CN1254841A

CN1254841A - 采用氧化还原反应的测定方法

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Publication number: CN1254841A
Application number: CN99124830A
Authority: CN
Inventors: 小森胤树; 米原聪
Original assignee: Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1998-11-17
Filing date: 1999-11-17
Publication date: 2000-05-31
Anticipated expiration: 2019-11-17
Also published as: US20020025546A1; ATE403011T1; US6514720B2; KR20000035527A; EP1002874A3; EP1002874B1; CN1198942C; KR100601272B1; US6352835B1; DE69939204D1; EP1002874A2

Abstract

提供一种用氧化还原反应测定样品中待测物的方法,可得到可靠性优异的测定值。在上述氧化还原反应之前,向样品中加入四唑鎓化合物以排除样品中所含还原物质的影响;之后,生成由上述待测物由来的还原物质或氧化物质,由氧化还原反应测定其量,由该测定值确定上述待测物的量。作为四唑鎓化合物,例如可以使用2－(4－碘苯基)－3－(2,4－二硝基苯基)－5－(2,4－二磺苯基)－2H－四唑鎓盐。

Description

采用氧化还原反应的测定方法

本发明涉及用氧化还原反应测定样品中待测物的方法。

此前，例如用氧化还原反应测定样品中待测物的量的方法已广泛被采用。例如，也适用于在生化分析和临床检查中的糖基化蛋白质的测定。

例如，血液中的糖基化蛋白质，特别是红细胞中的糖基化血红蛋白(HbAlc)，由于它能反映生物体血糖值过去的情况，故在糖尿病诊断及治疗中是重要的指标。例如，红细胞中的糖基化蛋白质可用氧化还原反应按下述方法进行测定。

首先，配制使红细胞溶血的样品，用适当的蛋白酶处理该溶血样品后，再用果糖基氨基酸氧化酶(以下称作FAOD)进行处理，使生成过氧化氢。该过氧化氢的量与红细胞中的糖基化蛋白质的质量相对应。然后，往该样品中添加过氧化物酶(以下称作POD)和还原剂，该POD作为催化剂在上述过氧化氢和上述还原剂之间引起氧化还原反应。此时，如果采用氧化能使能生色的还原剂作为这类还原剂，则可通过测定其生色来测定上述过氧化氢量，结果可知红细胞中的糖基化蛋白质量。

然而，在血液中通常存在抗坏血酸(AsA)和胆红素等各种还原物质，还在红细胞中存在谷胱甘肽(GSH)等各种还原物质。由于这些还原物质既可使上述过氧化氢还原，又阻碍上述氧化还原反应，能把上述还原剂生色后还原而使其退色。因此，要准确测定红细胞中糖基化蛋白质量是困难的，这是存在的问题。

另外，由于各种样品含有的还原物质浓度不一定，所以，测定的精确度差，这也是存在的问题。

为了避免这些问题，可采用例如往上述样品中添加各种氧化剂的方法。例如，在特开昭56-151358号公报中公开了采用碘酸、过碘酸等卤氧化物作为氧化剂的方法，在特开昭57-13357号公报、特开昭57-161650号公报、特开昭59-193354号公报、特开昭62-169053号公报、特开平3-30697号公报中公开了使用钴、铁、铈等金属配合物作为氧化剂的方法。

然而，即使在用这些氧化剂的场合，也不能充分避免对上述测定的影响，特别是，在待测物为红细胞内成分时，上述氧化剂使效果降低。

因此，本发明的目的是提供一种采用氧化还原反应来测定样品中待测物的测定方法，该法可得到可靠性优异的测定值。

为了达到上述目的，本发明的测定方法是用氧化还原反应来测定样品中待测物的测定方法，其特征在于，在上述氧化还原反应之前，先往样品中添加具有四唑环结构的四唑鎓化合物，以排除样品中所含的还原物质的影响，然后，使上述待测物产生还原物质或氧化物质，用氧化还原反应测定其含量，根据该测定值来确定上述待测物的量。上述的四唑鎓化合物为含四唑环结构的化合物。

本发明人进行了深入的研究，结果弄清，当采用先有技术的方法时，例如，并不是不能排除上述GSH和AsA那样的低分子量还原物质的影响，而是不能排除蛋白质那样的高分子量还原物质的影响。因此，本发明人发现，采用上述四唑鎓化合物，例如，不仅能排除上述低分子量还原物质的影响，而且也能排除其他还原物质的影响，从而完成了本发明的测定方法。按照本发明的测定方法，由于可以更可靠地求出待测物的量，所以，在临床医疗等中的各种检查是有用的。

在本发明的测定方法中，上述四唑鎓化合物优选是在其四唑环上至少在两处具有环状结构的取代基，更优选是在三处具有环状结构取代基。

如上所述，当上述四唑鎓化合物的四唑环上至少在两处具有环状结构取代基时，优选是在上述四唑环的2位及3位上具有上述的取代基。另外，当四唑鎓化合物在三处具有环状结构取代基时，优选是在上述四唑环的2位、3位及5位上具有上述的取代基。

