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CN106667986B - 大黄酸/壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

大黄酸/壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大黄酸/壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用，其中大黄酸/壳聚糖水凝胶包括大黄酸溶液和壳聚糖溶液，所述大黄酸溶液包括大黄酸和NaHCO3溶液。其制备方法，包括以下步骤：将大黄酸溶于NaHCO3溶液中，得到大黄酸溶液；在冰浴条件下，向壳聚糖溶液边搅拌边加入所述大黄酸溶液，然后以70～120W的超声功率超声脱气处理，置于高于32℃的温度下加热1～5min得到大黄酸/壳聚糖水凝胶。本发明的大黄酸/壳聚糖水凝胶具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等特性，可解决大黄酸溶解性差、半衰期短的问题，并保留了大黄酸的生物活性，在治疗阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿等小胶质细胞介导的炎症性脑病的药物中应用，治疗效果明显。

Description

大黄酸/壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种大黄酸/壳聚糖水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
大黄酸是源于中药大黄的一种游离型蒽醌类物质，分子式是CH15H8O6。它是一种来源于天然的抗氧化剂和抗炎物质，毒副作用小，而且具有很好的抗氧化和抗炎作用，因此在抗肿瘤，抗炎，泻下，神经保护，调脂等方面具有较高活性。
壳聚糖是自然界唯一大量存在的碱性多糖，生物毒性小，壳聚糖凭借着其良好的生物相容性(Biomacromolecules.2003.4：1457-1465)，特殊的生物活性(抗炎、止血、促进组织粘连、降脂、降胆固醇、降血糖、免疫调节、抗肿瘤作用等)和来源广泛，在生物医学领域得到了深入的研究和广泛的应用，是一种理想的医用植入材料。壳聚糖在体内溶菌酶的作用下，一部分可最终代谢为二氧化碳排除体外，另一部分则以糖蛋白的形式为人体吸收。
壳聚糖之所以在生物医药领域受到关注，是因为它是一种带正电荷的多糖聚合物，可以和带负电的细胞壁发生电荷吸引，有利于细胞的黏附；其降解后的产物与细胞外基质的某些成分结构类似，具有良好的生物相容性(Chem.Com.2015.51：15862-15865)；壳聚糖可以和细胞生长因子复合以减少药物的失活。
可注射水凝胶中一种比较重要的运用形式是温敏性凝胶注射系统，温敏水凝胶是指随温度的变化会发生溶液—凝胶的转变。这种水凝胶的形成往往不需要其它化学试剂的引发，可以液体的形式注射进入体内，原位固化，并且它们的交联点温度可通过调节接近体温，是一种非常理想的给药系统。
小胶质细胞作为中枢神经系统胶质细胞中的一种，其是参与大脑免疫炎症反应的主要效应细胞。在阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿等小胶质细胞介导的炎症性疾病中，当中枢神经系统受到损伤后，静息状态的小胶质细胞被激活，迁移至损伤的脑细胞区。活化的小胶质细胞可分泌诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和白介素12(IL-12)等多种细胞因子参与炎症反应的免疫应答。因此，抑制小胶质细胞的活化从而减轻炎症因子的表达对治疗阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿等小胶质细胞介导的中枢神经系统疾病发挥着重要的神经保护作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等特性的可注射的大黄酸/壳聚糖水凝胶，可解决大黄酸溶解性差问题，并保留了大黄酸的生物活性。本发明还提供了上述大黄酸/壳聚糖水凝胶的制备方法，制备工艺简单。本发明还提供了上述大黄酸/壳聚糖水凝胶在制备阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿等小胶质细胞介导的炎症性脑病的药物中的应用，治疗效果明显。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种大黄酸/壳聚糖水凝胶，包括大黄酸溶液和壳聚糖溶液，所述大黄酸溶液包括大黄酸和NaHCO3溶液。
