CN1656232A - 防止n－(羧甲基氨羰基)－4,4′－双(二甲氨基)二苯胺钠盐错误显色的方法、试剂溶液及使用该方法的测量方法 - Google Patents
防止n－(羧甲基氨羰基)－4,4′－双(二甲氨基)二苯胺钠盐错误显色的方法、试剂溶液及使用该方法的测量方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种防止N－(羧甲基氨羰基)－4，4′－双(二甲氨基)二苯胺钠盐作为显色底物错误显色的方法，从而提高了利用使用显色底物实行氧化还原反应的测量的准确度。在表面活性剂的存在下向样品中加入四唑鎓化合物、叠氮化钠和显色底物。样品中源于分析物的氧化性物质与通过氧化而显色的显色底物之间的反应通过氧化还原酶来引发。通过测量显示的颜色来确定氧化性物质的量。设置反应溶液中各组分的浓度，使每微摩尔显色底物存在0.01至1毫摩尔的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩尔的叠氮化钠和0.006至0.4毫摩尔的表面活性剂，并且反应溶液的pH值在6至9的范围内。
Description
技术领域
本发明涉及防止N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐错误显色的方法、试剂溶液和使用该方法利用氧化还原反应的测量方法。
背景技术
传统上，使用氧化还原反应测量样品中的分析物已经用于许多领域。例如，以下面的方式实施这种测量。首先，向作为分析物的氧化性物质或者从分析物中形成的氧化性物质中加入过氧化物酶(下文称作“POD”)和还原剂，使得在POD作为催化剂的情况下在氧化性物质和还原剂之间发生氧化还原反应。当使用氧化时显色的还原剂作为还原剂时，可通过测量显示的颜色来确定氧化性物质的量，因为显示颜色的量与氧化性物质的量之间存在着相互关系。已经使用N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐作为氧化时显色的还原剂。
但是，这种方法不能表现出足够的测量灵敏度，因此可能不提高测量的准确性。
发明内容
考虑上述的问题，本发明的发明人进行了深入的研究，并且发现通过在四唑鎓和叠氮化钠存在下实施氧化还原反应可以提高测量的灵敏度。所述结果已经在另一篇专利申请中递交。但是，本发明的发明人进一步发现尽管如上所述这种测量方法可以提高测量灵敏度，但是它引起另一个问题：由于溶液中一起存在N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐、四唑鎓化合物和叠氮化钠，所以在氧化还原反应之前，N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐作为显示颜色的底物(下文中称作“显色底物”)可能发生错误的显色。这种错误显色导致在上述显色测量中背景的增加，并且在一些情况中，即便添加的显色底物的量是足够的，也会导致氧化还原反应中显色底物的缺乏。
因此，本发明的目的是提供一种防止N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐错误显色的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种在包含四唑鎓化合物和叠氮化钠的含水溶剂中防止N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(下文也称作“DA-64”)错误显色的方法，其包括：在表面活性剂的存在下，在含水溶剂中混合四唑鎓化合物、叠氮化钠和DA-64，其中每微摩尔DA-64存在0.01至1毫摩尔的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩尔的叠氮化钠和0.006至0.4毫摩尔的表面活性剂，并且包含DA-64、四唑鎓化合物和叠氮化钠的含水溶剂的pH值在6至9的范围内。
通过在表面活性剂的存在下混合上述的三种组分并且设置混合物中各组分的浓度和pH值在上述的范围内，即便在含水溶剂中一起存在“DA-64、四唑鎓化合物和叠氮化钠”也能抑制上述DA-64的错误显色。因此，如果对后面所述的使用氧化还原反应的测量施用这种防止错误显色的方法，那么可以抑制吸光度测量中背景吸光度的增加，从而可以高准确度地测量分析物。添加各种组分的顺序没有特别限制，只要在含水溶剂中彼此混合DA-64、四唑鎓化合物和叠氮化钠时存在表面活性剂就行。因此例如，事先向含水溶剂中加入表面活性剂，然后分别向含水溶剂中加入剩下的三种组分。可选地，在已经向含水溶剂中加入了四唑鎓化合物和叠氮化钠后，可在表面活性剂的存在下加入DA-64。这些实例只是用于阐述目的，并且添加这些组分的顺序没有限制于这些实例。