在本发明的测定方法中，优选是至少有两处的环状结构取代基的环状结构为苯环。另外，作为苯环以外的环状结构取代基，可以举出，例如，在环状骨架上含有S或O，并且是共振结构的取代基，例如，噻吩基和噻唑基等。

在本发明的测定方法中，上述四唑鎓化合物优选是在其四唑环上至少在三处具有环状结构的取代基，并且在上述环状结构取代基中至少有两个环状结构取代基的环状结构为苯环。

在本发明的测定方法中，优选是至少一个环状结构取代基具有官能团，更优选是具有多个上述的官能团。

作为上述官能团，优选是吸电子性官能团，例如，可以举出，卤原子、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基、硝基、羟基、磺基等。其他的，例如，除了上述官能团以外，还可以举出，含氢过氧基、氧基、环氧基、环二氧基、桥氧基等含氧的特性基团，以及含有巯基、烷基硫代、甲基硫代甲基、硫代桥氧基、亚磺基、苯磺酰基(benzenesnlfonyl)、苯磺酰基(phenylsulfonyl)、对甲苯磺酰基(p-toluenesulfonyl)、对甲苯磺酰基(p-tolylsulfonyl)、甲苯磺酰基、氨磺酰基、异氰硫基等含硫的特性基团。在这些吸电子官能团中，理想的是硝基、磺基、卤素原子、羧基、羟基、甲氧基和乙氧基。另外，除上述吸电子官能基以外，例如，还可以举出苯基(C₆H₅-)、苯乙烯基(C₆H₅CH＝CH-)等不饱和烃基等。还有，上述官能团也可以解离为离子。

在本发明的测定方法中，上述四唑鎓化合物优选是在其四唑环的2位及3位上具有苯环，并且在这些苯环中的至少一个具有选自卤素原子、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基及乙氧基中的至少一个官能团。上述两个苯环也可以具有该官能团。在上述苯环中，可在其任一个位置(邻、间、对)上具有该官能团。另外，对官能团的数目没有特别限制，并且既可以是同一种官能团，也可以是不同的官能团。

在本发明的测定方法中，上述四唑鎓化合物，例如，是在上述四唑环的2位、3位及5位上具有苯环结构取代基的化合物，可以举出，例如，2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3，3′-(1，1′-联苯-4，4′-二基)-双(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3，3′-〔3，3′-二甲氧基-(1，1′-联苯)-4，4′-二基〕-双〔2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐〕、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(对二苯基)四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-(对二苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑鎓盐以及2，5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑鎓盐等。

另外，上述四唑鎓化合物不局限于上述那些化合物，除此之外，也可以使用在上述四唑环的两处具有苯环结构的取代基以及在一处具有其他环状结构取代基的化合物，例如，可举出，2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-〔4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基〕-2H-四唑鎓盐、2，2′-二苯并噻唑基-5，5′-双〔4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基〕-3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)二(四唑鎓盐)以及3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓盐等。

另外，也可以使用上述四唑环的两处无苯环结构取代基和一处无环状结构取代基的四唑鎓化合物，例如，可举出，2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐以及2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐等。

如上所述，在上述四唑鎓化合物中，优选是具有三个环状结构取代基的化合物，更优选是该环状结构具有三个苯环结构的取代基、并且有多个吸电子性官能团的四唑鎓化合物，特别优选是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。还有，这些四唑鎓化合物既可以用其盐，也可以用其离子状态。

就本发明的测定来说，上述四唑鎓化合物添加量没有限制，可根据样品的种类及上述还原物质的量来决定。具体来说，例如，优选上述四唑鎓化合物的添加量每μl样品为0.001～100μmol，更优选0.005～10μmol，最优选0.01～1μmol。

在本发明的测定方法中，当样品为全血时，添加上述四唑鎓化合物优选是使每1μl全血达到0.001～10μmol，更优选是0.005～5μmol，特别优选是0.01～1μmol。具体地说，当上述四唑鎓化合物为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐时，其添加量优选是使每1μl全血达到0.001～0.4μmol的范围，更优选是0.005～0.1μmol的范围，特别优选是0.01～0.07μmol的范围。

在本发明的测定方法中，如果来自上述待测物的氧化物质为过氧化氢，则优选是利用氧化还原反应来测定上述过氧化氢的量。

为了测定上述过氧化氢的量，优选是使用氧化酶和氧化产生的生色底物(下面称为生色性底物)来进行测定。

作为上述的生色性底物，没有特别限制，然后，为了能够高灵敏度地检测，优选使用例如，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲基氨基)二苯基胺钠。另外，上述氧化酶优选为过氧化酶。

