CN1659441A

CN1659441A - 利用使用甲化合物的氧化还原反应的测定方法

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Publication number: CN1659441A
Application number: CN03812998.1A
Authority: CN
Inventors: 米原聪; 石丸香
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2002-06-07
Filing date: 2003-04-28
Publication date: 2005-08-24
Anticipated expiration: 2023-04-28
Also published as: US20050202399A1; EP1515143A4; DE60325727D1; CN100335903C; WO2003104815A1; ATE420367T1; AU2003235973A1; JPWO2003104815A1; EP1515143A1; JP4214277B2; EP1515143B1; US7381539B2

Abstract

本发明提供利用氧化还原反应测定试样中的待测物的方法，可得到可靠性优良的测定值。在上述氧化还原反应之前，在试样中添加甲化合物以排除上述试样中所含的还原物质的影响，然后，使来自上述待测物的还原物质或氧化物质生成，通过氧化还原反应测定其量，从该测定值确定上述待测物的量。作为上述甲化合物，例如可以使用1－(4－碘苯基)－3－(2，4－二磺苯基)－5－(2，4－二硝基苯基)甲。

Description

利用使用甲䐶化合物的氧化还原反应的测定方法

技术领域

本发明涉及利用氧化还原反应测定试样中的待测物的方法。

背景技术

此前，例如，利用氧化还原反应测定试样中的待测物的量的方法已广泛被采用。例如，也适用于生化分析和临床检查等的糖化蛋白质的测定。

例如，血液中的糖化蛋白质，特别是红细胞中的糖化血红蛋白(HbAlc)，由于反映了生物中血糖值的过去的情况，因此被作为糖尿病的诊断和治疗等的重要指标。例如，红细胞中的糖化蛋白质可利用氧化还原反应如以下所述进行测定。

首先，配制使红细胞溶血的试样，用适当的蛋白酶等对该溶血试样进行处理后，再用果糖基氨基酸氧化酶(以下称作FAOD)处理，使过氧化氢生成。该过氧化氢量对应于红细胞中的糖化蛋白质量。然后，在该反应溶液中再添加过氧化物酶(以下称作POD)和还原剂，上述POD作为催化剂引起上述过氧化氢和上述还原剂之间的氧化还原反应。此时，作为上述还原剂，如果采用因氧化而显色的还原剂，则可通过测定其显色来测定上述过氧化氢量，结果可知红细胞中的糖化蛋白质量。

然而，在血液中通常存在抗坏血酸(AsA)、胆红素等各种还原物质，红细胞中还存在谷胱甘肽(GSH)等各种还原物质。由于这些还原物质既可使上述过氧化氢还原，又阻碍上述氧化还原反应，能把上述还原剂显色后还原而使其褪色。因此，存在的问题是难以准确测定红细胞中的糖化蛋白质量。

另外，由于各种试样含有的还原物质的浓度也不一定，所以还存在测定精度差的问题。

为了避免这些问题，例如有在上述试样中添加各种氧化剂的方法。例如，特开昭56-151358号公报中公开了采用碘酸、过碘酸等卤氧化物作为氧化剂的方法；特开昭57-13357号公报、特开昭57-161650号公报、特开昭59-193354号公报、特开昭62-169053号公报、特开平3-30697号公报中公开了采用钴、铁、铈等金属配合物作为氧化剂的方法。

然而，即使使用这些氧化剂的场合，也不能充分避免对上述测定的影响，特别是，待测物为红细胞内成分时，上述氧化剂效果差。

发明内容

因此，本发明的目的是提供利用氧化还原反应测定试样中的待测物的方法，该测定方法可得到可靠性优良的测定值。

为了达到上述目的，本发明的测定方法是利用氧化还原反应测定试样中的待测物的方法，其特征在于，通过甲化合物排除上述试样中的还原物质的影响。再者，本发明中，甲化合物是指具有甲(H₂NN＝CHN＝NH)骨架的甲的取代化合物。

