactant examples include, but are not limited to, dipotassium alkenyl succinate.
  • additives that can be used in the present invention can be used in combination with a function as an anionic surfactant.
  • concentration and conditions of each of the above components may vary depending on the type of reagents and enzymes used, such as reactivity and / or stability. It can be appropriately determined in consideration.
  • the above determination does not necessarily need to be an optimal solution, and there is no problem as long as a practically sufficient performance is ensured for the measurement of glycated hemoglobin according to the purpose and situation.
  • Glycated hemoglobin ratio measurement kit One embodiment of the present invention is a kit for measuring a glycated hemoglobin ratio comprising the following reagents (a) to (e): (A) a reagent containing a compound having a sulfo group (b) a reagent containing a glycated amino acid oxidase (c) a reagent containing a peroxidase (d) a color forming which produces a coloring dye upon contact with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase Reagent containing substrate (e) Glycated hemoglobin calibrator priced by glycated hemoglobin ratio
  • the kit of the present invention may further contain the following (f).
  • the configuration of the glycated hemoglobin ratio measurement kit of the present invention is not particularly limited.
  • glycated amino acid oxidase, buffer solution, protease, peroxidase, chromogenic substrate, chelating reagent that captures ions that interfere with the enzyme reaction, ascorbate oxidase that eliminates ascorbic acid that interferes with the determination of hydrogen peroxide, surfactant , Stabilizers, excipients, antibacterial agents, preservatives, and instruction manuals describing the measurement method according to the present invention on a recording medium such as paper may be included.
  • the measurement kit for the glycated hemoglobin ratio of the present invention can be used for the method for measuring the glycated hemoglobin ratio of the present invention. Therefore, the kit of this invention may be comprised with the articles
  • the kit of the present invention may be composed of several parts according to the aspect of the automatic analyzer.
  • a kit that can be applied to an automatic analyzer capable of setting a two-step reagent addition step it may be composed of two parts, a first reagent and a second reagent.
  • the kit may be composed of more than two parts, and the kit may be configured so that the first reagent and the second reagent can be prepared immediately before use.
  • the glycated hemoglobin ratio measurement kit of the present invention is composed of two parts, and is used as the first reagent. It is preferable that a glycated amino acid oxidase is contained and a protease is contained in the second reagent.
  • the first reagent may further contain any one or more of catalase, peroxidase, and dye.
  • the kit of the present invention may further contain a sample pretreatment agent in addition to the above configuration.
  • the form of the pretreatment agent is not particularly limited.
  • the purpose of the pretreatment is not particularly limited, and examples thereof include dilution and hemolysis.
  • a compound having a sulfo group may be included in the pretreatment agent, and a step of bringing the compound having a sulfo group into contact with a sample containing glycated hemoglobin during the pretreatment (step (1)) may be performed.
  • a pretreatment agent for a chromogenic substrate and a protease that produce a chromogenic dye upon contact with hydrogen peroxide in the presence of a compound having a sulfo group, glycated amino acid oxidase, peroxidase, and peroxidase.
  • An example of allocation to two reagents is illustrated in Table 1.
  • A represents a compound having a sulfo group
  • B represents a glycated amino acid oxidase
  • C represents a peroxidase
  • D represents a chromogenic substrate that forms a chromogenic dye upon contact with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase
  • F represents a protease.
  • the HbA1c ratio was determined by the following method. 1. Reagent first reagent (R1) MES buffer (pH 6.5) 100 mM CaCl 2 0.71 g / L Protease 100KU / L Peroxidase 3.7KU / L Sodium dodecylbenzenesulfonate 3g / L Second reagent (R2) MES buffer (pH 6.5) 100 mM Saccharified amino acid oxidase 5KU / L DA-67 16mg / L 2.
  • Measurement wavelength (nm) (sub / main) 800/660 Liquid volume ratio Sample / R1 / R2 10 ⁇ L / 120 ⁇ L / 40 ⁇ L (S: R1: R2 1: 12: 4)
  • Reaction temperature 37 ° C ABS LIMIT 32000 increase calibration 0.0-10000 absorbance launch
  • Calibration curve A includes calibrator 1 (hemoglobin (hereinafter referred to as Hb) 66.0 ⁇ mol / L, HbA1c 2.93 ⁇ mol / L, HbA1c ratio 6.2%) and calibrator 2 (Hb 66.0 ⁇ mol / L, HbA1c 7 .34 ⁇ mol / L, HbA1c ratio 12.3%).
  • the calibration curve B includes calibrator 3 (Hb 78.8 ⁇ mol / L, HbA1c 3.49 ⁇ mol / L, HbA1c ratio 6.2%), calibrator 4 (Hb 78.8 ⁇ mol / L, HbA1c 8.75 ⁇ mol / L, HbA1c). And a ratio of 12.3%).
  • the calibration curve C includes the calibrator 5 (Hb 56.9 ⁇ mol / L, HbA1c 2.52 ⁇ mol / L, HbA1c ratio 6.2%), and the calibrator 6 (Hb 56.9 ⁇ mol / L, HbA1c 6.32 ⁇ mol / L, HbA1c). And a ratio of 12.3%).
  • the calibration curve D includes a calibrator 7 (Hb 50.0 ⁇ mol / L, HbA1c 2.21 ⁇ mol / L, HbA1c ratio 6.2%), and a calibrator 8 (Hb 97.6 ⁇ mol / L, HbA1c 10.83 ⁇ mol / L, HbA1c). And a ratio of 12.3%).
  • 1 to 4 show correlation data between the method of the present invention and the HPLC method.
  • the correlation equations with the HPLC method when using the calibration curves A to D were as shown in the following (1) to (4), respectively.
  • the correlation between the method of the present invention and the HPLC method was very good.
  • Example 2 [Comparative Example 1] The HbA1c ratio was determined by the following method. 1. Reagent first reagent (R1) HEPES buffer (pH 7.3) 100 mM CaCl 2 0.71 g / L Protease 100KU / L Peroxidase 3.7KU / L Additives listed in Table 2 3 g / L Second reagent (R2) HEPES buffer (pH 7.3) 100 mM Saccharified amino acid oxidase 5KU / L DA-67 16mg / L 2. sample 10 samples of blood cells diluted 30 times with purified water before measurement Measurement parameters The measurement parameters were measured by the method described in Example 1.
  • the HbA1c ratio was obtained by comparing the above measurement results with the calibration curves created by the calibrator 1 and calibrator 2 described in Example 1 and the calibration curves created using the reagents A to E described in Table 2.
  • the HbA1c ratio was obtained by comparing the calibration curves created by the calibrator 1 and the calibrator 2 described in Example 1 with the calibration curves created using the reagents F and G.
  • the HbA1c ratio is a value calculated as an NGSP value.
  • the HbA1c ratio was determined by the following method. 1. Reagent first reagent (R1) MES buffer (pH 6.5) 100 mM CaCl 2 0.71 g / L Surfactant 1g / L Protease 100KU / L DA-67 16mg / L Sodium dodecylbenzenesulfonate 3g / L Second reagent (R2) MES buffer (pH 6.5) 100 mM Saccharified amino acid oxidase 5KU / L Peroxidase 3.7KU / L 2.
  • Measurement wavelength (nm) (sub / main) 800/660 Liquid volume ratio Sample / R1 / R2 10 ⁇ L / 120 ⁇ L / 40 ⁇ L (S: R1: R2 1: 12: 4)
  • Reaction temperature 37 ° C ABS LIMIT 32000 increase calibration 0.0-10000 absorbance launch
  • the above measurement results were compared with the following calibration curves E to H (x axis: HbA1c ratio, y axis: color development amount) to obtain the HbA1c ratio.
  • the HbA1c ratio is a value calculated as an NGSP value.
  • the calibration curve E includes a calibrator 9 (hemoglobin (hereinafter referred to as Hb) 210.5 ⁇ mol / L, HbA1c 7.0 ⁇ mol / L, HbA1c ratio 5.2%), and a calibrator 10 (Hb 210.5 ⁇ mol / L, HbA1c 19 3 ⁇ mol / L, HbA1c ratio 10.5%).
  • the calibration curve F includes a calibrator 11 (Hb 421.1 ⁇ mol / L, HbA1c 14.0 ⁇ mol / L, HbA1c ratio 5.2%), and a calibrator 12 (Hb 210.5 ⁇ mol / L, HbA1c 19.3 ⁇ mol / L, HbA1c). The ratio was 10.5%).
  • the calibration curve G includes a calibrator 13 (Hb 634.9 ⁇ mol / L, HbA1c 21.2 ⁇ mol / L, HbA1c ratio 5.2%), and a calibrator 14 (Hb 210.5 ⁇ mol / L, HbA1c 19.3 ⁇ mol / L, HbA1c). The ratio was 10.5%).
  • the calibration curve H includes a calibrator 15 (Hb 833.3 ⁇ mol / L, HbA1c 27.8 ⁇ mol / L, HbA1c ratio 5.2%), and a calibrator 16 (Hb 210.5 ⁇ mol / L, HbA1c 19.3 ⁇ mol / L, HbA1c). The ratio was 10.5%).
