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CN111751544B - 一种用于检测可溶性生长激素表达基因2蛋白的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测可溶性生长激素表达基因2蛋白的试剂盒 Download PDF

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CN111751544B CN201910241518.7A CN201910241518A CN111751544B CN 111751544 B CN111751544 B CN 111751544B CN 201910241518 A CN201910241518 A CN 201910241518A CN 111751544 B CN111751544 B CN 111751544B
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Abstract

本公开涉及一种用于检测可溶性生长激素表达基因2蛋白的试剂盒。具体而言，本公开涉及一种检测人样本中sST2浓度和/或含量的胶乳增强免疫浊度检测试剂盒。该试剂盒可以应用于透射光免疫比浊法和散射光免疫比浊法。试剂盒中包含缓冲体系、抗干扰组分、胶乳微球、抗sST2抗体等。本公开的胶乳增强免疫比浊试剂可以检测样本中<400ng/ml范围内的sST2蛋白，灵敏度可达0.1ng/ml，特异性高，准确性，精密度高。能够适用于全自动生化分析仪和散射分析仪，使用方便快捷，成本低，可以应用于临床sST2蛋白的检测。

Description

一种用于检测可溶性生长激素表达基因2蛋白的试剂盒
技术领域
本公开涉及一种用于检测人血液中可溶性生长激素表达基因2及其蛋白产物(sST2)试剂盒。具体而言，本公开涉及一种检测sST2浓度或含量的胶乳增强免疫浊度检测试剂盒。该试剂盒可以应用于透射光免疫比浊法和散射光免疫比浊法。
背景技术
Tominaga描述了通过在BALB/c-3T3细胞中的生长刺激特异性表达的鼠基因的分离；他们将这些基因之一称作“St2”(代表生长刺激表达基因2)。St2基因编码两种蛋白质产物：ST2，其是可溶性分泌形式；和ST2L，一种与白介素-1受体非常相似的跨膜受体形式。HUGO命名委员会将人同源称为白介素1受体样1(IL1R-L1)。
ST2是白介素-1受体家族成员，具有跨膜(ST2L)和可溶性(sST2)两种存在方式。作为Th(辅助性T细胞，helper T cell)，能分泌多种细胞因子。Th均表达CD4，通常所称的CD4+T细胞即指Th。艾滋病病毒能特异性地破坏Th细胞，导致患者免疫系统瘫痪。ST2L具有免疫调节功能，在T细胞介导的免疫性疾病如哮喘和类风湿性关节炎中发挥重要作用。
使用ST2L封闭性抗体或sST2会阻断ST2L与配体结合从而下调Th2(Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，主要功能为刺激B细胞增殖并产生免疫球蛋白G1和免疫球蛋白E抗体，与体液免疫有关)。淋巴细胞功能提示sST2具有抑制炎症反应的作用。
发明内容
根据本申请的一些实施方案，提供了一种可溶性生长激素表达基因2蛋白的检测试剂盒，其包含：-第一试剂、
-第二试剂、
-任选地，校准品、
-任选地，质控品。
在一些实施方案中，第一试剂包含：
10mmol/L至500mmol/L缓冲剂，pH范围为5.0至8.0、
10mmol/L至700mmol/L离散剂、
按w/v计0.05％至5％促凝剂、
抗干扰组合物、和
任选地，按w/v计0.05％至0.5％防腐剂。
在一些实施方案中，第二试剂包含：
10mmol/L至500mmol/L缓冲剂、
按w/v计0.05％至0.25％胶乳微球、和
抗sST2抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲剂选自以下的一种或组合：HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、PBS缓冲液、MOPS缓冲液、硼酸缓冲液。