上述的大黄酸/壳聚糖水凝胶，优选的，原料组分如下：所述壳聚糖溶液的浓度为20mg/mL，所述大黄酸溶液的浓度为1～3mg/mL，所述大黄酸溶液与所述壳聚糖溶液的体积比为2～5∶1，所述NaHCO3溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的大黄酸/壳聚糖水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将大黄酸溶于NaHCO3溶液中，得到大黄酸溶液；
S2、在冰浴条件下，向壳聚糖溶液边搅拌边加入所述大黄酸溶液，然后以70～120W的超声功率超声脱气处理，置于高于32℃的温度下加热1～5min得到大黄酸/壳聚糖水凝胶。
上述的制备方法，优选的，所述壳聚糖溶液采用以下方法制备得到：壳聚糖溶于乙酸溶液中，搅拌溶解得到壳聚糖溶液。
上述的制备方法，优选的，所述乙酸溶液的体积百分含量为1％；所述壳聚糖溶液的浓度为20mg/mL。
上述的制备方法，优选的，所述大黄酸溶液浓度为1～3mg/mL，所述大黄酸溶液与壳聚糖溶液的体积比为2～5∶1，所述NaHCO3溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。
作为一个总的技术构思，本发明提供了一种上述的大黄酸/壳聚糖水凝胶或上述制备方法制备得到的大黄酸/壳聚糖水凝胶在制备用于治疗小胶质细胞介导的相关疾病的药物中的应用。
作为一个总的技术构思，本发明提供了一种上述的大黄酸/壳聚糖水凝胶或上述制备方法制备得到的大黄酸/壳聚糖水凝胶在制备用于减轻或治疗小胶质细胞炎症性疾病药物中的应用；或在制备用于保护神经细胞药物中的应用；或在制备用于治疗小胶质细胞介导的炎症性脑病药物中的应用。
作为一个总的技术构思，本发明提供了一种上述的大黄酸/壳聚糖水凝胶或上述制备方法制备得到的大黄酸/壳聚糖水凝胶在制备用于治疗阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种大黄酸/壳聚糖水凝胶，可注射水凝胶中一种比较重要的运用形式是温敏性凝胶注射系统，温敏水凝胶是指随温度的变化会发生溶液—凝胶的转变。这种水凝胶的形成往往不需要其它化学试剂的引发，可以液体的形式注射进入体内，原位固化，并且它们的交联点温度可通过调节接近体温，是一种非常理想的给药系统。利用上述原理，我们成功地制备了大黄酸/壳聚糖水凝胶，此形成的水凝胶不仅解决了大黄酸溶解性差的问题，而且保留了大黄酸的生物活性，水凝胶的力学强度更大，运用更广泛。
(2)本发明提供了一种大黄酸/壳聚糖水凝胶，大黄酸和壳聚糖都具有抗炎作用，是源于天然产物的抗炎药物，加入的壳聚糖可以和大黄酸发生共组装，增强了水凝胶的机械强度和抗炎，抗菌性，使水凝胶具有适合的硬度，弹性和粘性。该水凝胶易于注射，注射后可迅速原位固化，然后缓慢药物，延长药物作用时间。因此，大黄酸/壳聚糖水凝胶运用于小胶质细胞介导的炎症性疾病中，可以发挥协同作用，很好地抑制活化的小胶质细胞分泌的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和白介素12(IL-12)等多种炎症因子的表达，从而发挥抗炎治疗相关疾病的疗效。对促进大黄酸应用于临床，成为临床新药具有积极意义。
(3)本发明提供了一种大黄酸/壳聚糖水凝胶的制备方法，制备过程简单，成本低，可商品化，适于大规模生产，有望运用在组织工程，药物缓释，伤口愈合和神经保护等生物医药领域。即保留了大黄酸生物活性，又延长了大黄酸在病变位置的作用时间，增强了药物的治疗效果，在生物医学方面具有良好的运用前景。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中大黄酸/壳聚糖水凝胶的透射电子显微镜(TEM)图。
图2为本发明实施例1中大黄酸/壳聚糖水凝胶的数码照片图。
图3为本发明实施例1中对照组和大黄酸/壳聚糖水凝胶组的傅里叶红外谱图。
图4为本发明实例2中不同浓度的大黄酸/壳聚糖水凝胶的体外缓释曲线图。
图5为本发明实施例3中大黄酸/壳聚糖水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞生成诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平的影响。