  • the present invention contributes to fields such as diagnosis and medical treatment such as measurement of a glycated hemoglobin ratio useful as a diabetes marker.

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Abstract

本発明は、糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程、糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる工程、前記工程で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる工程、前記工程で得られた発色色素の発色量を測定する工程、糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに前記工程で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する工程を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法を提供する。

Description

ヘモグロビンの糖化率測定方法
　本発明は、ヘモグロビンの糖化率の測定方法に関する。より詳しくは、血液等の生体試料中の糖化ヘモグロビンの割合を、酵素反応を利用して測定する方法およびそのための組成物に関する。
　糖尿病のマーカーの１つとしてＨｂＡ１ｃなどの糖化ヘモグロビンが利用されている。ＨｂＡ１ｃとはヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端のバリンのアミノ基にグルコースが結合した糖化ヘモグロビンのことである。糖尿病マーカーとして糖化ヘモグロビンを用いる際には、ヘモグロビンの糖化率、すなわち全ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の比率（以後、「糖化ヘモグロビン比率」とも記載する。）を算出して診断に用いる。例えば全ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ濃度の比率（以後、「ＨｂＡ１ｃ比率」とも記載する。）は血中のグルコース量と比較してその量が急激に変動せず、１～２か月前の血糖値とよく相関するので糖尿病の指標として優れているとされている。
　現在糖化ヘモグロビン比率の測定法としては高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、ラテックス凝集免疫比濁法が普及している。ＨＰＬＣ法はカラム価格が高い、また処理能力が低いという問題がある。またラテックス凝集免疫比濁法は測定に使用する分析装置の反応槽を汚染し、メンテナンスに手間がかかるという問題がある。そこで、これらの問題を解消した酵素法が近年着目されており、普及している。
　糖化ヘモグロビン比率を測定するに際し酵素法として代表的な方法は、非酵素反応で全ヘモグロビン濃度を測定し、別途、酵素反応で糖化ヘモグロビン濃度を測定後、計算式から糖化ヘモグロビン比率を算出するものである。
　全ヘモグロビン濃度の測定法としては国際標準法であるシアンメトヘモグロビン法、塩酸ヘマチン法、アルカリヘマチン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法、Ｈｂ・ｒｅｄ計測法、またはＨｂＣＯ計測法などが挙げられる。
　全ヘモグロビン濃度は、濃度既知で全ヘモグロビン濃度が異なる２種のキャリブレーターを用いて全ヘモグロビン濃度のキャリブレーションカーブを作成し、続いて試料中の全ヘモグロビン量を測定し、前記キャリブレーションカーブを用いて算出する。
　一方、糖化ヘモグロビン濃度測定法としては糖化ヘモグロビンまたはその分解産物に酸化還元酵素を反応させて過酸化水素を生成し、さらに該過酸化水素をパーオキシダーゼ存在下で発色基質と反応させて発色量を測定する比色定量法である（特許文献１）。
　糖化ヘモグロビン濃度は、濃度既知で糖化ヘモグロビン濃度が異なる２種のキャリブレーターを用いて糖化ヘモグロビン濃度のキャリブレーションカーブを作成し、続いて試料中の糖化ヘモグロビン量を測定し、前記キャリブレーションカーブを用いて算出する。
　例えば糖化ヘモグロビンとしてＨｂＡ１ｃを選択した場合、糖化ＨｂＡ１ｃ比率は上記反応で得られた全ヘモグロビン濃度や糖化ヘモグロビン濃度を以下の計算式に当てはめることで算出できる。
　
　ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ）値
　　＝０．０９１５　×　ＨｂＡ１ｃ濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）／総Ｈｂ濃度（ｍｏｌ／Ｌ）＋２．１５
　
　ＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値＝０．９８０　×　ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ）値　－　０．２４５
　
　したがって、酵素法によるＨｂＡ１ｃ比率測定方法を自動分析機に適用する場合、全ヘモグロビンを測定するチャンネルとＨｂＡ１ｃを測定するチャンネルの２チャンネルが必要となるため、２チャンネル分の試薬が必要となり、煩雑となる。また、２種類の測定を行うことから、ＨｂＡ１ｃ比率の測定処理速度は、１チャンネルを用いて１種類の測定を行う方法と比べて低下する。
特許第４４２７１３７号
　本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、酵素法を用いて糖化ヘモグロビン比率を測定する方法を、より簡便、より迅速、及び／又はより正確なものに向上させること、および／または、前記測定方法に用いるためのキャリブレーター、試薬組成物等を提供することにある。
　本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。理論に拘束されることは望まないが、本発明では、スルホ基を持つ化合物をヘモグロビンに接触させることで、ヘモグロビン分子中に含まれる２価の鉄イオンが部分的に酸化されて還元能が所定の割合で弱められ、その還元能が弱められたヘモグロビンが、その量に応じて、糖化ヘモグロビンに対する糖化アミノ酸オキシダーゼなどの酵素反応で発生する過酸化水素の濃度を低下させることで、ペルオキシダーゼ存在下における過酸化水素と発色基質との反応により得られる発色量と糖化ヘモグロビン比率との間で強い相関関係を生じさせていると推測される。そして本発明者らは、この強い相関関係は、キャリブレーターとして２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用い、それらの全ヘモグロビン濃度が所定の比率となるものを用いることで、より相関関係が高められることをも見出した。
　すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
［項１］
　以下の（１）～（５）の工程を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法：
　（１）糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程、
　（２）糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる工程、
　（３）工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる工程、
　（４）工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する工程、及び、
　（５）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する工程。
［項２］
　前記（５）の工程で用いる糖化ヘモグロビンキャリブレーターとして、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを使用し、測定完了時の反応液中における全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度はその１倍～６倍の濃度である、項１に記載の測定方法。
［項３］
　さらに、以下の（６）の工程を含む、項１又は２の測定方法：
　（６）糖化ヘモグロビンをプロテアーゼの作用により糖化ヘモグロビン分解物に分解する工程。
［項４］
　さらに、以下の（７）の工程を含む、項１～３のいずれかに記載の測定方法：
　（７）糖化ヘモグロビンを含む試料を溶血させる工程。
［項５］
　前記（１）の工程で用いるスルホ基を持つ化合物が、ベンゼンスルホン酸、アルキルスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸、ベンゾチアゾリンスルホン酸、アントラキノンスルホン酸、カンファースルホン酸、ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、項１～４のいずれかに記載の測定方法。
［項６］
　前記（１）の工程で用いるスルホ基を持つ化合物が、ドデシルベンゼンスルホン酸、３－アミノベンゼンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸、４－アミノアゾベンゼン－４’－スルホン酸、４－アミノ－４’－ニトロスチルベン－２，２’－ジスルホン酸、４，４’－ジアゾスチルベンゼン－２，２’－ジスルホン酸、スルファニル酸、５－スルホイソフタル酸、５－アミノ－２－クロロトルエン－４－スルホン酸、アルキルナフタレンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、８－アミノ－１－ナフタレンスルホン酸、ドデシルナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシル、ジアルキルスルホコハク酸、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、項１～５のいずれかに記載の測定方法。
［項７］
　上記（３）の工程で用いる発色基質が、ロイコ型色原体である、項１～６のいずれかに記載の測定方法。
［項８］
　上記（３）の工程で用いる発色基質が、フェノチアジン系のロイコ型色原体である、項１～７のいずれかに記載の測定方法。
［項９］
　上記（３）の工程で用いる発色基質が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン　ナトリウム塩、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン、及び１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンからなる群より選択される少なくとも１種のフェノチアジン系のロイコ型色原体である、項１～８のいずれかに記載の測定方法。
［項１０］
　上記（３）の工程で用いる発色基質が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン　ナトリウム塩である、項１～９のいずれかに記載の測定方法。
［項１１］
　１チャンネルで実施される、項１～１０のいずれかに記載の測定方法。
［項１２］
　以下の（ａ）～（ｅ）の試薬を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定キット：
　（ａ）スルホ基を持つ化合物を含有する試薬、
　（ｂ）糖化アミノ酸オキシダーゼを含有する試薬、
　（ｃ）ペルオキシダーゼを含有する試薬、
　（ｄ）ペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質を含有する試薬、及び、
　（ｅ）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーター。
［項１３］
　前記（ｅ）の糖化ヘモグロビンキャリブレーターが、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターであって、測定完了時の反応液中における全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度がその１倍～６倍の濃度である糖化ヘモグロビンキャリブレーターである、項１２に記載の測定キット。
［項１４］
　さらに、以下の（ｆ）の試薬を含む項１２又は１３に記載の測定キット：
　（ｆ）プロテアーゼを含有する試薬。
　本発明により、全ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度を別々に測定して値を算出する必要がなくなり、酵素法によって糖化ヘモグロビン比率を測定するにあたり汎用の自動分析機において１チャンネルしか必要とせず、より簡便、より迅速、及び／又はより正確な測定が可能になる。
実施例１における、本発明の方法（キャリブレーションカーブＡを適用した場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例１における、本発明の方法（キャリブレーションカーブＢを適用した場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例１における、本発明の方法（キャリブレーションカーブＣを適用した場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例１における、本発明の方法（キャリブレーションカーブＤを適用した場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例２における、本発明の方法（表２記載の試薬Ａを用いた場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例２における、本発明の方法（表２記載の試薬Ｂを用いた場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例２における、本発明の方法（表２記載の試薬Ｃを用いた場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例２における、本発明の方法（表２記載の試薬Ｄを用いた場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例２における、本発明の方法（表２記載の試薬Ｅを用いた場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 比較例１における方法（表２記載の試薬Ｆを用いた場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 比較例１における方法（表２記載の試薬Ｇを用いた場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例３における、本発明の方法（キャリブレーションカーブＥを適用した場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例３における、本発明の方法（キャリブレーションカーブＦを適用した場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例３における、本発明の方法（キャリブレーションカーブＧを適用した場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。 実施例３における、本発明の方法（キャリブレーションカーブＨを適用した場合）とＨＰＬＣ法との相関データを示す。
