CN105295441A - 一种显色剂的稳定剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学检测领域，尤其涉及一种显色剂的稳定剂及其应用。本发明采用偶氮染料作为显色剂的稳定剂，不仅起到了良好的稳定作用，而且不会对检测造成干扰。实验表明，述偶氮染料的加入，改善了显色剂的自发显色并且使显色剂保持了更好的显色能力。在不添加偶氮染料的对照试验中，染色剂皆发生了一定程度的颜色改变，吸光值也发生了明显的升高，而采用本发明提供的稳定剂后，染色剂颜色改变不明显，吸光值变化不显著。并且，在高温长期放置后，仍能获得良好的检测效果。
Description
技术领域
本发明涉及化学检测领域，尤其涉及一种显色剂的稳定剂及其应用。
背景技术
目前，对目标成分的测定(定性、定量)方法，大多应用了酶参与的氧化还原反应。该方法通常可以按照下述模式进行：例如，由待测的目标成分生成氧化物质，利用氧化酶使该氧化物质与通过氧化生成显色化合物的显色剂反应，测定所产生的显色的吸光度。该方法中，吸光度的大小与所生成的显色化合物的量相当，所生成的前述显色化合物的量与所生成的氧化物质的量相当，前述氧化物质的量与目标成分的量相当。也就是说，通过检测所产生的显色(所生成的显色化合物)，能够借助这样的氧化还原反应来间接地测定目标成分。
如上所述，显色剂在临床生化检测应用十分广泛。但是具有氧化还原活性的显色剂，往往非常不稳定。常常出现由于添加酶而导致的人为的氧化还原反应开始前、即在保存时产生自然显色这样的问题。其原因被推测是由于：例如在前述湿系的情况下，前述溶剂中前述显色剂变得不稳定，在干系的情况下，由于吸收空气中的水分，因而前述显色剂变得不稳定等。另外，不论湿系还是干系，在紫外线等光照射条件下保存时，前述显色剂也会不稳定化而产生自然显色，这也被视为问题。
已经有大量的方法被提出及采用以解决上述问题。
比如，在液相的试剂盒中往往采用将显色剂(及其他试剂)冻干，并且密封保存。但是这样的方法要求复杂的冻干工艺步骤，并且用户在使用时，也需要加入溶液复溶的操作步骤。
干化学试条具有较好的稳定性，但是其保存温度往往为室温，而不是试剂盒常用的冷藏温度(2-8℃)。因此，干化学试条中的显色剂稳定性问题同样是本领域亟待解决的问题。国内外对此也进行了大量的研究。
例如一种方法为：采用具有碳原子数8～16的烷基的表面活性剂及类黄酮系色素物质。但该方法配方复杂，并且试剂在市面上难以买到，保护剂本身对测试结果又有一定的干扰。
还有通过在液体介质中使亚甲蓝系显色剂与具有碳原子数为12以上的烃基的季铵或其盐共存，使其稳定化。但该方法对亚甲蓝系显色剂例如：10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嗪。具有较好的稳定性但是对常见的Trinder’s显色剂及苯胺类显色剂保护性较差或者没有稳定作用。
也有研究采用Ar-NH-NH-CO-NH2试剂稳定显色剂，或者采用一种显色稳定剂具有比显色剂较强的还原能力，另一种显色稳定剂具有介于显色剂和第一种显色稳定剂之间的还原能力。但上述方法添加了比较强的还原性物质，对显色剂的氧化还原反应具有一定的干扰效应，为了将干扰控制在可控范围内，对保护剂的配比及浓度的要求较高。尤其在检测较低浓度的分析物(肌酐、转氨酶)时，干扰显著。
另外还有将氧化发色剂(显色剂)与果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)及过氧化物酶(POD)的至少之一共存，使其稳定化。但该方法只能稳定N－(羧甲胺基羰基)－4，4’－二(二甲胺基)二苯胺钠对其他显色剂没有稳定性作用或者作用较差。
上述方法都在不同程度上解决了显色剂不稳定的问题，但仍存在着不同的缺陷，因此，进一步的研究用于显色剂的稳定剂是十分必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种显色剂的稳定剂及其应用。本发明提供的稳定剂具有良好的稳定效果，即便在较高的温度下仍能对显色剂起到良好的稳定作用，并且对显色剂的显色效果没有干扰。
本发明提供的显色剂的稳定剂，包括偶氮染料；
偶氮染料选自单偶氮染料、双偶氮染料或多偶氮染料；
单偶氮染料选自苏丹红l号、苏丹红2号、苏丹橙B、诱惑红、茜素黄R、橙黄G、柠檬黄、苋菜红、日落黄、苏丹红G、依莱铬红B、酸性红18或藏花橙G；
双偶氮染料选自酸性红66、苏丹黑B、直接红2B、碱性棕G、苏丹红B、苏丹红3号、苏丹红4号或苏丹红7B；
多偶氮染料为直接黑BN。
偶氮染料是目前染料市场中品种和数量最多的一类染料，因其分子中含有偶氮基而得名。目前，偶氮染料常用于各类纤维的染色和印花，并用于皮革、纸张、肥皂、蜡烛、木材、麦秆、羽毛等染色以及油漆、油墨、塑料、橡胶、食品等的着色。本发明通过实验证明，偶氮染料对生化检测中常用的显色剂具有稳定作用，能够改善显色剂的自发显色并且使显色剂保持了更好的显色能力。并且，偶氮染料作为稳定剂还能够降低对测试效果的干扰。
在一些实施例中，偶氮染料为双偶氮染料和多偶氮染料的组合物，其中，双偶氮染料与多偶氮染料的摩尔比为15:40。
在一些实施例中，偶氮染料为单偶氮染料和双偶氮染料的组合物，其中，单偶氮染料与双偶氮染料的摩尔比为7：(4～20)。
在本发明的实施例中，偶氮染料选自藏花橙G、橙黄G、碱性棕G、柠檬黄、茜素黄R、苏丹橙B、苏丹黑B、苏丹红3号、苏丹红4号、苏丹红7B、苏丹红B、苏丹红G、酸性红18、酸性红66、依莱铬红B、诱惑红、直接黑BN或直接红2B
在本发明的实施例中，偶氮染料选自苏丹红1号、苏丹红2号、诱惑红、苋菜红、苏丹红G、依莱铬红B、酸性红18、酸性红66、直接红2B、苏丹红B、、苏丹红3号、苏丹红4号或苏丹红7B。
在本发明的实施例中，偶氮染料选自苏丹红3号、苏丹红4号、苏丹红7B、苏丹红B、苏丹红G、酸性红18、酸性红66、依莱铬红B、直接红2B或诱惑红。
在本发明的实施例中，显色剂的稳定剂还包括还原剂、螯合剂、缓冲剂、辅助稳定剂、表面活性剂中的任一种或两者以上的组合。
还原性物质指在化学反应中能够降低氧化剂中起到氧化作用的元素的化合价降低的物质。实验表明，当本发明提供的稳定剂与还原性物质配合使用时，显色剂的稳定性可以进一步的提高。
在本发明的实施例中，还原剂的浓度为10μmol/L～100μmol/L；
还原剂选自1-苯基氨基脲、1，5-二苯基脲、N，N，N-三甲基氨基脲，4-苯基氨基脲、双酚A、五倍子酸、碳酰肼、对乙酰氨基酚或龙胆酸。
在一些实施例中，还原剂为1-苯基氨基脲、4-苯基氨基脲、碳酰肼或对乙酰氨基酚。
在本发明的实施例中，螯合剂的浓度为20μmol/L～150μmol/L；
