CN1496410A - 方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术，优选利用等位基因特异性扩增技术如扩增受阻突变系统(ARMS)或优选利用等位基因选择性杂交探针技术如Molecular Beacons或TaqMan，检测真菌中对应于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的一个或多个细胞色素b突变的诊断方法，该细胞色素b突变引起了对嗜球果伞素类似物或相同的交叉抗药性组中化合物的抗药性。本发明也涉及用在本发明方法中的突变特异寡核苷酸，及含有这些寡核苷酸的诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及利用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术，优选利用等位基因特异性扩增技术如扩增不应突变系统(ARMS)或优选利用等位基因选择性杂交探针技术如Molecular Beacons或TaqMan，检测真菌中对应于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的一个或多个细胞色素b突变的诊断方法，该细胞色素b突变引起了对嗜球果伞素类似物或在相同的交叉抗药性组中的化合物的抗药性。本发明也涉及用在本发明方法中的突变特异寡核苷酸，及含有这些寡核苷酸的诊断试剂盒。
背景技术
杀真菌剂在农业中的广泛应用是相对近代的现象，在过去40年期间发生了大部分重要进展。以前，农民常常忽视或没有认识到真菌病原体对他们农作物产量和质量的影响。然而，现今这些损失是不可接受的，农民依靠杀真菌化学药剂的应用控制真菌疾病。结果，商品化的杀真菌剂已经变成了整个农用化学品商业的重要部分，1996年全世界的销售约是59亿美元，相当于整个农用化学品市场的18.9％(WoodMackenzie，1997a‘Agchem products-The key agrochemical productgroups’，in Agrochemical Service，Update of the ProductsSection，1997年5月，1-74)。农民已经可以得到大量的杀真菌剂；最近版本的The Pesticide Manual(Tomlin，1994第10版，BritishCrop Protection Council，Farnham，UK，和the Royal Society ofChemistry，Cambridge，UK)包含目前使用的158种不同杀真菌活性组分。然而，目标是新化合物发现和开发的进一步工业研究是极其深入细致的，并且产品管理程序在确保具有特定作用方式和/或属于特定化合物系列的杀真菌剂的最好和最长持久效能方面极其重要。特别地，当引入具有新作用方式的杀真菌剂时，研究开发有效的抗药性处理策略至关重要(Fungicide Resistance Management：Into The NextMillenium(Russell)1999，in Pesticide Outlook，1999年10月(213-215)。
嗜球果伞素类似物组成了主要新系列的农业杀真菌剂，认为其是自从20世纪70年代1，2，4-三唑发现以来农业杀真菌剂史上最激动人心的发展。
嗜球果伞素类似物的杀真菌活性是它们能抑制真菌中线粒体呼吸的结果。更具体地，已经证实这些化合物有新的单点作用方式，通过阻断泛醌醇(ubiquinol)：细胞色素c氧化还原酶复合物(细胞色素bc1)发挥它们对真菌的作用，因此在真菌细胞中降低了高能ATP的产生(Becker等，1981 FEBs Letts.132：329-33)。该族抑制剂阻止了多聚体细胞色素b蛋白质上泛醌氧化还原位点Qo的电子传递(Esposti等，1993 Biochim.et Biophys Acta 1143(3)：243-271)。不同于许多线粒体蛋白质，细胞色素b蛋白质是线粒体编码的。
文献报道表明在细胞色素b靶位点特定氨基酸的改变能影响嗜球果伞素类似物的活性。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(此后称为：S.cerevisiae)(JP Rago等，1989 J.Biol.Chem.264：14543-14548)，小鼠(Howell等，1988 J.Mol.Biol.203：607-618)，Chlamydomonas reinhardtii(Bennoun等，1991 Genetics 127：335-343)和红细菌(Rhodobacter spp)(Daldal等，1989 EMBOJ.8(13)：3951-3961)中已经进行了深入的诱变研究。研究了在海胆Paracentrotus lividus(Esposti等，1990 FEBS 263：245-247)和担子菌真菌Mycena galopoda和Strobilurus tenacellus(Kraiczy等，1996 Eur.J.Biochem.235：54-63)(两者都产生了嗜球果伞素类似物的天然变异体)中对嗜球果伞素类似物抗药性的天然基础，从该研究中收集了相关信息。存在两个不同的细胞色素b基因区域，其中氨基酸改变对嗜球果伞素类似物的活性有显著的作用。这些区域包含氨基酸残基125-148和250-295(根据酿酒酵母(S.cerevisiae)残基编号系统)。更精确地，已经表明在残基126，129，132，133，137，142，143，147，148，256，275和295的氨基酸改变引起了对嗜球果伞素类似物的抗药性(Brasseur等，1996 Biochim.Biophys.Acta 1275：61-69和Esposti等，(1993)Biochimica etBiophysica Acta，1143：243-271)。
公开的国际专利申请号WO 00/66773描述了真菌细胞色素b基因中突变的鉴定，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基143位置引起了编码的蛋白质中甘氨酸到丙氨酸的置换(G143A)。本发明第一次鉴定了重要植物病原真菌田间分离物细胞色素b基因中其它突变的至关重要性，所述重要植物病原真菌显示了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中的化合物的抗药性。
发明概述
根据本发明第一方面，现在我们提供了检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的方法，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中的氨基酸置换，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括利用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术鉴定真菌核酸中所述突变的存在或缺乏。
根据本发明第一方面的优选实施方式，现在我们提供了检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的方法，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性，所述方法包括利用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术鉴定真菌核酸中所述突变的存在或缺乏。
在本发明中，现在我们发明了基于单核苷酸多态性检测方法，包括等位基因特异性扩增，检测真菌细胞色素b基因中一个或多个点突变的诊断方法。根据本发明，本领域技术人员知晓大量分析方法，所述分析方法可以用于检测在一个或多个多态位置变异核苷酸的存在或缺乏。一般地，等位基因变异的检测需要突变辩别技术，可选的扩增反应和可选的信号产生系统。Nollau等，Clin.Chem.43：1114-1120，1997和在标准教科书，例如‘Laboratory Protocols forMutation Detection’，U.Landegren编辑，Oxford University Press，1996及‘PCR’第二版，Newton和Graham，BIOS Scientific Publisherslimited，1997中综述了许多当前用于等位基因变异检测的方法。等位基因特异扩增反应包括基于引物的方法如基于PCR的方法，更具体地，等位基因特异性聚合酶链式反应(PCR)延伸(ASPCR(allelespecific polymerase chain reaction extension))。一种这样的ASPCR方法是ARMS(扩增不应诱变系统(Amplification RefractoryMutagenesis System))。在美国专利号5639611中描述了ASPCR技术，并且在欧洲专利号EP 332435中充分描述了ARMS技术。
所有这些基于PCR的方法都适合用于本发明方法中，并且特别优选基于ARMS的方法的应用。本发明方法也包括使用非辩别性PCR，接着是产生的扩增子的特异探测。
所有这些方法都适合于特异性等位基因的检测，其中该等位基因赋予了对任何嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性，而且已经研究开发了用于点突变检测的Robust试验，该点突变在众多真菌植物病原体中赋予了这种抗性。当对一个化合物的抗性机理也赋予了对另外一个化合物的抗性时，即使作用方式不同，可以认为化合物处在相同的交叉抗药性组中。
可以用在这里描述的本发明任何方面中的检测一个或多个突变的其它单核苷酸多态性(SNP)检测技术包括，例如限制性片段长度多态性(RFLP)，单链构象多态性，多克隆分析(multiple clonalanalysis)，等位基因特异寡核苷酸杂交，单核苷酸引物延伸(Singlenucleotide primer extension)(Juvonen等，(1994)Hum Genet 9316-20；Huoponen等，(1994)Hum Mutat 3 29-36；Mashima等，(1995)，Invest Opthelmol.Vision.Sci 36，1714-20；Howell等，(1994)AmJ Hum Genet.55 203-206；Koyabashi等，(1994)Am.J.Hum.Genet.55 206-209；Johns和Neufeld(1993)Am J Hum Genet 53 916-920；Chomyn等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89 4221-4225)和InvaderTM技术(从Third Wave Technologies Inc.502 South RosaRoad，Madison，WI 53719 USA可得到)。
基于PCR的检测系统的应用对于在这里所述的本发明所有方面和实施方式是优选的。常常与基于PCR的靶DNA片段扩增联合使用的等位基因选择性杂交探针技术也是这里所述的本发明所有方面和实施方式优选的。
在本发明第一方面的优选实施方式中，现在我们提供了检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的诊断方法，该突变引起了编码蛋白质中F129L置换，其中所述突变的存在引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的真菌抗性，所述方法包括检测PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在适当核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品，其中所述扩增子的检测与所述核酸中所述突变的存在或缺乏直接相关。
PCR反应期间产生的扩增子的检测可以直接依赖突变存在所特异的引物的延伸，即其中引物延伸依赖突变的存在，因此，仅仅当存在突变时，引物结合和/或被延伸时才产生扩增子(如用ARMS技术的情况)，类似地，它可以直接依赖突变缺乏所特异的引物(例如野生型序列)的延伸，或者可以直接与含有突变DNA序列的PCR延伸产物连接，即其中检测的是含有突变DNA序列的扩增子。特别优选第一个替代方案。在利用了等位基因选择性扩增的本发明上述方法中，所述诊断方法包括检测PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在适当核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品，其中所述扩增子的产生与所述核酸中所述突变的存在或缺乏直接相关。
扩增子可以来源于任何PCR循环，而且这包括第一个等位基因特异引物延伸产物。
在可替代的优选实施例中本发明方法利用等位基因选择性杂交探针技术如Molecular Beacons或TaqMan(如本文所述，参见实施例18)。
在本发明第一方面特别优选的实施方式中，现在我们提供了检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的诊断方法，该突变引起了编码蛋白质中F129L置换，其中所述突变的存在引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的真菌抗性，所述方法包括在适当核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用适于在编码蛋白质中引起F129L置换的突变的诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品，这样当在样品中存在引起了编码蛋白质中F129L置换的突变时或当野生型序列存在时，诊断引物被延伸；和通过参照诊断引物延伸产物的存在和缺乏检测所述突变的存在和缺乏。
在本发明进一步优选实施方式中提供了检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的方法，该突变引起了编码蛋白质中F129L置换，其中所述突变的存在引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的真菌抗性，所述方法包括在适当核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用针对特定突变的诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品，这样当在样品中存在所述突变时，诊断引物被延伸；和通过参照诊断引物延伸产物的存在和缺乏检测所述突变的存在和缺乏。
根据本发明第一方面特别优选的实施方式，现在我们提供了检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的方法，该突变引起了编码蛋白质中F129L置换，其中所述突变的存在引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的真菌抗性，所述方法包括在适当核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用针对特定突变的诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品，这样仅仅当样品中存在所述突变时，诊断引物才被延伸；通过参照诊断引物延伸产物的存在和缺乏检测突变的存在和缺乏。