在具体的实施方案中，第二试剂的缓冲剂为硼酸缓冲液，pH9.0。
在一些实施方案中，离散剂选自以下的一种或组合：盐离子、硫氰酸盐、有机分散剂、表面活性剂。
在一些实施方案中，促凝剂选自以下的一种或组合：聚乙二醇、甲基丙烯酰氧基磷脂胆碱、聚醚二胺。
在一些实施方案中，防腐剂选自以下的一种或组合：叠氮化物、PC防腐剂。
在一些实施方案中，所述胶乳微球的表面官能团选自以下的一种：羧基、巯基、氯甲基、或无表面官能团。
在一些实施方案中，所述胶乳微球的平均粒径为300nm至600nm，优选350nm至450nm。
在一些实施方案中，所述抗sST2抗体选自以下的一种或组合：非亲和性IgG抗体、亲和性IgG抗体、IgY抗体。
在一些实施方案中，抗sST2抗体源自鼠、兔、羊、禽。
在一些实施方案中，抗sST2抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在具体的实施方案中，所述抗原结合片段选自：Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv或scFv。
在一些实施方案中，所述抗sST2抗体或其抗原结合片段共价结合至所述胶乳微球的表面。
在一些实施方案中，所述的抗干扰组合物包含：按w/v计0.1％至10％表面活性剂、和0.5KU/L至10KU/L脂质消化酶。
在一些实施方案中，所述表面活性剂选自以下的一种或组合：Triton X、Tween、AEO、Thesit、Brij、NP。
在一些实施方案中，所述脂质消化酶选自以下的一种或组合：脂肪酶、甘油三酯氧化酶。
在一些实施方案中，胶乳微球表面的封闭剂选自以下的一种或组合：聚乙二醇、聚乙二醇多胺、牛血清白蛋白、葡聚糖凝胶、酪蛋白。
在一些实施方案中，第一试剂还包含阻断剂；所述阻断剂选自以下的一种或组合：小鼠血清、鼠IgG、鼠IgM、羊IgG、羊IgM；所述阻断剂的浓度为按w/v计0.1％至5％。
在一些实施方案中，校准品包含已知浓度的sST2。在具体的实施方案中，校准品包含25g/mL、50g/mL、100g/mL、200g/mL、或400ng/mLsST2蛋白。
在一些实施方案中，质控品包含已知浓度的sST2。在具体的实施方案中，所述质控品包含：30g/mL或100ng/mL sST2蛋白。
在一些实施方案中，所述质控品或校准品包含选自以下的缓冲剂：磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、PIPES缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲剂浓度为5mmol/至250mmol/L；pH为4.0-8.0。所述质控品或校准品还包含按w/v计1.0％至10％的保护剂(例如选自：牛血清白蛋白、糖、醇)。所述质控品或校准品还包含按w/v计0.05％至1.5％的防腐剂(例如选自：叠氮钠、PC、二硫苏糖醇)。
在具体的实施方案中，提供一种可溶性生长激素表达基因2蛋白的检测试剂盒，包含：
第一试剂，包含200mmol/L氯化钠、1％表面活性剂、0.1％叠氮钠、100mmol/lHPEPS缓冲液，pH8.0；
第二试剂，包含按w/v计0.1％的400nm胶乳微球、30μg/ml抗sST2单克隆抗体。
在另一具体的实施方案中，提供一种可溶性生长激素表达基因2蛋白的检测试剂盒，包含：
第一试剂，包含150mmol/L氯化钠、1％表面活性剂、0.1％叠氮钠、5KU/L脂肪酶、0.5％甲基丙烯酰氧基磷脂胆碱、100mmol/l Tris缓冲液，pH7.4；
第二试剂包含：按w/v计0.15％的400nm胶乳微球、20μg/ml sST2抗体Fab片段、100mmol/L甘氨酸缓冲液pH8.0、0.1％NaCl、0.5％甲基丙烯酰氧基磷脂胆碱、0.1％NaN3。
在另一具体的实施方案中，提供一种可溶性生长激素表达基因2蛋白的检测试剂盒，包含：
