KR20000035527A

KR20000035527A - 산화환원반응을 이용한 측정방법

Info

Publication number: KR20000035527A
Application number: KR1019990051069A
Authority: KR
Inventors: 고모리츠구키; 요네하라사토시
Original assignee: 도이 시게루; 가부시키가이샤 교토 다이이치 가가쿠
Priority date: 1998-11-17
Filing date: 1999-11-17
Publication date: 2000-06-26
Anticipated expiration: 2019-11-17
Also published as: EP1002874A3; US6352835B1; US20020025546A1; US6514720B2; CN1254841A; ATE403011T1; KR100601272B1; CN1198942C; EP1002874B1; EP1002874A2; DE69939204D1

Abstract

본 발명은 시료 중의 측정 대상물을 산화환원반응을 이용하여 측정하는 방법에 있어서, 신뢰성이 우수한 측정치를 얻을 수 있는 측정방법을 제공한다.

상기 산화환원반응에 앞서서, 시료에 테트라졸륨 화합물을 첨가하여 상기 시료 중에 포함되는 환원물질의 영향을 배제하고, 그 후, 상기 측정 대상물 유래의 환원물질 또는 산화물질을 발생시켜, 이 양을 산화환원반응에 의해 측정하여, 이 측정치로부터 상기 측정 대상물의 양을 결정한다. 상기 테트라졸륨 화합물로는 예를 들면 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염을 사용할 수 있다.

Description

산화환원반응을 이용한 측정방법 {Method for determining the amount of a subject to be measured in a sample by using an oxidation-reduction reaction}

본 발명은 시료 중의 측정 대상물을 산화환원반응을 이용하여 측정하는 방법에 관한 것이다.

종래부터, 예를 들면, 산화환원반응을 이용하여, 시료 중의 측정 대상물의 양을 측정하는 것은 널리 실시되고 있다. 예를 들면, 생화학 분석이나 임상 검사 등에 있어서의 당화 단백질의 측정에도 적용되어 있다.

예를 들면, 혈액 중의 당화 단백질, 특히 적혈구 중의 당화 헤모글로빈(HbAlc)는 생체 혈당치의 과거의 이력을 반영하고 있기 때문에, 당뇨병 진단이나 치료 등에 있어서의 중요한 지표로 되어 있다. 예를 들면, 적혈구 중의 당화 단백질은 산화환원반응을 이용하여, 이하에 나타낸 바와 같이 측정되고 있다.

우선, 적혈구를 용혈시킨 시료를 조제하여, 이 용혈시료를 적당한 프로테아제 등으로 처리한 후, 프룩토실아미노산옥시다아제(이하, FAOD라 함)로 처리하여, 과산화수소를 발생시킨다. 이 과산화수소 양은 적혈구 중의 당화 단백질 양에 대응한다. 그리고, 이 시료에 퍼옥시다아제(이하, POD라 함) 및 환원제를 첨가하여, 상기 POD를 촉매로서 상기 과산화수소와 상기 환원제 간에 산화환원반응을 일으킨다. 이 때, 상기 환원제로서, 산화되는 것에 의해 발색하는 환원제를 사용하면, 그 발색을 측정함으로써 상기 과산화수소 양을 측정할 수 있고, 그 결과, 적혈구 중의 당화 단백질 양을 알 수 있다.

그러나, 혈액 중에는 통상 아스코르브산(AsA), 빌리루빈 등의 각종 환원물질이 존재하고, 또한 적혈구 중에는 글루타티온(GSH) 등의 각종 환원물질이 존재한다. 이들 환원물질에 의해, 상기 과산화수소가 환원되거나, 상기 산화환원반응이 저해되거나, 상기 환원제가 발색한 후에 환원되어 퇴색될 우려가 있다. 이 때문에, 적혈구 중의 당화 단백질 양을 정확히 측정하는 것이 곤란한 문제가 있었다.

또한, 시료마다 함유되는 환원물질의 농도도 일정하지 않기 때문에, 측정 정밀도가 뒤떨어진다고 하는 문제도 있었다.

이러한 문제를 회피하기 위해, 예를 들면 여러가지의 산화제를 상기 시료에 첨가하는 방법이 있다. 예를 들면, 특개소 56-151358호 공보에는 산화제로서 요오드산, 과요오드산 등의 할로겐 산화물을 사용하는 방법이 개시되어 있고, 특개소 57-13357호 공보, 특개소 57-161650호 공보, 특개소 59-193354호 공보, 특개소 62-169053호 공보, 특개평 3-30697호 공보에는 산화제로서 코발트, 철, 세륨 등의 금속착화합물을 사용하는 방법이 개시되어 있다.

그렇지만, 이들 산화제를 사용한 경우라도, 상술한 바와 같은 측정에 대한 영향을 충분히 회피할 수 있지 않고, 특히, 측정 대상물이 적혈구내 성분인 경우에, 상술한 산화제에 의한 효과가 적었다.

그리하여, 본 발명의 목적은 시료 중의 측정 대상물을 산화환원반응을 이용하여 측정하는 방법에 있어서, 신뢰성이 우수한 측정치를 얻을 수 있는 측정방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 측정방법은 시료 중의 측정 대상물을 산화환원반응을 이용하여 측정하는 방법에 있어서, 상기 산화환원반응에 앞서서 시료에 테트라졸륨 화합물을 첨가하여 상기 시료 중에 포함되는 환원물질의 영향을 배제하고, 그 후, 상기 측정 대상물 유래의 환원물질 또는 산화물질을 발생시켜, 이 양을 산화환원반응에 의해 측정하여, 이 측정치로부터 상기 측정 대상물의 양을 결정하는 것을 특징으로 한다. 상기 테트라졸륨 화합물로는 테트라졸환 구조를 갖는 화합물이다.

본 발명자들은 예의 연구를 한 결과, 종래 방법에 의하면, 예를 들면, 상기 GSH나 AsA와 같은 저분자량 환원물질의 영향이 배제되어 있지 않은 것은 아니고, 단백질 등과 같은 고분자량 환원물질에 의한 영향이 배제되어 있지 않은 것을 밝혀냈다. 그리고, 본 발명자들은 상기 테트라졸륨 화합물에 의하면, 예를 들면, 상기저분자량 환원물질 뿐만 아니라, 그 밖의 환원물질의 영향도 배제할 수 있다는 것을 알아내어, 본 발명의 측정방법에 도달하였다. 본 발명의 측정방법에 의하면, 보다 신뢰성이 뛰어난 측정 대상물의 양을 구하는 것이 가능하기 때문에, 예를 들면, 임상의료 등에 있어서의 각종 검사에 유용하다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 상기 테트라졸륨 화합물이 테트라졸환의 적어도 2 개소에 환 구조 치환기를 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 개소에 환 구조 치환기를 갖는 구조이다.

