CN1795381A - 溶血试样的稳定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供即使放置于室温下在之后进行的测定中，对测定精度没有影响的溶血试样的稳定化方法和在该稳定化方法中使用的溶血试剂溶液。使用含有表面活性剂且溶解了二氧化碳的溶血试剂溶液使血球溶血来制备溶血试样。只要是如此制备的溶血试样，则例如即使保存在室温下，也可以以与刚刚制备之后的溶血试样同样的测定精度进行糖化蛋白质等的测定。在2～35℃下的前述溶血试样中的二氧化碳的溶解浓度为8mmol/L或以上。

Description

溶血试样的稳定化方法

技术领域

本发明涉及一种溶血试样的稳定化方法。

背景技术

在血球中的糖化蛋白质中，特别是糖化血红蛋白(HbA_1c)反映生体内的血糖值的过去的历史，因此是糖尿病的诊断或治疗等中的重要指标。

糖化血红蛋白例如可以通过高速液相色谱(HPLC)法、微型柱(minicolumn)法、免疫法等测定血红蛋白的糖化率，最近，还研究出了使用糖化氨基酸氧化还原酶(FAOD)的酶法测定方法。

前述酶法，首先，将红细胞溶血以制备溶血试样，将果糖基氨基酸氧化酶(以下称为″FAOD″)加到此溶血试样中，使其作用于糖化血红蛋白的糖化部分并产生过氧化氢。此过氧化氢的量对应于前述糖化血红蛋白的糖化量。然后，将过氧化物酶(以下称为″POD″)和还原剂加到此试样中，将前述POD作为催化剂在前述过氧化氢和前述还原剂之间发生氧化还原反应。此时，如果使用通过氧化而显色的基质作为前述还原剂，则可以通过测定这种显色来测定前述过氧化氢量，结果是，可以得知血球中的糖化血红蛋白量。这种酶法适用于实际的临床医疗领域。

发明内容

但是，这种酶法会产生以下的问题。也就是，在测定糖化蛋白质时，如前所述，首先，必须制备溶血试样，但是并不一定在溶血试样刚刚制备完之后就立即测定糖化蛋白质。即，在收集一定数量的溶血试样后，再将它们全部用于测定，根据各溶血试样的不同，则在从制备到测定开始的时间不同，由于将这样的溶血试样的放置，则会发现有测定精度下降的现象。具体地，即使是相同的溶血试样，在将其放置在室温下时，根据放置时间，会发现测定值随时间上升，产生无法得到正确的糖化蛋白质的质量的问题。为了避免这种问题、维持优异的测定精度而要求在刚刚制备完溶血试样之后就立即进行对糖化蛋白质的测定。但是，在临床医疗的领域中，必须处理大量的检测体，因此对各检测体来说，在刚刚制备完溶血试样之后就立即进行测定，在效率方面也有实际的困难。

因此，本发明的目的在于例如提供即使放置在室温下，对在以后所进行的测定中的测定的精度也不会产生影响的溶血试样的稳定化方法。

为了实现前述目的，本发明的溶血试样的稳定化方法，其特征在于：在使血球溶血的溶血试样中，含有选自碳酸离子、碳酸氢离子和二氧化碳中的至少一种。

本发明者等对将溶血试样放置在室温下时，对前述的糖化血红蛋白的测定值随着时间增加的原因进行了认真研究。其结果是，可以推断：由于在放置溶血试样时，大气中的二氧化碳溶解到前述溶血试样中，溶解的二氧化碳导致前述试样中的血红蛋白结构缓慢变化，伴随着这种变化，蛋白酶引起的消化反应速度产生变化，或者血红蛋白自身的氧化还原能也发生变化，因此前述的FAOD或POD引起的氧化还原反应受到影响，其结果是，测定值上升。基于这种推断进行研究的结果是，本发明者等发现通过使二氧化碳溶解于溶血试样中，或者通过使溶血试样含有碳酸离子或者碳酸氢离子，可以抑制前述这种溶血试样的放置而产生的测定值的经时变化，从而完成本发明。所有本发明的发明人首次发现：通过这样的溶血试样的放置，测定值随时间变化而上升；推断这种上升的原因是溶解了二氧化碳；以及通过使溶血试样预先含有二氧化碳或碳酸离子或者碳酸氢离子可以解决前述课题。如果根据这种溶血试样的稳定化方法，就不需要刚刚制备完之后就立即通过酶反应进行测定，因此在前述的临床领域中，可以非常有效地测定以糖化血红蛋白为代表的糖化蛋白质，并可以认为其是非常有用的方法。

