CN1466631A

CN1466631A - 蛋白质分解物的制备方法

Info

Publication number: CN1466631A
Application number: CNA018164935A
Authority: CN
Inventors: ��ľ��֮; 八木雅之; 石丸香
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2000-09-28
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2004-01-07
Also published as: WO2002027012A1; AU2001290301A1; EP1329512A4; US20030186346A1; EP1329512A1; JPWO2002027012A1

Abstract

提供一种能够迅速且有效分解试样中蛋白质(包括肽)的蛋白质分解物的制备方法。通过在四唑鎓化合物的存在下，对含有蛋白质的试样进行蛋白酶处理，制备蛋白质分解物。另外，使按照这种蛋白质分解物的制备方法得到的糖蛋白分解物的糖化部分与果糖基氨基酸氧化酶反应，通过测定该氧化还原反应，可以迅速测定糖蛋白量。作为上述四唑鎓化合物，可以使用2－(4－碘苯基)－3－(2，4－二硝基苯基)－5－(2，4－二磺基苯基)－2H－四唑鎓盐等。

Description

蛋白质分解物的制备方法

技术领域

本发明涉及对试样中的蛋白质进行蛋白酶处理制备蛋白质分解物的方法。

背景技术

以前，为了检测试样中的目的蛋白质(包括肽)，或者使影响测定的蛋白质的功能失活，在各种测定方法中，适用通过蛋白酶分解上述蛋白质的方法。

例如，目前正在尝试通过酶法测定作为糖尿病诊断或治疗等的重要指标的血细胞中的糖蛋白，特别是反映生物体血糖值过去历史的红细胞中的糖化血红蛋白，这时也适用对糖蛋白进行蛋白酶分解的方法。在上述酶法中，使果糖基氨基酸氧化酶(以下称为“FAOD”)对溶血试样中的糖蛋白的糖化部分作用，产生过氧化氢。该过氧化氢量与上述糖蛋白量相对应。然后，向这种FAOD处理后的上述试样中添加过氧化物酶(以下称为“POD”)和还原剂，以上述POD作为催化剂，使上述过氧化氢和上述还原剂之间发生氧化还原反应。这时，如果使用通过氧化发色的发色性基质作为上述还原剂，则可以通过测定其发色来测定上述过氧化氢量，结果可以得知试样中的糖蛋白量。

但是，与糖蛋白或糖肽相比，对上述糖化部分作用的FAOD容易作用于糖化氨基酸或更短的肽片断。因此，预先用蛋白酶将糖蛋白分解，使FAOD容易作用于糖化部分，从而提高测定精度。

发明公开

但是，由于蛋白酶具有基质特异性，分解活性根据处理的基质而不同，因此存在下述问题，即根据目的蛋白质的种类，分解需要长时间，不能迅速进行测定。而且，象上述糖蛋白那样，目的蛋白质被糖化的场合，有时由于其立体位阻等难以分解。基于这种理由，例如在如上所述糖蛋白的测定中，同样由于预先进行的蛋白酶处理，因而导致整个测定需要较长时间。因此，从用于临床检查等领域的观点出发，也需要能够更迅速地测定上述糖蛋白的方法。

因此，本发明的目的在于提供一种迅速且有效地分解试样中的蛋白质制备蛋白质分解物的方法。

为了实现上述目的，本发明的蛋白质分解物的制备方法是在四唑鎓化合物的存在下对含有蛋白质的试样进行蛋白酶处理的方法。另外，在本发明中，上述蛋白质也包括肽。

这样，如果在四唑鎓化合物存在下进行蛋白酶处理，能够迅速分解试样中的蛋白质。

上述四唑鎓化合物是指具有四唑环结构的化合物。在本发明的制备方法中，作为上述四唑鎓化合物，可以使用下述物质，优选在四唑环的至少2个部位具有环结构取代基，特别优选2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。

在本发明的制备方法中，上述四唑鎓化合物的添加量没有特别的限定，可以根据上述蛋白酶的种类和添加量、上述试样的种类或含有的蛋白质的量等适当确定。具体而言，每1μL试样优选添加例如上述四唑鎓化合物达到0.02～10μmol的范围，更优选0.05～2μmol的范围，特别优选0.1～2μmol的范围。