图6为本发明实施例3中大黄酸/壳聚糖水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞生成TNF-α炎症因子水平的影响。
图7为本发明实施例3中大黄酸/壳聚糖水凝胶和大黄酸LPS诱导BV2细胞生成6(IL-6)炎症因子水平的影响。
图8为本发明实施例3中大黄酸/壳聚糖水凝胶和大黄酸LPS诱导BV2细胞生成12(IL-12)炎症因子水平的影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种本发明的大黄酸/壳聚糖水凝胶，包括大黄酸溶液和壳聚糖溶液，大黄酸溶液包括大黄酸和NaHCO3溶液，采用以下方法制备得到：
(1)壳聚糖溶液的制备：称取200mg的壳聚糖于离心管中，加入10mL体积比为1％乙酸溶液，搅拌溶解，配置浓度为20mg/mL的壳聚糖溶液。
(2)NaHCO3溶液的制备：称取0.84g NaHCO3于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.1mol/L的NaHCO3溶液。
(3)称取2mg大黄酸粉末于相应的离心管中，向离心管中边震荡边加入1mL步骤(2)的NaHCO3溶液得到浓度为2mg/mL的大黄酸溶液。
(4)取0.5mL步骤(1)的壳聚糖溶液于螺口瓶中，在0℃冰水混合的冰浴条件下，向壳聚糖溶液中边搅拌边滴加1mL大黄酸溶液，搅拌均匀后然后以100W的超声功率超声1min脱气处理，置于高于32℃(本实施例为32℃)的恒温水浴锅中加热2min即可得到的大黄酸/壳聚糖水凝胶，其中大黄酸的浓度为1.4mg/mL，壳聚糖的最终浓度6.67mg/mL。
在其他实施例中，步骤(4)中可添加2.5mL大黄酸溶液。
用扫描电镜(TEM)考察其微观结构。
透射电镜制样：夹取铜网小心的放入水凝胶的半固体胶体或稀释后的溶液内，缓缓摆动铜网1min使样品附着在铜网上。取出铜网，用滤纸轻轻拭去铜网上多余样品。自然晾干，将样品放入干燥器内保持干燥，待测TEM。
图1为大黄酸/壳聚糖水凝胶电镜扫描结果。如图1所示大黄酸/壳聚糖水凝胶表现出带状的三维网络构。壳聚糖属于高分子聚合物，具有良好的成膜性，所得形貌图是层状结构。因此，大黄酸和壳聚糖通过非共价键自组装形成的可注射水凝胶是带状的相互交织的三维网络结构。
用数码相机记录实施例1中制备得到的大黄酸/壳聚糖水凝胶的外观。如图2所示，大黄酸/壳聚糖水凝胶是橘黄色的，均一稳定的。
对大黄酸/壳聚糖水凝胶进行傅里叶红外谱图谱考察；
大黄酸/壳聚糖水凝胶组：即实施例1的大黄酸/壳聚糖水凝胶，其中大黄酸的浓度为1.4mg/mL，壳聚糖的最终浓度为6.67mg/mL。
对照组：大黄酸粉末。
红外测试实验步骤：把实施例1的大黄酸/壳聚糖水凝胶冷冻干燥，得到冻干凝胶。称取一定质量的冻干水凝胶与相应质量的溴化钾压片(50:1)，得到片状的样品，大黄酸粉末固体作为对照。
图3为大黄酸/壳聚糖水凝胶的傅里叶红外谱图。图中(a)是对照组；(b)是大黄酸/壳聚糖水凝胶组。如图所示：a中3448cm-1属于的O-H的伸缩振动吸收峰，1962cm-1和1630cm-1分别属于C＝O的非对称和对称伸缩振动吸收峰，出现在1692cm-1，1630cm-1和1452cm-1的吸收峰属于芳环骨架的伸缩振动峰，位于1268cm-1处的峰属于C-O的伸缩振动峰，出现在808cm-1处的峰属于O-H的弯曲振动吸收峰；b中3446cm-1为O-H的伸缩振动吸收峰，此吸收峰变弱，并且在1558cm-1处出现了一个吸收峰，这是酰胺中N-H的特征吸收峰，说明有酰胺键的生成，大黄酸中的羧基和壳聚糖中的氨基发生反应生成一个有酰胺键。
实施例2
一种本发明的大黄酸/壳聚糖水凝胶，包括大黄酸溶液和壳聚糖溶液，大黄酸溶液包括大黄酸和NaHCO3溶液，采用以下方法制备得到：
(1)NaHCO3溶液的制备：称取0.84gNaHCO3于烧杯中，加入超纯水搅拌溶解，然后转移到100mL容量瓶中，加水定容，配置浓度0.1mol/L的NaHCO3溶液。
(2)大黄酸溶液的制备：分别称取3mg、2.5mg、2mg、1.7mg大黄酸于相应的螺口瓶中，向每个螺口瓶中边震荡边加入1mL浓度为0.1mol/L的NaHCO3溶液，分别配制成3mg/mL、2.5mg/mL、2mg/mL、1.7mg/mL的大黄酸溶液。
(3)壳聚糖溶液的制备：称取200mg的壳聚糖于离心管中，加入10mL体积比为1％乙酸溶液，超声溶解，配置浓度为20mg/mL的壳聚糖溶液。