就本发明的测定方法来说，上述样品的种类没有特别限制，除了全血，血浆，血清、血细胞外，其它如尿，髓液等生物材料，果汁等饮料以及酱油、汤等食品样品也可适用。

在本发明的测定方法中，作为待测物，可举出红细胞内成分、血浆中成分、血清成分、尿成分、髓液成分等，然而，优选是红细胞内的成分。作为上述红细胞内成分，例如，可以举出，糖基化血红蛋白、糖基化白蛋白等糖基化蛋白质，糖基化肽、糖基化氨基酸、葡萄糖、尿酸、胆甾醇、肌酸内酰胺、肌氨酸、甘油等，其中优选是糖基化蛋白质。例如，在测定上述红细胞成分的场合，既可以把全血直接溶血后作为样品，也可以从全血中分离出红细胞，与上述那样把红细胞溶血后获得的产物作为样品。

在本发明的测定方法中，优选是通过用FAOD把上述糖基化蛋白质的糖部分进行氧化分解来产生过氧化氢。另外，使上述糖基化肽、糖基化胺与FAOD反应，也同样是优选的。还有，上述糖基化蛋白质及糖基化肽，优选是根据需要，在上述FAOD处理前，用蛋白酶进行处理。

作为上述FAOD，优选是能够催化以下式(1)表示的反应的FAOD。

〔化1〕

……(1)

在上述式(1)中，R¹意指羟基或来自糖基化反应前的糖的残基(糖残基)。对于上述糖残基(R¹)来说，当反应前的糖为醛糖时，R¹为醛糖的残基，而当反应前的糖为酮糖时，R¹为酮糖的残基。例如，当反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多利重排，反应后的结构变成果糖结构，然而，此时，糖残基(R¹)转变成葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R¹)，例如，可用-[CH(OH)]_n-CH₂OH表示，n为0～6的整数。

在上述式(1)中，R²没有特别限制，然而，例如，在糖基化氨基酸、糖基化肽或糖基化蛋白质的情况、α-氨基糖基化的情况与其他氨基糖基化的情况不同。

在上述式(1)中，在α-氨基发生糖基化的情况下，R²为用下式(2)表示的氨基酸残基或肽残基。

〔化2〕

-CHR³-CO-R⁴ ……(2)

在上式(2)中，R³表示氨基酸的侧链基团。另外，R⁴表示羟基、氨基的残基或肽的残基，例如，可用下式(3)表示。在下式(3)中，n为大于0的整数，R³与上述同样，表示氨基酸侧链基团。

〔化3〕

-(NH-CHR³-CO)_n-OH ……(3)

另外，在上述式(1)中，当α-氨基以外的氨基发生糖基化(氨基酸侧链基发生糖基化)的情况下，R²可用下式(4)表示。

〔化4〕

在上式(4)中，R⁵表示氨基侧链基中被糖基化的氨基以外的部分。例如，被糖基化的氨基酸为赖氨酸的情况下，R⁵为：

-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-例如，被糖基化的氨基酸为精氨酸的情况下，R⁵为：

-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH(NH₂)-

另外，在上式(4)中，R⁶为氢原子、氨基酸残基或肽残基，例如，可有下式(5)表示。还有，在下式(5)中，n为0以上的整数，R³与上述同样地表示氨基酸侧链基。

〔化5〕

-(CO-CHR³-NH)_n-H ……(5)

另外，在上式(4)中，R⁷为羟基、氨基残基或肽残基，例如，可有下式(6)表示。还有，在下式(6)中，n为大于0的整数，R³与上述同样地表示氨基酸侧链基。

〔化6〕

-(NH-CHR³-CO)_n-OH ……(6)

在本发明的测定方法中，对上述样品中的还原物质没有特别限制，然而，其分子量例如一般在10,000以上，优选为10,000～3,000,000的范围，更优选为10,000～300,000的范围，特别优选为30,000～100,000的范围。

另外，样品中的上述还原物质优选为蛋白质。该蛋白质的分子量为，例如一般在3,000以上，优选为3,000～3,000,000的范围，更优选为10,000～300,000的范围，特别优选为30,000～100,000的范围。作为这样的还原物质，例如，可以举出血红蛋白、球蛋白、球蛋白、白蛋白等，其中优选为血红蛋白。

本发明的实施方案

下面，对本发明的测定方法，以测定血细胞中的糖基化蛋白质为例加以说明。

首先，把全血直接进行溶血，或者，采用离心分离等常规方法从全血中分离出血细胞组分，使其溶血，配制溶血样品，对该溶血方法没有特别限制，例如，可能使用，采用表面活性剂的方法，用超声波的方法，利用渗透压差的方法等。其中，从操作简便性考虑，优选采用上述表面活性剂的方法。

作为上述表面活性剂，例如，可以使用聚氧亚乙基-对叔辛基苯基醚(Triton类表面活性剂等)，聚氧亚乙基山梨糖醇烷基酯(Tween类表面活性剂等)，聚氧亚乙基烷基酯(Brij类表面活性剂等)等非离子型表面活性剂，具体地可以举出，例如Triton X-100、Tween-20、Brij35等。用上述表面活性剂时的处理条件，通常是处理溶液中的血细胞浓度为1～10％(体积)时，添加表面活性剂，使在上述处理溶液中的浓度达到0.01～5％(重量)，于室温搅拌数秒(约5秒)～10分钟左右即可。

