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CN1147276A - 利用聚合酶链反应检测真菌病原菌 - Google Patents

利用聚合酶链反应检测真菌病原菌 Download PDF

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Abstract

公开了得自壳针孢属、假小尾属、镰孢属和球腔菌属不同种和菌株的核糖体RNA基因的内部转录间隔区的DNA序列。利用聚合酶链反应技术，并利用得自这些序列的特定引物，即可鉴定真菌分离物。

Description

利用聚合酶链反应检测真菌病原菌
发明领域
本发明涉及在聚合酶链反应检测法中使用种属特异性引物而检测真菌病原菌。使用这些引物即能检测真菌病原菌的特异性分离物并能监视植物种群中疾病的发展。
发明背景
一复一年，植物病害均造成显著的农作物损失，既给农民造成经济损失，同时还在世界上的许多地方给当地居民造成营养供应短缺。杀真菌剂的广泛使用大大地阻止了植物病原菌的侵害。但是，尽管全世界花在杀真菌剂上的开支达到十亿美元，但农作物的损失仍达到约10％(James，1981；Seed Sci.&Technol.9：679-685)。
病害破坏的严重程度取决于病原菌的侵害性以宿主的反应性。大部分植物育种方案的一个目的就是提高宿主植物对病害的抵抗性。不同种属的病原菌通常以不同的方式作用于同一作物的不同品种，许多种类的宿主抗性只具有针对特定病原菌种属的保护作用。而且，某些种属的病原菌显示病症的早期症状，但对农作物的损害则很小。Jones和Clifford(1983；Cereal Diseases，John Wilney)曾报道，宿主栽培品种产生抗性的结果之一是在病原菌种群中出现致病力强的病原菌，因此必须对病原菌种群进行监测。另外，还有几篇文献报道了对某些杀真菌剂具有抗性的真菌菌株的进化情况。早在1981年，Fletcher和Wolfe(1981；Proc.1981 Brit.Crop Prot.Conf.)即曾提到24％来自春大麦的白粉菌和53％来自冬大麦的白粉菌显示出针对杀真菌剂triadimenol的显著变异，而且这种群体的分布在不同的品种之间各不相同，易感性最强的品种的发生率最高。也已报道过类似的真菌对杀真菌剂敏感性的变异，如小麦霉菌(对triadimenol)、葡萄孢菌(对苯菌灵)、核腔菌(对有机汞)、假小尾孢菌(对MBC型杀真菌剂)和菲济球腔菌(对三唑化合物)(Jones and Clifford；CerealDisease，John Wilney，1983)。
谷物在世界各地均有种植，是世界粮食的主要来源。尽管产量的减少可由许多病原菌引起，但在欧洲和北美的谷物种植地区坏死病原菌壳针孢菌和假小尾孢菌则发挥了尤其重要的作用。尤其是，由这些真菌的不同分离物和不同的菌种引起的差分症状使得以精确预测潜在的病害损失。因此，对于田间病原学家来说非常需要一种用于快速的准确鉴别具体的病原菌的改进诊断技术。
有四种壳针孢菌寄生于小谷类植物。小麦壳针孢是叶枯病的致病剂，它不仅对小麦而且对黑小麦和黑麦均有毒性，通常引起叶坏死。颖枯壳针孢是颖枯病的致病剂，它寄生于小麦、黑小麦、黑麦和大麦，虽然它主要限于颖片，但也发现它存在于叶片和叶鞘。莜麦壳针孢寄生于燕麦、小麦和黑小麦，大麦壳针孢则仅限于大麦。壳针孢病大量地存在于所有小麦生长地区。不同的壳针孢病常常同时发生在同一麦田中和同一植株上，此时同时将其病症总作为“壳针孢综合症”。它最常见于小麦壳针孢和颖枯壳针孢。按照Wiese(1977；Compendium of Wheat Diseases，Amer.Phytopath.Soc.pages 42-45)，目前壳针孢综合症每年要毁掉全世界小麦的2％，产量的减少主要是由于谷粒不饱满。在严重壳针孢感染的情况下，使用杀真菌剂进行治疗能够减少损失20％，但在感染发作时常常难以区分不同的壳针孢菌，这给决定是否使用杀真菌剂带来困难，因为不同的作物对各种壳针孢菌显示出不同程度的抗性。
谷物眼斑病是由真菌蔓毛假小尾孢引起，它限于植物的基秆部。小麦、黑麦、燕麦和其它禾本科植物易患眼斑病，该病发生于寒冷、潮湿的气侯地区，在欧洲、北美和南美、非洲和澳洲均很流行。小麦是最易感的谷物品种，但已鉴定其分离物对其它谷物也有毒害性。例如，也从黑麦中分离出该真菌的R-菌株，它在小麦上的生长要比从小麦上分离出的W-菌株慢得多。尽管眼斑病可杀死分蘖，它更主要的是引起倒伏和/或导致谷粒大小的减少和数量的减少。由眼斑病引起的减产甚至要比由小麦壳针孢和颖枯壳针孢引起的减产大几个数量级。对眼斑病的控制措施通常包括利用生长调节素进行治疗以增强节间和杀真菌剂治疗。但是，该作物对不同真菌菌株所具有的不同易感性使得难以达到预期的杀真菌治疗效果。
香蕉Sigatoka叶斑病以两种形式发生，分别由不同的真菌引起。较具经济影响的Black Sigatoka由菲济球腔菌引起，而经济上不太重要的Yellow Sigatoka由乐音球腔菌引起(Tohanson and Jeger，1993；Mycol.Res.97：670-674)。Black Sigaloka是香蕉业中的一个主要难题，造成30％或更大的损失。由于菲济球腔菌对杀真菌剂产生抗性，因此最好应限制使用杀真菌剂，以防止其进一步产生抗性。所以诊断工具的获得将提供一种鉴别适合使用杀真菌剂的条件的重要手段，从而避免产生进一步抗性的不必要危险。
因此，在实际中真正需要开发一种能够在病原真菌侵染的早期对其具体的种属进行鉴定的技术。通过在病症在作物中变得明显之前对病原菌的种属进行鉴定，农业学者就可以对该病原菌在作物中进一步发展所产生的可能后果作出评估，并在必要时选择合适的杀真菌剂。
发明概述
本发明涉及鉴别植物病原真菌的不同病变型的方法。本发明提供了在不同的真菌病变型之间显示出变异性的DNA序列。该DNA序列可用于本发明的方法中，因为它们可用于产生引物，该引物可用于根据聚合酶链反应(PCR)的诊断检测。这些引物在DNA模板由特定的真菌病变型提供的PCR反应中产生特定片段，因而可用于在病症发作之前鉴定出宿主植物材料中是否存在特定的病变型。
本发明为特定作物中的潜在损害与病原菌菌株相互关系的评估以及审慎地利用各种可利用的杀真菌剂提供了可能性。而且，它还可用于提供有关某一病原菌在大范围地区发展的详细情况。本发明提供了一种检测方法，它尤其适用于具有较长潜伏期的病害的检测，这类病害如由颖枯壳针孢或小麦壳针孢在小麦上引起的病害以及由菲济球腔菌在香蕉上引起的病害。
还提供了应用本发明的试剂盒。该盒尤其适用于鉴别壳针孢属、假小尾孢属、镰孢属和球腔菌属的病原菌
附图说明
图1  来自小麦壳针孢、颖枯壳针孢、蔓毛假小尾孢W菌株(两个品种)、蔓毛假小尾孢R菌株、菲济球腔菌和乐音球腔菌的内部转录间隔序列的排列图。
图2  来自颖枯壳针孢和莜麦壳针孢霉，小麦型种的内部转录间隔序列的排列图。
图3  来自禾本科镰孢、大刀镰孢、串珠镰孢和雪小球丝孢菌内部转录间隔序列的排列图。
发明详述
本发明提供了可用于鉴别植物病原真菌的不同病变型的独特DNA序列，具体地，该DNA序列可在依据PCR鉴定真菌病原型的分析中作为引物。本发明的DNA序列包括特定真菌病原菌核糖体RNA基因区的内部转录间隔区(ITS)以及得自该区域的能够鉴定该特定病原菌的引物。得自不同种或属的病原菌的不同病变型的这些ITS DNA序列各不相同，因而可用于鉴定病原菌的种属。
生物医学研究人员已使用过PCR技术，并在被感染的动物组织中检测病原菌方面取得一定成功。但直到最近该技术才被应用于检测植物病原菌，利用病原菌线粒体基因组专一性序列的PCR已检测出被侵染小麦中存在Gaumannomyces graminis(Schlesser et al.，1991；Applied and Environ.Microfiol.57：553-556)，而随机扩增多态DNA(即RAPD)标记物则可用于鉴别各种不同的Gremmeniellaabictina(针叶树腐烂病的致病剂)
由于核糖体基因具有高拷贝数，因而适用于作为分子探针靶物。虽然成熟的rRNA序列之间高度保守，但未转录和转录的间隔序列的保守性通常则较差，因而适用于作为检测最近的进化差异的靶序列。真菌rRNA基因组织成不同单位，每一单位分别编码三种成熟的亚单位18S、5.8S和28S。这些亚单位被两个约300bp的内部转录间隔区ITS1和ITS2隔开(White et al.，1990；ln：PCR Protocols；Eds.：Innes et al.；pages 315-322)。另外，该转录单位被非转录间隔序列(NTS)隔开。ITS和NTS序列尤其适用于检测不同真菌病原菌的特定病变型。
本发明的DNA序列得自不同植物病原菌的核糖体RNA基因区的内部转录间隔区(ITS)。得自一病原菌种或属的不同病变型的ITS DNA序列在该种属的不同成员间各不相同。一旦测定出一病原菌的ITS序列，即可将这些序列与其它的ITS序列排列对比。以此方式，可由该ITS序列获得引物。即，可根据ITS区中含有真菌病变型间最大序列差异的区域设计引物。利用这些序列和根据这些序列所设计的引物就可以鉴定具体的病原菌。
感兴趣的具体DNA序列包括得自下列种属的ITS DNA序列：壳针孢属，尤其是颖枯壳针孢和小麦壳针孢；球腔菌属，尤其是菲济球腔菌和乐音球腔菌；假小尾孢属，尤其是蔓毛假小尾孢，特别是其W-菌株和R-菌株；镰孢属，尤其是禾木科镰孢、大刀镰孢、串球镰孢和雪小球丝孢菌。这些ITS DNA序列及所感兴趣的引物在SEQID NO：1-47和SEQ ID NO：50-86中已给出。这些序列可用于通过PCR鉴定感兴趣的病变型。
在PCR分析中使用本发明引物序列的方法是现有技术中已知的。如见美国专利4,683,195和4,683,202以及Schlesser等人(1991)Applied and Enveron、Microfiol.57：553-556。也可见Nazar等人(1991；Physiol and Molec.plant Pathol.39：1-11)，它利用PCR扩增来研究黄萎轮枝孢和大丽花轮枝孢ITS区之间的差别，从而鉴别这两个种。Johanson和Jeger(1993；Mycol.Res.97：670-674)则利用类似技术来鉴别香蕉病原菌菲济球腔菌和乐音球腔菌。
可利用已知方法从真菌病原菌克隆本发明的ITS DNA序列。一般来说，从真菌分离物中分离DNA的方法是已知的。见Raeder&Broda(1985)Letters in APPlied Microbiology 2：17-20；Lee et al.(1990)Fungal Genetics Newsletter 35：23-24；和Lee and Taylor(1990)In：PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Innes et al.(Eds)；pages 282-287。
另外，可通过PCR扩增测定感兴趣的ITS区。用于扩增整个ITS区的引物可按White等人的方法设计(1990；In：PCR Protocols；Eds.：Innes et al.pages 315-322)，并将扩增后的ITS序列克隆到PCRII克隆载体。亚克隆的序列包括左手ITS(ITS1)、右手ITS(ITS2)以及位于中间的5.8SrRNA基因。这一方法已应用于颖枯壳针孢和小麦壳针孢；各种假小尾孢分离物和菲济球腔菌，乐音球腔菌，莜麦壳针孢小麦型种，禾本科镰孢，大刀镰孢，串镰孢和雪小球丝孢菌。
测定出ITS序列，并将每一病原菌组中的该序列进行比较以确定其不同处，而这即可用于在PCR中进行试验以鉴别出不同的种和/或属。已被测定的ITS区的序列示于SEQ ID 1-6，47和82-86，以及图1、2和3。通过些差异的鉴定，合成了大量的引物，并在PCR扩增中对其进行了测试。用于PCR扩增的模板首先是纯化的病原菌DNA，接着是自被侵染的宿主植物组织分离的DNA。这样就可能鉴定出用于诊断的引物对，即它鉴别出一具体病原菌种或菌株，而排除同一病原菌的另一种或菌株。优选的引物组合可用于在被感染的宿主组织(即已预先被一特定的病原菌种或菌株感染的宿主组织)中鉴别不同的种或菌株。
本发明提供了满足上述标准的各种引物组织，用于鉴别不同的壳针孢，球腔菌和镰孢种以及不同的假小尾孢菌株。本发明的引物是根据各种真菌ITS区的序列差异而设计的。序列间存在最少一个碱基的差异即能设计出鉴别引物。可将根据特定真菌DNA的ITS区设计的引物与根据核糖体DNA编码区中的保守序列区设计的引物组合，以扩增种属特异性PCR片段。一般来说，引物应具有60-70℃的理论解链温度以达到良好的敏感性，并应避免出现显著的次级结构和引物组织之间的3’重叠。引物通常至少为约5至10个核苷酸碱基。
利用克隆的ITS序列筛选用于诊断的引物主要是由于其快速的进化趋异性。例如，已发现病原菌蔓毛假小尾孢的W型和R型具有趋异ITS序列，根据这一序列即可制成诊断引物。但是，这种ITS序列内的快速趋异是从如下观察结果中得出的：W型的两个不同序列变异体是相同的。W型内的序列同一性为99.4％，而W型和R型的序列同一性为98.6％，这一结果提示两个W变异体之间要比W和R型之间具有更近的进化关系。这种更近的进化关系也可从具有趋异ITS序列的两种分离物的相似宿主致病性看出。