接着，本发明提供了一种包含DA-64、四唑鎓化合物、叠氮化钠和表面活性剂的DA-64试剂溶液，其中每微摩尔DA-64存在0.01至1毫摩尔的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩尔的叠氮化钠和0.006至0.4毫摩尔的表面活性剂，并且试剂溶液的pH值在6至9的范围内。
在具有这种组成的试剂溶液中，即便在四唑鎓化合物和叠氮化钠的存在下，如同在上述防止错误显色的方法的情况一样，也可以防止DA-64的错误显色。因此，可以以溶液形式稳定地储备DA-64，并且这种试剂溶液适用于例如下面描述的测量方法等。
接着，本发明提供了一种测量样品中源于分析物的氧化性物质的方法，其包括：在源于分析物的氧化性物质与作为显色底物的DA-64之间引起反应，所述反应在四唑鎓化合物和叠氮化钠的存在下通过氧化还原酶来引发；以及通过测量显色物质显示的颜色来确定氧化性物质的量。在此方法中，在表面活性剂的存在下于含水溶剂中混合四唑鎓化合物、叠氮化钠和显色底物，使得每微摩尔作为显色底物的DA-64存在0.01至1毫摩尔的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩尔的叠氮化钠和0.006至0.4毫摩尔的表面活性剂，并且所得混合物的pH值在6至9的范围内。
因为可以抑制由于DA-64错误显色引起的背景增加，这种测量方法不仅在测量灵敏度而且在测量准确度方面都是优异的。在本发明中，“源于分析物的氧化性物质”包括分析物自身、分析物中包含的氧化性物质，以及使用氧化还原酶从分析物形成的氧化性物质等。
在根据本发明的测量方法中，含水溶剂优选是包含分析物的样品溶液。例如，优选向样品溶液中加入了四唑鎓化合物和叠氮化钠，并且此后，在表面活性剂的存在下进一步加入N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(DA-64)以及氧化还原酶，从而通过氧化还原酶引起反应。
在根据本发明的测量方法中，样品的类型没有特别限制。所述方法还可以应用于全血、血浆、血清和血细胞以外的样品，例如生物样品，如尿和脊髓液、饮料如果汁，以及食物如酱油和辣酱油。
在根据本发明的测量方法中，分析物没有特别限制，只要使用氧化还原反应就行。例如，分析物可以是全血中的组分、红细胞中的组分、血浆中的组分、血清中的组分、尿中的组分、脊髓液中的组分等，并且优选是红细胞中的组分。例如，当需要测量红细胞中的组分时，全血自身可以发生溶血来制备样品，或者红细胞与全血分离，并且溶血来制备样品。分析五的具体实例包括糖化蛋白，例如糖化血红蛋白和糖化白蛋白、糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、尿酸、胆固醇、肌酸酐、肌氨酸和甘油。其中，糖化蛋白是优选的并且糖化血红蛋白是特别优选的。原因如下。已经认为糖化血红蛋白是一种在糖尿病的诊断、治疗等中的重要指示剂，因为它反映了患者血糖水平的过去历史。因为根据本发明可以准确测量糖化血红蛋白的量，所以提高了糖化血红蛋白作为指示剂的可靠性。因此，本发明在临床医学等领域是有利的。
在根据本发明的测量方法中，当分析物是糖化蛋白时，优选通过用果糖基氨基酸氧化酶(下文中称作“FAOD”)氧化降解其糖化位，从而形成过氧化氢。另外，当分析物是糖化肽或糖化氨基酸时，优选糖化肽或糖化氨基酸时相似地受到FAOD的作用。由此形成的过氧化氢对应于上述源自分析物的氧化性物质。另外，需要时，优选在FAOD处理前，用蛋白酶处理糖化蛋白和氧化肽。
优选使用能够催化由下式表示的反应的FAOD作为FAOD。
在式(1)中，R1表示羟基或者源于糖化前糖的残基(即糖残基)。糖残基(R1)在糖化前糖是醛糖时为醛糖残基，并且当糖化前糖是酮糖时为酮糖残基。例如，当糖化前糖是葡萄糖时，它在糖化后通过Amadori重排采取果糖结构。在此情况下，糖残基(R1)成为葡萄糖残基(一种醛糖残基)。例如，该糖残基(R1)可以如下表示：
-[CH(OH)]n-CH2OH
式中，n是0至6的整数。
在式(1)中，R2没有特别限制。但是，例如当底物是糖化氨基酸、糖化肽或者糖化蛋白质时，α-氨基被糖化的情况与α-氨基以外的氨基被糖化的情况是不同的。
在式(1)中，当α-氨基被糖化时，R2是氨基酸残基，或者由下式(2)表示的肽残基。
-CHR3-CO-R4 (2)
式(2)中，R3表示氨基酸侧链基团。R4表示羟基、氨基酸残基，或者肽残基，并且例如可以由下式(3)表示。在式(3)中，n是0或者更大的整数，并且R3表示与上述相同的氨基酸侧链基团。
-(NH-CHR3-CO)n-OH (3)
在式(1)中，当α-氨基以外的氨基被糖化(即氨基酸侧链基团被糖化)时，R2可以由下面的式(4)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7 (4)
式(4)中，R5表示氨基酸侧链基团中除糖化氨基以外的部分。例如，当糖化氨基酸是赖氨酸时，R5如下。
