CN103524639B - 一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药用材料技术领域，为解决目前临床使用的许多化学抗肿瘤药物存在着选择性差、难溶于水的问题，本发明提供一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法，通过选用不同分子量的壳寡糖和不同接枝率的吲哚美辛，可以达到对药物的控、缓释放。同时本发明还提供一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物在难溶性药物靶向载体上的应用，即提供一种负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛的微粒给药系统，本发明的给药系统具有高载药量和包封率的特点。

Description

一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法及其应用

技术领域

本发明涉及药用辅助材料技术领域，具体涉及一种壳聚糖/吲哚美辛的合成方法及其应用。

背景技术

癌症是当今最为常见的、影响人类健康并导致死亡的主要病因之一。据美国癌症协会的一项最新报告估计，2007年全球的新增癌症病例将超过1200万，并且有760万人死于癌症，即每天有2万人死于癌症。癌症正在成为全球面临的最重要疾病之一。最近30年在中国，癌症发病数以年均3％-5％的速度递增。每年新发癌症为280万，每4至5个死亡者中就有1个死于癌症，癌症已成为威胁国民健康的头号杀手。因此，癌症的治疗是摆在我们医药工作者面前的重大挑战，研制出有效的抗癌药品，将是我国医药学界面临的长期、艰巨的任务。

目前治疗癌症的手段主要包括：手术、介入、化疗、放射等治疗手段。手术是目前治疗恶性肿瘤的重要手段之一，但只对早期的病例有效，对中晚期和转移的肿瘤并不能彻底的根治，须结合其他的治疗方法综合治疗。介入治疗主要用于局部、单发性的肿瘤治疗。放射治疗是利用射线的电离作用引起组织和细胞内部发生电离，抑制、破坏肿瘤细胞，最终使之死亡，从而达到治疗目的的一种物理疗法，由于要通过电离辐射，放射治疗会损害机体的健康组织，从而带来种种的副作用，同时降低人体的免疫能力，从而导致整个治疗的失败。化学药物治疗仍然是当今最经典、最常用的癌症治疗手段之一，用化学药物治疗肿瘤已有60年的历史。目前大约有180种的抗癌化学药物，其中80多种正式应用于临床。然而目前临床使用的许多抗肿瘤药物存在着以下缺点：首先是选择性差，化学抗癌药物进入体内后，它们在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞及组织造成毒性，产生严重的毒副作用，使人体的正常免疫系统遭到破坏；其次是难溶于水，许多有很好药理活性的化疗药物在人体生物水环境中溶解度非常低，稳定性差，导致生物利用度低，达不到有效治疗浓度，需要不断给药。因此，制备低毒性、高疗效、高生物利用度的抗肿瘤药物制剂对于药物新剂型的研究和开发，对于肿瘤、这一人类重大疾病的防治都具有重大的贡献和指导意义。

聚合物纳米粒是近几年用于提高难溶性药物溶解度的一个新手段，其特殊结构和性能引起人们高度兴趣和关注。聚合物纳米粒是由两亲基团在溶剂中自发形成的核-壳状结构，和常用的表面活性剂相比，具有较低的临界聚集浓度和稳定的空间结构，能够体现出特有的生物稳定性。通过对亲水、疏水二部分基团的选择和修饰，赋予聚合物纳米粒不同的特性，以满足不同药物结构和给药部位的要求。与常用的表面活性剂相比，具有较低的临界纳米粒浓度和稳定的空间结构，能够体现出特有的生物稳定性。传统的聚合物纳米粒作为药物载体存在的主要困难包括：(1)纳米粒结构的大小限制了纳米粒内部的载药量；(2)在体内水性环境中载药纳米粒容易因解聚而导致药物的提前释放。因此需要从所包裹药物的结构特征出发，重新设计纳米粒载体分子适宜的疏水基团，对载体与药物在化学结构之间进行分子互补性设计，构建具有高载药量、良好生物稳定性的聚合物纳米粒。

聚合物纳米粒的亲水基团直接面对体内水性环境，因此亲水基团的结构和性能直接影响到载药纳米粒与人体之间的相容性，并在某种程度上影响其体内的分布。壳聚糖，是天然存在的、阳离子、多糖。它低毒，可生物降解，具有良好的生物相容性。壳聚糖分子上有活泼的羟基和氨基，为壳聚糖结构改性提供了活泼的官能团。在特定的条件下，壳聚糖能发生水解、烷基化、酰基化、羧甲基化、磺化、硝化、卤化、氧化、还原、缩合和络合等化学反应，生成具有不同性能的各种壳聚糖衍生物，从而扩大了壳聚糖的应用范围。由于壳聚糖具有的这一系列特殊的化学、生物性质，适合作为药物的控缓释载体，被广泛用于制剂研究。然而，由于壳聚糖高分子量、高粘性和高乙酰化，使得它不溶于一般的有机溶剂和水，这为其广泛应用造成了很大困难。为了改进其溶解性，人们对其进行了许多改性工作，其中经过酸溶和酶解得到的低分子壳寡糖保留了壳聚糖的优点，改进了其缺点，是理想的亲水性骨架材料，可用于聚合物纳米粒的构建。通过对壳寡糖分子量的调控，可实现纳米粒粒径的人为控制；其具有打开细胞膜间隙的能力，有利于聚合物纳米粒跨膜的转运；糖链上大量游离的自由氨基，为纳米粒接枝疏水性基团或其他功能基团提供可能。聚合物纳米粒作为药物载体还具有靶向性，可提高疗效，保护药物，药物释放时缓释的同时降低给药后药物对身体的毒副作用等优点。