상기 테트라졸륨 화합물이 상술한 바와 같이 상기 테트라졸환의 적어도 2 개소에 환 구조 치환기를 갖는 경우, 상기 치환기를 상기 테트라졸환의 2 위치 및 3 위치에 갖는 것이 바람직하다. 또한, 테트라졸륨 화합물이 3 개소에 환 구조 치환기를 갖는 경우는, 상기 치환기를 상기 테트라졸환의 2 위치, 3 위치 및 5 위치에 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 적어도 2 개의 환 구조 치환기의 환 구조가 벤젠환인 것이 바람직하다. 또한, 벤젠환 이외의 환 구조 치환기로는, 예를 들면 환골격에 S 또는 0을 포함하고, 또한 공명구조인 치환기로는 예를 들면 티에닐기, 티아졸릴기 등이 있다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 상기 테트라졸륨 화합물이 테트라졸환의 적어도 3 개소에 환 구조 치환기를 갖고, 상기 환 구조 치환기 중 적어도 2개의 환 구조 치환기의 환 구조가 벤젠환인 것이 바람직하다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 적어도 하나의 환 구조 치환기가 작용기를 갖는 것이 바람직하고, 상기 작용기의 수가 많은 것이 보다 바람직하다.

상기 작용기로는 전자흡인성 작용기가 바람직하고, 예를 들면 할로겐기, 에테르기, 에스테르기, 카복시기, 아실기, 니트로소기, 니트로기, 히드록시기, 술포 기 등을 들 수 있다. 이 밖에도, 예를 들면 상기 작용기 이외에, 히드로퍼옥시기, 옥시기, 에폭시기, 에피디옥시기, 옥소기 등의 산소를 포함하는 특성기나, 머캅토기, 알킬티오기, 메틸티오메틸기, 티옥소기, 술피노기, 벤젠술포닐기, 페닐술포닐기, p-톨루엔술포닐기, p-톨릴술포닐기, 토실기, 술파모일기, 이소티오시아네이토기 등의 황을 포함하는 특성기 등을 들 수 있다. 이들의 전자흡인성 작용기 중에서도, 바람직하게는 니트로기, 술포기, 할로겐기, 카복시기, 히드록시기, 메톡시기, 에톡시기이다. 또한, 상기 전자흡인성 작용기 외에, 예를 들면, 페닐기(C₆H₅-), 스티릴기(C₆H₅CH=CH-) 등의 불포화 탄화수소기 등도 들 수 있다. 또한, 상기 작용기는 해리에 의해 이온화되어 있어도 좋다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 상기 테트라졸륨 화합물이 테트라졸환의 2 위치 및 3 위치에 벤젠환을 가지며, 상기 벤젠환 중 적어도 한 쪽이 할로겐기, 카복시기, 니트로기, 히드록시기, 술포기, 메톡시기 및 에톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 작용기를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 상기 양쪽의 벤젠환이 상기 작용기를 갖더라도 좋다. 상기 벤젠환에 있어서, 어느 쪽의 위치(오르토-, 메타-, 파라-)에 상기 작용기를 갖더라도 좋다. 또한, 작용기의 수도 특히 제한되지 않고, 동일한 작용기를 갖더라도 상이한 작용기를 갖더라도 좋다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 상기 테트라졸륨 화합물은 예를 들면, 상기 테트라졸환의 2 위치, 3 위치 및 5 위치에 벤젠환 구조 치환기를 갖는 화합물로서, 예를 들면 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염, 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염, 2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염, 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸륨염, 3,3'-(1,1'-비페닐-4,4'-디일)-비스(2,5-디페닐)-2H-테트라졸륨염, 3,3'-[디메톡시-(1,1'-비페닐)-4,4'-디일]-비스[2-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸륨염], 2,3-디페닐-5-(4-클로로페닐)테트라졸륨염, 2,5-디페닐-3-(p-디페닐)테트라졸륨염, 2,3-디페닐-5-(p-디페닐)테트라졸륨염, 2,5-디페닐-3-(4-스티릴페닐)테트라졸륨염, 2,5-디페닐-3-(m-톨릴)테트라졸륨염 및 2,5-디페닐-3-(p-톨릴)테트라졸륨염 등을 들 수 있다.

또한, 상기 테트라졸륨 화합물은 상술한 화합물에는 제한되지 않고, 이밖에에, 상기 테트라졸환의 2 개소에 벤젠환 구조 치환기 및 1 개소에 그 밖의 환 구조 치환기를 갖는 화합물도 사용할 수 있고, 예를 들면, 2,3-디페닐-5-(2-티에닐)테트라졸륨염, 2-벤조티아졸릴-3-(4-카복시-2-메톡시페닐)-5-[4-(2-술포에틸카바모일)페닐]-2H-테트라졸륨염, 2,2'-디벤조티아졸릴-5,5'-비스[4-디(2-술포에틸)카바모일페닐]-3,3'-(3,3'-디메톡시-4,4'-비페닐렌)디테트라졸륨염 및 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨염 등을 들 수 있다.

또한, 상기 테트라졸환의 2 개소에 벤젠환 구조 치환기 및 1 개소에 환 구조가 아닌 치환기를 갖는 테트라졸륨 화합물도 사용할 수 있고, 예를 들면, 2,3-디페닐-5-시아노테트라졸륨염, 2,3-디페닐-5-카복시테트라졸륨염, 2,3-디페닐-5-메틸테트라졸륨염 및 2,3-디페닐-5-에틸테트라졸륨염 등을 들 수 있다.

상술한 테트라졸륨 화합물 중에서도, 상술한 바와 같이, 환 구조 치환기를 3개 갖는 화합물이 바람직하고, 보다 바람직하게는 환 구조가 벤젠환인 치환기를 3 개 가지며, 또한 전자흡인성 작용기를 많이 갖는 것으로, 특히 바람직하게는 2-(4-요오도페닐)3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염이다. 또한, 이러한 테트라졸륨 화합물은 예를 들면 염이어도 좋고, 이온화된 상태 등이어도 좋다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 상기 테트라졸륨 화합물의 첨가량은 특히 제한되지 않고, 시료의 종류나 상기 환원물질의 양에 의해 적절히 결정할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 시료 1 ㎕ 당, 상기 테트라졸륨 화합물을 O.O01∼10O μmol의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.005∼10 μmol의 범위, 특히 바람직하게는 0.01∼1 μmol의 범위이다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 상기 시료가 전혈인 경우, 상기 테트라졸륨 화합물을 전혈 1㎕당, O.001∼1O μmol의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.005∼5 μmol의 범위, 특히 바람직하게는 0.01∼1μmol의 범위이다. 구체적으로는, 상기 테트라졸륨 화합물이 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염의 경우는 전혈 1㎕당 0.001∼0.4 μmol의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 O.O05∼O.1 μmol의 범위, 특히 바람직하게는 0.01∼0.07 μmol의 범위이다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 상기 측정 대상물 유래의 산화물질이 과산화수소이고, 산화환원반응의 측정이 상기 과산화수소 양의 측정인 것이 바람직하다.

상기 과산화수소 양의 측정은 산화효소와 산화에 의해 발색하는 기질(이하, 발색성 기질이라 함)을 사용한 측정인 것이 바람직하다.