-CH2-CH2-CH2-CH2-
对于另一个实例，当糖化氨基酸是精氨酸时，R5如下。
-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-
式(4)中，R6表示氢、氨基酸残基，或者肽残基，并且例如可以由下面的式(5)表示。在式(5)中，n是0或者更大的整数，并且R3表示与上述相同的氨基酸侧链基团。
-(CO-CHR3-NH)n-H (5)
式(4)中，R7表示羟基、氨基酸残基，或者肽残基，并且例如可以由下面的式(6)表示。在式(6)中，n是0或者更大的整数，并且R3表示与上述相同的氨基酸侧链基团。
-(NH-CHR3-CO)n-OH (6)
作为FAOD，例如可以使用对具有糖化α-氨基的糖化氨基酸特异的名为果糖基氨基酸氧化酶(FAOX-E)的商购产品(由Kikkoman公司生产)、对具有糖化α-氨基的糖化氨基酸和具有糖化∈-氨基的诸如赖氨酸的糖化氨基酸特异的名为FOD(由Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产)和KAO(由Genzyme Japan K.K.生产)的商购产品等。
附图说明
图1是表示在根据本发明的测量方法一个实例中吸光度随时间的变化图。
具体实施方式
例如，本发明以下面的方式阻止了DA-64的错误显色。
首先，在含水溶剂中溶解表面活性剂，然后将四唑鎓化合物、叠氮化钠和DA-64与所得的溶液混合。四唑鎓化合物、叠氮化钠和DA-64按照每微摩尔DA-64存在0.01至1毫摩尔的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩尔的叠氮化钠和0.006至0.4毫摩尔表面活性剂的量来混合，并且调节所述混合物的pH值在6至9的范围内。
优选每微摩尔DA-64存在0.02至0.8毫摩尔的四唑鎓化合物、0.01至0.3毫摩尔的叠氮化钠和0.01至0.4毫摩尔的表面活性剂。特别优选每微摩尔DA-64存在0.03至0.6毫摩尔的四唑鎓化合物、0.01至0.2毫摩尔的叠氮化钠和0.04至0.3毫摩尔的表面活性剂。此外，优选所述混合物的pH值在6至9的范围内，更优选从6.5至8。
如上所述，只要在混合剩下的三种组分：四唑鎓化合物、叠氮化钠和DA-64时，表面活性剂落在上述浓度范围内，则添加各组分的顺序没有特别限制。
含水溶剂的种类没有特别限制，并且例如可以使用水、各种缓冲液等。缓冲液的实例包括Tris-HCl、磷酸钠、EPPS、HEPES和TES缓冲液。其中，Tris-HCl和磷酸钠缓冲液是优选的。此外，例如缓冲液的浓度在从10至300毫摩尔，优选从50至300毫摩尔的范围内。
表面活性剂没有特别限制，并且例如可以是聚氧乙烯烷基醚，例如Brii 35、Brij 58；及聚氧乙烯月桂基醚；聚氧乙烯烷苯基醚，例如Triton X-100和Triton X-114；聚氧乙烯脱水山梨糖醇醚，例如Tween20和Tween 60等。
例如，四唑鎓化合物优选至少在四唑环的两个位置上，更优选在四唑环的三个位置上具有带环结构的取代基(环取代基)。
在如上所述四唑鎓化合物至少在四唑环的两个位置上具有环取代基的情况中，优选环取代基在四唑环的2位和3位。此外，在四唑鎓化合物在四唑环的三个位置上具有环取代基的情况中，优选环取代基在四唑环的2位、3位和5位。
此外，优选四唑鎓化合物至少两个环取代基具有苯环结构。除了苯环结构以外，例如在环骨架中包含S或O时，环取代基可以具有共振结构。具有这种共振结构的环取代基的实例包括噻吩基、噻唑基等。
此外，优选四唑鎓化合物至少在四唑环的三个位置上具有环取代基，并且至少两个环取代基具有苯环结构。
另外，优选至少一个环取代基具有官能团，并且更多的官能团是更优选的。官能团优选的实例包括吸电子官能团，例如卤素基团、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基(nitroso group)、硝基、羟基和磺基。除这些官能团以外的实例包括含有氧的特征基团，例如氢过氧基、氧基、环氧基、环二氧基和桥氧基；以及含有硫的特征基团，例如巯基、烷硫基、甲基硫甲基、硫代基团、亚磺基、苯磺酰基(benzenesulfonyl)、苯磺酰基(phenylsulfonyl)、对甲苯磺酰基(p-toluenesulfonyl)、对甲苯磺酰基(p-tolylsulfonyl)、甲苯磺酰基(tosyl)、氨磺酰基和异硫氰酸酯基。其中，吸电子官能团、硝基、磺基、卤素基团、羧基、羟基、甲氧基、乙氧基是优选的。除上述吸电子官能团以外的实例包括不饱和的烃基，例如苯基(C6H5-)和苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)。应当指出所述官能团可以被离解离子化。