然后，往上述溶血样品添加上述具有四唑环结构的四唑鎓化合物，进行样品的前处理。

例如，当前处理溶液中的血细胞浓度为1～10％(体积)的情况下，添加上述四唑鎓化合物优选使其浓度达到0.02～2000 mmol/L的范围，更优选是0.1～1000mmol/L的范围，特别优选是0.4～200mmol/L的范围。具体地说，当上述四唑鎓化合物为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐时，优选将其添加到浓度为0.02～80mmol/L的范围，更优选是0.1～20mmol/L的范围，特别优选是0.2～15mmol/L的范围。

上述前处理，通常在缓冲液中进行。作为该缓冲液，可以使用例如CHES缓冲液、CAPSO缓冲液、CAPS缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、EPPS缓冲液、HEPES缓冲液等。其pH值，例如在6～13的范围内，优选在8～12范围内，更优选在9～11的范围内。另外，在上述前处理溶液中的该缓冲液的最终浓度，例如为1～400mmol/L的范围，优选为10～200mmol/L的范围。

对该前处理条件没有特别限制，然而，通常是，温度为10～37℃，处理时间10秒～60分钟。

上述四唑鎓化合物可以直接使用，然而，从操作的简便性及处理效率等考虑，优选是溶解在溶剂中作为四唑鎓化合物溶液使用。该溶液的浓度应根据四唑鎓化合物的种类(例如，分子量)等适宜地确定，例如在0.01～120mmol/L的范围内，优选在0.1～50mmol/L的范围内，更优选在0.2～20 mmol/L的范围内。作为溶剂，可以使用例如蒸馏水、生理盐水和缓冲液等，而作为该缓冲液，例如可以使用与上述同样的缓冲液，还有，上述四唑鎓化合物，既可以用一种，也可以两种以上并用。

下面，对该前处理完成后的溶血样品进行蛋白酶处理。这是为了在后面的处理中，使所用的FAOD易于与待测物作用。

对上述蛋白酶的种类没有特别限制，例如可以使用蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、氨肽酶等。该蛋白酶处理，通常在缓冲液中进行，其处理条件应根据使用的蛋白酶种类、作为待测物的糖基化蛋白质的种类及其浓度来适当确定。

具体的是，例如采用蛋白酶K作为上述蛋白酶来处理上述前处理完成的溶血样品的场合，通常，反应液中的蛋白酶浓度为10～30,000mg/L，反应液中的血细胞浓度为0.05～15％(体积)，反应温度15～37℃，反应时间为1分钟～24小时，pH为6～12。另外，对上述缓冲液的种类也没有特别限制，例如可以用Tris盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液等。

接着，把通过上述蛋白酶处理得到的分解物，用上述FAOD进行处理。通过这种FAOD处理来催化上述式(1)表示的反应。

这种FAOD处理优选在与上述蛋白酶处理同样的缓冲液中进行。其处理条件应根据使用的FAOD的种类、作为待测物的糖基化蛋白质的种类及其浓度来适当确定。

具体的是，例如，反应液中的FAOD浓度为50～50,000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.01～1％(体积)，反应温度为15～37℃，反应时间为1～60分钟，pH为6～9。另外，对上述缓冲液的种类也没有特别限制，可以使用与上述蛋白酶处理同样的缓冲液。

然后，用POD及上述生色底物，通过氧化还原反应测定在用上述FAOD处理时生成的过氧化氢。

作为该生色底物，例如可举出N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲基氨基)二苯胺钠、邻苯二胺(OPD)、特林达(トサンダ-)试剂和4-氨基安替比林组合的底物等。作为该特林达试剂，例如可举出苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺和萘胺衍生物等。另外，除上述氨基安替比林以外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉腙(MBTH)以及磺化的甲基苯并噻唑啉腙(SMBTH)等。在这些生色性底物中，特别理想的，如上所述，为N-(羧甲基氨基碳基)-4，4′-双(二甲基氨基)二苯胺钠。

上述氧化还原反应，通常在缓冲液中进行，其条件是根据上述生成的过氧化氢的浓度等适当确定。通常，反应液中的POD浓度为10～100,000IU/L，生色性底物浓度为0.005～30mmol/L，反应温度为15～37℃，反应时间为0.1～30分钟，pH为5～9。另外，上述缓冲液没有特别限制，例如可以使用与上述蛋白酶处理及FAOD处理等同样的缓冲液。

在上述氧化还原反应中，例如，在用上述生色性底物的场合，可以通过分光光度计测定上述反应液的生色程度(吸光度)来测出过氧化氢的量。而且，采用该过氧化氢浓度液和标准曲线等，可以求出样品中糖基化蛋白质的质量。

还有，上述过氧化氢的量，除了用上述POD等酶的方法外，例如，用电学方法也可以测定。

在该测定方法中，采用四唑鎓化合物的前处理工序，如上所述，只要在氧化还原反应实际发生之前即可，对此没有特别限制，然而，在上述FAOD处理后，因为产生过氧化氢，所以，在上述FAOD处理前进行是理想的。另外，如上所述，各处理工序可分别进行，然而，按下述组合也可同时进行。

