CN112972693B - 用于长效抑制肿瘤术后复发的多糖复合物及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于术后治疗、生物医学工程技术领域，公开了一种用于长效抑制肿瘤术后复发的多糖复合物及其制备与应用，该多糖复合物是由包括壳聚糖(CS)和香菇多糖(LNT)在内的原料复合而成。本发明是对香菇多糖肿瘤抑制剂的剂型进行创新改造，使得本发明中的多糖复合物具有良好的生物相容性的同时，能在局部保持长时间的缓慢释放，与常规的术后抑制肿瘤复发辅助治疗—化疗和放疗相比，大大降低了治疗的毒副作用，并提升长时间的抑制效果。

Description

用于长效抑制肿瘤术后复发的多糖复合物及其制备与应用

技术领域

本发明属于术后治疗、生物医学工程技术领域，更具体地，涉及一种用于长效抑制肿瘤术后复发的多糖复合物及其制备与应用。

背景技术

手术是实体肿瘤患者的主要治疗方法。然而，尽管外科切除具有治愈目的，术后进行的辅助治疗(通常为术后化疗和放疗)通常会导致严重系统性不良反应(Clin.Trans.Med.,2018,7:11)。有研究已经提出，术后使用的糖皮质激素反而会促进局部的肿瘤复发(Nature,2019,567:540–544)。更重要的是，化疗效果并不显著，术后肿瘤的局部复发和转移仍然很常见，并具有很高的死亡风险，这一问题严重影响病人术后生活质量和生存率。研究发现，肿瘤的迁移和入侵主要通过肿瘤周围组织的血液或淋巴血管，通过血液或淋巴流传播而迁移到远处器官(Cell,2006,127:679-695)。因此外科切除手术伴随的出血、局部细胞因子和免疫环境改变可能促进肿瘤复发或转移。由此可见，在控制毒副反应的基础上达到抑制局部残余肿瘤复发是有潜力的解决方案。

在手术创面植入可控药物递送系统(DDSs)是一种研究较多的策略，可以抑制手术后局部和远处肿瘤复发。诸如晶体，支架，泡沫和纤维已经有诸多研究涉及，但这些用于体内的材料在生物相容性上并没有很大进步，其中使用的成分(例如聚乳酸、聚己内酯)以及反应引发剂大多来自化学合成，或多或少会引起局部的应激反应(Biomaterials,2019,219:119182)。其次，上述给药系统在局部使用高剂量的化疗药物，并没有有效解决化疗药物引起的毒副反应。而且大多制备过程繁琐，临床应用成本高昂。

与体内物质化学性质类似，具有较好生物相容性的生物类似物近来引起广泛关注。特别地，本发明发明人所在课题组通过在真菌多糖领域多年的研究，明确了香菇多糖具有明显的直接和间接抗肿瘤活性，同时其体内外的生物相容性良好(J.Funct.Foods,2018,45:75-85；Cancer Lett.,2016,377,2:117-125)。壳聚糖是一种杂多糖，与体内大量存在的粘多糖(如透明质酸)结构相似，众多体内研究说明壳聚糖具有很好的生物相容性(Adv.Drug Deliv.Rev.,2010,62:83-99)。

目前，专门用于抑制术后肿瘤复发的多糖复合物治疗产品鲜有报道。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种用于长效抑制肿瘤术后复发的多糖复合物及其制备与应用，其中是对香菇多糖肿瘤抑制剂的剂型进行创新改造，使得本发明中的多糖复合物具有良好的生物相容性的同时，能在局部保持长时间的缓慢释放，与常规的术后抑制肿瘤复发辅助治疗—化疗和放疗相比，大大降低了治疗的毒副作用，并提升长时间的抑制效果。本发明首次拓展了香菇多糖在体内局部抑制肿瘤复发的应用，通过将壳聚糖载体与香菇多糖形成复合物，利用分子间氢键和范德华力作用可得到香菇多糖的缓释效果，在兼顾体内植入材料生物相容性的同时，有良好的长效抑制肿瘤术后复发的效果。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种天然多糖复合物，其特征在于，该复合物是由包括壳聚糖(CS)和香菇多糖(LNT)在内的原料复合而成。