这里所用术语诊断引物用于表示特别用于鉴定突变或野生型序列存在或缺乏的引物，术语普通引物表示与诊断引物所结合链相对的DNA链结合的引物，位于诊断引物识别区域的3’，并且通过普通引物与诊断引物一起作用允许在PCR过程中扩增居间DNA序列段。如果诊断引物是ARMS引物，当与突变体或野生型序列比较时，它可以有3’错配。
在本发明这个和进一步的方面和实施方式中，优选用检测系统检测引物延伸产物的延伸，该检测系统是诊断引物或相对链上普通引物的组成部分。可替代地，如果Taqman或TaqmanMGB探针与诊断引物和普通引物一起使用，Taqman或TaqmanMGB探针将包括检测手段。这里更充分地描述了这些。
当对一个化合物的抗性机理也赋予了对另外一个化合物的抗性时，即使作用方式不同，可以认为化合物处在相同的交叉抗药性组中。嗜球果伞素类似物和在相同交叉抗药性组中的化合物包括例如，腈嘧菌酯(azoxystrobin)，picoxystrobin，亚胺菌(kresoxim-methyl)，trifloxystrobin，pyraclostrobin，噁唑酮菌(famoxadone)和fenamidone(pyraclostrobin的详情参见2000年11月的BCPCConference in Brighton-参见摘要5A-2)。也应该注意到因为嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中的化合物对复合物IIIQo位点的作用，所以现在常常称它们为Qo位点抑制剂(QoIs)。
在抗嗜球果伞素类似物植物病原真菌的野外分离物中，我们发现了真菌编码细胞色素b的核酸中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)序列细胞色素b中第129个密码子/氨基酸的位置是对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的真菌抗性的关键决定因素。这里描述的本发明方法特别适于检测与编码酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129位置对应位置的突变，其中由另一个氨基酸置换了编码的苯丙氨酸残基，该另一个氨基酸阻止嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的活性，并且在携带有突变体细胞色素b基因的真菌中引起抗性表型，由此引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗性。
优选地，该方法用于突变的检测，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了所述苯丙氨酸残基被选自异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，酪氨酸的氨基酸置换。最优选待检测的突变引起了亮氨酸置换苯丙氨酸残基。
引起了编码蛋白质中F129L置换的真菌细胞色素b基因的突变通常是在密码子第一位(碱基)从胸腺嘧啶到胞嘧啶碱基的改变，或者是在密码子第三位(碱基)从胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤碱基的改变，并且对于这里所述本发明的所有方面和实施方式优选检测这些单核苷酸多肽性。进一步，也可能出现在密码子第一位从胸腺嘧啶到胞嘧啶的改变和在密码子第三位(碱基)从胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤碱基的改变的稀有联合，本发明所有方面和实施方式包括了这些。
应该注意在本专利申请中常引述赋予了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物抗性的细胞色素b基因的突变和等位基因变异体(等位基因)。这种引述基本上是同义的，尽管术语突变倾于暗示新或近的基因改变，而等位基因变异体暗示被分析的种群中基因的替代形式，在这里也是赋予抗性的形式，已经存在了一些时间。在天然种群分析期间，这些替换物是不可区分的。
应该注意，细胞色素b蛋白质的野生型和突变体/等位基因变异体形式特性差异的本性需要在各呼吸作用复合物III种类所谓的Qo位点内进行氨基酸置换，该呼吸作用复合物III种类部分地由细胞色素b蛋白质组成，其中赋予对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物抗性的基因编码所述细胞色素b蛋白质。通过改变的氨基酸的密码子变化引起了这种氨基酸置换。典型地，以及在这里所考虑的特定实施例中，通过该密码子中三个核苷酸残基中仅一个核苷酸残基的变化引起目的氨基酸置换。因此，可以描述这种变化为单核苷酸多态性(SNPs)。
偶尔地，因为遗传密码的简并性，两个紧密连接(在3个核苷酸内)的置换也可以引起由单核苷酸多态性引起的氨基酸置换。这里称这种情形为“简单核苷酸多态性(simple nucleotide polymorphisms)”。根据它们的性质，预测这种多态性比SNPs更罕见，因为发生这种多态性所需的序列变化需要相同密码子内至少两个单独的碱基变化，而不仅仅是一个碱基变化。
这里所用术语F129L用于意指真菌细胞色素b序列中，在与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞色素b序列第129个密码子/氨基酸位置等同的位置，用亮氨酸残基置换苯丙氨酸残基。这种命名用于这里引用的所有其它残基变化，即相对于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞色素b蛋白质序列引用所有的位置。从EMBL和SWISSPROT数据库(参见，EMBL记录号：X84042和SWISSPROT记录号：P00163)可得到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞色素b基因和蛋白质序列。本领域技术人员将理解由于氨基或羧基末端和/或一个或多个内部缺失或插入的结果，不同物种来源的等同蛋白质的精确长度和记录(register)可以变化。然而，因为含有与酿酒酵母(S.cerevisiae)中F129对应的残基的氨基酸序列段非常保守(Widger等，Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.81(1984)674-678)，所以在本领域技术人员能力范围内，通过视觉观察或几个序列对齐程序(包括Megalign或Macaw)之一的应用，在新获得的真菌细胞色素b序列中鉴定精确地对应的残基是显而易见的和容易的。尽管在本发明申请中称为F129(因为位置和功能等同)，但是在新细胞色素b中该苯丙氨酸的精确位置可以不是从其氨基末端开始的第129个残基。在SWISSPROT记录号：P00163中提供了酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b共有序列。这里描述的本发明所有方面和实施方式中，优选相对于EMBL记录号：X84042中提供的酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b序列定义细胞色素b序列中的位置。可替代地，这里描述的本发明所有方面和实施方式中，优选相对于SWISSPROT记录号：P00163中提供的酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b共有序列定义细胞色素b序列中的位置。
根据本发明的一个方面，提供了真菌细胞色素b基因中一个或多个核苷酸多态性的诊断方法，该方法包括在与三联体一个或多个碱基对应的位置确定真菌核酸的序列，其中该三联体编码细胞色素b蛋白质中在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，并且通过参照细胞色素b基因中一个或多个多态性，确定真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物的抗药性状态。
在这里描述的本发明所有方面和实施方式中，优选三联体中仅一个碱基显示了突变，即仅在一个位置有单核苷酸多态性出现，其中该三联体编码细胞色素b蛋白质中在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，并且进一步优选突变在三联体的第一或第三个碱基。
根据本发明这个方面的优选实施方式，提供了在真菌细胞色素b基因中单核苷酸多态性的诊断方法，该方法包括在与三联体第一或第三个碱基对应的位置确定真菌核酸的序列，其中该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，并且通过参照细胞色素b基因中的多态性，确定所述真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物抗药性状态。
在本发明上述方面的一个实施方式中，这里描述的诊断方法是这样的诊断方法，其中在DNA中对应于三联体第一或第三个碱基的位置的单核苷酸多态性是在密码子第一个碱基出现T或C，在密码子第三个碱基出现T，C，A或G，其中该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
表1：编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子序列
| 第一个位置 | 第二个位置 | 第三个位置 |
| T | ||
| T | Phe | T |
| Phe | C | |
| Leu | A | |
| Leu | G | |
| G | Leu | T |
| Leu | C | |
| Leu | A | |
| Leu | G |
在野生型细胞色素b中，如果在129位置的苯丙氨酸残基是TTT或TTC密码子编码的，那么在密码子第一位置突变为C(胞嘧啶)的单碱基突变将引起在嗜球果伞素抗药性突变体的Qo位点苯丙氨酸残基的置换。同样地，如果在野生型细胞色素b中，在129位置的苯丙氨酸残基是TTT或TTC密码子编码的，那么在密码子第三个位置突变为A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)的单碱基突变在嗜球果伞素抗药性突变体的Qo位点将引起苯丙氨酸残基的置换。第一位置的置换(从T到C)连同第三位置的置换(从T或C到A或G)的双置换也可能引起这种苯丙氨酸到亮氨酸的置换(参见表1)。
为了确定是否作为在129位置亮氨酸残基存在的结果特定的植物病原体或植物病原体群体对Qo位点抑制剂杀真菌剂是抗性的或含有显著水平的抗性等位基因，只需确定和/或测定是否病原体或群体在其相关密码子的第一位置有C残基和/或在第三位置有A或G残基。完成这种评估的一个方法是利用基于诊断引物如ARMS引物的技术。(在Newton等，Nucleic Acid Research 17(7)2503-2516 1989中充分描述了ARMS引物的概念)。
作为上述苯丙氨酸和亮氨酸密码子特征(参见表1)的结果，当利用ARMS技术检测和/或测定残基129的状态时，可能设计适合的PCR引物，该PCR引物具有确定病原体细胞色素b基因相关密码子第一或第三个位置特定残基身份和/或数量的能力。这种设计仅需要知道野生型序列。不需要知晓抗性由F129L突变引起的目的新真菌的抗性分离物。在表2中列出了相关植物病原真菌的一些例子。无论如何，该表不意指是唯一的。本领域的植物病理学家将能够容易地鉴定与本发明方法相关的那些真菌。
表2：可以测定F129L的物种例子
| 可以测定F129L的物种例子 | |
| 1 | 葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola) |
| 2 | 禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei) |
| 3 | 黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis) |
| 4 | 圆核腔菌(Pyrenophora teres) |
| 5 | 禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola) |
| 6 | Mycosphaerella fijiensis var.difformis |
| 7 | 苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea) |
| 8 | 葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator) |
| 9 | 禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola) |
| 10 | 瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum) |
| 11 | 盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides) |
| 12 | 番茄粉孢(Oidium lycopersicum) |
| 13 | 鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica) |
| 14 | 古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis) |
| 15 | 马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani) |
| 16 | Cercospora arachidola |
| 17 | 茄属丝核菌(Rhizoctonia solani) |
| 18 | 苹果黑星菌(Venturia inaequalis) |
| 19 | 蔓延疫霉(Phytophthora infestans) |
| 20 | Mycosphaerella musicola |
| 21 | Colletotrichum acutatum |
| 22 | Wilsonomyces carpophillum |
| 23 | Didymella bryoniae |
| 24 | Didymella lycopersici |
| 25 | Peronospora tabacina |
| 26 | 隐匿柄锈菌(Puccinia recondita) |
| 27 | 堀病柄锈菌(Puccinia horiana) |