第一试剂，包含1％表面活性剂、0.1％叠氮钠、5KU/L脂肪酶、2％胆酸钠、5mmol/lCaCl2、2.0％甲基丙烯酰氧基磷脂胆碱、3％阻断剂HBR-8TM、200mmol/l Tris缓冲液，pH7.4；
第二试剂，包含按w/v计0.15％的400nm胶乳微球、20μg/ml sST2抗体Fab片段、100mmol/L甘氨酸缓冲液pH8.0、0.1％NaCl、0.5％甲基丙烯酰氧基磷脂胆碱、0.1％NaN3。
上述试剂盒任选包含校准品和/或质控品，其包含sST2、100mmol/L磷酸缓冲液pH5.5、150mmol/L NaCl、5％BSA、10％山梨醇、0.1％NaN3。
根据本申请的实施方案，还提供一种抗干扰组合物，其包含按w/v计0.1％至10％表面活性剂和0.5KU/L至10KU/L脂质消化酶。所述表面活性剂选自以下的一种或组合：Triton X、Tween、AEO、Thesit、Brij、NP。所述脂质消化酶选自以下的一种或组合：脂肪酶、甘油三酯氧化酶。
根据本申请的实施方案，还提供抗干扰组合物在制备免疫比浊试剂盒中的用途。
根据本申请的实施方案，还提供一种试剂，其包含本申请的抗干扰组合物。
根据本申请的实施方案，还提供一种将多肽固定至胶乳微球的改进方法，包括步骤：
1)提供多肽，优选在缓冲剂中提供；
2)提供胶乳微球，优选在缓冲剂中提供；
3)将所述多肽和所述胶乳微球在10℃至35℃(优选20℃至25℃)混合(优选震荡混合)6至10小时(优选7至9小时)得到第一混合物；
4)提供交联剂，优选碳二亚胺；
5)将所述交联剂和所述第一混合物在30℃至60℃(优选45℃至55℃)接触2至5小时(优选2至4小时)，得到交联有多肽的胶乳微球。
在本申请上下文中，步骤1)和步骤2)可互换顺序。
在本申请上下文中，所述步骤4)分别和步骤1)、2)、3)可互换顺序。
在一些实施方案中，所述多肽是带有氨基、羧基、羟基、或巯基的多肽；优选地，所述多肽选自：抗体、抗原结合片段、抗原、酶、重组蛋白。
在一些实施方案中，所述胶乳微球的表面官能团选自以下的一种：羧基、巯基、氯甲基、或无表面官能团。
在一些实施方案中，所述胶乳微球的平均粒径为300nm至600nm，优选350nm至450nm。
在一些实施方案中，步骤1)和步骤2)中所述缓冲剂选自以下的一种或组合：HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、PBS缓冲液、MOPS缓冲液、硼酸缓冲液；所述缓冲剂提供的pH为7.0-9.0。
在具体的实施方案中，步骤1)和步骤2)中所述缓冲剂为硼酸缓冲液，pH9.0；所述缓冲剂的浓度是10mmol/l至1000mmol/l。
在一些实施方案中，还包括封闭步骤：将所述交联有多肽的胶乳微球和封闭体系在15℃至28℃接触1小时至24小时；在一些实施方案中，所述封闭体系包含封闭剂、pH为5.0至8.0的缓冲剂、和表面活性剂。封闭剂选自以下的一种或组合：按w/v计0.1％至5.0％分子量为1000至5000的聚乙二醇、按w/v计0.1％至5.0％分子量为1000至5000的聚乙二醇多胺、按w/v计2.0％至10.0％牛血清白蛋白、按w/v计2.0％至10.0％葡聚糖凝胶、按w/v计2.0％至10.0％酪蛋白。在一些实施方案中，所述缓冲剂选自：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液。在一些实施方案中，所述表面活性剂选自以下的一种或组合：按w/v计2.0％至8.0％Triton X、按w/v计2.0％至8.0％Tween、按w/v计2.0％至8.0％AEO。
在一些实施方案中，封闭步骤后还任选包括选自以下的一个步骤或组合：清洗交联有多肽的胶乳微球、离心并收获交联有多肽的胶乳微球、包装交联有多肽的胶乳微球。
附图说明
图1：不同交联缓冲体系对交联后试剂吸光度的影响。
图2：不同交联温度对交联吸光度的影响。
图3：不同EDC活化温度对试剂吸光度的影响。
图4：不同抗体交联后对试剂吸光度的影响。
图5：不同封闭体系对试剂空白和灵敏度的影响。
图6：本公开试剂盒的线性结果。
图7：本公开试剂盒的前带结果。