상기 발색성 기질로는 특히 제한되지 않지만, 고감도로 검출가능한 것이기 때문에, 예를 들면 N-(카복시메틸아미노카보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨이 바람직하다. 또한, 상기 산화효소는 퍼옥시다아제인 것이 바람직하다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 상기 시료의 종류는 특히 제한되지 않고, 전혈, 혈장, 혈청, 혈구 등 이외에, 예를 들면 요, 수액 등의 생체 시료나, 쥬스 등의 음료수, 간장, 소스 등의 식품류 등의 시료에 대하여도 적용할 수 있다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 측정 대상물로는 예를 들면 전혈 중 성분, 적혈구내 성분, 혈장 중 성분, 혈청 중 성분, 요 성분, 수액 성분 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 적혈구내 성분이다. 상기 적혈구내 성분으로는 예를 들면 당화 헤모글로빈, 당화 알부민 등의 당화 단백질, 당화 펩티드, 당화 아미노산, 글루코오스, 요산, 콜레스테롤, 크레아티닌, 사르코신, 글리세롤 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 당화 단백질이다. 예를 들면, 상기 적혈구 성분을 측정하는 경우, 전혈을 그대로 용혈시킨 것을 시료로도 사용하여도 좋고, 전혈로부터 적혈구를 분리하여, 상기 적혈구를 용혈시킨 것을 시료로 사용하더라도 좋다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 상기 당화 단백질의 당부분을 FAOD로 산화분해함으로써 과산화수소를 생성시키는 것이 바람직하다. 또한, 상기 당화 펩티드, 당화 아민도 동일하게 FAOD를 작용시키는 것이 바람직하다. 상기 당화 단백질이나 당화 펩티드는 필요에 따라, 상기 FAOD 처리전에 프로테아제 처리하는 것이 바람직하다.

상기 FAOD로는 하기식(1)에 나타내는 반응을 촉매하는 FAOD인 것이 바람직하다.

R¹-CO-CH₂-NH-R²+ H₂O + O₂→R¹-CO-CHO + NH₂-R²+ H₂O₂ㆍㆍㆍ (1)

상기식(1)에 있어서, R¹는 히드록시기 또는 당화 반응전의 당에 유래하는 잔기(당잔기)를 의미한다. 상기 당잔기(R¹)는 반응전의 당이 알도오스의 경우는 알도오스 잔기이고, 반응전의 당이 케토오스의 경우, 케토오스 잔기이다. 예를 들면, 반응전의 당이 글루코오스의 경우는 아마도리 전위(Amadori rearrangement)에 의해, 반응후의 구조는 프룩토오스 구조를 취하지만, 이 경우, 당잔기(R¹)는 글루코오스 잔기(알도오스 잔기)로 된다. 이 당잔기(R¹)는 예를 들면, -[CH(OH)]_n-CH₂OH 로 나타낼 수 있고, n은 0∼6의 정수이다.

상기식(1)에 있어서, R²는 특히 제한되지 않지만, 예를 들면 당화 아미노산, 당화 펩티드 또는 당화 단백질의 경우, α-아미노기가 당화되어 있는 경우와, 그 이외의 아미노기가 당화되어 있는 경우와 다르다.

상기식(1)에 있어서, α-아미노기가 당화되어 있는 경우, R²는 하기식(2)으로 나타내는 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기이다.

-CHR³-CO-R⁴ㆍㆍㆍ(2)

상기식(2)에 있어서, R³은 아미노산 측쇄기를 나타낸다. 또한, R⁴는 히드록시기, 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기를 나타내며, 예를 들면 하기식(3)으로 나타낼 수 있다. 하기식(3)에 있어서, n은 O 이상의 정수이고, R³은 상술한 바와 같이 아미노산 측쇄기를 나타낸다.

-(NH-CHR³-CO)_n-OH ㆍㆍㆍ (3)

또한, 상기식(1)에 있어서, α-아미노기 이외의 아미노기가 당화되어 있는 (아미노산 측쇄기가 당화되어 있다)경우, R²는 하기식(4)으로 나타낼 수 있다.

상기식(4)에 있어서, R⁵는 아미노산 측쇄기 중, 당화된 아미노기 이외의 부분을 나타낸다. 예를 들면, 당화된 아미노산이 리신인 경우, R⁵는-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-이고, 예를 들면 당화된 아미노산이 아르기닌인 경우, R⁵는 -CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH (NH₂)-이다.

또한, 상기식(4)에 있어서, R⁶은 수소, 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기이고, 예를 들면 하기식(5)으로 나타낼 수 있다. 또한, 하기식(5)에 있어서, n은 O 이상의 정수이고, R³은 상술한 바와 같이 아미노산 측쇄기를 나타낸다.

-(CO-CHR³-NH)_n-H ㆍㆍㆍ (5)

또한, 상기식(4)에 있어서, R⁷은 히드록시기, 아미노산 잔기 또는 펩티드 잔기이고, 예를 들면, 하기식(6)으로 나타낼 수 있다. 또한, 하기식(6)에 있어서, n은 O 이상의 정수이고, R₃은 상술한 바와 같이 아미노산 측쇄기를 나타낸다.

-(NH-CHR³-CO)_n-OH ㆍㆍㆍ (6)

본 발명의 측정방법에 있어서, 시료 중의 상기 환원물질은 특히 제한되지 않지만, 그 분자량이 예를 들면, 10,000이상이고, 바람직하게는 10,000∼3,000,000의 범위이고, 보다 바람직하게는 10,000∼300,000의 범위이며, 특히 바람직하게는 30,000∼100,000의 범위이다.

또한, 시료 중의 상기 환원물질은 단백질인 것이 바람직하다. 상기 단백질의 분자량은 예를 들면 3,000이상이고, 바람직하게는 3,O00∼3,000,000의 범위, 보다 바람직하게는 10,000∼300,000의 범위, 특히 바람직하게는 30,000∼100,000의 범위이다. 이러한 환원물질로는 예를 들면, 헤모글로빈, 글로빈, 글로불린, 알부민 등을 들 수 있고, 바람직하게는 헤모글로빈이다.

다음에, 본 발명의 측정방법에 대하여, 혈구 중의 당화 단백질을 측정하는 예를 들어 설명한다.

우선, 전혈을 그대로 용혈하거나, 또는 전혈로부터 원심분리 등의 상용법에 의해 혈구획분을 분리하여 이것을 용혈하여, 용혈 시료를 조제한다. 이 용혈방법은 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 계면활성제를 사용하는 방법, 초음파에 의한 방법, 침투압의 차를 이용하는 방법 등이 사용될 수 있다. 그 중에서도, 조작 간편성 등의 이유로 상기 계면활성제를 사용하는 방법이 바람직하다.

