CN101314622A - 水杨酸-g-壳寡糖接枝物及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水杨酸－g－壳寡糖接枝物及其合成方法，所述水杨酸－g－壳寡糖接枝物的结构通式如式(I)所示。所述水杨酸－g－壳寡糖接枝物通过壳寡糖和水杨酸接枝聚合得到，所述壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70～100％，所述水杨酸－g－壳寡糖接枝物中壳寡糖链上的部分氨基被水杨酰基取代，胺基取代度为1～80％。本发明所述水杨酸－g－壳寡糖接枝物的合成方法简单，后处理容易，制备得到的水杨酸－g－壳寡糖接枝物，以向水性化合物水杨酸为疏水性部分，以壳寡糖为亲水性部分，在水性介质中，能通过自聚集形成水杨酸－g－壳寡糖胶团，可作为水难溶性药物的载体，将大大丰富给药手段、提高疗效。

Description

水杨酸-g-壳寡糖接枝物及其合成方法

(一)技术领域

本发明涉及水杨酸-g-壳寡糖接枝物及其合成方法。

(二)背景技术

两亲性高分子聚合物胶束作为难溶性药物载体材料，是近几年用于提高难溶性药物溶解度的一个新手段。聚合物胶束是由两亲基团在溶剂中自发形成的核-壳状结构，和常用的表面活性剂相比，具有较低的临界胶束浓度和稳定的空间结构，能够体现出特有的生物稳定性。通过对亲水、疏水二部分基团的选择和修饰，可赋予聚合物胶束不同的特性，以满足不同药物结构和给药部位的要求。纳米尺寸的聚合物胶束还具有“增强了的渗透和滞留作用”，对于肿瘤靶向治疗有特殊意义。

壳聚糖，是天然存在的、阳离子多糖。可生物降解，具有良好的生物相容性。由于壳聚糖具有一系列特殊的化学和生物性质，适合作为药物的控缓释载体，被广泛用于制剂研究。然而，由于壳聚糖呈高分子量、高粘性和高乙酰化，使得它不溶于一般的有机溶剂和水，这为其广泛应用造成了很大困难。为了改进其溶解性，人们对其进行了许多改性工作，其中经过酸溶和酶解得到的低分子壳寡糖保留了壳聚糖的优点，改进了其缺点，是理想的亲水性骨架材料，可用于聚合物胶束的构建。通过对壳寡糖分子量的调控，可实现胶束粒径的人为控制；其具有打开细胞膜间隙的能力，有利于聚合物胶束跨膜的转运；糖链上大量游离的自由氨基，为胶束接枝疏水性基团或其他功能基团提供可能。

水杨酸是能将难溶性药物溶解度提高的向水性化合物，它在水中呈微溶，化学结构为苯环上带有相邻的一个羧基和一个羟基。它不仅含有π键，而且是以难溶性药物大都具有的苯环结构存在。它主要是通过π键与难溶性药物的苯环相互作用，增加了和难溶性药物之间的作用力，从而提高了难溶性药物在水中的溶解度，同时也增加难溶性药物进入水溶性介质后的稳定性。研究表明紫杉醇在3.5M水杨酸钠水溶液中的溶解度为5.543mg/ml，这与紫杉醇在纯水中的溶解度(0.3μg/ml)相比，增加了大约18,000倍。事实上，水杨酸钠对于难溶性药物的增溶性已广为人知并加以利用，它常被加在体外释放介质中营造漏槽条件。但是作为小分子化合物，水杨酸钠作为药物载体时，容易随药物进入细胞，产生毒性。因此，需要将水杨酸与其他化合物接枝或嵌段共聚成高分子化合物作为药物载体材料。