这里描述的本发明方法在植物病原真菌，特别是下列任何真菌物种方面特别有用：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Pucciniarecondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)，并且最特别地在下列真菌物种方面特别有用：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe，graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola。
在本发明其它方面提供了检测真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物抗药性的方法，所述方法包括鉴定编码真菌细胞色素b蛋白质的真菌核酸中一个或多个突变的存在或缺乏，其中所述突变的存在引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性，所述方法包括鉴定单核苷酸多态性的存在或缺乏，该单核苷酸多态性出现在对应于三联体一个或多个碱基的位置，其中该三联体编码真菌细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在这个方面进一步优选实施方式中，本发明提供了检测真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物抗药性的方法，所述方法包括鉴定编码真菌细胞色素b蛋白质的真菌核酸中突变的存在或缺乏，其中所述突变的存在引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性，所述方法包括鉴定单核苷酸多态性的存在或缺乏，该单核苷酸多态性出现在对应于三联体第一和/或第三个碱基的位置，其中该三联体编码真菌细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明这方面优选实施方式中，用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术鉴定在对应于三联体第一和/或第三个碱基的位置的单核苷酸多态性的存在和缺乏，其中该三联体编码细胞色素b基因中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
本发明进一步提供了编码全部或部分野生型细胞色素b蛋白质的真菌DNA序列，其中所述DNA序列在野生型蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置编码苯丙氨酸残基，其中从真菌中可得到或获得所述的序列，所述真菌选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinulanecator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercosporaarachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomycescarpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)，优选地，选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)和堀病柄锈菌(Pucciniahoriana)。
根据本发明上述方面的真菌DNA序列优选在对应于三联体中一个或多个碱基(优选第三个碱基)的DNA位置的任一侧或两侧含有约30个核苷酸，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，因为这种核酸的范围提供了本领域技术人员设计用在这里所述的所有单核苷酸多态性检测技术中/与这里所述的所有单核苷酸多态性检测技术一起使用的物种和突变特异性试剂和/或方法必需的所有信息。这里所用术语约30意指序列可以包含不超过30个核苷酸，例如5个，多至10，15，20，或25个核苷酸，或可以包含多于30个核苷酸，例如约50个核苷酸，即达到35，40，45或50或更多个核苷酸。
与所有DNA和蛋白质序列有关的这里所用术语“全部或部分的”用于意指DNA序列或蛋白质序列或其片段。DNA或蛋白质片段可以例如是整个序列长度的10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或95％。
本发明也延及本发明DNA序列编码的新的蛋白质。
根据本发明，可以分析含有基因组(线粒体)DNA和cDNA的两种样品，这对本领域技术人员是显而易见的。对于样品含有基因组DNA的情况，当利用序列信息时，需要考虑内含子结构。在下表3中提供了包含根据本发明上述方面的部分野生型细胞色素b基因序列的野生型真菌DNA序列的例子，并且所述序列形成了本发明的另一个方面。
表3：一系列重要植物病原体的位于对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b序列129密码子的密码子两侧的野生型细胞色素b基因组和/或cDNA序列段(第一个和最后残基以粗体和下划线表示)
在上表中，三联体第一和第三个碱基是粗体和下划线形式，该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，所述第一和第三个碱基在被适当替换时引起可替代的氨基酸对正常苯丙氨酸残基的置换，其中所述的置换赋予了对嗜球果伞素类似物和相同交叉抗药性组内化合物的抗药性。
本发明也延及与表3中所述DNA序列显示了同源性或序列同一性的真菌DNA序列，并且包括例如在相同物种不同样品或分离物中发现的DNA序列的变异。这里变异可以，例如是因为可替代密码子使用的应用，改变的内含子/外显子线粒体组构和氨基酸置换而造成。
在本发明另一个方面提供了真菌DNA序列，其编码全部或部分真菌细胞色素b蛋白质，其中当与相应的编码细胞色素b蛋白质的野生型DNA序列对齐所述真菌DNA序列时，在对应于三联体一个或多个碱基的DNA位置观察到该真菌DNA序列含有单核苷酸多态性突变，其中该三联体编码该蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，所述单核苷酸多态性突变引起了可替代的氨基酸对正常苯丙氨酸残基的置换。
在本发明该方面的另一个优选实施方式中提供了编码全部或部分细胞色素b蛋白质的真菌DNA序列，其中当与相应的编码细胞色素b蛋白质的野生型DNA序列对齐所述真菌DNA序列时，在对应于三联体第一或第三个碱基的DNA位置观察到该真菌DNA序列含有单核苷酸多态性突变，其中该三联体编码该蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，所述单核苷酸多态性突变引起了可替代的氨基酸对正常苯丙氨酸残基的置换。
根据本发明上述方面的真菌DNA序列优选在对应于三联体中一个或多个碱基，优选对应于三联体中第三个碱基的DNA位置任一侧或两侧含有约30个核苷酸，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，因为这种核酸的范围提供了本领域技术人员设计用在所有单核苷酸多态性技术中的物种和突变特异性试剂和/或方法必需的所有信息。这里所用术语约30意指序列可以包含不超过30个核苷酸，例如5个，多达10，15，20，或25个核苷酸，或可以包含多于30个核苷酸。
本发明进一步提供了编码全部或部分突变体细胞色素b蛋白质的真菌DNA序列，其中在所述DNA中一个或多个突变的存在赋予了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组内化合物的抗药性，所述突变出现在对应于三联体一个或多个碱基的DNA位置，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
本发明该方面优选的实施方式中，进一步提供了编码全部或部分突变体细胞色素b蛋白质的真菌DNA序列，其中在所述DNA中突变的存在赋予了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组内化合物的抗药性，所述突变出现在对应于三联体第一或第三个碱基的DNA位置，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明上述方面，优选地，在对应于编码蛋白质中对应于酿酒酵母细胞色素b残基129的位置的氨基酸的三联体第一或第三个碱基的DNA位置出现的突变分别是胸腺嘧啶到胞嘧啶和胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤。
优选从选自葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophorateres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercosporaarachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomycescarpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)，优选地选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophorateres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola中的真菌可得到或得到根据本发明以上方面的编码全部或部分突变体细胞色素b蛋白质的真菌DNA序列，其中在所述DNA中一个或多个突变的存在赋予了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组内化合物的抗药性。
本发明也延及包含全部或部分表4中提供的序列的DNA序列，其中在对应于三联体第一碱基的DNA位置的残基是胞嘧啶残基，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。这些序列，包括包含表4所述序列的那些序列，形成了本发明的另一方面。
表4：植物病原体细胞色素b基因序列段，其中与蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b129残基的位置的密码子第一碱基对应的残基(粗体所示)是胞嘧啶残基，结果编码亮氨酸
本发明也延及包含全部或部分表5中提供的序列的DNA序列，其中在对应于三联体第三个碱基的DNA位置的残基是腺嘌呤残基，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。这些序列形成了本发明的另一方面。
表5：植物病原体细胞色素b基因序列段，其中与该蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b129残基的位置的密码子第三个碱基对应的残基(粗体所示)是腺嘌呤残基，结果编码亮氨酸
本发明也延及包含全部或部分表6中提供的序列的DNA序列，其中在对应于三联体第三个碱基的DNA位置的残基是鸟嘌呤残基，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。这些序列形成了本发明的另一方面。
表6：植物病原体细胞色素b基因序列段，其中与该蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b129残基的位置的密码子第三个碱基对应的残基(粗体所示)是鸟嘌呤残基，结果编码亮氨酸
本发明也延及包含全部或部分表7中提供的序列的DNA序列，其中在对应于三联体第一个碱基的DNA位置的残基是胞嘧啶，在相应密码子第三个碱基的残基是腺嘌呤，其中该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。这些序列形成了本发明的另一方面。
表7：植物病原体细胞色素b基因序列段，其中与该蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b129残基的位置的密码子第一碱基对应的残基(下划线所示)是胞嘧啶，相应密码子第三碱基处的粗体表示的残基是腺嘌呤，结果编码亮氨酸
| 物种 | 序列 |
| 葡萄生单轴霉(cDNA和基因组) | 5’TTATGGTGTTCAGGGGTAATTATTTTTATTTTAATGATGGCGACTGCA CTAATGGGTTATG 3’ |
| 黑麦喙孢(cDNA和基因组) | 5’GTATGAACAATAGGTACATTTATATTCATATTAATGATCGTTACAGCA CTATTGGGTTATG 3’ |
| 圆核腔菌(cDNA) | 5’GTATGAACTATTGGTACTGTTATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGCC CTACTGGGTTACG 3’ |
| 圆核腔菌(基因组) | 5’CGCTATACAGATAAATTTAGGTTGTAGTTAGCCGGAACTTAGACAGCC CTACTGGGTTACCAACATAGCCCAAAATGGTTTAATATAAGTAATAAAAAAAG 3’ |
| 禾生球腔菌(cDNA和基因组) | 5’ACATGAACAATCGGTACTATAATACTAGTTCTGATGATGGCAACCGCA CTATTAGGGTATG 3’ |
| Mycosphaerella fijiensis var.difformis(cDNA和基因组) | 5’GTATGAGTTATAGGTACTATTATATTAGTTCTAATGATGGCAACTGCC CTATTAGGGTATG 3’ |
| 苍耳单丝壳菌(cDNA) | 5’CATTAGGTGTAGTTATATTCATATTAATGATCGTTACTGCA CTACTGGGTTATG 3’ |
| 葡萄白粉病钩丝壳霉(cDNA) | 5’CAATTGGTACAGTAATATTCATTTTAATGATGGCTACAGCA CTATTGGGTTATG 3’ |
| 禾生刺盘孢-Cgr1(基因组和cDNA) | 5’GTTTGAGTTATAGGTGCTATAATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTATTAGGGTATGTTTTACCTTACGGACAAATGTCATTATGAGGTGCTACAGT 3’ |
| 禾生刺盘孢-Cgr2(基因组和cDNA) | 5’GTTTGAGTTATAGGTTGTATAATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTATTAGGATATGTTTACCTTACGGACAAATGTCATTATGAGGTGCTACAGT 3’ |
| 禾生刺盘孢-Cgr3(cDNA) | 5’GTTTGAGTTATAGGTACTATAATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTACTGGGTTATGTTTTACCTTACGGACAAATGTCACTATGAGGTGCAACTGT 3’ |