另外，关于蛋白酶和四唑鎓化合物的添加比例，相对于1KU蛋白酶，例如为0.001～100μmol的范围，优选0.01～20μmol的范围，更优选0.05～5μmol的范围。

在本发明的制备方法中，优选在四唑鎓化合物和表面活性剂的存在下进行蛋白酶处理。这样，如果在还有表面活性剂共存的条件下进行蛋白酶处理，可以进一步促进蛋白酶引起的分解，迅速进行蛋白质的分解。

作为上述表面活性剂，没有特别的限定，例如可以使用非离子表面活性剂等，具体而言可以例举聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、脱水山梨醇脂肪酸酯等。其中优选聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚。此外，也可以使用月桂基硫酸钠、脱氧胆酸等。

具体而言，可以使用例如作为聚氧乙烯对叔辛基苯基醚的市售Triton类表面活性剂等、作为聚氧乙烯脱水山梨醇烷基酯的市售Tween类表面活性剂等、作为聚氧乙烯烷基醚的市售Brij类表面活性剂等。此外，也可以使用例如聚氧乙烯(10)月桂基醚、商品名NikkolBL-9EX(聚氧乙烯的重均聚合度N为9，和光纯药工业社制)等聚氧乙烯(9)月桂基醚、商品名Tergitol NPX(聚氧乙烯的重均聚合度N为约10.5，ナカライテスク社制)以及商品名Tergitol NP-40(聚氧乙烯的重均聚合度N为20，ナカライテスク社制)等聚氧乙烯辛基苯基醚等。

在本发明的制备方法中，上述表面活性剂的添加量没有特别的限定，每1mol四唑鎓化合物优选例如0.01～300mol的范围，更优选0.05～150mol的范围，特别优选0.2～100mol的范围。

另外，表面活性剂相对于1μL试样的添加量优选例如0.01～50μmol的范围，更优选0.05～10μmol的范围。

在本发明的制备方法中，上述分解的蛋白质优选为糖蛋白。作为上述糖蛋白，例如糖化血红蛋白、糖化白蛋白等，其中优选糖化血红蛋白。如果按照本发明的制备方法制备糖蛋白的分解物，在后述糖蛋白(包括糖肽)的测定方法中，可以迅速地测定上述糖蛋白。

在本发明的制备方法中，上述蛋白酶没有特别的限定，可以使用例如丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶等，具体而言优选胰蛋白酶、蛋白酶K、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、氨肽酶等。

另外，上述分解的蛋白质是糖化血红蛋白时，上述蛋白酶是选择性分解上述糖化血红蛋白的蛋白酶，优选菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰脏的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来源于枯草杆菌(Bacillussubtillis)的蛋白酶等。作为上述来源于枯草杆菌的蛋白酶，可以例举商品名蛋白酶N(例如フルカ社制)、商品名蛋白酶N“アマノ”(天野制药社制)等。作为上述金属蛋白酶，可以例举来源于杆菌属(Bacillus)的金属蛋白酶(EC3.4.24.4)(例如东洋纺社制，商品名トヨチ-ム)等。其中更优选金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，特别优选金属蛋白酶。这是因为，如果使用选择性分解的蛋白酶，可以选择性地制备特定蛋白质的分解物。

在本发明的制备方法中，蛋白酶的添加量可以根据使用的蛋白酶的种类、分解的蛋白质的种类和量等适当确定，例如相对于1μL试样，优选10～1000,000U的范围，更优选100～500,000U的范围，特别优选500～200,000U的范围。

在本发明的制备方法中，上述试样没有特别的限定，除全血、血浆、血清、血细胞等血液试样以外，还可以例举尿、髓液、唾液等生物体试样，或者果汁等饮料，酱油、调味汁等食品类等。其中优选全血等血液试样或血细胞试样。

其次，本发明的糖蛋白的测定方法是按照上述本发明的蛋白质分解物的制备方法，将试样中的糖蛋白分解，使得到的糖蛋白分解物的糖化部分与FAOD反应，通过测定该氧化还原反应测定糖蛋白量的方法。另外，糖蛋白与上述同样包括糖肽。