图8：本公开试剂盒的灵敏度结果。
图9：本公开试剂盒的稳定性结果。
具体实施方式
实施例
实施例1.缓冲液种类和pH对试剂吸光度的影响
1.第一试剂：
200mmol/L氯化钠、
1％表面活性剂(Triton X 100)、
0.1％叠氮钠、
100mmol/l HPEPS缓冲液，pH8.0，
第一试剂为无色或淡黄色透明液体。
2.第二试剂：
制备方法：
(1)各取0.5mL粒径400nm胶乳微球，分别加入到4.5mL硼酸pH9.0、碳酸pH9.0、HEPES pH8.0、Tris pH8.0、PBS pH 7.0、HEPES pH 7.0的缓冲液中，得到胶乳微球悬液；
(2)各取1mg抗sST2单克隆抗体，分别加入到4.5mL硼酸pH9.0、碳酸pH9.0、HEPESpH8.0、Tris pH8.0、PBS pH 7.0、HEPES pH 7.0的缓冲液中，得到抗体溶液；
(3)将抗体溶液和胶乳微球悬液混合在20℃条件下，混合震荡8小时；
(4)用8mL去离子水溶解25mg碳化二亚胺，配制得到碳化二亚胺水溶液备用；
(5)将碳化二亚胺水溶液加入步骤(3)的混合液中，60℃下反应活化4h，得到交联的胶乳-抗体悬液；
(6)加入含有BSA的封闭液，室温(15至28℃)封闭过夜；
(7)将混合液，4℃离心，14000rpm，30分钟；
(8)弃掉上清液，加入50ml工作液(100mmol/L HEPES缓冲液pH8.0、0.1％NaCl、1％蔗糖、0.1％NaN3)；
(9)重悬待用。
3.校准品和质控品：
sST2重组抗原、
100mmol/L HEPES缓冲液pH 7.5、
100mmol/L NaCl、
0.1％NaN3。
4.检测：
检测工具：Beckman AU5800型全自动生化分析仪；
分析方法：FIXED；
波长：660nm；
样本量：10μL；R1：150μL；R2：50μL；
校准方式：SPLINE，6点定标；反应方向：上升。
根据图1显示，不同缓冲液种类，不同pH条件下，对试剂吸光度的影响不同。根据结果优选硼酸缓冲液，pH9.0为最优的交联环境。
实施例2.不同温度对试剂吸光度的影响
1.第一试剂：同实施例1。
2.第二试剂：
(1)各取0.5mL粒径400nm胶乳微球，分别加入到4.5mL硼酸pH9.0的缓冲液中，得到胶乳微球悬液；
(2)各取1mg抗sST2单克隆抗体，分别加入到4.5mL硼酸pH9.0的缓冲液中，得到抗体溶液；
(3)分别取2ml将抗体溶液和胶乳微球悬液在10、15、20、25、30、35℃条件下，混合震荡8小时；
(4)至(7)同实施例1。
(8)弃掉上清液，各加入10ml工作液(100mmol/L HEPES缓冲液pH8.0、0.1％NaCl、1％蔗糖、0.1％NaN3)；
(9)重悬待用。
3.校准品和质控品：
同实施例1。
4.检测：
根据图2显示，不同温度对试剂吸光度的影响不同。根据结果优选硼酸缓冲液，20-25℃为最优的交联环境。
实施例3.不同温度对胶乳官能团的活化效果
1.第一试剂：同实施例1。
2.第二试剂：
制备方法：
(1)同实施例2；
(2)同实施例2；
(3)将抗体溶液和胶乳微球悬液在25℃条件下，混合震荡8小时；
(4)同实施例1；
(5)将碳化二亚胺水溶液加入步骤(3)的混合液中，分别取2ml混合液，放置30、40、45、50、55、60℃下反应活化4h，得到交联完全的胶乳-抗体悬液；
(6)至(8)同实施例2；
(9)重悬待用。
3.校准品和质控品：同实施例1。
4.检测：
根据图3显示，不同温度的EDC对胶乳官能团(例如羧基)的活化效果不同，最终影响试剂吸光度的不同。根据结果优选硼酸缓冲液，45-55℃为最优的活化环境。
实施例4.Fab片段抗体的抗体亲和性
1.第一试剂：同实施例1。
2.第二试剂：
制备方法：
(1)同实施例2；
(2)各取1mg抗sST2单克隆抗体(IgG型和Fab片段)，分别加入到4.5ml硼酸pH9.0，缓冲液中，得到抗体溶液；
(3)同实施例3；
(4)同实施例1；
(5)将碳化二亚胺水溶液加入步骤(3)的混合液中，放置50℃下反应活化4h，得到交联完全的胶乳-抗体悬液；
