CN113842462A - 一种透明质酸-小分子自组装纳米药物的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种透明质酸‑小分子自组装纳米药物的制备与应用。本发明将透明质酸与疏水小分子药物通过简单的透析法自组装形成形貌均一的纳米药物，解决了疏水性药物的低水溶性问题，增加了药物的生物利用度。同时透明质酸作为一种广泛存在于人体内的大分子，具有无毒、无免疫原性和可降解的特点，因此本发明的透明质酸‑小分子自组装纳米药物具有更好的生物安全性。利用透明质酸的CD44的靶向能力，本发明的纳米药物在一些特定疾病如癌症、炎性疾病的治疗中将发挥更强疗效。本发明的制备工艺绿色简单，纳米药物的组分明确、质量可控，有望进行大规模工业生产。
Description
技术领域
本发明属于纳米药物制备领域，尤其涉及一种以透明质酸为模板的透明质酸-小分子自组装纳米药物的制备与应用。
背景技术
大多数的小分子药物水溶性较差，只能溶解在二氯甲烷、丙酮、DMSO等有机溶剂中，而这些有机溶剂普遍具有毒性，无法应用于临床治疗中。尽管可以通过药物制剂技术将疏水性药物制备成混悬剂、乳剂等药物制剂，但在体内药物分子会自发聚集成较大的结晶，降低药物的生物利用度，从而影响药物发挥正常疗效。随着纳米技术广泛应用于药物制剂领域，纳米载体辅助药物递送系统提供了一种提高疏水性药物水溶性的新途径，即通过纳米级别的在水中分散性良好的递送系统装载疏水性药物，间接提升疏水性药物的水溶性。而这种纳米载药体系也存在着一些难以避免的问题，例如，纳米载体合成工艺复杂，药物装载量低，部分载体材料长期使用对于人体的安全性难以评估等。
透明质酸(hyaluronic acid，以下简称为HA)是一种广泛存在于人体组织器官中的内源性大分子多糖。为了增加大分子HA的溶解性与稳定性，一般将HA制备成其钠盐的形式。由于HA具有良好的亲水性，并且作为人体内存在的物质可被降解，无毒无免疫原性，因此是一种非常理想的药物递送载体材料。CD44蛋白是HA的主要受体，二者可以特异性结合发挥多种生物学作用。由于肿瘤细胞以及M1型巨噬细胞表面的CD44呈高表达状态，因此用HA合成的纳米材料具有肿瘤组织以及炎性组织器官的靶向能力，这是其他药物载体材料所不具备的。
自组装是指基本结构单元基于非共价键/弱共价键(范德华力、静电作用力、亲水疏水相互作用力，氢和配位键等)的相互作用下自发形成有序结构的一种技术。通过这种技术可以使药物分子与其他药物分子或功能性分子自发形成稳定的纳米药物。通过自组装形成纳米药物的制备过程绿色简单，避免了繁琐的合成工艺，且相对于传统纳米载体载药后形成的纳米药物具有更高的载药量。
综上所述，将疏水性药物与HA通过自组装的方式形成的纳米药物可以增加疏水性药物的水溶性，增加其生物利用度，同时赋予药物以肿瘤组织以及炎性组织器官的靶向能力，增强其治疗效果。这种纳米药物相对于传统纳米药物具有高生物安全性，高载药量的优点，同时合成过程绿色简单，有望进行工业化生产。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种HA-小分子自组装纳米药物的制备方法与应用。通过HA与疏水性小分子药物之间的自组装形成粒径大小较为均一的纳米药物，以解决现有纳米载药系统安全性低、载药量低、制备工艺复杂的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种HA-小分子自组装纳米药物，其是由HA与多种疏水性小分子药物通过简单的透析法自组装形成的纳米粒。
所述的疏水小分子药物包括雷公藤红素、齐墩果酸、齐墩果酮酸、香树脂酮、奥利司他、二氢卟吩中的一种或多种。具体的制备方法如下：