상기 계면활성제로는 예를 들면, 폴리옥시에틸렌-p-t-옥틸페닐에테르 (트리톤(Triton)계 계면활성제 등), 폴리옥시에틸렌소르비탄알킬에스테르 (트윈(Tween)계 계면활성제 등), 폴리옥시에틸렌알킬에테르 (브리(Brij)계 계면활성제 등) 등의 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있고, 구체적으로는, 예를 들면, 트리톤 X-100, 트윈-20, 브리 35 등을 들 수 있다. 상기 계면활성제에 의한 처리조건은 통상 처리용액 중의 혈구농도가 1∼10 체적%의 경우, 상기 처리용액 중의 농도가 0.01∼5 중량%가 되도록 상기 계면활성제를 첨가하여, 실온에서 수초(약 5초)∼10분 정도 교반하면 좋다.

다음에, 상기 용혈시료에 대하여, 상기 테트라졸환 구조를 갖는 테트라졸륨화합물을 첨가하여, 시료의 전처리를 한다.

상기 테트라졸륨 화합물은 예를 들면 전처리 용액 중의 혈구농도가 1∼1O 체적%의 경우, 농도 O.O2∼2OOOmmol/ℓ의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1∼1000mmol/ℓ의 범위, 특히 바람직하게는 0.4∼200 mmol/ℓ의 범위이다. 구체적으로, 상기 테트라졸륨 화합물이 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염의 경우는, 농도 O.02∼80 mmol/ℓ의 범위가 되도록 첨가하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1∼20 mmol/ℓ의 범위, 특히 바람직하게는 0.2∼15 mmol/ℓ의 범위이다.

상기 전처리는 통상 완충액 중에서 행해진다. 상기 완충액은 예를 들면, C HES 완충액, CAPSO 완충액, CAPS 완충액, 인산 완충액, 트리스(Tris) 완충액, EPPS 완충액, HEPES 완충액 등이 사용될 수 있다. 그 pH는 예를 들면, 6∼13의 범위이고, 바람직하게는 8∼12의 범위, 보다 바람직하게는 9∼11의 범위이다. 또한, 상기전처리 용액 중에서의 상기 완충액의 최종농도는 예를 들면, 1∼400 mmol/ℓ의 범위이고, 바람직하게는 10∼20O mmol/ℓ의 범위이다.

이러한 전처리 조건은 특히 제한되지 않지만, 통상 온도가 10∼37℃의 범위이고, 처리시간이 10초∼60분의 범위이다.

상기 테트라졸륨 화합물은 그대로 사용하더라도 좋지만, 조작 간편성이나 처리효율 등의 점에서, 용매에 용해한 테트라졸륨 화합물 용액으로서 사용하는 것이 바람직하다. 상기 용액의 농도는 테트라졸륨 화합물의 종류(예를 들면, 분자량등) 등에 의해 적절하게 결정할 수 있고, 예를 들면 0.01∼120 mmol/ℓ의 범위이고, 바람직하게는 0.1∼50 mmol/ℓ의 범위, 보다 바람직하게는 0.2∼20 mmol/ℓ의 범위이다. 상기 용매로는 예를 들면, 증류수, 생리식염수, 완충액 등을 사용할 수 있고, 상기 완충액으로는 예를 들면, 상술한 바와 같은 완충액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 테트라졸륨 화합물은 1 종류로도 좋고, 2 종류 이상을 병용하더라도 좋다.

다음에, 이 전처리를 행한 용혈시료에 대하여, 프로테아제 처리를 한다. 이것은 후처리에 사용하는 FAOD를 측정 대상물에 용이하게 작용시키기 위해서이다.

상기 프로테아제의 종류는 특히 제한되지 않고, 예를 들면 프로테아제 K, 서브틸리신, 트립신, 아미노펩티다아제 등을 사용할 수 있다. 상기 프로테아제 처리는 통상 완충액 중에서 행해져, 그 처리조건은 사용하는 프로테아제의 종류, 측정 대상물인 당화 단백질의 종류 및 그 농도 등에 의해 적절히 결정된다.

구체적으로는, 예를 들면, 상기 프로테아제로서 프로테아제 K를 사용하여 상기 전처리를 행한 용혈 시료를 처리하는 경우, 통상 반응액 중의 프로테아제 농도 10∼30,00Omg/ℓ, 반응액 중의 혈구농도 0.05∼15 체적%, 반응온도 15∼37℃, 반응시간 1분∼24시간, pH 6∼12의 범위이다. 또한, 상기 완충액의 종류도 특히 제한되지 않고, 예를 들면 트리스 염산 완충액, EPPS 완충액, PIPES 완충액 등을 사용할 수 있다.

다음에, 상기 프로테아제 처리에 의해 얻어진 분해물을 상기 FAOD로 처리한다. 이 FAOD 처리에 의해, 상기식(1)으로 나타낸 반응이 촉매된다.

이 FAOD 처리는 상기 프로테아제 처리와 동일하게 완충액 중에서 하는 것이 바람직하다. 그 처리조건은 사용하는 FAOD의 종류, 측정 대상물인 당화 단백질의 종류 및 그 농도 등에 의해 적절히 결정된다.

구체적으로는, 예를 들면 반응액 중의 FAOD 농도 50∼50,000 U/ℓ, 반응액 중의 혈구농도 0.01∼1 체적%, 반응온도 15∼37℃, 반응시간 1∼60분, pH 6∼9의 범위이다. 또한, 상기 완충액의 종류도 특히 제한되지 않고, 상기 프로테아제 처리와 같은 완충액을 사용할 수 있다.

다음에, 상기 FAOD 처리로 생성한 과산화수소를 POD 및 상기 발색성 기질을 사용하여 산화환원반응에 의해 측정한다.

상기 발색성 기질로는 예를 들면, N-(카복시메틸아미노카보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨, 오르토페닐렌디아민(OPD), 토린더 시약과 4-아미노안티피린을 조합시킨 기질 등을 들 수 있다. 상기 토린더 시약으로는, 예를 들면 페놀, 페놀 유도체, 아닐린 유도체, 나프톨, 나프톨 유도체, 나프틸아민, 나프틸아민 유도체 등을 들 수 있다. 또한, 상기 아미노안티피린 외에, 아미노안티피린 유도체, 발린디아민술폰산, 메틸벤즈티아졸리논히드라존(MBTH), 술폰화 메틸벤즈티아졸리논히드라존(SMBTH) 등도 사용할 수 있다. 이러한 발색성 기질 중에서도, 특히 바람직하게는 상술한 바와 같이, N-(카복시메틸아미노카보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨이다.

상기 산화환원반응은 통상 완충액 중에서 행해지고, 그 조건은 상기 생성한 과산화수소의 농도 등에 의해 적절히 결정된다. 통상, 반응액 중의 POD 농도 10∼100,000 IU/ℓ, 발색성 기질농도 0.005∼30 mmol/ℓ, 반응온도 15∼37℃, 반응시간 0.1∼30분, pH 5∼9이다. 또한, 상기 완충액은 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 상기 프로테아제 처리 및 FAOD 처리 등과 같은 완충액 등을 사용할 수 있다.