武雪芬等提出了一种壳聚糖-g-水杨酸及合成方法[合成化学，2005年第13卷第5期，461-463页]，该方法是以高分子的壳聚糖和水杨酸为原料，在一定温度下和无溶剂或适量溶剂中通过搅拌或研磨反应，使得壳聚糖上的氨基和水杨酸的羧基自动吸附脱水制得壳聚糖-g-水杨酸，但该方法产物后处理比较麻烦。并且，该方法由于采用高分子的壳聚糖为原料，所以制得的壳聚糖-g-水杨酸也不可避免地带上了壳聚糖本身的一些缺陷，如溶解性能不佳等，在应用上面受到限制。

中国专利申请200510107271.8公开了一种水杨酸与壳聚糖-2，6位接枝物及其制备方法，其接枝物的结构为不仅在壳聚糖糖元的2位的自由氨基上接枝水杨酸，而且在壳聚糖糖元的6位甲氧基上也接枝了水杨酸。其中以6位接枝物为主。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种水杨酸-g-壳寡糖接枝物及合成方法，该水杨酸-g-壳寡糖接枝物在水性介质中，通过自聚集形成水杨酸-g-壳寡糖胶团，可作为水难溶性药物的载药胶束。

本发明所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物，其结构通式如下：

其中

所述水杨酸-g-壳寡糖接枝物通过壳寡糖和水杨酸接枝聚合得到，所述壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70～100％，所述水杨酸-g-壳寡糖接枝物中壳寡糖链上的部分自由氨基被水杨酰基取代，氨基取代度为1～80％。

本发明还提供了一种水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备方法，其特征在于所述的制备方法为：选取分子量为1～100kDa、脱乙酰度为70～100％的壳寡糖，用水溶解，在5～95℃加入用有机溶剂溶解的水杨酸和碳二亚胺的溶液，在5～95℃反应2～80小时，反应液经分离纯化得结构如通式(I)所示的水杨酸-g-壳寡糖接枝物；

所述的有机溶剂能溶解水杨酸和碳二亚胺，也能与溶解壳寡糖的溶剂互溶，可以是乙醇、乙腈等，优选乙醇。

本发明所述的反应物投料物质的量比壳寡糖糖元2位上自由氨基数∶水杨酸∶碳二亚胺为1∶0.01-1∶1-20。

所述的分离纯化可采取如下步骤：反应液经透析纯化，透析后的溶液冷冻干燥得到水杨酸-g-壳寡糖接枝物粗品，将水杨酸-g-壳寡糖接枝物粗品溶于水中，超声处理，离心，取上清液冷冻干燥得到水杨酸-g-壳寡糖接枝物纯品。所述的透析采用膜截留分子量为3500的透析膜，所述的超声处理采用探头超声。

本发明所述的壳寡糖可按照如下方法制备：选取脱乙酰度为70～100％的壳聚糖，在40-60℃和pH4.0-6.0条件下，按纤维素酶与壳聚糖比例0.1-5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖，以粘度法控制壳聚糖的降解程度，所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，选择合适的超滤膜超滤分级，超滤液冷冻干燥，得所述的壳寡糖。

进一步，在40-60℃和pH4.0-6.0条件下，最好先通过搅拌使壳聚糖充分溶胀，然后加入纤维素酶进行降解反应。

与现有技术相比，本发明的有益之处主要体现在：

a)本发明选用分子量为1～100kDa、理化性质相对稳定的壳寡糖作为原料，研究表明，分子量小于200kDa的壳寡糖，具备在较高pH环境下的良好水溶性，且细胞毒性随分子量的下降而显著降低。因此，本发明制备得到的水杨酸-g-壳寡糖接枝物，以向水性化合物水杨酸为疏水性部分，以壳寡糖为亲水性部分，在水性介质中，能通过自聚集形成水杨酸-g-壳寡糖胶团，可作为水难溶性药物(如一些抗癌药物)的载体，将大大丰富给药手段、提高疗效。

