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CN115531291B - 一种可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶，未载药赖氨大黄酸自组装水凝胶是以赖氨大黄酸为原料，将赖氨大黄酸溶解于磷酸盐缓冲溶液中，超声分散得到赖氨大黄酸自组装水凝胶。本发明还公开了一种载药赖氨大黄酸自组装水凝胶，载药赖氨大黄酸自组装水凝胶是以赖氨大黄酸、带有芳香环的药物为原料，以磷酸盐缓冲溶液为溶剂，将带有芳香环的药物配制成含药溶液，将含药溶液与赖氨大黄酸混合，涡旋使赖氨大黄酸充分溶解，得到包含药物和赖氨大黄酸的溶液，再经超声分散得到载药赖氨大黄酸自组装水凝胶。与大黄酸相比，赖氨大黄酸在广泛的pH范围内均可形成均匀、稳定的可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶，制备方法简单且无需有机溶剂。

Description

一种可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于中药领域，涉及一种可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶及其制备方法与应用，以及载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
脑胶质瘤是一种具有高度侵袭性的常见的原发性颅内肿瘤，手术切除后即便进行化疗与放疗等治疗，生存期也仅为14个月。在外科手术结束时，若将治疗药物绕过血脑屏障直接递送至切除腔局部，则可提高疗效，减轻药物的毒副作用，改善脑胶质瘤患者的生存机会。目前，以晶片为药物载体的局部植入剂如卡莫司汀晶片已进入临床试验。然而，晶片的永久形状与刚度不利于药物的扩散及向肿瘤深部的渗透。因此，开发新的药物局部递送载体至关重要。
大量证据表明，脑胶质瘤的进展受到肿瘤微环境内肿瘤细胞和免疫细胞之间复杂相互作用的影响。免疫系统对肿瘤的响应促进了神经炎性肿瘤微环境的形成，而神经炎症是引起胶质瘤的存活和进展的关键因素之一。手术切除肿瘤也会导致脑部炎症的发生。
水凝胶作为一种高分子网络体系，具有可注射、机械强度可调等特点，被认为是局部给药的理想药物载体。近年来，多种携载药物的超分子水凝胶递送系统被用于肿瘤切除术后空腔。然而，目前市售的凝胶基质普遍生物相容性和生物降解性较差，且载药量较低，对临床应用带来了很大的障碍。因此，无需任何药物载体、可注射并具有刺激响应性的药物自组装凝胶递送系统引起了广泛关注。
大黄酸作为一种从中药大黄中分离出来的蒽醌类衍生物，因能发挥抗神经炎症作用而被用来治疗神经退行性疾病和脑外伤的神经损伤。已有研究表明，大黄酸也能够抑制胶质瘤细胞的生长，具有抗胶质瘤的潜力。大黄酸平面结构上蒽醌环及羧酸根的存在使其具有自组装形成水凝胶的潜能。然而，大黄酸极差的水溶性使其成胶的条件十分严格，只能在pH 8.0～9.4的范围内溶解超声分散后成胶，这极大的限制了它在脑胶质瘤切除术后切除腔局部的应用。此外，联合用药因可以提高药物对肿瘤的治疗效果，被广泛应用于肿瘤的治疗中，但大黄酸严苛的成胶条件极大的限制了其载药的可能性。
因此，寻找一种改善了大黄酸水溶性，在不影响其药理活性的同时保留其成胶潜能的大黄酸衍生物，并将其制备为可载药的自组装水凝胶应用于脑胶质瘤切除术后切除腔局部就显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于解决大黄酸因溶解性差自组装成胶条件严苛的问题，提供一种可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶，在无需有机溶剂参与的条件下、在pH 6～10的范围内均可形成均匀、稳定的水凝胶，该水凝胶具有抗肿瘤、抗神经炎症活性，且具备可载药性能，可以荷载具有不同药理活性的药物。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶(RHL-hydrogel)，所述的未载药赖氨大黄酸自组装水凝胶是以赖氨大黄酸为原料，将赖氨大黄酸溶解于磷酸盐缓冲溶液中，超声分散得到赖氨大黄酸自组装水凝胶。