本发明的发明人已经发现，当采用现有的方法时，虽然排除了上述GSH和AsA那样的低分子量还原物质的影响，但不能排除蛋白质等那样的高分子量还原物质的影响。因此，本发明的发明人进行了深入的研究，结果发现，采用上述甲化合物，与现有的氧化剂不同，不仅能排除与上述低分子量还原物质等同样的还原型物质的影响，例如，也能排除血红蛋白及血红蛋白分解物(以下将两者合称为“血红蛋白”)的影响，从而完成了本发明的测定方法。这样，本发明的发明人首次发现，通过还原型物质甲化合物可以排除上述那样的高分子量还原物质的影响。按照本发明的测定方法，由于可以更可靠地求出待测物的量，所以，例如，在临床医疗等的各种检查中有用。再者，推测还原物质甲化合物排除试样中的还原物质对测定系统的影响，是由于与现有的氧化剂不同的机理。另外，由于该甲化合物非常稳定，因此氧化还原反应也不受甲化合物的影响。

本发明的测定方法中，优选在上述氧化还原反应之前，在上述试样中添加甲化合物以排除上述试样中所含的还原物质的影响，然后，使来自上述待测物的还原物质或氧化物质生成，利用上述氧化还原反应测定其量，由该测定值确定上述待测物的量。

本发明的测定方法中，上述甲化合物例如可以用下述式(1)表示，甲骨架的至少1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子上可以具有取代基(R¹、R²及R³)。下述式(1)中，作为R¹、R²及R³，可以为氢或以下所示的取代基。

R¹N＝N-C(R²)＝N-NHR³ …(1)

作为上述甲化合物，例如优选在甲骨架的1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子的至少两处具有环结构的取代基(环结构取代基)，更加优选在三处都具有环结构取代基。

如上所述，当上述甲化合物至少在两处具有环结构取代基时，优选在1位的氮原子及5位的氮原子上具有上述取代基。另外，当甲化合物在三处具有环结构取代基时，优选在1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子上具有上述取代基。

上述甲化合物优选至少两个环结构取代基的环结构为苯环。另外，作为环结构为苯环以外的环结构取代基，例如有在环骨架中含有S或O，并且是共振结构的取代基，例如，噻吩基、噻唑基等。

上述甲化合物优选在甲骨架的至少1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子上具有环结构取代基，上述环结构取代基的至少两个环结构取代基的环结构为苯环。

上述甲化合物优选至少一个环结构取代基具有官能团，更加优选具有多个上述官能团。

作为上述官能团，优选为吸电子性官能团，例如有卤素基、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基、硝基、羟基、磺基等。其他，除上述官能团以外，例如还可举出，氢过氧基、氧基(oxy)、环氧基、环二氧基、氧代基(oxo)等含氧的特性基及巯基、烷硫基、甲基硫甲基、硫代基、亚磺基、苯磺酰基(benzene sulfonyl)、苯基磺酰基(phenylsulfonyl)、对甲苯磺酰基(p-toluenesulfonyl)、对甲苯基磺酰基(p-tolylsulfonyl)、对甲苯磺酰基(tosyl)、氨磺酰基、异硫氰酸酯基等含硫的特性基等。这些吸电子性官能团中，优选硝基、磺基、卤素基、羧基、羟基、甲氧基、乙氧基。另外，除了上述吸电子性官能团外，例如还有苯基(C₆H₅-)、苯乙烯基(C₆H₅CH＝CH-)等不饱和烃基等。再者，上述官能团也可以通过离解而离子化。

上述甲化合物优选在甲骨架的1位的氮原子及5位的氮原子上具有苯环(苯基)，上述两苯环(苯基)中的至少一个具有选自卤素基、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基及乙氧基的至少一个官能团。再者，上述两个苯环(苯基)具有上述官能团也可以。上述苯环(苯基)中，在任一位置(邻位、间位、对位)上有上述官能团也可以。另外，对官能团的数目没有特别限制，可以具有相同的官能团，也可以具有不同的官能团。

甲骨架的1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子上具有环结构为苯环的环结构取代基的甲化合物，例如可以举出以下化合物。