(4)分别取0.5mL壳聚糖溶液于4个螺口瓶中，在0℃冰水混合的冰浴条件下，边搅拌边分别滴加1mL浓度为3mg/mL、2.5mg/mL、2mg/mL、1.7mg/mL的大黄酸溶液，搅拌均匀后以100W的超声功率超声1min脱气处理，然后放入高于32℃(本实施例为32℃)的恒温水浴锅中加热2min后即可得到的大黄酸/壳聚糖水凝胶，其中大黄酸的浓度分别为2mg/mL、1.7mg/mL、1.4mg/mL、1.1mg/mL，壳聚糖溶液的最终浓度为6.67mg/mL。
在紫外可见分光度计下进行吸光度检测，检测方法为：配置PH＝7.4(模拟生理体液)，浓度为10mmol/L的PBS(磷酸氢二钠～磷酸二氢钾)缓冲溶液作为大黄酸的释放介质，每个大黄酸/壳聚糖水凝胶中加入5mL的PBS缓冲液，置于高于32℃(本实施例为32℃)的恒温水浴锅中，在一定的时间点分别摇动水凝胶，大黄酸逐渐被释放出来，每隔一段时间取出PBS缓冲液3mL，并同时补充3mL新鲜的PBS缓冲液到释放体系中，在紫外可见分光度计下测试吸光度，以空白凝胶作对照，记录不同时间段的吸光度值，本实验选取的时间点为0.5h、2h、6h、30h、54h、72h、90h、108h。
根据标准曲线计算大黄酸的浓度，从而绘制出释放曲线。
表1：大黄酸水凝胶的吸光度变化率
释放率＝累计释放量/载药量×100％。
同时参见图4，图4体现不同浓度的大黄酸/壳聚糖水凝胶释放大黄酸的情况。
从表1和图4中可知：在6h内，不同浓度的大黄酸/壳聚糖水凝胶释放大黄酸的速度都很快，随着时间的增加，释放速率逐渐减慢。随着大黄酸浓度的增加，大黄酸和壳聚糖之间的相互作用力增强，释放速率降低。在100h内，大黄酸/壳聚糖水凝胶能持续释放药达70％以上。这表明大黄酸/壳聚糖水凝胶具有很好的缓释效果。
实施例3
一种本发明的大黄酸/壳聚糖水凝胶在治疗小胶质细胞介导的炎症性疾病中的应用，具体方法包括以下步骤：
1.药物培基的配制：
含药培基1的配置：取含大黄酸浓度为1.6mg/mL的大黄酸/壳聚糖水凝胶母液，加入培养基中稀释得到含药培基1，含药培基1中大黄酸/壳聚糖水凝胶所含大黄酸的浓度为4.5μg/mL。
含药培基2的配置：取浓度为6mg/mL的大黄酸单体母液，加入到培养基中，配制含药培基2，含药培基2中大黄酸单体浓度4.5μg/mL。
2.大鼠小胶质细胞(BV2细胞系)炎症性模型的制备：
大黄酸组：取处于对数生长期的BV2细胞，用胰酶消化液消化，制成细胞悬液；铺板，保证每孔70％的覆盖率。过夜，细胞贴壁；去除BV2细胞的培基，加入上述含药培基2，并标号；待以上含药培基2处理30min后，每孔加入1μg/mL的脂多糖(LPS)，处理48h后收集细胞和上清液，进行后续检测。
大黄酸/壳聚糖水凝胶组：取处于对数生长期的BV2细胞，用胰酶消化液消化，制成细胞悬液；铺板，保证每孔70％的覆盖率。过夜，细胞贴壁；去除BV2细胞的培基，加入含药培基1，并标号；待以上含药培基1处理30min后，每孔加入1μg/mL的LPS，处理48h后收集细胞和上清液，进行后续检测。
LPS组：取处于对数生长期的BV2细胞，用胰酶消化液消化，制成细胞悬液；铺板，保证每孔70％的覆盖率。过夜，细胞贴壁；去除BV2细胞的培基，加入新鲜不含药物的培基，30min后，加入1μg/mL的LPS，处理48h后收集细胞和上清液，进行后续检测。
空白组：取处于对数生长期的BV2细胞，用胰酶消化液消化，制成细胞悬液；铺板，保证每孔70％的覆盖率。过夜，细胞贴壁；去除BV2细胞的培基，加入新鲜不含药物的培基，并标号。
3.ELISA法测定小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素12(IL-12)的表达：
(1)实验仪器：台式高速冷冻离心机湘仪(H1650R)；全自动酶标洗板机汇松(PW-812)；多功能酶标分析仪汇松(MB-530)；恒温培养箱光明(DHP-500)；自动平衡离心机湘仪(L530)；干净试管和离心管；容量瓶；系列可调节移液器及吸头。
(2)样本采集；分别收集每孔板中的细胞上清，于10000rpm离心10min，仔细吸取上清，-20℃冰箱保存留作实验的样本，实验之前从冰箱取出，自然解冻。
(3)实验试剂的配制：
本实施例中，试剂盒为武汉华美生物科技有限公司生产的ELISA法试剂盒，其中各试剂盒的批号如下：一氧化氮合酶试剂盒为Lot:A16039818，肿瘤坏死因子的试剂盒为Lot:Z06939817，白介素6的试剂盒为Lot:Z01039820，白介素12的试剂盒为Lot:Z01039822。