在四唑鎓化合物非存在下进行的现有方法中，为了用蛋白酶将糖蛋白充分分解，使FAOD容易作用于糖化部分，有必要进行蛋白酶处理约6～40小时。因此，采用上述酶法测定糖蛋白时，需要长时间，很难说是有用的方法。但是，按照本发明的测定方法，能够在短时间内分解蛋白质，因此能够迅速进行糖蛋白的测定。按照本发明的测定方法，例如除添加四唑鎓化合物以外，在与现有方法相同的条件下进行测定时，与四唑鎓化合物不存在的条件下进行测定时相比，可以缩短测定时间约25～1200倍。

在本发明的制备方法中，上述四唑鎓化合物和上述蛋白酶可以使用与上述同样的物质，其添加量也同样。

在本发明的测定方法中，上述糖蛋白可以例举与上述同样的物质，特别优选糖化血红蛋白。血液中的血红蛋白浓度较高，为约60～200g/L，而且分解困难，因此蛋白酶处理需要数小时～数日，但是采用本发明的测定方法，例如20秒～2小时的处理成为可能，能够迅速进行糖化血红蛋白的测定。

在本发明的测定方法中，上述氧化还原反应的测定优选测定通过使糖蛋白分解物的糖化部分与FAOD反应生成的过氧化氢量。

上述过氧化氢量的测定优选使用氧化酶和通过氧化显色的基质(发色性基质)进行测定。作为上述氧化酶，没有特别的限定，优选POD。作为上述发色性基质，没有特别的限定，从能够高灵敏度检测出发，例如优选N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯胺钠(例如商品名DA-64，和光纯药工业社制)。

在本发明的测定方法中，上述试样没有特别的限定，可以例举与上述相同的物质。

在本发明的测定方法中，作为上述FAOD，优选对下述式(1)表示的反应进行催化的FAOD。

…(1)

在上述式(1)中，R¹表示羟基或来源于糖化反应前的糖的残基(糖残基)。在反应前的糖为醛糖时，上述糖残基(R¹)为醛糖残基，在反应前的糖为酮糖时，上述糖残基(R¹)为酮糖残基。例如，反应前的糖为葡萄糖时，由于阿玛窦利(Amadori)重排，反应后的结构采取果糖结构，但这时糖残基(R¹)为葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R¹)例如可以用下式表示，n为0～6的整数。

-〔CH(OH)〕_n-CH₂OH

上述式(1)中，R²没有特别的限定，例如糖化氨基酸、糖肽或糖蛋白的场合，α-氨基被糖化的场合与除此以外的氨基被糖化的场合不同。

上述式(1)中，α-氨基被糖化的场合，R²为下述式(2)表示的氨基酸残基或肽残基。

-CHR³-CO-R⁴ …(2)

上述式(2)中，R³表示氨基酸侧链基。另外，R⁴表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下述式(3)表示。下述式(3)中，n为0以上的整数，R³与上述同样表示氨基酸侧链基。

-(NH-CHR³-CO)_n-OH …(3)

另外，上述式(1)中，α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸侧链基被糖化)的场合，R²可以用下述式(4)表示。

-R⁵-CH(NH-R⁶)-CO-R⁷ …(4)

上述式(4)中，R⁵表示氨基酸侧链基中被糖化的氨基以外的部分。例如被糖化的氨基酸为赖氨酸时，R⁵为下述基团，

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-

被糖化的氨基酸为精氨酸时，R⁵为下述基团。

-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH(NH₂)-

另外，上述式(4)中，R⁶为氢、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下述式(5)表示。另外，下述式(5)中，n为0以上的整数，R³与上述同样表示氨基酸侧链基。

-(CO-CHR³-NH)_n-H …(5)

另外，上述式(4)中，R⁷为羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下述式(6)表示。另外，下述式(6)中，n为0以上的整数，R³与上述同样表示氨基酸侧链基。

-(NH-CHR³-CO)_n-OH …(6)

发明的最佳实施方式

本发明的制备方法中使用的四唑鎓化合物优选四唑环的至少2个部位具有环结构取代基，更优选3个部位具有环结构取代基。

上述四唑鎓化合物如上所述在上述四唑环的至少2个部位具有环结构取代基时，优选在上述四唑环的2位和3位具有上述取代基。另外，四唑鎓化合物在3个部位具有环结构取代基时，优选在上述四唑环的2位、3位和5位具有上述取代基。

上述四唑鎓化合物的至少2个环结构取代基的环结构优选为苯环。另外，作为苯环以外的环结构取代基，可以例举环骨架中含有S或O且为共振结构的取代基，例如噻吩基、噻唑基等。