另外，前述的本发明的溶血试样的稳定化方法，例如，可以使用一种含有表面活性剂的血球溶血用的溶血试剂溶液，其进一步含有选自碳酸离子、碳酸氢离子和二氧化碳中的至少一种。如果使用这种溶血试剂溶液，则可以容易地进行前述的本发明的溶血试样的稳定化，所以可以认为，例如在临床领域等测定糖化蛋白质时这种溶血试剂溶液是非常有用的试剂。另外，通过本发明的溶血试样的稳定化方法可以进行溶血试样的制造。

附图说明

图1是表示根据本发明制备的溶血试样的一个实施例中，前述溶血试样的保存时间和测定值变化的关系的曲线图。

图2是表示在前述实施例中，其它的溶血试样的保存时间和测定值变化的关系的曲线图。

图3是表示在前述实施例中，另外的溶血试样的保存时间和测定值变化的关系的曲线图。

具体实施方式

如前所述，本发明的溶血试样的稳定化方法的特征在于：在使血球溶血的溶血试样中，含有选自碳酸离子、碳酸氢离子和二氧化碳中的至少一种。另外，在本发明中，所述的溶血试样中含有二氧化碳是指在前述溶血试样中溶解有二氧化碳。

首先，对在溶血试样中溶解二氧化碳而将前述溶血试样稳定化的方法的一个例子进行说明。

对于前述溶血试样中的二氧化碳的溶解浓度，例如可以根据用于溶血处理的血球量等适当确定，例如，在2～35℃时，该溶解浓度为约8mmol/L或以上，优选为约10～80mmol/L，更优选为约15～80mmol/L。具体地，前述溶血试样中的血球浓度为约5g/L时，二氧化碳的溶解浓度在约2～35℃下，例如该溶解浓度优选为约8mmol/L或以上，更优选为约10～80mmol/L，特别优选为约15～80mmol/L。另外，不含二氧化碳的溶血试样(血球浓度为5g/L)的二氧化碳浓度通常为0.4～1mmol/L左右。

在本发明中，优选在前述溶血试样中进一步含有表面活性剂。通过含有表面活性剂，例如，在测定糖化血红蛋白等糖化蛋白质时，可以有效地进行用于分解前述蛋白质的蛋白酶处理。另外，如前所述，由于二氧化碳的影响，例如，血红蛋白的消化速度可能会产生变化，但是如果添加表面活性剂，则可以进一步促进其消化反应。作为前述表面活性剂，没有特别的限制，例如，可以使用聚氧乙烯对-叔辛基苯基醚(Triton类表面活性剂等)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基醚(Tween类表活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij类表面活性剂等)等非离子性表面活性剂，具体地，例如可以列举出TritonX-100、Tween-20、Brij35等。

前述溶血试样中的表面活性剂的含有浓度例如优选为约6～40mmol/L，更优选为约10～40mmol/L，特别优选为约15～40mmol/L。具体地，在前述溶血试样中的血球浓度为约5g/L时，表面活性剂的浓度在约2～35℃下，例如为约8mmol/L，优选为约10～40mmol/L，更优选为约15～40mmol/L。

在本发明的稳定化方法中，为了使二氧化碳溶解于溶血试样中，例如，优选进一步包括通过含有表面活性剂且溶解了二氧化碳的溶血试剂溶液使血球溶血的工序。通过使用这种溶血试剂溶液而使血球溶血，从而可以制备溶解了二氧化碳的溶血试样。

血球的溶血例如可以向全血中添加前述溶血试剂溶液来进行，也可以从全血回收的血球(粒子)中添加混合前述溶血试剂溶液来进行。血球可以通过例如离心分离、血球分离膜等膜处理等现有公知的方法回收。

前述溶血试剂溶液中的表面活性剂(A)和二氧化碳(B)的比例(摩尔比A∶B)没有特别的限制，优选为1∶0.5～1∶13，更优选为1∶2～1∶13，特别优选为1∶2～1∶3。