　本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「★～☆」と記載されていれば「★以上、☆以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。
　本発明において、酵素の活性については、明細書に記載がないものについては、原則として、市販品については容器や添付の説明書・パンフレット等に測定法や単位の記載があればそれに従う。また、文献に記載されたものであれば、その文献に記載されている活性測定方法に従う。
　活性の定義（測定方法）がわからない場合や、測定に必要な試薬の入手に制約がある場合などにおいては、当業者の常識に基づいて合理的に適宜基質を選定し、測定条件を決定した上で測定する。
［１．糖化ヘモグロビン比率の測定方法］
　本発明の実施態様の一つは、以下の（１）～（５）の工程を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法である。
（１）糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程
（２）糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる工程
（３）工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる工程
（４）工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する工程
（５）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する工程
　本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定方法では、全ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度とを別々に測定する必要がない。したがって、汎用の自動分析機において１チャンネルしか必要とせず、より簡便・迅速・正確な測定が可能になる。
　［１－１．測定対象、試料等について］
　本発明の糖化ヘモグロビン比率測定方法の測定対象となる試料は特に限定されない。例えば、全血、血漿、血清、血球等の他に、尿、髄液等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。
　本発明の測定方法の対象となる糖化ヘモグロビンは特に限定されない。例えば、ヘモグロビンのβ鎖に糖類が結合したものをヘモグロビンＡ１といい、糖の種類によってさらにＡ１ａ１、Ａ１ａ２、Ａ１ｂ、Ａ１ｃに分画される。一般に、ヘモグロビンのβ鎖にフルクトース１－６二リン酸が結合したものをヘモグロビンＡ１ａ１（ＨｂＡ１ａ１）、グルコース－６－リン酸が結合したものをヘモグロビンＡ１ａ２（ＨｂＡ１ａ２）、ピルビン酸が結合したものをヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、グルコースが結合したものをヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ） と呼ぶ。これらの分画のうち最も多いのがＡ１ｃ分画（ＨｂＡ１ｃ）であり、糖尿病マーカーとしてよく用いられている。本発明では前記の分画のいずれを測定対象としても良いが、好ましくはＨｂＡ１ｃである。
　本発明の方法は、糖尿病の診断に応用することができるため、上記の中でも特に全血試料、血球試料に有用である。特に限定されるものではないが、赤血球内の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、全血をそのまま溶血したり、全血から分離した赤血球を溶血したりして、この溶血試料を測定用の試料とすればよい。
　測定用試料の調製にあたっては、希釈操作を行ってもよい。希釈液には精製水を用いてもよいし、グッド緩衝液やリン酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。安定化剤としてアミノ酸、酸化合物、サポニンやシクロデキストリンなどの糖類を含んでもよい。その他、アジ化ナトリウムやプロクリンなどの保存剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類やラウリルトリメチルアンモニウム塩、アルキルベタインなどの界面活性剤など、何らかの成分を含む液を用いてもよい。
　試料には、広義には、キャリブレーターも含まれる。
　キャリブレーターとしては、特に限定されるものではないが、全血、血球、全血を精製水や試薬に溶解した液、血球を精製水や試薬に溶解した液などが挙げられる。前記溶解のための試薬としては、前記の測定用試料調製の目的で例示されている精製水または希釈液を用いてもよい。これらは、冷蔵または冷凍保存することが好ましく、中でも冷凍保存が好ましい。冷凍保存により凍結されたキャリブレーターは使用の際に解凍して用いればよい。
　また、キャリブレーターとして、前記の全血、血球、溶解液などを凍結乾燥させたものを用いることもできる。凍結乾燥されたキャリブレーターは使用の際に再溶解して用いればよい。前記再溶解の際には、例えば、前記の測定用試料調製の目的で例示されている精製水または希釈液を用いることができる。
　［１－２．工程（７）、溶血等について］
　本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定方法は、さらに、以下の（７）の工程を含んでもよい。
（７）糖化ヘモグロビンを含む試料を溶血させる工程
　工程（７）は、糖化ヘモグロビンを含む試料が全血または血球を含む場合に好ましく用いられる。
　工程（７）は、例えば、前記のように工程（１）～（５）に先立って測定用の試料を調製する際に実施することができる。また、工程（７）は、工程（２）～（５）に先立って工程（１）と同時に行ってもよい。また、工程（７）を実施してから工程（２）～（５）に先立って工程（１）を行ってもよい。
　自動分析機への適用を考慮する場合、工程（７）は測定用試料調製時に行うのではなく、試薬添加時に行うこともできる。この場合、最初の試薬添加により開始する第一ステップで行うことが好ましい。
　溶血とは赤血球膜が破壊される現象を指す。正常な全血や、生理食塩水などの等張液に赤血球を浮遊させた場合は溶血せず赤色不透明な懸濁液として観察されるが、溶血を起こすとヘモグロビンが漏出し、赤色透明な溶液に変化する。
　溶血方法は、特に制限されず、例えば、全血や血球を蒸留水や低張液に懸濁して浸透圧差を利用して赤血球膜を破壊する方法、界面活性剤を含む試薬に懸濁して赤血球膜を溶解させる方法、超音波による方法、凍結溶解による方法などが挙げられる。中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法または、浸透圧の差を利用する方法が好ましい。
　界面活性剤を用いる前記溶血方法に用いる界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン－ｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン　ソルビタン　アルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン　アルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、商品名Ｔｗｅｅｎ－２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等が挙げられる。また、ＣＨＡＰＳＯ、ＣＨＡＰＳ等の両イオン性の界面活性剤、コール酸ナトリウムやデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、塩化ベンゼトニウムなどの陽イオン性界面活性剤も使用可能である。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が０．５～１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０５～５重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒～１分程度攪拌すればよい。
　また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２～１００倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
　［１－３．工程（１）、スルホ基を持つ化合物等について］
　工程（１）では、糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる。
　スルホ基を持つ化合物としては、特に限定されないが、例えば、アルキルスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、ベンゼンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、ナフタレンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、スルホコハク酸、その塩またはそれらの誘導体、ベンゾチアゾリンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、アントラキノンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、カンファースルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体などが挙げられる。本発明において、より一層効果的に糖化ヘモグロビン比率を得ることができるという観点から、好ましくは、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩が用いられ、より好ましくはベンゼンスルホン酸、及びその誘導体、並びにそれらの塩が用いられる。ここで、塩の種類は限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができ、好ましくはナトリウム塩である。
　アルキルスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としてはラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸リチウム等が挙げられる。
　ベンゼンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としてはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、３－アミノベンゼンスルホン酸、４－アミノアゾベンゼン－４’－スルホン酸ナトリウム、４－アミノ－４’－ニトロスチルベン－２，２’－ジスルホン酸２ナトリウム、４，４’－ジアゾスチルベンゼン－２，２’－ジスルホン酸２ナトリウム、スルファニル酸、５－スルホイソフタル酸一ナトリウム、５－アミノ－２－クロロトルエン－４－スルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。好ましくは、ベンゼンスルホン酸、その誘導体、またはそれらの塩として、ドデシルベンゼンスルホン酸、３－アミノベンゼンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩である。
　ナフタレンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としては、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム、２－ナフタレンスルホン酸ナトリウム、８－アミノ－１－ナフタレンスルホン酸、ドデシルナフタレンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。好ましくは、アルキルナフタレンスルホン酸、及びその誘導体、並びにそれらの塩である。
　スルホコハク酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としてはスルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシルナトリウム、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム等が好ましい例として挙げられる。
　カンファースルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としては（±）－１０－カンファースルホン酸が挙げられる。
　ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としては４－クロロ－７－クロロスルホニル－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールが挙げられる。