상기 산화환원반응에 있어서, 예를 들면 상기 발색성 기질을 사용한 경우, 상기 반응액의 발색정도(흡광도)를 분광광도계로 측정함으로써, 과산화수소의 양을 측정할 수 있다. 그리고, 예를 들면, 이 과산화수소 농도와 검량선 등을 이용하여, 시료 중의 당화 단백질 양을 구할 수 있다.

또한, 상기 과산화수소 양은 상기 POD 등을 사용한 효소적 수법 외에, 예를 들면, 전기적 수법에 의해 측정할 수도 있다.

이 측정방법에 있어서, 테트라졸륨 화합물에 의한 전처리 공정은 상술한 바와 같이, 산화환원반응이 실질적으로 발생하기 전이면, 특히 제한되지 않지만, 상기 FAOD 처리후에 과산화수소가 발생하기 때문에, 상기 FAOD 처리전에 하는 것이 바람직하다. 또한, 각 처리 공정은 상술한 바와 같이 따로따로 행하여도 좋지만, 예를 들면, 이하에 나타내는 바와 같은 조합으로 동시에 행하여도 좋은 처리공정이 있다.

1: 용혈처리 + 전처리

2: 용혈처리 + 전처리 + 프로테아제 처리

3: 프로테아제 처리 + FAOD 처리

4: FAOD 처리 + POD 산화환원처리

5: 프로테아제 처리 + FAOD 처리 + POD 산화환원처리

또한, 상기 FAOD, POD 및 발색성 기질의 첨가순서도 특히 제한되지 않는다.

이와 같이, 시료에 테트라졸륨 화합물을 접촉시킴으로써, GSH, AsA, 디티오트레이톨, 시스테인, N-아세틸-시스테인 등의 저분자량 환원물질에 의한 영향뿐만아니라, 예를 들면, 단백질이나 상술한 바와 같은 분자량의 범위인 환원물질에 의한 영향도 회피할 수 있다.

또한, 본 발명의 측정방법의 상기 테트라졸륨 화합물에 의한 전처리 공정에서, 예를 들면 상기 테트라졸륨 화합물 이외의 산화제를 병용하더라도 좋다. 상기 산화제로는 예를 들면, 요오드초산나트륨, 요오드산, 과요오드산 등의 할로겐 산화물, EDTA-Fe, 아스코르브산 옥시다아제, 빌리루빈 옥시다아제 등을 사용할 수 있다. 이러한 산화제의 첨가량은 예를 들면, 시료 1㎕ 당 O.OO1∼O.1mg의 범위이다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 측정 대상물은 산화환원반응을 이용하는 것이면, 특히 제한되지 않고, 상기 당화 단백질 외에, 예를 들면 상술한 바와 같이 당화 펩티드, 당화 아미노산, 글루코오스, 콜레스테롤, 요산, 크레아티닌, 사르코신, 글리세롤 등을 들 수 있다.

예를 들면, 과산화수소를 발생시켜, 상기 각 측정 대상물의 양을 측정하는 경우는, 예를 들면 상기 글루코오스에는 글루코오스 옥시다아제를, 상기 콜레스테롤에는 콜레스테롤 옥시다아제를, 상기 요산에는 우리카아제를, 상기 크레아티닌에는 사르코신 옥시다아제를, 상기 사르코신에는 사르코신 옥시다아제를, 상기 글리세롤에는 글리세롤 옥시다아제를 각각 작용시켜 과산화수소를 발생시키면 좋다. 이 과산화수소 양의 측정방법은 상술한 바와 같이 행할 수 있다. 또한, 당화 펩티드, 당화 아미노산은 예를 들면, 상기 당화 단백질의 측정과 동일하게 측정할 수 있다.

또한, 상기 테트라졸륨 화합물에 의한 시료 중의 환원물질의 처리후, 측정 대상물 유래의 환원물질을 발생시켜, 그 양을 산화환원반응에 의해 측정하여, 그 측정치로부터 상기 측정 대상물의 양을 결정하는 경우는, 예를 들면 이하에 나타낸 바와 같이 측정을 행할 수 있다.

예를 들면, 상기 측정 대상물이 글루코오스의 경우, 예를 들면 NAD나 NADP 등의 존재하에, 글루코오스데히드로게나아제를 사용하여, NADH나 NADPH 등의 환원물질을 발생시킨다. 그리고, 상기 측정 대상물 유래의 환원물질인 NADH나 NADPH를 예를 들면 디아포라아제와 환원에 의해 발생하는 기질을 사용하여, 산화환원반응에 의해 측정한다. 그리고, 상술한 바와 같이, 예를 들면 이 측정 대상물 유래의 환원물질의 농도와 검량선 등을 사용하여, 시료 중의 측정 대상물의 양을 구할 수 있다. 또한, 예를 들면 측정 대상물이 콜레스테롤인 경우는 콜레스테롤데히드로게나아제를, 사르코신인 경우는 사르코신데히드로게나아제를 각각 사용할 수 있다.

상기 환원에 의해 발생하는 기질로는 특히 제한되지 않지만, 예를 들면 상기 시료 중의 환원물질의 영향을 배제하기 때문에, 첨가한 발색성 테트라졸륨 화합물을 사용하여도 좋다. 또한, 각 측정파장에 따라 상기 시료의 전처리에 사용한 것과는 다른 종류의 발색성 테트라졸륨 화합물을 사용하여도 좋다. 상기 발색성 테트라졸륨 화합물 이외에는 예를 들면 2,6-디클로로페놀인도페놀 등도 사용할 수 있다. 또한, 보다 우수한 신뢰성의 측정치를 얻기 때문에, 예를 들면 상기 측정 대상물 유래의 환원물질을 측정하기 전에 미리 흡광도를 측정하는 것이 바람직하다.

또한, 이와 같이 상기 테트라졸륨 화합물을 사용하여 시료를 처리하면, 상기 저분자량 환원물질 뿐만 아니라, 예를 들면, 상술한 바와 같은 단백질 등의 고분자량 환원물질의 영향도 회피할 수 있다. 이 때문에, 분자량 1 만 이상의 환원물질이나 단백질인 환원물질이 영향을 주는 경우는, 상기 전혈 시료만으로는 한정되지 않고, 상술한 바와 같은 각종 시료에 대하여도 적용할 수 있다. 또한, 전혈 시료 이외의 시료를 사용하는 경우는, 상기 시료가 다른 것 이외에는 동일한 시약을 사용하여, 동일하게 측정할 수 있다.

(실시예)

다음에, 실시예에 관해 비교예와 함께 설명한다.

(실시예 1, 비교예 1)

이 실시예는 시료를 테트라졸륨 화합물로 전처리하여, 상기 시료 중의 환원물질의 영향을 배제한 예이다. 이하에, 사용한 시약 및 방법을 나타낸다.

(계면활성제 용액)

폴리옥시에틸렌(1O)-p-t-옥틸페닐에테르 (이하, 트리톤 X-1OO 이라 함)을 농도 0.1 체적%가 되도록 정제수와 혼합하여 조제하였다.

(WST-3 용액)

농도가 1 mmol/ℓ가 되도록, 정제수에 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨, 일나트륨염(WST-3, 同仁化學硏究所社製)을 용해시켜 조제하였다.