申请号为200810062648.6的中国专利公开了一种水杨酸-g-壳寡糖接枝物及其合成方法，该方法以向水性化合物水杨酸为疏水性部分，以壳寡糖为亲水性部分，在水性介质中，通过自聚集形成水杨酸-g-壳寡糖胶团，但是这些空白胶团的粒径分布(PDI或者PI)较大，有些PI为0.878、0.988甚至1.0。因此，胶团在水中呈现大小不一、不稳定现象。该专利没有提供水杨酸-g-壳寡糖空白胶团的细胞毒性。但是据后续的实验发现，壳寡糖_MW＝18000/SA_{理论投料量＝50％}在肺癌细胞(A549)上毒性为IC50＝463.16μg/ml，在乳腺癌细胞(MCF-7)上毒性为IC50＝262.28μg/ml，毒性较大。

发明内容

为解决目前临床使用的许多化学抗肿瘤药物存在着选择性差、难溶于水的问题，本发明提供一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法，通过选用不同分子量的壳寡糖和不同接枝率的吲哚美辛，可以达到对药物的控、缓释放。

同时本发明还提供一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物在难溶性药物靶向载体上的应用，即提供一种负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛的微粒给药系统，本发明的给药系统具有高载药量和高包封率的特点。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法为以下步骤：

(1)称取碳二亚胺和吲哚美辛置于丙酮中，形成A液，将A液在5～55℃恒温下，搅拌使溶液溶解；然后称取壳寡糖置于蒸馏水中，形成B液，同样将B液在5～55℃恒温下搅拌溶解，在5～55℃时，B液在搅拌下，将A液滴入B液中，滴加完毕后，在5～55℃反应温度下反应5～72小时，然后将反应液转入透析袋以去离子水为透析液透析，透析6～24小时后将透析袋中的样品溶液冷冻干燥，得到壳寡糖/吲哚美辛接枝物粗产物冻干品；

(2)称取步骤(1)得到的壳寡糖/吲哚美辛接枝物粗产物冻干品，用蒸馏水溶解，配制成浓度为0.1～20mg/ml的溶液，在冰浴状态下超声处理，然后离心处理，离心结束后，取上清液，冷冻干燥，即得到壳寡糖/吲哚美辛接枝物的纯化品。壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成路线如下所示：

X为1分子壳寡糖链上未乙酰化的糖环数；Y为1分子壳寡糖链上乙酰化的糖环数。

作为优选，碳二亚胺与吲哚美辛的摩尔比为1～20∶1。

作为优选，壳寡糖的分子量为1000-45000，吲哚美辛与壳寡糖上自由氨基的摩尔比为0.01～200∶1。由于市购的壳寡糖去乙酰度一般为95％以上，因此可确定上述X，Y的值。

作为优选，步骤(1)中丙酮、蒸馏水的使用量分别为使溶质溶解的量。

作为优选，透析袋的膜截留分子量(MWCO)＝1000～10000。

作为优选，步骤(1)中透析步骤为前2～5小时每10min～45min换一次水，然后每隔0.5～2小时换一次水。

作为优选，步骤(2)超声处理中探头超声功率为50～1000瓦，每次超声时间1～5秒，超声间隔2～9秒，超声20～200次。

作为优选，步骤(2)离心处理中离心转速为2000～6000rpm、2～40℃温度下离心15～230分钟，作为更优选，2～10℃温度下离心15～30分钟。

本发明采用已经经过长期应用、证明是安全可靠的吲哚美辛作为疏水性部分，以壳寡糖为亲水性部分，在水性介质中，通过自聚集形成壳寡糖/吲哚美辛纳米粒。并且用这一材料负载难溶性药物，作为难溶性药物载体。

通过采用不同分子量的壳寡糖和改变吲哚美辛的不同投料量，合成一系列接枝率在1～50％之间的壳寡糖/吲哚美辛接枝物(CSO_Mw/Indo)。CSO/Indo形成的接枝物结构更规整，形成的纳米粒粒径分布更小。这些载体溶于水后可形成粒径在50～1000nm，ζ电位在5～90mV，临界聚集浓度为5～1000μg/ml的无药物负载(空白)的壳寡糖/吲哚美辛纳米粒。由于吲哚美辛为传统消炎药，毒性几乎没有，因此，经实验表明，壳寡糖/吲哚美辛这一空白载体的细胞毒性(IC50)在300～2000μg/ml之间。

上述的一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物作为难溶性药物靶向载体的应用，提供一种负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛的微粒给药系统。壳寡糖/吲哚美辛接枝物的应用在：既可做成壳寡糖/吲哚美辛空白纳米粒即无药物负载的壳寡糖/吲哚美辛纳米粒，又可做成壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒即有药物负载的壳寡糖/吲哚美辛纳米粒，也就是有药物负载的壳寡糖/吲哚美辛的微粒给药系统。