1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(4-硝基苯基)甲

1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲

1-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(4-硝基苯基)甲

1-(4-碘苯基)-3-苯基-5-(4-硝基苯基)甲

3-(4-氯苯基)-1，5-(二苯基)甲

1，3-二苯基-5-(对二苯基)甲

3-(对二苯基)-1，5-(二苯基)甲

1，3-二苯基-5-(4-苯乙烯基苯基)甲

1，3-二苯基-5-(间甲苯基)甲

1，3-二苯基-5-(对甲苯基)甲

另外，上述甲化合物并不限于上述那些化合物，除此之外，也可以使用在甲骨架的1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子中的两处具有环结构为苯环的环结构取代基、另一处具有其他环结构取代基的化合物。作为这样的化合物，例如可以举出以下化合物。

3-(2-噻吩基)-1，5-(二苯基)甲

1-苯并噻唑基-3-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-5-(4-羧基-2-甲氧基苯基)甲

1，3-二苯基-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)甲

另外，也可以使用甲骨架的1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子中的两处具有环结构为苯环的环结构取代基、另一处具有非环结构取代基的甲化合物，例如可以举出以下化合物。

3-氰基-1，5-(二苯基)甲

3-羧基-1，5-(二苯基)甲

3-甲基-1，5-(二苯基)甲

3-乙基-1，5-(二苯基)甲

其他，例如也可以使用5，5’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯)-4，4’-二基]-双[1-(4-硝基苯基)-3-苯基甲]、1-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-3，5-二苯基甲等。

上述甲化合物中，如上所述，优选具有三个环结构取代基的化合物，更加优选具有三个环结构为苯环的取代基，且含有较多吸电子性官能团的化合物，特别优选1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲。再者，这样的甲化合物，例如可以是盐，也可以是离子化的状态等。

在本发明的测定方法中，上述甲化合物的添加量没有特别限制，可根据试样的种类及上述试样中的还原物质的量来适当确定。具体地说，例如，优选每1μl试样添加上述甲化合物使达到0.001～100μmol的范围，更加优选0.005～10μmol的范围，特别优选0.01～1μmol的范围。

本发明的测定方法中，当上述试样为全血时，优选每1μl全血添加上述甲化合物使达到0.001～10μmol的范围，更加优选0.005～5μmol的范围，特别优选0.01～1μmol的范围。具体地说，当上述甲化合物为1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲时，优选每1μl全血添加上述甲化合物使达到0.001～0.4μmol的范围，更加优选0.005～0.1μmol的范围，特别优选0.01～0.07μmol的范围。

本发明的测定方法中，例如，优选上述氧化还原反应通过氧化酶还原来自上述待测物的氧化物质，并且是使因氧化而显色的底物(显色底物)氧化的显色反应，上述氧化物质的量的测定是通过上述显色反应的显色程度的测定。另外，上述显色程度的测定优选是上述底物的检测波长处的吸光度测定。

这样，使用氧化酶使来自上述待测物的氧化物质与上述显色底物发生显色反应，对上述底物因氧化的显色程度进行吸光度测定时，优选上述显色底物的检测波长与甲化合物的吸收波长为不同的波长。

作为上述显色底物没有特别限制，为了能够高灵敏度地检测，优选例如N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)二苯基胺钠(例如，商品名DA-64：和光纯药工业公司生产)。另外，上述氧化酶优选为过氧化物酶(POD)。

本发明的测定方法中，优选来自上述待测物的氧化物质为过氧化氢，通过测定上述过氧化氢的量来确定待测物的量。例如，用上述氧化酶POD还原过氧化氢，并且使上述显色底物发生氧化，通过测定上述底物的显色程度来测定上述过氧化氢的量。

本发明的测定方法中，上述试样的种类没有特别限制，除了全血、血浆、血清、血细胞等以外，例如对尿、髓液等生物试样，以及果汁等饮料、酱油、调味汁等食品类等试样也可适用。