| 禾生刺盘孢-Cgr3(基因组) | 5’GTTGAGTTATAGGTACTATAATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTACTGGGTTACTTCAACATAGCCCAAAATGATATGCAATTATTAGGATTTCA 3’ |
| 瓜果腐霉(基因组和cDNA) | 5’TTATGGTGTTCAGGTGTTGTTATTTTTATTTTAATGATGGCAACAGCT CTAATGGGTTTATG 3’ |
| 辣椒盘长孢状刺盘孢(基因组和cDNA) | 5’GTTTGAGTTATAGGTGCTATAATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTACTGGGTTATG 3’ |
| 芒果盘长孢状刺盘孢(基因组和cDNA) | 5’GTTTGAGTAATAGGTGCTATAATTCTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTATTGGGTTATGTTITACCTTACGGGCAAATGTCATTATGAGGTGCAACAGT 3’ |
| 番茄粉孢(cDNA) | 5’ACATGAACTATAGGTACAGTTATATTCATATTAATGATGGCTACAGCA CTACTGGGTTATG 3’ |
| 鞑靼内丝白粉菌-Lt1(cDNA) | 5’ACATGAACAATAGGTGTGGTMTATTTATATTAATGATGGCTACAGCT CTATTGGGTTATGTTTTACCGTACGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCAACAGT 3’ |
| 鞑靼内丝白粉菌-Lt4(cDNA) | 5’ACATGAACAATAGGTGTTGTAATATTTATATTAATGATGGCTACAGCT CTACTAGGTTACGTTTTACCATACGGACAAATGTCATTATGAGGTGCAACAGT 3’ |
| 鞑靼内丝白粉菌-Lt2(cDNA) | 5’ACATGAACTATTGGTGTTGTTATCTTTATATTAATGATGGCTACTGCC CTATTAGGATATGTTTTACCATATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGT 3’ |
| 鞑靼内丝白粉菌-Lt3(cDNA) | 5’ATGAACAATTGGTACAGTAATATTCATATTAATGATGGCTACTGCA CTACTGGGTTATGTTCTACCTTTCGGACAGATGTCGCTCTGGGGTGCAACCGT 3’ |
| 古巴假霜霉(cDNA和基因组) | 5’TTATGGTGTTCAGGTGTTATTATTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC CTTAATGGGTTATG 3’ |
| 马铃薯早疫病链格孢(cDNA和基因组) | 5’GTATGAACTATTGGTACTGTTATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGCT CTACTGGGTTATG 3’ |
| Cercospora arachidola(cDNA和基因组) | 5’TTATGATCTATTGGAGTTATAATTTTAGTTCTTATGATGGCAATAGCC CTATTAGGATATG 3’ |
| 茄属丝核菌(cDNA) | 5’CTATCGGAGTTGTTATGCTTGTTATGATGATGGGGATCGCA CTATTAGGTTATG 3’ |
| Mycosphaerella musicola(基因组和cDNA) | 5’GTATGAGTTATAGGTACTATTATATTAGTTCTAATGATGGCTACCGCC CTATTAGGATATG 3’ |
| Didymella bryoniae-Db1(cDNA) | 5’GTATGAACAATTGGTACTGTTATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGCT CTACTGGGTTATGTTCTTCCTTATGGGCAAATGTCATTATGAGGTGCAACTGT 3’ |
| Didymella bryoniae-Db2(cDNA) | 5’GTGTGAACAATTGGTACTGTTATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGCT CTACTGGGTTATGTGCTGCCCTACGGGCAGATGTCATTATGAGGTGCTACAGT 3’ |
| Didymella lycopersici(cDNA) | 5’GTATGAACAATTGGTACTGTTATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGCT CTACTGGGTTATGTTCTTCCTTATGGGCAAATGTCATTATGAGGTGCTACAGT 3’ |
本发明也延及包含全部或部分表8中提供的序列的DNA序列，其中在对应于三联体第一碱基的DNA位置的残基是胞嘧啶，在相应密码子第三碱基的残基是鸟嘌呤，其中该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。这些序列形成了本发明的另一方面。
表8：植物病原体细胞色素b基因序列段，其中与该蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b129残基的位置的密码子第一碱基对应的残基(下划线所示)是胞嘧啶，相应密码子第三碱基的粗体表示的残基是鸟嘌呤，结果编码亮氨酸
| 物种 | 序列 |
| 葡萄生单轴霉(cDNA和基因组) | 5’TTATGGTGTTCAGGGGTAATTATTTTTATTTTAATGATGGCGACTGCA CTGATGGGTTATG 3’ |
| 黑麦喙孢(cDNA和基因组) | 5’GTATGAACAATAGGTACATTTATATTCATATTAATGATCGTTACAGCA CTGTTGGGTTATG 3’ |
| 圆核腔菌(cDNA) | 5’GTATGAACTATTGGTACTGTTATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGCC CTGCTGGGTTACG 3’ |
| 圆核腔菌(基因组) | 5’CGCTATACAGATAAATTTAGGTTGTAGTTAGCCGGAACTTAGACAGCC CTGCTGGGTTACCAACATAGCCCAAAATGGTTTAATATAAGTAATAAAAAAAG 3’ |
| 禾生球腔菌(cDNA和基因组) | 5’ACATGAACAATCGGTACTATAATACTAGTTCTGATGATGGCAACCGCA CTGTTAGGGTATG 3’ |
| Mycosphaerella fijiensis var.difformis(cDNA和基因组) | 5’GTATGAGTTATAGGTACTATTATATTAGTTCTAATGATGGCAACTGCC CTGTTAGGGTATG 3’ |
| 苍耳单丝壳菌(cDNA) | 5’CATTAGGTGTAGTTATATTCATATTAATGATCGTTACTGCA CTGCTGGGTTATG 3’ |
| 葡萄白粉病钩丝壳霉(cDNA) | 5’CAATTTGGTACAGTAATATTCATTTTAATGATGGCTACAGCA CTGTTGGGTTATG 3’ |
| 禾生刺盘孢-Cgr1(基因组和cDNA) | 5’GTTTGAGTTATAGGTGCTATAATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTGTTAGGGTATGTTTTACCTTACGGACAAATGTCATTATGAGGTGCTACAGT3’ |
| 禾生刺盘孢-Cgr2(基因组和cDNA) | 5’GTTTGAGTTATAGGTTGTATAATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTGTTAGGATATGTTTTACCTTACGGACAAATGTCATTATGAGGTGCTACAGT 3’ |
| 禾生刺盘孢-Cgr3(cDNA) | 5’GTTTGAGTTATAGGTACTATAATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTGCTGGGTTATGTTTTACCTTACGGACAAATGTCACTATGAGGTGCAACTGT 3’ |
| 禾生刺盘孢-Cgr3(基因组) | 5’GTTTGAGTTATAGGTACTATAATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTGCTGGGTTACTCAACATAGCCCAAAATGATATGCAATTATTAGGATTTCA 3’ |
| 瓜果腐霉(基因组和cDNA) | 5’TTATGGTGTTCAGGTGTTGTTATTTTTATTTTAATGATGGCAACAGCT CTGATGGGTTATG 3’ |
| 辣椒盘长孢状刺盘孢(基因组和cDNA) | 5’GTTTGAGTTATAGGTGCTATAATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTGCTGGGTTATG 3’ |
| 芒果盘长孢状刺盘孢(基因组和cDNA) | 5’GTTTGAGTAATAGGTGCTATAATTCTTGTAGCTATGATGGGTATAGGT CTGTTGGGTTATGTTTTACCTTACGGGCAAATGTCATTATGAGGTGCAACAGT 3’ |
| 番茄粉孢(cDNA) | 5’ACATGAACTATAGGTACAGTTATATTCATATTAATGATGGCTACAGCA CTGCTGGGTTATG 3’ |
| 鞑靼内丝白粉菌-Lt1(cDNA) | 5’ACATGAACAATAGGTGTGGTAATATTTATATTAATGATGGCTACAGCT CTGTTGGGTTATGTTTTACCGTACGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCAACAGT 3’ |
| 鞑靼内丝白粉菌-Lt4(cDNA) | 5’ACATGAACAATAGGTGTTGTAATATTTATATTAATGATGGCTACAGCT CTGCTAGGTTACGTTTTACCATACGGACAAATGTCATTATGAGGTGCAACAGT 3’ |
| 鞑靼内丝白粉菌-Lt2(cDNA) | 5’ACATGAACTATTGGTGTTGTTATCTTTATATTAATGATGGCTACTGCC CTGTTAGGATATGTTTTACCATATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGT 3’ |
| 鞑靼内丝白粉菌-Lt3(cDNA) | 5’ATGAACAATTGGTACAGTAATATTCATATTAATGATGGCTACTGCA CTGCTGGGTTATGTTCTACCTTTCGGACAGATGTCGCTCTGGGGTGCAACCGT 3’ |
| 古巴假霜霉 | 5’TTATGGTGTTCAGGTGTTATTATTTTTATTTTAATGAT |
| (cDNA和基因组) | GGCAACAGCT CTGATGGGTTATG 3’ |
| 马铃薯早疫病链格孢(cDNA和基因组) | 5’GTATGAACTATTGGTACTGTATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGCT CTGCTGGGTTATG 3’ |
| Cercospora arachidola(cDNA和基因组) | 5’TTATGATCTATTGGAGTTATAATTTTAGTTCTTATGATGGCAATAGCC CTGTTAGGATATG 3’ |
| 茄属丝核菌(cDNA) | 5’CTATCGGAGTTGTTATGCTTGTTATGATGATGGGGATCGCA CTGTTAGGTTATG 3’ |
| Mycosphaerella musicola(基因组和cDNA) | 5’GTATGAGTTATAGGTACTATTATATTAGTTCTAATGATGGCTACCGCC CTGTTAGGATATG 3’ |
| Didymella bryoniae-Db1(cDNA) | 5’GTATGAACAATTGGTACTGTTATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGCT CTGCTGGGTTATGTTCTTCCTTATGGGCAAATGTCATTATGAGGTGCAACTGT 3’ |
| Didymella bryoniae-Db2(cDNA) | 5’GTGTGAACAATTGGTACTGTTATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGCT CTGCTGGGTTATGTGCTGCCCTACGGGCAGATGTCATTATGAGGTGCTACAGT 3’ |
| Didymella lycopersici(cDNA) | 5’GTATGAACAATTGGTACTGTTATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGCT CTGCTGGGTTATGTTCTTCCTTATGGGCAAATGTCATTATGAGGTGCTACAGT 3’ |
本发明也延及对所述含有所述多态性的DNA序列显示了同源性或序列同一性的真菌DNA序列，并且包括例如在相同物种不同样品中发现的DNA序列的变异。这些变异可以，例如是可替代密码子使用的应用，改变内含子/外显子组构和氨基酸置换造成的。
如这里所述的编码全部或部分野生型或突变体细胞色素b蛋白质的DNA序列优选是分离的形式。例如通过从与其天然存在的任何物质部分地纯化。该DNA序列是从这里公开的真菌可分离(可得到)或分离(获得)的。
可以在公开的国际专利申请号WO 00/66773中发现本文提供的野生型序列3’末端下游的进一步序列信息，这里并入该专利申请的教导以供参考。本文提供的序列信息和教导可以与公开的国际专利申请号WO 00/66773中的序列信息和教导一同使用以设计鉴定对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129和/或143的位置的突变存在和缺失的方法，并且本发明延及任何这种方法。