所述的一种负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛的微粒给药系统，其制备方法为：

1)盐酸阿霉素的碱化

称取盐酸阿霉素溶于二甲基亚砜中，制成盐酸阿霉素二甲基亚砜溶液的浓度为10g/L，然后加入2倍盐酸阿霉素摩尔量的三乙胺，避光搅拌4～18小时，再将反应液放入透析袋中，避光透析，透析液为去离子水，透析8～16小时后冷冻干燥，即得碱化阿霉素的冻干粉末；

透析袋的膜截留分子量MWCO＝1000～10000，透析步骤为：每隔半小时换一次水，4～5次后每隔一小时换一次水，作为优选，MWCO＝1000。

2)负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛微粒给药系统的制备：以步骤1)制备的碱化阿霉素为模型药物，用透析法制备负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒，

(a)、称取本发明制得的壳寡糖/吲哚美辛接枝物(CSO/Indo接枝物)的纯化品，加蒸馏水，在冰浴状态下进行超声处理，得到无药物负载(空白)的壳寡糖/吲哚美辛(CSO/Indo)纳米粒，溶液浓度为2mg/ml；超声处理中探头超声功率为50～1000瓦，超声时间1～5秒，超声间隔2～9秒，超声20～200次，作为优选，探头超声功率400w，超声2s，间隔4s，20次。

(b)、将步骤1)制备的碱化阿霉素的冻干粉末，用二甲基亚砜配制成浓度为1.0mg/ml的碱化阿霉素/二甲基亚砜溶液，在室温磁力搅拌下，向步骤(a)制备的无药物负载的壳寡糖/吲哚美辛纳米粒中滴加碱化阿霉素二甲基亚砜溶液，碱化阿霉素与壳寡糖/吲哚美辛接枝物的质量比为0.1∶1；然后冰浴超声处理，室温避光搅拌6～16小时，然后将反应液转移至透析袋中，透析液为去离子水，避光透析10小时后，将透析袋中剩余溶液离心处理，除去尚未增溶的碱化阿霉素固体，即得负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛给药系统溶液，然后冷冻干燥，即得到负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛微粒给药系统的冻干品。

超声处理中探头超声功率为50～1000瓦，超声时间1～5秒，超声间隔2～9秒，超声20～200次，作为优选，探头超声功率400W，超声2s，间隔4s，40次。

透析袋的膜截留分子量MWCO＝1000～10000，透析步骤为：每隔半小时换一次水，4～5次后每隔一小时换一次水，作为优选，MWCO＝7000，刚开始每隔半小时换一次水，4次后每隔一小时换一次水。

离心处理为离心转速为2000～6000rpm、2～40℃温度下离心15～230分钟，作为优选，离心转速4000rpm，2～10℃下离心15min。

室温为标准状况下25℃。

本发明选择已降解的低分子量壳寡糖为亲水部分，吲哚美辛作为疏水末端，通过壳寡糖上的氨基和这些化合物的羧基之间的化学反应，制备纳米粒载体材料。并以碱化的阿霉素作为难溶性药物模型，制备载药纳米粒。

上述负载阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛微粒给药系统在水溶液中可形成粒径为5～1000nm、zeta电位为5mV～+60mV的微粒。微粒的载药量为1％～80％，包封率为20％～100％。药物在体外漏槽条件下表现出缓慢释放特征，起到控释功能，该微粒给药系统的肿瘤细胞抑制率也得到提高。将载体材料荧光标记后制备载药纳米粒，经荷瘤裸鼠尾静脉注射后，在设定时间点处死小鼠，取各脏器组织切片，结果发现荧光标记的载体材料在肝脏大量富集。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明中的壳寡糖/吲哚美辛接枝物，壳寡糖为酶解的低分子，完全水溶。吲哚美辛和药物之间存在着范德华力，因此通过选用不同分子量的壳寡糖和不同接枝率的吲哚美辛，可以达到对药物的控、缓释放；

(2)壳寡糖/吲哚美辛空白纳米粒在细胞上呈现低毒性，可以作为药物载体使用；(3)本发明所述的壳寡糖/吲哚美辛微粒给药系统，制备简单，无有机溶剂残留；载药纳米粒具有高载药量和包封率的特点，对肿瘤细胞的抑制率比盐酸阿霉素的水溶液强，并具有肝脏靶向性。

说明附图

图1为不同分子量壳寡糖的标准曲线；

图2为无药物负载的壳寡糖/吲哚美辛纳米粒的TEM照片(放大倍数150000，标尺100nm)；

其中，(a)为CSO₉₀₀₀/Indo_5.72％；(b)为CSO₉₀₀₀/Indo_15.99％；(c)为CSO₉₀₀₀/Indo_26.28％；(d)为CSO₁₈₀₀₀/Indo_5.13％；(e)为CSO₁₈₀₀₀/Indo_10.62％；(f)为CSO₁₈₀₀₀/Indo_21.37％