除了从得自ITS的序列设计出用于真菌分离物的PCR诊断的引物外，本发明也包括从RAPD引物库中鉴别出当用于PCR时可区分颖枯壳针孢和小麦壳针孢的引物。待筛选的引物可从市场上买到，并且可得自Operon Technologies In Corporated(Alameda，CA)。对壳针孢基因组DNA的筛选鉴定出两个仅可用于检测小麦壳针孢的引物，及三个仅可用于检测颖枯壳针孢的引物。
利用本发明本身即可很容易地制备含有实施该方法所必需成分的“试剂盒”。该盒可包含一载体，它被隔开，以密封形式在其中接受一个或多个容器装置，如试管或小瓶。一个该容器装置可含有未标记的或可检测标记的DNA引物。标记DNA引物可以冻干形式存在，或根据需要以适宜的缓冲液形式存在。一个或多个容器装置可含有一种或多种在PCR反应中要用的酶或试剂。这些酶可以冻干形式或适宜缓冲液形式单独存在或混合存在。
最后，该药盒可含有为实施本发明技术所必需的其它成分，如缓冲液、萃取试剂、酶、移液管、平板、核酸、三磷酸核苷、滤纸、胶凝材料、转移物质、放射自显影材料等。
以下实施例显示而不是限定典型的实施方案，它们可用于分离ITS序列，选择合适的引物序列，测试引物的选择和诊断效力，以及该引物在病害和真菌分离物检测中的应用。这些实施例是用于说明而不是限定本发明。实施例实施例1：真菌分离物和基因组DNA的提取
颖枯壳针孢、小麦壳针孢、大麦壳针孢、大豆壳针孢、蔓毛假小尾孢、夏令假小尾孢、柠檬球腔菌、禾生球腔菌、菲济球腔菌和乐音球腔菌的活真菌分离物得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。大刀镰孢和禾本科镰孢分离物从宾夕法尼亚州立大学的Paul Nelson博士处获得。雪小球丝孢菌分离物从ciba-Basel获得，串球镰孢的分离物从Dr.Loral Castor处获得。将真菌在150ml马铃薯右旋糖培养液中生长，该培养液接种了来自PDA(马铃薯右旋糖琼脂)培养物的菌丝体片段。将培养物在一轨道振荡器上于28℃培养7-11天。通过离心沉淀菌丝体，然后将其在液氮中粉碎，并利用Lee和Taylor的方法(1990；ln：PCR Protocols：A Guide to Methods and Applica-tions；Eds.：Innes et al.：pages 282-287)提取总的基因组DNA。
得克萨斯A&M大学的Bruce McDonald博士提供了十种颖枯壳针孢分离物和九种小麦壳针孢分离物的基因组DNA，伯明翰大学的chris由Caten博士提供了从六种颖枯壳针孢分离物纯化的真菌DNA。从英国诺威其John Innes中心的Paul Nicholson博士处获得了12种蔓毛假小尾孢分离物的纯化基因组DNA，其中六种分离物为W型；另六种分离物为R型。这些分离物是根据病原性和RFLP研究而进行分型的。自然资源研究所的Andrea Johanson提供了六种乐音球腔菌分离物、六种菲济球腔菌分离物和一种芭蕉球腔菌分离物的基因组DNA。USDA(Beltsville，Maryland)的Peter Ueng博士提供了莜麦壳针孢，小麦型种ATCC#26380的纯化基因组DNA。
表1：试验分离物的来源分离物    种            起源           来源ATCC#24425  颖枯壳针孢    蒙大拿      ATCC1XA1.1       颖枯壳针孢    得克萨斯    B.McDonald2Xa5A.2      颖枯壳针孢    得克萨斯    B.McDonaldYA3.1       颖枯壳针孢    得克萨斯    B.McDonaldXD2.1       颖枯壳针孢    得克萨斯    B.McDonaldYB2.2       颖枯壳针孢    得克萨斯    B.McDonald93HBh6a     颖枯壳针孢    俄勒冈      B.McDonald93A3a       颖枯壳针孢    俄勒冈      R McDonald93AYa       颖枯壳针孢                  俄勒冈         B.McDonald93HBh8a     颖枯壳针孢                  俄勒冈         B.McDonald93C5a       颖枯壳针孢                  俄勒冈         B.McDonaldATCC#26517  小麦壳针孢                  明尼苏达       ATCCBS3         颖枯壳针孢                  爱尔兰         C.Caten3BS6         颖枯壳针孢                  爱尔兰         C.CatenBS175       颖枯壳针孢                  英格兰         C.CatenBS425       颖枯壳针孢                  英格兰         C.Catenalpha5      颖枯壳针孢                  法国           C.Catenm300        颖枯壳针孢                  英格兰         C.CatenTKV2a       小麦壳针孢                  土耳其         B.McDonaldSYK2        小麦壳针孢                  叙利亚         B.McDonaldISZC36.2    小麦壳针孢                  以色列         B.McDonaldCNRC4a.1    小麦壳针孢                  加拿大         B.mcDonaldALA1a       小麦壳针孢                  阿尔及利亚     B.McDonaldETK1        小麦壳针孢                  埃塞俄比亚     B.McDonaldGEB2a.1     小麦壳针孢                  德国           B.McDonaldUK92D2      小麦壳针孢                  英国           B.McDonaldDNB1a       小麦壳针孢                  丹麦           B.McDonaldATCC#38699  大豆壳针孢                  伊利诺斯       ATCCATCC#22585  大麦壳针孢                  明尼苏达       ATCCATCC#42040  蔓毛假小尾孢-小麦                          ATCCATCC#62012  夏令假小尾孢                 德国          ATCCATCC#60972  蔓毛假小尾孢，蔓毛变种-大麦   德国          ATCCW1          蔓毛假小尾孢                 英国          P.Nicholson4W2          蔓毛假小尾孢                 英国          P.NicholsonW3          蔓毛假小尾孢                 英国          P.NicholsonW4          蔓毛假小尾孢                 英国          P.NicholsonW5          蔓毛假小尾孢                 新西兰        P.NicholsonW6          蔓毛假小尾孢                 意大利        P.NicholsonR1          蔓毛假小尾孢                 比利时        P.NicholsonR2          蔓毛假小尾孢                 新西兰        P.NicholsonR3          蔓毛假小尾孢                 德国          P.NicholsonR4          蔓毛假小尾孢                 瑞典          P.NicholsonR5          蔓毛假小尾孢                 英国          P.NicholsonR6          蔓毛假小尾孢                 英国          P.NicholsonATCC#22116  菲济球腔菌                   菲律宾        ATCCATCC#22115  乐音球腔菌                   菲律宾        ATCCATCC#24046    柠檬球腔菌                佛多里达        ATCCATCC#62714    禾生球腔菌                蒙大拿          ATCCPA92          菲济球腔菌                巴拿马          A.Johanson5PNG291        菲济球腔菌                巴布亚新几内亚  A.JohansonGH6-3         菲济球腔菌                加纳            A.JohansonTG120         菲济球腔菌                汤加            A.JohansonHSB4          菲济球腔菌                洪都拉斯        A.JohansonRT689         菲济球腔菌                拉罗通加        A.JohansonCR548         乐音球腔菌                哥斯达黎加      A.JohansonCM61          乐音球腔菌                喀麦隆          A.JohansonCU823         乐音球腔菌                古巴            A.JohansonMQ103         乐音球腔菌                马提尼克        A.JohansonCI31          乐音球腔菌                象牙海岸        A.JohansonCB90          乐音球腔菌                哥伦比亚        A.JohansonBD1-4         芭蕉球腔菌                巴巴多斯        A.JohansonATCC#44234    谷物角担菌                荷兰            ATCCATCC#11404    层叠德氏菌                明尼苏达        ATCCR-5126        大刀镰孢                  明尼苏达        P.Nelson0R-5106        大刀镰孢                  密执安          P.NelsonR-5146        大刀镰孢                  芬兰            P.NelsonR-8417        禾本科镰孢                意大利          P.NelsonR-8422        禾本科镰孢                加拿大          P.NelsonR-8546        禾本科镰孢                保加利亚        P.Nelson4551          串珠镰孢                  印第安那        L.Castor92            雪小球丝孢菌              ------          Ciba Basel0ATCC#26380    莜麦壳针孢霉，小麦型种     明尼苏达        P.Uengy1 American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA2 Dr.Bruce McDonald，Texas A&M University，USA3 Dr.Chris Caten，Birmingham University，UK4 Dr.Paul Nicholson，John Innes Centre，UK5 Dr.Andrea Johanson，Natural Resources Institute，UK6 Dr.Paul Nelson，Penn State University7 Dr.Loral Castor，Ciba Seeds Research，Bloomington，Illinois8 Ciba-Geigy Limited，Basel，Switzerland9 Dr.Peter Ueng，USDA，Beltsville，Maryland实施例2  分离内部转录间隔子(ITS)区