赖氨大黄酸(rheinlysinate,RHL)是大黄酸的羧基与赖氨酸的氨基结合形成的盐类化合物。所述的赖氨大黄酸是由以下方法制得的：将大黄酸和水混匀，分批加入赖氨酸，待赖氨酸加入完毕，体系中大黄酸应全部溶解；在温度32℃下搅拌反应24小时，反应结束后，向反应液中滴入丙酮，滴加完毕后，于-20℃析晶，收集结晶，用无水乙醇清洗，真空干燥，即得赖氨大黄酸。
所述的大黄酸和水的质量比为1:250；所述的水和丙酮的体积比为1:4。
所述的大黄酸和赖氨酸的投料摩尔比为1:2～1:3。赖氨大黄酸能否成胶与大黄酸与赖氨酸的投料摩尔比息息相关。发明人按照实施例1，只调整大黄酸与赖氨酸的投料摩尔比(1:2,1:3,1:4)制得赖氨酸与大黄酸比例不同的赖氨大黄酸盐，并考察在pH 7.4条件下的成胶能力：称取赖氨大黄酸6mg于螺口瓶中，加入1mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，涡旋溶解，得到浓度为6mg/mL的赖氨大黄酸溶液，在超声功率100W、冰浴条件下超声分散10分钟。试验结果表明，与大黄酸相比，各个摩尔比所制备的赖氨大黄酸溶解度均明显增加，但仅投料比为1:2～1:3所制备的赖氨大黄酸盐超声分散后才能成胶。具体结果如下：按照大黄酸和赖氨酸的投料摩尔比1:2制备的赖氨大黄酸盐超声分散后易制备成均匀稳定、可倒置的水凝胶；按照大黄酸和赖氨酸的投料摩尔比1:3制备的赖氨大黄酸超声分散后可以成胶，但成胶较以1:2的摩尔比投料所制备的赖氨大黄酸难，具体为：采用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液将两个不同投料比下制备的赖氨大黄酸盐配制成浓度为6mg/mL的溶液，投料比1:3合成的赖氨大黄酸盐超声分散成胶所需的时间较投料比1:2的时间更长，且超声分散后需要静置一段时间或者存放于冰箱一段时间后才能稳定倒置，即成胶后的稳定性不如投料比1:2(投料比1:2制备的赖氨大黄酸盐超声分散后即可形成均匀稳定可倒置的凝胶，且超声分散所需时间更短；按照大黄酸和赖氨酸的摩尔比1:4制备的赖氨大黄酸，超声分散后无法成胶。
优选的，所述的大黄酸和赖氨酸的投料摩尔比为1:2。
赖氨大黄酸的浓度越高，超声分散成胶后水凝胶的稳定性越好，随着赖氨大黄酸浓度的增加，其所能荷载的药物量也随之增加，所述的赖氨大黄酸的浓度为4～14mg/mL，优选为4～12mg/mL；所述的磷酸盐缓冲液的pH为6～10。
所述的超声分散的功率为75～150W，优选为100W，超声分散的时间为5～30min。
所述的超声分散在冰浴条件下进行。
本发明的另一个目的是提供了一种所述的可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶的制备方法，包括：将赖氨大黄酸溶解于磷酸盐缓冲溶液中，超声分散得到赖氨大黄酸自组装水凝胶。该制备方法工艺简单且无需有机溶剂。
本发明另一个目的是提供所述的可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶在制备治疗脑胶质瘤或小胶质细胞介导的神经退行性疾病的药物、制备治疗脑外伤引起的神经损伤药物的应用。
作为本发明的进一步优选方案，本发明的另一个目的是一种载药赖氨大黄酸自组装水凝胶，所述的载药赖氨大黄酸自组装水凝胶是以赖氨大黄酸、带有芳香环的药物为原料，以磷酸盐缓冲溶液为溶剂，将带有芳香环的药物配制成含药溶液，将含药溶液与赖氨大黄酸混合，涡旋使赖氨大黄酸充分溶解，得到包含药物和赖氨大黄酸的溶液，再经超声分散得到载药赖氨大黄酸自组装水凝胶。
所述的带有芳香环的药物为5-氟尿嘧啶、替莫唑胺或依达拉奉等。
所述的磷酸盐缓冲液的pH为6～10。