上述四唑鎓化合物优选在四唑环的至少3个部位具有环结构取代基，且上述环结构取代基中至少2个环结构取代基的环结构为苯环。

优选上述四唑鎓化合物的至少1个环结构取代基具有官能团，更优选上述官能团的数目较多。

作为上述官能团，优选吸电子性官能团，例如卤素基团、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基、硝基、羟基、磺基等。除此之外，还可以例举氢过氧基、氧基、环氧基、环二氧基、酮基等含有氧的特性基团，巯基、烷硫基、甲硫基甲基、硫代基团、亚磺基、苯磺酰基、苯基磺酰基、对甲苯磺酰基、对甲苯基磺酰基、甲苯磺酰基、氨磺酰基、异硫氰酸酯基等含有硫的特性基团等。这些吸电子性官能团中优选硝基、磺基、卤素基团、羧基、羟基、甲氧基、乙氧基。另外，除上述吸电子性官能团以外，还可以例举苯基(C₆H₅-)、苯乙烯基(C₆H₅CH＝CH-)等不饱和烃基等。另外，上述官能团也可以通过解离进行离子化。

上述四唑鎓化合物优选在四唑环的2位和3位具有苯环，且上述苯环中至少一个具有选自卤素基团、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基和乙氧基的至少一个官能团。另外，也可以是上述两个苯环具有上述官能团。在上述苯环中，可以在任何位置(ortho-、meta-、para-)具有上述官能团。另外，官能团的数目没有特别的限定，可以具有相同的官能团，也可以具有不同的官能团。

上述四唑鎓化合物作为例如在上述四唑环的2位、3位和5位具有苯环结构取代基的化合物，可以例举2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3，3’-(1，1’-联苯-4，4’-二基)-二(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3，3’-〔3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯)-4，4’-二基〕-二〔2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐〕、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(对二苯基)四唑鎓盐(2，5-diphenyl-3-(p-diphenyl)tetrazolium salt)、2，3-二苯基-5-(对二苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑鎓盐以及2，5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑鎓盐等。

另外，上述四唑鎓化合物并不限于上述化合物，此外也可以使用在上述四唑环的2个部位具有苯环结构取代基并在1个部位具有其它环结构取代基的化合物，例如2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-〔4-(2-磺基乙基氨基甲酰基)苯基〕-2H-四唑鎓盐、2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二〔4-二(2-磺基乙基)氨基甲酰基苯基〕-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-亚联苯基)二四唑鎓盐和3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓盐等。

另外，也可以使用在上述四唑环的2个部位具有苯环结构取代基并在1个部位具有非环结构取代基的四唑鎓化合物，例如2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐等。

在上述四唑鎓化合物中，如上所述优选具有3个环结构取代基的化合物，更优选具有3个环结构为苯环的取代基，且具有多个吸电子性官能团的化合物，特别优选2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。这种四唑鎓化合物例如可以是盐，也可以呈离子化的状态等。另外，四唑鎓化合物可以为1种，也可以2种以上同时使用。

关于本发明的蛋白质分解物的制备方法，以分解血细胞中的糖蛋白为例进行说明。

首先，将全血直接溶血，或者采用离心分离等常规方法由全血分离血细胞级分并将其溶血，制备溶血试样。该溶血方法没有特别的限定，例如可以采用使用表面活性剂的方法、利用超声波的方法、利用渗透压差的方法等，其中优选上述使用表面活性剂的方法。

作为溶血用表面活性剂，没有特别的限定，可以使用例如聚氧乙烯对叔辛基苯基醚(Triton类表面活性剂等)、聚氧乙烯脱水山梨醇烷基酯(Tween类表面活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij类表面活性剂等)等非离子表面活性剂，具体而言例如商品名TritonX-100、商品名Tween-20、商品名Brij35等。关于利用上述表面活性剂进行处理的条件，通常在处理溶液中的血细胞浓度为1～10体积％的场合，可以添加上述表面活性剂达到上述处理溶液中的浓度为0.1～1重量％，在室温下搅拌5秒～1分钟。