(프룩토실발린 용액)

프룩토실발린(이하, FV라 함)은 특개평 2-69644호 공보에 따라 제조한다(이하 동일). 상기 FV를 농도 50 μmol/ℓ가 되도록 0.5 mol/ℓ 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)에 첨가하여 조제하였다.

(산화환원반응 용액 A)

FAOD(아사히 화성공업사제: 이하 동일) 28.6 KU/ℓ

POD (東洋紡社製: 이하 동일) 14.3 KU/ℓ

DA-64(和光純藥工業社製: 이하 동일) 28.6μmol/ℓ

증류수 잔여분

건강한 정상인의 전혈을 원심분리(1630 G, 10분간)하여 혈구를 회수하였다. 그리고, 상기 혈구를 상기 트리톤 X-100 용액으로 20배(체적) 희석하여 용혈시킨 것을 용혈시료로 하였다.

상기 시료 50㎕에 0.5 mol/ℓ CHES 완충액(pH 9.0) 50㎕을 첨가하고 나서, 상기 WST-3용액 100㎕를 첨가하여, 교반후 37℃에서 10분간 처리하였다. 상기 처리후, 상기 처리한 시료에 상기 FV 용액 400㎕를 첨가하고 나서, 상기 산화환원반응용액 A 1400㎕를 첨가하여 반응을 개시하였다. 그리고, 반응용액의 726 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

컨트롤로는 상기 용혈시료 대신에 증류수를 사용한 것 이외에는, 상술한 바와 동일한 방법으로 측정하였다. 비교예 1로는 상기 WST-3 용액 대신에 증류수를 사용한 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다.

또한, 이들 측정치를 하기식(수 1)에 대입하여, 컨트롤의 흡광도를 100%로 했을 때의 상대치(%)를 구하였다. 이들 결과를 하기 표 1에 나타낸다.

(수 1)

상대치(%)=(X₁- X₀/ Y₁- Y₀) ×100

X₁: 5분후의 흡광도

X₀: 반응개시시의 흡광도

Y₁: 컨트롤의 5분후의 흡광도

Y₀: 컨트롤의 반응개시시의 흡광도

(표 1)

상대치(%)

실시예 1 83

비교예 1 34

컨트롤 100

이와 같이, 혈구의 용혈시료를 테트라졸륨 화합물로 처리함으로써, 상기 시료 중의 환원물질의 영향을 배제할 수 있고, 측정의 신뢰성이 향상하였다.

(비교예 2 및 비교예 3)

실시예 1과 동일하게 하여 혈구를 회수하고, 이것을 1.0 체적% 트리톤 X-100용액으로 5배(체적) 희석하여 용혈시킨 것을 용혈시료로 하였다. 이 용혈시료 50㎕에 1.0 mol/ℓ 요오드초산나트륨(Aldorich 사제: 이하 동일) 용액 150㎕를 첨가하여, 교반후 37℃에서 10분간 처리하였다. 상기 처리후, 상기 처리한 시료에 상기 FV 용액 400㎕를 첨가하고, 계속해서 상기 산화환원반응용액 A 1400㎕를 첨가하여 반응을 개시하였다. 그리고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여, 컨트롤에 대한 상대치(%)를 구하였다. 이것을 비교예 2로 하였다. 또한, 컨트롤로는 상기 용혈시료 대신에 증류수를 사용한 것 이외에는, 상술한 바와 동일한 방법으로 측정하였다.

비교예 3은 상기 요오드초산나트륨 용액 대신에 증류수를 첨가한 것 이외에는, 상기 실시예 1와 동일하게 하여 측정하였다. 이들 결과를 하기 표 2에 나타낸다.

(표 2)

상대치(%)

비교예 2 37

비교예 3 35

컨트롤 100

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 종래부터 사용되고 있는 산화제인 요오드초산나트륨으로는 용혈시료 중의 환원물질의 영향을 회피할 수 없는 것을 확인할 수 있다.

(비교예 4)

이 비교예는 적혈구의 용혈시료를 분자량 분획하고 나서, 요오드초산나트륨으로 처리한 예이다.

헤파린을 첨가한 건강한 정상인 혈액 10 ㎖을 원심분리(1630 G, 10분간)하여, 혈장층 및 백혈구층을 피펫으로 제거하였다. 얻어진 적혈구층에 생리식염수를 가하여, 상기 적혈구가 용혈하지 않도록 천천히 혼화하고 나서, 상술한 바와 동일하게 원심분리를 행하여 상청을 제거하였다. 이 일련의 세정조작은 3회 되풀이하였다. 다음에, 얻어진 적혈구에 동량(체적)의 증류수를 가하여 완전히 용혈시킨 후, 다시 원심분리(4530 G, 10분간)을 행하여 막성분을 제거한 용액을 시료 1로 하였다.

다음에, 시료 1을 CENTRIPREP 30 (밀리포아사제)를 사용하여, 원심분리(1630 G, 4시간)함으로써 한외여과하였다. 상기 CENTRIPREP 30에 남은 분자량 3만 이상의 획분을 시료 2로 하고, 여액을 시료 3으로 하였다.

다음에, 상기 시료 3을 CENTRIPREP 10 (밀리포아사제)를 사용하여, 원심분리(1630 G, 2시간)함으로써 한외여과하였다. 상기 CENTRIPREP 10에 남은 분자량 1만 이상 3만 미만의 획분을 시료 4로 하고 여액을 시료 5로 하였다.

그리고, 상기 각 시료를 증류수로 희석한 희석용액 200㎕에 상기 FV 용액 400㎕를 첨가하고, 계속해서 상기 산화환원반응용액 A 1400㎕를 첨가하여 반응을 개시하였다. 그리고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여, 컨트롤에 대한 상대치(%)를 구하였다. 또한, 상기 시료 1∼2는 증류수로 80배 희석하고, 시료 3∼시료 5는 10배로 희석하였다. 컨트롤로는 상기 용혈시료 대신에 증류수를 사용한 것 이외에는 상술한 바와 동일한 방법으로 측정하였다.

또한, 상기 각 시료의 희석용액 50㎕에 대하여, 상기 요오드초산나트륨 용액 150㎕를 첨가하고, 교반후 37℃에서 10분간 처리하였다. 그리고, 상기 처리한 희석시료에 상기 FV 용액 400㎕을 첨가하고, 계속해서 상기 산화환원반응용액 A 1400㎕를 첨가하여 반응을 개시하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 흡광도를 측정하고, 컨트롤에 대한 상대치(%)를 구하였다. 이들 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

(표 3)

상대치 (%)

시료 1 0

시료 2 7

시료 3 93

시료 4 100

시료 5 93

시료 1 + 요오드초산나트륨 0

시료 2 + 요오드초산나트륨 8

시료 3 + 요오드초산나트륨 98

시료 4 + 요오드초산나트륨 100

시료 5 + 요오드초산나트륨 98

컨트롤 100

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 시료 1(미분획)과 시료 2(분자량 3만 이상의 획분)에 있어서는 거의 측정할 수 없었다. 또한, 상기 시료 1 및 시료 2를 요오드초산나트륨으로 처리하더라도, 마찬가지로 거의 측정할 수 없었다. 이로부터, 요오드초산나트륨으로는 1만 이상, 특히 3만 이상의 환원물질에서의 영향을 거의 회피할 수 없다는 것을 알아냈다.