　上記のうち特に好ましくはラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、スルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシルナトリウム、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウムであり、なかでも好ましくはアルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウムである。
　上記の化合物の添加濃度は特に限定されないが、処理溶液中の血球濃度が０．０１～１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０５～５重量％になるように添加することが好ましい。
　例えば、工程（１）を工程（７）と同時に行う場合、０．２５～１体積％の前記化合物を含む試薬にて行うことができる。また、例えば工程（１）を工程（２）と同時に行う場合、０．１～３体積％の前記化合物を含む試薬にて行うことができる。
　工程（１）において糖化ヘモグロビンを含む試料への前記の化合物の接触方法は特に限定されない。例えば試料を調製する際に糖化ヘモグロビンを含む試料へ添加剤を添加すればよい。
　その場合、工程（１）は工程（７）と同時に行ってもよいし、工程（７）の次に行ってもよい。また、工程（１）と工程（２）とを同時に行うことは可能である。
　自動分析機への適用を考慮する場合、工程（１）に必要な試薬成分は、工程（３）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより前の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（１）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで供給されていてもよい。
　［１－４．工程（２）、糖化アミノ酸オキシダーゼ等について］
　工程（２）では、糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる。
　本明細書において糖化アミノ酸オキシダーゼとはアマドリ化合物を酸化して過酸化水素を生成する反応を触媒することができる酵素を意味する。糖化アミノ酸オキシダーゼはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、アマドリアーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ、糖化ヘモグロビンオキシダーゼなどと呼ばれることもある。
　前記のアマドリ化合物としては、例えば、糖化タンパク質の一種である糖化ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン分解物の一種である糖化ジペプチド（例えば、α－フルクトシルバリルヒスチジンが知られている。）、糖化ヘモグロビン分解物の一種である糖化ヘキサペプチド（例えば、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸が知られている。）、糖化ヘモグロビン分解物の一種である糖化アミノ酸などが挙げられる。
　本発明の方法に用いる糖化アミノ酸オキシダーゼは特に限定されない。例えば、公知のものとして、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）属、アカエトミウム（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ウロクラディウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）属、コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属由来酵素およびその改変体などが使用できる。
　糖化ヘキサペプチドが反応する糖化アミノ酸オキシダーゼとしては特に限定されないが、ＷＯ０８／１０８３８５で糖化ヘキサペプチドオキシダーゼとして示されているものが挙げられる。
　また糖化タンパク質に反応する糖化アミノ酸オキシダーゼとしては特に限定されないが、ＷＯ２０１５／００５２５７、ＷＯ２０１５／００５２５８で糖化ヘモグロビンオキシダーゼとして示されているもの、ＷＯ２０１５／０６０４２９でアマドリアーゼとして示されているものなどが挙げられる。
　また、市販のものでは、ＦＰＯ－３０１（商標）（東洋紡）、ＦＰＯＸ－ＣＥ（商標）（キッコーマン）、ＦＰＯＸ－ＥＥ（商標）（キッコーマン）などを使用することができる。
　なお、現時点では本願発明に使用することはできない糖化アミノ酸オキシダーゼであっても、今後遺伝子工学的または化学的等の方法で改変を加え、上記の特性を有するように改良したものは、本願発明に使用できる。あるいは、今後新規に得られた糖化アミノ酸オキシダーゼであって、上記の特性を有する糖化アミノ酸オキシダーゼは、本願発明に使用できる。そして、そのような糖化アミノ酸オキシダーゼを用いて構築した糖化ヘモグロビン比率の測定系もまた、本願発明の技術思想に包含される。
　糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる条件は、用いる糖化アミノ酸オキシダーゼが測定対象の糖化ペプチド、糖化ヘモグロビンやそれらの分解産物に作用し過酸化水素を生成する条件であれば、いかなる条件でもよい。
　使用する糖化アミノ酸オキシダーゼの量は試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択される。例えば、一例として糖化アミノ酸オキシダーゼを、測定完了時の反応液中の濃度が０．１ＫＵ／Ｌ以上（好ましくは１ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは２ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは３ＫＵ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が１００ＫＵ／Ｌ以下（好ましくは５０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは５ＫＵ／Ｌ以下）となるように加える。
　糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる際のｐＨは無調整でもよく、使用する酵素の作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、反応液中のｐＨが２以上（好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上）となるように、かつ、反応液中のｐＨが９以下（好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８以下）となるように調整してもよい。
　糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる温度は、例えば、反応液中で２０℃以上（好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上）となるように、かつ、反応液中で７０℃以下（好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下）となるように行うことができる。
　この際の作用時間は、測定対象の糖化ペプチド、糖化ヘモグロビンやその分解産物に作用し過酸化水素を生成するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒以上（好ましくは１分以上、さらに好ましくは３分以上）となるように、かつ、１８０分以下（好ましくは６０分以下、さらに好ましくは１０分以下）になるように行うことができる。
　また、糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる際には、作用性を高めるため等の目的で界面活性剤などの変性剤を共存させても良い。
　工程（２）において糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる方法は特に限定されない。例えば糖化ヘモグロビンを含む試料へ糖化アミノ酸オキシダーゼを添加すればよい。
　その場合、工程（１）の説明で述べたとおり工程（１）と工程（２）とを同時に行うことは可能である。したがって、工程（２）は工程（７）と同時に行ってもよいし、工程（７）の次に行ってもよい。
　自動分析機への適用を考慮する場合、工程（２）に必要な試薬成分は、工程（３）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより前の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（２）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで揃うように供給されていてもよい（例えば、後述の「消去系」を構築する場合にはこの態様が好ましい。）が、第二ステップで揃うように供給されてもよい。第二ステップで揃うように供給する場合は、工程（２）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
　また、例えば１段階の試薬添加ステップしか設定できない自動分析機への適用においては、工程（２）に必要な試薬成分と工程（３）に必要な試薬成分とが同一ステップで供給されてもよい。
　なお、３段階以上の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用についても、上記の原則を考慮して適宜試薬の供給方法を決めればよい。
　［１－５．工程（６）、プロテアーゼ等について］
　工程（２）で用いられる前記糖化アミノ酸オキシダーゼの糖化タンパク質に対する反応性が弱いかまたはほとんど無い場合は、さらに、以下の（６）の工程を含んでもよい。
（６）糖化ヘモグロビンをプロテアーゼの作用により糖化ヘモグロビン分解物に分解する工程
　本明細書においてプロテアーゼとは糖化ヘモグロビンに作用して糖化ヘモグロビン分解物に分解する反応を触媒することができる酵素を意味する。プロテアーゼはペプチダーゼ、プロテイナーゼなどと呼ばれることもある。
　前記の糖化ヘモグロビン分解物としては、糖化ヘモグロビンがプロテアーゼにより、糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに断片化されたものであれば特に限定されない。断片の大きさも特に制限されない。例えば、糖化ジペプチド（例えば、α－フルクトシルバリルヒスチジン）、糖化ヘキサペプチド（例えば、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸）、または、糖化アミノ酸などが挙げられる。
　本発明の方法に用いるプロテアーゼは特に限定されず、アミノペプチターゼ、ジペプチターゼ、ジペプチジルペプチターゼ、トリペプチジルペプチターゼ、ペプチジルジペプチターゼ、セリンカルボキシペプチターゼ、プロリンカルボキシペプチダーゼ、アラニンカルボキシペプチダーゼ、金属プロテアーゼ、システイン性カルボキシペプチターゼ、オメガペプチターゼ、セリンエンドペプチターゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、スレオニンエンドペプチターゼなどが例示できる。
　これらのプロテアーゼは、市販のものをそのまま用いても良いし、公知文献に記載されたものをその記載にしたがって製造したものを使用しても良い。これらのプロテアーゼを２以上組み合わせて用いてもよい。
　本発明に用いるプロテアーゼは、安定性、反応速度（比活性）、入手の容易性などから、以下のものが好ましい。
　メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ　ｓａｉｔｏｉ由来プロテアーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ由来プロテアーゼ等が使用できる。
　市販品としては、例えば、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム）、プロテアーゼＮ「アマノ」（天野エンザイム）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム）、パパインＭ－４０（天野エンザイム）、サーモリシン（大和化成）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成）、トヨチーム（東洋紡）、プロナーゼ（ロシュ）、プロテアーゼ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．由来（シグマアルドリッチ）、プロテアーゼ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ由来　Ｔｙｐｅ　ＸＩＶ（シグマアルドリッチ）、プロテアーゼＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ由来　Ｔｙｐｅ　ＸＸＩ（シグマアルドリッチ）、アクチナーゼＥ（科研製薬）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（ロシュ）が挙げられる。
　なお、現時点では本願発明に使用することはできないプロテアーゼであっても、今後遺伝子工学的または化学的等の方法で改変を加え、上記の特性を有するように改良したものは、本願発明に使用できる。あるいは、今後新規に得られたプロテアーゼであって、上記の特性を有するプロテアーゼは、本願発明に使用できる。そして、そのようなプロテアーゼを用いて構築した糖化ヘモグロビン比率の測定系もまた、本願発明の技術思想に包含される。
　糖化ヘモグロビンにプロテアーゼの作用させる条件は、用いるプロテアーゼが測定対象の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビン分解物に分解する条件であれば、いかなる条件でもよい。