前述溶血试剂溶液中的表面活性剂和二氧化碳的浓度，例如可以根据对血球的添加量和血球量适当确定，例如：表面活性剂为约6～42mmol/L、二氧化碳为约8～84mmol/L，优选表面活性剂为约6.3～42mmol/L、二氧化碳为约8.4～84mmol/L，更优选表面活性剂为10～40mmol/L、二氧化碳为约10～80mmol/L，特别优选为表面活性剂为15～40mmol/L、二氧化碳为约15～80mmol/L。另外，前述二氧化碳的浓度例如是2～35℃下的浓度。

含有前述表面活性剂且溶解了二氧化碳的前述溶血试剂溶液，例如可以通过使99.9％的二氧化碳气体在含有前述表面活性剂的溶液中起泡而制备。起泡可以使用例如二氧化碳的贮气瓶等进行。其条件没有特别的限制，通常在2～35℃的条件下进行。具体地，在前述溶液为10mL时，例如通过在自然的大气压下、温度为1.5～35℃、时间为10秒的条件下起泡，则可以得到二氧化碳的溶解浓度为约20～80mmol/L的溶血试剂溶液。

另外，作为含有表面活性剂的溶液的溶剂，没有特别的限制，例如可以使用水和各种缓冲液。另外，二氧化碳除了可以溶解于上述的含有表面活性剂的溶液中以外，例如，也可以预先溶解在用于制备前述溶液的前述溶剂中。

血球和前述溶血试剂溶液的混合比例没有特别的限制，例如，优选将制备的溶血试样中的二氧化碳的溶解浓度以及表面活性剂的浓度设定为前述范围。

另外，在本发明的稳定化方法中，为了使二氧化碳溶解于前述溶血试样中除了使用前述的溶血试剂溶液以外，例如也可以通过使用表面活性剂的方法、超声波法、使用渗透压差的方法等制备溶血试样后，在该溶血试样中直接进行二氧化碳气体的起泡。

接着，对使溶血试样含有碳酸离子或者碳酸氢离子而将前述溶血试样稳定化的方法的一个例子进行说明。

前述溶血试样中的碳酸离子或碳酸氢离子的浓度，例如可以根据提供溶血处理的血球量等适当确定，例如该浓度为约8mmol/L或以上，优选为约10～80mmol/L，更优选为约15～80mmol/L。具体地，在前述溶血试样中的血球浓度为5g/L时，碳酸离子或碳酸氢离子的浓度例如为约8mmol/L或以上，优选为约10～80mmol/L，更优选为约15～80mmol/L。另外，可以含有碳酸离子和碳酸氢离子的中任意之一，也可以两者都含有。另外，在含有两种离子时，其总浓度例如可以是前述浓度(例如浓度为8mmol/L或以上)。

与前述相同，优选在前述溶血试样中进一步含有表面活性剂。另外，表面活性剂的种类和浓度等没有特别的限制，例如与前述相同。

在本发明中，为了使溶血试样含有碳酸离子或碳酸氢离子，例如优选包含通过含有表面活性剂且含有碳酸离子或碳酸氢离子的溶血试剂溶液使血球溶血的工序。通过使用这种溶血试剂溶液使血球溶血可以制备含有碳酸离子或碳酸氢离子的溶血试样。

对于含有前述表面活性剂且溶解碳酸离子或碳酸氢离子的前述溶血试剂溶液，例如可以通过在含有表面活性剂的溶液中将碳酸盐溶解而制备。

作为前述碳酸盐，例如优选为碱金属盐，具体地，可以使用碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、碳酸锂、碳酸钠·钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸铵、碳酸氢铵和三(羟甲基)氨基甲烷碳酸盐(Tris carbonate)等，其中特别优选碳酸钠等。另外，可以使用它们中的一种，可以将二种或更多种同时使用。

前述溶血试剂溶液中的表面活性剂(A)和碳酸盐(C)的添加比例(摩尔比A∶C)例如优选为1∶0.2～1∶27，更优选为1∶1.5～1∶27，特别优选为1∶1.5～1∶4。

作为前述溶血试剂溶液中的碳酸离子或碳酸氢离子的浓度，例如可以根据向血球的添加量以及血球量适当确定，例如该浓度为约8mmol/L或以上，优选为约8.4mmol/L或以上，更优选为约10～80mmol/L，特别优选为约15～80mmol/L。