1.溶血处理+前处理

2.溶血处理+前处理+蛋白酶处理

3.蛋白酶处理+FAOD处理

4.FAOD处理+POD氧化还原处理

5.蛋白酶处理+FAOD处理+POD氧化还原处理。

另外，上述FAOD、POD以及生色底物的添加顺序也没有特别限制。

这样，通过使样品与四唑鎓化合物接触，不仅GSH、AsA、二硫苏糖醇、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸等低分子量还原物质的影响可避免，而且，蛋白质及上述分子量范围内的还原物质的影响也可避免。

另外，在用本发明测定方法的上述四唑鎓化合物的前处理工序中，也可再与上述四唑鎓化合物以外的氧化剂并用。作为该氧化剂，例如可以用碘醋酸钠、亚碘酸、过碘酸等卤素氧化物，EDTA-Fe、抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶等。这种氧化剂的添加量，例如，每1μl上述样品中为0.001～0.1mg。

在本发明的测定方法中，只要待测物能利用氧化还原反应即可，对此没有特别限制，除上述糖基化蛋白质以外，例如，可以举出上述的糖基化肽、糖基化氨基酸、葡萄糖、胆甾醇、尿酸、肌酸内酰胺、肌氨酸和甘油等。

例如，在通过产生过氧化氢来测定上述各种待测物量的情况下，例如，使葡萄糖氧化酶作用于上述葡萄糖、胆甾醇氧化酶作用于上述胆甾醇、尿酸氧化酶作用于上述尿酸、肌氨酸氧化酶作用于上述肌酸内酰胺、肌氨酸氧化酶作用于上述肌氨酸、甘油氧化酶作用于上述甘油，以使其产生过氧化氢。这种过氧化氢量的测定方法可与上述方法同样地进行。另外，糖基化肽和糖基化氨基酸，可与上述糖基化蛋白质的测定方法同样地加以测定。

还有，如果在用上述四唑鎓化合物处理所述样品中的还原物质后，使待测物中的还原物质生成，用氧化还原反应测定所生成的量，并由该值确定测定对象中的还原物质的量时，即可用如下的方法进行测定。

例如，当待测物是葡萄糖时，可在NAD和NADP的存在下用葡萄糖脱氢酶生成NADH和NADPH等还原物质。因此，可以用例如，硫辛酰胺脱氢酶和可以还原生色的底物通过氧化还原反应来对上述待测物来源的还原物质NADH和NADPH进行测定。从而，如上所述，可以使用待测物由来的还原物质的量和标准曲线，得到待测物的量。另外，例如，待测物是胆固醇时可以使用胆固醇脱氢酶，肌氨酸时可以使用肌氨酸脱氢酶。

对上述的还原生色底物来说，没有特别限制，例如，可以使用为了排除样品中的还原物质的影响而添加的生色性四唑鎓化合物。还有，为了使测定波长范围更大，可以使用与样品前处理中所用不同的生色性四唑鎓化合物。其他的生色性四唑鎓化合物有例如，2，6-二氯苯酚靛酚。另外，为了得到更可靠的测定值，例如，可以在对待测物由来的还原物质测定前，预先测定吸光度。

这么一来，如果用上述四唑鎓化合物处理样品，不仅上述低分子量还原物质的影响，而且上述蛋白质等高分子量还原物质的影响也可以避免。因此，在分子量在1万以上的还原物质，以及蛋白质等还原物质影响的场合，并不仅仅适用于上述全血样品，而且对上述各种样品也适用。还有，在用全血样品以外的样品的场合，除样品不同外，可用同样的样品，用同样的方法进行测定。

实施例

下面，通过实施例和比较例加以说明。

实施例1和比较例1

该实施例是用四唑鎓化合物对样品进行前处理，是一个排除上述样品中还原物质影响的实例。下面示出所用的试剂及方法。

(表面活性剂溶液)

把聚氧亚乙基(10)一对叔辛基苯基醚(下面称作Triton X-100)与纯净水混合配制，使浓度达到0.1％(体积)。

(WST-3溶液)

把2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓单钠盐(WST-3，同仁化学研究所社制)溶解在纯净水中，使浓度达到1mmol/L。

(果糖基缬氨酸溶液)

果糖基缬氨酸(以下称作FV)，按照特开平2-69644号公报制造(下同)。把上述FV添加至0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH2.0)，使其浓度达到50μmol/L。

(氧化还原反应溶液A)

FAOD(旭化成工业社制：下同) 28.6KU/L

POD(东洋纺社制：下同) 14.3KU/L

DA-64(和光纯药工业社制：下同) 28.6μmol/L

蒸馏水其余量

把健康人的全血进行离心分离(1630G，10分钟)回收血细胞。然后，用上述Triton X-100溶液把该全血稀释20倍(体积)，以该溶血的样品作为溶血样品。

往上述样品50μl中添加0.5mol/L CHES缓冲液(pH9.0)50μl后，添加上述WST-3溶液100μl，搅拌后，于37℃处理10分钟。经上述处理后，在上述处理过的样品中添加上述FV溶液400μl，然后添加上述氧化还原反应溶液A1400μl，开始反应。然后，在726nm测定反应溶液的吸光度。