本发明的测定方法中，作为待测物，例如可举出全血中成分、红细胞内成分、血浆中成分、血清中成分、尿成分、髓液成分等，优选红细胞内成分。作为上述红细胞内成分，例如可以举出糖化血红蛋白、糖化白蛋白等糖化蛋白质、糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、尿酸、胆固醇、肌酸酐、肌氨酸、甘油等，更加优选糖化蛋白质。例如，测定上述红细胞成分的场合，可以把全血直接溶血后作为试样，也可以从全血中分离出红细胞，把上述红细胞溶血后作为试样。

本发明的测定方法中，当上述待测物为糖化蛋白质的场合，优选通过使果糖基氨基酸氧化酶作用于上述待测物，使来自上述待测物的氧化物质生成过氧化氢。另外，使上述糖化肽、糖化氨基酸等糖化胺与FAOD反应，也同样是优选的。再者，根据需要，优选在上述FAOD处理前对上述糖化蛋白质及糖化肽进行蛋白酶处理。

作为上述FAOD，优选是催化下式(2)表示的反应的FAOD。

…(2)

上述式(2)中，R¹表示羟基或来自糖化反应前的糖的残基(糖残基)。当反应前的糖为醛糖时，上述糖残基(R¹)为醛糖残基，而当反应前的糖为酮糖时，R¹则为酮糖残基。例如，当反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多利重排，使反应后的结构变成果糖结构，这时，糖残基(R¹)变成葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R¹)例如可以用-[CH(OH)]_n-CH₂OH

表示，n为0～6的整数。

上述式(2)中，R²没有特别限制，然而，例如，在糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白质的情况、α-氨基被糖化的情况与其他氨基被糖化的情况不同。

上述式(2)中，在α-氨基被糖化的情况下，R²为下式(3)表示的氨基酸残基或肽残基。

-CHR³-CO-R⁴ …(3)

上述式(3)中，R³表示氨基酸侧链基。另外，R⁴表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下式(4)表示。下式(4)中，n为0以上的整数，R³与上述相同，表示氨基酸侧链基。

-(NH-CR³H-CO)_n-OH …(4)

另外，上述式(2)中，当α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸侧链基被糖化)的情况下，R²可以由下式(5)表示。

-R⁵-CH(NH-R⁶)-CO-R⁷ …(5)

上述式(5)中，R⁵表示氨基酸侧链基中被糖化的氨基以外的部分。例如，被糖化的氨基酸为赖氨酸时，R⁵为

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-

例如，被糖化的氨基酸为精氨酸时，R⁵为

-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH(NH₂)-

另外，上述式(5)中，R⁶表示氢、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下式(6)表示。再者，下式(6)中，n为0以上的整数，R³与上述相同，表示氨基酸侧链基。

-(CO-CHR³-NH)_n-H …(6)

另外，上述式(5)中，R⁷表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下式(7)表示。再者，下式(7)中，n为0以上的整数，R³与上述相同，表示氨基酸侧链基。

-(NH-CHR³-CO)_n-OH …(7)

另外，试样中的上述还原物质优选为蛋白质。上述蛋白质的分子量例如为3000以上，优选为3000～3000000的范围，更加优选为10000～300000的范围，特别优选为30000～100000的范围。作为这样的还原物质，例如可以举出血红蛋白、珠蛋白、球蛋白、白蛋白等，优选血红蛋白。

具体实施方式

下面，关于本发明的测定方法，以测定血细胞中的糖化蛋白质为例加以说明。

首先，将全血直接溶血，或用离心分离等常用方法从全血分离出血细胞成分，将其溶血，配制溶血试样。该溶血方法没有特别限制，例如，可以使用采用表面活性剂的方法、采用超声波的方法、利用渗透压差的方法等。其中，从操作的简便性等的理由看，上述采用表面活性剂的方法是优选的。

作为上述表面活性剂，例如，可以使用聚氧乙烯对叔辛基苯基醚(Triton类表面活性剂等)、聚氧乙烯失水山梨糖醇烷基酯(Tween类表面活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij类表面活性剂等)非离子型表面活性剂，具体例如有TritonX-100、Tween-20、Brij35等。上述采用表面活性剂的处理条件，通常，当处理溶液中的血细胞浓度为1～10体积％时，添加上述表面活性剂使得在上述处理溶液中的浓度达0.01～5重量％，室温下，搅拌数秒(约5秒)～10分钟。