利用50pmol引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；SEQ ID NO：38)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；SEQ ID NO：41)，由自颖枯壳针孢(ATCC#24425)、小麦壳针孢(ATCC#26517)、蔓毛假小尾孢分离物R1、R2、W2和W5、菲济球腔菌(ATCC#22115)和乐音球腔菌(ATCC#22115)分离的25ng基因组DNA通过PCR扩增约550bp的内部转录间隔子区片段。PCR按实施例4进行，所不同的是反应在100μl中进行，且退火于50℃进行。按照Maniatis等人的方法(1982；Molecular Cloning；Eds.：Mani-atis et al.；pages 461-462)通过异丙醇沉淀纯化ITS片段。将该DNA再悬浮于50μldH2O中，利用Invitrogen Corporations(SanDiego，CA)公司的TA克隆盒(K2000-01)通过pCRII克隆载体进行克隆。利用Applied Biosystems(Foster City，CA)自动序列仪373A型，通过双脱氧法测定ITS区的DNA序列，其中使用了引物ITS1(序列如上)、ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′；SEQ IDNO：39)、ITS4(序列如上)和M13 uriversal-20(5′-GTAAAAC-GACGGCCAGT-3′；SEQ ID NO：48)和Reverse(5′-AACAGC-TATGACCATG-3′；SEQ ID NO：49)引物。用于克隆ITS区的ITS引物ITS1(SEQ ID NO：38)、ITS2(SEQ ID NO：39)、ITS3(SEQ IDNO：40)和ITS4(SEQ ID NO：41)详见White等人(1990；In：PCRProtocols；Eds.；Innes et al.pages 315-322)。
另外，自25ng莜麦壳针孢霉，小麦型种、雪小球丝孢菌、串珠镰孢(#4551)、禾本科镰孢分离物R-8417、R-8546和R-8422及大刀镰孢分离物R-5126、R-5106和R-5146基因组DNA经PCR扩增了内部转录间隔子区。利用Promega的Wizard DNA清洁盒(Madison，WI)纯化PCR产物。利用ITS1(SEQ ID NO：38)、ITS2(SEQ ID NO：39)、ITS3(SEQ ID NO：40)和ITS4(SEQ ID NO：41)引物，按上述方法测定ITS区的DNA序列。将测序反应物与大刀镰孢和禾本科镰孢的三种分离物结合以产生与大刀镰孢和禾本科镰孢一致的序列。实施例3  从小麦和香蕉叶中提取DNA
使用MicroProbe公司(Garden Grove，CA)Iso Quick核酸提取盒(MXT-020-100)，通过经改进的快速DNA提取法从小麦叶中提取DNA。通常的产率为从0.2g叶组织中获得5-10μg总DNA。在每次PCR检测中使用约100ng总DNA。经改进的快速DNA提取法：
在首次使用盒之前，将试剂2A(20x颜料浓缩物)的整个内容物加到试剂2(提取基质)中。
(1)将约0.2g叶样品加到含有50μl样品缓冲液A和50μl#1裂解溶液的1.5ml eppendorf试管中。用Kontes研杵将叶样品捣碎。
(2)将试剂2(提取基质)剧烈振荡。将350μl试剂2加到样品裂解物中。
(3)向样品中加入200μl试剂3(提取缓冲液)旋转样品20秒。
(4)以12,000xg的速度微量离心5分钟。
(5)将水相(上层)转移至一新的微量离心管中，其体积通常为约200μl。
(6)向水相样品中加入0.1倍于其体积的试剂4(乙酸钠)。
(7)向水相样品中加入等体积的异丙醇，然后旋转。
(8)以12,000xg微量离心10分钟。
(9)在不破坏核酸沉淀的情况下弃去上清液。向沉淀中加入0.5ml20℃70％乙醇，旋转试管将其混合。
(10)以12,000xg微量离心5分钟。
(11)弃去上清液，并让沉淀干燥。
(12)将核酸沉淀渗于50μl试剂5(无RNA酶的水)。实施例4：聚合酶链反应扩增
利用得自Perkin-Elmer/Cetus公司(Norwolk，CT；部件号N808-0009)的Genl Amp试剂盒来完成聚合酶链反应，其中使用了50mM Kcl，2.5mM MgCl2，10mM Tris-Hcl(pH8.3)，各为100μM的TTP、dATP、dCTP和dGTP，50mM引物，2.5单位Taq聚合酶和25ng基因组DNA，最终体积为50μl。于Perkin-E1mer/Cetus 9600型热循环器中将该反应循环30次，每一循环包括94℃15秒，50℃、60℃或70℃15秒，及72℃45秒。通过在1.1-1.2％琼脂糖凝胶上装填20μl每种PCR样品并电泳来分析产物。实施例5：寡核苷酸的合成和纯化
利用B-Cyanothyl-phosphoramidite化学法，在AppliedBcosystems 380A DNA合成仪上合成寡核苷酸(引物)。实施例6：种属特异性引物的筛选
图1中列出了颖枯壳针孢、小麦壳针孢、蔓毛假小尾孢R和W菌株、菲济球腔菌和乐音球腔菌的ITS序列。图2列出了颖枯壳针孢和莜麦壳针孢，小麦型种的ITS序列。图3排列出了禾本科镰孢、大刀镰孢、串珠镰孢和雪小球丝孢菌的ITS序列。根据对所排列出的序列的分析，按照实施例5合成多套引物。对于图1-2，这些引物是根据含有真菌种的最大序列差异的区域而设计的。在图3中，引物是根据镰孢中的最高同源性区域而设计的。另外，也合成了已公开的核糖体基因特异性引物ITSl(SEQ ID NO：38)，ITS2(SEQID NO：39)，ITS3(SEQ ID NO：40)和ITS4(SEQ ID NO：41)(Whiteet al.，1990；In：PCR Protocols：Eds.：Innes et al.page 315-322)，以便与ITS区特异性引物结合用于测试。表2：用于真菌检测的引物设计引物模板    引物名称                引物序列颖枯壳针孢  JB433  5′ACACTCAGTAGTTTACTACT 3′(SEQ ID NO：7)颖枯壳针孢  JB434  5′TGTGCTGCGCTTCAATA 3′(SEQ ID NO：8)颖枯壳针孢  JB525  5′GCGACTTGTGCTGCGCTICAATA 3′(SEQ ID NO：9)颖枯壳针孢    JB527  5’CATTACACTCAGTAGTTTACTACT 3’(SEQ ID NO：10)小麦壳针孢    JB445  5’CTGCGTCGGAGTTTACG 3’(SEQ ID NO：11)小麦壳针孢    JB446  5’CGAGGCTGGAGTGGTGT 3’(SEQ ID NO：12)小麦壳针孢    JB526  5’CCCAGCGAGGCTGGAGTGGTGT 3’(SEQ ID NO：13)蔓毛假小尾孢  JB536  5’CTGGGGGCTACCCTACTTGGTAG 3’(SEQ ID NO：14)蔓毛假小尾孢  JB537  5’GGGGGCTACCCTACTTGGTAG 3’(SEQ ID NO：15)蔓毛假小尾孢  JB538  5’ACTTGGTAGGGTTTAGAGTCGTCA 3’(SEQ ID NO：16)蔓毛假小尾孢  JB539  5’CTTCGGTAAGGTTTAGAGTCGTCG 3’(SEQ ID NO：17)蔓毛假小尾孢  JB540  5’GGGGGCCACCCTACTTCGGTAA 3’(SEQ ID NO：18)蔓毛假小尾孢  JB541  5’CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAG 3’(SEQ ID NO：19)蔓毛假小尾孢  JB542  5’CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAA 3’(SEQ ID NO：20)蔓毛假小尾孢  JB543  5’CCTGTAAAAAATTGGGGGTTA 3’(SEQ ID NO：21)蔓毛假小尾孢  JB544  5’CCTGTAAAAAATTGGGGGTTG 3’(SEQ ID NO：22)菲济球腔菌    JB547  5’ATTACCGAGTGAGGGCTCACGC 3’(SEQ ID NO：23)菲济球腔菌    JB548  5’GTTGCTTCGGGGGCGACCTG 3’(SEQ ID NO：24)菲济球腔菌    JB442  5’TCGGGGGCGACCTGCCG 3’(SEQ ID NO：25)菲济球腔菌    JB443  5’CCGGAGGCCGTCTA 3’(SEQ ID NO：26)菲济球腔菌    JB545  5’CCACAACGCTTAGAGACGGACAG 3’(SEQ ID NO：27)菲济球腔菌    JB546  5’CACCCGCACTCCGAAGCGAATT 3’(SEQ ID NO：28)菲济球腔菌    JB549  5’GATCCGAGGTCAACCTTTGAATAA 3’(SEQ ID NO：29)菲济球腔菌    JB444  5’GGTCAACCTTTGAATAA 3’(SEQ ID NO：30)乐音球腔菌    JB451  5’CCTTTGTGAACCACACCT 3’(SEQ ID NO：31)乐音球腔菌    JB440  5’CTGCCGGCGAACTT 3’(SEQ ID NO：32)乐音球腔菌    JB449  5’ACCCTGCCGGCGAACTT 3’(SEQ ID NO：33)乐音球腔菌    JB448  5’GCGACCCTGCCGGCGAAC 3’(SEQ ID NO：34)乐音球腔菌    JB441  5’TAGCCGGGAGACTTTGG 3’(SEQ ID NO：35)乐音球腔菌    JB450  5’TCTGCGTCGGAGTTCC 3’(SEQ ID NO：36)乐音球腔菌    JB452  5’CCGCGCTCCGGAGCGAAC 3’(SEQ ID NO：37)18S rDNA      ITS1   5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’(SEQ ID NO：38)5.8S rDNA     ITS2   5’GCTGCGTTCTTCATCGATGC 3’(SEQ ID NO：39)5.8S rDNA     ITS3   5’GCATCGATGAAGAACGCAGC 3’(SEQ ID NO：40)25S rDNA      ITS4   5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’(SEQ ID NO：41)颖枯壳针孢    JB563  5’CTTGCCTGCCGGTTGGACAAATT 3’(SEQ ID NO：50)颖枯壳针孢    JB564  5’CTCAGTAGTTTACTACTGTAAAAGG 3’(SEQ ID NO：51)颖枯壳针孢    JB565  5’CTTCTGGACGCAAGTGTTTGTTAC 3’(SEQ ID NO：52)镰孢属数种    JB566  5’GTTTTTAGTGGAACTTTCTGAGT 3’(SEQ ID NO：53)镰孢属数种    JB567  5’CGCAGGAACCCTAAACTCT 3’(SEQ ID NO：54)镰孢属数种    JB568  5’GCCCGCCGCAGG 3’(SEQ ID NO：55)镰孢属数种    JB569  5’RTWWTTWRTGGAMYYTCTGAGT 3’(SEQ ID NO：56)镰孢属数种    JB570  5’TATGTTGCCTCGGCGG 3’(SEQ ID NO：57)镰孢属数种    JB571  5’TAACGATATGTAAATTACTACGCT 3’(SEQ ID NO：58)镰孢属数种    JB572  5’AAGTTGGGGTTTAACGGC 3’(SEQ ID NO：59)镰孢属数种    JB573  5’AGCGAGCCCGCCAC 3’(SEQ ID NO：60)镰孢属数种    JB574  5’CCATTGTGAACGTTACCTATAC 3’(SEQ ID NO：61)镰孢属数种    JB575  5’CGACCAGAGCGAGATGTA 3’(SEQ ID NO：62)镰孢属数种    JB576  5’GTGAACATACCTTATGTTGCC 3’(SEQ ID NO：63)镰孢属数种    JB577  5’GTTGCCTCGGCGGATC 3’(SEQ ID NO：64)镰孢属数种    JB578  5’CCGCGACGATTACCAG 3’(SEQ ID NO：65)注：镰孢属数种包括禾本科镰孢、大刀镰孢、串珠镰孢和雪小球丝孢菌。实施例7：随机扩增多态DNA(RAPD)引物的筛选