本发明进一步提供了计算机可读介质，其上存储有这里所述的和要求保护的任何序列，包括如这里所述的编码突变体细胞色素b蛋白质的DNA序列的全部或部分，所述蛋白质优选细胞色素b蛋白质序列，其中在等同于氨基酸残基129的位置的氨基酸残基是亮氨酸，所述氨基酸残基129残基处在等同于酿酒酵母(S.cerevisiae)残基129的位置，并且一个或多个突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何化合物的抗药性，所述突变出现在对应于如下三联体一个或多个碱基的DNA位置，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸；编码突变体细胞色素b蛋白质的DNA或突变体细胞色素b蛋白质的氨基酸序列的全部或部分，所述突变出现在对应于三联体一个或多个碱基的DNA位置，该三联体编码蛋白质中在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中所述蛋白质来自真菌并赋予真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物的抗药性，所述真菌选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Pucciniarecondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)，优选地选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinulanecator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola；编码真菌的野生型细胞色素b序列的DNA或该野生型细胞色素b序列的氨基酸序列的全部或部分，其中所述真菌选自下列真菌：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Pucciniarecondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)，优选地，选自引起真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物抗药性葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinulanecator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola；或任何等位基因特异寡核苷酸；这里公开的等位基因特异寡核苷酸探针，等位基因特异引物，普通或诊断引物。
例如，在同源性检索，作图，单元型分型(haplotyping)，基因型分型(genotyping)或任何其它生物信息学分析中可以利用计算机可读介质。可以利用任何计算机可读介质，例如光盘，磁带，软盘，硬驱动机或计算机芯片。
本发明多核苷酸序列，或其部分，特别是与这里鉴定的单核苷酸多态性有关和鉴定这里鉴定的单核苷酸多态性，尤其是与在编码的蛋白质中引起F129L改变的真菌细胞色素b中T到C(第一碱基)和/或T到A或G和C到A或G(第三碱基)的改变有关和鉴定所述这些改变的多苷酸序列，是有价值的信息资源。通过在计算机可读介质存储序列信息，然后在标准生物信息学程序中利用该信息，使得该信息资源的应用最容易便利化。本发明多核苷酸序列作为用于序列同一性和其它检索分析的数据库中的成分特别有用。如这里所用的，在计算机可读介质中序列信息的存储，和在与本发明多核苷酸和多核苷酸序列有关的序列数据库中的应用包括了可以被整理，转换或存储在有形媒介中，如计算机磁盘(优选以计算机可读形式)中的本发明多核苷酸任何可检测的化学或物理特性。例如，色谱扫描数据或峰值数据，照相扫描或峰值数据，质谱数据，序列凝胶(或其它)数据。
也提供了用于进行序列鉴定的基于计算机的方法，所述方法包括步骤：提供计算机可读媒介中的含有本发明多态性的多核苷酸序列，比较含有所述多态性的多核苷酸序列和至少一个其它多核苷酸或多肽序列以鉴定同一性(同源性)，即筛选多态性的存在。
本发明进一步提供了真菌细胞色素b蛋白质，该蛋白质赋予真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物的抗药性，其中在所述蛋白质中，由于在编码所述蛋白质的DNA中一个或多个突变的存在，所以改变了正常的苯丙氨酸残基，所述突变出现在对应于三联体第一和/或第三碱基的DNA位置，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明该方面的优选实施方式中进一步提供了真菌细胞色素b蛋白质，该蛋白质赋予真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物的抗药性，其中在所述蛋白质中，由于在编码所述蛋白质的DNA中突变的存在，所以改变了正常的苯丙氨酸残基，所述突变出现在对应于三联体第一或第三碱基的DNA位置，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在根据本发明上述方面的蛋白质中，优选地，由可替代的氨基酸置换蛋白质中的苯丙氨酸残基，所述的置换导致真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物显示了抗药性。
根据本发明上述方面，优选地，突变引起了选自异亮氨酸，亮氨酸，半胱氨酸，丝氨酸，缬氨酸，酪氨酸的氨基酸，最优选亮氨酸对所述苯丙氨酸残基的置换。
在本发明的另一个方面提供了具有识别所述突变体细胞色素b蛋白质能力的抗体。
在本发明另一方面提供了检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的方法，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸残基的置换，所述方法包括用任何或一种单核苷酸多态性检测方法鉴定真菌核酸样品中所述突变的存在或缺乏，其中所述单核苷酸多态性检测方法是基于对应于三联体一个或多个碱基的位置上游和/或下游约30到90个核苷酸的序列信息，该三联体编码野生型或突变蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明该方面进一步优选实施方式中提供了检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的方法，该突变在编码蛋白质中引起了F129L置换，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态性检测方法鉴定真菌核酸样品中所述突变的存在或缺乏，其中所述单核苷酸多态性检测方法基于对应于三联体第一或第三碱基的位置上游和/或下游约30到90个核苷酸的序列信息，该三联体编码野生型或突变体蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明该方面的进一步优选实施方式中提供了检测真菌细胞色素b基因中第一碱基胸腺嘧啶到胞嘧啶的突变和/或第三碱基胸腺嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤的突变或胞嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤的突变的方法，该突变在编码蛋白质中引起了F129L置换，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态性检测方法鉴定真菌核酸样品中所述突变的存在或缺乏，其中所述单核苷酸多态性检测方法基于对应于三联体第一或第三碱基的位置上游和/或下游约30到90个核苷酸的序列信息，该三联体编码野生型或突变体蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明该方面进一步特别优选的实施方式中提供了检测真菌细胞色素b基因中第一碱基胸腺嘧啶到胞嘧啶的突变和/或第三碱基胸腺嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤的突变或胞嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤的突变的方法，该突变在编码蛋白质中引起了F129L置换，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态性检测方法鉴定真菌核酸样品中所述突变的存在或缺乏，其中所述单核苷酸多态性检测方法基于对应于三联体第一或第三碱基的位置上游和/或下游约30到90个核苷酸的序列信息，该三联体编码野生型或突变体蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明该方面进一步特别优选实施方式中提供了检测真菌细胞色素b基因中第三碱基胞嘧啶到腺嘌呤之突变的方法，该突变在编码蛋白质中引起了F129L置换，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态性检测方法鉴定真菌核酸样品中所述突变的存在或缺乏，其中所述单核苷酸多态性检测方法基于对应于三联体第一或第三碱基的位置上游和/或下游约30到90个核苷酸的序列信息，该三联体编码野生型或突变体蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明上述方面，优选地，单核苷酸多态性检测方法基于对应于三联体第三碱基的位置上游和/或下游约30到90核苷酸的序列信息，该三联体编码野生型或突变体蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
这里所用术语“上游”用于意指序列“5’方向”，术语“下游”意指序列“3’方向”。
根据本发明上述方面，序列信息优选来源于选自下面的真菌：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinulanecator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Pucciniarecondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)，优选地选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viricola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinulanecator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola，更优选地选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophorateres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
这里所用术语“约30”意指序列可以包含不超过30个核苷酸，例如5个，不超过10，15，20，或25个核苷酸，或可以包含多于30个核苷酸。在本发明上述方面，优选地，所用核酸序列信息是对应于三联体第一或第三碱基的位置上游和/或下游约30，优选30个核苷酸，该三联体编码野生型或突变体蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
根据本发明，核酸优选是DNA。方便地，核酸的试验样品是来源于真菌材料的总DNA制备物，来源于真菌材料的cDNA制备物或真菌材料本身或含有真菌核酸的植物或种子提取物。在本说明书中，我们描述了通过利用总基因组DNA或cDNA制备物检测F129L突变。然而，可以理解，试验样品同样可以是核酸，其序列对应于试验样品中的序列。即，在样品核酸中所述区域的全部或部分在用于本发明方法中之前，可以首先利用任何方便的技术如PCR分离或扩增。
本发明提供了分析农业野外样品的DNA中突变的方法，由于农业野外样品特别的来源，与涉及人样品的类似情况比较，其通常相当不明确，其中这里描述的诊断方法更常用于人样品。当与常常含有来源于仅一个个体的DNA的人样品比较时，农业野外样品更难于研究，并且在非常大量的野生型DNA和/或存在于野外分离物中的其它生物体的外来DNA中检测以低频率出现的突变事件在技术上要求更高。
只要用于聚合的任何适合的酶在任何显著的程度上没有内在的区别正常和突变体模板序列的能力，就可以利用该酶。适合的酶的例子包括没有显著3’-5’外切核酸酶活性的热稳定酶，例如Taq DNA聚合酶，特别是‘Ampli Taq Gold’TMDNA聚合酶(Applied Biosystem)，Stoffel片段，或Taq(栖热水生菌(Thermus aquaticua))或Tth(嗜热栖热菌(Thermus thermophiulus))DNA聚合酶的其它适当N-末端缺失修饰物。
在本发明另一个方面中提供了能结合编码野生型细胞色素b蛋白质的真菌核酸序列的等位基因特异寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含识别编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的苯丙氨酸残基的核酸序列的序列。
在优选实施方式中，所述真菌核酸序列从下面的真菌中选取：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Eryrsiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinulanecator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Pucciniarecondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)。
在本发明该方面优选实施方式中，所述真菌核酸序列从下组真菌中选择：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teresa)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicolael)，苹果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuligineaca)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinulanecator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola，在特别优选的实施方式中，真菌核酸选自：葡萄生单轴霉(Plasmoparaviticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminisf.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinulanecator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
根据本发明上述方面，真菌核酸优选是DNA。
在本发明另一方面我们提供了能结合编码突变体细胞色素b蛋白质的真菌核酸序列的等位基因特异寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含识别编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸的核酸序列的序列，所述氨基酸选自：异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，酪氨酸，最优选亮氨酸。