图3为载药壳寡糖/吲哚美辛(DOX-loadedCSO_分子量/Indo_{理论投药量})微粒给药系统的TEM图(放大倍数为150000，标尺100nm)；

其中，(a)DOX-loadedCSO₉₀₀₀/Indo_5.72％；(b)DOX-loadedCSO₉₀₀₀/Indo_15.99％；(c)DOX-loadedCSO₉₀₀₀/Indo_26.28％；(d)DOX-loadedCSO₁₈₀₀₀/Indo_5.13％；(e)DOX-loadedCSO₁₈₀₀₀/Indo_10.62％；(f)DOX-loadedCSO₁₈₀₀₀/Indo_21.37％；

图4为负载阿霉素的不同剂型溶液在不同pH(pH＝5.0，pH＝6.8，pH＝7.4)磷酸盐缓冲液中的体外释放图；

其中，(a)为DOX-loadedCSO₉₀₀₀/Indo_5.72％NPs，(b)为DOX-loadedCSO₉₀₀₀/Indo_15.99％NPs，(c)为DOX-loadedCSO₉₀₀₀/Indo_26.28％NPs，(d)为DOX-loadedCSO₁₈₀₀₀/Indo_5.13％NPs，(e)为DOX-loadedCSO₁₈₀₀₀/Indo_10.62％NPs，(f)为DOX-loadedCSO₁₈₀₀₀/Indo_21.37％NPs，(g)游离阿霉素溶液；

图5为载药纳米粒尾静脉给药后荷瘤裸鼠各组织切片；

图6为盐酸阿霉素尾静脉给药后荷瘤裸鼠各组织切片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

(1)称取碳二亚胺EDC(0.5953g，3.105mmol)和吲哚美辛0.2222g(0.6210mmol)置于8ml的丙酮中，形成A液，将A液在25℃恒温下，搅拌使溶液溶解。然后称取0.2g(0.02222mmol)的壳寡糖(Mw＝9000)置于10ml蒸馏水中，形成B液，同样将B液在25℃恒温下，搅拌溶解。在25℃时，B液在搅拌下，将A液缓慢滴入B液。滴加完毕后，将溶液放置在恒温加热磁力搅拌器上，在25℃反应温度下反应53h。反应结束后将反应液转入透析袋(膜截留分子量MWCO＝7000)，以去离子水为透析液透析10h，前三小时每半小时换一次水，紧接着每隔一小时换一次水。透析结束后将透析袋中的样品溶液冷冻干燥，得到壳寡糖/吲哚美辛接枝物粗产物的冻干品。

(2)称取步骤(1)制备的壳寡糖/吲哚美辛接枝物粗产物冻干品，用蒸溜水溶解，配制成浓度为10mg/ml的溶液。在冰浴状态下超声处理，(超声探头功率400w，超声2s，间隔4s，60次)，然后在转速为4000rpm、4℃温度下离心20分钟。离心结束后，取上清液，冷冻干燥，即得到壳寡糖/吲哚美辛接枝物的纯化品1。

实施例2～7

如表1所述的不同分子量壳寡糖和吲哚美辛不同接枝比例，按照实施例1的壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法，合成得到壳寡糖/吲哚美辛接枝物的纯化品2～7。

表1：不同分子量壳寡糖和吲哚美辛不同接枝率

测试例1：吲哚美辛的接枝率的测定

按照三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid，TNBS)法测定壳寡糖/吲哚美辛接枝物的吲哚美辛的接枝率(substitutedegreeofaminogroup，SD)，详述如下：

(1)壳寡糖标准曲线：取不同分子量的壳寡糖10mg，分别溶于10mL蒸溜水中，得到浓度为1.0mg/ml的壳寡糖水溶液。分别移取0、20、50、100、200、500、800、1000μL壳寡糖水溶液，用蒸溜水定容至3.0ml，加入4％碳酸氢钠2.0ml和0.1％三硝基苯磺酸2.0ml(w/v)，得到混合液。37℃下孵育2小时后，再加入2.0mol/L盐酸2.0ml，摇匀。采用紫外-可见分光光度仪，测定各溶液在波长为344nm处的吸光度，得到不同分子量壳寡糖的标准曲线，如图1所示。

它们的线性方程分别为：

CSO(Mw＝9000)：y＝0.0156x+0.0192R²＝0.9953

CSO(Mw＝18,000)y＝0.0124x-0.0022R²＝0.9990

(2)壳寡糖/吲哚美辛接枝率测定：称取不同分子量的壳寡糖接枝物10mg，分别溶于10ml去离子水中，从中取300μL，同上述(1)操作，测定344nm处吸光度，按标准曲线计算CSO/Indo接枝物的接枝率。

A₁/A₂＝[(m₁/M₁)/(m₂/M₂)]×[X/(X-N)]，

SD＝N/X。

其中A₁，A₂分别是壳寡糖与壳寡糖/吲哚美辛接枝物的吸光度值；

m₁，m₂分别是壳寡糖与壳寡糖/吲哚美辛接枝物的质量；

M₁，M₂分别是壳寡糖与壳寡糖/吲哚美辛接枝物的摩尔质量；

X为每molCSO上含有游离NH₂的个数；

N为每molCSO被取代的NH₂的个数，

CSO₉₀₀₀/Indo_50％的接枝率为15.99±0.72。

应用例1：无药物负载(空白)壳寡糖/吲哚美辛纳米粒的制备

称取实施例1～7制备的纯化后的壳寡糖/吲哚美辛冻干品1～7，用蒸溜水配制成1mg/ml的溶液10ml。在冰浴状态下进行超声处理，(探头超声功率400w，超声2s，间隔4s，40次)，即得空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒1～7。