另外，在使前述溶血试样含有碳酸离子或碳酸氢离子时，除了使用前述的溶血试剂溶液以外，例如，也可以在制备了溶血试样后，在该溶血试样中直接溶解前述的碳酸盐，或者也可以添加混合溶解了前述碳酸盐的溶液。

另外，作为现有的问题，特别是在使血液溶血的状态下放置，可以发现：如前所述的那样，HbA_1c值上升，所以在本发明的稳定化方法中，至少在放置溶血试样，可以含有二氧化碳或碳酸离子、碳酸氢离子。在本发明的稳定化方法中，如前所述的那样，前述二氧化碳或碳酸离子、碳酸氢离子，例如可以在溶血试样中含有，也可以预先在溶血前的检测体中含有。另外，可以在溶血试样或溶血前的检测体中直接含有，也可以如前所述的那样，在溶血试剂溶液中含有二氧化碳或碳酸离子、碳酸氢离子，并将该试剂添加到溶血前检测体中。其中，例如从临床实验现场中的便利性和简易性的观点出发，优选为预先在溶血试剂中含有二氧化碳或碳酸离子、碳酸氢离子，再添加到溶血前的检测体中。

只要是如上制备的含有二氧化碳或碳酸离子或者碳酸氢离子的溶血试样，例如，在室温条件下保存时，就可以维持长时间稳定的状态。为此，例如，即使在前述的保存后通过酶反应进行溶血试样中的糖化蛋白质的测定时，也可以抑制测定值随时间的变化。本发明例如还适用于在低温条件下保存溶血试样的情形，由于可以解决前述的室温条件下的问题，所以可以认为本发明是在室温(例如，15～35℃左右)下保存溶血试样时有用的方法。特别是，在前述这种临床医疗等的分析化学的领域中发现：实际上制备后的溶血试样主要保存在室温下，由于这种条件下的保存会产生前述的这种问题，所以认为本发明对室温下的稳定化有用。另外，刚刚制备完之后就立即测定溶血试样显然是可以的，但是如前所述的那样，由于可以避免保存时的问题，所以优选适用于在前述的临床医疗领域中的刚刚制备完之后的使用是困难时的情形。根据本发明，例如可以将溶血试样调整后26小时左右的测定值保持到与刚刚制备完成之后相同的程度，优选保持时间为3～10小时左右。

根据本发明制备的溶血试样，例如可以作为糖化血红蛋白、血红蛋白、糖化白蛋白(glycocyamidine)、白蛋白、球蛋白、肌红蛋白等的测定试样使用，特别优选糖化血红蛋白。

以下，就根据本发明制备的溶血试样，说明测定糖化血红蛋白的方法的一个例子。

首先，对前述溶血试样进行蛋白酶处理，分解前述试样中的糖化血红蛋白。前述蛋白酶处理通常是在缓冲液中进行，其处理条件可以根据所使用的蛋白酶的种类、糖化血红蛋白的种类及其浓度等适当确定。

作为蛋白酶，没有特别的限制，例如，可以使用丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶等，具体地，优选为胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、氨基肽酶等。另外，在分解的糖化蛋白质为糖化血红蛋白时，前述蛋白酶优选为选择性地分解前述糖化血红蛋白的蛋白酶，例如，可以列举出菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来自猪的胰脏的胰蛋白酶，金属蛋白酶、来自枯草杆菌(bacillus subtilis)的蛋白酶等。作为来自前述枯草杆菌的蛋白酶可以列举出商品名为蛋白酶N(例如，Fluka公司制造)，商品名为蛋白酶N“Amano”(天野制药公司制造)等。作为前述金属蛋白酶可以列举出来自Bacillus属的金属蛋白酶(EC3.4.24.4)(例如，东洋纺织公司制造的，商品名为Toyoteam)等。其中，更优选为金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，特别优选为金属蛋白酶。如果使用如上所述的选择性地分解的蛋白酶，则可以选择性地制备特定的蛋白质的分解物。

作为前述缓冲液，例如可以列举出CHES缓冲液、CAPSO缓冲液、CAPS缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、EPPS缓冲液、HEPES缓冲液等。其pH值例如为6～13，优选为7～11。另外，蛋白酶处理溶液中的前述缓冲液的最终浓度，例如为1.0～10mmol/L。