从Operon Technologies Incorporoted(Alemeda，CA)购买了20种核苷酸的两个RAPD引物文库(盒B和E)。测试这些引物区分颖枯壳针孢、小麦壳针孢、菲济球腔菌和乐音球腔菌的纯化基因组DNA的能力。PCR的条件与实施例4中所述基本相同，所不同的是循环次数增加到35，退火温度为30℃，且每种引物的用量仅为5pM。鉴定出能够区分颖枯壳针孢、小麦壳针孢、菲济球腔菌和乐音球腔菌纯化基因组DNA的五种RAPD引物。引物OPB-12和OPE-6在与小麦壳针孢基因组DNA一起扩增时产生单一片段。引物OPE-12、OPB-19和OPE-15自颖枯壳针孢基因组DNA产生单一片段。引物OPB-12和OPE-6不从颖枯壳针孢、菲济球腔菌和乐音球腔菌基因组DNA中产生任何扩增产物。引物OPE-12、OPB-19和OPE-15不从小麦壳针孢、菲济球腔菌和乐音球腔菌基因组DNA扩增任何片段。表3用于壳针孢诊断的RAPD引物
                                                        扩增片段模板DNA来源   引物           引物序列                      的近似大小小麦壳针孢    OPB-12    5’-CCTTGACGCA-3’(SEQ ID NO：42)    1.3kb小麦壳针孢    OPE-6     5’-AAGACCCCTC-3’(SEQ ID NO：43)    1.0kb颖枯壳针孢    OPE-12    5’-TTATCGCCCC-3’(SEQ ID NO：44)    2.2kb颖枯壳针孢    OPB-19    5’-ACCCCCGAAG-3’(SEQ ID NO：45)    1.1kb颖枯壳针孢    OPE-15    5’-ACGCACAACC-3’(SEQ ID NO：46)    1.3kb实施例8：测定引物对纯化真菌基因组DNA的特异性
利用不同的引物组合，按照实施例4完成PCR，以企扩增单个种属特异性片段。从每一感兴趣真菌菌株的18S和25S核糖体DNA亚单位之间的ITS区设计出的引物产生种属特异性PCR扩增产物。表4  得自ITS的诊断PCR引物
                                                                扩增片段的模板DNA的来源         5’引物                     3’引物            近似大小颖枯壳针孢   JB433(SEQ ID NO：7)           JB434(SEQ ID NO：8)         448bp
        JB433(SEQ ID NO：7)           ITS4(SEQ ID NO：41)(JB415)  553bp
        ITS1(SEQ ID NO：38)(JB410)    JB434(SEQ ID NO：8)         478bp
        ITS3(SEQ ID NO：40)(JB414)    JB434(SEQ ID NO：8)         232bp*
        JB527(SEQ ID NO：10)          JB525(SEQ ID NO：9)         458bp
        JB564(SEQ ID NO：51)          JB565(SEQ ID NO：52)        480bp
        JB563(SEQ ID NO：50)          JB565(SEQ ID NO：52)        368bp小麦壳针孢
        JB445(SEQ ID NO：11)          ITS4(SEQ ID NO：41)(JB415)  407bp
        ITS1(SEQ ID NO：38)(JB410)    JB446(SEQ ID NO：12)        345bp
        ITS3(SEQ ID NO：40)(JB414)    JB446(SEQ ID NO：12)        143bp*
        JB445(SEQ ID NO：11)          JB446(SEQ ID NO：12)        204bp菲济球腔菌
         JB443(SEQ ID NO：26)          ITS4(SEQ ID NO：41)(JB415)    418bp
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         JB443(SEQ ID NO：26)          JB444(SEQ ID NO：30)          366bp*
         ITS3(SEQ ID NO：40)(JB414)    JB444(SEQ ID NO：30)          281bp*
         ITS1(SEQ ID NO：38)(JB410)    JB549(SEQ ID NO：29)          489bp乐音球腔菌
         JB449(SEQ ID NO：33)          ITS4(SEQ ID NO：41)(JB4 15)   430bp
         JB448(SEQ ID NO：34)          ITS4(SEQ ID NO：41)(JB4 15)   449bp*
         JB448(SEQ ID NO：34)          ITS2(SEQ ID NO：39)(JB4 11)   138bp*
         JB450(SEQ ID NO：36)          ITS4(SEQ ID NO：41)(JB4 15)   390bp*蔓毛假小尾孢
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         JB539(SEQ ID NO：17)          JB542(SEQ ID NO：20)          400bp++
         JB539(SEQ ID NO：17)          JB544(SEQ ID NO：22)          487bp++镰孢属数种
         JB566(SEQ ID NO：53)          ITS4(SEQ ID NO：41)(JB415)  430bp1
         JB566(SEQ ID NO：53)          JB572(SEQ ID NO：59)        346bp1
         JB569(SEQ ID NO：56)          ITS4(SEQ ID NO：41)(JB415)  430bp1
         JB569(SEQ ID NO：56)          JB572(SEQ ID NO：59)        346bp1
         ITS1(SEQ ID NO：38)(JB410)    JB572(SEQ ID NO：59)        485bp1
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         JB569(SEQ ID NO：56)          JB571(SEQ ID NO：58)        308bp2
         JB570(SEQ ID NO：57)          ITS4(SEQ ID NO：41)(JB415)  501bp2
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         JB577(SEQ ID NO：64)          JB571(SEQ ID NO：58)        373bp2
         JB577(SEQ ID NO：64)          JB578(SEQ ID NO：65)        389bp2
         ITS1(SEQ ID NO：38)(JB410)    JB571(SEQ ID NO：58)        447bp2
         ITS1(SEQ ID NO：38)(JB410)    JB578(SEQ ID NO：65)        463bp2
         ITS1(SEQ ID NO：38)(JB410)    JB575(SEQ ID NO：62)        479bp2雪小球丝孢菌
         JB569(SEQ ID NO：56)          JB575(SEQ ID NO：62)        340bp
         JB567(SEQ ID NO：54)          JB575(SEQ ID NO：62)        360bp
         JB574(SEQ ID NO：61)          ITS4(SEQ ID NO：41)(JB415)  520bp
         JB574(SEQ ID NO：61)          JB572(SEQ ID NO：59)        436bp*……引物组合通过假引导扩增某些片段，但其中没有一个片段是所需片段的大小。+……引物蔓毛假小尾孢的R和W型扩增正确大小的片段。++……引物组合仅从蔓毛假小尾孢的R型扩增正确大小的片段。1……引物组合从禾本科镰孢、大刀镰孢、串珠镰孢和雪小球丝孢菌扩增正确大小的片段。2……引物组合从禾本科镰孢、大刀镰孢和串珠镰孢扩增正确大小的片段。实施例9：测定引物对被真菌感染的植物组织的特异性
按照实例3所述方案，从健康的小麦叶、被颖枯壳针孢感染的小麦叶、被小麦壳针孢感染的小麦叶和被颖枯壳针孢及小麦壳针孢共同感染的小麦叶中分离总基因组DNA。按实例4进行PCR，以测试实例8中的引物组合对小麦叶DNA的反应性。
小麦壳针孢特异性引物JB446(SEQ ID NO：12)和ITS1(SEQID NO：38)(JB410)从纯化的小麦壳针孢DNA、小麦壳针孢感染的小麦叶组织及被小麦壳针孢和颖枯壳针孢感染的小麦叶样品扩增了-345bp的片段。该引物组不从健康小麦叶组织或颖枯壳针孢感染的小麦叶组织扩增诊断片段。同样，小麦壳针孢特异性引物JB445(SEQ ID NO：11)和ITS4(SEQ ID NO：41)(JB415)，象JB446(SEQID NO：12)和ITS1(SEQ ID NO：38)(JB410)引物组合一样，从同样组织扩增-407bp的诊断片段。
利用颖枯壳针孢特异性引物JB433(SEQ ID NO：7)和JB434(SEQ ID NO：8)获得了类似的诊断结果。该引物组合从颖枯壳针孢感染的小麦组织、被颖枯壳针孢和小麦壳针孢感染的小麦叶组织和从纯化的颖枯壳针孢基因组DNA扩增-448bp的片段。JB433(SEQ ID NO：7)和JB434(SEQ ID NO：8)的引物组合不从健康小麦组织、小麦壳针孢感染的小麦组织或纯化的小麦壳针孢基因组DNA扩增任何片段。颖枯壳针孢特异性引物JB527(SEQ ID NO：10)和JB525(SEQ ID NO：9)，象JB433(SEQ ID NO：7)和JB434(SEQ IDNO：8)组合一样，从同样的基因组DNA和小麦组织扩增458bp片段。
针对实例12所获得的小麦茎提取物，对实例8所列出的蔓毛假小尾孢引物组合进行PCR试验。按实例4完成PCR，但作出如下改动：完成94℃15秒和70℃45秒的35个循环，并使用1.5-2.5mMMgCl2和200μm的每种dNTP。在每次PCR中使用1μl小麦提取物。
JB537(SEQ ID NO：15)和JB541(SEQ ID NO：19)的引物组合从被蔓毛假小尾孢的W病变型感染的小麦提取物扩增出413bp片段。通过健康的小麦提取物或被蔓毛假小尾孢的R病变型感染的小麦提取物的扩增，则未产生任何扩增产物。
JB539(SEQ ID NO：17)和JB544(SEQ ID NO：22)引物组合及JB540(SEQ ID NO：18)和JB542(SEQ ID NO：20)引物组合分别从被R型感染的小麦扩增出487bp和413bp的片段，但不未健康小麦或W型感染的小麦扩增出产物。
也利用实例3的方法，从健康的和被菲济球腔菌感染的香蕉叶分离出总的基因组DNA。按实例4所述完成PCR，以试验实例8所列出的引物组合对香蕉叶DNA的反应性。