螯合剂选自乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、反式-1，2-二氨基环己烷-N，N，N’，N’-四乙酸、O，O’-二(2-氨乙基)乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸或氨三乙酸。
在一些实施例中，螯合剂为EDTA、GEDTA或DTPA。
在本发明的实施例中，缓冲剂的浓度为0.1mol/L；
缓冲剂选自柠檬酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、醋酸缓冲剂或Good’s缓冲剂。
在一些实施例中，缓冲剂为Hepes缓冲液、磷酸盐缓冲剂、MOPS缓冲液或MES缓冲液。
在本发明的实施例中，表面活性剂的质量分数为0.5％～1％；
所述表面活性剂选自Tween系列、Triton系列、Brij系列或Pluronic系列。
在一些实施例中，表面活性剂为TritonX100、PluronicF-68或Tween20。
在本发明的实施例中，辅助稳定剂的质量分数为1％～2％；
辅助稳定剂选自糖类或蛋白类。
在一些实施例中，糖类为蔗糖、海藻糖或山梨醇；蛋白为BSA。
在本发明的实施例中，显色剂选自苯胺类、酚类、Trinder、联氮类或咪唑类。
在一些实施例中，苯胺类显色剂选自TOPS(N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐)、MAOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-5-二甲氧基苯胺)、MADB[N,N-双(4-磺丁基)-3-5-二甲基苯胺]、TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)或TOOS[N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐]。
在一些实施例中，Trinder显色剂选自4AA(4-氨基安替比林)、TBHBA(2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸)或DHBS(3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠)。
在一些实施例中，联氮类显色剂为ABTS[(2，2′-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)]。
在一些实施例中，显色剂选自TMB、4AA、MAOS、MADB、DHBS或TBHBA。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、表面活性剂和缓冲剂，其中偶氮染料的浓度为1μmol/L～110μmol/L；表面活性剂的质量分数为1％；缓冲液的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料选自苏丹橙B、茜素黄R、藏花橙G、橙黄G、日落黄或柠檬黄；表面活性剂为TritonX100；缓冲液为MOPS缓冲液。
作为优选，染色剂的稳定剂包括浓度为1μmol/L的偶氮染料，质量分数为1％的表面活性剂，浓度为0.1mol/L的缓冲液。
优选的，染色剂的稳定剂包括浓度为1μmol/L的苏丹橙B，质量分数为1％的TritonX100，浓度为0.1mol/L的MOPS缓冲液。
作为优选，染色剂的稳定剂包括浓度为110μmol/L的偶氮染料，质量分数为1％的表面活性剂，浓度为0.1mol/L的缓冲液。
优选的，染色剂的稳定剂包括浓度为10μmol/L的茜素黄R，浓度为100μmol/L的藏花橙G、质量分数为1％的TritonX100，浓度为0.1mol/L的MOPS缓冲液。
作为优选，染色剂的稳定剂包括浓度为25μmol/L的偶氮染料，质量分数为1％的表面活性剂，浓度为0.1mol/L的缓冲液。
优选的，染色剂的稳定剂包括浓度为5μmol/L的橙黄G，浓度为20μmol/L的日落黄、质量分数为1％的TritonX100，浓度为0.1mol/L的MOPS缓冲液。
作为优选，染色剂的稳定剂包括浓度为5μmol/L的偶氮染料，质量分数为1％的表面活性剂，浓度为0.1mol/L的缓冲液。
优选的，染色剂的稳定剂包括浓度为5μmol/L的柠檬黄，质量分数为1％的TritonX100，浓度为0.1mol/L的MOPS缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂TMB的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂TMB的摩尔比为1:10000、110:10000、25:10000、或5:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为7.4。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料和缓冲剂，其中偶氮染料的浓度为0.1μmol/L～1mmol/L；缓冲液的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料选自酸性红66、苏丹黑B、碱性棕G、直接黑BN、苏丹红B或苏丹红7B；缓冲液为磷酸盐缓冲液。
作为优选，染色剂的稳定剂包括浓度为0.1μmol/L的偶氮染料，浓度为0.1mol/L的缓冲液。
优选的，染色剂的稳定剂包括浓度为0.1μmol/L的酸性红66，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
作为优选，染色剂的稳定剂包括浓度为50μmol/L的偶氮染料，浓度为0.1mol/L的缓冲液。
优选的，染色剂的稳定剂包括浓度为50μmol/L的苏丹黑B，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
作为优选，染色剂的稳定剂包括浓度为55μmol/L的偶氮染料，浓度为0.1mol/L的缓冲液。
优选的，染色剂的稳定剂包括浓度为15μmol/L的碱性棕G，浓度为40μmol/L的直接黑BN，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
作为优选，染色剂的稳定剂包括浓度为1075μmol/L的偶氮染料，浓度为0.1mol/L的缓冲液。
优选的，染色剂的稳定剂包括浓度为15μmol/L的苏丹红B，浓度为1000μmol/L的苏丹红7B，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂4AA和MAOS的稳定。