(실시예 2, 비교예 5)

이 실시예는 각종 테트라졸륨 화합물을 사용하여, 혈액시료를 처리하여, 상기 시료 중의 환원물질의 영향을 배제한 예이다. 이하에, 사용한 테트라졸륨 화합물의 화합물명과 그 구조를 나타낸다.

(1) 테트라졸환의 3 개소에 벤젠환 구조 치환기를 갖는 테트라졸륨 화합물

(1-1) WST-1

2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨, 일나트륨염

(1-2) WST-3

2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨, 일나트륨염

(1-3) WST-8

2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨, 일나트륨염

(1-4) INT

2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸륨클로라이드

(1-5) Neo-TB

3,3'-(1,1'-비페닐-4,4'-디일)-비스(2,5-디페닐)-2H-테트라졸륨클로라이드

(1-6) NTB

3,3'-[3,3'-디메톡시-(1,1'-비페닐)-4,4'-디일]-비스[2-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸륨클로라이드]

(1-7) B 329

2,3-디페닐-5-(4-클로로페닐)테트라졸륨클로라이드

(1-8) D 0883

2,5-디페닐-3-(p-디페닐)테트라졸륨클로라이드

(1-9) D 0884

2,3-디페닐-5-(p-디페닐)테트라졸륨클로라이드

(1-10) D 0915

2,5-디페닐-3-(4-스티릴페닐)테트라졸륨클로라이드

(1-11) T 324

2,5-디페닐-3-(m-톨릴)테트라졸륨클로라이드

(1-12) T 326

2,5-디페닐-3-(p-톨릴)테트라졸륨클로라이드

(2) 테트라졸환의 2 개소에 벤젠환 구조 치환기를 갖고, 1 개소에 그 밖의 환 구조 치환기를 갖는 테트라졸륨 화합물

(2-1) BO325

2,3-디페닐-5-(2-티에닐)테트라졸륨클로라이드

(2-2) WST-4

2-벤조티아졸릴-3-(4-카복시-2-메톡시페닐)-5-[4-(2-술포에틸카바모일)페닐]-2H-테트라졸륨

(2-3) WST-5

2,2'-디벤조티아졸릴-5,5'-비스[4-디(2-술포에틸)카바모일페닐]-3,3,-(3,3'-디메톡시-4,4'-비페닐렌)디테트라졸륨, 이나트륨염

(2-4) MTT

3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨클로라이드

(3) 테트라졸환의 2 개소에 벤젠환 구조 치환기를 갖고, 1 개소에 환 구조 이외의 치환기를 갖는 테트라졸륨 화합물

(3-1) B 0293

2,3-디페닐-5-시아노테트라졸륨클로라이드

(3-2) B 295

2,3-디페닐-5-카복시테트라졸륨클로라이드

(3-3) B 313

2,3-디페닐-5-메틸테트라졸륨클로라이드

(3-4) B 319

2,3-디페닐-5-에틸테트라졸륨클로라이드

또한, WST-1, WST-3, WST-8, WST-4, WST-5, INT, MTT, NTB, Neo-TB는 동인화학연구소제, 다른 것은 동경화성사제이다.

(FV 용액)

상기 FV를 농도 10 μmol/ℓ가 되도록 0.145 mol/ℓ KPB(pH 7.0)에 첨가하여 조제하였다.

(산화환원반응용액 B)

FAOD 73 KU/ℓ

POD 219 KU/ℓ

DA-64 146 μmol/ℓ

증류수 잔여분

1.0 mol/ℓ CAPSO 완충액(pH 10.0) 25㎕에, 상기 10 체적% 트리톤 X-100 용액 41.3㎕ 및 건강한 정상인의 전혈 1.65㎕을 첨가하여, 증류수로 250㎕로 정량하였다. 그리고, 이것을 정제수로 3배(체적) 희석한 것을 용혈시료로 하였다.

상기 용혈시료 250㎕에, 각종 테트라졸륨 화합물 용액 150㎕를 첨가하여, 교반후 37℃에서 60분간 처리하였다. 그리고, 상기 처리한 시료 25㎕에, 상기 FV 용액 55㎕를 첨가하고 나서, 상기 산화환원반응용액 B 15㎕를 첨가하여, 반응을 개시하였다. 그리고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여, 컨트롤에 대한 상대치(%)를 구하였다. 또한, 상기 테트라졸륨 화합물 용액의 농도는 WST-5에 있어서는 0.5 mmol/ℓ로 하고, 그 이외의 용액은 농도 5 mmol/ℓ로 하였다.

컨트롤로는 상기 용혈시료 대신에 증류수를 사용한 것 이외에는 상술한 바와 동일한 방법으로 측정하였다. 비교예 5로는 상기 테트라졸륨 화합물 용액 대신에 증류수를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다. 이들 결과를 하기 표 4에 나타낸다.

(표 4)

테트라졸륨 화합물 상대치 (%)

1 - 1 90

1 - 2 94

1 - 3 89

1 - 4 90

1 - 5 88

1 - 6 94

1 - 7 94

1 - 8 91

1 - 9 93

1 - 10 91

1 - 11 91

1 - 12 74

2 - 1 81

2 - 2 42

2 - 3 44

2 - 4 47

3 - 1 76

3 - 2 74

3 - 3 74

3 - 4 68

비교예 5 35

컨트롤 100

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 용혈시료를 상기 각종 테트라졸륨 화합물로 처리함으로써, 측정치의 신뢰성이 향상하였다. 특히, 테트라졸환의 3 개소에 벤젠환 구조 치환기를 갖는 테트라졸륨 화합물(1-1)∼(1-12)에 의하면, 더욱 신뢰성이 뛰어난 측정치를 얻을 수 있었다.

(실시예 3)

이 실시예는 테트라졸륨 화합물로서 WST-3, WST-1, WST-8 및 INT를 사용하여, 처리시의 pH를 변화시킨 예이다. 이하에, 사용한 완충액을 나나탠다.

(완충액)

1.0 mol/ℓ CHES 완충액(pH 9.0)

1.0 mol/ℓ CAPSO 완충액(pH 10.0)

1.0 mol/ℓ CAPS 완충액(pH 11.0)

상기 각 완충액을 각각 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로, 상기 각 테트라졸륨 화합물을 사용한 처리를 하여, 흡광도를 측정하였다. 또한, 상대치는 WST-3의 pH 10.0에서의 흡광도를 100%로 하여 구하였다. 그 결과, 상기 각 테트라졸륨 화합물에 관해, 상기 각 완충액(pH 9, 10, 11)을 사용하더라도, 이들 상대치는 100%이고, pH에 의한 영향은 나타나지 않았다.