此外，优选四唑鎓化合物在四唑环的2位和3位上具有苯环并且至少一个苯环具有至少一种选自卤素基团、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基、乙氧基中的官能基团。应当指出此处两个苯环都可以具有这种官能团。此外，官能团可以在位于每个苯环的任意位置上(邻、间、对位)。此外，官能团的数量没有特别限制，并且苯环可以具有相同或者不同的官能团。
在四唑环的2位、3位和5位上具有苯环结构的环取代基的四唑鎓化合物的实例包括：
2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐；
2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐；
2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐；
2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐；
3，3′-(1，1′-二苯基-4，4′-二基)-双(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓盐；
3，3′-[3，3′-二甲氧基-(1，1′-二苯基)-4，4′-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐]；
2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓盐；
2，5-二苯基-3-(对-联苯基)四唑鎓盐；
2，3-二苯基-5-(对-联苯基)四唑鎓盐；
2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯苯基)四唑鎓盐；
2，5-二苯基-3-(间-甲苯基)四唑鎓盐；及
2，5-二苯基-3-(对-甲苯基)四唑鎓盐。
四唑鎓化合物没有局限于上述化合物。除了上述四唑鎓化合物外，也可以使用在四唑环两个位置具有带苯环结构的环取代基并且一个环取代基具有除苯环结构以外的结构的四唑鎓化合物。
这些四唑鎓化合物的实例包括：
2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓盐；
2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓盐；
2，2′-二苯并噻唑基-5，5′-双[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)二四唑鎓盐；及
3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5二苯基-2H-四唑鎓盐。
此外，可以使用在四唑环两个位置具有带苯环结构的环取代基并且在一个位置上一个取代基不具有环结构的四唑鎓化合物。这些四唑鎓化合物的实例包括：
2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐；
2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐；
2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐；及
2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐。
在上述四唑鎓化合物中，优选是上述具有三个环取代基的化合物，并且更优选是具有三个带苯环结构并且具有许多吸电子官能团的环取代基的化合物。特别优选是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。应当指出上述四唑鎓化合物例如可以是盐或者可以是离子化的。另外，四唑鎓化合物可以单独使用或者两种或多种组合使用。
可以使用制备来防止DA-64错误显色的溶液作为DA-64试剂溶液。DA-64试剂溶液的应用没有特别限制。例如，它可以在例如后面所述的氧化还原反应中用作显色底物的试剂溶液。
下文中，参照下面的实施例详细地描述使用根据本发明的氧化还原反应的测量方法，其中测量血细胞中的糖化蛋白质。
首先，全血自身被溶血，或者按照例如离心的常用方法从全血中分离出血细胞部分，然后溶血，从而制备出溶血样品。引起溶血的方法没有特别限制，并且例如可以是使用表面活性剂的方法、使用超声波的方法和使用渗透压差异的方法。其中，因其操作简单等，使用表面活性剂的方法是优选的。
例如，可以使用诸如聚氧乙烯-对-叔辛苯基醚(例如Triton系列表面活性剂)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基酯(例如Tween系列表面活性剂)、聚氧乙烯烷基醚(例如Brij系列表面活性剂)等。具体的实例是Triton X-100，Tween-20，Brij 35等。使用表面活性剂的处理条件通常如下：当待处理溶液中血细胞浓度在从1至10体积％的范围时，加入表面活性剂，使其在溶液中的浓度落在从0.01至5重量％的范围内，并且在室温下搅拌约几秒种(约5秒种)至10分钟。