测试例2：

(1)无药物负载(空白)壳寡糖/吲哚美辛纳米粒的临界聚集浓度的测定

采用芘荧光法测定载体纳米粒的临界聚集浓度，具体实验方法如下：

1.1)芘丙酮溶液的配制：称取3mg的芘放入50ml的容量瓶中，然后用丙酮溶液定容，得浓度为60μg/ml的芘丙酮母液，从母液中移取5ml，用丙酮定容至100ml，得到3μg/ml的芘丙酮(B液)，接着从B液中移取4ml用丙酮定容至10ml，即可得1.2μg/ml芘丙酮溶液。

1.2)不同纳米粒溶液的配制：称取10份实施例1合成的壳寡糖/吲哚美辛接枝物1，然后分别用蒸溜水稀释使溶液浓度分别为10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，800μg/ml，1200μg/ml，1600μg/ml，2400μg/ml，在冰浴状态下进行超声处理，(探头超声功率400w，超声2s，间隔4s，60次)，制成浓度不同的空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒。

1.3)芘荧光法测定：取1.2μg/ml芘丙酮溶液0.5ml放入20ml的试管中。用铝箔包裹试管避光，放入通风橱内挥干过夜。待试管中丙酮溶剂完全挥干后，在各个试管中分别加入5ml步骤1.2)制成的各浓度的空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒溶液，先在60℃的摇床中振摇2小时，然后在37℃下振摇过夜。在激发波长为339nm，激发狭宽为3nm，发射狭宽为3nm测定条件下，扫描350～450nm的发射光谱，记录第一发射波长λ＝374nm(I₁)和第三个发射波长λ＝385nm(I₃)的荧光强度值，计算I₁及I₃波长处两者荧光强度比值从而确定CAC，得到CSO₉₀₀₀/Indo_50％的临界聚集浓度为161.34μg/ml。

(2)无药物负载(空白)壳寡糖/吲哚美辛纳米粒的粒径与表面电位

以微粒粒度及表面电位仪分别测定应用例1浓度为1mg/m空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒2～7水溶液的粒径和表面电位，如表2所示。

表2空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒的理化性质

从PDI可以看到，壳寡糖/吲哚美辛的粒径分布非常小，全部在0.3以下，呈狭窄分布。因此，纳米粒大小均匀，能稳定存在。呈现出比壳寡糖/水杨酸更均匀、狭窄的粒径分布。

(3)透射电镜观察壳寡糖/吲哚美辛纳米粒的形态

称取10mg实施例2～7合成的壳寡糖/吲哚美辛接枝物纯化品2～7，加入10mL蒸溜水，在冰浴状态下进行超声处理，(探头超声功率400w，超声2s，间隔4s，40次)，得到1mg/ml的空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒2～7的水溶液，用干净滴管移取1滴样品溶液于覆盖碳膜的铜网上，然后用2％(w/v)磷钨酸染色，红外干燥后在透射电镜(TEM)下观察壳寡糖/吲哚美辛纳米粒的形态。空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒的透射电镜(TEM)照片如图2所示：

(4)无药物负载(空白)壳寡糖/吲哚美辛纳米粒的细胞学评价

4.1)细胞培养

将人肝癌细胞HepG2细胞系置于DMEM培养液(含青霉素、链霉素各100U/mL；10％新生牛血清(v/v))中连续培养(孵育条件：5％CO₂，37℃)，使用胰酶消化传代培养。

4.2)空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒细胞毒性的测定

采用四唑盐比色法(MTT)进行细胞毒性评估。取200μL对数期生长的HepG2细胞悬液(细胞密度为5×10⁴个/mL)，接种在96孔培养板中，置于37℃，5％CO₂孵箱培养24小时。加入不同浓度的空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒溶液，(浓度分别为：100μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、700μg/ml、900μg/ml、1200μg/ml、1400μg/ml、1600μg/ml、1800μg/ml)。以未处理的空白细胞为对照，设3个复孔，于37℃，5％CO₂孵箱孵育。72h后加入20μLMTT(5mg/mL水溶液)，继续孵育4h后，小心吸弃孔内培养的上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，在室温下振荡15min，用酶联检测仪测定570nm处的吸光度，绘制细胞生长抑制率图表，如表3所示，按下式计算细胞生长抑制率：

细胞抑制率(％)＝1-A570(treated)/A570(control)×100％

其中A570(treated)为实验组(细胞中加入了空白纳米粒)的吸光度，A570(control)为空白(细胞中未加空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒)对照组的吸光度。