　使用するプロテアーゼの量は、試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、プロテアーゼを、測定完了時の反応液中の濃度が、０．０１ＫＵ／Ｌ以上、一般的には０．１ＫＵ／Ｌ以上、より一般的には５０ＫＵ／Ｌ以上（好ましくは１００ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは３００ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは５００ＫＵ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が２０００ＫＵ／Ｌ以下（好ましくは１８００ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１５００ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１３００ＫＵ／Ｌ以下）となるように加える。
　プロテアーゼを作用させる際のｐＨは無調整でもよく、使用するプロテアーゼの作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、反応液中のｐＨが２以上（好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上）となるように、かつ、反応液中のｐＨが９以下（好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８以下）となるように調整してもよい。
　プロテアーゼを作用させる温度は、例えば、反応液中で２０℃以上（好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上）となるように、かつ、反応液中で７０℃以下（好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下）となるように行うことができる。
　この際の処理時間は、測定対象の糖化ヘモグロビンに作用して糖化ヘモグロビン分解物に分解するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒間以上（好ましくは１分間以上、さらに好ましくは３分以上）となるように、かつ、１８０分間以下（好ましくは６０分間以下、さらに好ましくは１０分間以下）になるように行うことができる。
　工程（６）において糖化ヘモグロビンにプロテアーゼを作用させる方法は特に限定されない。例えば糖化ヘモグロビンを含む試料へプロテアーゼを添加すればよい。
　自動分析機への適用を考慮する場合、工程（６）の実施手順の設定は、測定対象に共存する非測定対象物である糖化アミノ酸の影響を排除するため、あらかじめ糖化アミノ酸オキシダーゼを添加して非測定対象物である糖化アミノ酸を消去（消去反応）してから測定対象物である糖化ヘモグロビンの本反応を開始する測定系（以下「消去系」とする）を構築する場合と構築しない場合とで考え方が異なる。
　消去系を構築しない場合、工程（６）に必要な試薬成分は、工程（２）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより前の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（６）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで揃うように供給されていてもよいが、第二ステップで揃うように供給されてもよい。第二ステップで揃うように供給する場合は、工程（６）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
　また、例えば１段階の試薬添加ステップしか設定できない自動分析機への適用においては、工程（６）に必要な試薬成分と工程（２）に必要な試薬成分とが同一ステップで供給されてもよい。
　一方、消去系を構築する場合は、２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、消去反応を第一ステップで行い、本反応を第二ステップで行うことになるため、工程（６）に必要な試薬成分が揃うのは第二ステップとなり、この時に工程（６）に必要な試薬成分と工程（２）に必要な試薬成分の両方が全て揃っていればよい。また、この場合は、工程（６）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよく、また、工程（２）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
　なお、３段階以上の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用についても、上記の原則を考慮して適宜試薬の供給方法を決めればよい。
　［１－６．工程（３）、ペルオキシダーゼ、発色基質等について］
　工程（３）では、工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる。
　本発明の方法に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素を発色基質に接触させて発色色素を生成させることができるものであれば特に限定されないが、好適なものとしては、西洋ワサビや微生物などに由来するものが挙げられる。中でも、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。前記ペルオキシダーゼは、高純度かつ低価格のものが商業的に入手可能である。
　前記の発色基質としては、ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応し、単独で色素を生成する色原体であれば特に限定されない。そのようなものとしてロイコ型色原体、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体などが挙げられる。好ましくは、ロイコ型色原体が用いられ、より好ましくはフェノチアジン系のロイコ型色原体が用いられる。
　具体的には、Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン　ナトリウム塩（ＤＡ－６４と略称される。）、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン　ナトリウム塩（ＤＡ－６７と略称される。）、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰと略称される。）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰと略称される。）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡと略称される。）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ－３－スルホプロピル－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ－ＰＳと略称される。）、４，４’－ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン）等が挙げられる。
　検体由来の共存物の影響を受けにくいという点ではＤＡ－６４が好ましく、感度面ではＤＡ－６７が好ましい。本発明において、より一層効果的に糖化ヘモグロビン比率を得ることができるという観点から、好ましくは、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン　ナトリウム塩）、ＣＣＡＰ（１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン）、ＭＣＤＰ（１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン）等のフェノチアジン系のロイコ型色原体が用いるのがよく、なかでも好ましくは、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン　ナトリウム塩）を用いるのがよい。
　使用する発色基質の量は、試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン　ナトリウム塩を、測定完了時の反応液中の濃度が０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上（好ましくは０．００３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下（好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以下）となるように加える。他の発色基質を用いる場合、特にフェノチアジン系のロイコ型色原体を発色基質として用いる場合にも、上記と同様の濃度で使用することが可能である。
　工程（３）においてペルオキシダーゼを作用させる条件は、用いるペルオキシダーゼが過酸化水素および発色基質に作用し発色色素を生成する条件であれば、いかなる条件でもよい。
　使用するペルオキシダーゼの量は、試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、ペルオキシダーゼを、測定完了時の反応液中の濃度が０．１ＫＵ／Ｌ以上（好ましくは１ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは２ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは３ＫＵ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が１００ＫＵ／Ｌ以下（好ましくは５０ＫＵ／Ｌ以下、より好ましくは３０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１０ＫＵ／Ｌ以下）となるように加える。
　ペルオキシダーゼを作用させる際のｐＨは無調整でもよく、使用するペルオキシダーゼの作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、反応液中のｐＨが２以上（好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上）となるように、かつ、反応液中のｐＨが９以下（好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８以下）となるように調整してもよい。
　ペルオキシダーゼを作用させる温度は、例えば、反応液中で２０℃以上（好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上）となるように、かつ、反応液中で７０℃以下（好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下）となるように行うことができる。
　この際の処理時間は、ペルオキシダーゼが過酸化水素および発色基質に作用し発色色素を生成するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒間以上（好ましくは１分間以上、さらに好ましくは３分以上）となるように、かつ、１８０分間以下（好ましくは６０分間以下、さらに好ましくは１０分間以下）になるように行うことができる。
　工程（３）においてペルオキシダーゼを過酸化水素および発色基質に作用させ発色色素を生成させる方法は特に限定されない。例えば、工程（２）の反応により過酸化水素が生成している（または生成することが想定される）反応液へペルオキシダーゼを添加すればよい。
　自動分析機への適用を考慮する場合、工程（３）に必要な試薬成分は、工程（２）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより後の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（３）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで揃うように供給されていてもよいが、第二ステップで揃うように供給されてもよい。第二ステップで揃うように供給する場合は、工程（３）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
　また、例えば１段階の試薬添加ステップしか設定できない自動分析機への適用においては、工程（３）に必要な試薬成分と工程（２）に必要な試薬成分とが同一ステップで供給されてもよい。
　なお、３段階以上の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用についても、上記の原則を考慮して適宜試薬の供給方法を決めればよい。
　［１－７．工程（４）、発色量の測定等について］
　工程（４）では、工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する。
　発色量の測定は、工程（３）開始後の適当な時間範囲で、ペルオキシダーゼを過酸化水素および発色基質に作用させ発色した色素量に起因する吸光度変化量を測定する。
　吸光度の測定波長は特に限定されないが、色素によって測定に適する波長が異なる。例えば１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン　ナトリウム塩を発色基質として用いた場合は６００ｎｍから７００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６６０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン　ナトリウム塩を発色基質として用いた場合は６５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては７２７ｎｍの吸光度を測定すればよい。
　１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンを発色基質として用いた場合は６００ｎｍから７００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６６０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
　１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンを発色基質として用いた場合は６００ｎｍから７００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６６０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