然后，在上述溶血试样中添加上述甲化合物，进行试样的前处理。

例如，当前处理溶液中的血细胞浓度为1～10体积％时，优选添加上述甲化合物以使浓度达0.02～2000mmol/L的范围，更加优选0.1～1000mmol/L的范围，特别优选0.4～200mmol/L的范围。具体地说，当上述甲化合物为1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲时，优选添加上述甲化合物以使浓度达0.02～80mmol/L的范围，更加优选0.1～20mmol/L的范围，特别优选0.2～15mmol/L的范围。

上述前处理通常在缓冲液中进行。上述缓冲液，例如可以使用CHES缓冲液、CAPSO缓冲液、CAPS缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、EPPS缓冲液、HEPES缓冲液等。其pH例如为6～13的范围，优选为8～12的范围，更加优选为9～11的范围。另外，上述前处理溶液中的上述缓冲液的最终浓度例如为1～400mmol/L的范围，优选为10～200mmol/L的范围。

该前处理的条件没有特别限制，通常，温度为10～37℃的范围，处理时间为10秒～60分钟的范围。

上述甲化合物可以直接使用，但从操作的简便性和处理效率等考虑，优选溶解在溶剂中作为甲化合物溶液使用。上述溶液的浓度可以根据甲化合物的种类(例如分子量等)等适当确定，例如为0.01～120mmol/L的范围，优选为0.1～50mmol/L的范围，更加优选为0.2～20mmol/L的范围。作为上述溶剂，例如可以使用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等，作为上述缓冲液，例如可以使用与上述相同的缓冲液。再者，上述甲化合物可以使用一种，也可以两种以上并用。

下面，对该前处理完成后的溶血试样进行蛋白酶处理。这是为了使后面的处理中使用的FAOD易于与待测物作用。

上述蛋白酶的种类没有特别限制，例如，可以使用蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、氨肽酶等。上述蛋白酶处理通常在缓冲液中进行，其处理条件根据使用的蛋白酶的种类、作为待测物的糖化蛋白质的种类及其浓度等适当确定。

具体地说，例如，使用蛋白酶K作为上述蛋白酶来处理上述前处理完成的溶血试样时，通常，反应液中的蛋白酶浓度为10～30000mg/L，反应液中的血细胞浓度为0.05～15体积％，反应温度为15～37℃，反应时间为1分钟～24小时，pH为6～12的范围。另外，上述缓冲液的种类也没有特别限制，例如可以使用Tris-盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液等。

接着，将通过上述蛋白酶处理得到的分解物用上述FAOD进行处理。通过该FAOD处理来催化上述式(2)表示的反应。

该FAOD处理优选在与上述蛋白酶处理相同的缓冲液中进行。其处理条件根据使用的FAOD的种类、作为待测物的糖化蛋白质的种类及其浓度等适当确定。

具体地说，例如，反应液中的FAOD浓度为50～50000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.01～1体积％，反应温度为15～37℃，反应时间为1～60分钟，pH为6～9的范围。另外，上述缓冲液的种类也没有特别限制，可以使用与上述蛋白酶处理相同的缓冲液。

接着，使用POD及上述显色底物，通过氧化还原反应测定在用上述FAOD处理时生成的过氧化氢。

作为上述显色底物，例如有N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠(以下也称为DA-64)、邻苯二胺(OPD)、Trinder试剂与4-氨基安替比林(4AA)组合的底物等。作为上述Trinder试剂，例如有苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等，可以使用N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺钠盐二水合物(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺钠盐一水合物(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐(DAOS)等。另外，除上述氨基安替比林以外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。这些显色底物中，如上所述，特别优选N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠(DA-64)。