表3空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒的IC₅₀值

从上述试验证明：除了CSO₁₈₀₀₀/Indo_21.37％较毒之外，别的空白壳寡糖/吲哚美辛纳米粒细胞毒性都非常小，均大于600μg/ml。其中CSO₉₀₀₀/Indo_5.72％的IC50值为1365.3μg/ml；CSO₉₀₀₀/Indo_15.99％的IC50值为1037.63μg/ml。对比壳寡糖/水杨酸纳米粒呈现的较大细胞毒性(壳寡糖MW＝18000/SA理论投料量＝50％在肺癌细胞(A549)上毒性为IC50＝463.16μg/ml，在乳腺癌细胞(MCF-7)上毒性为IC50＝262.28μg/ml)是非常安全的药物载体材料。

应用例2载药壳寡糖/吲哚美辛微粒给药系统(纳米粒)的制备

(1)盐酸阿霉素的碱化

阿霉素的碱化方法详述如下：称取盐酸阿霉素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，使质量浓度为10g/L，加入2倍摩尔量的三乙胺，避光搅拌15小时使脱盐酸。然后将反应液放入透析袋中(MWCO＝1000)，避光透析，透析液为去离子水，透析时每隔半小时换一次水，5次后每隔一小时换一次水。透析12小时后冷冻干燥，即得碱化阿霉素的冻干粉末。

(2)负载阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛微粒给药系统(载药纳米粒)制备

以碱化阿霉素为模型药物，用透析法制备负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒。下面以DOX(10％)-loadedCSO₉₀₀₀/Indo_15.99％载药纳米粒的制备方法为例：

称取10mg实施例1的CSO/Indo接枝物纯化品1，加蒸溜水5ml，在冰浴状态下进行超声处理(探头超声功率400w，超声2s，间隔4s，20次)，得到5mL的空白CSO/Indo纳米粒溶液(2mg/ml)。用二甲基亚砜配制1.0mg/ml的碱化阿霉素溶液，在室温磁力搅拌下，向纳米粒溶液中逐滴滴加碱化阿霉素二甲基亚砜溶液1ml，使碱化阿霉素的投药量为10％(w/w)。冰浴超声处理(探头超声功率400W，超声2s，间隔4s，40次)，室温避光搅拌过夜。然后将反应液转移至透析袋(MWCO＝7000)中，透析液为去离子水，避光透析10小时(刚开始每隔半小时换一次水，4次后每隔一小时换一次水)以除去二甲基亚砜。透析结束后，将产物以4000rpm离心15min，除去尚未增溶的碱化阿霉素固体，即得负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛微粒给药系统(DOX_{理论投料量10％}-loadedCSO₉₀₀₀/Indo_15.99％NP)，然后冷冻干燥，即得负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛微粒给药系统冻干品。

测试例3

(1)包封率和载药量的测定

用荧光分光光度法测定载药纳米粒的包封率和载药量

1.1)碱化阿霉素标准曲线的制作：取1.0mg/ml的碱化阿霉素/二甲基亚砜溶液，用混合溶媒(二甲基亚砜∶水＝99∶1混合溶剂，v/v)稀释成下列不同浓度：1μg/ml、05μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.08μg/ml、0.06μg/ml、0.05μg/ml，荧光分光光度仪检测各样品的荧光值(E_X＝468nm，E_M＝566nm，狭缝＝5nm，工作电压700mV)，以样品的浓度为横坐标，荧光光度仪测得的荧光吸光度为纵坐标，绘制碱化阿霉素标准曲线。

1.2)负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒包封率和载药量的测定：取应用例2制得的负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒，用二甲基亚砜∶水＝99∶1混合溶媒稀释药物溶液，使浓度降至1.1)绘制的碱化阿霉素标准曲线线性范围内，水浴超声30min，测定荧光吸光度。由标准曲线计算稀释后样品的药物浓度，根据实际稀释倍数计算载药纳米粒的药物浓度C。载药纳米粒的包封率(EE)和载药量(DL)的计算公式如下：

EE(％)＝C’×V/W_d，(1)

DL(％)＝C’×V/(W_c+C’×V)(2)

式中，C’为实测药物总浓度，，V为载药纳米粒溶液体积，W_d为最初的实际投药量，W_c为载药纳米粒溶液中载体重量，由公式(1)，(2)可以计算出载药纳米粒的包封率和载药量。在理论投药量为10％的前提下，CSO₉₀₀₀/Indo_50％载药纳米粒的包封率为(81.39±0.77)％，载药量为(7.69±0.12)％。

(2)负载阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒粒径和表面电位的测定

以微粒粒度与表面电位分析仪测定负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒在蒸溜水溶液中的粒径和表面电位，如表4所示。

表4：负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒的理化性质

(3)透射电镜观察负载阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒的形态

用蒸溜水将应用例2得到的负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒稀释一定的倍数，滴管移取1滴样品溶液于覆盖碳膜的铜网上，然后用2％(w/v)磷钨酸染色，干燥后在透射电镜(TEM)下观察负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒的表面形态。下面为理论投药量为10％，各种CSO/Indo载药纳米粒的透射电镜照片如图3所示。