在本发明该方面的优选实施方式中，我们提供了具有结合编码突变体细胞色素b蛋白质的真菌核酸序列能力的等位基因特异寡核苷酸，所述真菌核酸序列选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Pucciniarecondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiaina)，其中所述寡核苷酸包含识别编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸的核酸序列的序列，所述氨基酸选自：异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，酪氨酸，最优选亮氨酸。
在本发明该方面的进一步优选实施方式中，我们提供了具有结合编码突变体细胞色素b蛋白质的真菌核酸序列能力的等位基因特异寡核苷酸，所述真菌核酸序列选自：葡萄生单轴霉(Plasmoparaviticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminisf.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraninicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
根据本发明上述方面的真菌核酸优选是DNA。
在本发明进一步方面提供了具有检测在对应于三联体一个或多个碱基的DNA位置的野生型细胞色素b基因序列能力的等位基因特异寡核苷酸探针，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明进一步方面提供了具有检测在对应于三联体一个或多个碱基的DNA位置的真菌细胞色素b基因多态性能力的等位基因特异寡核苷酸探针，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明该方面进一步优选的实施方式中提供了具有检测在对应于三联体第一和/或第三个碱基的DNA位置的真菌细胞色素b基因多态性能力的等位基因特异寡核苷酸探针，该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明该方面进一步优选的实施方式中提供了具有检测在对应于三联体第一或第三个碱基的DNA位置的真菌细胞色素b基因多态性能力的等位基因特异寡核苷酸探针，该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明该方面进一步优选的实施方式中提供了具有检测在对应于三联体第三个碱基的DNA位置的真菌细胞色素b基因多态性能力的等位基因特异寡核苷酸探针，该三联体编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在本发明该方面进一步优选实施方式中，所述多态性是在所述密码子第一个碱基从胸腺嘧啶到胞嘧啶碱基的改变，所述密码子第三个碱基从胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤的改变，该突变存在于选自下列的真菌中：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminincola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporiorides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Pucciniarecondita)和堀病柄锈菌(Puccinia houiana)。
在本发明该方面进一步优选的实施方式中，所述多态性是在所述密码子第一个碱基从胸腺嘧啶到胞嘧啶碱基的改变，所述密码子第三个碱基从胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤的改变，突变存在于选自下列的真菌中：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pserdoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
等位基因特异寡核苷酸探针优选长度是12到50个核苷酸，更优选长度约是12-35个核苷酸，最优选长度约12-30个核苷酸。
这种探针的设计对于普通技术的分子生物学家是显而易见的，并且可以根据DNA或RNA序列信息。这种探针具有任何适合的长度，如达到50个碱基，达到40个碱基，更适合的达到30个碱基的长度，如，例如8-25或8-15个碱基长度。一般地，这种探针将包含与所述基因中相应野生型或变异体座位完全互补的碱基序列。然而，只要寡核苷酸探针的辨别力不被不适当地影响，如果需要，可以引入一个或多个错配。本发明探针可以带有一个或多个标记以利于检测(例如，荧光标记，包括例如FAM和VIC)。
本发明进一步提供了可以检测根据本发明的核苷酸多态性的核苷酸引物。
根据本发明的另一方面，提供了具有检测在对应于三联体一个或多个碱基的DNA位置的细胞色素b基因多态性能力的等位基因特异引物，该三联体编码蛋白质中在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
根据本发明该方面优选实施方式，提供了具有检测在对应于三联体第一和/或第三碱基的DNA位置的细胞色素b基因多态性能力的等位基因特异引物，该三联体编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
根据本发明该方面进一步优选的实施方式，提供了具有检测在对应于三联体第一或第三碱基的DNA位置的细胞色素b基因多态性能力的等位基因特异引物，该三联体编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
根据本发明该方面进一步优选的实施方式，提供了具有检测在对应于三联体第三个碱基的DNA位置的细胞色素b基因多态性能力的等位基因特异引物，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
在上述方面中，DNA序列中所述突变优选是在所述三联体第一碱基从胸腺嘧啶到胞嘧啶碱基的改变和在所述三联体第三碱基从胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤的改变，最优选在第三位置从胞嘧啶到腺嘌呤的改变。
在本发明另一方面提供了具有检测编码野生型细胞色素b蛋白质的真菌DNA序列能力的等位基因特异引物，所述真菌DNA序列从如下真菌选择：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophorateres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercosporaarachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomycescarpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)，其中所述引物具有检测编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的苯丙氨酸残基的DNA序列的能力。
在本发明该方面优选实施方式中提供了具有检测编码野生型细胞色素b蛋白质的真菌DNA序列能力的等位基因特异引物，所述真菌DNA序列选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophorateres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola，其中所述引物具有检测编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的苯丙氨酸残基的DNA序列的能力。
在本发明该方面优选实施方式中，所述真菌DNA序列选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
在本发明另一方面我们提供了具有检测编码部分突变体细胞色素b蛋白质的真菌DNA序列的能力的等位基因特异引物，其中所述等位基因特异引物能够检测编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸的DNA序列，所述氨基酸选自：异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，酪氨酸，最优选亮氨酸。
在本发明该方面进一步的实施方式中，我们提供了能够检测编码部分突变体细胞色素b蛋白质的真菌DNA序列的等位基因特异引物，其中所述等位基因特异引物能够检测编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸的DNA序列，所述氨基酸选自：异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，酪氨酸，最优选亮氨酸。
在本发明该方面优选实施方式中，我们提供了具有检测编码部分突变体细胞色素b蛋白质的真菌DNA序列能力的等位基因特异引物，所述真菌DNA序列选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyreophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymella lycopersici)，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Pucciniarecondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)，其中所述引物能够检测编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸的DNA序列，所述氨基酸选自：异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，酪氨酸，最优选亮氨酸。
在本发明该方面进一步优选实施方式中，我们提供了具有检测真菌编码部分突变体细胞色素b蛋白质的DNA序列能力的等位基因特异引物，所述真菌DNA序列选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麦喙孢(Rhyunchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亚隔孢壳菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola，其中所述引物能检测编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸的DNA序列，所述氨基酸选自：异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，酪氨酸，最优选亮氨酸。
通常在扩增反应，如PCR反应中，等位基因特异引物与普通引物一起使用，通过在特定序列位置，例如ARMS测定中所用的特定序列位置的一个等位基因的选择性扩增，该扩增反应提供了等位基因间的辩别。
现在，我们能设计用于上面列出的真菌物种中F129L突变的引物，已经证明该引物能可靠地和有力地检测特异突变。所述引物检测在对应于三联体第一碱基的DNA位置的胸腺嘧啶到胞嘧啶碱基的改变，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，和/或检测在对应于三联体第三碱基的DNA位置的胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鸟嘌呤碱基的改变，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。这里等位基因特异引物指诊断引物。
因此，本发明另一方面提供了能够在对应于三联体第一和/或第三碱基位置结合含有突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与真菌细胞色素b基因的所述突变体形式中存在的核苷酸对应，并且所述核苷酸的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗性。
因此，在该方面进一步实施方式中，本发明提供了能够在对应于三联体第一或第三碱基位置结合含有突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与真菌细胞色素b基因的所述突变体形式中存在的核苷酸对应，并且所述核苷酸的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性。
因此，在该方面的进一步实施方式中，本发明提供了能够在对应于三联体第一和/或第三个碱基位置结合含有突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与真菌细胞色素b基因的所述突变体形式中存在的核苷酸对应，并且所述核苷酸的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性。
因此，在该方面进一步优选实施方式中，本发明提供了能够在对应于三联体第一或第三碱基位置结合含有突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与真菌细胞色素b基因的所述突变体形式中存在的核苷酸对应，并且所述核苷酸的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性。
因此，本发明的另一方面提供了能够在对应于三联体第三碱基的位置结合含有突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中在对应于酿酒酵母(S.cerevisiaec)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与真菌细胞色素b基因的所述突变体形式中存在的核苷酸对应，并且所述核苷酸的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性。
因此在另一方面，本发明提供了具有在对应于三联体第一碱基的位置结合含有突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板能力的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与真菌细胞色素b基因的所述突变体形式中存在的核苷酸对应，并且所述核苷酸的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性。