所述的含药溶液的配制方法为：称取带有芳香环的药物，加入磷酸盐缓冲液，涡旋30s，超声使药物充分溶解，得到含药溶液。
所述的包含药物和赖氨大黄酸的溶液中，赖氨大黄酸的浓度为4～14mg/mL，带有芳香环的药物的浓度为0.1～2.5mg/mL。
所述的超声分散的功率为100～200W，超声分散的时间为10～40min。
所述的超声分散在冰浴条件下进行。
本发明另一个目的是提供所述的载药赖氨大黄酸自组装水凝胶在制备治疗脑胶质瘤或保护神经损伤药物的应用。
具体的，荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶中，替莫唑胺与赖氨大黄酸可发挥协同作用，效果显著，明显抑制肿瘤细胞的增殖，有望成为一种比较理想的脑胶质瘤术后空腔局部植入物。本发明还提供了荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶在制备治疗脑胶质瘤药物的应用。
本发明的有益效果在于：
与大黄酸相比，赖氨大黄酸具有更好的水溶性，在广泛的pH范围内均可形成均匀、稳定的可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶，制备方法简单且无需有机溶剂。凝胶的形成极大的延缓了赖氨大黄酸的释放，并保留了赖氨大黄酸自身的抗肿瘤、抗神经炎症等药理活性，具备胶质瘤术后空腔局部应用的潜力。简便易行的成胶条件，广泛的成胶范围使得赖氨大黄酸自组装水凝胶可以荷载具有不同药理活性的药物，如抗肿瘤药5-氟尿嘧啶、替莫唑胺，神经保护剂依达拉奉等，赖氨大黄酸可与所荷载的药物发挥协同作用，为胶质瘤术后及其他局部的药物递送提供新的思路。
附图说明
图1是实施例2制备的赖氨大黄酸溶液与赖氨大黄酸自组装水凝胶的数码照片。
图2是实施例2制备的赖氨大黄酸溶液与赖氨大黄酸自组装水凝胶的荧光发射光谱图。
图3是实施例2中赖氨大黄酸粉末与赖氨大黄酸自组装水凝胶冻干粉的红外光谱图。
图4是实施例3不同pH条件下制备的赖氨大黄酸自组装水凝胶的数码照片。
图5是实施例4制备的赖氨大黄酸自组装水凝胶的透射电镜图(A)与扫描电镜图(B)。
图6是赖氨大黄酸自组装水凝胶的体外释药行为；其中，A为浓度6mg/mL的赖氨大黄酸溶液制得的赖氨大黄酸自组装水凝胶的体外释药行为，B为浓度12mg/mL的赖氨大黄酸溶液制得的赖氨大黄酸自组装水凝胶的体外释药行为。
图7是赖氨大黄酸溶液与赖氨大黄酸自组装水凝胶对U87细胞的增殖抑制作用；其中，A为给药24h对U87细胞的增殖抑制作用，B为给药72h对U87细胞的增殖抑制作用。
图8是赖氨大黄酸溶液与赖氨大黄酸自组装水凝胶对被LPS激活的BV2细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)的抑制作用。
图9是赖氨大黄酸溶液与赖氨大黄酸自组装水凝胶对被LPS激活的BV2细胞分泌白介素6(IL-6)的抑制作用。
图10是分别荷载了5-氟尿嘧啶、替莫唑胺和依达拉奉的赖氨大黄酸自组装水凝胶于室温下放置0天与30天的数码照片图片。
图11是中分别荷载了5氟尿嘧啶、替莫唑胺和依达拉奉的赖氨大黄酸自组装水凝胶的透射电镜图。
图12是未载药赖氨大黄酸自组装水凝胶与荷载了替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶对U87细胞的增殖抑制作用
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。
本发明所采用试剂：大黄酸、赖氨酸、替莫唑胺、5-氟尿嘧啶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、依达拉奉(南京医科大学药化实验室)。
实施例1
赖氨大黄酸的制备