(4)负载阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒的体外释放

取应用例2制得的负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒溶液，使碱化阿霉素的含药总量控制在47μg，放入透析袋(MWCO＝7000)中，并将透析袋分别置于5ml的不同pH的磷酸缓冲盐溶液(PBSpH＝5.0，6.8，7.4)释放介质中。同法将含有47μg碱化阿霉素的碱化阿霉素/二甲基亚砜溶液置于5ml相应的缓冲液中，得到游离药物溶液，作为阴性对照。每组平行三个样品，在37℃，100rpm/min的水浴恒温振荡条件下，进行体外释放实验.分别于0.5，1，2，4，6，8，10，12，24，36，48，60，72hr取样测定。为了确保漏槽条件，取样时倒出全部释放介质，并补充相应量体积的新鲜介质于其中。荧光分光光度法测定样品中药物的浓度。由碱化阿霉素标准曲线计算药物累计释放量，如图4所示。

(5)负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒抗肿瘤细胞疗效的考察

采用四唑盐比色法(MTT)对HepG2细胞进行抗肿瘤疗效考察：取200μL对数期生长的HepG2细胞悬液(细胞密度为5×10⁴个/mL)，接种在96孔培养板中.置于37℃，5％CO₂孵箱培养24小时。分别向细胞中加入不同浓度的载药纳米粒溶液(CSO/Indo-DOX)(使每孔中阿霉素的浓度为0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、8μg/ml、10μg/ml)，DOX.HCl(使每孔中阿霉素的浓度为0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、15μg/ml)，以未处理的空白细胞为对照，设3个复孔，于37℃，5％CO2孵箱孵育。72h后加入20μLMTT(5mg/mL水溶液)，继续孵育4h，停止培养.小心吸弃孔内培养的上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，恒温振荡15min，用酶联检测仪测定570nm处的吸光度，绘制细胞生长抑制率图表，按下式计算细胞生长抑制率：

细胞抑制率(％)＝1-A570(treated)/A570(control)×100％

其中A570(treated)为实验组吸(细胞中加入了载药纳米粒)的光度，A570(control)为空白(细胞中未加载药纳米粒)对照组的吸光度。

实验结果表明，理论投药量为10％，CSO₉₀₀₀/Indo_15.99％载药纳米粒在HepG2的IC50为3.39μg/ml，而盐酸阿霉素的游离溶液在HepG2的IC50为8.576μg/ml。因此，负载阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒的对肿瘤细胞的抑制率比盐酸阿霉素的游离溶液提高2.5倍。

(6)负载阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛载药纳米粒在荷瘤裸鼠上组织分布考察

6.1)荷瘤小鼠建模

将肿瘤细胞混悬在不含血清的DMEM培养液中，使细胞密度为1×10⁶～5×10⁷。用注射器抽取该悬液以0.2ml/每只接种于裸鼠的背部皮下，定期测量瘤径与动物体重。

6.2)FITC标记的微粒给药系统的制备

按照FITC∶CSO₉₀₀₀/Indo_15.99％摩尔比＝5∶1，精密称定FITC8.8mg，溶于4.4ml无水乙醇中，制成2mg/ml的FITC乙醇溶液；精密称定CSO₉₀₀₀/Indo_15.99％30mg，溶于6ml蒸馏水中，制成5mg/ml载体溶液；移取2.875mlFITC溶液滴加于载体溶液中，25摄氏度避光搅拌过夜。将制备得到的FITC-CSO₉₀₀₀/Indo_15.99％置于MW＝7000分子量透析袋中，蒸馏水透析8h，超低温冰箱中预冻后冷冻干燥即得。6.3)负载碱化阿霉素的FITC-CSO₉₀₀₀/Indo_15.99％微粒给药系统的组织分布

根据空白载体材料的急毒数据，选择注射剂量为20mg/kg，碱化阿霉素总量为0.4mg。取冻干后的负载碱化阿霉素的FITC-CSO₉₀₀₀/Indo_15.99％微粒给药系统。用注射用水配制成2mg/ml的溶液，取0.2ml尾静脉注射。在注射后定时摘除眼球进行眼眶取血，取血完毕后若裸鼠未死亡，再进行颈椎脱臼；剪开裸鼠腹腔，取出各个脏器。每个脏器取出后，剪下一小片，先挤少许OCT于铝箔上，再放上脏器，然后挤适量OCT，将脏器完全包裹住，包上铝箔置于冰箱中冷冻。血液置于离心管中，再放入冰箱中保存。冷冻好的脏器剥去铝箔，冷冻切成10μm和20μm的切片，置于荧光显微镜下观察，FITC标记的载体为绿色荧光，阿霉素为红色荧光。如图5所示，载药纳米粒尾静脉给药后荷瘤裸鼠各组织切片(图中绿色荧光为FITC标记的纳米粒，红色荧光为阿霉素)

从所示图5中看出，阿霉素的红色荧光总体都很弱，仅在肝中发现少许分布，其他器官都几乎检测不到荧光；由于选择的解剖时间点过早。但该实验结果仍可提示载药纳米粒可能有一定的肝靶向。载体方面，肝、肾绿色荧光最强，而其他器官几乎检测不到，表明载药纳米粒在肝肾中有聚集，提示载药纳米粒具有肝肾靶向。

6.4)DOX·HCL原料药体内分布实验

以注射用水配制高浓度0.4mg/mlDOX·HCL溶液，裸鼠尾静脉注射0.2ml。后面的处理方法同上，切片置于荧光显微镜下观察，阿霉素为红色荧光。如图6所示，盐酸阿霉素尾静脉给药后荷瘤裸鼠各组织切片，(图中红色荧光为阿霉素)