(6)至(8)同实施例1；
(9)重悬待用。
3.校准品和质控品：同实施例。
4.检测：
根据图4显示，Fab片段抗体的抗体亲和性高，检测吸光度高。可以更高程度提高试剂检测灵敏度。
实施例5.胶乳的封闭优化
1.第一试剂：同实施例1。
2.第二试剂：
制备方法：
(1)同实施例2；
(2)各取1mg抗sST2Fab片段重组单克隆抗体，分别加入到4.5ml硼酸pH9.0缓冲液中，得到抗体溶液；
(3)同实施例3。
(4)同实施例1；
(5)同实施例4。
(6)各取2ml加入不同封闭液中，室温封闭过夜。封闭液的组成见表1。
表1.封闭液的组成
组分 体系浓度(w/v)
聚乙二醇多胺 1％
BSA 1％
Tween 1％
酪蛋白 0.05％
聚乙二醇多胺+BSA 1％+1％
(7)至(8)同实施例1；
(9)重悬待用。
3.校准品和质控品：同实施例1。
4.检测：
根据图5显示，使用聚乙二醇多胺可以有效地与未与抗体结合的活化羧基结合，中和其所带电荷降低活化后羧基与蛋白吸附。BSA可以有效附着在胶乳微球表面，降低胶乳微球表面与蛋白的吸附。
实施例6.sST2检测盒的制备(含抗干扰组合物)
1.第一试剂：
150mmol/L氯化钠、
1％表面活性剂(Brij 35)、
0.1％叠氮钠、
5KU/L脂肪酶、
0.5％甲基丙烯酰氧基磷脂胆碱、
100mmol/l Tris缓冲液，pH7.4。
2.第二试剂包含：
按w/v计0.15％的400nm胶乳微球、
重组Fab片段单克隆抗体20μg/ml、
100mmol/L甘氨酸缓冲液pH8.0、
0.1％NaCl、
0.5％甲基丙烯酰氧基磷脂胆碱、
0.1％NaN3。
胶乳微球的制备工艺同实施例5。
3.校准品和质控品：同实施例1。
4.试剂检测精密度：见表2。
表2.实施例6所制备的试剂的精密度
重复性(n＝20) 中间精密度(n＝80)
质控1(30ng/ml) 1.50％ 1.78％
质控2(100ng/ml) 0.90％ 1.01％
样本(20ng/ml) 2.1％ 3.40％
实施例7.sST2检测盒的制备(含阻断剂+抗干扰组合物)
1.第一试剂：
1％表面活性剂(Thesit)、
0.1％叠氮钠、
5KU/L脂肪酶、
2％胆酸钠、
5mmol/l CaCl2、
2.0％甲基丙烯酰氧基磷脂胆碱、
3％阻断剂HBR-8TM、
200mmol/l Tris缓冲液，pH7.4。
2.第二试剂包含：
同实施例6。
3.校准品和质控品：同实施例1。
测试例
测试例1.试剂特异性
通过对第一试剂的调整，加入表面活性剂和脂肪酶体系提高了试剂对高乳糜样本的检测准确性。通过加入阻断剂提高了试剂对高RF样本的检测准确性。具体数据见表3。
表3.抗干扰结果
干扰 实施例6(ng/ml) 实施例7(ng/ml)
对照 25.0 26.7
500mg/dl血红蛋白 24.8 25.2
1000mg/dl甘油三脂 0.8 26.1
500IU/L类风湿因子 51.0 25.1
40mg/dl胆红素 23.8 26.4
测试例2.线性
使用高浓度样本，使用生理盐水进行定比例稀释，检测结果R2>0.99(见图6)。
测试例3.前带效应
使用抗原sST2蛋白，理论浓度2000ng/ml，生理盐水等比例稀释，检测理论浓度2000ng/ml样本，检测结果仍高于线性范围(见图7)。
测试例4.灵敏度
使用散射免疫浊度分析时，使用常规样本和生理盐水进行稀释，每个水平样本检测20次，计算CV。CV<10％，为LoQ。
实施例7的试剂盒检测结果LoQ＝0.1ng/ml(见图8)。
测试例5.临床参考范围的建立
选用体检样本，根据性别分别进行分组，排除心脏疾病，炎症疾病，肿瘤等相关疾病。男女各检测120例，进行分析结果如下：
表4.临床参考范围
男 女
平均值 30.0ng/ml 20.5ng/ml
Sd 3.5ng/ml 3.7ng/ml
99％分位数 42.1ng/ml 32.4ng/ml
测试例6.疾病诊断性能
采用实施例7的试剂盒，使用临床参考范围：0.1ng/ml至35ng/ml为正常人群，检测结果判定。
表5.参考范围
诊断 sST2(ng/ml)检测均值 阳性结果