另外，上述利用渗透压差的场合，例如相对于全血的体积添加2～100倍体积量的蒸馏水可以溶血。

其次，在上述四唑鎓化合物存在下对上述溶血试样进行上述蛋白酶处理。从而得到糖蛋白分解物。

上述蛋白酶处理通常在缓冲液中进行。上述缓冲液的种类没有特别的限定，例如可以使用Tris盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液、磷酸缓冲液、ADA缓冲液、枸橼酸缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酰胺缓冲液、CHES缓冲液等，其pH优选pH5～12的范围，更优选6～10的范围，特别优选7～9的范围。

关于上述蛋白酶的添加量，例如前处理溶液中的血细胞浓度为0.1～10体积％的场合，优选添加蛋白酶达到0.1～100g/升的范围，更优选0.3～50g/升的范围，特别优选0.5～20g/升的范围。

另外，分解对象蛋白质为糖化血红蛋白时，蛋白酶如上所述是选择性分解糖化血红蛋白的蛋白酶，上述蛋白酶优选菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰脏的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来源于枯草杆菌的蛋白酶。关于这些蛋白酶的添加比例，例如前处理溶液中的血细胞浓度为0.1～10体积％的场合，优选添加蛋白酶达到0.1～50g/升的范围，更优选0.3～30g/升的范围，特别优选1～20g/升的范围。具体而言，蛋白酶为金属蛋白酶的场合，优选向血细胞浓度0.3～5体积％的前处理溶液中添加至0.1～30g/升的范围，更优选0.3～20g/升的范围，特别优选1～10g/升的范围。

关于上述四唑鎓化合物的添加比例，例如前处理溶液中血细胞浓度为0.1～10体积％的场合，优选添加至浓度达到0.1～50mmol/升的范围，更优选0.2～20mmol/升的范围，特别优选0.3～10mmol/升的范围。具体而言，上述四唑鎓化合物为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐，且前处理溶液中的血细胞浓度为0.1～10体积％的场合，优选添加至浓度达到0.3～15mmol/升的范围，更优选0.5～15mmol/升的范围，特别优选1～10mmol/升的范围。

上述四唑鎓化合物可以直接使用，从操作的简便性和处理效率等观点出发，优选制成溶解于溶剂中得到的四唑鎓化合物溶液使用。上述溶液的浓度可以根据四唑鎓化合物的种类(例如分子量等)等适当确定，例如为0.01～120mmol/升的范围，优选0.1～50mmol/升的范围，更优选0.2～20mmol/升的范围。作为上述溶剂，例如可以使用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等，作为上述缓冲液，可以使用例如前述的缓冲液等。另外，上述四唑鎓化合物可以使用1种，也可以2种以上同时使用。

上述四唑鎓化合物存在下的蛋白酶处理的条件没有特别的限定，例如温度为10～37℃的范围，处理时间为30秒～60分钟的范围，优选温度为20～37℃的范围，处理时间为30秒～10分钟的范围，更优选温度为25～37℃的范围，处理时间为30秒～5分钟的范围。

如果如上所述在四唑鎓化合物存在下对试样进行蛋白酶处理，则可以促进试样中糖蛋白的分解。因此，可以在短时间内且以优良的分解效率得到糖蛋白的分解物。

另外，如果不仅存在上述四唑鎓化合物，而是在四唑鎓化合物与表面活性剂共存的条件下进行该蛋白酶处理，则可以进一步促进蛋白酶引起的分解。

表面活性剂的添加量没有特别的限定，例如在前处理溶液中血细胞浓度为0.3～5体积％的场合，优选添加至浓度达到0.1～500mmol/升的范围，更优选0.5～150mmol/升的范围，特别优选1～100mmol/升的范围。具体而言，上述表面活性剂为商品名TritonX-100的场合，优选添加至浓度达到0.2～400mmol/升的范围，更优选1～150mmol/升的范围，特别优选2～100mmol/升的范围。另外，商品名Brij35的场合，优选添加至浓度达到0.1～200mmol/升的范围，更优选0.5～10mmol/升的范围，特别优选1～50mmol/升的范围。

另外，上述表面活性剂相对于上述四唑鎓化合物1mmol，可以添加至0.01～300mmol的范围，优选0.05～150mmol的范围，更优选0.2～100mmol的范围。

具体而言，上述表面活性剂为商品名TritonX-100的场合，相对于四唑鎓化合物1.5mmol，优选添加至0.2～400mmol的范围，更优选1～150mmol的范围，特别优选2～100mmol的范围。另外，商品名Brij35的场合，相对于四唑鎓化合物1.5mmol，优选添加至0.1～200mmol的范围，更优选0.5～150mmol的范围，特别优选1～50mmol的范围。