具体地，例如在使用金属蛋白酶作为前述蛋白酶来处理前述溶血试样时，通常反应液中的金属蛋白酶的浓度为0.1～40MU/L，反应液中的血球浓度0.05～15体积％、反应温度为15～37℃、反应时间为1分钟～24小时、pH值为6～12。

另外，例如在使用蛋白酶K作为前述蛋白酶来处理前述溶血试样时，通常反应液中的金属蛋白酶的浓度为10～300KU/L，反应液中的血球浓度0.05～15体积％、反应温度为15～37℃、反应时间为1分钟～24小时、pH为6～12。另外，前述缓冲液的种类也没有特别的限制，例如，Tris盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液等。

接着，通过前述蛋白酶处理得到的糖化血红蛋白分解物用后述的FAOD处理。通过该FAOD处理可以催化后述的式(1)所示的反应。与前述FAOD进行反应的糖化血红蛋白分解物的糖化部分根据所使用的FAOD的催化反应而异，例如优选为氨基酸残基侧链的糖化氨基或糖化α-氨基。其中，由于具有后述的催化功能的FAOD容易作用，所以优选为前述氨基酸残基侧链的糖化氨基，例如，可以列举出赖氨酸残基侧链的糖化氨基、精氨酸残基侧链的糖化氨基。

该FAOD处理优选与前述蛋白酶处理同样地在缓冲液中进行，作为前述缓冲液，没有特别的限制，可以使用与前述蛋白酶处理相同的缓冲液。

该处理条件，例如为：反应液中的FAOD浓度为200～30,000U/L，反应液中的血红蛋白的浓度为0.1～10g/L，反应温度为15～37℃，反应时间为1～20分钟，pH为7～9。

接着，使用POD和因氧化而发色的基质利用氧化还原反应测定前述FAOD处理所产生的过氧化氢。

通过该POD的氧化还原反应通常在缓冲液中进行，其条件根据过氧化氢浓度等适当决定。通常，反应液中的POD的浓度为1～20000IU/L，基质浓度为0.0001～1mmol/L，反应温度为20～37℃，反应时间为1～5分钟，pH为6～9。另外，前述缓冲液没有特别的限制，可以使用与前述FAOD处理等相同的缓冲液等。

作为前述因氧化而发色的基质，没有特别的限制，例如可以列举出N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺钠、邻苯二胺(OPD)、组合Trinder试剂和4-氨基安替比林的基质等。作为N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺钠，例如可以使用商品名为DA-64(和光纯药公司制造)。作为前述Trinder试剂，例如可以列举出苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除了前述4-氨基安替比林以外，还可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在这种发色性基质中，特别优选为N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯基胺钠。

使用前述因氧化而发色基质时，通过使用分光光度计测定其发色(反应液的吸光度)，可以测定过氧化氢的浓度，由此测定前述试样中的血红蛋白糖化量。

作为前述FAOD，例如可以使用催化下式(1)所示的反应的FAOD。

                                           ...(1)

在前式(1)中，R¹-CO-CH₂-NH-R²是例如糖化蛋白质、糖化肽和糖化氨基酸。在前式(1)中，R¹表示羟基或来自糖化反应前的糖的残基(糖残基)。前述糖残基(R¹)在反应前的糖为醛糖时是醛糖残基，在反应前的糖是酮糖时，是酮糖残基。例如，在反应前的糖为葡萄糖时，由于阿玛窦利重排(Amadori Rearrangement)使反应后的结构为左旋糖结构，此时，糖残基(R¹)为葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R¹)，例如可以用下述式表示，

-[CH(OH)]_n-CH₂OH

n是0～6的整数。另外，在前式(1)中，R²表示氨基酸残基或肽残基。

所使用的FAOD的催化反应只要是前述的这种反应，就没有特别的限制，优选为在前式(1)中作用于糖与α-氨基以外的氨基成键的糖化部位的催化反应。另外，前述FAOD并不仅限于这种催化功能，可以进一步同时具有作用于糖与α-氨基成键的糖化部位的催化功能。

实施例

(实施例1)

(标准试样的制备)

将血红蛋白的冷冻干燥品用下述溶血试剂溶液A溶解，制备血红蛋白浓度为4.1g/L、HbA_1c值为4.4％的试样溶液(以下，称作“试样Low”)，以及血红蛋白浓度为5.3g/L、HbA_1c值为10.4％的试样溶液(以下，称作“试样High”)。

