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CN107907534A - 一种用于1,5‑脱水‑d‑山梨醇检测显色试剂 - Google Patents

一种用于1,5‑脱水‑d‑山梨醇检测显色试剂 Download PDF

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CN107907534A CN201810049362.8A CN201810049362A CN107907534A CN 107907534 A CN107907534 A CN 107907534A CN 201810049362 A CN201810049362 A CN 201810049362A CN 107907534 A CN107907534 A CN 107907534A
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张远
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Abstract

本发明提供了一种检测人体血清中1,5‑脱水‑D‑山梨醇含量的Trinder反应显色试剂，其组成为N‑(羧甲基氨基羰基)‑4,4’‑双(二甲胺基)二苯胺钠盐（简称DA‑64）和18‑冠醚‑6(CAS:17455‑13‑9)。其特征在于，在DA‑64水溶液中添加18‑冠醚‑6，使DA‑64与所添加的18冠醚‑6形成复合物体系，增加了DA‑64分子在溶液中的稳定性，从而获得具有长期稳定Trinder反应显色试剂。在液体状态保存下，18‑冠醚‑6类化合物与DA‑64的添加比摩尔比为1：2.5。本发明延长DA‑64作为Trinder显色剂的稳定性，并用于人体血清中1,5‑脱水‑D‑山梨醇含量的检测。