b)本发明所述水杨酸-g-壳寡糖接枝物的合成方法简单，后处理容易。

(四)附图说明

图1是实施例1制得的壳寡糖的¹H-NMR谱图。

图2是水杨酸的¹H-NMR谱图。

图3是实施例1制得的水杨酸-g-壳寡糖的¹H-NMR谱图。

(五)具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

(1)壳寡糖的制备

取市售分子量为550kDa的壳聚糖(70％脱乙酰度)，在55℃和pH5.0条件下搅拌2小时，使壳聚糖充分溶涨后，按纤维素酶与壳聚糖比例0.5∶100(w/w)加入纤维素酶(上海伯奥生物科技有限公司生产)，降解壳聚糖。以粘度法控制壳聚糖的降解程度。所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，使用分子量为10kDa和30kDa的超滤膜进行超滤分级。取分子量介于10kDa和30kDa的超滤液冷冻干燥，得脱乙酰度为70％、分子量18.0kDa的壳寡糖。

(2)水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备

精密称取0.2756g碳二亚胺(EDC)和0.0397g水杨酸(Salicycleacid，SA)置于3ml的无水乙醇中(A液)，然后精密称取0.1g的壳寡糖(CSO)置于6ml的蒸馏水(DW)中(B液)，在25℃时，将A液滴加到B液中，25℃下反应53hr。冷却后，转入透析袋(MWCO＝3500)透析24小时后，预冻，冻干即得粗产品。将粗产品溶于一定量的水中，探头超声(400w，超声2s，间隔3s，40次)，4000rmp离心10min，取上清液预冻，冻干即得纯化后的载体材料。采用氢谱核磁共振(¹H-NMR)确认CSO-g-SA的结构.

实施例2-5

按照表1所列的合成处方制备水杨酸-g-壳寡糖接枝物，其他条件同实施例1。

表1：不同分子量和接枝率的水杨酸-壳寡糖(SA-g-CSO)的合成处方

实施例

壳寡糖

水杨酸

EDC(g)

水杨酸

乙醇

壳寡糖

蒸馏水

	分子量(kDa)	的理论取代度		(g)	(ml)	(g)	(ml)
								实施例1	1,8000	50％	0.2756	0.0397	3	0.1	6
实施例2	2,8000	15％	0.0826	0.0119	1	0.1	6
								实施例3	2,8000	50％	0.2756	0.0397	3	0.1	6
实施例4	2,8000	100％	0.5512	0.0794	6	0.1	6
								实施例5	4,4000	50％	0.2756	0.0397	3	0.1	6

实施例6：水杨酸-g-壳寡糖接枝物的理化性质测定

分别以实施例1-5制得的水杨酸-g-壳寡糖接枝物作为测试对象。

A.采用三硝基苯磺酸法，测定所得水杨酸-g-壳寡糖接枝物的氨基取代度。

取不同重量的某分子量壳寡糖(0.5～9mg)，精密称定，分别溶于2ml的蒸馏水中，加入4％(w/v)的碳酸氢钠溶液2ml和0.1％(w/v)的三硝基苯磺酸2ml，37℃孵育2h。加入2N盐酸2ml，摇匀，超声赶走气泡，在344nm波长处测定吸光度值(A)，得到该分子量壳寡糖的氨基取代度标准曲线。称取适量该分子量壳寡糖的水杨酸接枝物4mg溶于2ml重蒸水，同法操作，测定344nm波长处的吸收值，按标准曲线计算壳寡糖-水杨酸嫁接物的氨基取代度。

计算方法：氨基取代度SD＝N/X。

其中X为每molCSO上含有游离NH₂的个数，N为每molCSO被取代的NH₂的个数，而A糖/A载体＝[(m糖/M糖)/(m载体/M载体)]*[X/(X-N)]

B.采用芘荧光法测定，水杨酸-g-壳寡糖接枝物的临界胶团浓度。

取0.5ml 0.0012mg/ml芘放入10ml的试管中，放入50℃烘箱挥干芘(约6hr)。配制0.05mg/ml～500mg/ml不同浓度的空白载体溶液5ml，将5ml这些各浓度的空白载体溶液加入到已挥干芘的试管中，使芘的终浓度为7×10^-7mol·L^-1在37℃的摇床中振摇过夜。测定荧光。将激发光谱固定在339nm，激发光谱的狭缝固定在10nm，发射光谱的狭缝固定在2.5nm，扫描速度为1500nm/min，激发电压为400V.扫描350-450nm发射光谱，测定芘在374nm、384nm处的荧光强度。根据测定得到的I₃₇₄/I₃₈₄计算临界胶团浓度。