接着，向溶血的样品中加入表面活性剂。在通过使用上述表面活性剂引起溶血的方法来制备溶血样品的情况中，如果样品中的表面活性剂浓度已经在下面的范围内，则不需要再加入表面活性剂。另一方面，如果表面活性剂的浓度没有达到下面的范围，则可以加入表面活性剂，补偿不足量。
加入表面活性剂，使其在后面所述的氧化还原反应的反应溶液中的最终浓度落在从0.006至80毫摩尔/升，优选从0.05至40毫摩尔/升，并且特别优选从0.2至20毫摩尔/升的范围内。此外，在已经添加了表面活性剂的溶血样品中，表面活性剂的浓度例如在从0.1至200毫摩尔/升，优选从0.5至100毫摩尔/升，并且特别优选从2至100毫摩尔/升的范围内。
随后，再向包含表面活性剂的溶血样品中加入四唑鎓化合物和叠氮化钠。
加入四唑鎓化合物和叠氮化钠，使它们在氧化还原反应的反应溶液中的最终浓度落在下面的范围内：四唑鎓化合物在从0.01至40毫摩尔/升的范围内并且叠氮化钠在从0.015至20毫摩尔/升的范围内；优选四唑鎓化合物在从0.1至32毫摩尔/升的范围内并且叠氮化钠在从0.05至12毫摩尔/升的范围内；并且特别优选四唑鎓化合物在从0.15至24毫摩尔/升的范围内并且叠氮化钠在从0.05至8毫摩尔/升的范围内。
此外，加入四唑鎓化合物(A)和叠氮化钠(B)，使它们的比例(摩尔比A∶B)例如处于从10∶1至1∶1，优选从6∶1至1.5∶1，并且更优选从4∶1至2∶1的范围内。
具体地说，当待处理溶液中的血细胞浓度在1至10体积％的范围内时，例如优选加入四唑鎓化合物，使其在溶液的浓度落在从0.02至2000毫摩尔/升，更优选从0.1至1000毫摩尔/升，并且特别优选从0.4至200毫摩尔/升的范围内。另一方面，当待处理溶液中的血细胞浓度在1至10体积％的范围内时，例如优选加入叠氮化钠，使其在溶液的浓度落在从0.006至800毫摩尔/升，更优选从0.04至400毫摩尔/升，并且特别优选从0.1至80毫摩尔/升的范围内。
可以简单按原样向溶血样品中加入四唑鎓化合物和叠氮化钠。但是，就操作简单性等而言，优选使用通过在溶剂中溶解四唑鎓化合物获得的四唑鎓化合物溶液和在溶剂中溶解叠氮化钠获得的叠氮化钠溶液，或者使用包含四唑鎓化合物和叠氮化钠的液态混合物(即四唑鎓化合物-叠氮化钠液态混合物)。
例如，可以使用MOPS、CHES、Tris-HCl、磷酸钠、磷酸钾、HEPES、TES缓冲液等作为上述溶液的溶剂。
另外，所制备的四唑鎓化合物-叠氮化钠液态混合物优选在加入溶血样品之前先旋转一段时间来老化，因为这会更进一步提高灵敏度。根据所述老化处理，例如灵敏度变成高于不实行老化处理情况的约1.2至3倍。
在老化处理中，处理温度优选在4℃至80℃，更优选在25℃至75℃，并且特别优选在40℃至70℃的范围内，而且例如处理时间在10分钟至200小时，更优选在1至180小时，并且特别优选在3至100小时的范围内。
在简单按原样或者按上述溶液向溶血样品中加入四唑鎓化合物和叠氮化钠后，通常通过在10℃至40℃下培养样品1至10分钟，实施溶血样品的预处理。通过用四唑鎓化合物预处理样品，可以消除样品中所含的还原物质等对氧化还原反应的影响，从而提高测量准确度。如上所述，四唑鎓化合物通过消除还原物质的影响而有助于提高测量的准确度。另外，当四唑鎓化合物与叠氮化钠一起存在时，也可以提高测量灵敏度。
接着，用蛋白酶处理包含四唑鎓化合物和叠氮化钠的经预处理溶血样品。实施所述蛋白酶处理，使随后处理中使用的FAOD能够更容易对分析物作用。
蛋白酶的类型没有特别限制，并且例如可以使用丝氨酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、金属蛋白酶等。具体地说，蛋白酶K、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、氨肽酶等是优选的。在要降解的糖化蛋白质是糖化血红蛋白时，蛋白酶是选择性降解糖化血红蛋白的酶，并且菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、源自猪胰腺的胰蛋白酶、金属蛋白酶和源自枯草杆菌(Bacillus subtilis)的蛋白酶等是优选的。源自枯草杆菌的蛋白酶包括名为Protease N的产品(如FlukaChemie AG)和名为Protease N“AMANO”的产品(Amano EnzymeInc.)。金属蛋白酶的实例包括源于杆菌属的金属蛋白酶(EC 3.4.24.4)。其中，金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶是更优选的，并且金属蛋白酶是特别优选的。因此，通过使用选择性降解蛋白质的蛋白酶可以选择性地制备特定蛋白质的降解产物。蛋白酶处理通常在缓冲液中进行，并且处理条件根据所用蛋白酶的类型、分析物糖化蛋白质的类型和浓度等来适当地确定。