在此实施例中，偶氮染料的摩尔数与染色剂4AA和MAOS的摩尔数之和之比为0.1:20000、50:20000、55:20000或1075:20000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为6.5。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、还原剂、辅助稳定剂和缓冲剂，其中偶氮染料的浓度为10μmol/L～15μmol/L，还原剂的浓度为50μmol/L～100μmol/L，辅助稳定剂的质量分数为2％，缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料选自直接红2B、诱惑红；还原剂为4-苯基氨基脲；辅助稳定剂为蔗糖；缓冲液为HEPES缓冲液。
作为优选，染色剂的稳定剂包括浓度为10μmol/L的直接红2B；浓度为50μmol/L的4-苯基氨基脲；质量分数为2％的蔗糖；浓度为0.1mol/L的HEPES缓冲液。
作为优选，偶氮染料选自为直接红2B、诱惑红；还原剂为4-苯基氨基脲；辅助稳定剂为蔗糖；缓冲液为HEPES缓冲液。
作为优选，染色剂的稳定剂包括浓度为15μmol/L的诱惑红；浓度为100μmol/L的4-苯基氨基脲；质量分数为2％的蔗糖；浓度为0.1mol/L的HEPES缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂4AA和MADB的稳定。
在此实施例中，偶氮染料的摩尔数与染色剂4AA和MADB的摩尔数之和的比为10:20000或15:20000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为7.5。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、螯合剂、辅助稳定剂和缓冲剂，其中，偶氮染料的浓度为20μmol/L、螯合剂的浓度为40μmol/L、辅助稳定剂的质量分数为2％，缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为苏丹红3号；螯合剂为EDTA；辅助稳定剂为蔗糖；缓冲剂为HEPES。
优选的，染色稳定剂包括浓度为20μmol/L的苏丹红3号；浓度为40μmol/L的EDTA；质量分数为2％的蔗糖；浓度为0.1mol/L的HEPES。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂4AA和MADB的稳定。
在此实施例中，偶氮染料的摩尔数与染色剂4AA和MADB的摩尔数之和的比为20:20000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为7.5。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、螯合剂、辅助稳定剂和缓冲剂，其中，偶氮染料的浓度为35μmol/L、辅助稳定剂的质量分数为2％、缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为苏丹红4号；辅助稳定剂为蔗糖；缓冲剂为HEPES。
优选的，染色稳定剂包括浓度为35μmol/L的苏丹红4号；质量分数为2％的蔗糖；浓度为0.1mol/L的HEPES缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂4AA和MADB的稳定。
在此实施例中，偶氮染料的摩尔数与染色剂4AA和MADB的摩尔数之和的比为35:20000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为7.5。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、还原剂、螯合剂、表面活性剂、辅助稳定剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为55μmol/L～100μmol/L、还原剂的浓度为10μmol/L～50μmol/L、螯合剂的浓度为100μmol/L～140μmol/L、表面活性剂的质量分数为0.5％、辅助稳定剂的质量分数为1％，缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料选自直接红2B，苏丹红3号或苏丹红G；还原剂为碳酰肼；螯合剂为DTPA；表面活性剂为PluronicF-68；辅助稳定剂为山梨醇；缓冲液为MES缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为100μmol/L的直接红2B，浓度为10μmol/L的碳酰肼，浓度为100μmol/L的DTPA，质量分数为0.5％的PluronicF-68，质量分数为1％的山梨醇，浓度为0.1mol/L的MES缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为35μmol/L的苏丹红3号，浓度为20μmol/L的苏丹红G，浓度为50μmol/L的碳酰肼，浓度为140μmol/L的DTPA，质量分数为0.5％的PluronicF-68，质量分数为1％的山梨醇，浓度为0.1mol/L的MES缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂TMB的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂TMB的摩尔比为100:10000或55:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为6.0。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、还原剂、表面活性剂、辅助稳定剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为45μmol/L，还原剂的浓度为25μmol/L，表面活性剂的质量分数为0.5％，辅助稳定剂的质量分数为1％，缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为酸性红18和依莱铬红B，还原剂为碳酰肼；表面活性剂为PluronicF-68；辅助稳定剂为山梨醇；缓冲液为MES缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为40μmol/L的酸性红18，浓度为5μmol/L的依莱铬红B，浓度为25μmol/L的碳酰肼，质量分数为0.5％的PluronicF-68，质量分数为1％的山梨醇，浓度为0.1mol/L的MES缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂TMB的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂TMB的摩尔比为45:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为6.0。