菲济球腔菌特异性引物JB549(SEQ ID NO：29)和ITS1(SEQID NO：38)(JB410)从纯化的菲济球腔菌DNA和菲济球腔菌感染的香蕉叶组织扩增出489bp的片段。该引物组未从健康的香蕉叶组织扩增诊断片段。菲济球腔菌特异性引物组织JB443(SEQ ID NO：26)/ITS4(SEQ ID NO：41)(JB415)和ITS1(SEQ ID NO：38)(JB410)/JB444(SEQ ID NO：30)，象JB549(SEQ ID NO：29)和ITS1(SEQ ID NO：38)(JB410)一样，从同样的基因组DNA和香蕉叶组织分别扩增出418bp和482bp片段。实施例10：测定种属特异性引物与其它种属和分离物的交叉反应性
按实例1所述方法获得纯化的真菌基因组DNA，并按实例4所述利用种属特异性引物进行PCR检测。测试种属特异性引物与其它真菌DNA种和分离物交叉反应的能力。
小麦壳针孢特异性引物JB446(SEQ ID NO：12)和ITS1(SEQID NO：38)(JB410)从实例1所列出的所有小麦壳针孢分离物中扩增出345bp片段。与颖枯壳针孢、大豆壳针孢或大麦壳针孢的纯化基因组DNA不具有交叉反应性。这些其它真菌种中没有一种与小麦壳针孢特异性引物产生扩增产物。
利用颖枯壳针孢特异性引物JB433(SEQ ID NO：7)和JB434(SEQ ID NO：8)，从实例1所列出的所有颖枯壳针孢分离物中扩增出-448bp的片段。同样，颖枯壳针孢特异性引物JB527(SEQ IDNO：10)和JB525(SEQ ID NO：9)从实例1列出的所有颖枯壳针孢分离物中扩增出-458bp的片段。当利用颖枯壳针孢特异性引物组JB433(SEQ ID NO：7)和JB434(SEQ ID NO：8)或JB527(SEQ IDNO：10)和JB525(SEQ ID NO：9)进行检测时，小麦壳针孢、大豆壳针孢或大麦壳针孢均不产生任何扩增产物。
利用实例9所述条件进行PCR，测定实例8列出的蔓毛假小尾孢特异性引物组合对实例1列出的其它真菌DNA种或分离物的反应性。
只有当对蔓毛假小尾孢分离物及随后的谷物病原菌夏令假小尾孢、P、cereale、P.sorokiniana、小麦壳针孢和颖枯壳针孢进行测试时，引物组合JB537(SEQ ID NO：15)和JB541(SEQ ID NO：19)才从W型蔓毛假小尾孢分离物中产生出413bp片段。只有当测试同样DNA时引物组合JB539(SEQ ID NO：17)和JB544(SEQ ID NO：22)才从R型蔓毛假小尾孢分离物中扩增出487bp片段。只有当测试同样DNA时引物组合JB540(SEQ ID NO：18)和JB542(SEQ IDNO：20)才从R型蔓毛假小尾孢分离物中产生出413bp片段。实施例11：蔓毛假小尾孢感染小麦的来源
从Ciba Basle的杀真菌剂筛选程序IC期获得眼斑感染的小麦茎。通过喷洒悬浮在0.2％Tween20中的分生孢子悬液(5×105分生孢子/ml)于小麦茎基上，用蔓毛假小尾孢感染8日龄的小麦植株。接种后，用塑料覆盖植株，在20℃及95-100％相对湿度条件下培养1天。然后将植株移至12℃及60％相对湿度的生长室中培养4周。然后再移至温室，于18℃及60％相对湿度下培养。对于用W型蔓毛假小尾孢311菌株感染的小麦植株，于感染后8-9周采样。对于用R型菌株308病原菌感染的小麦植株，于感染后9-10周采样。实施例12：从小麦茎中提取DNA用于蔓毛假小尾孢检测
利用经过某些改进的Klimyuk等人的方法(the Plant Journal3(3)：493-494)，从小麦茎中提取DNA。将从基秆上0.5cm处切下的2cm长小麦茎置于160μl0.25M NaOH中，用Kontes研杵捣碎直至完全浸软。将样品煮沸30秒，向其中加入160μl0.25M Hcl和80μl 0.5M Tris-Hcl(pH8.0)/0.25％V/V Nonidet p-40。再将样品煮沸2分钟，然后置于冰水浴中。使用1μl提取物进行PCR检测。实施例13：将诊断检测结合到定量比色检测中
按Nikiforov等人的方法(PCR Methods and Applications 3：285-291)进行比色检测，并作出如下改动：
1)向捕获引物孔中加入30μlR型PCR产物和3M Nacl/20mMEDTA混合物。50μlW型PCR产物和3M Nacl/20mM EDTA混合物用于杂化反应。
2)核酸外切酶处理和杂化反应于37℃保温。
3)使用1∶1000稀释的抗生物素辣根过氧化物酶(HRP)单克隆抗体。
4)在与O-苯二胺二盐酸盐(OPD)底物保温2分钟后，向每一检测孔中加入50μl 3NHcl。利用常规的ELISA平板读数器，于492nm处对96孔平板进行读数，并以570nm作为对照。
为对用于比色检测的捕获引物进行测试，按实例5合成表5所列出的引物。表5  用于比色检测的捕获引物引物名称     引物模板                  引物序列ITS2   5.8S rDNA         5’GCTGCGTTCTTCATCGATGC3’(SEQ ID NO：39)JB541  W型蔓毛假小尾孢    5’CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAG3’(SEQ ID NO：19)JB542  R型蔓毛假小尾孢    5’CCACTGATTTTAGAGGCCGCGAA3’(SEQ ID NO：20)JB538’W-型蔓毛假小尾孢   5’TGACGACTCTAAACCCTACCA3’(SEQID NO：66)JB539’R型蔓毛假小尾孢    5’CGACGACTCTAAACCTTACCG3’(SEQ ID NO：67)W130   W-型蔓毛假小尾孢   5’ATTCAAGGGTGGAGGTCTGA3’(SEQ ID NO：68)R130   R-型蔓毛假小尾孢   5’ATTCAAGGGTGGAGGTCTGG3’(SEQ ID NO：69)JB538’15W-型蔓毛假小尾孢 5’CTCTAAACCCTACCA3’(SEQ ID NO：70)JB539’15R-型蔓毛假小尾孢 5’CTCTAAACCTTACCG3’(SEQ ID NO：71)JB553  R & W types       5’GTGGTCCTCTGGCAG3’(SEQ ID NO 72)JB554  R & W types       5’CTCAACAGCCGAAGC3’(SEQ ID NO：73)JB555  W-型蔓毛假小尾孢   5’GGGTGGAGGTCTGA3’(SEQ ID NO：74)JB556  R-型蔓毛假小尾孢   5’GGTGGAGGTCTGG3’(SEQ ID NO：75)JB561  R-型蔓毛假小尾孢   5’TGGAGGTCTGGACCA3’(SEQ ID NO：76)JB562  W-型蔓毛假小尾孢   5’TGGAGGTCTGAACCA3’(SEQ ID NO：77)JB559  W-型蔓毛假小尾孢   5’AGGGTGGAGGTCTGA3’(SEQ ID NO：78)JB560  R-型蔓毛假小尾孢   5’AGGGTGGAGGTCTGG3’(SEQ ID NO：79)JB557  W-型蔓毛假小尾孢   5’TTCTCCGAGAGGCCT3’(SEQ ID NO：80)JB558  R-型蔓毛假小尾孢   5’TTCTCCGAGAGGCCC3’(SEQ ID NO：81)
将颖枯壳针孢诊断引物JB527(SEQ ID NO：10)和JB525(SEQID NO：9)整合到定量比色格式中。引物JB527(SEQ ID NO：10)由Midland Certified Reagent Company(Midland，Texas)合成，它含有生物素标记，且5′末端含有四种核苷酸间硫代磷酸酯键。当利用ITS2(SEQ ID NO：39)引物作为PCR产生捕获引物进行比色检测时，按照实例4所述利用改进的JB527(SEQ ID NO：10)和JB525(SEQ IDNO：9)引物进行PCR扩增，从健康、低、中和高度感染颖枯壳针孢的小麦分别产生出无、低、中和高A492值。
也对蔓毛假小尾孢R型特异性5′引物JB539(SEQ ID NO：17)和JB540(SEQ ID NO：18)及蔓毛假小尾孢W型特异性5′引物JB537(SEQ ID NO：15)进行修饰，以使其含有生物素标记和四种核苷酸间硫代磷酸酯键。利用修饰的JB540(SEQ ID NO：18)引物、JB542(SEQ ID NO：20)引物和捕获引物JB539′15，形成蔓毛假小尾孢R型PCR检测的比色形式。利用修饰的JB540(SEQ ID NO：18)引物和JB542(SEQ ID NO：20)引物从R型感染小麦和R型基因组DNA扩增产生的产物在进行比色检测时产生阳性比色值。当利用JB538′15作为捕获引物利用修饰的JB537(SEQ ID NO：15)引物和W型特异性引物JB541(SEQ ID NO：19)进行PCR扩增时，从W型感染小麦和W型基因组DNA也获得了经比色分析为阳性的比色值。而且，比色信号的强度与在琼脂糖凝胶上观察到的PCR产物的片段强度相对应。
以前，通过显微镜检测可鉴定不同的壳针孢种，且不同的假小尾孢属菌株只有通过病理实验才能鉴定。同样清楚地鉴定乐音球腔菌和菲济球腔菌一直非常困难，即使是分离出成熟的子囊壳也不总能保证精确的鉴定(Pons，1990；In：Sigatoka Leaf Spot Diseases of Ba-nana，Eds.RA Fullerton and RH Stover，International Network for theImprovement of Banama and Plantain，France)。目前，利用ELIS技术的免疫诊断盒被常规地用于鉴定小麦壳针孢、颖枯壳针孢、蔓毛假小尾孢和其它病原菌，但是该技术缺乏准确性、检测范围及区分本发明不同分离物的能力。因此，一种快速鉴定这些真菌的不同菌株的DNA试验的开发不仅对真菌分类学家，而且对于病害的控制及杀真菌剂的选择性使用均提供了现实的优越性。
虽然已借助具体的实施方案对本发明进行了描述，但应理解的是各种改动、改进和其它实施方案仍是可能的。因此，所有这些改变、改进和实施方案均应包括在本发明的范围之内。保藏
以下保藏于1994年3月28日在农业研究服务及专利培养物中心(NRRU)(North Regional Research Center；1815 North UniversityStreet，Peoria，Illcnois 61604，U.S.A)：1.    HB 101 DH5d(pCRW2-1；SEQ ID NO：3)     Accession No.NRRL B-212312.    HB 101 DH5d(pCRW5-1；SEQ ID.NO：47)    Accession No NRRL B-212323.    E.coli DH5d(pCRSTRIT1；SEQ ID NO：1)   Accession No.NRRL B-212334.    E.coli DH5d(pCRRl-21；SEQ ID NO：4)    Accession No.NRRL B-212345.    E.coli DH5d(pCRSNOD31；SEQ ID NO：2)   Accession No NRRL B-21235
                            序列表(1)  一般信息
   (i)  APPLICANT：Ligon，James M
                   Beck，James J
   (ii) TITLE OF INVENTION：Detection of Fungal pathogens Using the
         Polymerase Chain Reaction
  (iii)NUMBER OF SEQUENCES：86
  (iv)CORRESPONDENCE ADDRESS：
     (A) ADDRESSEE：Ciba-Geigy Corporation
     (B) STREET：7 Skyline Drive
     (C) CITY：Hawthorne
     (D) STATE：NY
     (E) COUNTRY：USA
     (F) ZIP：10532
  (v) COMPUTER READABLE FORM：
     (A) MEDIUM TYPE：Floppy disk
     (B) COMPUTER：IBM PC compatible
     (C) OPERATING SYSTEM：PC-DOS/MS-DOS
     (D) SOFTWARE：patentIn Release#1.0，Version#1.25
 (vi) CURRENT APPLICATION DATA：
     (A) APPLICATION NUMBER：US TBA
     (B) FILING DATE：
     (C) CLASSIFICATION：
(vii) PRIOR APPLICATION DATA：
       (A) APPLICATION NUMBER：US08/233,608
       (B) FILING DATE：04-ApR-1994(viii) ATTORNEY/AGENTINFORMATION：
     (A) NAME：Walsh，Andrea C.