上述氧化还原反应通常在缓冲液中进行，其条件根据上述生成的过氧化氢的浓度等适当确定。通常，反应液中的POD浓度为10～100000IU/L，显色浓度为0.005～30mmol/L，反应温度为15～37℃，反应时间为0.1～30分钟，pH为5～9。另外，上述缓冲液没有特别限制，例如，可以使用与上述蛋白酶处理及FAOD处理等相同的缓冲液等。

上述氧化还原反应中，例如，使用上述显色底物时，通过用分光光度计测定上述反应液的显色程度(吸光度)，可以测定过氧化氢的量。而且，例如，用该过氧化氢浓度与校正曲线等，可以求出试样中的糖化蛋白质量。

再者，已知上述甲化合物多为色素化合物，在特定的波长处显示吸收，如上所述进行吸光度测定时，例如，如果采用与使用的显色底物显色的吸收波长不同的吸收波长的甲化合物，也不会因甲化合物产生测定误差。

以下列举甲化合物的具体例及其λmax、显色底物的具体例及其λmax。由各λmax的值，例如对于显色底物(1)，可以组合(2)、(3)或(5)的甲化合物；对于显色底物(2)，可以组合(1)～(5)之任一甲化合物；对于显色底物(3)，可以组合(1)～(5)之任一甲化合物；对于显色底物(4)，可以组合(2)、(3)或(5)的甲化合物。再者，这些只是一例，其组合并没有特别限定。

(甲化合物及其λmax)

(1)5，5’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯)-4，4’-二基]-双[1-(4-硝基苯基)-3-苯基甲] λmax＝530(nm)

(2)1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(4-硝基苯基)甲

λmax＝438(nm)

(3)1-(4-碘苯基)-3-苯基-5-(4-硝基苯基)甲

λmax＝490(nm)

(4)1-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-3，5-二苯基甲

λmax＝565(nm)

(5)1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲

λmax＝433(nm)

(显色底物及其λmax)

(1)TOOS与4AA的组合 λmax＝555(nm)

(2)MAOS与4AA的组合 λmax＝630(nm)

(3)DA-64 λmax＝723(nm)

(4)DAOS与4AA的组合 λmax＝593(nm)

再者，上述过氧化氢的量，除了采用上述POD等酶的方法外，例如，也可以通过电学方法测定。

在该测定方法中，采用甲化合物的前处理工序，如上所述，只要是在氧化还原反应实际发生之前即可，并没有特别限制，然而，在上述FAOD处理后，由于产生过氧化氢，所以，优选在上述FAOD处理前进行。另外，如上所述，各处理工序可分别进行，例如，也可以如下所示组合同时进行。

1：溶血处理+前处理

2：溶血处理+前处理+蛋白酶处理

3：蛋白酶处理+FAOD处理

4：FAOD处理+POD氧化还原处理

5：蛋白酶处理+FAOD处理+POD氧化还原处理

另外，上述FAOD、POD以及显色底物的添加顺序也没有特别限制。

这样，通过使试样与甲化合物接触，不仅可避免GSH、AsA、二硫苏糖醇、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸等低分子量还原物质的影响，而且，例如，也可避免蛋白质及上述分子量范围内的还原物质的影响。

另外，在本发明的测定方法的采用上述甲化合物的前处理工序中，例如，除作为还原物质的上述甲化合物以外，也可再与各种氧化剂并用。作为上述氧化剂，例如可以使用碘乙酸钠、亚碘酸、过碘酸等卤素氧化物、EDTA-Fe、抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶等。这种氧化剂的添加量，例如，为每1μl试样0.001～0.1mg的范围。

本发明的测定方法中，只要待测物能利用氧化还原反应即可，没有特别限制，除上述糖化蛋白质以外，例如，如上所述，可以举出糖化肽、糖化氨基酸、葡萄糖、胆固醇、尿酸、肌酸酐、肌氨酸、甘油等。

例如，在通过使过氧化氢生成来测定上述各待测物的量时，例如，使葡萄糖氧化酶作用于上述葡萄糖、胆固醇氧化酶作用于上述胆固醇、尿酸酶作用于上述尿酸、肌氨酸氧化酶作用于上述肌酸酐、肌氨酸氧化酶作用于上述肌氨酸、甘油氧化酶作用于上述甘油，以使过氧化氢生成。这种过氧化氢量的测定方法可与上述同样地进行。另外，糖化肽、糖化氨基酸，例如，可与上述糖化蛋白质的测定同样地测定。