(실시예 4, 비교예 6)

이 실시예는 반응 용액에 있어서의 전혈시료의 최종 희석배율이 약 100배가 되도록 설정하여, WST-3에 의해 처리를 한 예이다.

건강한 정상인의 전혈 33㎕ 및 1.0 mol/ℓ CAPSO 완충액(pH 10) 50㎕를 사용한 것 이외에는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 용혈을 행하여, 증류수 125.7㎕를 첨가함으로써, 250㎕로 정량하였다. 그리고, 이것을 정제수로 3배(체적) 희석한 것을 용혈시료로 하였다.

상기 용혈시료 25㎕에 5 mmol/ℓ WST-3 용액 15㎕를 첨가하여, 교반후 37℃에서 5분간 처리하였다. 그리고, 상기 처리한 시료에, 6 μmol/ℓ FV 용액 55㎕를 첨가하고 나서, 상기 산화환원반응용액 B 15㎕를 첨가하여, 반응을 개시하였다. 그리고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여, 컨트롤에 대한 상대치(%)를 구하였다. 컨트롤로는 상기 용혈시료 대신에 증류수를 사용한 것 이외에는, 상술한 바와 동일한 방법으로 측정하였다. 비교예 6으로는 상기 WST-3 용액 대신에 증류수를 사용한 것 이외에는, 상술한 바와 동일한 방법으로 측정하였다. 이들 결과를 하기 표 5에 나타낸다.

(표 5)

상대치 (%)

실시예 4 80

비교예 6 0

컨트롤 100

실시예 4에서는 전혈시료의 최종 희석배율을 낮게 함으로써, 반응용액 중의 환원물질 농도가 높게 되더라도, 상기 표 5에 나타낸 바와 같이 환원물질의 영향을 배제할 수 있고, 우수한 신뢰성을 갖는 측정치를 얻을 수 있었다. 이것에 대하여, WST-3으로 처리하지 않은 비교예 6에서는 반응개시직후, 겨우 발색이 보였지만, 곧 퇴색이 되고, 5분 경과후에는 완전히 퇴색하였다. 이것 때문에, 흡광도를 측정할 수 있지 않고, 상기 표 5에 나타낸 바와 같이 상대치는 0%이었다.

이상과 같이, 본 발명의 측정방법은 상기 테트라졸륨 화합물을 시료에 첨가함으로써, 시료 중의 환원물질의 영향을 배제할 수 있기 때문에, 신뢰성이 뛰어난 측정을 할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 측정방법은 예를 들면, 임상의료에서의 각종 분석에 적용할 수 있고, 특히, 당뇨병 진단에 있어서 중요하며, 적혈구 중의 당화 헤모글로빈 등의 당화 단백질의 측정에 유용하다.

Claims

시료 중의 측정 대상물을 산화환원반응을 이용하여 측정하는 방법에 있어서, 상기 산화환원반응에 앞서서, 시료에 테트라졸륨 화합물을 첨가하여 상기 시료 중에 포함되는 환원물질의 영향을 배제하여, 그 후, 상기 측정 대상물 유래의 환원물질 또는 산화물질을 발생시켜, 이 양을 산화환원반응에 의해 측정하여, 이 측정치로부터 상기 측정 대상물의 양을 결정하는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 테트라졸륨 화합물이 테트라졸환의 적어도 2 개소에 환 구조 치환기를 갖는 측정방법.
제 2 항에 있어서, 적어도 2 개의 환 구조 치환기의 환 구조가 벤젠환인 측정방법.
제 1 항에 있어서, 테트라졸륨 화합물이 테트라졸환의 적어도 3 개소에 환 구조 치환기를 갖고, 상기 환 구조 치환기 중 적어도 2 개의 환 구조 치환기의 환 구조가 벤젠환인 측정방법.
제 2 항에 있어서, 적어도 하나의 환 구조 치환기가 전자흡인성 작용기를 갖는 측정방법.
제 5 항에 있어서, 전자흡인성 작용기가 할로겐기, 에테르기, 에스테르기, 카복시기, 아실기, 니트로소기, 니트로기, 히드록시기 및 술포기로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 작용기인 측정방법.
제 1 항에 있어서, 테트라졸륨 화합물이 테트라졸환의 2 위치 및 3 위치에 벤젠환을 갖고, 상기 벤젠환 중 적어도 한 쪽이 할로겐기, 카복시기, 니트로기, 히드록시기, 술포기, 메톡시기 및 에톡시기로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 작용기를 갖는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 테트라졸륨 화합물이 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐) -5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염, 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염, 2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염, 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸륨염, 3,3'-(1,1'-비페닐-4,4'-디일)-비스(2,5-디페닐)-2H-테트라졸륨염,3,3'-[3,3'-디메톡시-(1,1'-비페닐)-4,4'-디일]-비스[2-(4-니트로페닐)-5-페닐-2H-테트라졸륨염], 2,3-디페닐-5-(4-클로로페닐)테트라졸륨염, 2,5-디페닐-3-(p-디페닐)테트라졸륨염, 2,3-디페닐-5-(p-디페닐)테트라졸륨염, 2,5-디페닐-3-(4-스티릴페닐)테트라졸륨염, 2,5-디페닐-3-(m-톨릴)테트라졸륨염 및 2,5-디페닐-3-(p-톨릴)테트리졸륨염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물인 측정방법.
제 1 항에 있어서, 테트라졸륨 화합물이 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염인 측정방법.
제 1 항에 있어서, 테트라졸륨 화합물을 시료 1 ㎕ 당 O.001∼100 μmol의 범위가 되도록 첨가하는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 시료가 전혈이고, 테트라졸륨 화합물을 전혈 1 ㎕ 당 0.001∼10 μmol의 범위가 되도록 첨가하는 측정방법.
제 9 항에 있어서, 시료가 전혈이고, 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨염을 전혈 1 ㎕ 당 0.001∼0.4 μmol의 범위가 되도록 첨가하는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 측정 대상물 유래의 산화물질이 과산화수소이고, 산화환원반응의 측정이 상기 과산화수소 양의 측정인 측정방법.
제 13 항에 있어서, 과산화수소 양의 측정이 퍼옥시다아제와 산화에 의해 발색하는 기질을 사용한 측정인 측정방법.
제 14 항에 있어서, 기질이 N-(카복시메틸아미노카보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨인 측정방법.
제 1 항에 있어서, 측정 대상물이 적혈구내 성분인 측정방법.
제 13 항에 있어서, 측정 대상물이 적혈구내의 당화 단백질이고, 상기 당화 단백질의 당부분을 프룩토실아미노산 옥시다아제로 산화분해함으로써 과산화수소를 발생시키는 측정방법.
제 1 항에 있어서, 시료 중의 환원물질의 분자량이 10,000 이상인 측정방법.
제 1 항에 있어서, 시료 중의 환원물질이 단백질인 측정방법.
제 1 항에 있어서, 시료 중의 환원물질이 헤모글로빈인 측정방법.