Description

一种用于1,5-脱水-D-山梨醇检测显色试剂
技术领域
本发明涉及人体血清中1,5-脱水-D-山梨醇的定量检测领域，具体涉及一种具有长期稳定性的以N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲胺基)二苯胺钠盐为显色剂的显色试剂。
背景技术
近年来，糖尿病的发病率急剧增长，已经成为威胁人类健康的主要疾病之一，引起了人们的极大关注。糖尿病作为一种慢性高发性疾病，早预防、早诊断、早治疗尤为重要，然而，作为目前临床上广泛使用诊断糖尿病的标准—口服葡萄糖耐量试验操作繁琐，患者依从性较差；而空腹血糖和糖化血红蛋白容易遗检早期糖尿病患者。所以，需要继续寻找更加敏感、更加特异的诊断指标，作为筛查早期糖尿病及其监控血糖波动水平。l,5-脱水-D-山梨醇（以下简称l,5-AG）是存在于人体血液中主要的多元醇糖物质之一，由于其代谢稳定，在含量波动范围小，可及时反映糖尿病患者的糖代谢情况，具有空腹血糖、果糖胺和糖化血红蛋白所不具备的特征，在糖尿病的早期诊断和治疗中有很高的临床价值。近年来，越多研究表明血清中l,5-AG的含量可作为一个新的糖尿病诊断和监测的客观指标，(Diabetes,1989,38:723-729, Sci. Rep.2017,7:44291)。美国和日本已将其列为糖尿病的常规监测项目。
酶法分析具有特异性强、操作简便、样品和试剂用量少、测定快速灵敏等特点，可简便快速地测量人体血清中l,5-AG的含量(CN103725748A)。例如，可以采用以下方式对血清中的l,5-AG进行定量测量。首先，将试样中的l,5-AG通过氧化酶定量的转化为过氧化氢；再使所生成的过氧化氢在过氧化物酶的催化下与显色剂发生氧化还原反应从而产生显色物质即Trinder反应；反应体系中，显色物质颜色的量（吸光度）与过氧化氢量存在对应量效关系，进而对血清样本中的l,5-AG进行定量测定。
可以看出，显色剂是上述检测过程中的主要成分，显色剂的灵敏程度和抗干扰能力将直接影响l,5-AG的检测结果。常规显色剂，如TOOS，HDAOS等常规显色剂在测量时所需的波长易受血清样本本底的干扰，造成检测结果不准确；而且其检测灵敏度较低。N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲胺基)二苯胺钠盐（结构式如图1所示，CAS:115871-19-7，以下简称DA-64）作为被氧化而显色的显色剂具有灵敏度高和很强的抗干扰能力优点，尤其在检测时的波长700nm可避开血清本底如血红蛋白等的干扰，适用使用Trinder反应作为方法学并可以在全自动生化分析仪上使用，从而达到对血清中的l,5-AG进行快速定量测定的目的。
在进行上述检测时，必须将显色剂DA-64作为液体试剂使用。然而，DA-64在溶液保存时并不稳定，随着保存时间的延长，易自然氧化而生成显色物质，造成背景吸光度增高或失去还原剂的作用，从而导致使用时的检测精度降低。这样就给在全自动生化仪上使用DA-64作为显色剂精准检测人体血清中的l,5-AG造成了困难。目前为止，已经有研究并报道了使DA-64在液体中稳定化的方法，例如，添加聚氧乙烯烷基胺或和聚氧乙烯烯基胺作为DA-64稳定剂(PCT公布号WO2012/020746,中国专利公布号CN10308039)；使用碳原子数为12以上的烃链季铵或其盐作为DA-64稳定剂（PCT公布号WO2007/083703,中国专利公布号CN10308039）等。
本发明人在研究中发现，在DA-64显色剂溶液中添加18冠醚-6，可在不影响检测精度的情况下显著增加其长期稳定性，目前未见关于该方法报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种可长期保持稳定的以DA-64为显色剂的显色试剂，用于血清中l,5-AG的定量检测，其特征在于在溶液使DA-64与18冠醚-6(CAS: 17455-13-9，其化学结构式图2所示)共存，使其DA-64分子趋于稳定化。所得显色试剂中的DA-64不易自然氧化而显色，可长期以溶液状态保存，能够在全自动生化分析仪上使用，且长时间范围内其检测准确度高，重复性好。由此，本发明的显色试剂可以以液体状态长期保存，使简单、低成本的测定血清中的l,5-AG变得容易。
本发明的原理:利用18-冠醚-6在溶液中与DA-64分子形成分子自组装结构，使DA-64分子趋于稳定化，不易被自然氧化，从而使含DA-64的液体显色试剂长期稳定化。具体来说，在水溶液中，DA-64分子上的二甲胺基以铵盐的形式存在，而18-冠醚-6可与溶液中的铵盐形成稳定的络合物，利用这一性质，可将DA-64分子上的二甲胺基部分螯合在18-冠醚-6环内，对DA-64分子起到保护作用，使其不易被自然氧化，进而增加DA-64显色试剂的稳定性。
本发明所提供的显色试剂中，DA-64浓度范围例如为300-700 umol/L；18-冠醚-6相对于DA-64每100 umol的添加比例例如为10-1000umol，优选为150-350 umol。
本发明对于上述液体显色试剂所使用的液体介质没有特别的限定，通常使用缓冲液，例如可以举出Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、TAPS缓冲液等。所使用缓冲液浓度例如为1-500mM，优选为5-100mM。本发明的液体显色试剂的pH值没有特别的限定，例如为pH 3-11，优选为pH 6-8。