步骤一、将疏水小分子药物溶解在水性有机溶剂中，得到溶液A。
步骤二、将HA溶解在去离子水中，得到溶液B。
步骤三、将溶液A缓慢滴加至溶液B中，磁力搅拌30min得到溶液C。
步骤四、将溶液C置于截留分子量10000Da的透析袋中，避光磁力搅拌下在去离子水中透析，其中，透析温度为15～25℃；其中，透析时间为24h。
步骤五、透析结束后取出透析袋中的溶液，可得目标产物。
优选的，所述步骤一中疏水小分子为雷公藤红素、齐墩果酸、齐墩果酮酸、奥利司他、二氢卟吩时，步骤一所述的水性有机溶剂为二甲基亚砜；所述步骤一中疏水小分子为香树脂酮时，步骤一所述的水性有机溶剂为甲醇。
优选的，所述步骤二中HA为HA的钠盐形式。
优选的，所述步骤二中HA的分子量为5kDa～200kDa。
优选的，所述步骤三中磁力搅拌的转速为100～500rpm，搅拌温度为室温。
优选的，所述步骤三中溶液A与溶液B的体积比为1:20～1:100。
优选的，所述步骤四中的透析过程每隔12h需要更换一次去离子水。
优选的，上述A溶液的质量浓度为10mg/mL～40mg/mL。
优选的，上述C溶液中疏水小分子与HA的质量比为1:50～1:150。
本发明的目的之二在于提供一种雷公藤红素-HA纳米药物(CHNPs)在非酒精性脂肪肝疾病治疗中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.本发明所使用的HA为人体内源性大分子，无毒，无免疫原性，体内可降解，因此合成的纳米药物具有更高的生物安全性。同时HA作为一种可以功能性分子可以靶向肿瘤组织以及炎性组织器官，在特定的疾病治疗中会发挥更强的疗效。
2.本发明通过自组装的方式将HA与疏水小分子直接结合形成纳米药物，二者相辅相成，避免了使用其他载体材料，省去了载药的过程，因此具有更高的药物装载量以及包封率。
3.本发明的制备工艺绿色简单，耗时短，不浪费能源与材料，可重复性强，有望大批量工业生产。
附图说明
图1为雷公藤红素分散在水中的透射电镜图(左)以及HA-雷公藤红素纳米药物的透射电镜图(右)。
图2为齐墩果酸分散在水中的透射电镜图(左)以及HA-齐墩果酸纳米药物的透射电镜图(右)。
图3为齐墩果酮酸分散在水中的透射电镜图(左)以及HA-齐墩果酮酸纳米药物的透射电镜图(右)。
图4为香树脂酮分散在水中的透射电镜图(左)以及HA-香树脂酮纳米药物的透射电镜图(右)。
图5为奥利司他分散在水中的透射电镜图(左)以及HA-奥利司他纳米药物的透射电镜图(右)。
图6为二氢卟吩分散在水中的透射电镜图(左)以及HA-二氢卟吩纳米药物的透射电镜图(右)。
图7为通过CCK8法测定的经由不同浓度的雷公藤红素-HA纳米药物(CHNPs)处理HepG2细胞24h后的细胞活力结果图。
图8为未经处理、油酸处理后以及油酸+CHNPs处理后的HepG2细胞的油红O染色图。
图9为未经处理、油酸处理后以及油酸+CHNPs处理后的HepG2细胞内甘油三酯水平的量化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施实例1
本实例提供了一种HA-小分子自组装纳米药物，所述小分子为雷公藤红素。具体制备步骤如下：
将10mg雷公藤红素溶解在1mL二甲基亚砜中，得到10mg/mL的雷公藤红素溶液；将20mg分子量为17kDa的HA溶解在2mL去离子水中，得到10mg/mL的HA溶液。然后将HA溶液置于磁力搅拌台，设置转速为300rpm，温度为25℃。取20uL的雷公藤红素溶液逐滴加入到HA溶液中，继续磁力搅拌30min。搅拌结束后将混合溶液移至截留分子量为10000Da的蛇皮透析袋中，室温条件下在3L去离子水中透析24h，隔12h更换一次去离子水，透析期间注意避光。透析结束后将混合溶液移至5mL EP管中，4℃保存。