另外，如上所述通过表面活性剂处理进行试样的溶血处理时，也可以预先在溶血步骤中添加表面活性剂，使之在预处理中达到必要的浓度。

其次，关于本发明的糖蛋白的测定方法，以测定血细胞中的糖蛋白量为例进行说明。

首先，与上述同样由全血试样或血细胞试样制备溶血试样。接着，与上述同样在四唑鎓化合物存在下对上述溶血试样进行蛋白酶处理，制备糖蛋白的分解物。这样用蛋白酶处理糖蛋白是由于如上所述与糖蛋白相比，在后处理中使用的FAOD容易作用于糖化氨基酸或较短的糖肽片断，因而进行分解使之容易作用于糖化部分。如上所述，如果在四唑鎓化合物存在下进行蛋白酶处理，则能够在短时间内且以高分解效率分解糖蛋白，因此即使蛋白酶处理时间短，FAOD也能充分作用于糖化部分。另外，也可以在四唑鎓化合物和表面活性剂的存在下进行处理，因为这样可以进一步促进分解。

接着，对通过上述蛋白酶处理得到的分解物用上述FAOD进行处理。通过这种FAOD处理，可以催化上述式(1)表示的反应。

该FAOD处理与上述蛋白酶处理同样优选在缓冲液中进行。其处理条件可以根据使用的FAOD的种类、作为测定对象物的糖蛋白的种类及其浓度等适当确定。

具体而言，例如反应液中的FAOD浓度为50～50,000U/升，反应液中的血细胞浓度为0.01～1体积％，反应温度为15～37℃，反应时间为1～60分钟，pH为6～9的范围。上述缓冲液的种类也没有特别的限定，可以使用与上述蛋白酶处理同样的缓冲液。

接着，使用POD和上述发色性基质，通过氧化还原反应测定上述FAOD处理生成的过氧化氢。

作为上述发色性基质，可以例举N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺钠、邻苯二胺(OPD)、トリンダ-试剂和4-氨基安替比林组合而成的基质等。作为上述トリンダ-试剂，例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除上述4-氨基安替比林以外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香兰素二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。这些发色性基质中，如上所述特别优选N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺钠。

上述氧化还原反应通常在缓冲液中进行，其条件可以根据上述生成的过氧化氢的浓度等适当确定。通常，反应液中的POD浓度为10～20,000IU/升，发色性基质浓度为0.001～1mmol/l，反应温度为20～37℃，反应时间为1～5分钟，pH为6～9。另外，上述缓冲液没有特别的限定，例如可以使用与上述蛋白酶处理和FAOD处理等同样的缓冲液等。

在上述氧化还原反应中，例如使用上述发色性基质的场合，用分光光度计测定上述反应液的显色程度(吸光度)，从而可以测定过氧化氢的量。而且，可以使用该过氧化氢浓度与标准曲线等，求出试样中的糖蛋白量。

另外，除上述使用POD等的酶法以外，也可以通过例如电的方法测定上述过氧化氢量。

按照这种本发明的测定方法，能够如上所述迅速进行测定。另外，按照现有方法，如果缩短蛋白酶处理的时间，恐怕测定精度会降低，但是按照本发明的测定方法，则可以在短时间内以优良的精度进行测定。

实施例

以下，对于实施例结合比较例进行说明。

(实施例1、比较例1)

该实施例是在四唑鎓化合物存在下对血红蛋白(Hb)进行蛋白酶处理，测定其分解物的糖化物量，考察Hb的分解程度的实例。使用的试样、试剂和方法如下所示。

(Hb的制备)

采集健康正常人的全血，用0.9重量％NaCl水溶液洗涤3～5次。用蒸馏水将血细胞稀释5倍(体积)，使之溶血，离心分离(7000g，30分钟)，回收上清液(溶血试样)(约75～200mL)。用20mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)500mL使阳离子交换凝胶(商品名POROS HS/50，アプライドバイオシステムズ社制)约30g膨润，向其中加入上述上清液，搅拌，使之吸附Hb。静置约60分钟后，用直径95mm的桐山漏斗过滤，用上述磷酸钠缓冲液洗涤回收的凝胶，直到滤液透明。接着，用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)洗脱，回收洗脱级分(约300～400ml)，以其作为纯化Hb试样。另外，上述试样的Hb浓度按照常规方法(例如SLS法等)进行测定，保存温度为-80℃。