例如，作为缓冲液，可以使用CHES、CAPSO、CAPS、磷酸盐、Tris、EPPS、HEPES缓冲液等。缓冲液的pH例如在6至13，优选在7至10的范围内。另外，接受蛋白酶处理的溶液中缓冲液的最终浓度例如在1至200毫摩尔/升的范围内。
具体地说，当使用金属蛋白酶作为蛋白酶处理预处理的溶血样品时，通常在如下条件中进行蛋白酶处理：反应溶液中金属蛋白酶的浓度在2至20,000 KU/l的范围内；反应溶液中血细胞浓度在0.05至15体积％的范围内；反应温度在15℃至37℃的范围内；反应时间在1分钟至24小时的范围内；并且pH在6至12的范围内。
此外，当使用蛋白酶K作为蛋白酶来处理预处理的溶血样品时，通常在如下条件中进行蛋白酶处理：反应溶液中金属蛋白酶的浓度在2至10,000 KU/l的范围内；反应溶液中血细胞浓度在0.05至15体积％的范围内；反应温度在15℃至37℃的范围内；反应时间在1分钟至24小时的范围内；并且pH在6至12的范围内。另外，缓冲液的类型没有特别限制，并且例如可以使用可以Tris-HCl、EPPS、PIPES缓冲液等。
接下来，用FAOD处理通过蛋白酶处理获得的降解产物。通过所述FAOD处理催化了上面式(1)表示的反应。
与上述蛋白酶处理相似，所述FAOD处理优选在缓冲液中进行。FAOD处理的条件根据所用FAOD的类型、作为分析物的糖化蛋白质的类型和浓度等来适当地确定。
具体例如，在如下条件下实施FAOD处理：反应溶液中FAOD的浓度在50至50,000 U/l的范围内；反应溶液中血细胞浓度在0.01至1体积％的范围内；反应温度在15℃至37℃的范围内；反应时间在1至60分钟的范围内；并且pH在6至9的范围内。另外，缓冲液的类型没有特别限制，并且在FAOD处理中也可以使用与蛋白酶处理中相同的缓冲液。
接下来，使用POD和DA-64通过氧化还原反应测量FAOD处理形成的过氧化氢。
可以加入DA-64作为显色底物，使其在氧化还原反应的反应溶液中最终浓度落在从0.001至20毫摩尔/升，优选从0.005至2毫摩尔/升，并且特别优选从0.01至0.5毫摩尔/升的范围内。
DA-64(C)和已经加入的表面活性剂(D)、四唑鎓化合物(E)和叠氮化钠(E)之间的比例(摩尔比C∶D∶E∶F)例如在1∶6∶10∶3至1∶2000∶1000∶500，优选从1∶10∶20∶10至1∶1000∶800∶300，并且更优选从1∶40∶30∶10至1∶500∶600∶200的范围内。
该反应溶液的pH在从6至9，优选从6至8的范围内。
氧化还原反应通常在缓冲液中进行。反应的条件根据所形成的过氧化氢等的浓度来适当地确定。具体例如，所述条件如下：反应溶液中的POD浓度在10至100,000 IU/l的范围内；显色底物的浓度在从0.001至20毫摩尔/升的范围内；反应温度在15℃至37℃的范围内；反应时间在0.1至30分钟的范围内；并且pH在6至8的范围内。另外，缓冲液的类型没有特别限制，并且例如可以使用与蛋白酶处理和FAOD处理中相同的缓冲液。
DA-64通过氧化还原反应显色。因此，通过用分光光度计在例如从650至760纳米范围内的波长下测量反应溶液的吸光度(即显色的程度)，可以确定过氧化氢的量。然后，使用由此确定的过氧化氢的量和先前绘制的表示过氧化氢量和糖化蛋白质量之间关系的校准曲线，可以确定样品中的糖化蛋白质的量。
因此，通过添加表面活性剂以及四唑鎓化合物和叠氮化钠，并且设置这种组分的比例在上述范围内，可以防止DA-64的错误显色。结果，可以抑制背景的增加，从而实现高的测量准确度。
此外，如上所述，只要使用氧化还原反应，分析物没有特别限制。除了糖化蛋白质以外的分析物的实例包括糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、胆固醇、尿酸、肌酸酐、肌氨酸和甘油。当测量上述每种分析物实例的量时，例如通过形成源于分析物的氧化性物质，并且按照上述相同的方式使用氧化还原反应测量氧化性物质的量，从而实施测量。
例如，通过形成过氧化氢作为源于分析物的氧化性物质来实施测量时，例如可分别通过葡萄糖氧化酶对葡萄糖；胆固醇氧化酶对胆固醇；尿酸酶对尿酸；肌氨酸氧化酶对肌酸酐；或者甘油氧化酶对甘油的作用来形成过氧化氢。以与上述相同的方式测量过氧化氢的量。另外，例如以与上述糖化蛋白质的测量相同的方式来测量糖化肽和糖化氨基酸。
实施例
(处理溶液A)
A-1：包含7克/升(12毫摩尔/升)的聚氧乙烯(9)月桂醚(PEGLE)的40毫摩尔/升CHES缓冲液(pH9.5)
A-2：包含50克/升(85毫摩尔/升)PEGLE的40毫摩尔/升CHES缓冲液(pH9.5)