由图1可知：形成的纳米药物为形貌均一的球形结构，并且平均粒径在150nm左右，并具有良好的分散性。
实施实例2
本实例提供了一种HA-小分子自组装纳米药物，所述小分子为齐墩果酸。具体制备步骤如下：
将10mg齐墩果酸溶解在1mL二甲基亚砜中，得到10mg/mL的齐墩果酸溶液；将20mg分子量为17kDa的HA溶解在2mL去离子水中，得到10mg/mL的HA溶液。然后将HA溶液置于磁力搅拌台，设置转速为300rpm，温度为25℃。取20uL的齐墩果酸溶液逐滴加入到HA溶液中，继续磁力搅拌30min。搅拌结束后将混合溶液移至截留分子量为10000Da的蛇皮透析袋中，室温条件下在3L去离子水中透析24h，隔12h更换一次去离子水，透析期间注意避光。透析结束后将混合溶液移至5mL EP管中，4℃保存。
由图2可知：形成的纳米药物为形貌均一的球形结构，并且平均粒径在200nm左右，并具有良好的分散性。
实施实例3
本实例提供了一种HA-小分子自组装纳米药物，所述小分子为齐墩果酮酸。具体制备步骤如下：
将10mg齐墩果酮酸溶解在1mL二甲基亚砜中，得到10mg/mL的齐墩果酮酸溶液；将20mg分子量为17kDa的HA溶解在2mL去离子水中，得到10mg/mL的HA溶液。然后将HA溶液置于磁力搅拌台，设置转速为300rpm，温度为25℃。取20uL的齐墩果酮酸溶液逐滴加入到HA溶液中，继续磁力搅拌30min。搅拌结束后将混合溶液移至截留分子量为10000Da的蛇皮透析袋中，室温条件下在3L去离子水中透析24h，隔12h更换一次去离子水，透析期间注意避光。透析结束后将混合溶液移至5mL EP管中，4℃保存。
由图3可知：形成的纳米药物为形貌均一的球形结构，并且平均粒径在60nm左右，并具有良好的分散性。
实施实例4
本实例提供了一种HA-小分子自组装纳米药物，所述小分子为香树脂酮。具体制备步骤如下：
将2mg香树脂酮溶解在1mL甲醇中，得到2mg/mL的香树脂酮溶液；将20mg分子量为17kDa的HA溶解在2mL去离子水中，得到10mg/mL的HA溶液。然后将HA溶液置于磁力搅拌台，设置转速为300rpm，温度为25℃。取100uL的香树脂酮溶液逐滴加入到HA溶液中，继续磁力搅拌30min。搅拌结束后将混合溶液移至截留分子量为10000Da的蛇皮透析袋中，室温条件下在3L去离子水中透析24h，隔12h更换一次去离子水，透析期间注意避光。透析结束后将混合溶液移至5mL EP管中，4℃保存。
由图4可知：形成的纳米药物为形貌均一的球形结构，并且平均粒径在200nm左右，并具有良好的分散性。
实施实例5
本实例提供了一种HA-小分子自组装纳米药物，所述小分子为奥利司他。具体制备步骤如下：
将10mg奥利司他溶解在1mL二甲基亚砜中，得到10mg/mL的奥利司他溶液；将20mg分子量为17kDa的HA溶解在2mL去离子水中，得到10mg/mL的HA溶液。然后将HA溶液置于磁力搅拌台，设置转速为300rpm，温度为25℃。取100uL的奥利司他溶液逐滴加入到HA溶液中，继续磁力搅拌30min。搅拌结束后将混合溶液移至截留分子量为10000Da的蛇皮透析袋中，室温条件下在3L去离子水中透析24h，隔12h更换一次去离子水，透析期间注意避光。透析结束后将混合溶液移至5mL EP管中，4℃保存。
由图5可知：形成的纳米药物为形貌均一的球形结构，并且平均粒径在250nm左右，并具有良好的分散性。
实施实例6
本实例提供了一种HA-小分子自组装纳米药物，所述小分子为二氢卟吩。具体制备步骤如下：