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、表面活性剂、辅助稳定剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为40μmol/L，表面活性剂的质量分数为0.5％，辅助稳定剂的质量分数为1％，缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为酸性红18；表面活性剂为PluronicF-68；辅助稳定剂为山梨醇；缓冲液为MES缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为40μmol/L的酸性红18，质量分数为0.5％的PluronicF-68，质量分数为1％的山梨醇，浓度为0.1mol/L的MES缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂TMB的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂TMB的摩尔比为40:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为6.0。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、还原剂、螯合剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为35μmol/L～80μmol/L，还原剂的浓度为15μmol/L～30μmol/L，螯合剂的浓度为80μmol/L～100μmol/L，缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料选自柠檬黄、橙黄G或依莱铬红B；还原剂为对乙酰氨基酚；螯合剂为GEDTA；缓冲液为磷酸盐缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为60μmol/L的柠檬黄；浓度为20μmol/L的橙黄G；浓度为30μmol/L的对乙酰氨基酚；浓度为80μmol/L的GEDTA；浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为15μmol/L的依莱铬红B；浓度为20μmol/L的橙黄G；浓度为15μmol/L的对乙酰氨基酚；浓度为100μmol/L的GEDTA；浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂TMB的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂TMB的摩尔比为80:10000或35:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为6.0。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、还原剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为75μmol/L，还原剂的浓度为20μmol/L，缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为苏丹红7B和酸性红18；还原剂为对乙酰氨基酚；缓冲液为磷酸盐缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为35μmol/L的苏丹红7B；浓度为40μmol/L的酸性红18；浓度为20μmol/L的对乙酰氨基酚；浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂TMB的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂TMB的摩尔比为75:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为6.0。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、螯合剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为40μmol/L，螯合剂的浓度为150μmol/L，缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为酸性红18；螯合剂为GEDTA；缓冲液为磷酸盐缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为40μmol/L的酸性红18；浓度为150μmol/L的GEDTA；浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂TMB的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂TMB的摩尔比为40:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为6.0。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、辅助稳定剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为55μmol/L～115μmol/L，辅助稳定剂的质量分数为2％，缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为柠檬黄和橙黄G；辅助稳定剂为BSA；缓冲液为MES缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为55μmol/L的柠檬黄；质量分数为2％的BSA；浓度为0.1mol/L的MES缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为100μmol/L的柠檬黄；浓度为15μmol/L的橙黄G；质量分数为2％的BSA；浓度为0.1mol/L的MES缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂DHBS的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂DHBS的摩尔比为55:10000或115:1000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为6.5。