健康对照(n＝50) 30ng/ml 3例(94％)
患者(n＝50) 156ng/ml 35例(70％)
测试例7.试剂稳定性
使用实施例5至7中的试剂盒进行稳定性试验。将试剂加入37℃进行加入稳定性试验。实施例6和7的试剂盒稳定性最优。37℃加速7天后，试剂定标吸光度基本无变化。

Claims (6)

1.一种将抗体固定至胶乳微球的改进方法，包括步骤：
1）在10 mmol/l 至1000mmol/l硼酸缓冲液pH 9.0中提供抗体；
2）在10 mmol/l 至1000mmol/l硼酸缓冲液pH 9.0中提供胶乳微球；
3）将所述抗体和所述胶乳微球在20℃至25℃混合7至9小时得到第一混合物，震荡混合；
4）提供交联剂碳二亚胺；
5）将所述交联剂和所述第一混合物在45℃至55℃接触2至4小时，得到交联有抗体的胶乳微球；
6）将所述交联有抗体的胶乳微球和封闭体系在15℃至28℃接触1小时至24小时；
其中：
步骤1）和步骤2）可互换顺序；
所述步骤4）分别和步骤1）、2）、3）可互换顺序；
所述胶乳微球的表面官能团是羧基；
所述胶乳微球的平均粒径为350nm至450nm；
所述封闭体系包含封闭剂、pH为5.0至8.0的封闭缓冲剂、和表面活性剂；
所述封闭剂包含：按w/v计1% 分子量为1000至5000的聚乙二醇多胺、按w/v计1 %牛血清白蛋白；
所述封闭缓冲剂选自：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液；
所述表面活性剂选自以下的一种或组合：按w/v计2.0%至8.0%Triton X、按w/v计2.0%至8.0%Tween、按w/v计2.0%至8.0%AEO。
2.根据权利要求1所述的方法，封闭步骤后还任选包括选自以下的一个步骤或组合：
清洗交联有抗体的胶乳微球、离心并收获交联有抗体的胶乳微球、包装交联有抗体的胶乳微球。
3. 一种可溶性生长激素表达基因2蛋白的检测试剂盒，其包含：
- 第一试剂、
- 第二试剂、
其中，所述第一试剂包含：
按w/v计1% Thesit、
按w/v计0.1%叠氮钠、
5KU/L脂肪酶、
按w/v计2% 胆酸钠、
5mmol/l CaCl2、
按w/v计2.0%甲基丙烯酰氧基磷脂胆碱、
按w/v计3%阻断剂HBR-8TM、
200mmol/l Tris缓冲液，pH7.4；
所述第二试剂包含：
按w/v计0.15%的400nm胶乳微球、
20μg/ml sST2抗体Fab片段、
100mmol/L甘氨酸缓冲液pH8.0、
按w/v计0.1%NaCl、
按w/v计0.5%甲基丙烯酰氧基磷脂胆碱、
按w/v计0.1%NaN3；
所述胶乳微球的表面官能团是羧基；
通过权利要求1或2所述的方法，将所述sST2抗体Fab片段共价结合至所述胶乳微球的表面。
4.根据权利要求3所述的可溶性生长激素表达基因2蛋白的检测试剂盒，其还包含校准品、和/或质控品。
5.根据权利要求4所述的可溶性生长激素表达基因2蛋白的检测试剂盒，其中：
所述校准品包含：25g/mL、50g/mL、100g/mL、200g/mL、或400ng/mL sST2蛋白；
所述质控品包含：30g/mL或100ng/mL sST2蛋白；
所述质控品或校准品包含选自以下的缓冲剂：磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、PIPES缓冲液；
所述缓冲剂浓度为5 mmol/至250mmol/L；
所述缓冲剂pH为4.0-8.0；
所述质控品或校准品包含按w/v计1.0%至10%的保护剂，其选自：牛血清白蛋白、糖、醇；
所述质控品或校准品包含按w/v计0.05%至1.5%的防腐剂，其选自：叠氮钠、PC、二硫苏糖醇。
6.根据权利要求5所述的可溶性生长激素表达基因2蛋白的检测试剂盒，其中：