作为本发明的进一步优选，所述壳聚糖和所述香菇多糖的质量之比为(2～15):1，优选为4:1。

作为本发明的进一步优选，所述壳聚糖的纯度在98％以上，脱乙酰率在80％-95％；所述香菇多糖的纯度不低于99％，重均分子量300-600KDa。

作为本发明的进一步优选，该复合物具有多孔结构；所述复合是通过将壳聚糖溶液与香菇多糖溶液混合，利用中和反应，同时基于分子间氢键和范德华力作用进行的；其中，所述壳聚糖溶液是以酸性溶液为溶剂，所述香菇多糖溶液是以碱性溶液为溶剂；

优选的，所述酸性溶液为盐酸，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液。

作为本发明的进一步优选，所述香菇多糖的纯度在99％以上，是香菇经水提醇沉得到粗多糖，再经冻融、脱色和超滤得到的精制组分。

按照本发明的另一方面，本发明提供了制备上述天然多糖复合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)基于水提醇沉方法制备香菇多糖，得到香菇多糖原料；

(2)溶解壳聚糖，形成透明的壳聚糖溶液；

(3)溶解所述香菇多糖原料，形成透明的香菇多糖溶液；

(4)在搅拌条件下将所述壳聚糖溶液与所述香菇多糖溶液相混合，得到均匀混合溶液；

(5)将所述步骤(4)得到的所述混合溶液置于形状预先设计的模具中冷冻，接着冻干即可得到多孔的天然多糖复合物。

作为本发明的进一步优选，对于所述步骤(1)得到的所述香菇多糖原料，其重均分子量为300-600KDa，且不含蛋白和核酸类杂质。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述溶解是在搅拌条件下进行的，搅拌转速为400rpm-4000rpm；

所述步骤(3)中，所述溶解同样是在搅拌条件下进行的，搅拌转速同样为400rpm-4000rpm。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(4)得到的所述混合溶液其pH值为6.5～7.5。

按照本发明的又一方面，本发明提供了上述天然多糖复合物应用于制备抑制肿瘤切除术后复发的制剂。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明中用于长效抑制肿瘤术后复发的真菌多糖复合物(即，香菇多糖/壳聚糖复合物)，所用组分包括香菇多糖和壳聚糖，其中壳聚糖与人体内粘多糖结构相似，香菇多糖为天然抗肿瘤多糖，使得本发明的多糖复合物具有良好的生物相容性，并且本发明还利用香菇多糖/壳聚糖复合物中分子间氢键和范德华力作用，使得香菇多糖功能成分能够缓慢释放，达到缓释效果，因此具有长效抗肿瘤作用。与临床常用化疗药相比，该多糖复合物用于体内局部抑制肿瘤术后复发时，可以长时间缓慢释放抗肿瘤成分且不会产生严重的副作用。本发明中的天然多糖复合物能够长效抑制肿瘤切除术后复发，可以有效解决术后抗肿瘤复发辅助治疗的给药频繁以及副作用等问题，为术后肿瘤复发的治疗和预防提供了解决方案(当然，除了用于抑制肿瘤术后复发外，也可应用于其他需要香菇多糖功能成分缓慢释放的场合)。

本发明将天然抗肿瘤真菌多糖与载体壳聚糖复合形成天然多糖复合物，具有制备简单，原料获取方便，香菇多糖具有明显的抗肿瘤作用且生物相容性好等优点；同时制备得到的香菇多糖复合物有良好的吸水性，可以用于吸收术后局部渗出的组织液和血液，降低肿瘤细胞扩散的可能性；此外，所述香菇多糖复合物成分均匀，可以植入体内在局部达到长期释放药物的效果。

单独的香菇多糖用于口服或注射液时，体内降解代谢速度于传统化疗药相似，均较快，需要多次给药；壳聚糖相关的体内应用研究中，多采用化学修饰以及化学交联反应，制备过程复杂且不可避免产生毒副产物(Biomacromolecules,2019,20,801-812)。本发明中的多糖复合物，采用简单温和的制备过程，成分间不发生化学交联反应，即不产生毒副产物。在保护抗肿瘤成分香菇多糖空间结构的基础上，利用壳聚糖富含氨基，香菇多糖富含羟基，两组分分子间氢键和范德华力使成分均匀分布，可以达到局部缓释的目的，并且，上述制备过程中分子间范德华力和氢键作用形成是的网状结构，而采用冻干工艺能够进一步确保样品呈多孔疏松海绵状，可以吸收肿瘤摘除术时局部出血防止肿瘤细胞扩散。本发明中的香菇多糖/壳聚糖复合物解决了一般肿瘤术后抑制复发治疗中化疗、放疗的毒副作用，以及化疗药物半衰期短，长期频繁服药问题。此外，本发明中的香菇多糖/壳聚糖复合物制备过程简单，形状易塑，在应用于局部时可操作性较高。