C.测定水杨酸-g-壳寡糖接枝物胶团的粒径及Zeta电位。

取水杨酸-g-壳寡糖接枝物10mg，精密称定，溶解于蒸馏水，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，定容至10ml，制备1mg/ml的水杨酸-g-壳寡糖接枝物胶团溶液。Zetasizer 3000HS分析仪测定壳寡糖-水杨酸接枝物胶团的粒径及Zeta电位。

经测定，壳寡糖-水杨酸接枝物的理化性质见表2

表2.壳寡糖-水杨酸接枝物的理化性质(n＝3)

实施例	壳寡糖分子量(kDa)	水杨酸的理论取代度	氨基取代度(％)	临界胶团浓度(μg/ml)	Z均粒径(nm)	Zeta电位(mV)
							实施例1	1,8000	50％	12.41±0.47	454.79	481.0	39.9±38.3
实施例2	2,8000	15％	8.94±1.31	368.89	513.2	51.9±22.9
							实施例3	2,8000	50％	11.44±1.75	163.98	461.8	48.6±9.9

实施例4	2,8000	100％	23.39±2.63	78.90	440.8	44.1±1.6
							实施例5	4,4000	50％	4.26±0.47	78.89	12209.4	51.5±1.6

Claims (9)

1、一种水杨酸-g-壳寡糖接枝物，其结构通式如下：

其中

所述水杨酸-g-壳寡糖接枝物通过壳寡糖和水杨酸接枝聚合得到，所述壳寡糖的分子量为1～100kDa，脱乙酰度为70～100％，所述水杨酸-g-壳寡糖接枝物中壳寡糖链上的部分氨基被水杨酰基取代，氨基取代度为1～80％。

2、一种如权利要求1所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备方法，其特征在于所述的制备方法为：选取分子量为1～100kDa、脱乙酰度为70～100％的壳寡糖，用水溶解，在5～95℃加入用有机溶剂溶解的水杨酸和碳二亚胺的溶液，在5～95℃反应2～80小时，反应液经分离纯化得所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物。

3、如权利要求2所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备方法，其特征在于所述的反应物投料物质的量比壳寡糖糖元2位上自由氨基数∶水杨酸∶碳二亚胺为1∶0.01-1∶1-20。

4、如权利要求2所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备方法，其特征在于所述的分离纯化为：反应液经透析纯化，透析后的溶液冷冻干燥得到水杨酸-g-壳寡糖接枝物粗品，将水杨酸-g-壳寡糖接枝物粗品溶于水中，超声处理，离心，取上清液冷冻干燥得到水杨酸-g-壳寡糖接枝物纯品。

5、如权利要求2所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙醇或乙腈。

6、如权利要求4所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备方法，其特征在于所述的透析采用膜截留分子量为3500的透析膜。

7、如权利要求4所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备方法，其特征在于所述的超声处理采用探头超声。

8、如权利要求2～7之一所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备方法，其特征在于所述的壳寡糖按照如下方法制备：选取脱乙酰度为70～100％的壳聚糖，在40-60℃和pH4.0-6.0条件下，按纤维素酶与壳聚糖比例0.1-5∶100(w/w)加入纤维素酶，降解壳聚糖，以粘度法控制壳聚糖的降解程度，所得壳聚糖的降解液，经过滤除去杂质，选择合适的超滤膜超滤分级，超滤液冷冻干燥，得所述的壳寡糖。

9、如权利要求8所述的水杨酸-g-壳寡糖接枝物的制备方法，其特征在于在40-60℃和pH4.0-6.0条件下，搅拌使壳聚糖充分溶胀，然后加入纤维素酶进行降解反应。

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