将100mg大黄酸加入到250mL茄形瓶中，向茄形瓶中加入25mL双蒸水，置于磁力搅拌器上搅拌30分钟；称取103mg赖氨酸，分批缓慢加入到茄形瓶中，边加入边观察大黄酸的溶解情况，控制加入时间在140分钟，加完赖氨酸后，反应液中大黄酸应全部溶解，呈现红棕色透明溶液；反应液于32℃搅拌反应24小时，向反应液中缓慢滴加丙酮，控制滴速约6滴/分钟，边滴加边观察反应液的变化，加入100mL丙酮后停止加入，将茄形瓶放于-20℃冰箱中过夜，次日观察到茄形瓶内壁析出紫色结晶，部分紫色结晶沉于茄形瓶底部；反应液过滤，滤饼及茄形瓶真空干燥，刮下反应瓶壁结晶及滤饼，并用无水乙醇清洗3次，离心去除洗液，产物于真空干燥箱干燥过夜，即得赖氨大黄酸，是大黄酸的羧基与赖氨酸的氨基结合形成的盐类化合物。
实施例2
赖氨大黄酸酸自组装水凝胶的制备
(1)、称取3.63g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、8.0g氯化钠，加入双蒸水1L，用盐酸与氢氧化钠溶液调节pH至7.4，配制得磷酸盐缓冲溶液。
(2)、称取赖氨大黄酸6mg于螺口瓶中，加入1mL pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，涡旋溶解，得到浓度为6mg/mL的赖氨大黄酸溶液，在超声功率100W、冰浴条件下超声分散10分钟，制备得到赖氨大黄酸自组装水凝胶。
用数码相机记录赖氨大黄酸溶液和赖氨大黄酸自组装水凝胶的外观，如图1所示，赖氨大黄酸自组装水凝胶呈红棕色，均匀稳定，且可倒置。
吸取适量本实施例赖氨大黄酸溶液与自组装水凝胶，以434nm为激发波长，扫描所有样品在450～700nm处的发射光强度，分别绘制赖氨大黄酸溶液和赖氨大黄酸自组装水凝胶的荧光发射光谱。如图2所示，当游离状态的赖氨大黄酸溶液通过超声分散转变为水凝胶状态时，其荧光强度大幅下降，这主要归因于赖氨大黄酸上蒽醌环的π-π相互作用，它抑制了赖氨大黄酸的构象旋转并淬灭了荧光。该结果证明了π-π堆积在赖氨大黄酸自组装水凝胶形成中起到重要作用。
将本实施例制备得到的赖氨大黄酸自组装水凝胶冷冻干燥得到干凝胶，分别称取等质量的干凝胶与赖氨大黄酸粉末，分别与溴化钾进行压片，得到片状样品，检测赖氨大黄酸自组装水凝胶和赖氨大黄酸粉末的傅里叶红外光谱图。如图3所示，赖氨大黄酸粉末于2919cm-1和2850cm-1处的氨盐的伸缩振动峰以及1623cm-1处的羧基离子强峰，均在形成水凝胶后发生了偏移，氨盐的伸缩振动峰偏移至2942cm-1和2869cm-1处，羧基离子强峰偏移至1629cm-1处。该结果证明了氢键在赖氨大黄酸自组装水凝胶形成中起到重要作用。
实施例3
pH对赖氨大黄酸成胶能力的影响
称取赖氨大黄酸6mg于螺口瓶中，平行8份，分别向其中加入1mL pH为4、5、6、7.4、8、9、10、11的磷酸盐缓冲溶液，涡旋溶解，得到浓度为6mg/mL、不同pH的赖氨大黄酸溶液，在超声功率100W、冰浴条件下超声分散10分钟，观察pH对赖氨大黄酸成胶能力的影响。
如图4所示，浓度为6mg/mL的赖氨大黄酸溶液在pH6～10内均能自组装形成均匀稳定、可倒置的水凝胶。随着pH的逐渐增加，样品逐渐由黄色转为深红棕色。过酸(pH＜6)、过碱(pH＞10)都不利于水凝胶的形成。当溶剂的pH小于6时，赖氨大黄酸的结构会被破坏，黄色的大黄酸原料析出。这一结果证明了赖氨大黄酸能在较广泛的pH范围内成胶。
实施例4赖氨大黄酸酸自组装水凝胶的微观结构考察
制备4mg/mL的赖氨大黄酸溶液与自组装水凝胶：称取赖氨大黄酸4mg于螺口瓶中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液1mL，涡旋溶解得到浓度为4mg/mL的赖氨大黄酸溶液，在超声功率100W、冰浴条件下超声分散10分钟，制备得到赖氨大黄酸自组装水凝胶。
透射电子显微镜：吸取适量赖氨大黄酸自组装水凝胶于载玻片上，用镊子夹取铜网在样品中轻轻的来回捞几下，将铜网正面朝上置于滤纸上，于阴凉处自然风干后利用透射电子显微镜观察水凝胶微观结构(图5A)，赖氨大黄酸自组装水凝胶呈现出由连贯的纳米纤维构成的网络状结构。