所述试剂盒包含校准品和/或质控品，其包含sST2、100mmol/L 磷酸缓冲液pH 5.5、150mmol/L NaCl、按w/v计5%BSA、按w/v计10%山梨醇、按w/v计0.1%NaN3。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112730845A (zh) * 2020-12-16 2021-04-30 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 一种舒伯特气单胞菌乳胶凝集抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
CN112834758B (zh) * 2021-01-07 2023-06-16 北京九强生物技术股份有限公司 B因子的检测试剂盒
CN113030489B (zh) * 2021-04-01 2023-07-25 捷和泰（北京）生物科技有限公司 一种胱抑素c兔多抗-胶乳粒子的制备方法
CN114076741B (zh) * 2021-11-18 2023-12-22 青岛汉唐生物科技有限公司 一种甘胆酸检测试剂盒的制备方法
CN114965986A (zh) * 2022-02-24 2022-08-30 上海麦棵生物科技有限公司 用于检测血液中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(st2)的试剂盒
CN114705641B (zh) * 2022-03-21 2024-07-02 江西乐成生物医疗有限公司 壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂、试剂盒及定量方法
CN115236323A (zh) * 2022-06-17 2022-10-25 北京安百胜诊断科技有限公司 胶乳增强免疫比浊法检测人血浆中狂犬抗体的试剂盒
CN115575627B (zh) * 2022-11-15 2023-03-14 北京博奥森生物技术有限公司 超支化聚缩水甘油醚的应用、蛋白质标记物保存液和比浊法检测试剂盒
CN115856319B (zh) * 2022-11-30 2023-07-28 中拓生物有限公司 一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒及其制备方法和应用
CN117250356B (zh) * 2023-05-23 2024-02-20 安徽千诚生物技术有限公司 一种定量检测可溶性st2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法
CN116987194B (zh) * 2023-09-26 2023-12-26 江西乐成欣生生物技术研究有限责任公司 人st2抗原的模拟表位肽的抗独特型纳米抗体及应用
CN117471110B (zh) * 2023-12-27 2024-03-19 天津德祥生物技术股份有限公司 一种用于封闭抗原-微球指示系统的封闭液及封闭方法
CN118706772B (zh) * 2024-08-16 2025-02-14 中金生物(山东)有限公司 一种抗干扰的尿微量白蛋白测定试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001124779A (ja) * 1999-08-19 2001-05-11 Kyowa Medex Co Ltd Ｈｃｖコア抗原の検出または定量方法およびそれに用いる検出または定量試薬。
CN1656232A (zh) * 2002-05-21 2005-08-17 爱科来株式会社 防止n－(羧甲基氨羰基)－4,4′－双(二甲氨基)二苯胺钠盐错误显色的方法、试剂溶液及使用该方法的测量方法
CN103604931A (zh) * 2013-11-15 2014-02-26 陆上苏 一种人s100蛋白检测试剂及制备方法
CN106324239A (zh) * 2016-07-28 2017-01-11 武汉景川诊断技术股份有限公司 C‑反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及应用