作为对照物，除了用蒸馏水代替上述溶血样品之外，其余与上述同样操作，进行测定。作为比较例1，除了用蒸馏水代替上述WST-3溶液以外，其余与上述实施例1同样操作进行测定。

然后，把这些测定值代入下式(数1)中，求出以对照物吸光度作为100％时的相对值(％)。这些结果示于下表1。

〔数1〕

相对值(％)＝(X₁-X_o/Y₁-Y_o)×100

X₁：5分钟后的吸光度

X_o：反应开始时的吸光度

Y₁：对照物5分钟后的吸光度

Y_o：对照物反应开始时的吸光度

〔表1〕

相对值(％)

实施例1 83

比较例1 84

对照 100

这样，通过用四唑鎓化合物处理血细胞的溶血样品，可以排除上述样品中还原物质的影响，测定的可靠性得到提高。

(比较例2及比较例3)

与实施例1同样操作回收血细胞，用1.0％(体积)的Triton X-100溶液将其稀释5倍(体积)，以此溶血的样品作为溶血样品。往该溶血样品50μl中添加1.0mol/L的碘醋酸钠(Aldorich社制：下同)溶液150μl，搅拌后，于37℃处理10分钟。经前处理后，往前处理完成的样品中添加上述FV溶液400μl，接着，添加上述氧化还原反应溶液A1400μl，开始反应。然后，与上述实施例1同样操作，测定吸光度。求出对对照物的相对值(％)。以此作为比较例2。还有，作为对照物，除了用蒸馏水代替上述溶血样品外，其余与上述同样进行测定。

比较例3，除了用添加蒸馏水代替上述碘醋酸钠溶液以外，其余与上述实施例1同样操作进行测定。结果示于下表2。

〔表2〕

相对值(％)

比较例2 37

比较例3 35

对照物 100

如上述表2所示，可以确认，用以前所用的氧化剂碘醋酸钠，无法避免溶血样品中还原物质的影响。

(比较例4)

该比较例是把红细胞溶血样品按分子量进行分级后，用碘醋酸钠处理的例子。

把添加了肝素的健康人血液10ml进行离心分离(1630G，10分钟)，用移液管除去血浆层和白血细胞层。往得到的红细胞层添加生理盐水，为使上述红细胞不溶血，在充分混合后，与上述同样进行离心分离，除去上清液。该一系列洗涤操作反复进行3次。然后，往所得到的红细胞添加同量(体积)的蒸馏水，使完全溶血后，再度进行离心分离(4530G，10分钟)，以除去了膜的成分的溶液作为样品1。

然后，把样品1用CENTRIPREP 30(ミリポァ社制)通过进行离心分离(1630G，4小时)进行超滤。把残留在上述CENTRIPREP 30中的分子量在3万以上的级分作为样品2，滤液作为样品3。

接着，把上述样品3再用CENTRIPREP 10(ミリポァ社制)，通过离心分离(1630G，2小时)进行超滤。在上述CENTRIPREP 10中残留的分子量在1万以上至小于3万的级分作为样品4，把滤液作为样品5。

而且，往用蒸馏水稀释上述各种样品的稀释溶液200μl中添加上述FV溶液400μl，接着，添加上述氧化还原反应溶液A1400μl，开始反应。然后，与上述实施例1同样操作，测定吸光度，求出与对照物的相对值(％)。还有，把上述样品1～2用蒸馏水稀释80倍，而把样品3～样品5稀释10倍。作为对照物，除了用蒸馏水代替上述溶血样品外，其余与上述同样操作，进行测定。

另外，往上述各样品的稀释溶液50μl中添加上述碘醋酸钠溶液150μl，搅拌后，于37℃处理10分钟。并且，往上述处理完成的稀释样品中添加上述FV溶液400μl，接着，添加上述氧化还原反应溶液A1400μl，开始反应。与上述实施例1同样进行操作，测定吸光度。求出对对照物的相对值(％)。这些结果示于下表3。

〔表3〕

相对值(％)

样品1 0

样品2 7

样品3 93

样品4 100

样品5 93

样品1+碘醋酸钠 0

样品2+碘醋酸钠 8

样品3+碘醋酸钠 98

样品4+碘醋酸钠 100

样品5+碘醋酸钠 98

对照物 100

如上述表3所示，样品1(粉的制备)和样品2(分子量3万以上的级分)几乎无法测定。另外，即使用碘乙酸钠处理上述样品1和样品2，同样也是几乎无法测定。因此，用碘醋酸钠，对于1万以上，特别是3万以上的还原物质的影响几乎无法避免。

(实施例2，比较例5)