本发明诊断引物优选至少20个核苷酸长度，最优选约26个核苷酸长度。然而，本发明的诊断引物也可以是15到20个核苷酸之间的长度。本领域技术人员将理解本发明的诊断引物可以是与编码真菌细胞色素b蛋白质的核酸的有义或反义链杂交的这种引物。
在本发明上述方面优选实施方式中，引物的倒数第二个核苷酸(-2)与在野生型细胞色素b序列相应位置存在的核苷酸不相同。
在进一步优选实施方式中，是引物的-3核苷酸与在野生型细胞色素b序列相应位置存在的核苷酸不相同。
也可以与-2或-3核苷酸一起引入其它去稳定成分。
在本发明上述方面进一步特别优选的实施方式中，我们提供了能够结合含有对应于三联体第一和/或第三碱基的突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与真菌细胞色素b基因的所述突变体形式中存在的核苷酸对应，其中剩余核苷酸中多至10，如多达8，6，4，2，1个核苷酸可以相对于野生型序列改变，而不显著影响诊断引物的特性。
在本发明该方面进一步特别优选的实施方式中，我们提供了能结合含有对应于三联体第一或第三碱基的突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与真菌细胞色素b基因的所述突变体形式中存在的核苷酸对应，其中剩余核苷酸中多达10，如多达8，6，4，2，1个核苷酸可以相对于野生型序列改变，而不显著影响诊断引物的特性。
在本发明上述方面进一步特别优选的实施方式中，我们提供了能结合含有对应于三联体第三碱基的突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与真菌细胞色素b基因的所述突变体形式中存在的核苷酸对应，其中剩余核苷酸中多达10，如多达8，6，4，2，1个核苷酸可以相对于野生型序列改变，而不显著影响诊断引物的特性。
在本发明上述方面进一步特别优选的实施方式中，我们提供了能结合含有对应于三联体第一碱基的突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与真菌细胞色素b基因的所述突变体形式中存在的核苷酸对应，其中剩余核苷酸中多达10，如多达8，6，4，2，1个核苷酸可以相对于野生型序列改变，而不显著影响诊断引物的特性。
在本发明上述方面进一步特别优选的实施方式中，我们提供了包含下面给定序列和其衍生物的诊断引物，其中在3’末端最末端的核苷酸与下面给定的序列相同，其中剩余核苷酸中达到10，如达到8，6，4，2，1个核苷酸可以改变，而不显著影响诊断引物的特性。
如本领域技术人员将理解的，诊断(例如ARMS)引物有高Tm，优选地，在本发明所有方面中，ARMS引物是约26个核苷酸长度。适合地，诊断引物的序列可以和下面(参见表9到13)提供的完全相同。在下列表9到13中列出的所有引物中，倒数第二的核苷酸已从野生型细胞色素b序列改变以使模板/引物杂合体去稳定，由此使其对期望模板更有选择性，并且根据本发明，特别优选这些引物。也可以改变替代上文讨论的那些的或除上文讨论的那些之外的碱基，而不会不利地影响引物与模板结合的能力，这对引物设计领域技术人员显而易见。
表9：用于F129L突变检测的ARMS引物设计，其中编码亮氨酸残基的三联体第一碱基是胞嘧啶。
表10：用于F129L突变检测的ARMS引物设计，其中编码亮氨酸残基的三联体第三碱基是腺嘌呤残基。
表11：用于F129L突变检测的ARMS引物设计，其中编码亮氨酸残基的三联体第三碱基是鸟嘌呤。
表12：用于F129L突变检测的ARMS引物设计，其中编码残基129的三联体第一碱基是胞嘧啶，第三碱基是腺嘌呤残基，因此编码亮氨酸。
表13：用于F129L突变检测的ARMS引物设计，其中编码残基129的三联体第一碱基是胞嘧啶，编码三联体第三碱基是鸟嘌呤，因此编码亮氨酸。
为了举例说明的目的，包含在表9到13中的引物包括：
●用于葡萄生单轴霉(P.teres)，禾生球腔菌(C.graminicola-Cgr3)和苹果黑星菌(V.ineaqualis)的ARMS引物，该引物可以有效地用于基因组DNA制备物或生物样品，包括真菌分离物，真菌培养物，真菌孢子或感染的植物材料。
●用于苍耳单丝壳菌(S.fulginea)，番茄粉孢(O.lycopersicon)，鞑靼内丝白粉菌(L.taurica)Lt1，Lt2，Lt3和Lt4，葡萄白粉病钩丝壳霉(U.necator)，蔓延疫霉(Phytopthora infestans)，茄属丝核菌(R.solani)，D.bryoniae Db1和Db2，和D.lycopersici的ARMS引物，该引物可能仅对cDNA有效。
●用于葡萄生单轴霉(P.viticola)，黑麦喙孢(R.secalis)，禾生球腔菌(M.graminicola)，M.fijiensis var.difformis，禾生球腔菌(C.graminicola)Cgr1和Cgr2，瓜果腐霉(P.aphanidermatum)，辣椒和芒果盘长孢状刺盘孢(C.gloesporides-chilli and mango)，古巴假霜霉(P.cubensis)，落花生尾孢(C.arachidola)，Mycosphaerella musicola和马铃薯早疫病链格孢(A.solani)的ARMS引物，该引物可以有效地与基因组DNA制备物，cDNA制备物，cDNA制备物或生物样品，包括真菌分离物，真菌培养物，真菌孢子或感染的植物材料一起使用。
对于目前没有表征目的核苷酸多态性周围内含子/外显子组构的那些物种推荐cDNA材料。
上表9-13中描述的ARMS引物提供了本发明诊断引物的具体例子。
为了使上表所示引物适于用在标准ASPCR反应中，在3’末端的最后碱基应该与点突变对应，不引入去稳定碱基。
可以用任何适合的合成方法生产这种引物。在标准教科书中可以发现这种方法的例子，例如“Protocols For Oligonucleotides AndAnalogues：Synthesis And Properties；”Method In MolecularBiology Series；20卷；Sudhir Agrawal编辑，HumanaISBN：0-89603-247-7；1993；第一版。
应当理解，可以设计诊断引物以显示在编码蛋白质中引起F129L置换的一个或多个突变的缺乏，即检测编码苯丙氨酸的野生型序列，或证实在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b密码子129的位置编码亮氨酸的序列的存在。优选ARMS引物用于检测在编码蛋白质中引起F129L置换的突变的缺乏。这里描述了为该目的设计的引物。
野生型序列的检测作为相对于突变检测的对照是有用的，当希望定量在样品中存在的野生型和突变体等位基因时也是必要的。
因此，在本发明另一方面提供了能够结合含有对应于三联体第一和/或第三碱基的野生型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与野生型真菌细胞色素b基因中存在的核苷酸对应，所述野生型真菌显示对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物敏感。
因此，在本发明该方面的进一步实施方式中提供了具有结合含有对应于三联体第一或第三碱基的野生型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板能力的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与野生型真菌细胞色素b基因中存在的核苷酸对应，所述野生型真菌显示了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的敏感性。
因此，在本发明该方面的进一步实施方式中提供了能结合含有对应于三联体第三碱基的野生型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与野生型真菌细胞色素b基因中存在的核苷酸对应，所述野生型真菌显示了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的敏感性。
在本发明该方面的优选实施方式中，引物的倒数第二个核苷酸(-2)与在野生型细胞色素b序列相应位置存在的核苷酸不相同。
在进一步优选实施方式中，引物的-3核苷酸与在野生型细胞色素b序列相应位置存在的核苷酸不相同。
也可以与-2或-3核苷酸一起引入其它去稳定成分。
本发明诊断引物优选至少20个核苷酸长度，最优选26个核苷酸长度，但是其也可以是15到20之间的长度。
在本发明上述方面进一步特别优选的实施方式中，我们提供了能结合含有对应于三联体第一和/或第三碱基的野生型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与野生型真菌细胞色素b中存在的核苷酸对应，其中剩余核苷酸中达到10，如达到8，6，4，2，1个核苷酸可以相对于野生型序列改变，而不显著影响诊断引物的特性。
在本发明上述方面进一步特别优选的实施方式中，我们提供了能结合含有对应于三联体第一或第三碱基的野生型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与野生型真菌细胞色素b中存在的核苷酸对应，其中剩余核苷酸中达到10，如达到8，6，4，2，1个核苷酸可以相对于野生型序列改变，而不显著影响诊断引物的特性。
在本发明该方面进一步特别优选的实施方式中，我们提供了包含下面给定序列和其衍生物的诊断引物，其中在3’末端最末端的核苷酸于下面给定的序列相同，其中剩余核苷酸中达到10，如达到8，6，4，2，1个核苷酸可以改变，而不显著影响诊断引物的特性。方便地，诊断引物的序列可以完全和下面(表14和15)提供的序列相同。在下面列出的大部分引物中，倒数第二个核苷酸已从野生型细胞色素b改变以使模板/引物杂合体去稳定，由此使其对期望模板更有选择性。也可以改变替代以上讨论的那些的或除以上讨论的那些之外的碱基，而不会不利地影响引物与模板结合的能力，这对引物设计领域技术人员显而易见。
表14：用于植物病原体细胞色素b基因密码子129位置1处野生型序列检测的ARMS引物设计。
表15：用于植物病原体细胞色素b基因密码子129的位置3野生型序列检测的ARMS引物设计。
为了使上表所示引物适于用在标准ASPCR反应中，在3’末端的最后碱基应该对应于野生型序列，不引入去稳定碱基。
上述例子涉及基于DNA正向链的ARMS引物。特别优选基于DNA正向链的ARMS引物的应用。然而，也可以利用基于反向(反义)链的ARMS引物。
如果期望，ARMS引物也可以基于DNA反向链。遵循上述用于正向链引物的相同原理，设计这种反向链引物，即引物可以至少是20个核苷酸长度，最优选26个核苷酸长度，但是其也可以是15到20之间的长度，并且引物3’末端的最末端核苷酸匹配相关的模板，即突变体或野生型模型，优选地，优化改变倒数第二的残基，这样它不匹配相关的模板。此外，引物剩余核苷酸中达到10，如达到8，6，4，2，1个核苷酸可以改变，而不显著影响诊断引物的特性。
在许多情况下，在一轮或多轮PCR扩增中，方便地一起使用本发明的诊断引物和这里称为普通引物的另外扩增引物。在欧洲专利号EP-B1-0332435中阐述了该方面的方便的例子。所述另外扩增引物是正向或反向普通引物。在下表16中给出了可以用于特定植物病原体的这种普通引物的例子。
表16：与ARMs引物一起使用的普通正向和反向引物的例子
| 物种 | 引物序列(5’-3’) | |
| 1 | 葡萄生单轴霉(正向) | CATATTTTTAGGGGTTTGTATTACGG |
| 2 | 禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型 | AACACCTAAAGGAGGATTACCAGATCCTGCAC |
| 3 | 黑麦喙孢 | TACACCTAAAGGATTACCTGACCCTGCAC |
| 4 | 圆核腔菌(cDNA) | TTACAGAGAAACCACCTCAAATGAACTCAACTATGTCCAC |
| 5 | 圆核腔菌(基因组) | TTTTTATTATACTTTTGTTAAACAGTCTTTTATTGTTTAA |
| 6 | 禾生球腔菌 | AAATCCACCTCATACGAATTCAACTATGT |
| 7 | Mycosphaerella fjiensis var.difformis | AAACCTCCTCAAATAAACTCAACTATATC |
| 8 | 苍耳单丝壳菌(cDNA) | TAACTGAGAAACCCCCTCAGAGAAACTCCACAATATCTTG |
| 9 | 葡萄白粉病钩丝壳霉(cDNA) | TTACAGAAAAACCACCTCAAAGAAACTCCACGATATCTTG |
| 10 | 禾生刺盘孢-Cgr1 | TAACTGAGAAACCTCCTCAAACGAATTCAACAATATCTTG |
| 11 | 禾生刺盘孢-Cgr2 | TAACAGAGAAACCTCCTCAAACOAATTCAACAATATCTTG |
| 12 | 禾生刺盘孢-Cgr3(cDNA) | TAACAGAGAAACCTCCTCAAACGAACTCAACAATATCTTG |
| 13 | 禾生刺盘孢-Cgr3(基因组) | TATTTTTAATTGTAGTCTTGCCTTTCCTCGGAGAGGACAA |
| 14 | 瓜果腐霉(正向)(反向) | TATATTATGGTTCATATATTACTCCAAGTATTTAAAGTTGGATTATCTACAGC |
| 15 | 辣椒盘长孢状刺盘孢 | TAACAGAGAAACCTCCTCAAACGAATTCAACTATATCTTG |
| 16 | 芒果盘长孢状刺盘孢 | TAACAGAGAAACCTCCTCAAACGAACTCAACGATATCTTG |
| 17 | 番茄粉孢 | TTACAGAAAAACCTCCTCAAAGAAACTCCACGATATCTTG |
| 18 | 鞑靼内丝白粉菌-Lt1 | TTACAGAGAAACCACCTCAAATAAATTCAACTATATCTTG |
| 19 | 鞑靼内丝白粉菌-Lt4 | TTACAGAGAAACCTCCTCAAATAAATTCAACTATATCTTG |
| 20 | 鞑靼内丝白粉菌-Lt2 | TAACACTGAAACCTCCTCAAATAAATTCAACTACATCTTG |
| 21 | 鞑靼内丝白粉菌-Lt3 | TTACAGAAAAACCTCCTCAAATAAACTCGACGATATCTTG |
| 22 | 古巴假霜霉 | CTACAGCAAAACCGCCCCACAACCAATCAACAATATCTTT |
| 23 | 马铃薯早疫病链格孢 | TAACACTGAAACCTCCTCAAATGAACTCAACAATA |
| TCTTG | ||
| 24 | Cercospora arachidola | AAACAGAGAAACCTCCTCATATAAATTCAACTAAATCTTG |
| 25 | 茄属丝核菌 | ACACGGAAAAGCCACCCCAGATTAACTCTACAAAATCTTG |
| 26 | 苹果黑星菌(cDNA) | TCACTGAAAAGCCTCCCCACAGAAATTCGACTATATCTTG |