(处理溶液B)
制备包含5毫摩尔/升2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐(产品名WST-3，由Dojindo Laboratories生产)和1.5毫摩尔/升叠氮化钠的混合物，并且在50℃下培养24小时。然后，3毫升这种溶液、1毫升金属蛋白酶(ARKRAY，Inc.，10,000 KU/l)、1毫升MES缓冲液(50毫摩尔/升，pH5.5)、NaCl溶液(500毫摩尔/升)，以及3毫升纯化水被彼此混合。使用所得混合物作为处理溶液B。
(处理溶液C)
C-1：DA-64 80微摩尔/升
Tris缓冲液(pH7.0) 300毫摩尔/升
FAOD(ARKRAY，INC.) 30 KU/l
POD 100 KU/l
C-2：DA-64 1000微摩尔/升
Tris缓冲液(pH7.0) 300毫摩尔/升
FAOD(ARKRAY，INC.) 30 KU/l
POD 100 KU/l
(程序)
离心血液(3000rpm)，并且收集血细胞。然后，10微升血细胞分别与300微升的处理溶液A(A-1和A-2)混合，制备溶血样品。然后，向10微升这些溶血样品中加入100微升的处理溶液B，并且所得混合物在37℃培养5分钟。随后，分别向每种混合物中加入22微升的处理溶液C(C-1和C-2)，并且在37℃下培养所得混合物。使用名为JCA-BM 8(由Japan Electron Optics Laboratory Co.Ltd.生产)的自动分析仪测量这些反应溶液的吸光度(在751纳米的波长下)。溶血样品与处理试剂B混合的瞬间被视为0秒，并且加入处理溶液C的瞬间为300秒。为了测量在完成FAOD和POD之间的反应之后，继续发生的错误显色，确定486秒和603秒间吸光度变化的量。下面的表1表示了反应溶液中各种组分的最终浓度和相对于1微摩尔DA-64各组分的量。此外，图1和和下面的2表示了吸光度变化量的测定结果。图1是表示反应溶液吸光度随时间变化的图。
表1
| 实施例1 | 比较例1 | 比较例2 | 比较例3 | |
| 处理溶液A | A-1 | A-2 | A-1 | A-2 |
| 处理溶液B | B | B | B | B |
| 处理溶液C | C-1 | C-1 | C-2 | C-2 |
| 反应期间最终浓度 | ||||
| PEGLE(毫摩尔/升) | 0.909 | 6.44 | 0.909 | 6.44 |
| WST-3(毫摩尔/升) | 1.136 | 1.136 | 1.136 | 1.136 |
| NaN3(毫摩尔/升) | 0.341 | 0.341 | 0.341 | 0.341 |
| DA-64(微摩尔/升) | 13.3 | 13.3 | 166.7 | 166.7 |
| 各组分量 | ||||
| PEGLE(毫摩尔/升) | 0.068 | 0.483 | 0.005 | 0.039 |
| WST-3(毫摩尔/升) | 0.085 | 0.085 | 0.0068 | 0.0068 |
| NaN3(毫摩尔/升) | 0.026 | 0.026 | 0.0020 | 0.0020 |
| DA-64(微摩尔/升) | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
表2
| 实施例1 | 比较例1 | 比较例2 | 比较例3 | |
| 吸光度变化量 | 0.0049 | 0.0091 | 0.0087 | 0.0099 |
如上面表所示，在比较例1中，PEGLE的量(＞0.4毫摩尔)相对于1微摩尔DA-64太大。在比较例2中，PEGLE(＜0.006毫摩尔)、WST-3(＜0.01毫摩尔)和NaN3(＜0.003毫摩尔)的量相对于1微摩尔DA-64太小，并且在比较例3中，WST-3(＜0.01毫摩尔)和NaN3(＜0.003毫摩尔)的量相对于1微摩尔DA-64太小。因此，比较例1至3由于错误显色表现出高的吸光度，如图1所示，因此吸光度的变化量是很大的，如表2所示。相反，在实施例1中，因为防止了错误显色，吸光度是低的，如图1所示，因此吸光度的变化量减小。这些结果表明本发明的方法可以防止DA-64的错误显色，从而提高了测量准确度。
工业应用性
如上面具体所述，根据本发明可以防止作为显色底物的DA-64的错误显色。因此，通过将防止错误显色的方法运用于使用氧化还原反应的测量中，可以抑制由于错误显色引起的背景增加，从而提高了测量准确度。另外，通过将这种测量方法运用于例如红细胞中HbAlc的测量中，可以实现比传统方法更高准确度的测量，这进一步增加了HbAlc作为指示剂在糖尿病诊断等中的重要性。
Claims (17)
1、一种在包含四唑鎓化合物和叠氮化钠的含水溶剂中防止N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐错误显色的方法，其包括：