扫描电子显微镜：吸取适量赖氨大黄酸自组装水凝胶样品于西林瓶中，置于-80℃预冻至固态后用冷冻干燥机冻干24小时，得到水凝胶粉末。将适量水凝胶粉末喷金处理后于扫面电子显微镜下观测其微观结构(图5B)，赖氨大黄酸自组装水凝胶呈现出多孔的三维空间立体结构。
实施例5
赖氨大黄酸自组装水凝胶的体外释药行为
制备6mg/mL的赖氨大黄酸溶液与自组装水凝胶：称取赖氨大黄酸6mg于螺口瓶中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液1mL，涡旋溶解得到浓度为6mg/mL的赖氨大黄酸溶液，在超声功率100W、冰浴条件下超声分散10分钟，制备得到赖氨大黄酸自组装水凝胶。
制备12mg/mL的赖氨大黄酸溶液与自组装水凝胶：称取赖氨大黄酸12mg于螺口瓶中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液1mL，涡旋溶解得到浓度为12mg/mL的赖氨大黄酸溶液，在超声功率100W、冰浴条件下超声分散15分钟，制备得到赖氨大黄酸自组装水凝胶。
采用pH7.4的PBS为释放介质，模拟体内生理环境考察赖氨大黄酸自组装水凝胶的体外释药行为。分别取适量浓度分别为6mg/mL与12mg/mL的赖氨大黄酸溶液以及各自浓度制得的赖氨大黄酸自组装水凝胶，置于15mL离心管底部，加入预热到37℃的释放介质10mL，将各离心管置于37℃的摇床中，以100rpm的频率恒温震荡，于0.25、0.5、1、2、4、6、9、12、24、36、48、72小时等预设时间点，吸取释放介质150μL，同时补充等量的预热好的新鲜释放介质。不同时间点取出的释放介质用PBS稀释至适当浓度，用全波长酶标仪于434nm处检测其紫外吸光度，依据赖氨大黄酸标准曲线计算其累计释放百分比，考察其体外释药行为。平行操作三份。
如图6所示，由浓度为6mg/mL的赖氨大黄酸溶液制得的水凝胶(图6A)在4天后可释放出80％的赖氨大黄酸，而赖氨大黄酸溶液(浓度为6mg/mL)释放出相同的量仅需要36小时；由浓度为12mg/mL的赖氨大黄酸溶液制得的水凝胶(图6B)，其缓慢释放出80％的赖氨大黄酸需要20天，这远长于赖氨大黄酸溶液(浓度为12mg/mL)释放出相同药物所需的7天。以上结果表明，赖氨大黄酸溶液自组装形成水凝胶后，明显延缓了赖氨大黄酸的体外释放。
实施例6
一、赖氨大黄酸自组装水凝胶对U87细胞的增殖抑制作用
药液的配制：
含赖氨大黄酸自组装水凝胶培养基的配制：以赖氨大黄酸自组装水凝胶(参照实施例2制备)为母液，加入DMEM培养基稀释成赖氨大黄酸自组装水凝胶(以赖氨大黄酸计)浓度分别为20μM(8.6μg/mL)、40μM(17.2μg/mL)、80μM(34.4μg/mL)、160μM(68.8μg/mL)的含赖氨大黄酸自组装水凝胶培养基。
含赖氨大黄酸溶液培养基的配制：取浓度为6mg/mL的赖氨大黄酸溶液(参照实施例2制备)为母液，加入DMEM培养基稀释成赖氨大黄酸浓度分别为20μM(8.6μg/mL)、40μM(17.2μg/mL)、80μM(34.4μg/mL)、160μM(68.8μg/mL)的含赖氨大黄酸溶液培养基。
给药：
取处于对数生长期、生长状况良好的U87细胞株，细胞计数后用DMEM培养基重悬，以5×103个/孔的密度均匀的接种于96孔板上，于细胞培养箱常规培养24小时后，弃去培养基，分别加入未含药培养基、不同浓度的含赖氨大黄酸自组装水凝胶培养基、含赖氨大黄酸溶液培养基，以添加同体积的未含药培养基于接种细胞孔为阴性对照组，以添加同体积的未含药培养基于未接种细胞孔为空白对照组，分别培养24、72小时后，每孔加入10μL用PBS配制的5mg/mL的MTT溶液，于孵育箱中继续培养4小时，小心的弃去上层培养基，每孔加入150μL二甲亚砜，避光震荡10分钟使板底的紫色结晶完全溶解，于酶标仪上在570nm处检测每孔的吸光度值，按公式(1)计算细胞存活率，从而考察赖氨大黄酸自组装水凝胶对U87的增殖抑制作用。