     (B) REGISTRATION NUMBER：34，988
     (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER：CGC1739
(ix)  TELECOMMUNICATION INFORMATION：
     (A) TELEPHONE：919-541-8666
     (B) TELEFAX：919-541-8689(2)  SEQ ID NO：1的信息
 (i)序列特征：
    (A)长度：548碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(ix)特征
    (A)名称/关键词：misc-特征
    (B)位置：1··548
    (D)其它信息：/注＝“小麦壳针孢内部转录间隔区的DNA序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGCGAGG GCCTCCGGGT CCGACCTCCA        60ACCCTTTGTG AACACATCCC GTTGCTTCGG GGGCGACCCT GCCGGGCGCC CCCGGAGGAC       120CACCAAAAAA CACTGCATCT CTGCGTCGGA GTTTACGAGT AAATCGAAAC AAAACTTTCA       180ACAACGGATC TCTTGGTTCT GGCATCGATG AAGAACGCAG CGAAATGCGA TAAGTAATGT       240GAATTGCAGA ATTCAGTGAA TCATCGAATC TTTGAACGCA CATTGCGCCC CCTGGTATTC       300CGGGGGGCAT GCCCGTTCGA GCGTCATTAC ACCACTCCAG CCTCGCTGGG TATTGGGCGT       360CTTTTCGCGG GGGATCACTC CCCCGCGCGC CTCAAAGTCT CCGGCTGAGC GGTCTCGTCT       420CCCAGCGTTG TGGCATCACG TCTCGCCGCG GAGTTCACGA GCCCTCACGG CCGTTAAATC       480ACACCTCAGG TTGACCTCGG ATCGGGTAGG GATACCCGCT GAACTTAAGC ATATCAATAA       540GCGGAGGA                                                                                                  548(2)  SEQ ID NO：2的信息
 (i)序列特征：
     (A)长度：583碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链度：单链
     (D)拓扑结构：线性
 (ii)分子类型：DNA(基因组)
 (iii)假定：无
 (iv)反义：无
 (vi)原始来源：
     (A)生物：颖枯壳针孢
 (ix)特征
     (A)名称/关键词：misc-特征
     (B)位置：1··583
     (D)其它信息：/注＝“颖枯壳针孢内部转录间隔区的DNA序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA CACTCAGTAG TTTACTACTG TAAAAGGGGC         60TGTTAGTCTG TATAGCGCAA GCTGATGAGC AGCTGGCCTC TTTTATCCAC CCTTGTCTTT        120TGCGTACCCA CGTTTCCTCG GCAGGCTTGC CTGCCGGTTG GACAAATTTA TAACCTTTTT        180AATTTTCAAT CAGCGTCTGA AAAACTTAAT AATTACAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG        240TTCTGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAAGTA GTGTGAATTG CAGAATTCAG        300TGAATCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGC GCCCCTTGGT ATTCCATGGG GCATGCCTGT        360TCGAGCGTCA TTTGTACCCT CAAGCTCTGC TTGGTGTTGG GTGTTTGTCC TCTCCCTAGT        420GTTTGGACTC GCCTTAAAAT AATTGGCAGC CAGTGTTTTG GTATTGAAGC GCAGCACAAG        480TCGCGATTCG TAACAAACAC TTGCGTCCAC AAGCCTTTTT AACTTTTGAC CTCGGATCAG        540GTAGGGATAC CCGCTGAACT TAAGCATATC AATAAGCGGA GGA                          583(2) SEQ ID NO：3的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：626碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(vi)原始来源：
    (A)生物：蔓毛假小尾孢
    (B)菌株：菌株R
    (C)单个分离物：变异株W2-1
(ix)特征
    (A)名称/关键词：misc-特征
    (B)位置：1··626
    (D)其它信息：/注＝“蔓毛假小尾孢W菌株(变异株W2-1)内部转录间隔区的DNA序列”
(xi)序列描述：  SEQ ID NO：3：TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ATAGAGCAAT GAACAGACAG CGCCCCGGGA        60GAAATCCTGG GGGCTACCCT ACTTGGTAGG GTTTAGAGTC GTCAGGCCGC TCGGAGAAGC       120CTGGTTCAGA CCTCCACCCT TGAATAAATT ACCTTTGTTG CTTTGGCAGG GCGCCTCGCG       180CCAGCGGCTT CGGCTGTTGA GTACCTGCCA GAGGACCACA ACTCTTGTTT TTAGTGATGT       240CTGAGTACTA TATAATAGTT AAAACTTTCA ACAACGGATC TCTTGGTTCT GGCATCGATG       300AAGAACGCAG CGAAATGCGA TAAGTAATGT GAATTGCAGA ATTCAGTGAA TCATCGAATC       360TTTGAACGCA CATTGCGCCC TCTGGTATTC CGGGGGGCAT GCCTGTTCGA GCGTCATTAT       420AACCACTCAA GCTCTCGCTT GGTATTGGGG TTCGCGTCCT CGCGGCCTCT AAAATCAGTG       480GCGGTGCCTG TCGGCTCTAC GCGTAGTAAT ACTCCTCGCG ATTGAGTCCG GTAGGTTTAC       540TTGCCAGTAA CCCCCAATTT TTTACAGGTT GACCTCGGAT CAGGTAGGGA TACCCGCTGA       600ACTTAAGCAT ATCAATAAGC GGAGGA                                            626(2) SEQ ID NO：4的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：627碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(vi)原始来源：
    (A)生物：蔓毛假小尾孢
    (B)菌株：菌株R(ix)特征
    (A)名称/关键词：misc-特征
    (B)位置：1··627
    (D)其它信息：/注＝“蔓毛假小尾孢R菌株内部转录间隔区的DNA序列”(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ATAGAGCAAT GGATAGACAG CGCCCCGGGA        60GAAATCCTGG GGGCCACCCT ACTTCGGTAA GGTTTAGAGT CGTCGGGCCT CTCGGAGAAG       120CCTGGTCCAG ACCTCCACCC TTGAATAAAT TACCTTTGTT GCTTTGGCAG GGCGCCTCGC       180GCCAGCGGCT TCGGCTGTTG AGTACCTGCC AGAGGACCAC AACTCTTGTT TTTAGTGATG       240TCTGAGTACT ATATAATAGT TAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGTTC TGGCATCGAT       300GAAGAACGCA GCGAAATGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAAT       360CTTTGAACGC ACATTGCGCC CTCTGGTATT CCGGGGGGCA TGCCTGTTCG AGCGTCATTA       420TAACCACTCA AGCTCTCGCT TGGTATTGGG GTTCGCGTCT TCGCGGCCTC TAAAATCAGT       480GGCGGTGCCT GTCGGCTCTA CGCGTAGTAA TACTCCTCGC GATTGAGTCC GGTAGGTTTA       540CTTGCCAGCA ACCCCCAATT TTTTACAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG       600AACTTAAGCA TATCAATAAG CGGAGGA                                           627(2)  SEQ ID NO：5的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：543碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(vi)原始来源：
    (A)生物：菲济球腔菌
(ix)特征
    (A)名称/关键词：misc-特征
    (B)位置：1··534
    (D)其它信息：/注＝“菲济球腔菌内部转录间隔区的DNA序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGTGAGG GCTCACGCCC GACCTCCAAC        60CCTTTGTGAA CCACAACTTG TTGCTTCGGG GGCGACCTGC CGTCGGCGGG CGCCCCCGGA       120GGCCGTCTAA ACACTGCATC TTTGCGTCGG AGTTTAAAAC AAATCGAACA AAACTTTCAA       180CAACGGATCT CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC GAAATGCGAT AAGTAATGTG       240AATTGCAGAA TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCT TTGGTATTCC       300GAAGGGCATG CCTGTTCGAG CGTCATTTCA CCACTCAAGC CTGGCTTGGT ATTGGGCGTC        360GCGGTTCTTC GCGCGCCTTA AAGTCTCCGG CTGAGCTGTC CGTCTCTAAG CGTTGTGGAT        420CTTTCAATTC GCTTCGGAGT GCGGGTGGCC GCGGCCGTTA AATCTTTATT CAAAGGTTGA        480CCTCGGATCA GGTAGGGATA CCCGCTGAAC TTAAGCATAT CAATAAGCGG AGGA              534(2) SEQ ID NO：6的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：540碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(vi)原始来源：
    (A)生物：乐音球腔菌
(ix)特征
    (A)名称/关键词：misc-特征
    (B)位置：1··540
    (D)其它信息：/注＝“乐音球腔菌内部转录间隔区的DNA序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：TCCGTAGGTG AACCTGCGGG GGGATCATTA CCGAGTGAGG GCTCACCCCC GACCTCCAAC         60CCTTTGTGAA CCACACCTGT TGCTTCGGGG GCGACCCTGC CGGCGAACTT GTCGCCGGGC        120GCCCCCGGAG GTCTCCTTAA CACTGCATCT CTGCGTCGGA GTTCCAAACA AATCGGACAA        180AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA        240AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGCGCCCTT        300TGGCATTCCG AAGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCAC CACTCAAGCC TAGCTTGGTA        360TTGGGCGCCG CGGTGCTCCG CGCGCCCCAA AGTCTCCCGG CTAAGCCGTC CGTCTCTAAG        420CGTTGTGGAT TTTTCAGTTC GCTCCGGAGC GCGGGTGGCC GCGGCCGTTA AATCTTCAAA        480GGTTGACCTC GGATCAGGTA GGGATACCCG CTGAACTTAA GCATATCAAT AAGCGGAGGA        540(2) SEQ ID NO：7的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JR433
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：  SEQ ID NO：7：ACACTCAGTA GTTTACTACT                        20(2) SEQ ID NO：8的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB434
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：TGTGCTGCGC TTCAATA                           17(2) SEQ ID NO：9的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：23碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB525
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：GCGACTTGTG CTGCGCTTCA ATA                      23(2) SEQ ID NO：10的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：24碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JR527
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：  CATTACACTC AGTAGTTTAC TACT              24(2) SEQ ID NO：11的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB445
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：CTGCGTCGGA GTTTACG                        17(2) SEQ ID NO：12的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB446
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：CGAGGCTGGA GTGGTGT                        17(2) SEQ ID NO：13的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：22碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB526
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：CCCAGCGAGG CTGGAGTGGT GT                  22(2)  SEQ ID NO：14的信息(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链度：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它核酸
(A)描述：寡核苷酸引物JB536(iii)假定：无(iv)反义：无
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：CTGGGGGCTA CCCTACTTGG TAG                      23(2) SEQ ID NO：15的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：21碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB537
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：GGGGGCTACC CTACTTGGTA G                       21(2) SEQ ID NO：16的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：24碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JR538
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：ACTTGGTAGG GTTTAGAGTC GTCA                    24(2) SEQ ID NO：17的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：24碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其它核酸
   (A)描述：寡核苷酸引物JB539(iii)假定：无(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：CTTCGGTAAG GTTTAGAGTC GTCG                     24(2) SEQ ID NO：18的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：22碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB540
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：GGGGGCCACC CTACTTCGGT AA                       22(2) SEQ ID NO：19的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：23碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB541
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：CCACTGATTT TAGAGGCCGC GAG                      23(2) SEQ ID NO：20的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：23碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB542
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：CCACTGATTT TAGAGGCCGC GAA                     23(2) SEQ ID NO：21的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：21碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB543
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：CCTGTAAAAA ATTGGGGGTT A                        21(2) SEQ ID NO：22的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：21碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB544
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：CCTGTAAAAA ATTGGGGGTT G                        21(2) SEQ ID NO：23的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：22碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB547
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23： ATTACCGAGT GAGGGCTCAC GC                       22(2) SEQ ID NO：24的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB548
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：GTTGCTTCGG GGGCGACCTG                          20(2) SEQ ID NO：25的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB442