　４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミンを発色基質として用いた場合は７００ｎｍから８００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては７５０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
　Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ－３－スルホプロピル－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタンを発色基質として用いた場合は５５０ｎｍから６５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては５９１ｎｍの吸光度を測定すればよい。
　４，４’－ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン）を発色基質として用いた場合は５５０ｎｍから６５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６１７ｎｍの吸光度を測定すればよい。
　４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンを発色基質として用いた場合は６５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては７００ｎｍの吸光度を測定すればよい。
　２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機の場合は、例えば、第二ステップが実行されている間のいずれかの時間範囲での吸光度変化量を測定することにより、測定をすることができる。前記のタイミングとしては、特に限定されないが、例えば第二試薬添加直後と第二試薬添加後一定時間経過後（例えば６０秒経過時から６００秒経過時の間の任意のタイミング、好ましくは３００秒後）の時点でそれぞれ吸光度を測定し、その差から吸光度変化量を求めることができる。このほか、種々の公知の吸光度変化量測定法（たとえば１ポイントエンド法、２ポイントエンド法、レート法など）を用いてもよい。これらの方法は、各自動分析機の取扱説明書に従い適宜設定することができる。
　［１－８．工程（５）、キャリブレーター、キャリブレーション方法等について］
　工程（５）では、糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する。典型的なキャリブレーションカーブとしては、ｘ軸に糖化ヘモグロビン比率、ｙ軸に発色量を取る態様が挙げられる。
　キャリブレーションとは、目的とする測定項目の値（たとえば本発明においては前記糖化ヘモグロビン比率）と測定値（たとえば本発明においては前記発色量）との関係が既知のキャリブレーターを用いて、あらかじめ検量線（キャリブレーションカーブ）を作成しておき、試料の測定値をその検量線に適応させ、当該試料の測定項目の値を得る手段である。キャリブレーターは標準試薬、標準液、較正用試薬と呼ばれることもある。
　本発明で使用するキャリブレーターのベース組成は特に限定されない。例えばヒト血液由来の成分を用いてもよいし、人工的に作製したものであってもよい。ヒト血液由来の物であれば全血を用いてもよいし、血球など一部の成分を分離して用いてもよい。
　また、これらのキャリブレーターの形状は凍結乾燥、液状、凍結などそれぞれの機能を損ねない範囲で、特に限定されない。
　本発明で使用するキャリブレーターの溶媒は特に制限されないが、蒸留水や緩衝液を使用できる。例えば、グッド緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、酒石酸緩衝液等があげられる。
　本発明で使用するキャリブレーターには、必要に応じて各種抗菌剤および防腐剤を使用することができる。防腐剤としては、プロクリン（登録商標、スペルコ社）各種、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、ピペラシリンやイミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
　本発明で使用するキャリブレーターには、必要に応じて（例えば安定化剤として）、各種糖類、塩類、タンパク質類を使用できる。
　塩類としては、特に限定されないが、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、水酸化カリウム、塩化アルミニウム、酢酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。
　糖類としては、特に限定されないが、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
　タンパク質類としては、特に限定されないが、血清アルブミン類、グロブリン類または繊維性タンパク質類などの不活性タンパク質を添加することができる。好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンである。
　本発明で使用するキャリブレーターには、必要に応じて（例えば、試料由来の還元物質の影響回避、ヘモグロビンのメト化やプロテアーゼの反応促進などを目的として）、フェロシアン化カリウム等のフェロシアン化物や亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩類を添加してもよいし、添加しなくてもよい。
　本発明で使用するキャリブレーターには、必要に応じて界面活性剤を使用できる。本発明に用いることができる界面活性剤は特に限定されない。例えば、非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤および／または陽イオン性界面活性剤および／または陰イオン性界面活性剤を用いることができる。
　非イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
　両性イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、例えばアルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
　陽イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、ココナットアミンアセテート、ステアリルアミンアセテートなどが挙げられる。
　陰イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、アルケニルコハク酸ジカリウムなどが挙げられる。
　本発明で使用するキャリブレーターに用いることができる添加剤の一部は陰イオン性界面活性剤としての機能を併用することもできる。
　上記の各成分（試薬中に存在する酵素、発色基質、界面活性剤および、他の成分）の濃度・条件等は、使用する試薬・酵素等の種類により、反応性および／または安定性などを考慮して適宜決定することが出来る。
　上記の決定は、必ずしも最適解である必要はなく、目的や状況に応じて、糖化ヘモグロビン比率の測定に関して実用上十分な性能が担保されていれば差し支えない。
　本発明で使用するキャリブレーターは糖化ヘモグロビン比率で値付けされている。一般には、ヒト血液をプールし、各種測定法によって糖化ヘモグロビン比率の値付けをしたものを使用するが、ヘモグロビンなどのタンパク質やアミノ酸を人工的に糖化したものやその分解産物を前記プール血清などに添加して糖化ヘモグロビン比率を調整することもできる。
　本発明で使用するキャリブレーターの糖化ヘモグロビン比率の値付けは、ＩＦＣＣ、ＮＧＳＰなどの標準物質を用いて、ＨＰＬＣ法、酵素法、ラテックス免疫法など各種測定方法で行うことができる。
　ヘモグロビン濃度は、シアンメトヘモグロビン法、塩酸ヘマチン法、アルカリヘマチン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法など、Ｈｂ・ｒｅｄ計測法、ＨｂＣＯ計測法など各種測定法で測定することができる。
　本明細書においては、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬を用いたシアンメトヘモグロビン法に従うことが好ましい。具体的には、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬（フェリシアン化カリウム２００ｍｇ，　シアン化カリウム５０ｍｇ及び炭酸水素ナトリウム１．０ｇを蒸留水に溶かし，１Ｌとしたもの）を調製後、試験管に　Ｄｒａｂｋｉｎ試液　４．５ｍｌとサンプル０．５ｍｌ加え混和後２０分間室温放置し、生成したシアノメトヘモグロビンの吸光度を５４０ｎｍで測定するという方法である。
　本発明で使用するキャリブレーターの値付け水準数は２水準以上（即ち、糖化ヘモグロビン比率が異なる２種類以上）であれば特に限定されない。好ましくは２水準であるが、３水準以上の多水準（好ましくは５水準以下）でもよい。例えば２水準の値付けがされたキャリブレーターを用いる場合、キャリブレーション時には当該キャリブレーターのほかに、精製水や緩衝液など糖化ヘモグロビンが含まれない試料を用いてキャリブレーターの代用とし、キャリブレーターの２水準と合わせて３水準のキャリブレーションを行うことが可能である。
　２水準が好ましい理由は水準が多いほど使用する試薬量が増加し、手間もかかるためである。
　本発明で使用するキャリブレーターの糖化ヘモグロビン比率は、２水準の場合、低濃度と高濃度の２種類となり、低濃度が３％～７％、高濃度が８％～２０％となることが望ましく、低濃度が３％～６％、高濃度が８％～２０％となることがより望ましい。さらに望ましくは低濃度が３％～６％、高濃度が１０％～２０％、さらにより望ましくは、低濃度が３％～５．５％、高濃度が１０％～２０％、なかでも望ましくは、低濃度が３％～５％、高濃度が１０％～２０％、とりわけ望ましくは低濃度が３％～５％、高濃度が１０％～１８％である。
　本発明で使用するキャリブレーターは、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターであって、測定完了時の反応液中における全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のもの（残りの全て）の全ヘモグロビン濃度はその１倍～６倍程度であることが好ましく、その１倍～５倍程度であることがより好ましく、その１～４倍程度であることがさらに好ましく、その１～３．５倍程度であることがさらに好ましく、その１～３倍程度であることがとりわけ好ましい。さらに好ましくは１倍～２．５倍程度、さらに好ましくは１倍～２倍程度、さらに好ましくは１倍～１．５倍程度、特に好ましくは１倍（等濃度）程度である。
　なお、全ヘモグロビン濃度の高低の順番は糖化ヘモグロビン比率の高低の順番とは無関係であってもよい。例えば、糖化ヘモグロビン比率が低濃度・中濃度・高濃度の３水準のキャリブレーターの場合、その全ヘモグロビン濃度はどれがもっとも高いものであってもよいし、どれが最も低いものであってもよい。より良好な相関関係が得られる傾向が高いという観点から、糖化ヘモグロビン比率の低いものを全ヘモグロビン濃度の低いものとし、糖化ヘモグロビン比率の高いものを全ヘモグロビン濃度が高いものとすることが好ましい。
　本発明で用いるキャリブレーターは、使用する際に希釈して前記の全ヘモグロビン濃度の比率を満たすように作製されているものを用いてもよい。
　本発明で用いるキャリブレーターの全ヘモグロビン濃度の絶対値は特に限定されないが、好ましくは測定完了時の反応液中の濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌ以上（好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは３μｍｏｌ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が５０μｍｏｌ／Ｌ以下（好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは８μｍｏｌ／Ｌ以下）となるように設定されていればよい。
　本発明で用いるキャリブレーターは、使用する際に希釈して前記の全ヘモグロビン濃度の絶対値を満たすように作製されているものを用いてもよい。
　キャリブレーター単独の全ヘモグロビン濃度としては特に限定されないが、一例として、１０μｍｏｌ／Ｌ～９００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、好ましくは２０μｍｏｌ／Ｌ～７００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、より好ましくは３０μｍｏｌ／Ｌ～５００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、さらに好ましくは、４０μｍｏｌ／Ｌ～３００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、さらにより好ましくは、５０μｍｏｌ／Ｌ～２５０μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができる。更には、例えば５０μｍｏｌ／Ｌ～２００μｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターをそのまま使用してもよいし、２ｍｍｏｌ／Ｌ～５ｍｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターを水や前処理液で希釈して使用してもよい。
　本発明で使用するキャリブレーターの糖化ヘモグロビン濃度の絶対値は特に限定されないが、好ましくは測定完了時の反応液中の濃度が０．０１μｍｏｌ／Ｌ以上（好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．０３μｍｏｌ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が１５μｍｏｌ／Ｌ以下（好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下）となるように設定されていればよい。
　本発明で用いるキャリブレーターは、使用する際に希釈して前記の糖化ヘモグロビン濃度の絶対値を満たすように作製されているものを用いてもよい。