如图7A所示，给药24h后，20～160μM的赖氨大黄酸溶液与赖氨大黄酸自组装水凝胶均显著的降低了U87细胞的活力(****P<0.0001，与阴性对照组比较)，且赖氨大黄酸溶液和水凝胶对U87细胞增殖的抑制作用相当。如图7B，随着给药时间延长至72小时，U87细胞的活力持续下降，进一步证明了赖氨大黄酸对U87细胞的增殖抑制作用。从图7可以看出，给药72小时后，与水凝胶相比，赖氨大黄酸溶液对U87细胞展现出更强的增殖抑制的作用(****P<0.0001，与阴性对照组比较；NS：差别无统计学意义，###P<0.001，####P<0.0001，组间比较)，这归因于水凝胶的缓释延长了药物的起效时间。
二、赖氨大黄酸自组装水凝胶对被LPS激活的BV2细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的抑制作用
药液的配制：
含赖氨大黄酸自组装水凝胶培养基的配制：以赖氨大黄酸自组装水凝胶(参照实施例2制备)为母液，加入DMEM培养基稀释成赖氨大黄酸自组装水凝胶浓度(以赖氨大黄酸计)为20μM(8.6μg/mL)的含药培养基1。
含赖氨大黄酸溶液培养基的配制：取浓度为6mg/mL的赖氨大黄酸溶液(参照实施例2制备)为母液，加入DMEM培养基稀释成赖氨大黄酸浓度为20μM(8.6μg/mL)的含药培养基2。
取处于对数生长期、生长状况良好的BV2细胞株，细胞计数后以8×104个/孔的密度均匀的接种于24孔板上，于细胞培养箱中常规培养24小时后，弃去培养基，分别加入未含药培养基，含药培养基1、2预处理BV2细胞1小时后，加入LPS溶液至LPS终浓度为100ng/mL孵育24小时，以仅加入同体积未含药培养基预处理且未经LPS刺激的BV2细胞为control组，以仅加入同体积未含药培养基预处理且经LPS刺激的BV2细胞为vehicle组，按照IL-6和TNF-α的ELISA试剂盒检测说明书分别检测BV2细胞培养基中的IL-6和TNF-α含量，用0.1％的曲拉通裂解孔板上的细胞，3000转离心20分钟后，收集上层清液，按照BCA试剂盒检测说明书测定每孔蛋白含量，以检测出的IL-6和TNF-α的含量与该孔蛋白含量的比值衡量该孔产生IL-6和TNF-α的水平。
如图8、图9所示，与赖氨大黄酸相比，赖氨大黄酸自组装水凝胶展现出更优的抑制BV2细胞分泌TNF-α和IL-6的能力(NS：差别无统计学意义，***P<0.001，****P<0.0001，与control组比较；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001，组间比较)。这一结果验证了赖氨大黄酸的抗神经炎症活性，而且水凝胶的形成能更好的发挥出药效。
实施例7
荷载5-氟尿嘧啶、替莫唑胺和依达拉奉的赖氨大黄酸自组装水凝胶的制备
称取5-氟尿嘧啶2mg于EP管中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液1mL，涡旋30s，超声使药物充分溶解，得到含药磷酸盐缓冲溶液；称取赖氨大黄酸8mg于EP管中，加入含药磷酸盐缓冲溶液，涡旋使赖氨大黄酸充分溶解，在超声功率125W、冰浴条件下超声分散20分钟得到荷载5-氟尿嘧啶的赖氨大黄酸自组装水凝胶。
称取替莫唑胺2mg于EP管中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液1mL，涡旋30s，超声使药物充分溶解，得到含药磷酸盐缓冲溶液；称取赖氨大黄酸8mg于EP管中，加入含药磷酸盐缓冲溶液，涡旋使赖氨大黄酸充分溶解，在超声功率125W、冰浴条件下超声分散20分钟得到荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶。
称取依达拉奉1.33mg于EP管中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液1mL，涡旋30s，超声使药物充分溶解，得到含药磷酸盐缓冲溶液；称取赖氨大黄酸8mg于EP管中，加入含药磷酸盐缓冲溶液，涡旋使赖氨大黄酸充分溶解，在超声功率125W、冰浴条件下超声分散30分钟得到荷载依达拉奉的赖氨大黄酸自组装水凝胶。