将10mg二氢卟吩溶解在1mL二甲基亚砜中，得到10mg/mL的二氢卟吩溶液；将20mg分子量为17kDa的HA溶解在2mL去离子水中，得到10mg/mL的HA溶液。然后将HA溶液置于磁力搅拌台，设置转速为300rpm，温度为25℃。取100uL的二氢卟吩溶液逐滴加入到HA溶液中，继续磁力搅拌30min。搅拌结束后将混合溶液移至截留分子量为10000Da的蛇皮透析袋中，室温条件下在3L去离子水中透析24h，隔12h更换一次去离子水，透析期间注意避光。透析结束后将混合溶液移至5mL EP管中，4℃保存。
由图4可知：形成的纳米药物为形貌均一的球形结构，并且平均粒径在70nm左右，并具有良好的分散性。
实施实例7
本实例通过CCK8比色法来考察CHNPs的浓度大小对于HepG2细胞的细胞活力的影响，其方法如下：
(1)细胞培养
将人肝癌细胞HepG2细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM液体培养基中，置于37℃、含5％二氧化碳的培养箱中培养。
(2)细胞活力测定
以8000个细胞/孔的密度，将细胞接种于96孔板内，共接种54个孔。待到细胞贴壁生长至孔板的60％时，将细胞分为9组，每组6个孔，每组分别加入0μM(对照组)、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、2.0μM、3.0μM、4.0μM的CHNPs。药物处理24h后去除培养基，用灭菌PBS漂洗2次后，每孔加入100μL，含10％(体积比)CCK8的DMEM培养基，在孵箱中孵育2h后，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值。每孔吸光度值除以对照组的吸光度值作为细胞活力值，然后利用Graphpad进行作图分析。
由图7可知，当CHNPs的给药剂量小于或等于3μM时，HepG2细胞的细胞活力不受到影响，因此选择3μM以内的CHNPs剂量作为后续实验的给药剂量。
实施实例8
本实例通过油红O染色法来考察实例1所提供的CHNPs在油酸刺激的HepG2细胞高甘油三酯模型中的降脂能力，其方法如下：
(1)细胞培养
方法同实例7
(2)油红O/苏木素染色
将1cm*1cm载玻片置于24孔板中，以5000个细胞/片的密度，将细胞接种在的载玻片上。待到细胞生长至60％时，将其分为三组，一组加入终浓度为0.2mM的油酸(OA)的二甲基亚砜溶液；一组加入终浓度为0.2mM的油酸(OA)的二甲基亚砜溶液和终浓度为0.5mM的CHNPs溶液；第三组加入同等体积的PBS溶液作为对照组。在孵箱孵育24h后弃去培养基，PBS漂洗2遍后加入4％的多聚甲醛固定15min。细胞固定完全后加入预先配好的油红O工作液，避光放置30min。染色结束后用75％异丙醇漂洗10s，再用PBS漂洗2遍，加入苏木素染色液静置3min。苏木素染色结束后用盖玻片进行封片，在正置显微镜下拍摄图片。
由图8可知，OA处理后的HepG2细胞内脂滴数量(黑色箭头)相对于对照组明显增多，而经过CHNPs与OA共处理的HepG2细胞内脂滴数目相对于OA处理组明显降低。表明CHNPs在OA刺激的HepG2高甘油三酯模型中具有降脂能力。
实施实例9
本实例通过甘油三酯含量检测试剂盒来考察实例1所提供的的CHNPs在油酸刺激的HepG2细胞高甘油三酯模型中的降脂能力，其方法如下：
(1)细胞培养
方法同实例7
(2)酶法检测HepG2细胞内甘油三酯含量