(蛋白酶溶液)

将商品名蛋白酶K(和光纯药工业社制)、商品名トヨチ-ム(东洋纺社制)、商品名蛋白酶Nアマノ(天野制药社制)、商品名木瓜蛋白酶(ロシユ社制)分别溶解于蒸馏水中，配制各蛋白酶溶液(2g/L)。

(WST-3溶液：以下相同)

将作为四唑鎓化合物的下式(7)表示的2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓一钠盐(商品名WST-3，同仁化学研究所社制)溶解于蒸馏水中，使浓度达到5mM，进行配制。

(缓冲液)

80mM甘氨酸-钠缓冲液(pH10、pH11)

(蛋白酶反应液的组成)

实施例1 比较例1 终浓度纯化Hb试样 50μl 50μl 1.87mg/ml蒸馏水 250μl 350μl -缓冲液 50μl 50μl 8.0mM蛋白酶溶液 50μ1 50μl 0.2g/LWST-3溶液 100μl - 1.7mM合计液量 500μl 500μl

(试剂A)POD(东洋纺绩社制，以下相同) 20KU/L商品名DA-64(和光纯药工业社制) 40μmol/L磷酸钾缓冲液(KPB)pH7.0 0.1mol/L(试剂B)FAOD(旭化成社制) 14.6KU/LKPB 0.1mol/L

(方法)

使用上述各种蛋白酶，将蛋白酶反应溶液混合达到上述组成，在37℃下开始反应，反应给定的时间(0分钟、10分钟、30分钟和60分钟)后，用冰冷却反应溶液，使反应停止。用超滤膜(分级分子量10000、7000G、60分钟、4℃)处理这些反应溶液，回收滤液。

接着，向上述滤液25μl中添加上述试剂A 45μl，5分钟后，再添加上述试剂B 20μl。然后，以添加上述试剂B时为0分钟，用生物化学自动分析装置(商品名JCA BM-8，日本电子社制)测定3分钟后的吸光度的增加。测定波长为主波长751nm、副波长884nm。WST-3存在下的实施例1的吸光度如下述表1所示。以反应开始0分钟的吸光度为0.000。另外，作为比较例1，如上述反应液组成所示除了添加蒸馏水代替WST-3以外，与上述实施例1同样进行处理，测定吸光度。

(表1)蛋白酶反応液蛋白酶处理时间

的pH 10分钟 30分钟 60分钟蛋白酶K 10 0.022 - -

11 0.011 0.018 -トヨチ一ム 10 0.004 0.007 0.010

11 0.002 0.004 0.004蛋白酶Nアマノ 10 0.003 0.011 0.017

11 0.004 0.004 0.005木瓜蛋白酶 10 0.000 0.002 0.004

在比较例1中，即使进行蛋白酶处理60分钟，也不能确认吸光度的增加(吸光度0.00)，蛋白酶处理3～6小时后才勉强见到吸光度的增加(0.000～0.004)。与此相对，在WST-3存在下进行蛋白酶处理的实施例1中，Hb经过10～60分钟的蛋白酶处理而被分解，因此如上述表1所示可以确认吸光度随时间的经过增加。

(实施例2)

该实施例是进一步在WST-3和表面活性剂存在下对血红蛋白进行蛋白酶处理，考察其分解程度的实例。以下，说明使用的试样、试剂和方法。除了特殊说明以外，与上述实施例1同样进行。

(表面活性剂溶液)

将商品名TritonX-100(和光纯药工业社制)和商品名Brij35(Sigma社制)添加到蒸馏水中达到0.3重量％，进行配制。

除了将蒸馏水250μl更换为上述表面活性剂溶液250μl以外，与上述实施例1同样进行蛋白酶反应(表面活性剂的终浓度为0.15重量％)，同样测定吸光度。在WST-3和TritonX-100存在下处理时的结果如下述表2所示，在WST-3和Brij35存在下处理时的结果如下述表3所示。

(表2)

(WST-3和TritonX-100)