用数码相机分别记录刚制备好与室温放置30天后的荷载药物的载药赖氨大黄酸自组装水凝胶的外观。如图10所示，表明赖氨大黄酸自组装水凝胶具有载药能力，可荷载5-氟尿嘧啶、替莫唑胺和依达拉奉等小分子药物。且载药水凝胶在室温下放置30天后仍呈凝胶状态，可稳定倒置，这验证了载药凝胶具有较好的稳定性。
实施例8
载药赖氨大黄酸自组装水凝胶的透射电镜图
称取5-氟尿嘧啶0.2mg于EP管中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液1mL，涡旋30s，超声使药物充分溶解，得到含药磷酸盐缓冲溶液；称取赖氨大黄酸4mg于EP管中，加入含药磷酸盐缓冲溶液，涡旋使赖氨大黄酸充分溶解，在超声功率125W、冰浴条件下超声分散20分钟得到荷载5-氟尿嘧啶的赖氨大黄酸自组装水凝胶。
称取替莫唑胺0.2mg于EP管中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液1mL，涡旋30s，超声使药物充分溶解，得到含药磷酸盐缓冲溶液；称取赖氨大黄酸4mg于EP管中，加入含药磷酸盐缓冲溶液，涡旋使赖氨大黄酸充分溶解，在超声功率125W\冰浴条件下超声分散20分钟得到荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶。
称取依达拉奉0.1mg于EP管中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液1mL，涡旋30s，超声使药物充分溶解，得到含药磷酸盐缓冲溶液；称取赖氨大黄酸4mg于EP管中，加入含药磷酸盐缓冲溶液，涡旋使赖氨大黄酸充分溶解，在超声功率125W、冰浴条件下超声分散30分钟得到荷载依达拉奉的赖氨大黄酸自组装水凝胶。
分别吸取适量分别荷载了不同药物的赖氨大黄酸自组装水凝胶于载玻片上，用镊子夹取铜网在样品中轻轻的来回捞几下，将铜网正面朝上置于滤纸上，于阴凉处自然风干后利用透射电子显微镜观察水凝胶微观结构。如图11所示，荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶、荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶和荷载依达拉奉的赖氨大黄酸自组装水凝胶均呈现出与未载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶(实施例4)相似的连贯的纳米纤维网络结构。表明加入适量5-氟尿嘧啶、替莫唑胺和依达拉奉等带有芳香环的小分子药物并不影响赖氨大黄酸自组装水凝胶的微观结构。
实施例9
参照实施例7荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶的制备方法，仅将赖氨大黄酸的用量从8mg调整为6mg，制得荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶。
待测药液的配制：取实施例2制得的赖氨大黄酸酸自组装水凝胶、替莫唑胺、本实施例制得的荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶，采用DMEM培养基，分别配制得到浓度(以赖氨大黄酸计)为40μM的赖氨大黄酸自组装水凝胶稀释液，浓度为30μM的替莫唑胺溶液，赖氨大黄酸浓度为40μM、替莫唑胺浓度为30μM的荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶稀释液。
荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶对U87细胞的增殖抑制作用