在表面活性剂存在下，在含水溶剂中混合四唑鎓化合物、叠氮化钠和N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐，
其中每微摩尔N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐存在0.01至1毫摩尔的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩尔的叠氮化钠和0.006至0.4毫摩尔的表面活性剂，并且包含四唑鎓化合物、叠氮化钠、N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐和表面活性剂的含水溶剂的pH值在6至9的范围内。
2、根据权利要求1的方法，其中每微摩尔N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐存在0.02至0.8毫摩尔的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩尔的叠氮化钠和0.01至0.4毫摩尔的表面活性剂。
3、根据权利要求1的方法，其中所述四唑鎓化合物是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。
4、根据权利要求1的方法，其中在将表面活性剂加入到含水溶剂中后，将四唑鎓化合物、叠氮化钠和N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐加入含水溶剂中。
5、根据权利要求1的方法，其中在四唑鎓化合物和叠氮化钠加入到含水溶剂中后，N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐在表面活性剂存在下加入到所述含水溶剂中。
6、一种N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐试剂溶液，其包含：
N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐；
四唑鎓化合物；
叠氮化钠；
表面活性剂，
其中每微摩尔N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐存在0.01至1毫摩尔的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩尔的叠氮化钠和0.006至0.4毫摩尔的表面活性剂，并且该试剂溶液的pH值在6至9的范围内。
7、根据权利要求6的试剂溶液，其中所述四唑鎓化合物是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。
8、一种测量样品中源于分析物的氧化性物质的方法，其包括：
在源于分析物的氧化性物质与作为显色底物的N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐之间引起反应，所述反应在四唑鎓化合物和叠氮化钠存在下通过氧化还原酶来引发；及
通过测量底物显示的颜色来确定氧化性物质的量；
其中，在表面活性剂的存在下于含水溶剂中混合四唑鎓化合物、叠氮化钠和显色底物，使得每微摩尔作为底物的N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐存在0.01至1毫摩尔的四唑鎓化合物、0.003至0.5毫摩尔的叠氮化钠和0.006至0.4毫摩尔的表面活性剂，并且所得混合物的pH值在6至9的范围内。
9、根据权利要求8的方法，其中所述含水溶剂是包含分析物的样品溶液。
10、根据权利要求9的方法，其中将所述四唑鎓化合物和叠氮化钠加入到所述样品溶液中，然后，在表面活性剂的存在下进一步加入N-(羧甲基氨羰基)-4，4′-双(二甲氨基)二苯胺钠盐和氧化还原酶，通过氧化还原酶引起反应。
11、根据权利要求10的方法，其中在通过氧化还原酶引起反应之前用蛋白酶处理所述分析物。
12、根据权利要求11的方法，其中所述氧化还原酶对使用蛋白酶处理获得的分析物的降解产物起作用。
13、根据权利要求8的方法，其中所述氧化还原酶是果糖基氨基酸氧化酶。
14、根据权利要求8的方法，其中所述源于分析物的氧化性物质是过氧化氢。
15、根据权利要求8的方法，其中所述分析物是糖化蛋白质。
16、根据权利要求15的方法，其中所述分析物是糖化血红蛋白。
17、根据权利要求8的方法，其中所述四唑鎓化合物是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。
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