　キャリブレーター単独の糖化ヘモグロビン濃度としては特に限定されないが、一例として、１μｍｏｌ／Ｌ～４０μｍｏｌ／Ｌ程度のキャリブレーターを使用することができ、好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌ程度のキャリブレーターを使用することができる。更には、例えば１μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターをそのまま使用してもよいし、１００μｍｏｌ／Ｌ～５００μｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターを水や前処理液で希釈して使用してもよい。
　［１－９．糖化ヘモグロビン比率の測定方法について、その他の事項］
　本発明において、反応は緩衝液中で行われることが好ましい。前記緩衝液としては特に制限されないが、例えば、グッド緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、酒石酸緩衝液等があげられる。
　本発明において、必要に応じて各種抗菌剤および防腐剤を使用することができる。防腐剤としては、プロクリン（登録商標、スペルコ社）各種、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、ピペラシリンやイミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
　本発明において、必要に応じて（例えば酵素安定化剤として）、各種糖類、塩類、タンパク質類を使用できる。
　塩類としては、特に限定されないが、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、水酸化カリウム、塩化アルミニウム、酢酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。
　糖類としては、特に限定されないが、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
　タンパク質類としては、特に限定されないが、血清アルブミン類、グロブリン類または繊維性タンパク質類などの不活性タンパク質を添加することができる。好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンである。好ましい不活性タンパク質は、酵素分解を起こすプロテアーゼ不純物を含まないものである。
　本発明において、必要に応じて（例えば、試料由来の還元物質の影響回避、ヘモグロビンのメト化やプロテアーゼの反応促進などを目的として）、フェロシアン化カリウム等のフェロシアン化物や亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩類を添加してもよいし、添加しなくてもよい。
　本発明において、必要に応じて界面活性剤を使用できる。本発明に用いることができる界面活性剤は特に限定されない。例えば、非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤および／または陽イオン性界面活性剤および／または陰イオン性界面活性剤を用いることができる。
　非イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
　両性イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、例えばアルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
　陽イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、ココナットアミンアセテート、ステアリルアミンアセテートなどが挙げられる。
　陰イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、アルケニルコハク酸ジカリウムなどが挙げられる。
　本発明に用いることができる添加剤の一部は陰イオン性界面活性剤としての機能を併用することもできる。
　上記の各成分（試薬中に存在する酵素、発色基質、界面活性剤および、他の成分）の濃度・条件等は、使用する試薬・酵素等の種類により、反応性および／または安定性などを考慮して適宜決定することが出来る。
　その際には、試薬中に存在するそれぞれの成分が互いに干渉しあうことにより、糖化ヘモグロビンの測定や試薬の安定性等に影響が及ぶ可能性についても、考慮することが好ましい。例えば、２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用において、第二ステップで、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼが共存する場合は、できるだけ両酵素の特性を活かせるよう適宜条件決定することができる。
　上記の決定は、必ずしも最適解である必要はなく、目的や状況に応じて、糖化ヘモグロビンの測定に関して実用上十分な性能が担保されていれば差し支えない。  
　［２．糖化ヘモグロビン比率の測定キット］
　本発明の実施態様の一つは、以下の（ａ）～（ｅ）の試薬を含む糖化ヘモグロビン比率の測定キットである。
（ａ）スルホ基を持つ化合物を含有する試薬
（ｂ）糖化アミノ酸オキシダーゼを含有する試薬
（ｃ）ペルオキシダーゼを含有する試薬
（ｄ）ペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質を含有する試薬
（ｅ）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーター
　本発明のキットにおいては、さらに以下の（ｆ）を含んでもよい。
（ｆ）プロテアーゼを含有する試薬
　本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定キットの構成は特に限定されない。例えば、糖化アミノ酸オキシダーゼ、緩衝液、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、発色基質、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、抗菌剤、防腐剤および本発明にかかる測定方法を紙などの記録媒体に記載した取り扱い説明書などが含まれていてもよい。
　本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定キットは、本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定方法に利用し得るものである。よって、本発明のキットは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法の項における説明を援用することができる。
　本発明のキットは、自動分析機の態様に合わせ、いくつかの部分から構成されていても良い。例えば、２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機に適用できるようなキットの場合は、第一試薬および第二試薬の２つの部分から構成すればよい。
　キットの保存安定性を考慮した場合、２を超える部分からなる構成とし、使用直前に第一試薬および第二試薬の２つを用意できるようにキットを構成しても良い。
　２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用において、消去系を構築する場合は、本発明の糖化ヘモグロビン比率測定キットは、２つの部分から構成され、第一試薬に糖化アミノ酸オキシダーゼを含み、第二試薬にプロテアーゼを含むことが好ましい。このような形態の試薬には、第一試薬にさらにカタラーゼ、パーオキシダーゼおよび色素のうちいずれか１つ以上を含ませることができる。
　本発明のキットは、上記構成に加えてさらに試料の前処理剤を含んでも良い。前処理剤の形態は特に限定されない。前処置の目的は特に限定されないが、希釈、溶血などが挙げられる。スルホ基を持つ化合物を前処理剤に含ませ、前処理の際に、糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程（工程（１））を行っても良い。
　上記で説明したキットについて、スルホ基を持つ化合物、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質およびプロテアーゼの、前処理剤、第一試薬および第二試薬への配分例を表１に例示する。
　表中、Ａはスルホ基を持つ化合物、Ｂは糖化アミノ酸オキシダーゼ、Ｃはペルオキシダーゼ、Ｄはペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質、Ｆはプロテアーゼをそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
［実施例１］
　以下の方法によりＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
１．試薬
第一試薬（Ｒ１）
　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）　　　　　　１００ｍＭ
　ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　 ０．７１ｇ／Ｌ
　プロテアーゼ　　　　　　　　　　　　　 １００ＫＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　 ３．７ＫＵ／Ｌ
　ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム　 ３ｇ／Ｌ
第二試薬（Ｒ２）
　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）　　　　　　１００ｍＭ
　糖化アミノ酸オキシダーゼ　　　　　　　５ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　１６ｍｇ／Ｌ
２．試料　
　血球　１０検体
　測定前に精製水で３０倍希釈
３．測定パラメーター
　測定機種　日立７１８０
　分析法／測定ポイント　２ポイントエンド（１０）１６－３４
　このパラメーターを用いた場合、測定に要する時間は、第一反応約３００秒、第二反応約３００秒の計約６００秒である。
　測定波長（ｎｍ）（副／主）　８００／６６０
　液量比　試料／Ｒ１／Ｒ２　１０μＬ／１２０μＬ／４０μＬ（Ｓ：Ｒ１：Ｒ２＝１：１２：４）
　反応温度　３７℃
　ＡＢＳ　ＬＩＭＩＴ　３２０００増加
　キャリブレーション　０．０－１００００吸光度打出し
　上記の測定結果を、以下のキャリブレーションカーブＡ～Ｄ（ｘ軸：ＨｂＡ１ｃ比率、ｙ軸：発色量）と対比してＨｂＡ１ｃ比率を求めた。ここでＨｂＡ１ｃ比率は、ＮＧＳＰ値として算出される値である。
　キャリブレーションカーブＡは、キャリブレーター１（ヘモグロビン（以下Ｈｂと記載）　６６．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　２．９３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター２（Ｈｂ　６６．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　７．３４μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
　キャリブレーションカーブＢは、キャリブレーター３（Ｈｂ　７８．８μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　３．４９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター４（Ｈｂ　７８．８μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　８．７５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
　キャリブレーションカーブＣは、キャリブレーター５（Ｈｂ　５６．９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　２．５２μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター６（Ｈｂ　５６．９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　６．３２μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
　キャリブレーションカーブＤは、キャリブレーター７（Ｈｂ　５０．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　２．２１μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター８（Ｈｂ　９７．６μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　１０．８３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
［ＨＰＬＣ法（対照）］
　アークレイ社製ＨＡ８１７０を用いて通法に従い測定を実施した。
　図１～図４に本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関データを示す。上記キャリブレーションカーブＡ～Ｄを用いたときのＨＰＬＣ法との相関式はそれぞれ次の（１）～（４）のとおりであった。
　（１）Ｙ＝１．０４２Ｘ＋０．３０７２　、Ｒ２＝０．９９５
　（２）Ｙ＝０．９７２１Ｘ＋０．６０８３　、Ｒ２＝０．９９５
　（３）Ｙ＝１．１１６２Ｘ－０．０１５６　、Ｒ２＝０．９９５
　（４）Ｙ＝０．８７１６Ｘ＋１．４１２３　、Ｒ２＝０．９９５
　このように、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関はきわめて良好であった。
［実施例２］［比較例１］
　以下の方法によりＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
１．試薬
第一試薬（Ｒ１）
　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）　　　　１００ｍＭ
　ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　 ０．７１ｇ／Ｌ