标准品：从试剂盒中取出一支标准品，于10000rpm离心30s。用1mL样本稀释液(本实施例为10mmol/L的PBS(磷酸氢二钠～磷酸二氢钾)，PH值为7.4，0.05％吐温-20(体积比)，0.5％的牛血清蛋白(BSA)溶解，并用枪头对准冻存管底部反复吸打5次以助溶解，充分混匀得到标准品S7，放置备用；取7个1.5mL离心管，编号为S6～S0。将离心管依次排列，各加入250μL样本稀释液。吸取250μL标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀。从S6中吸取250μL到第二个EP管(S5)，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释。S0为样本稀释液。
洗涤工作液：将浓洗涤液(本实施例为0.02mol/L PBS(PH＝7.4)加上0.05％吐温-20)按1∶25倍用去离子水进行稀释，具体为：用量筒量取240mL去离子水，倒入烧杯或其他洁净容器中，再量取10mL浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
生物素标记抗体工作液：将生物素标记抗体液(本实施例为10mg/mL生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液)按1∶100倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释，具体为：10μL生物素标记抗体液加990μL生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，在临用前10min内配妥。
辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：辣根过氧化物酶标记亲和素(本实施例采用的为武汉华美生物科技有限公司生产的辣根过氧化物酶标记亲和素)按1∶100倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行稀释，具体为：10μL辣根过氧化物酶标记亲和素加990μL辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，轻轻混匀，在临用前10min。
(4)操作步骤：
4.1、将各种试剂移至室温(18～25℃)平衡至少30min，按前述方法配置试剂，备用。
4.2、加样：分别设标准孔和待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，置37℃温育2h。
4.3、弃去液体，甩干，不用洗涤。
4.4、每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，置37℃温育1h。
4.5、弃去孔内液体，甩干，采用配制的洗涤工作液洗板3次。每次洗板，将洗涤工作液浸泡2min，200μL每孔，甩干。
4.6、每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，置37℃温育1h。
4.7、弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2min，200μL每孔，甩干。
4.8、依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15min。
4.9、依序每孔加终止液(本实施例为2mol/L H2SO4溶液)50μL，终止反应。
4.10、在反应终止后5min内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)，计算各个炎症因子的含量。实验结果分别见图5、图6、图7和图8。
图5为大黄酸/壳聚糖水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞产生诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平的影响，从图5可以看出：与空白组相比(#p＜0.01)，LPS组iNOS的水平显著增加，说明LPS能刺激BV2细胞产生iNOS水平明显增加，与LPS组比较，大黄酸组iNOS表达水平明显低于LPS组(△p＜0.01)，大黄酸/壳聚糖水凝胶组iNOS表达水平明显低于LPS组(*p＜0.01)，这说明大黄酸和大黄酸/壳聚糖水凝胶均能抑制iNOS的表达，与大黄酸组相比，大黄酸/壳聚糖水凝胶组iNOS表达水平明显低于大黄酸组(□p＜0.01)，这说明大黄酸/壳聚糖水凝胶抑制iNOS表达的水平明显优于大黄酸。