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、还原剂、辅助稳定剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为100μmol/L；还原剂的浓度为50μmol/L；辅助稳定剂的质量分数为2％；缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为直接红2B；辅助稳定剂为BSA；缓冲液为MES缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为100μmol/L的直接红2B；浓度为50μmol/L的1-苯基氨基脲；质量分数为2％的BSA；浓度为0.1mol/L的MES缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂DHBS的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂DHBS的摩尔比为100:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为6.5。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、螯合剂、辅助稳定剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为150μmol/L；螯合剂的浓度为20μmol/L；辅助稳定剂的质量分数为2％；缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为苏丹红3号；螯合剂为EDTA；辅助稳定剂为BSA；缓冲液为MES缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为150μmol/L的苏丹红3号；浓度为20μmol/L的EDTA；质量分数为2％的BSA；浓度为0.1mol/L的MES缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂DHBS的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂DHBS的摩尔比为150:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为6.5。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、还原剂、表面活性剂、辅助稳定剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为10μmol/L；还原剂的浓度为50μmol/L；表面活性剂的质量分数为0.5％；辅助稳定剂的质量分数为2％；缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为酸性红66；还原剂为4-苯基氨基脲；表面活性剂为Twenn20；辅助稳定剂为海藻糖；缓冲液为MOPS缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为10μmol/L的酸性红66；浓度为50μmol/L的4-苯基氨基脲；质量分数为0.5％的Twenn20；质量分数为2％的海藻糖；浓度为0.1mol/L的MOPS缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂TBHBA的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂TBHBA的摩尔比为10:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为7.4。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、表面活性剂、辅助稳定剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为125μmol/L；表面活性剂的质量分数为0.5％；辅助稳定剂的质量分数为2％；缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为直接红2B和柠檬黄；表面活性剂为Twenn20；辅助稳定剂为海藻糖；缓冲液为MOPS缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为25μmol/L的直接红2B；浓度为100μmol/L的柠檬黄；质量分数为0.5％的Twenn20；质量分数为2％的海藻糖；浓度为0.1mol/L的MOPS缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂TBHBA的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂TBHBA的摩尔比为125:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为7.4。
在本发明的一个实施例中，染色剂的稳定剂包括偶氮染料、表面活性剂、辅助稳定剂和缓冲剂；其中，偶氮染料的浓度为85μmol/L；表面活性剂的质量分数为0.5％；辅助稳定剂的质量分数为2％；缓冲剂的浓度为0.1mol/L。
作为优选，偶氮染料为日落黄；表面活性剂为Twenn20；辅助稳定剂为海藻糖；缓冲液为MOPS缓冲液。
优选的，显色剂的稳定剂包括浓度为85μmol/L的日落黄；质量分数为0.5％的Twenn20；质量分数为2％的海藻糖；浓度为0.1mol/L的MOPS缓冲液。
作为优选，此实施例中提供的稳定剂用于染色剂TBHBA的稳定。
在此实施例中，偶氮染料与染色剂TBHBA的摩尔比为85:10000。
在此实施例中，染色剂的稳定剂的适宜工作pH值为7.4。
在本发明的实施例中，显色剂与本发明提供的显色剂的稳定剂的质量比为1:(10～100000)。
在一些实施例中，显色剂与本发明提供的显色剂的稳定剂的质量比为1:(100～10000)。
本发明提供的显色剂的稳定剂在制备生化检测试剂中的应用；生化检测为对胆红素、血红蛋白、葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶或谷草转氨酶的定量或定性检测。
在测定上述分析物时需要添加相应的氧化酶，以产生双氧水与上述显色剂显色。例如，测定葡萄糖时添加葡萄糖氧化酶。