从图6中看出药物在肝、肾均有分布，可能由于药物是通过肝肾代谢，文献报道会有一定量的阿霉素聚集于心脏，但照片中心脏的荧光并不算强，可能由于此时间点药物尚未分布完全，药物在肺和脾内荧光较弱；而在肿瘤切片中观察到了较强的荧光，显示药物在肿瘤有较高的分布，且药物多聚集在肿瘤外围。

本发明通过测定载药量、对药物的控缓释能力以及在细胞水平的评价，研究难溶性药物、聚合物载体材料结构及其作为药物载体特性之间的关系和影响因素；将载体材料表面接枝荧光物质，观察载药微粒在小鼠体内的分布；为难溶性药物设计和构建低毒性、高载药量和高疗效的聚合物载体提供一种负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛的微粒给药系统。

Claims (9)

1.一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法，其特征在于：所述的合成方法为以下步骤：

（1）称取碳二亚胺和吲哚美辛置于丙酮中，形成A液，将A液在5~55℃恒温下，搅拌使溶液溶解；然后称取壳寡糖置于蒸馏水中，形成B液，同样将B液在5~55℃恒温下搅拌溶解，同时将A液滴入B液中，在5~55℃温度下反应5~72小时，然后将反应液转入透析袋以去离子水为透析液透析，透析6~24小时后将透析袋中的样品溶液冷冻干燥，得到壳寡糖/吲哚美辛接枝物粗产物冻干品；

（2）称取步骤（1）得到的壳寡糖/吲哚美辛接枝物粗产物冻干品，用蒸馏水溶解，配制成浓度为0.1~20mg/ml的溶液，在冰浴状态下超声处理，然后离心处理，取上清液，冷冻干燥，即得到壳寡糖/吲哚美辛接枝物的纯化品；

上述碳二亚胺与吲哚美辛的摩尔比为1~20：1，壳寡糖的分子量为1000~45000，吲哚美辛与壳寡糖上自由氨基的摩尔比为0.01~200：1，丙酮、蒸馏水的使用量分别为使溶质溶解的量。

2.根据权利要求1所述的一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法，其特征在于，透析袋的膜截留分子量1000~10000，透析步骤为：前2~5小时每10min~45min换一次水，然后每隔0.5~2小时换一次水。

3.根据权利要求1所述的一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法，其特征在于，超声处理中探头超声功率为50~1000瓦，每次超声时间1~5秒，超声间隔2~9秒，超声20~200次。

4.根据权利要求1所述的一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法，其特征在于，离心处理为离心转速为2000~6000rpm、2~40℃温度下离心15~230分钟。

5.一种如权利要求1所述的种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的合成方法所合成的壳寡糖/吲哚美辛接枝物在难溶性药物靶向载体上的应用。

6.根据权利要求5所述的一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的应用，其特征在于，所述的应用是提供一种负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛的微粒给药系统，所述的一种负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛的微粒给药系统，其制备方法为：

1）盐酸阿霉素的碱化

称取盐酸阿霉素溶于二甲基亚砜中，制成盐酸阿霉素二甲基亚砜溶液的浓度为10g/L，然后加入2倍盐酸阿霉素摩尔量的三乙胺，避光搅拌4~18小时，再将反应液放入透析袋中，避光透析，透析液为去离子水，透析8~16小时后冷冻干燥，即得碱化阿霉素的冻干粉末；

2）负载阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛微粒给药系统的制备

（a）、称取壳寡糖/吲哚美辛接枝物的纯化品，加蒸馏水，在冰浴状态下进行超声处理，得到无药物负载的壳寡糖/吲哚美辛纳米粒，溶液浓度为2mg/ml；

（b）、将步骤1）制备的碱化阿霉素的冻干粉末，用二甲基亚砜配制成浓度为1.0mg/ml的碱化阿霉素二甲基亚砜溶液，在室温搅拌下，向步骤（a）制备的无药物负载的壳寡糖/吲哚美辛纳米粒中滴加碱化阿霉素二甲基亚砜溶液，碱化阿霉素与壳寡糖/吲哚美辛接枝物的质量比为0.1：1；然后冰浴超声处理，室温避光搅拌6~16小时，然后将反应液转移至透析袋中，透析液为去离子水，避光透析10小时后，将透析袋中剩余溶液离心处理，即得负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛给药系统溶液，然后冷冻干燥，即得到负载碱化阿霉素的壳寡糖/吲哚美辛微粒给药系统的冻干品。

7.根据权利要求6所述的一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的应用，其特征在于，透析袋的膜截留分子量=1000~10000，透析步骤为：每隔半小时换一次水，4~5次后每隔一小时换一次水。

8.根据权利要求6所述的一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的应用，其特征在于，超声处理中探头超声功率为50~1000瓦，超声时间1~5秒，超声间隔2~9秒，超声20~200次。

9.根据权利要求6所述的一种壳寡糖/吲哚美辛接枝物的应用，其特征在于，离心处理为离心转速为2000~6000rpm、2~40℃温度下离心15~230分钟。