本发明涉及使DA-64稳定化的方法，具体来说是指将DA-64在液体介质中与18-冠醚-6共存，形成稳定的分子自组装结构，使其在溶液中稳定化。本发明中所述稳定化是指，含有DA-64的液体显色试剂中的DA-64的稳定性，优选是指抗自然氧化从而保持长期稳定。因此，本发明中液体显色试剂的稳定性可以通过在一定时间范围内，试剂液体的着色程度（吸光度）来评价，即所述液体试剂的吸光度增量越大，其稳定性越差，DA64被自然氧化的程度越高；另一方面，所述液体试剂的吸光增量度越小，其稳定性越好，DA64被自然氧化的程度越低。
附图说明
图1.N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲胺基)二苯胺钠盐（DA-64）(CAS:115871-19-7 )的结构式
图2.18-冠醚-6(CAS: 17455-13-9)的结构式
图3.显色试剂DA-64稳定性测试
图4.采用新鲜配置显色试剂测定1,5-AG含量
图5.4℃放置90天后检测1,5-AG含量
图6 .4℃放置180天后测定1,5-AG含量
图7.第1天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的线性范围测试结果
图8.第30天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的线性范围测试结果
图9.第90天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的线性范围测试结果
图10.第180天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的线性范围测试结果
图11.第360天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的线性范围测试结果
具体实施方式
本发明的内容，通过以下的实施例作具体说明，其中所用试剂来源如下表所示：
表1.实施案例中的试剂来源
实施例1：
含有18冠醚-6的DA-64显色试剂的制备
步骤1: 将0.189 g DA-64 和0.660 g 18-冠醚-6 溶解于100 ml纯化水，室温搅拌30min；
步骤2: 将按步骤1所得溶液稀释至1 L，加入12.15 g三羟甲基甲胺基丙磺酸和8.7 g氯化钠，并用5 M 的氢氧化钠将PH调至8.0；
步骤3:向按步骤2所得溶液中加入150 KU吡喃糖氧化酶，5 KU辣根过氧化酶；并将所制得液体试剂保存在4℃。
实施例2：
含DA-64的显色试剂稳定性测试
将实施例1中所制得的液体试剂置于4℃恒温箱中，每隔一定的时间，使用紫外分光光度计（MapadaUV-1800）测试其波长在700 nm的吸光度，用其吸光度的增量来评价试剂的长期稳定性；作为对照，制备不含18-冠醚-6的液体显色试剂并同时置于4℃恒温箱中，在同样的时间使用紫外分光光度计测试其波长在700 nm的吸光度，以评价其稳定性。
其吸光度随时间变化曲线见图3。由图3可见，由于未加入18-冠醚-6，普通DA-64显色试剂中的DA-64逐渐自然氧化而生成显色物质，其背景吸光度随试剂的保存时间的延长而大幅增加；相应的，本发明中所提供的含18-冠醚-6的显色试剂，在180天的测试中，吸光度无明显改变，说明本发明中所提供的显色试剂确实具有长期稳定性。
实施例3：
本发明的显色试剂测定l,5-AG标准品
仪器：日立7060全自动生化分析仪；
测定波长：主波长700 nm 副波长800 nm；
测试方法：用全自动生化分析仪比色定量测定；
参数设定：反应温度37℃，主波长700nm，副波长800nm；
反应类型：两点终点法；
校准方式：Spline；
1,5-AG标准品浓度：
0umol/L 50umol/L100umol/L200umol/L400umol/L500umol/L
本发明的显色试剂作为试剂二来使用，所用试剂一配方如下：
表2.试剂一的配方
测试过程：试剂一180ul加样品4uL反应5分钟读取第一个点A1，加入试剂二90ul继续反应5min后读取吸光度A2；A2减去A1的值为反应增量。
用上述方法和本发明的显色试剂制定用于标定1,5-AG的标准曲线，并将试剂在4℃储存90天和180天，再用同样方法标定标准曲线；作为对照，同样的，将未添加18-冠醚-6的显色试剂分别在新配置时，储存90天后，储存180天后标定标准曲线。
上述新配置显色试剂标定的标准曲线如图4所示，可以看出，加入和未加入18-冠醚-6的显色试剂的标准曲线几乎重合，说明18-冠醚-6对该显色反应没有阻碍、抑制或促进的作用，对标准曲线的标定并无影响。
如图5所示，在试剂储存90天后，本发明的加入18-冠醚-6的显色试剂所标定的标准曲线没有变化，而未加入18-冠醚-6的显色试剂所标定的标准曲线有了明显改变，其整体斜率明显下降，这是由于显色试剂中的DA-64分子自然氧化进而发色，造成背景吸光度增高，和溶液中余留的DA-64分子浓度下降所造成的。
如图6所示，在试剂储存90天后，本发明的加入18-冠醚-6的显色试剂所标定的标准曲线没有明显变化，而未加入18-冠醚-6的显色试剂所标定的标准曲线的斜率进一步下降，其灵敏度已经很难满足检测需要。
综上所述，18-冠醚-6的加入可极大的提高DA-64显色试剂的稳定性，本发明中所提供的显色试剂确实具有长期稳定性。
l实施例4：
本发明的显色试剂测定临床样本1，5脱水葡萄糖醇(l,5-AG)含量
人体血清内1，5脱水葡萄糖醇的含量可以有效的反应短期内糖尿病的控制程度，其对糖尿病的诊断有很重要的价值。以N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲胺基)二苯胺钠盐（DA-64）为显色底物的吡喃糖氧化酶法测定血清中l,5-AG含量，具有灵敏度高的特点，但是DA-64稳定性比较低，会随时间自然氧化，本发明18-冠醚-6对DA-64有保护作用，使其长期稳定性延长，利于1，5脱水葡萄糖醇测定试剂盒的产业化。