(检测体试样的制备)

将人的全血离心处理(3000rpm，10分钟，20℃)来回收红血球，在前述红血球中添加混合50倍(体积)的下述溶血试剂溶液A，由此进行溶血，作为检测体试样。

(溶血试剂溶液A)

表面活性剂(聚氧乙烯月桂基醚)           12g/L

CHES/MOPS缓冲液(pH9.4)             CHES 80mM

                                   MOPS 30mM

Na₂CO₃                               33mM

在25℃下将前述各试样(溶血试样)放置一定时间(0、2、4、6、8小时)。然后，在放置后的20μL溶血试样中，添加180μL下述蛋白酶试剂，在37℃下处理5分钟后，再添加45μL下述FAOD试剂，在37℃下进行处理。然后，在主波长700nm、副波长570nm下测定添加FAOD试剂5分钟后的反应液的吸光度。再将前述测定值代入使用HbA_1c的标准物质预先制作的HbA_1c(％)和吸光度的标准线，求得前述溶血试样的HbA_1c(％)，将放置时间为0小时的溶血试样的HbA_1c值(％)作为“100％”，对各溶血试样的HbA_1c值算出相对值(％)。

另外，除了将表面活性剂的浓度设定为12g/L、不添加碳酸钠以外，制备组成与前述溶血试样A相同的溶血试剂溶液C。然后，除了使用溶血试剂溶液C代替溶血试剂溶液A以外，同样地制备溶血试样以及进行放置，将进行了发色反应的试样作为比较例1。

它们的结果如图1～3所示。另外，图1～3分别是表示溶血试样的放置时间和HbA_1c值的相对值(％)的关系图，图1表示试样Low的结果，图2表示试样High的结果，图3表示检测体试样的结果。

(蛋白酶试剂)

金属蛋白酶(ARKRAY公司制造)                   2MU/L

MES缓冲液(pH5.5)                             1mM

(FAOD试剂)

FAOD(ARKRAY公司制造)                         17.4KU/L

POD(Kikkman公司制造)                         67.0KU/L

Tris缓冲液(pH7.0)                            300mM

商品名为DA-64(同仁化学公司制造)              71.3μmol/L

(实施例2)

除了使用下述溶血试剂溶液B代替溶血试剂溶液A以外，与前述实施例1同样地测定吸光度，求得HbA_1c值的相对值。这些结果一并表示于图1～图3中。

(溶血试剂溶液B)

除了不添加Na₂CO₃以外，通过便携贮气瓶(商品名Standard GasCo₂；GL Sciences公司制造)在与前述溶血试剂溶液A相同组成的混合液中，进行二氧化碳起泡。起泡的条件是在室温(约20℃)、自然大气压下、进行10秒。由此，制备二氧化碳浓度约为30mmol/L的溶血试剂溶液B。

如前述图1～图3所示，除了未添加碳酸钠、不进行二氧化碳起泡以外，如果是使用与前述溶血试剂溶液A相同组成的前述溶血试剂溶液C的比较例1，则会由于溶血试样的放置而使HbA_1c值的相对值随时间变化而增大。相对于此，如果是使用溶血试剂溶液A和溶血试剂溶液B的实施例，则即使与比较例1同样地将溶血试样放置7小时，也几乎没有确认出HbA_1c值的相对值的增加。由该结果，可以知道通过预先在溶血试样中溶解二氧化碳，可以防止溶血试样的放置引起的HbA_1c值的相对值的增加，从而防止溶血试样的放置而导致测定精度的降低。

(实施例3、比较例2)

然后，确认溶血试样在25℃下放置24小时后的HbA_1c值的相对值的变化。首先，使用前述溶血试剂溶液B，与前述同样地制备溶血试样，使用刚制备后的溶血试样和在25℃下放置24小时后的溶血试样，分别进行发色反应，测定吸光度。然后，从使用HbA_1c的标准物质预先制作的HbA_1c(％)和吸光度的标准线，求得前述各溶血试样的HbA_1c(％)。另外，作为比较例2，除了使用溶血试剂溶液C代替溶血试剂溶液A以外，与实施例1同样地求得HbA_1c(％)。这些结果如下述表1所示。另外，在下表中，所述的0小时和24小时表示溶血试样在25℃下的放置时间，括号内的值表示放置24小时后的HbA_1c(％)变化值。