香菇多糖有优良的抗肿瘤活性，但其分子量大，中性条件下溶解度低等缺点，临床上一般少量用于抗肿瘤免疫辅助治疗。本发明发明人所在课题组经过长期的探究发现，香菇多糖对肿瘤细胞有明显的直接杀伤作用，故香菇多糖直接应用于体内抗肿瘤的研究少之又少，而应用于体内局部抑制肿瘤复发的应用更是未有涉及。本发明利用香菇多糖在碱性条件下溶解性好的特点，将其于酸性的壳聚糖溶液混合，在中和作用下，两组分溶解度降低，两组分的分子间彼此发生范德华力和氢键作用，经冻干得到所述香菇多糖/壳聚糖复合物。本发明创造性的将香菇多糖的抗肿瘤作用应用于体内局部组织，拓展了香菇多糖的应用，使临床上肿瘤术后抑制的辅助治疗更简便。

本发明还通过对壳聚糖的脱乙酰率属性进行优选控制，壳聚糖的脱乙酰率优选为80-95％，一方面既能够保证壳聚糖在酸性溶液中有较好的溶解度，以便于使壳聚糖发挥作为缓释香菇多糖载体的作用，另一方面，又能够避免脱乙酰率过高时，壳聚糖成本陡增但对壳聚糖溶解度和体内相容性增益不明显等负面影响。

本发明进一步对制得的复合材料进行体外的抗肿瘤细胞增殖效果评估，体内的长时间示踪表征复合材料的体内释放，除此之外，还进行体内长时间抗肿瘤术后复发效果评估，综合探索、验证了该材料在生物医学工程领域的应用潜力。

附图说明

图1为实施例6香菇多糖复合物的实物图(图中虽然分出了2个样品，但这2个样品之间并没有区别)。

图2为实施例6香菇多糖复合物在不同放大倍率下的扫描电子显微镜图像；其中，图2中的(a)对应50倍放大倍率，图2中的(b)对应200倍放大倍率。

图3为实施例6香菇多糖/壳聚糖复合物中香菇多糖在一定浓度范围对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的细胞活力影响的效果图；其中，图3中的(a)对应MDA-MB-231，图3中的(b)对应MCF-7。

图4为实施例6香菇多糖/壳聚糖复合物对乳腺癌细胞MDA-MB-231和正常人体肝细胞L-o2的细胞活力影响的效果图；其中，图4中的(a)对应MDA-MB-231，图4中的(b)对应L-o2。

图5为实施例6香菇多糖/壳聚糖复合物在Balb/c nude小鼠术后局部植入的长期释放效果图(直到D59，即第59天)。

图6为实施例6香菇多糖/壳聚糖复合物与其他对照组的肿瘤摘除术后体内各器官在同一放大倍率下的生物相容性表征。

图7为实施例6香菇多糖/壳聚糖复合物与其他对照组的肿瘤摘除术后体内长效抑制肿瘤复发表征；其中，图7中的(a)对应复发后肿瘤实体，图7中的(b)对应复发后肿瘤实体的体积统计平均值。

图8是本发明多糖复合物的结构示意图(其中，LNT结构式中的n可以为1850-3700内的整数)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

总的来说，本发明中用于长效抑制肿瘤术后复发的多糖复合物，以香菇多糖为主要抗肿瘤成分，壳聚糖作为载体，不同pH溶液溶解两组份后，搅拌混合，通过中和作用、分子间氢键以及范德华力等作用制备混合均匀的多孔香菇多糖/壳聚糖复合物，达到局部吸收组织液和出血，以及局部体内环境下的长时间缓释的性能。

其制备过程可以包括以下步骤：(1)水提醇沉方法制备精制的香菇多糖；(2)溶解壳聚糖形成透明溶液；(3)溶解香菇多糖形成透明溶液；(4)搅拌条件下混合步骤(2)和步骤(3)得到的溶液，得到均匀混合溶液；(5)将步骤(4)所得混合溶液置于合适模具中冷冻，接着冻干。其中，