该实施例是用各种四唑鎓化合物处理血液样品来排除上述样品中还原物质影响的例子。下面示出所用的四唑鎓化合物的化合物名称及其结构。

(1)在四唑环的三处具有苯环结构取代基的四唑鎓化合物

(1-1)WST-1

2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓，单钠盐

〔化7〕

(1-2)WST-3

2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓，单钠盐

〔化8〕

(1-3)WST-8

2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓，单钠盐

〔化9〕

(1-4)INT

2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物

〔化10〕

(1-5)Neo-TB

3，3′-(1，1′-联苯-4，4′-二基)-双(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓氯化物

〔化11〕

(1-6)NTB

3，3′-〔3，3′-二甲氧基-(1，1′-联苯)-4，4′-二基〕-双〔2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物〕〔化12〕

(1-7)B3292，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓氯化物〔化13〕

(1-8)D08832，5-二苯基-3-(对二苯基)四唑鎓氯化物〔化14〕(1-9)D08842，3-二苯基-5-(对二苯基)四唑鎓氯化物〔化15〕

(1-10)D09152，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓氯化物〔化16〕

(1-11)T3242，5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑鎓氯化物〔化17〕

(1-12)T3262，5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑鎓氯化物〔化18〕

(2)在四唑环的两处具有苯环结构取代基，并在一处具有其他环状结构取代基的四唑鎓化合物

(2-1)B0325

2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓氯化物

〔化19〕

(2-2)WST-4

2-苯并噻唑-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-〔4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基〕-2H-四唑鎓〔化20〕

(2-3)WST-5

2，2′-二苯并噻唑基-5，5′-双〔4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基〕-3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，′4-亚联苯基)二(四唑鎓)，二钠盐

〔化21〕

(2-4)MTT

3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓氯化物

〔化22〕

(3)在四唑环的两处具有苯环结构取代基，并在一处具有非苯环结构取代基的四唑鎓化合物

(3-1)B0293

2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓氯化物

〔化23〕

(3-2)B2952，3-二苯基-5-羧基四唑鎓氯化物〔化24〕

(3-3)B3132，3-二苯基-5-甲基四唑鎓氯化物〔化25〕

(3-4)B3192，3-二苯基-5-乙基四唑鎓氯化物〔化26〕

WST-1、WST-3、WST-8、WST-4、WST-5、INT、MTT、NTB、Neo-TB为同仁化学研究所制，其他为东京化成社制。

(FV溶液)

往0.145mol/L KPB(pH7.0)中添加上述FV，使浓度达到10μmol/L，配制FV溶液。

(氧化还原反应溶液B)

FAOD 73KU/L

POD 219KU/L

DA64 146μmol/L

蒸馏水其余量

往1.0mol/L CAPSO缓冲液(pH10.0)25μl中添加上述10％(体积)Triton X-100溶液41.3μl及健康人的全血1.65μl，用蒸馏水定量至250μl。然后，用纯净水将其稀释3倍(体积)，以此作为溶血样品。

往上述溶血样品250μl中添加各种四唑鎓化合物溶液150μl，搅拌后，于37℃处理60分钟。然后，往上述处理完成的样品25μl中添加上述FV溶液55μl后，添加上述氧化还原反应溶液B15μl，反应开始。然后，与上述实施例1进行同样操作，测定吸光度，求出对对照物的相对值(％)。还有，上述四唑鎓化合物的浓度，对WST-5为0.5mmol/L，对其他的溶液，浓度为5mmol/L。

作为对照物，除了用蒸馏水代替上述溶血样品外，其余与上述同样操作，进行测定。作为比较例5，除了用蒸馏水代替上述四唑鎓化合物以外，其余与上述实施例1同样操作，进行测定。这些结果示于下表4。

〔表4〕

四唑鎓化合物相对值(％)

1-1 90

1-2 94

1-3 89

1-4 90

1-5 88

1-6 94

1-7 94

1-8 91

1-9 93

1-10 91

1-11 91

1-12 74

2-1 81

2-2 42

2-3 44

2-4 47

3-1 76

3-2 74

3-3 74

3-4 68

比较例5 35

对照物 100

如上表4所示，通过用各种四唑鎓化合物处理溶血样品，可提高测定值的可靠性。特别是，在四唑环的三处具有苯环结构取代基的四唑鎓化合物(1-1)～(1-12)，可得到可靠性更优异的测定值。

(实施例3)

该实施例是用WST-3、WST-1、WST-8及INT作为四唑鎓化合物来改变处理时pH值的例子。下面示出所用的缓冲液。

(缓冲液)

1.0mol/L CHES 缓冲液(pH9.0)

1.0mol/L CAPSO 缓冲液(pH10.0)

1.0mol/L CAPS 缓冲液(pH11.0)

除了分别用上述各缓冲液以外，其余与上述实施例2同样操作，用上述各种四唑鎓化合物进行处理，进行吸光度的测定。还有，把WST-3的pH10.0的吸光度作为100％来求相对值。结果是，对上述各种四唑鎓化合物，即使用上述各种缓冲液(pH9、10、11)，它们的相对值为100％，未发现pH的影响。