　プロテアーゼ　　　　　　　　　　　　　 １００ＫＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　 ３．７ＫＵ／Ｌ
　表２記載の添加剤　 　　　　　　　　　　３ｇ／Ｌ
第二試薬（Ｒ２）
　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）　　　　１００ｍＭ
　糖化アミノ酸オキシダーゼ　　　　　　　５ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　１６ｍｇ／Ｌ
２．試料　
　血球　１０検体
　測定前に精製水で３０倍希釈
３．測定パラメーター
　実施例１記載の方法で実施した。
　上記の測定結果を、実施例１記載のキャリブレーター１及びキャリブレーター２で作成したキャリブレーションカーブと、表２記載の試薬Ａ～Ｅを用いて作成したキャリブレーションカーブと対比してＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
　比較例として、実施例１記載のキャリブレーター１及びキャリブレーター２で作成したキャリブレーションカーブと、試薬Ｆ、Ｇを用いて作成したキャリブレーションカーブと対比してＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
　これらにおいて、ＨｂＡ１ｃ比率は、ＮＧＳＰ値として算出される値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［ＨＰＬＣ法（対照）］
　アークレイ社製ＨＡ８１７０を用いて通法に従い測定を実施した。
　図５～図１１に本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関データを示す。上記試薬Ａ～Ｇを用いたときのＨＰＬＣ法との相関式はそれぞれ次の（５）～（１１）のとおりであった。
　（５）Ｙ＝０．９７３３Ｘ＋１．９１２７　、Ｒ２＝０．９８８６
　（６）Ｙ＝１．００１１Ｘ＋０．９０４５　、Ｒ２＝０．９９８２
　（７）Ｙ＝０．９９４７Ｘ＋０．８１７５　、Ｒ２＝０．９８７４
　（８）Ｙ＝１．０５６２Ｘ＋０．２３３２　、Ｒ２＝０．９７８１
　（９）Ｙ＝１．１７１９Ｘ－０．３９９９　、Ｒ２＝０．９８３０
　（１０）Ｙ＝－０．１８０５Ｘ＋６．４５６　、Ｒ２＝０．０６９２
　（１１）Ｙ＝０．５９３Ｘ＋１．７６９９　、Ｒ２＝０．３０８０
　このように、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関はきわめて良好であった（（５）～（９））。一方、比較例では相関性は認められなかった（（１０）～（１１））。
［実施例３］
　以下の方法によりＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
１．試薬
第一試薬（Ｒ１）
　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）　　　　　　１００ｍＭ
　ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　 ０．７１ｇ／Ｌ
　界面活性剤　　　　　　　　　　　　　　１ｇ／Ｌ
　プロテアーゼ　　　　　　　　　　　　　１００ＫＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　１６ｍｇ／Ｌ
　ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム　３ｇ／Ｌ
第二試薬（Ｒ２）
　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）　　　　　　１００ｍＭ
　糖化アミノ酸オキシダーゼ　　　　　　　５ＫＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　３．７ＫＵ／Ｌ
２．試料　
　血球　３０検体
　測定前に精製水で３０倍希釈
３．測定パラメーター
　測定機種　日立７１８０
　分析法／測定ポイント　２ポイントエンド（１０）１６－３４
　このパラメーターを用いた場合、測定に要する時間は、第一反応約３００秒、第二反応約３００秒の計約６００秒である。
　測定波長（ｎｍ）（副／主）　８００／６６０
　液量比　試料／Ｒ１／Ｒ２　１０μＬ／１２０μＬ／４０μＬ（Ｓ：Ｒ１：Ｒ２＝１：１２：４）
　反応温度　３７℃
　ＡＢＳ　ＬＩＭＩＴ　３２０００増加
　キャリブレーション　０．０－１００００吸光度打出し
　上記の測定結果を、以下のキャリブレーションカーブＥ～Ｈ（ｘ軸：ＨｂＡ１ｃ比率、ｙ軸：発色量）と対比してＨｂＡ１ｃ比率を求めた。ここでＨｂＡ１ｃ比率は、ＮＧＳＰ値として算出される値である。
　キャリブレーションカーブＥは、キャリブレーター９（ヘモグロビン（以下Ｈｂと記載）　２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　７．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１０（Ｈｂ　２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　１９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
　キャリブレーションカーブＦは、キャリブレーター１１（Ｈｂ　４２１．１μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　１４．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１２（Ｈｂ　２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　１９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
　キャリブレーションカーブＧは、キャリブレーター１３（Ｈｂ　６３４．９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　２１．２μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１４（Ｈｂ　２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　１９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
　キャリブレーションカーブＨは、キャリブレーター１５（Ｈｂ　８３３．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　２７．８μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１６（Ｈｂ　２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ　１９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
［ＨＰＬＣ法（対照）］
　アークレイ社製ＨＡ８１７０を用いて通法に従い測定を実施した。
　図１２～図１５に本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関データを示す。上記キャリブレーションカーブＥ～Ｈを用いたときのＨＰＬＣ法との相関式はそれぞれ次の（１２）～（１５）のとおりであった。
　（１２）Ｙ＝１．０１５Ｘ－０．３３８　、Ｒ２＝０．９９４５
　（１３）Ｙ＝０．９７４７Ｘ＋０．０５７７　、Ｒ２＝０．９９４５
　（１４）Ｙ＝０．９１４３Ｘ＋０．６５１７　、Ｒ２＝０．９９４５
　（１５）Ｙ＝０．７９５８Ｘ＋１．８１５７　、Ｒ２＝０．９９４５
　このように、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関はきわめて良好であった。なかでも、糖化ヘモグロビンキャリブレーターの全ヘモグロビン濃度比率が、１：１～３程度となる場合に、特に高い相関性を示すことが明らかとなった。
　なお、上記開示した実施形態および実施例はすべて例示であり制限的なものではない。また、実施形態および実施例に開示された内容を組み合わせた実施形態及び実施例も本発明の範囲に含まれる。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲によって有効であり、特許請求の範囲の記載と均等の意味および範囲内のすべての変更・修正・置き換え等を含むものである。
　本発明は、糖尿病マーカーなどとして有用な糖化ヘモグロビン比率の測定など、診断や医療などの分野に貢献する。

Claims (14)

  1. 　以下の（１）～（５）の工程を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法：
    　（１）糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程、
    　（２）糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる工程、
    　（３）工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる工程、
    　（４）工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する工程、及び、
    　（５）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する工程。
  2. 　前記（５）の工程で用いる糖化ヘモグロビンキャリブレーターとして、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを使用し、測定完了時の反応液中における全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度はその１倍～６倍の濃度である、請求項１に記載の測定方法。
  3. 　さらに、以下の（６）の工程を含む、請求項１又は２の測定方法：
    　（６）糖化ヘモグロビンをプロテアーゼの作用により糖化ヘモグロビン分解物に分解する工程。
  4. 　さらに、以下の（７）の工程を含む、請求項１～３のいずれかに記載の測定方法：
    　（７）糖化ヘモグロビンを含む試料を溶血させる工程。
  5. 　前記（１）の工程で用いるスルホ基を持つ化合物が、ベンゼンスルホン酸、アルキルスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸、ベンゾチアゾリンスルホン酸、アントラキノンスルホン酸、カンファースルホン酸、ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、請求項１～４のいずれかに記載の測定方法。
  6. 　前記（１）の工程で用いるスルホ基を持つ化合物が、ドデシルベンゼンスルホン酸、３－アミノベンゼンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸、４－アミノアゾベンゼン－４’－スルホン酸、４－アミノ－４’－ニトロスチルベン－２，２’－ジスルホン酸、４，４’－ジアゾスチルベンゼン－２，２’－ジスルホン酸、スルファニル酸、５－スルホイソフタル酸、５－アミノ－２－クロロトルエン－４－スルホン酸、アルキルナフタレンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、８－アミノ－１－ナフタレンスルホン酸、ドデシルナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシル、ジアルキルスルホコハク酸、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、請求項１～５のいずれかに記載の測定方法。
  7. 　上記（３）の工程で用いる発色基質が、ロイコ型色原体である、請求項１～６のいずれかに記載の測定方法。
  8. 　上記（３）の工程で用いる発色基質が、フェノチアジン系のロイコ型色原体である、請求項１～７のいずれかに記載の測定方法。
  9. 　上記（３）の工程で用いる発色基質が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン　ナトリウム塩、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン、及び１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンからなる群より選択される少なくとも１種のフェノチアジン系のロイコ型色原体である、請求項１～８のいずれかに記載の測定方法。
  10. 　上記（３）の工程で用いる発色基質が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン　ナトリウム塩である、請求項１～９のいずれかに記載の測定方法。
  11. 　１チャンネルで実施される、請求項１～１０のいずれかに記載の測定方法。
  12. 　以下の（ａ）～（ｅ）の試薬を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定キット：
    　（ａ）スルホ基を持つ化合物を含有する試薬、
    　（ｂ）糖化アミノ酸オキシダーゼを含有する試薬、
    　（ｃ）ペルオキシダーゼを含有する試薬、
    　（ｄ）ペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質を含有する試薬、及び、
    　（ｅ）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーター。
  13. 　前記（ｅ）の糖化ヘモグロビンキャリブレーターが、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターであって、測定完了時の反応液中における全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度がその１倍～６倍の濃度である糖化ヘモグロビンキャリブレーターである、請求項１２に記載の測定キット。
  14. 　さらに、以下の（ｆ）の試薬を含む請求項１２又は１３に記載の測定キット：
    　（ｆ）プロテアーゼを含有する試薬。
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