香菇多糖及其溶液可以如下：将干香菇浸泡后水提醇沉得到粗多糖，再经反复冻融和脱色除去其中蛋白质和色素等杂质，最后经超滤和透析进一步除去杂质和小分子寡糖。经冻干得到精制的香菇多糖，最后将香菇多糖溶于合适浓度的碱液中，得到香菇多糖溶液。

步骤(5)可以是对混合溶液先经匀速降温冷冻后，再经真空冻干，从而可以得到均匀多孔的香菇多糖/壳聚糖复合物。另外，模具的形状可根据实际需求来预先设计，从而得到形状多变的海绵状香菇多糖复合物。

本发明中所采用的原料壳聚糖纯度在98％以上，脱乙酰率在80％-95％；以购自浙江澳兴生物科技有限公司的壳聚糖为例，壳聚糖的纯度具体为99.6％，脱乙酰率具体为85％，满足要求。

本发明中用于长效抑制肿瘤术后复发的多糖复合物，其制备及效果验证过程整体可以包括以下步骤：(a)提取纯化香菇多糖；(b)香菇多糖体外抑制肿瘤细胞增殖效果评估；(c)溶解香菇多糖和壳聚糖；(d)搅拌条件下充分均匀混合步骤c得到的香菇多糖溶液和壳聚糖溶液；(e)冻干步骤d得到的混合物溶液；(f)香菇多糖/壳聚糖复合物微观形态表征—扫描透镜图像；(g)香菇多糖/壳聚糖复合物体内释放曲线；(h)体内抗肿瘤术后复发效果评估试验。

本发明中用于长效抑制肿瘤术后复发的多糖复合物，其制备方法具体可包含以下步骤：

S1：首先，以食药两用真菌为初始原材料，水提醇沉法提取香菇粗多糖，粗多糖经冻融、脱色、透析得到初步精制香菇多糖，其再经超滤、透析和冻干得到白色絮状蓬松的精制香菇多糖。该提取方法详细可参考相关现有技术(J.Agric.Food Chem.2013,61,9849-9858)。使用含有不同浓度香菇多糖的完全培养基培养MDA-MB-231细胞，MTT法检测细胞活力，得到多糖浓度和细胞活力的关系。

S2：搅拌条件下，将香菇多糖溶于氢氧化钠溶液中，壳聚糖溶解于盐酸溶液中，得到透明溶液。搅拌条件下混合两溶液，混合均匀后冷冻并冻干，得到多糖复合物。

在进一步验证作用效果时，可以采用以下步骤；

S3：用扫描电子显微镜表征香菇多糖复合物显微形貌。

S4：适量的多糖复合物植入裸鼠术后局部位置并缝合，然后用近红外荧光小动物活体成像仪监测多糖复合物长时间的释放，并在试验结束时记录肿瘤复发情况。

S5：评估香菇多糖复合物用于长效抑制体内术后肿瘤复发的效果，以及复合物体内的生物兼容性和代谢。

其中：

在S1步骤中，香菇多糖透析时可以采用300KDa透析膜，相应得到精制香菇多糖重均分子量范围为300-600KDa(如420KDa等；香菇多糖的重均分子量之所以优选控制为300KDa-600KDa，主要是因为本发明发明人课题组前期研究表明，在这一重均分子量范围内，香菇多糖具有良好的抗肿瘤活性)；在基于水提醇沉方法制备香菇多糖的实际操作中，对于制得的精制香菇多糖，除了重均分子量要求外，还需要不含蛋白和核酸类杂质，可以利用可见-紫外扫描产物水溶液吸收曲线，260-280nm处应无明显吸收峰。MTT试验中，香菇多糖的实验浓度梯度可设置为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL；最终MTT法检测细胞活力时测量吸光度的吸收波长可以为570nm和630nm。

在S2步骤中，搅拌条件可控制在3000rpm，壳聚糖与香菇多糖的质量比可以为2～15:1；盐酸的浓度例如可以为0.1mol/L，氢氧化钠的浓度例如可以为0.01～0.05mol/L(如30mmol/L)。