另外，如果在用上述甲化合物处理试样中的还原物质后，使来自待测物的还原物质生成，用氧化还原反应测定所生成的量，由该测定值确定上述待测物的量时，例如可以如下所示进行测定。

例如，当上述待测物为葡萄糖时，例如，在NAD和NADP等的存在下，使用葡萄糖脱氢酶使NADH和NADPH等还原物质生成。而且，使用例如硫辛酰胺脱氢酶和因还原而显色的底物，通过氧化还原反应测定来自上述待测物的还原物质NADH和NADPH。从而，如上所述，例如可以使用来自该待测物的还原物质的浓度和校正曲线等求出试样中的待测物的量。另外，例如，待测物为胆固醇时，可以使用胆固醇脱氢酶；待测物为肌氨酸时，可以使用肌氨酸脱氢酶。

作为上述因还原而显色的底物，没有特别限制，例如，可以使用2，6-二氯酚靛酚等。再者，为了得到更可靠的测定值，例如，优选在测定来自上述待测物的还原物质之前，预先测定吸光度。

这样，如果用上述甲化合物处理试样，例如，可以避免上述蛋白质等高分子量还原物质的影响。因此，分子量为1万以上的还原物质，以及蛋白质还原物质影响的场合，并不只限定于上述全血试样，对上述各种试样也适用。使用全血试样以外的试样的场合，除上述试样不同外，可以使用同样的试剂，同样地进行测定。

实施例

下面通过实施例和比较例加以说明。

(实施例1、比较例1)

该实施例是用甲化合物对试样进行前处理以排除上述试样中的还原物质的影响的实例。以下所示为使用的试剂及方法。

(Hb试样)

使用HbAlc浓度为6.7％的精制Hb冻干品。

(甲化合物)

甲化合物使用下式表示的1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲(商品名WSF3，同仁化学公司生产)。

(果糖基缬氨酸溶液)

果糖基缬氨酸(以下称作FV)按照特开平2-69644号公报制备。将上述FV溶解在精制水中，配制10mM的FV溶液。

(溶血试剂)

在含有40mM CHES及15mM MOPS的缓冲液(pH＝9.4)中混合表面活性剂(商品名Nikkol，Nikko Chemical公司生产)使达7.5％，配制溶血试剂。

(前处理试剂)

WSF3 0、0.25、1.7mM

NaN₃ 0.043g/L

CaCl₂ 2.5mM

NaCl 50mM

MES-MES·Na(pH＝5.5) 1mM

(显色试剂)

FAOD 17.5KU/L

POD 67KU/L

商品名DA-64(和光纯药工业公司生产) 70μM

Tris-HCl(pH＝7.0) 300mM

(方法)

在上述Hb试样10mg中添加10mM FV溶液0.123mL及上述溶血试剂1.877mL，配制测定样品。在该测定样品8.4μL中添加含有上述规定浓度的WSF3的前处理试剂75.6μL，于37℃下处理5分钟。之后，再添加显色试剂18.9μL，于37(℃下进行3分钟显色反应(全量102.9μL)。然后，测定该显色反应后的反应溶液在726nm处的吸光度。再者，由于WSF3的吸收波长为430nm附近，所以对DA-64的检测没有影响。

作为对照，除了使用不添加10mg上述Hb试样而将10mM FV溶液0.123mL及上述溶血试剂1.877mL混合成的物质以外，与上述同样地进行测定。作为比较例1，除了使用不添加上述WSF3而配制的前处理试剂以外，与上述实施例1同样地进行测定。

然后，将这些测定值代入下式，求出以对照的吸光度作为100％时的相对值(％)。前处理试剂中的WSF3浓度为1.7mM时的结果如下表1所示。

相对值(％)＝[(X₁-X₀)/(Y₁-Y₀)]×100

X₁：显色反应8分钟后的吸光度

X₀：显色反应开始时的吸光度

Y₁：对照的显色反应8分钟后的吸光度

Y₀：对照的显色反应开始时的吸光度

(表1)