取处于对数生长期生长状况良好的U87细胞株，细胞计数后用DMEM培养基重悬，以5×103个/孔的密度均匀的接种于96孔板上，于细胞培养箱常规培养24小时后，弃去培养基，分别加入浓度为40μM的赖氨大黄酸自组装水凝胶稀释液，浓度为30μM的替莫唑胺溶液，以及赖氨大黄酸浓度为40μM、替莫唑胺浓度为30μM的荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶稀释液，以添加同体积培养基于接种细胞孔为阴性对照组，以添加同体积培养基于未接种细胞孔为空白对照组，分别培养24、48、72、120小时后，每孔加入10μL用PBS配制的5mg/mL的MTT溶液，于孵育箱中继续培养4小时后，小心的弃去上层培养基，每孔加入150μL二甲亚砜，避光震荡10分钟使板底的紫色结晶完全溶解，于酶标仪上在570nm处检测每孔的吸光度值，按公式(1)计算细胞存活率，从而考察赖氨大黄酸自组装水凝胶对U87的增殖抑制作用。
如图12所示，随着给药时间的延长，与替莫唑胺溶液与未载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶相比，载药水凝胶(TMZ-loaded hydregel)中替莫唑胺与赖氨大黄酸间发挥协同作用，能更好的抑制U87细胞的增殖，当给药时间延长至120小时，载药水凝胶对U87细胞的增殖抑制作用明显优于未载药赖氨大黄酸自组装水凝胶(*P<0.05，与对应给药时间的荷载替莫唑胺的赖氨大黄酸自组装水凝胶比较)。

Claims (7)

1.一种载药赖氨大黄酸自组装水凝胶，其特征在于：所述的载药赖氨大黄酸自组装水凝胶是以赖氨大黄酸、带有芳香环的药物为原料，以磷酸盐缓冲溶液为溶剂，将带有芳香环的药物配制成含药溶液，将含药溶液与赖氨大黄酸混合，涡旋使赖氨大黄酸充分溶解，得到包含药物和赖氨大黄酸的溶液，再经超声分散得到载药赖氨大黄酸自组装水凝胶；
赖氨大黄酸是大黄酸的羧基与赖氨酸的氨基结合形成的盐类化合物；所述的大黄酸和赖氨酸的投料摩尔比为1:2～1:3；
所述的带有芳香环的药物为5-氟尿嘧啶、替莫唑胺或依达拉奉；
所述的磷酸盐缓冲液的pH为6～10；
包含药物和赖氨大黄酸的溶液中，赖氨大黄酸的浓度为4～14 mg/mL，带有芳香环的药物的浓度为0.1～2.5 mg/mL。
2.根据权利要求1所述的载药赖氨大黄酸自组装水凝胶，其特征在于：所述的超声分散的功率为100～200 W，超声分散的时间为10～40 min。
3.权利要求1所述的载药赖氨大黄酸自组装水凝胶在制备治疗脑胶质瘤或保护神经损伤药物的应用。
4.一种可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶，其特征在于：所述的可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶是以赖氨大黄酸为原料，将赖氨大黄酸溶解于磷酸盐缓冲溶液中，超声分散得到赖氨大黄酸自组装水凝胶；
赖氨大黄酸是大黄酸的羧基与赖氨酸的氨基结合形成的盐类化合物；所述的大黄酸和赖氨酸的投料摩尔比为1:2～1:3；
所述的赖氨大黄酸的浓度为4～14 mg/mL；所述的磷酸盐缓冲液的pH为6～7.4。
5.根据权利要求4所述的可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶，其特征在于：所述的赖氨大黄酸的浓度为4～12 mg/mL。
6.根据权利要求4所述的可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶，其特征在于：所述的超声分散的功率为75～150 W，超声分散的时间为5～30 min。
7.权利要求4所述的可载药的赖氨大黄酸自组装水凝胶在制备治疗脑胶质瘤或小胶质细胞介导的神经退行性疾病的药物、制备治疗脑外伤引起的神经损伤药物的应用。
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