本发明的稳定剂也可以应用于干化学检测。将本发明的组合物固定在固相载体上，然后干燥。测试时将样本加在固相载体上，进行反应。同样可以获得良好的稳定性。
本发明采用偶氮染料作为显色剂的稳定剂，不仅起到了良好的稳定作用，而且不会对检测造成干扰。实验表明，述偶氮染料的加入，改善了显色剂的自发显色并且使显色剂保持了更好的显色能力。在不添加偶氮染料的对照试验中，染色剂皆发生了一定程度的颜色改变，吸光值也发生了明显的升高，而采用本发明提供的稳定剂后，染色剂颜色改变不明显，吸光值变化不显著。并且，在高温长期放置后，仍能获得良好的检测效果。
具体实施方式
本发明提供了一种显色剂的稳定剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
配制如下表所示的组合物：
表1实施例1实验方案
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| TMB | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L |
| 苏丹橙B | 1μmol/L | ||||
| 茜素黄R | 10μmol/L | ||||
| 橙黄G | 5μmol/L | ||||
| 柠檬黄 | 5μmol/L | ||||
| 日落黃 | 20μmol/L | ||||
| 藏花橙G | 100μmol/L | ||||
| TritonX100 | 1％ | 1％ | 1％ | 1％ | 1％ |
| MOPS | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L |
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至7.4。
各溶液配制后650nm的吸光度为0.02。50℃放置7天，测试上述溶液的650nm的吸光度，结果如下表所示：
表2实施例1各方案50℃放置7天后吸光度
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 吸光度 | 0.201 | 0.156 | 0.143 | 0.135 | 0.137 |
另外，取上述溶液1ml，加入20U/L的HRP溶液100μl，加入10mmol/L的双氧水100μl，37℃孵化3min，观察上述溶液的颜色，结果如下表所示：
表3实施例1各方案50℃放置7天后颜色
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 颜色 | 淡蓝 | 蓝 | 蓝 | 蓝 | 蓝 |
可见，上述染料的加入，改善了TMB的自发显色并且使显色剂保持了更好的显色能力。
实施例2
配制如下表所示的组合物：
表4实施例2实验方案
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 4AA | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L |
| MAOS | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L |
| 酸性红66 | -- | 0.1μmol/L | |||
| 苏丹黑B | -- | 50μmol/L | |||
| 碱性棕G | -- | 15μmol/L | |||
| 苏丹红B | -- | 75μmol/L | |||
| 直接黑BN | -- | 40μmol/L | |||
| 苏丹红7B | -- | 1mmol/L | |||
| 磷酸缓冲液 | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L |
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至6.5。
各溶液配制后630nm的吸光度为0.015。60℃放置7天，测试上述溶液的630nm的吸光度，结果如下表所示：
表5实施例2各方案60℃放置7天后吸光度
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 吸光度 | 0.101 | 0.045 | 0.063 | 0.071 | 0.083 |
另外，取上述溶液1ml，加入20U/L的HRP溶液100μl，加入10mmol/L的双氧水100μl，37℃孵化3min，观察上述溶液的颜色，结果如下表所示：
表6实施例2各方案60℃放置7天后颜色
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 颜色 | 淡蓝 | 蓝 | 蓝 | 蓝 | 蓝 |
可见，上述染料的加入，改善了4AA和MAOS的自发显色并且使显色剂保持了更好的显色能力。
实施例3
配制如下表所示的组合物：
表7实施例3实验方案
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 4AA | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L |
| MADB | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L |
| 直接红2B | -- | 10μmol/L | |||
| 苏丹红3号 | -- | 20μmol/L | |||
| 苏丹红4号 | -- | 35μmol/L | |||
| 诱惑红 | -- | 15μmol/L | |||
| EDTA | -- | 40μmol/L | |||
| 4-苯基氨基脲 | -- | 50μmol/L | 100μmol/L | ||
| 蔗糖 | 2％ | 2％ | 2％ | 2％ | 2％ |
| HEPES | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L |
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至7.5。
各溶液配制后630nm的吸光度为0.014。60℃放置7天，测试上述溶液的630nm的吸光度，结果如下表所示：
表8实施例3各方案60℃放置7天后吸光度
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 吸光度 | 0.125 | 0.035 | 0.045 | 0.077 | 0.047 |
另外，取上述溶液1ml，加入20U/L的HRP溶液100μl，加入10mmol/L的双氧水100μl，37℃孵化3min，观察上述溶液的颜色，结果如下表所示：
表9实施例3各方案60℃放置7天后颜色