图6为大黄酸/壳聚糖水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平的影响，从图6可以看出：与空白组比(#p＜0.01)，LPS组TNF-α水平显著增加，说明LPS刺激BV2细胞产生TNF-α水平明显增加；与LPS组比较，大黄酸组TNF-α表达水平明显降低(△p＜0.05)，大黄酸/壳聚糖水凝胶组TNF-α表达水平也显著下降(*p＜0.01)，这说明大黄酸/壳聚糖水凝胶均能抑制TNF-α的表达水平；与大黄酸组比，大黄酸/壳聚糖水凝胶组TNF-α表达水平明显下降(□p＜0.05)，这说明大黄酸/壳聚糖水凝胶抑制TNF-α的表达明显优于大黄酸。
图7为大黄酸/壳聚糖水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞产生白介素6(IL-6)水平的影响，从图7可以看出：与空白组比(#p＜0.01)，LPS组IL-6水平显著增加，说明LPS刺激BV2细胞产生IL-6水平明显增加；与LPS组比较，大黄酸组IL-6表达水平明显降低(△p＜0.01)，大黄酸/壳聚糖水凝胶组IL-6表达水平也显著下降(*p＜0.01)，这说明大黄酸和大黄酸/壳聚糖水凝胶均能抑制IL-6的表达水平；与大黄酸组比，大黄酸/壳聚糖水凝胶组IL-6表达水平明显下降(□p＜0.05)，这说明大黄酸/壳聚糖水凝胶抑制IL-6的表达明显优于大黄酸。
图8为大黄酸/壳聚糖水凝胶和大黄酸对LPS诱导BV2细胞白介素12(IL-12)水平的影响，从图8可以看出：与空白组比(#p＜0.01)，LPS组IL-12水平显著增加，说明LPS刺激BV2细胞产生IL-12水平明显增加；与LPS组比较，大黄酸组IL-12表达水平明显降低(△p＜0.01)，大黄酸/壳聚糖水凝胶组IL-12表达水平也显著下降(*p＜0.01)，这说明大黄酸和大黄酸/壳聚糖水凝胶均能抑制IL-12的表达水平；与大黄酸组比，大黄酸/壳聚糖水凝胶组IL-12表达水平明显下降(□p＜0.01)，这说明大黄酸/壳聚糖水凝胶抑制IL-12的表达明显优于大黄酸。
因此，大黄酸/壳聚糖水凝胶运用于小胶质细胞介导的炎症性疾病中，可以发挥协同作用，很好地抑制活化的小胶质细胞分泌的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和白介素12(IL-12)等多种炎症因子的表达，从而发挥抗炎治疗相关疾病的疗效。对促进大黄酸应用于临床，成为临床新药具有积极意义。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (7)

1.一种大黄酸/壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述大黄酸/壳聚糖水凝胶的原料包括大黄酸溶液和壳聚糖溶液，所述大黄酸溶液包括大黄酸和NaHCO3溶液。
2.根据权利要求1所述的大黄酸/壳聚糖水凝胶，其特征在于，原料组分如下：所述壳聚糖溶液的浓度为20 mg/mL，所述大黄酸溶液的浓度为1～3 mg/mL，所述大黄酸溶液与所述壳聚糖溶液的体积比为2～5∶1，所述NaHCO3溶液的浓度为0.1～0.5 mol/L。
3.一种大黄酸/壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将大黄酸溶于NaHCO3溶液中，得到大黄酸溶液；
S2、在冰浴条件下，向壳聚糖溶液边搅拌边加入所述大黄酸溶液，然后以70～120 W的超声功率超声脱气处理，置于高于32 ℃的温度下加热1～5 min得到大黄酸/壳聚糖水凝胶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液采用以下方法制备得到：壳聚糖溶于乙酸溶液中，搅拌溶解得到壳聚糖溶液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸溶液的体积百分含量为1 %；所述壳聚糖溶液的浓度为20 mg/mL。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述大黄酸溶液浓度为1～3 mg/mL，所述大黄酸溶液与壳聚糖溶液的体积比为2～5∶1，所述NaHCO3溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。
7.一种权利要求1或2所述的大黄酸/壳聚糖水凝胶或权利要求3至6中任一项所述制备方法制备得到的大黄酸/壳聚糖水凝胶在制备用于治疗阿尔茨海默病、帕金森病、脑外伤、脑水肿药物中的应用。
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