[表1]

	实施例3		比较例2
					试样试样Low试样High	0小时5.5％11.6％	24小时5.8％(0.3％)11.4％(-0.2％)	0小时5.5％11.6％	24小时6.4％(0.9％)12.5％(0.9％)

如前述表1所示，可以知道：比较例2的测定变化值为0.9％，相对于此，实施例3在测定误差的范围内(约0.5％或以下)，即使放置溶血试样，也可以可靠性高地测定HbA_1c浓度。

如上所述，根据本发明，即使将制备的溶血试样例如保存在室温下，也可以以与刚刚制备之后的溶血试样同样的测定精度进行糖化蛋白质的测定。因此，可以认为本发明是在需要处理大量的检测体时特别有用的溶血试样的稳定化方法。

Claims (24)

1.一种溶血试样的稳定化方法，其包含在溶血试样中含有选自碳酸离子、碳酸氢离子和二氧化碳中的至少一种。

2.根据权利要求1所记载的稳定化方法，其中在2～35℃下的所述溶血试样中的二氧化碳的溶解浓度为8mmol/L或以上。

3.根据权利要求2所记载的稳定化方法，其中在2～35℃下的所述溶血试样中的二氧化碳的溶解浓度为8～80mmol/L。

4.根据权利要求1所记载的稳定化方法，其中所述溶血试样中的碳酸离子或碳酸氢离子的浓度为8mmol/L或以上。

5.根据权利要求4所记载的稳定化方法，其中所述溶血试样中的碳酸离子或碳酸氢离子的浓度为8～80mmol/L。

6.根据权利要求1所记载的稳定化方法，其中在溶血试样中进一步含有表面活性剂。

7.根据权利要求6所记载的稳定化方法，其中溶血试样中的表面活性剂的浓度为6～40mmol/L。

8.根据权利要求6所记载的稳定化方法，其中溶血试样中的血球浓度为3～7.5重量％。

9.根据权利要求1所记载的稳定化方法，其中包含通过含有表面活性剂且含有选自二氧化碳、碳酸离子和碳酸氢离子中的至少1种的溶血试剂溶液使血球溶血的工序。

10.根据权利要求9所记载的稳定化方法，其中在含有表面活性剂的溶液中，通过使二氧化碳气体起泡来制备溶解了二氧化碳的所述溶血试剂溶液。

11.根据权利要求9所记载的稳定化方法，其中所述溶血试剂溶液中的表面活性剂和二氧化碳的比例为1∶0.5～1∶13。

12.根据权利要求9所记载的稳定化方法，其中通过在含有表面活性剂的溶液中溶解碳酸盐来制备含有碳酸离子的所述溶血试剂溶液。

13.根据权利要求12所记载的稳定化方法，其中所述碳酸盐是碱金属盐。

14.根据权利要求13所记载的稳定化方法，其中所述碱金属盐是选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、碳酸锂、碳酸钠·钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸铵、碳酸氢铵和三(羟甲基)氨基甲烷碳酸盐中的至少1种盐。

15.根据权利要求9所记载的稳定化方法，其中表面活性剂和碳酸盐的比例为1∶0.2～1∶27。

16.根据权利要求1所记载的稳定化方法，其中在所述溶血试样中使二氧化碳气体起泡。

17.根据权利要求1所记载的稳定化方法，其中在所述溶血试样中溶解碳酸盐。

18.根据权利要求1所记载的稳定化方法，其中所述溶血试样是用于测定糖化血红蛋白。

19.一种溶血试样的制造方法，该方法包含权利要求1所记载的溶血试样的稳定化方法。

20.一种含有表面活性剂的血球溶血用溶血试剂溶液，该溶液进一步包含选自碳酸离子、碳酸氢离子和二氧化碳中的至少一种。

21.根据权利要求20所记载的溶血试剂溶液，其中二氧化碳的溶解浓度在2～35℃下为8mmol/L或以上。

22.根据权利要求20所记载的溶血试剂溶液，其中表面活性剂和二氧化碳的比例为1∶0.5～1∶13。

23.根据权利要求20所记载的溶血试剂溶液，其中碳酸离子或碳酸氢离子的浓度为8mmol/L或以上。

24.根据权利要求20所记载的溶血试剂溶液，其中表面活性剂和碳酸盐的比例为1∶0.2～1∶27。