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：TCGGGGGCGA CCTGCCG                             17(2) SEQ ID NO：26的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：14碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB443
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：CCGGAGGCCG TCTA14(2) SEQ ID NO：27的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：23碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB545
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：CCACAACGCT TAGAGACGGA CAG                       23(2) SEQ ID NO：28的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：22碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB546
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：CACCCGCACT CCGAAGCGAA TT                        22(2) SEQ ID NO：29的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：24碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB549
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：GATCCGAGGT CAACCTTTGA ATAA                       24(2) SEQ ID NO：30的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB444
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：GGTCAACCTT TGAATAA                             17(2) SEQ ID NO：31的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：18碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB451
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：CCTTTGTGAA CCACACCT                            18(2) SEQ ID NO：32的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：14碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB440
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：CTGCCGGCGA ACTT                                 14(2) SEQ ID NO：33的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB449
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：ACCCTGCCGG CGAACTT                              17(2) SEQ ID NO：34的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：18碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB448
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：GCGACCCTGC CGGCGAAC                             18(2) SEQ ID NO：335的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB441
(iii)假定：无
(iv)反义：无
((xi)序列描述：SEQ ID NO：35：TAGCCGGGAG ACTTTGG                              17(2) SEQ ID NO：36的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：16碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB450
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：TCTGCGTCGG AGTTCC                              16(2) SEQ ID NO：37的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：18碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物JB452
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：CCGCGCTCCG GAGCGAAC                            18(2) SEQ ID NO：38的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：19碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物ITS1
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：(2) SEQ ID NO：39的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物ITS2
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：GCTGCGTTCT TCATCGATGC(2) SEQ ID NO：40的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
   (A)描述：寡核苷酸引物ITS3
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：GCATCGATGA AGAACGCAGC(2) SEQ ID NO：41的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物ITS4
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：
TCCTCCGCTT ATTGATATGC(2) SEQ ID NO：42的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：10碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物OPB-12
(iii)假定：无
(iv)反义：无
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：42：CCTTGACGCA                                     10
(2) SEQ ID NO：43的信息
    (i)序列特征：
        (A)长度：10碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链度：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：其它核酸
        (A)描述：寡核苷酸引物OPE-6
    (iii)假定：无
    (iv)反义：无
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：43：AAGACCCCTC                                     10
(2) SEQ ID NO：44的信息
    (i)序列特征：
        (A)长度：10碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链度：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：其它核酸
        (A)描述：寡核苷酸引物OPF-12
    (iii)假定：无
    (iv)反义：无
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：44：TTATCGCCCC                                     10
(2) SEQ ID NO：45的信息
    (i)序列特征：
        (A)长度：10碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链度：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：其它核酸
        (A)描述：寡核苷酸引物OPE-19
    (iii)假定：无
    (iv)反义：无
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：45：ACCCCCGAAG                                      10(2) SEQ ID NO：46的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：10碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：寡核苷酸引物OPE-15
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：46：ACGCACAACC                                      10(2) SEQ ID NO：47的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：627碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(vi)原始来源：
    (A)生物：蔓毛假小尾孢
    (B)菌株：菌株W
    (C)单个分离物：变异株W5-1
(ix)特征
    (A)名称/关键词：misc-特征
    (B)位置：1··627
    (D)其它信息：/注＝“蔓毛假小尾孢W菌株(变异株W5-1)内部转录间
       隔区的DNA序列”
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：47：TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ATAGAGCAAT GAACAGACAG CGCCCTGGGA        60GAAATCCTGG GGGCTACCCT ACTTCGGTAG GGTTTAGAGT CGTCAGGCCT CTCGGAGAAG       120CCTGGTTCAG ACCTCCACCC TTGAATAAAT TACCTTTGTT GCTTTGGCAG GGCGCCTCGC       180GCCAGCGGCT TCGGCTGTTG AGTACCTGCC AGAGGACCAC AACTCTTGTT TTTAGTGATG       240TCTGAGTACT ATATAATAGT TAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGTTC TGGCATCGAT       300GAAGAACGCA GCGAAATGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAAT       360CTTTGAACGC ACATTGCGCC CTCTGGTATT CCGGGGGGCA TGCCTGTTCG AGCGTCATTA       420TAACCACTCA AGCTCTCGCT TGGTATTGGG GTTCGCGTCC TCGCGGCCTC TAAAATCAGT       480GGCGGTGCCT CTCGGCTCTA CGCGTAGTAA TACICCTCGC GAIIGAGICC GGTAGGTTTA        540CTTGCCAGTA ACCCCCAATT TTTTACAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG        600AACTTAAGCA TATCAATAAG CGGAGGA                                            627(2) SEQ ID NO：48的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：17碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：M13全适-20寡核苷酸引物
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：48：GTAAAACGAC GGCCAGT                              17(2) SEQ ID NO：49的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：16碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：M13全适-20寡核苷酸引物
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：49：AACAGCTATG ACCATG                               16(2) SEQ ID NO：50的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：23碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB563”
(iii)假定：无
 (xi)序列描述：SEQ ID NO：50：CTTGCCTGCC GGTTGGACAA ATT                       23(2) SEQ ID NO：51的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：25碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB564”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：CTCAGTAGTT TACTACTGTA AAAGG                     25(2) SEQ ID NO：52的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：24碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB565”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：CTTCTGGACG CAAGTGTTTGTTAC                       24(2) SEQ ID NO：53的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：22碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB566”
(iii)假定：无
((xi)序列描述：SEQ ID NO：53：GTTTTTAGTG GAACTTCTGA GT                         22(2) SEQ ID NO：54的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：19碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/dese“寡核苷酸引物JB567”
(iii)假定：无
((xi)序列描述：SEQ ID NO：54：CGCAGGAACC CTAAACTCT                           19(2) SEQ ID NO：55的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：12碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB568”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：GCCCGCCGCA GG                                  12(2) SEQ ID NO：56的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：22碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB569”
(iii) 假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：RTWWTTWRTG GAMYYTCTGA GT                       22(2) SEQ ID NO：57的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：16碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB570”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEO ID NO：57：TATGTTGCCT CGGCGG                              16(2) SEQ ID NO：58的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：24碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB571”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：TAACGATATG TAAATTACTA CGCT                     24(2) SEQ ID NO：59的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：18碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB572”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：AAGTTGGGGT TTAACGGC                            18(2) SEQ ID NO：60的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：14碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB573”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：AGCGAGCCCG CCAC                                14(2) SEQ ID NO：61的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：22碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB574”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：CCATTGTGAA CGTTACCTAT AC                       22(2) SEQ ID NO：62的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：18碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB575”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：CGACCAGAGC GAGATGTA                            18(2) SEQ ID NO：63的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：21碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB576”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：63：GTGAACATAC CTTATGTTGC C                        21(2) SEQ ID NO：64的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：16碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB577”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：64：GTTGCCTCGG CGGATC                              16(2) SEQ ID NO：65的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：16碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB578”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：65：CCGCGACGAT TACCAG                              16(2) SEQ ID NO：66的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：21碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB538”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：TGACGACTCT AAACCCTACC A                        21(2) SEQ ID