本发明的显色试剂作为试剂二来使用，测定临床样本。
所用试剂一配方如下：
表3.用于临床测试的试剂一配方
仪器：日立7060全自动生化分析仪；
测定波长：主波长700 nm 副波长800 nm；
测试方法：用全自动生化分析仪比色定量测定；
参数设定：反应温度37℃，主波长700nm，副波长800nm；
反应类型：两点终点法；
校准方式：两点定标；
1,5-AG标准品浓度：0umol/L，300umol/L
计算方法：
其中 C 为血清 1 , 5-AG 浓度(μmol/L)；
∆A样本：以空白管吸光度为对照的样本管吸光度；
∆A标准：以空白管吸光度为对照的标准管吸光度；
C标准为标准溶液浓度(μmol/L)
测试方案：
1.将含有18-冠醚-6的试剂二配制三批，同时将不含18-冠醚-6的试剂二也配制三批，每批8套，其它物质浓度不变；
2.将这三批试剂放置于2-8℃冰柜中储藏，分别于第1天，第30天，第90天，第180天，第360天测试其性能指标；
3.性能指标检测方法：
3.1.线性范围：
用接近线性区间上限的高浓度(活性)样品和接近线性区间的下限的低浓度(活性)样品，混合成至少5个稀释浓度（xi）。分别测试试剂盒，每个稀释浓度测定3次，分别求出测定结果的均值（yi）。以稀释浓度（xi）为自变量，以测定结果均值（yi）为因变量求出线性回归方程。按公式（1）计算线性回归的相关系数（r），理论浓度与实测浓度的线性相关系数 r 应≥0.9900。
…………………… (1)
3.2.准确度
用定值校准品（校准品）对试剂（盒）进行测试，重复测定3次，计算出测试结果均值(M)，根据公式（4）计算相对偏差（B）,相对偏差应不超过±10%。
………………………………………(2)
3.2.精密度
3.2.1批内精密度
在重复性条件下，用已知浓度的高、低值样品或质控测试同一批号试剂盒，重复测定至少10次(n≥10),分别计算测量值的平均值()和标准差(SD)。按公式(6)计算批内精密度的变异系数(CV)。CV值应不大于5.0%。
………………………………(3)
3.2.2批间精密度
用同一质控分别测试3个不同批号的试剂盒，每个批号测试3次，分别计算每批3次测定的均值(i=1,2,3),按公式（7）,公式(8)计算相对偏差（R）。批间差R应不大于10.0%。
…………………………(4)
…………………………(5)
式中：
_________ 中的最大值
_________ 中的最小值
3.3.确定参考区间
选取300例体检合格的成年人，男150例，女150例，年龄18岁~60岁。空腹静脉采血，测试血清1,5AG浓度，得出参考范围（`X ±2s）。
4.结果
4.1.线性范围
测试结果如图7、图8、图9、图10、图11，分别是第1天，第30天，第90天，第180天，第360天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的线性范围测试结果。可以看出，加18-冠醚-6试剂具有360天的试剂稳定，而不加18-冠醚-6试剂在30天后试剂就开始不稳定，90天后不合格。
4.2.准确度
表4.第1天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的准确度测试结果
表5.第30天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的准确度测试结果
表6.第90天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的准确度测试结果
表7.第180天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的准确度测试结果
表8.第360天加18-冠醚-6试剂与不加18-冠醚-6试剂的准确度测试结果
4.3.精密度
本实验采用浓度50umol/L、175umol/L、325umol/L的混合血清样本，测定各个时间段试剂的精密度。
表9.第1天血清1,5AG精密度检
表10.第30天血清1,5AG精密度检
表11.第90天血清1,5AG精密度检
表12.第180天血清1,5AG精密度检
表13.第360天血清1,5AG精密度检
4.4.参考区间
选取300例体检合格的成年人，男150例，女150例，年龄18岁~60岁。空腹静脉采血，测试血清1,5AG浓度为（172±52 umol/L），参考范围（`X ±2s）为（68~276umol/L）。

Claims (3)

1.一种具有长期稳定N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲胺基)二苯胺钠盐液体显色试剂，其特征在于在N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲胺基)二苯胺钠盐水溶液中添加18-冠醚-6，并与之形成稳定的分子自组装，使试剂达到稳定化的目的。
2.根据权利要求1所述的液体显色试剂中N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲胺基)二苯胺钠盐与冠醚类化合物之间的摩尔比为1:1.5至1:3.5。
3.根据权利要求1所述的液体显色试剂用于人体血清中1,5-脱水-D-山梨醇含量的检测。
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