(实施例4，比较例6)

该实施例是把反应溶液中全血样品的最终稀释倍数设定为约100倍，用WST-3进行处理的例子。

除了用健康者全血33μl及1.0mol/L CAPSO缓冲液(pH10)50μl以外，其余与上述实施例2同样操作，进行溶血，通过添加蒸馏水125.7μl，定量至250μl。然后，用蒸馏水将其稀释3倍(体积)，以此作为溶血样品。

往上述溶血样品25μl中添加5mmol/L的WST-3溶液15μl，搅拌后，于37℃处理5分钟。然后，往上述处理过的样品中添加6μmol/LFV溶液55μl后，添加上述氧化还原溶液B15μl，反应开始。然后，与上述实施例1同样操作，测定吸光度，求出对对照物的相对值(％)作为对照物，除了用蒸馏水代替上述溶血样品以外，其余与上述同样操作，进行测定。作为比较例6，除了用蒸馏水代替上述WST-3溶液以外，其余与上述同样操作，进行测定。这些结果示于下表5。

〔表5〕

相对值(％)

实施例4 80

比较例6 0

对照物 100

在实施例4中，由于全血样品的最终稀释倍数降低，即使反应溶液中的还原物质浓度增高，仍可排除上述表5中所示的还原物质的影响，可得到可靠性优良的测定值。与此相反，在未用WST-3处理的比较例6中，人们发现，反应一开始即稍微生色，然而，马上退色，经过5分钟后完全退色。因此，不能测定吸光度，故上表5中所示的相对值为0％。

如上所述，本发明的测定方法是通过往样品中添加上述四唑鎓化合物来排除样品中还原物质的影响，故可以进行可靠性优异的测定。因此，本发明的测定方法，例如，可适用于临床医疗的各种分析，特别是在糖尿病诊断中是重要的，对红细胞中糖基化血红蛋白等糖基化蛋白质的测定是有用的。

Claims

1.用氧化还原反应测定样品中待测物的方法，该测定方法是在上述氧化还原反应之前，往样品中添加具有四唑环结构的四唑鎓化合物以排除上述样品中所含的还原物质的影响，然后，使上述待测物产生还原物质或氧化物质，通过氧化还原反应测定其含量，根据该测定值来确定上述待测物的量。

2.权利要求1所述的测定方法，其中四唑鎓化合物至少在两处具有四唑环结构的取代基。

3.权利要求2所述的测定方法，其中至少有两个环状结构的取代基的环结构为苯环。

4.权利要求1中所述的测定方法，其中四唑鎓化合物的四唑环至少在三处具有环状结构的取代基，且其中环状结构取代基中，至少两个具有环状结构的取代基的环状结构为苯环。

5.权利要求2所述的测定方法，其中至少一个环状结构的取代基为具有吸电子性官能团。

6.权利要求5所述的测定方法，其中吸电子性官能团为选自卤素原子、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基、硝基、羟基和磺基中的至少一种官能团。

7.权利要求1中所述的测定方法，其中，四唑鎓化合物为在四唑环的2位和3位具有苯环、所述苯环中的至少一个具有选自卤素原子、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基和乙氧基中的至少一种官能团。

8.权利要求1中所述的测定方法，其中，四唑鎓化合物为选自2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3，3′-(1，1′-联苯-4，4′-二基)-双(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3，3′-〔3，3′-二甲氧基-(1，1′-联苯)-4，4′-二基〕-双〔2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐〕、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(对二苯基)四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-(对二苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑鎓盐以及2，5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑鎓盐中的至少一种化合物。

9.权利要求1中所述的测定方法，其中四唑鎓化合物为2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。

10.权利要求1中所述的测定方法，其中，添加四唑鎓化合物，使每1μl样品中达到0.001～100μmol。

11.权利要求1所述的测定方法，其中样品是全血且添加四唑鎓化合物使达到每μl全血0.001～100μmol。

12.权利要求9所述的测定方法，其中样品为全血且添加2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐，使在每1μl全血中达到0.001～0.4μmol。

13.权利要求1中所述的测定方法，其中来自被测物的氧化物质为过氧化氢，氧化还原反应的测定为对上述过氧化氢量的测定。

14.权利要求13所述的测定方法，其中，过氧化氢量的测定是采用过氧化物酶和通过氧化产生颜色的底物的测定。

15.权利要求14所述的测定方法，其中底物是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲基氨基)二苯基胺钠。

16.权利要求1中所述的测定方法，其中待测物为红细胞内的成分。

17.权利要求13所述的测定方法，其中待测物为红细胞内的糖基化蛋白质，该方法是用果糖基氨基酸氧化酶来使上述糖基化蛋白质的糖部分进行氧化分解而生成过氧化氢。

18.权利要求1中所述的测定方法，其中样品中还原物质的分子量为10,000以上。

19.权利要求1中所述的测定方法，其中样品中还原物质为蛋白质。

20.权利要求1中所述的测定方法，其中样品中还原物质为血红蛋白。