NO：67的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：21碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB539”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：67：CGACGACTCT AAACCTTACC G                        21(2) SEQ ID NO：68的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物W130”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：68：ATTCAAGGGT GGAGGTCTGA                           20(2) SEQ ID NO：69的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：20碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物R130”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：69：ATTCAAGGGT GGAGGTCTGG                           20(2) SEQ ID NO：70的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：15碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB539’15”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：70：CTCTAAACCC TACCA                               15(2) SEQ ID NO：71的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：15碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB539’15”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：71：CTCTAAACCT TACCG                               15(2) SEQ ID NO：72的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：15碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB553”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：GTGGTCCTCT GGCAG                               15(2) SEQ ID NO：73的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：15碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/dcsc＝“寡核苷酸引物JB554”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：73：CTCAACAGCC GAAGC                               15(2) SEQ ID NO：74的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：14碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB555”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：74：GGGTGGAGGT CTGA                                 14(2) SEQ ID NO：75的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：13碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB556”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：75：GGTGGAGGTC TGG                                  13(2) SEQ ID NO：76的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：15碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/des＝“寡核苷酸引物JB561”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：76：TGGAGGTCTG GACCA                                15(2) SEQ ID NO：77的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：15碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB562”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：77：TGGAGGTCTG AACCA                                15(2) SEQ ID NO：78的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：15碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB559”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：78：AGGGTGGAGG TCTGA                                15(2) SEQ ID NO：79的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：15碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB560”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：79：AGGGTGGAGG TCTGG                                15(2)SEQ ID NO： 80的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：15碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB557”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：80：TTCTCCGAGA GGCCT                                15(2) SEQ ID NO：81的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：15碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
    (A)描述：/desc＝“寡核苷酸引物JB558”
(iii)假定：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：81：TTCTCCGAGA GGCCC                                15(2) SEQ ID NO：82的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：504碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(iii)假定：无
(ix)特征：
    (A)名称/关键词：misc-特征
    (B)位置：1..504
    (D)其它信息：/注＝“大刀镰孢内部转录间隔区的DNA序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：82：GAGGGATCAT TACCGAGTTT ACTRACTCCC AAACCCCTGT GAACDTACCT TATGTTGCCT        60CGGCGGATCA GCCCGCGCCC CGTAAAAAGG GACGGCCCGC CGCAGGAACC CTAAACTCTG       120TTTTTAGTGG AACTTCTGAG TATAAAAAAC AAATAAATCA AAACTTTCAA CAACGGATCT       180CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC AAAATGCGAT AAGTAATGTG AATTGCAGAA       240TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCG CCAGTATTCT GGCGGGCATG       300CCTGTTCGAG CGTCATTTCA ACCCTCAAGC CCAGCTTGGT GTTGGGAGCT GCAGTCCTGC       360TGCACTCCCC AAATACATTG GCGGTCACGT CGRAGCTTCC ATAGCGTAGT AATTTACATA       420TCGTTACTGG TAATCGTCGC GGCYACGCCG TTAAACCCCA ACTTCTGAAT GTTGACCTCG       480GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAA                     504(2) SEQ ID NO：83的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：503碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(iii)假定：无
(ix)特征：
    (A)名称/关键词：misc-特征
    (B)位置：1..503
    (D)其它信息：/注＝“禾本科镰孢内部转录间隔区的DNA序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：83：GGATCATTAC CGAGTTTACW SACTCCCAAA CCCCTGTGAA CATACCTTAT GTTGCCTCGG        60CGGATCAGCC CGCGCCCCGA AAGGGACGGC CCGCCGCAGG AACCCTAAAC TCTGTTTTTA       120GTGGAACTTC TGAGTATAAA AAACAAATAA ATCAAAACTT TCAACAACGG ATCTCTTGGT       180KCTGGCATCG ATGAAGAACG CASCRAAATG CGATAAGTAA TGTGWATTGC AGAATTCAGT       240GAATCAWCGA ATCTTTGAAC GCWSATTGCK MCCRCCAGTA TTCTGGCGGG CATGCCTGTT       300CGAGCGTCAT TTCAACCCTC AAGCCCAGVT TGGTGTKGGG GARYTGCAGK CCTRYTKCAC       360TCCCCAAATA ARTTGGCGGT CACGTCGAAC TTCCATAGCG TAGTAAGTTA CACATCGTTA       420CTGGTAATCG TCGCGGCTAC GCCGTTAAAC CCCAACTTCT GAATGTTGAC CTCGGATCAG       480GTAGGAATAC CCGCTGAAGG TAA                                               503(2) SEQ ID NO：84的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：353碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(iii)假定：无
(ix)特征：
    (A)名称/关键词：misc-特征
    (B)位置：1..353
    (D)其它信息：/注＝“串球镰孢内部转录间隔区的DNA序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：84：TCCGTAGGTG AACCTGCGGA TAGGRGTCAT TASMGAGTTT ACWACTSCCA AACCCCTGTG        60AAYATACCTT ATGTTGCSTC GGCGGATCAG CCCGCGCSCC GTARRAAGGG ACGGCCCGCC       120GCAGGAACCC TAAACTCTGT TTTTAGTGGA ACTTCTGAGT ATAAAAAACA AATAAATCAA        180AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCA AAATGCGATA        240AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGYGMCCGC        300CAGTATTCTG GCGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCAA CCCTCAAGCC CAG               353(2) SEQ ID NO：85的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：545碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：基它核酸
(iii)假定：无
(ix)特征：
    (A)名称/关键词：misc-特征
    (B)位置：1..545
    (D)其它信息：/注＝“雪小球丝孢菌内部转录间隔区的DNA序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：85：GCGGATCATT ACAGAGTTGC AAAACTCCCT AAACCATTGT GAACGTTACC TATACCGTTG        60CTTCGGCGGG CGGCCCCGGG GTTTACCCCC CGGRAGYCCC TGGKMCCCAC CGCGGGSGCC       120MGCCGGAGGT CACCAAACTC TTGATAATTT ATGGCCTCTC TGAGTCTTCT GTACTGAATA       180AGTCAAAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG TTCTGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT       240GCGATAAGTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGC       300GCCCGCCAGC ATTCTGGCGG GCATGCCTGT TCGAGCGTCA TTTCAACCAT CAAGCCCCCG       360GGCTTGTGTT GGGGACCTRC GGCTGCCGCA GGCCCTGAAA AGCAGTGKCG GGCTCGCTGT       420CGCACCGAGM GTAGTAGSAT ACATCTCGCT CTGGTCGCGC CGCGGGTTCC GGCCGTTAAA       480CCACCTTTTT AACCCAAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGA AGACCCGCTG AACTTACGCA       540TATCA                                                                   545(2) SEQ ID NO：86的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：563碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链度：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：其它核酸
(iii)假定：无
(ix)特征：
   (A)名称/关键词：misc-特征
   (B)位置：1..563
   (D)其它信息：/注＝“莜麦壳针孢霉，小麦型种ATCC#26380(satits con)内部转录间隔区的DNA序列”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：86TCCCGTAGGT GAACCTGCGG AAGGATCATT ACACTCAGTA GTTTACTACT GTAAAGGAGG         60CTGTTAGTCT GTATAGCGCA AGCTGATGAG CAGCTAGCCT CTTTTATCCA CCCTTGTCTT        120TTGCGTACCC ACGTTTCCTC GGCAGGCTTG CCTGCCGATT GGACAAACCT ATAACCTTTT        180TAATTTTCAA TCAGCGTCTG AAAAACTTAA TAATTACAAC TTTCAACAAC GGATCTCTTG        240GTTCTGGCAT CGATGAAGAA CGCAGCGAAA TGCGATAAGT AGTGTGAATT GCAGAATTCA        300GTGAATCATC GAATCTTTGA ACGCACATTG CGCCCCTTGG TATTCCATGG GGCATGCCTG        360TTCGAGCGTC ATTTGTACCC TCAAGCTCTG CTTGGTGTTG GGTGTTTGTC CTCTCCCTAG        420TGTTTGGACT CGCCTTAAAA TAATTGGCAG CCAGTGTTTT GGTAYTGAAG CGCAGCACAA        480GTCGCGATTC TTATCAAATA CTTGCGTCCA CAAGCCCTTT TTTAACTTTT GACCTCGGAT        540CAGGTAGGAG ACCGCTGACT TAA                                                563

Claims (22)

1.编码间插转录序列(Intervening Transcribed Sequence)的DNA，它选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85和SEQ IDNO：86。
2.用于真菌间插转录序列的扩增检测的寡核苷酸引物，其中所说的引物得自权利要求1的DNA序列。
3.根据权利要求2的寡核苷酸，其中所说的引物选自SEQ IDNO：7-37和50-65。
4.用于真菌间插转录序列的扩增检测的寡核苷酸引物对，其中至少一种选自SEQ ID NO：7-37和50-65。
5.根据权利要求4的寡核苷酸引物对，其中一种引物选自SEQID NO：7-37和50-65，另一种引物选自SEQ ID NO：38-41。
6.根据权利要求4的寡核苷酸引物对，其中所说的引物对选自表4的引物对。
7.根据权利要求4的寡核苷酸引物对，其中所说的引物对选自SEQ ID NO：7和8。
8.根据权利要求5的寡核苷酸引物对，其中所说的引物对选自：
(a)SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：9；
(b)SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：38；
(c)SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：41；
(d)SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：38；
(e)SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：41；
(f)SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：38；
(g)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：19；
(h)SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：22；
(i)SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20；
(j)SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：41。
9.用于鉴定真菌病原菌的寡核苷酸引物，其中所说的引物选自SEQ ID NO：42-46。
10.检测真菌病原菌的方法，它包括以下步骤：
(a)从被病原菌感染的植物叶中分离DNA；
(b)利用所说DNA作为模板的聚合酶链反应并使用权利要求4或5的引物对，扩增所述病原菌的间插转录区的部分；和
(c)目测所述的间插转录区的扩增部分。
11.根据权利要求10的方法，其中所说的真菌病原菌选自颖枯壳针孢、小麦壳针孢、蔓毛假小尾孢、菲济球腔菌、乐音球腔菌、大刀镰孢、禾本科镰孢、雪小球丝孢菌和串珠镰孢。
12.根据权利要求10的方法，其中所说的蔓毛假小尾孢选自W菌株和R菌株。
13.检测真菌病原菌的方法，它包括以下步骤：
(a)从被病原菌感染的植物叶中分离DNA；
(b)利用至少一种权利要求9的引物对所述DNA进行聚合酶链反应扩增；和
(c)目测所述聚合酶链反应扩增产物。
14.一种试剂盒，它包括一种被隔开的载体，用于接受密封在其中的一个或多个容器装置，一个该容器装置含有权利要求2的引物。
15.一种试剂盒，它包括一种被隔开的载体，用于接受密封在其中的一个或多个容器装置，一个该容器装置含有权利要求3的引物。
16.一种试剂盒，它包括一种被隔开的载体，用于接受密封在其中的一个或多个容器装置，一个该容器装置含有权利要求4的引物。
17.一种试剂盒，它包括一种被隔开的载体，用于接受密封在其中的一个或多个容器装置，一个该容器装置含有权利要求5的引物。
18.一种试剂盒，它包括一种被隔开的载体，用于接受密封在其中的一个或多个容器装置，一个该容器装置含有权利要求13的引物。
19.用于检测真菌病原菌的定量比色检测法，它包括(a)从被病原菌感染的植物叶中分离出DNA；(b)在聚合酶链反应中扩增该病原菌的DNA区；和(c)目测该间插转录区的扩增部分，
其中所述的改进包括利用作为诊断引物的权利要求4的引物对作为模板从该病原菌的间插转录区部分扩增所述的DNA，并利用一捕获引物目测该扩增部分，其中所说的捕获引物选自表5的引物。
20.根据权利要求19的检测法，其中所说的诊断引物选自SEQID NO：10和9，捕获引物为SEQ ID NO：39。
21.根据权利要求19的检测法，其中所说的诊断引物选自SEQID NO：18和20，且捕获引物为SEQ ID NO：71。
22.根据权利要求19的检测法，其中所说的诊断引物选自SEQID NO：15和19，且捕获引物为SEQ ID NO：71。
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