在S3步骤中，扫描电子显微镜获得香菇多糖/壳聚糖复合物内切面微观形貌结构图片，其实际放大倍率可为50-500倍。

在S4步骤中，裸鼠左侧第四乳腺位置皮下植入MDA-MB-231细胞，待肿瘤实体体积生长达到100mm³时进行手术摘除肿瘤，肿瘤解除后保留5mm³视作复发病灶，同时给予香菇多糖复合物，吸收局部的组织液和出血，然后缝合，并给予腹腔注射青霉素4万单位/天/只，以防止感染；在体内监测香菇多糖复合物长时间释放试验中，所涉及香菇多糖经荧光标记物Cy7标记，Cy7与香菇多糖反应质量比Cy7:LNT为0.2:100(具体可类比参考Dyes Pigm.,2020,172:107837；ZL201810948911.5)。然后每周两次使用近红外荧光小动物活体成像系统获得裸鼠的活体荧光成像。

在S5步骤中，历经约60天的监测，香菇多糖复合物组和其他对照组分别解剖得到肿瘤实体，统计肿瘤体积数据和复发率数据。

以下为具体实施例：

实施例1

香菇多糖抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖效果试验

香菇多糖为实验室制备，其余试剂购买自上海碧云天生物技术有限公司，细胞购自中国科学院细胞库。

称取5mg香菇多糖溶于适量完全培养基至浓度1600μg/mL，梯度稀释至浓度800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL以备用。MDA-MB-231细胞培养在完全培养基(DMEM空白培养基含10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素)，消化收集后，96孔板中每孔接种约2000个细胞；24h后，更换培养基，使细胞接触不同浓度香菇多糖，对照组换不含香菇多糖的新鲜完全培养基，培养48h后每孔加10μL(5mg/mL in PBS)的MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)，继续培养4h后除去培养基并加100μL DMSO，充分混匀后，酶标仪检测570nm和630nm处吸光度。使用Graphpad Prism 8软件处理所得数据。如图3中的(a)所示，香菇多糖在溶液中对乳腺癌细胞MDA-MB-231呈现出浓度依赖性的抑制作用。

实施例2

香菇多糖抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖效果试验

称取5mg香菇多糖溶于适量完全培养基至浓度1600μg/mL，梯度稀释至浓度800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL以备用。MCF-7细胞培养在完全培养基(DMEM空白培养基含10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素)，消化收集后，96孔板中每孔接种约2000个细胞；24h后，更换培养基，使细胞接触不同浓度香菇多糖，对照组换不含香菇多糖的新鲜完全培养基，培养48h后每孔加10μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h后除去培养基并加100μLDMSO，充分混匀后，酶标仪检测570nm和630nm处吸光度。使用Graphpad Prism 8软件处理所得数据。如图3中的(b)所示，香菇多糖在溶液中对细胞MCF-7呈现出浓度依赖性的抑制作用，相同浓度下整体抑制效果相比对MDA-MB-231较弱。

实施例3

香菇多糖/壳聚糖复合物的制备

盐酸和氢氧化钠为分析纯，购自中国医药集团有限公司。

壳聚糖购自浙江澳兴生物科技有限公司。

称取精制香菇多糖50mg，壳聚糖100mg，搅拌条件下，将香菇多糖溶解于5mL 0.03M氢氧化钠溶液中，将壳聚糖溶解于5mL 0.1M盐酸溶液中，3000rpm充分搅拌3h；混合时将香菇多糖溶液缓慢加入到壳聚糖溶液，加入速度可控制为0.2mL/min，搅拌速度为3000rpm，香菇多糖溶液加入完毕后继续搅拌1h，pH精密试纸测定其pH在6.5-7.5，近中性，之后将混合好的溶液定量加入96孔板或EP管，冷冻之后冻干，密封保存。

实施例4

香菇多糖/壳聚糖复合物的制备

称取精制香菇多糖10mg，壳聚糖150mg，搅拌条件下，将香菇多糖溶解于2mL 0.03M氢氧化钠溶液中，将壳聚糖溶解于8mL 0.1M盐酸溶液中，3000rpm充分搅拌3h；混合时将香菇多糖溶液缓慢加入到壳聚糖溶液，加入速度可控制为0.2mL/min，搅拌速度为3000rpm，香菇多糖溶液加入完毕后继续搅拌1h，pH精密试纸测定其pH在6.5-7.5，之后将混合好的溶液定量加入96孔板或EP管，冷冻之后冻干，密封保存。

实施例5

称取精制香菇多糖25mg，壳聚糖100mg，搅拌条件下，将香菇多糖溶解于4mL 0.03M氢氧化钠溶液中，将壳聚糖溶解于6mL 0.1M盐酸溶液中，400rpm充分搅拌3h；混合时将香菇多糖溶液缓慢加入到壳聚糖溶液，加入速度可控制为0.2mL/min，搅拌速度为400rpm，香菇多糖溶液加入完毕后继续搅拌1h，pH精密试纸测定其pH在6.5-7.5，之后将混合好的溶液定量加入96孔板或EP管，冷冻之后冻干，密封保存。