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 颜色 | 淡蓝 | 蓝 | 蓝 | 蓝 | 蓝 |
可见，上述染料的加入，改善了4AA和MADB的自发显色并且使显色剂保持了更好的显色能力。
实施例4
配制如下表所示的组合物：
表10实施例4实验方案
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| TMB | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L |
| 直接红2B | 100μmol/L | ||||
| 苏丹红3号 | 35μmol/L | ||||
| 酸性红18 | 40μmol/L | 40μmol/L | |||
| 依莱铬红B | 5μmol/L | ||||
| 苏丹红G | 20μmol/L | ||||
| DTPA | 100μmol/L | 150μmol/L | 100μmol/L | ||
| 碳酰肼 | 10μmol/L | 25μmol/L | 50μmol/L | ||
| 山梨醇 | 1％ | 1％ | 1％ | 1％ | 1％ |
| Pluronic F-68 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| MES | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L |
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至6.0。
各溶液配制后650nm的吸光度为0.018。70℃放置7天，测试上述溶液的650nm的吸光度，结果如下表所示：
表11实施例4各方案70℃放置7天后吸光度
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 吸光度 | 0.205 | 0.103 | 0.095 | 0.085 | 0.071 |
另外，取上述溶液1ml，加入20U/L的HRP溶液100μl，加入10mmol/L的双氧水100μl，37℃孵化3min，观察上述溶液的颜色，结果如下表所示：
表12实施例4各方案70℃放置7天后颜色
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 颜色 | 淡蓝 | 蓝 | 蓝 | 蓝 | 蓝 |
可见，上述染料的加入，改善了TMB的自发显色并且使显色剂保持了更好的显色能力。
实施例5
配制如下表所示的组合物：
表13实施例5实验方案
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| TMB | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L |
| 柠檬黄 | 60μmol/L | ||||
| 苏丹红7B | 35μmol/L | ||||
| 酸性红18 | 40μmol/L | 40μmol/L | |||
| 依莱铬红B | 15μmol/L | ||||
| 橙黄G | 20μmol/L | 20μmol/L | |||
| GEDTA | 80μmol/L | 100μmol/L | 150μmol/L | ||
| 对乙酰氨基酚 | 30μmol/L | 20μmol/L | 15μmol/L | ||
| 磷酸盐缓冲剂 | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L |
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至6.0。
各溶液配制后650nm的吸光度为0.019。60℃放置7天，测试上述溶液的650nm的吸光度，结果如下表所示：
表14实施例5各方案60℃放置7天后吸光度
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 吸光度 | 0.205 | 0.030 | 0.045 | 0.025 | 0.021 |
另外，取上述溶液1ml，加入20U/L的HRP溶液100μl，加入10mmol/L的双氧水100μl，37℃孵化3min，观察上述溶液的颜色，结果如下表所示：
表15实施例5各方案60℃放置7天后颜色
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| 颜色 | 淡蓝 | 蓝 | 蓝 | 蓝 | 蓝 |
可见，上述染料的加入，改善了TMB的自发显色并且使显色剂保持了更好的显色能力。
实施例6
配制如下表所示的组合物：
表16实施例6实验方案
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| DHBS | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L |
| 胆固醇酯酶 | 200KU/L | 200KU/L | 200KU/L L | 200KU/L | 200KU/L |
| 胆固醇氧化酶 | 300KU/L | 300KU/L | 300KU/L | 300KU/L | 300KU/L |
| 过氧化物酶 | 300KU/L | 300KU/L | 300KU/L | 300KU/L | 300KU/L |
| 直接红2B | -- | 100μmol/L | |||
| 苏丹红3号 | -- | 150μmol/L | |||
| 柠檬黄 | -- | 55μmol/L | 100μmol/L | ||
| 橙黄G | -- | 15μmol/L | |||
| EDTA | -- | 20μmol/L | |||
| 1-苯基氨基脲 | -- | 50μmol/L | |||
| BSA | 2％ | 2％ | 2％ | 2％ | 2％ |
| MES | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L |
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至6.5。
上述5个方案分别在2-8℃和45℃温度中各放置一份，3天后分别用5个方案中2-8℃保存的溶液测试2.5mmol/L、8.7mmol/L、11mmol/L总胆固醇血清样本(上述总胆固醇浓度采用全自动生化仪测出)，得到吸光度。根据样本浓度绘制标准曲线并得到回归方程。
测试方法为在2.7ml上述溶液添加0.3ml血清样本，37℃孵化5min，在520nm读取吸光度。
将上述5个方案在60℃储存溶液按照同样的方法测试上述3个样本，将吸光度结果带入上述回归方程，计算得到样本测试浓度。结果如下表所示(单位：mmol/L)：