以1.2*106个细胞/孔的密度，将细胞接种于六孔板内，待到细胞生长至60％时将其分为三组，一组加入终浓度为0.2mM的油酸(OA)的二甲基亚砜溶液；一组加入终浓度为0.2mM的油酸(OA)的二甲基亚砜溶液和终浓度为0.5mM的CHNPs溶液；第三组加入同等体积的PBS溶液作为对照组。在孵箱孵育24h后弃去培养基，每孔加入200uL的细胞裂解液，混匀后静置15min。细胞充分裂解后以5000rpm的转速离心5min取上清液进行后续分析。在96孔板中分别按照甘油三酯检测试剂盒以及BCA检测试剂盒的步骤将上清液与工作液混合，并于37℃下静置30min。随后在酶标仪上测定每孔550nm处的吸光度值。将吸光度值带入预先制好的标准曲线中计算出每组细胞内甘油三酯含量以及蛋白含量，每组细胞内甘油三酯含量/蛋白含量作为细胞内甘油三酯的终含量，然后利用Graphpad进行作图分析。
由图9可知，OA处理后的HepG2细胞内甘油三酯含量相对于对照组明显增多，而经过CHNPs与OA共处理的HepG2细胞内的甘油三酯含量相对于OA处理组明显降低。表明CHNPs在OA刺激的HepG2高甘油三酯模型中具有降脂能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种透明质酸-小分子自组装纳米药物，其特征在于，其是由透明质酸与疏水小分子药物通过简单的透析法自组装形成的纳米粒。
2.如权利要求1所述的一种透明质酸-小分子纳米药物，其特征在于，所述的透明质酸为透明质酸的钠盐形式；所述小分子药物为疏水小分子，包括雷公藤红素、齐墩果酸、齐墩果酮酸、香树脂酮、奥利司他、二氢卟吩中的一种或多种。
3.如权利要求1-2任一所述的一种透明质酸-小分子纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将疏水小分子药物溶解在水性有机溶剂中，得到溶液A。
步骤二、将透明质酸溶解在去离子水中，得到溶液B。
步骤三、将溶液A缓慢滴加至溶液B中，磁力搅拌30min得到溶液C。
步骤四、将溶液C置于截留分子量10000Da的透析袋中，避光磁力搅拌下在去离子水中透析，其中，透析温度为15～25℃；其中，透析时间为24h。
步骤五、透析结束后取出透析袋中的溶液，可得目标产物。
4.如权利要求3所述的一种透明质酸-小分子纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中疏水小分子为雷公藤红素、齐墩果酸、齐墩果酮酸、奥利司他、二氢卟吩时，步骤一所述的水性有机溶剂为二甲基亚砜；所述步骤一中疏水小分子为香树脂酮时，步骤一所述的水性有机溶剂为甲醇。
5.如权利要求3所述的一种透明质酸-小分子纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中透明质酸分子量为5kDa～200kDa。
6.如权利要求3所述的一种透明质酸-小分子纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤三中溶液A与溶液B的体积比为1:20～1:100。
7.如权利要求3所述的一种透明质酸-小分子纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤三中A溶液的质量浓度为10mg/mL～40mg/mL。
8.如权利要求3所述的一种透明质酸-小分子纳米药物的制备方法，其特征在于，所述步骤三中上述C溶液中疏水小分子与HA的质量比为1:50～1:150。
9.如权利要求3中所述方法制备的一种透明质酸-雷公藤红素自组装纳米药物，其特征在于，一种透明质酸-雷公藤红素纳米药物在非酒精性脂肪肝治疗中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20211228 |