实施例6

称取精制香菇多糖25mg，壳聚糖100mg，搅拌条件下，将香菇多糖溶解于4mL 0.03M氢氧化钠溶液中，将壳聚糖溶解于6mL 0.1M盐酸溶液中，4000rpm充分搅拌3h；混合时将香菇多糖溶液缓慢加入到壳聚糖溶液，加入速度可控制为0.2mL/min，搅拌速度为4000rpm，香菇多糖溶液加入完毕后继续搅拌1h，pH精密试纸测定其pH在6.5-7.5，之后将混合好的溶液定量加入96孔板或EP管，冷冻之后冻干，密封保存。得到香菇多糖/壳聚糖复合物实物如图1所示。

实施例7

香菇多糖/壳聚糖复合物微观形貌表征

使用环境扫描电子显微镜记录香菇多糖复合物内切面的微观形貌。将多糖复合物冻干并切成小块，固定在绝缘载物台上干燥、镀金，在真空状态下放大50倍和200倍记录香菇多糖复合物内部切面的微观形貌。结果如图2所示，香菇多糖/壳聚糖复合物呈多空疏松海绵状。

实施例8

香菇多糖/壳聚糖复合物体外抗肿瘤细胞MDA-MB-231增殖效果试验

称取5mg香菇多糖/壳聚糖复合物，紫外线照射1h杀菌以备用。MDA-MB-231细胞培养在完全培养基中(DMEM空白培养基含10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素)，消化收集后，96孔板中每孔接种约2000个细胞；24h后，更换培养基，放入准备好的香菇多糖/壳聚糖复合物，对照组放入葡聚糖/壳聚糖复合物，培养48h后每孔加10μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h后除去培养基并加100μL DMSO，充分混匀后酶标仪检测570nm和630nm处吸光度。使用Graphpad Prism 8软件处理所得数据。如图4中的(a)所示，与对照组相比，香菇多糖/壳聚糖复合物组显示出明显的肿瘤增殖抑制作用。

实施例9

香菇多糖/壳聚糖复合物体外对人正常肝细胞L-o2的影响试验

称取5mg香菇多糖/壳聚糖复合物，紫外线照射1h杀菌以备用。L-o2细胞培养在完全培养基中(DMEM空白培养基含10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素)，消化收集后，96孔板中每孔接种约2000个细胞；24h后，更换培养基，放入准备好的香菇多糖/壳聚糖复合物，对照组放入葡聚糖/壳聚糖复合物，培养48h后每孔加10μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h后除去培养基并加100μL DMSO，充分混匀后酶标仪检测570nm和630nm处吸光度。使用GraphpadPrism 8软件处理所得数据。如图4中的(b)所示，与对照组相比，香菇多糖/壳聚糖复合物组对正常细胞未显示出明显的细胞毒作用。

实施例10

香菇多糖/壳聚糖复合物体内释放表征

Balb/c nude小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

CY-7标记的香菇多糖(LNT-Cy7)为实验室自制。Cy-7荧光标记香菇多糖/壳聚糖复合物制备同前所述。

6-8周Balb/c裸鼠适应饲养一周，大量培养MDA-MB-231细胞后胰酶消化收集离心，去上清，用空白的DMEM培养基制成约1亿cells/mL的细胞浆，每只裸鼠左侧第四乳腺位置皮下接种0.1mL细胞浆(1000W细胞)，饲养至肿瘤实体体积达到100mm³，水合氯醛麻醉状态下解剖除去肿瘤，局部给予5mg多糖复合物，缝合，并在随后的三天腹腔注射青霉素4万单位/只/天以防止感染。实验中，对照组Saline为腹腔注射生理盐水；CS/DEX为局部葡聚糖/壳聚糖复合物；Paclitaxel为腹腔注射紫杉醇溶液。从第二天开始，每周两次，使用近红外荧光小动物活体成像系统拍摄荧光变化图像，记录多糖复合物在体内逐渐代谢降解的过程。如图5所示，容易看出，香菇多糖在裸鼠局部组织的降解释放连续且可保持长达59天，相比化疗药物能大大延长单次给药的有效作用时间。