表17实施例6各方案吸光度
| 样本实际浓度 | 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E |
| 2.5mmol/L | 3.5 | 2.8 | 2.7 | 2.9 | 2.7 |
| 8.7mmol/L | 6.3 | 8.2 | 8.2 | 7.8 | 7.9 |
| 11mmol/L | 7.5 | 10.5 | 3.7 | 10.1 | 10.2 |
从上表可以看出，不添加本发明保护剂的方案A，低值(2.5mmol/L)偏高，是因为背景升高引起。而高值(11mmol/L)降低是由于显色剂变质失去了显色能力。而添加本发明的保护剂后，这两方面的问题都得到了显著的改善，即提高了显色剂的稳定性。
实施例7
配制如下表所示的组合物：
表18实施例7实验方案
| 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E | |
| TBHBA | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L | 10mmol/L |
| 尿酸氧化酶 | 200KU/L | 200KU/L | 200KU/L L | 200KU/L | 200KU/L |
| 过氧化物酶 | 300KU/L | 300KU/L | 300KU/L | 300KU/L | 300KU/L |
| 酸性红66 | -- | 10μmol/L | |||
| 直接红2B | -- | 25μmol/L | |||
| 柠檬黄 | -- | 100μmol/L | L | ||
| 日落黃 | -- | 85μmol/L | |||
| EDTA | -- | 20μmol/L | |||
| 4-苯基氨基脲 | -- | 50μmol/L | |||
| 海藻糖 | 2％ | 2％ | 2％ | 2％ | 2％ |
| Twenn 20 | 0.5％ | 0.5％ | 0.5％ | 0.5％ | 0.5％ |
| MOPS | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L | 0.1mol/L |
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至7.4。
将上述5个方案涂在1cm×1cm的滤纸上，每个方案涂2张滤纸。在40℃烘烤2h。烘干后将两张滤纸分别放入2-8℃和55℃的温度中，7天后。分别用5个方案中2-8℃保存的滤纸测试0.11mmol/L、0.67mmol/L、1.1mmol/L尿酸血清样本(上述尿酸浓度采用全自动生化仪测出)，得到反射率。根据样本浓度绘制标准曲线并得到回归方程。
测试方法为在滤纸上滴加30μl血清样本，37℃孵化3min，读取530nm读取反射率。
将上述5个方案在60℃储存滤纸按照同样的方法测试上述3个样本，将反射率结果带入上述回归方程，计算得到样本测试浓度。结果如下表所示(单位：mmol/L)：
表19实施例7各方案测定浓度
| 样本实际浓度 | 方案A | 方案B | 方案C | 方案D | 方案E |
| 0.11mmol/L | 0.20 | 0.13 | 0.14 | 0.13 | 0.12 |
| 0.67mmol/L | 0.55 | 0.65 | 0.66 | 0.62 | 0.68 |
| 1.1mmol/L | 0.75 | 1.02 | 1.05 | 1.03 | 1.12 |
从上表可以看出，不添加本发明保护剂的方案A，低值(0.11mmol/L)偏高，是因为背景升高引起。而高值(1.1mmol/L)降低是由于显色剂变质失去了显色能力。而添加本发明的保护剂后，这两方面的问题都得到了显著的改善，即提高了显色剂的稳定性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种显色剂的稳定剂，其特征在于，包括偶氮染料；
所述偶氮染料选自单偶氮染料、双偶氮染料或多偶氮染料；
所述单偶氮染料选自苏丹红l号、苏丹红2号、苏丹橙B、诱惑红、茜素黄R、橙黄G、柠檬黄、苋菜红、日落黄、苏丹红G、依莱铬红B、酸性红18或藏花橙G；
所述双偶氮染料选自酸性红66、苏丹黑B、直接红2B、碱性棕G、苏丹红B、苏丹红3号、苏丹红4号或苏丹红7B；
所述多偶氮染料为直接黑BN。
2.根据权利要求1所述的显色剂的稳定剂，其特征在于，还包括还原剂、螯合剂、缓冲剂、辅助稳定剂、表面活性剂中的任一种或两者以上的组合。
3.根据权利要求2所述的显色剂的稳定剂，其特征在于，其中所述还原剂的浓度为10μmol/L～100μmol/L；
所述还原剂选自1-苯基氨基脲、1，5-二苯基脲、N，N，N-三甲基氨基脲，4-苯基氨基脲、双酚A、五倍子酸、碳酰肼、对乙酰氨基酚或龙胆酸。
4.根据权利要求2所述的显色剂的稳定剂，其特征在于，其中所述螯合剂的浓度为20μmol/L～150μmol/L；
所述螯合剂选自乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、反式-1，2-二氨基环己烷-N，N，N’，N’-四乙酸、O，O’-二(2-氨乙基)乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸或氨三乙酸。
5.根据权利要求2所述的显色剂的稳定剂，其特征在于，其中所述缓冲剂的浓度为0.1mol/L；
所述缓冲剂选自柠檬酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、醋酸缓冲剂或Good’s缓冲剂。
6.根据权利要求2所述的显色剂的稳定剂，其特征在于，其中所述表面活性剂的质量分数为0.5％～1％；
所述表面活性剂选自Tween系列、Triton系列、Brij系列或Pluronic系列。
7.根据权利要求2所述的显色剂的稳定剂，其特征在于，其中所述辅助稳定剂的质量分数为1％～2％；
所述辅助稳定剂选自糖类或蛋白类。
8.根据权利要求1～7任一项所述的显色剂的稳定剂，其特征在于，所述显色剂选自苯胺类、酚类、Trinder、联氮类或咪唑类。
9.根据权利要求1～7任一项所述的显色剂的稳定剂，其特征在于，所述显色剂与权利要求1～7任一项所述的显色剂的稳定剂的质量比为1:(10～100000)。
10.权利要求1～7任一项所述的显色剂的稳定剂在制备生化检测试剂中的应用；所述生化检测为对葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶或谷草转氨酶的定量或定性检测。
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