WO2018129885A1 (zh) * 2017-01-13 2018-07-19 深圳开立生物医疗科技股份有限公司 一种全血c反应蛋白检测试剂盒
CN109374902A (zh) * 2018-10-08 2019-02-22 杭州康知生物科技有限公司 一种定量检测IgG4的乳胶增强免疫比浊试剂盒及其制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030003503A1 (en) * 2001-06-29 2003-01-02 Tsai Tenlin S. Enhancing sensitivity and equimolar detection through modifications of the reaction environment
CN104459164B (zh) * 2014-11-28 2016-03-23 山东博科生物产业有限公司 一种血清肌酐检测试剂
CN106771232A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 深圳市鸿美诊断技术有限公司 一种纳米胶乳增强免疫比浊法测定钙卫蛋白的试剂盒
CN108107201A (zh) * 2017-12-20 2018-06-01 青岛汉唐生物科技有限公司 一种胱抑素c检测试剂盒及其制备方法
CN108535491B (zh) * 2018-03-22 2019-11-08 北京九强生物技术股份有限公司 一种肌钙蛋白i的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒
CN108872592A (zh) * 2018-07-04 2018-11-23 浙江伊利康生物技术有限公司 一种胶乳增强免疫比浊法测定血清淀粉样蛋白a检测试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001124779A (ja) * 1999-08-19 2001-05-11 Kyowa Medex Co Ltd Ｈｃｖコア抗原の検出または定量方法およびそれに用いる検出または定量試薬。
CN1656232A (zh) * 2002-05-21 2005-08-17 爱科来株式会社 防止n－(羧甲基氨羰基)－4,4′－双(二甲氨基)二苯胺钠盐错误显色的方法、试剂溶液及使用该方法的测量方法
CN103604931A (zh) * 2013-11-15 2014-02-26 陆上苏 一种人s100蛋白检测试剂及制备方法
CN106324239A (zh) * 2016-07-28 2017-01-11 武汉景川诊断技术股份有限公司 C‑反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及应用
WO2018129885A1 (zh) * 2017-01-13 2018-07-19 深圳开立生物医疗科技股份有限公司 一种全血c反应蛋白检测试剂盒
CN109374902A (zh) * 2018-10-08 2019-02-22 杭州康知生物科技有限公司 一种定量检测IgG4的乳胶增强免疫比浊试剂盒及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Increased serum concentrations of soluble ST2 are associated with pulmonary complications and mortality in polytraumatized patients;Thomas Haider 等;Clin Chem Lab Med;56(5);全文 *
基于顺磁微粒的金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫层析试纸条的制备;张琨;王伟华;万一;颜真;訾静;王军;高磊;;西北大学学报(自然科学版)(03);全文 *

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