实施例11

香菇多糖/壳聚糖复合物长时间抑制肿瘤术后复发的试验

培养MDA-MB-231细胞，胰酶消化收集离心，空白DMEM培养基重悬得到浓度约为1亿cells/mL的细胞浆，每只裸鼠左侧第四乳腺位置皮下植入0.1mL细胞浆(100W cells)，正常状态下饲养，待肿瘤实体生长达到100mm³时，麻醉状态下解剖除去肿瘤实体，保留5mm³作为残余肿瘤复发基础。裸鼠分为四组，每组6只，其中两组分别局部原位给予香菇多糖/壳聚糖复合物、葡聚糖/壳聚糖复合物，缝合裸鼠，另外两组分别给予腹腔注射紫杉醇(溶于蓖麻油/乙醇混合溶剂，day1和day8给药，20mg/kg/每只/次)和生理盐水。各组在相同条件下饲养，自解除原位瘤后共计饲养60天，60天后或者期间有肿瘤复发并且体积达到300mm³的裸鼠则处死解剖，保留肿瘤组织和心、肝、脾、肺、肾等器官做H&E染色切片，表征各组给予药物的系统性毒性。统计各组肿瘤复发情况以及肿瘤体积数据。由图6可知，香菇多糖/壳聚糖复合物在裸鼠体内对各器官未显示出毒性。复发后肿瘤实体如图7中的(a)所示，复发后肿瘤实体的体积统计平均值如图7中的(b)所示(另外，图7中的(b)所示出的数据点表示实际测量复发后肿瘤实体体积)，可见，香菇多糖/壳聚糖复合物在长达59天的抑制肿瘤复发作用后，与其余对照组相比，肿瘤复发率得到明显降低，且复发后肿瘤实体体积显著变小。结果显示出香菇多糖/壳聚糖复合物在局部应用于抑制肿瘤术后复发的潜力，为临床治疗术后肿瘤复发提供了新的手段。

另外，关于香菇多糖的负载量，除上述实施例中使用的浓度800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL外，经过体外实验表征表明，400μg/mL以上均视为有效浓度(例如，在实际体内使用时，因局部组织液量极少，故局部负载1mg香菇多糖完全满足有效浓度)。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种天然多糖复合物在制备抑制乳腺癌切除术后复发的制剂中的应用，其特征在于，该天然多糖复合物是由包括壳聚糖(CS)和香菇多糖(LNT)在内的原料复合而成。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述壳聚糖和所述香菇多糖的质量之比为(2～15):1。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述壳聚糖和所述香菇多糖的质量之比为4:1。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述壳聚糖的纯度在98％以上，脱乙酰率在80％-95％；所述香菇多糖的纯度不低于99％，重均分子量300-600KDa。

5.如权利要求1所述应用，其特征在于，该复合物具有多孔结构；所述复合是通过将壳聚糖溶液与香菇多糖溶液混合，利用中和反应，同时基于分子间氢键和范德华力作用进行的；其中，所述壳聚糖溶液是以酸性溶液为溶剂，所述香菇多糖溶液是以碱性溶液为溶剂。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述酸性溶液为盐酸，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液。

7.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述香菇多糖纯度在99％以上，是香菇经水提醇沉得到粗多糖，再经冻融、脱色和超滤得到的精制组分。

8.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述天然多糖复合物是按照包括以下步骤的方法制备得到的：

(1)基于水提醇沉方法制备香菇多糖，得到香菇多糖原料；

(2)溶解壳聚糖，形成透明的壳聚糖溶液；

(3)溶解所述香菇多糖原料，形成透明的香菇多糖溶液；

(4)在搅拌条件下将所述壳聚糖溶液与所述香菇多糖溶液相混合，得到均匀混合溶液；

(5)将所述步骤(4)得到的所述混合溶液置于形状预先设计的模具中冷冻，接着冻干即可得到多孔的天然多糖复合物。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，对于所述步骤(1)得到的所述香菇多糖原料，其重均分子量为300-600KDa，且不含蛋白和核酸类杂质。

10.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述步骤(2)中，所述溶解是在搅拌条件下进行的，搅拌转速为400rpm-4000rpm；

所述步骤(3)中，所述溶解同样是在搅拌条件下进行的，搅拌转速同样为400rpm-4000rpm。

11.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述步骤(4)得到的所述混合溶液其pH值为6.5～7.5。

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