WSF3浓度相对值

(mM) (％)

实施例 1.7 32

比较例 0 1

对照 1.7 100

这样，关于含有对利用氧化还原反应的测定有影响的还原物质Hb的测定试样，通过用甲化合物处理，可以排除上述测定试样中的还原物质的影响，提高测定的可靠性。

产业上的可利用性

如上所述，本发明的测定方法是通过在试样中添加上述甲化合物来排除试样中的还原物质的影响，所以可以进行可靠性优良的测定。因此，本发明的测定方法，例如，可适用于临床医疗的各种分析，特别是在糖尿病诊断中重要，对红细胞中的糖化血红蛋白等糖化蛋白质的测定有用。

Claims

1、利用氧化还原反应测定试样中的待测物的方法，其特征在于，在试样中添加甲化合物以排除上述试样中所含的还原物质的影响。

2、权利要求1所述的测定方法，其中在上述氧化还原反应之前，在试样中添加甲化合物以排除上述试样中所含的还原物质的影响，然后，使来自上述待测物的还原物质或氧化物质生成，通过上述氧化还原反应测定其量，从该测定值确定上述待测物的量。

3、权利要求1所述的测定方法，其中甲化合物在甲骨架的1位的氮原子、3位的碳原子及5位的氮原子中至少两处具有环结构的取代基。

4、权利要求3所述的测定方法，其中甲化合物至少在甲骨架的1位的氮原子及5位的氮原子上具有环结构的取代基。

5、权利要求4所述的测定方法，其中甲化合物在甲骨架的1位的氮原子及5位的氮原子上具有苯环(苯基)取代基。

6、权利要求5所述的测定方法，其中在甲骨架的1位的氮原子及5位的氮原子上具有苯环(苯基)取代基，上述两苯环(苯基)中的至少一个具有选自卤素基、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基及乙氧基的至少一个官能团。

7、权利要求1所述的测定方法，其中甲化合物为1-(4-碘苯基)-3-(2，4-二磺苯基)-5-(2，4-二硝基苯基)甲。

8、权利要求2所述的测定方法，其中上述氧化还原反应通过氧化酶还原来自上述待测物的氧化物质，并且是使因氧化而显色的底物氧化的显色反应，上述氧化物质的量的测定是利用上述显色反应的显色程度的测定。

9、权利要求8所述的测定方法，其中上述显色程度的测定是上述底物的检测波长处的吸光度测定。

10、权利要求9所述的测定方法，其中因氧化而显色的底物的检测波长与甲化合物的吸收波长为不同的波长。

11、权利要求2所述的测定方法，其中来自上述待测物的氧化物质为过氧化氢。

12、权利要求8所述的测定方法，其中上述氧化酶为过氧化物酶。

13、权利要求2所述的测定方法，其中待测物为选自糖化蛋白质、糖化肽及糖化氨基酸的至少一种，通过使果糖基氨基酸氧化酶作用于上述待测物，使来自上述待测物的氧化物质过氧化氢生成。

14、权利要求13所述的测定方法，其中在使上述果糖基氨基酸氧化酶作用于上述待测物之前，在上述试样中添加甲化合物。

15、权利要求13所述的测定方法，其中在使果糖基氨基酸氧化酶作用于待测物之前，使蛋白酶作用于上述待测物。

16、权利要求1所述的测定方法，其中待测物为选自糖化蛋白质、糖化肽及糖化氨基酸的至少一种。

17、权利要求16所述的测定方法，其中糖化蛋白质为糖化血红蛋白。

18、权利要求1所述的测定方法，其中上述试样中所含的还原物质为蛋白质。

19、权利要求1所述的测定方法，其中上述试样为红细胞的溶血试样。

20、权利要求17所述的测定方法，其中对于血细胞1～10体积％，相对于上述试样的甲的添加比例为0.02～2000mmol/L的范围。