蛋白酶反応液蛋白酶处理时间

的pH 10分钟 30分钟 60分钟蛋白酶K 11 0.020 0.021 0.019トヨチ一ム 10 0.014 0.018 0.020蛋白酶Nアマノ 10 0.021 0.022 0.022木瓜蛋白酶 10 0.003 0.005 0.005

(表3)

(WST-3和Brij35)

蛋白酶反応液蛋白酶处理时间

的pH 10分钟 30分钟 60分钟蛋白酶K 11 0.023 0.021 0.021トヨチ一ム 10 0.012 0.015 0.016蛋白酶Nアマノ 10 0.018 0.018 0.020

如上述表2和表3所示，在WST-3存在下进行蛋白酶处理时通过同时使用表面活性剂，可以见到比上述表1所示的实施例1的吸光度更高的吸光度增加。另外，见不到吸光度从0.020附近增加，认为这是因为反应已经结束。

由此可以得知，如果在WST-3存在下进行蛋白质的蛋白酶处理，则能够促进蛋白质的分解，因此可以在短时间内且以高分解效率分解蛋白质。另外，通过进一步同时使用表面活性剂，可以进一步促进蛋白酶处理。

工业实用性

如上所述，本发明的蛋白质分解物的制备方法通过在四唑鎓化合物存在下对试样进行蛋白酶处理，能够迅速分解试样中的蛋白质。因此，按照适用该制备方法的本发明的糖蛋白的测定方法，能够迅速进行例如糖尿病诊断中重要的红细胞中糖化血红蛋白等的测定。

Claims

1.蛋白质分解物的制备方法，在四唑鎓化合物的存在下对含有蛋白质的试样进行蛋白酶处理。

2.如权利要求1所述的制备方法，四唑鎓化合物在四唑环的2位和3位具有苯环，且上述苯环中至少一个具有选自卤素基团、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基和乙氧基中的至少一个官能团。

3.如权利要求1所述的制备方法，四唑鎓化合物是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。

4.如权利要求1所述的测定方法，四唑鎓化合物的添加量为每1μL试样添加0.02～10μmol的范围。

5.如权利要求1所述的测定方法，蛋白酶的添加量为每1μL试样添加10～1000,000U的范围。

6.如权利要求1所述的测定方法，四唑鎓化合物的添加量为每1KU蛋白酶添加0.001～100μmol的范围。

7.如权利要求1所述的制备方法，在四唑鎓化合物和表面活性剂的存在下进行蛋白酶处理。

8.如权利要求7所述的制备方法，表面活性剂为非离子表面活性剂。

9.如权利要求8所述的制备方法，非离子表面活性剂是选自聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和脱水山梨醇脂肪酸酯的至少一种表面活性剂。

10.如权利要求7所述的制备方法，表面活性剂的添加量为每1mmol四唑鎓化合物添加0.01～300mmol的范围。

11.如权利要求7所述的制备方法，表面活性剂的添加量为每1μL试样添加0.01～50μmol。

12.如权利要求1所述的制备方法，蛋白酶是选自胰蛋白酶、蛋白酶K、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶和氨肽酶的至少一种。

13.如权利要求1所述的制备方法，蛋白酶是选择性分解糖化血红蛋白的蛋白酶中，选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰脏的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来源于枯草杆菌的蛋白酶的至少一种蛋白酶。

14.如权利要求1所述的制备方法，分解的蛋白质为糖蛋白。

15.如权利要求14所述的制备方法，糖蛋白为糖化血红蛋白。

16.如权利要求1所述的制备方法，试样为全血。

17.如权利要求1所述的制备方法，试样为含有红细胞的试样。

18.糖蛋白的测定方法，按照权利要求1所述的蛋白质分解物的制备方法，将试样中的糖蛋白分解，使得到的糖蛋白分解物的糖化部分与果糖基氨基酸氧化酶反应，通过测定该氧化还原反应测定糖蛋白的量。

19.如权利要求18所述的测定方法，氧化还原反应的测定是测定通过使糖蛋白分解物与果糖基氨基酸氧化酶反应生成的过氧化氢的量。

20.如权利要求19所述的测定方法，过氧化氢的测定是使用过氧化氢与通过氧化显色的基质进行的测定。

21.如权利要求20所述的测定方法，过氧化氢的测定是使用氧化酶使过氧化氢与基质反应，测定显色的上述基质的吸光度。