| 27 | 苹果黑星菌(基因组) | TTGGTCCACTAATAGCCTTTCAACTACAGCTTGGTATAAG |
| 28 | 蔓延疫霉 | CAACAGCAAAACCTCCCCATAACCAATCAACAATATCTTT |
| 29 | Mycosphaerella musicola | TAACAGAAAACCCACCTCAAATAAATTCAACTATATCTTG |
| 30 | Didymella bryoniae-Db1 | TAACGCTGAAACCTCCTCATATGAACTCAACAATATCTTG |
| 31 | Didymella bryoniae-Db2 | TAACTGAGAAACCACCTCAAATGAACTCAACGATATCTTG |
| 32 | Didymella lycopersici | TAACAGAAAAACCTCCTCATATGAACTCAACAATATCTTG |
以前在公开的国际专利申请号WO 00/66773中描述了表16中用于黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，Mycosphaerella fijiensisvar.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fjlginea)(cDNA)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)(cDNA)，禾生刺盘孢-Cgr1(Colletotrichum graminicola-Cgr1)，辣椒盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides-chilli)，番茄粉孢(Oidiumlycipersicum)，鞑靼内丝白粉菌-Lt4(Leveillula taurica-Lt4)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，Cercospora arachidola，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，蔓延疫霉(Phytopthora infestans)和Mycospharella musicola的普通引物。
在表3-8和公开的国际专利申请号WO 00/66773中提供的较长序列的情况下，本领域技术人员将能利用这些信息设计适合的引物。
普通引物可以是任何方便的病原体特异序列，该序列识别位于突变选择引物3’的细胞色素b基因(或其它目的基因)的互补链，这对本领域技术人员将是显而易见的。
PCR扩增子大小优选50到400bp长，但是可以从30到2500bp长，或潜在地从30到10,000bp长。
可以利用适合的对照引物，从F129L位置上游设计该对照引物。对照引物可以是对突变或野生型序列扩增不特异的任何引物。当与上述相应的反向(“普通”)引物一起使用这些引物时，不管F129L点突变是否存在，都将出现扩增。
表17：适于用在本发明中的对照引物的例子
| 引物 | 序列 | 对比引物序列(5’-3’) |
| 1 | 葡萄生单轴霉(反向) | GTCCCCAAGGCAAAACATAACCCAT |
| 2 | 禾白粉菌小麦专化型/大麦专化型 | ATTCATATTAATGATCGTTACTGC |
| 3 | 黑麦喙孢 | ATATTCATATTAATGATCGTTACAGC |
| 4 | 圆核腔菌(cDNA) | ATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGC |
| 5 | 圆核腔菌(基因组) | TTGTAGTTAGCCGGAACTTAGACAGC |
| 6 | 禾生球腔菌 | ATACTAGTTCTGATGATGGCAACCGC |
| 7 | Mycosphaerella fijiensis var.difformis | ATATTAGTTCTAATGATGGCAACTGC |
| 8 | 苍耳单丝壳菌 | ATATTCATATTAATGATCGTTACTGC |
| 9 | 葡萄白粉病钩丝壳霉 | ATATTCATTTTAATGATGGCTACAGC |
| 10 | 禾生刺盘孢-Cgr1 | ATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGG |
| 11 | 禾生刺盘孢-Cgr2 | ATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGG |
| 12 | 禾生刺盘孢-Cgr3 | ATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGG |
| 13 | 瓜果腐霉(反向) | TTGACCCCAAGGTAATACATAACCC |
| 14 | 辣椒盘长孢状刺盘孢 | ATACTTGTAGCTATGATGGGTATAGG |
| 15 | 芒果盘长孢状刺盘孢 | ATTCTTGTAGCTATGATGGGTATAGG |
| 16 | 番茄粉孢 | ATATTCATATTAATGATGGCTACAGC |
| 17 | 鞑靼内丝白粉菌-Lt1 | ATATTTATATTAATGATGGCTACAGC |
| 18 | 鞑靼内丝白粉菌-Lt4 | ATATTTATATTAATGATGGCTACAGC |
| 19 | 鞑靼内丝白粉菌-Lt2 | ATCTTTATATTAATGATGGCTACTGC |
| 20 | 鞑靼内丝白粉菌-Lt3 | ATATTCATATTAATGATGGCTACTGC |
| 21 | 古巴假霜霉 | ATTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC |
| 22 | 马铃薯早疫病链格孢 | ATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGC |
| 23 | Cercospora arachidola | ATTTTAGTTCTTATGATGGCAATAGC |
| 24 | 茄属丝核菌 | ATGCTTGTTATGATGATGGGGATCGC |
| 25 | 苹果黑星菌 | ATCTTTATATTAATGATAGTTACAGC |
| 26 | 蔓延疫霉 | ATTTTTATTTTAATGATGGCTACTGC |
| 27 | Mycosphaerella musicola | ATATTAGTTCTAATGATGGCTACCGC |
| 28 | Didymella bryoniae-Db1 | ATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGC |
| 29 | Didymella bryoniae-Db2 | ATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGC |
| 30 | Didymella lycopersici | ATCTTTATCTTAATGATGGCTACAGC |
本发明旨在延及上表中公开的所有新的寡核苷酸(其可以用作引物)。
可以用各种方法检测诊断引物延伸的产物和/或扩增产物的存在或缺乏。这对于核酸检测方法领域的技术人员显而易见。优选的方法避免需要放射标记的试剂。特别优选的检测方法是基于诊断引物延伸产物存在和/或缺乏的荧光检测的方法。特定的检测方法包括凝较电泳分析，在1998年11月25日以Zeneca Limited名义提交的PCT申请PCT/GB98/03521中所述的“Scorpions”TM产品检测，这里并入其教导作参考。进一步优选的检测方法包括如公开的PCT申请WO 99/04037中所述的ARMS线性延伸(ALEX)和利用ALEX的PCR。方便地，利用实时检测。特别优选如PCT申请号PCT/GB98/03521和公开的英国专利申请号GB2338301中所述“Scorpions”TM产品检测的应用用在这里描述的本发明所有方面中。特别优选如这里所述ARMS和Scorpion技术联合用在这里描述的本发明的所有方面中，并且优选的检测方法是基于荧光的检测方法。这些检测方法中许多适于利用所有上述引物定量操作。可以在不同试管中进行或在一个试管中多路进行这些不同的PCRs。利用这种方法，可以对在野生型分子背景中存在的点突变分子的频率进行评估。
本领域技术人员知晓，基于ARMS引物的技术提供了在等位基因选择性杂交探针杂交后选择性引发邻接序列复制的能力，探针中3’残基精确地匹配一个或其它SNP替代物。可能的是，在例如在密码子129第一位存在C残基的情况下能够例如产生高选择扩增的ARMS引物将很好地结合可替代的，野生型的，含有T残基的基因的细胞色素b基因，因为除了3’和倒数第二个残基外，存在完全的匹配。ARMS引物的关键特性是，因为在关键3’残基的错配，没有邻接区域的复制。
本领域技术人员也将理解，在给出包含在本专利申请中的植物病原真菌细胞色素b序列数据库后，也可以利用其它的单核苷酸多态性(SNP)或简单核苷酸多态性检测技术检测F129L突变。这种方法包括等位基因选择性杂交技术如：例如，如在专利号US-A-5487972和US-A-5210015中所述的“TaqMan”TM产品检测；例如在通过Applied-Biosystems(850 Lincoln Centre Drive，Foster City，CA 94404，USA)可以得的the Applied Biosystems User Bulletin：PrimerExpress Version 1.5和TaqMan MGB Probes for AllelicDiscrimination(2000年5月)中以及本文中所述的“TaqManMGB”和“turbo TaqMan”探针(也参见实施例)。也可以用于检测F129L突变的其它SNP或简单核苷酸多态性检测技术包括如在专利号WO-95/13399中概述的“Molecular Beacon”产品检测和如在专利申请WO 97/05280中概述的表面增强拉曼共振光谱学(surfaceenhanced Raman resonance spectroscopy)(SERRS)，这里并入这两篇文献为参考文献。可以用于确定密码子129位置存在的等位基因的其它SNP和/或简单多态性检测技术包括，但不限于：″PyrosequencingTM″(Pyrosequencing AB，Uppsala，Sweden)，锁定核酸(LNA)技术(Exiqon A/S，Bygstubben 9，2950 Vedbk，丹麦)，动态等位基因特异杂交(DASH)(Hybaid US，8 East ForgeParkway，Franklin.MA 02038，USA)和变性高效液相层析(dHPLC)(Giordano M.等，Genomics 56(1999)247-253，Oefner P.J.J.Chromatogr.，B：Biomed.Sci.Appl.739(2000)345-355)，再一次，这里并其为参考文献。
熟练的使用者也会理解，例如，通过设计具有识别包含两个置换的突变体序列能力的TaqMan MGB探针，或因为SNP和/或简单核酸识别序列技术在几个紧密连锁的位置直接确定序列，如Pyrosequencing技术的情况，可以容易地改变一些该技术以在密码子129的位置检测编码亮氨酸的等位基因，其中该密码子129通过2个碱基的改变(例如：TTT→CTA)不同于野生型苯丙氨酸密码子。在其它情况下，特别是依赖于等位基因特异扩增方法(例如，ARMS等)的情况下，可以期望研究开发几种检测方法，包括对有义和反义序列作用以区分单和双核苷酸多态性的可能引物。也可能联合不同的SNP检测技术(例如，ARMS和Pyrosequencing)以允许单和双核苷酸多态性之间最敏感和特异的检测和辩别。本发明延及用在这里描述的本发明适合方面和实施方式中的不同SNP检测技术的联合。例如Taqman(或TaqmanMGB)探针可以与ARMS引物和普通引物联合使用。如果是这种情况，则优选ARMS引物提供了对SNP突变检测的特异性，并且Taqman(和TaqmanMGB)探针提供了检测手段(例如待检测的荧光团)。
如这里所示例的，我们利用了与作为检测方法的基于DNA反向链的Scorpion检测联合的基于DNA正向链的ARMS引物。这里我们也示例了与作为检测方法的基于DNA正向链的Scorpion检测联合的基于DNA反向链的ARMS引物。ARMS引物和Scorpion检测成分的可替代联合对本领域技术人员显而易见。例如，基于DNA正向链的引物可以是ARMS引物与Scorpion检测系统的联合，并且这可以与基于DNA反向链的普通引物一起使用，或者基于DNA反向链的引物可以是ARMS引物与Scorpion检测系统的联合，并且这可以与基于DNA正向链的普通引物一起使用。
在这里所述的实例中，Scorpion检测成分是在普通引物上。对突变和野生型序列特异的ARMS引物和普通荧光标记引物联合使用。在不同PCR试管中进行这两种反应，当探针结合产生的扩增子时荧光发射。可替代地，Scorpion检测成分掺入ARMS引物。在这种情况下，可以用不同荧光团标记两个ARMS引物，并且与普通引物(这次是没有标记的)一起使用。这三种引物可以包含在相同反应中，因为由此产生的突变体和野生型扩增子将引起不同的荧光发射。这种测定通常称为多重测定法。
如在公开的英国专利申请号：GB2338301中所述，可以以大量不同方式利用Scorpion技术，如嵌入实施方式，其中Scorpion引物尾部带有嵌入染料，该嵌入染料具有被掺入在双链核酸分子碱基之间的能力，一旦它被掺入，其就变成高度发荧光的；FRET实施方式，其中包含在引物中的染料形成了能量转移对；非猝灭剂(No-Quencher)实施方式，其中荧光团附着到Scorpion引物尾部；双分子实施方式，其中荧光团和猝灭剂可以引入到两个独立的，但互补的分子上；捕获探针实施方式，其中可以用相同的不可扩增的尾特异地捕获和探测到扩增子，及茎(Stem)实施方式，其中引物尾含有自身互补的茎。在公开的英国专利申请号：GB2338301中充分地描述了这些实施方式，这里并入其教导作为参考。
如上所述，可以用Taqman探针或TaqmanMGB探针作为用于突变存在和/或缺乏检测的等位基因特异杂交探针。在这些情况下，这种探针与普通正向和反向引物联合使用，该普通正向和反向引物分别对突变上游和下游的DNA序列特异。更具体地，设计用第一荧光报道染料(例如VICTM)标记的第一Taqman探针(或第一TaqmanMGB探针)以与野生型序列杂交。设计用不同的第二荧光报道染料(例如FAM)标记的第二Taqman探针(或第一TaqmanMGB探针)以与突变杂交。该第一和第二探针还都以猝灭剂分子标记。在正向和反向引物位点之间，每种探针特异地与其互补序列退火，并且当探针退火时，作为猝灭剂分子紧密接近的结果，荧光报道染料的荧光猝灭。在PCR期间，有5’到3’外切核酸酶活性的Taq DNA聚合酶仅从与它们的特异靶序列杂交的探针切割报道染料。这引起了报道染料与猝灭剂分子的物理分离，因此引起了报道染料荧光的增加。因为探针是用不同荧光报道基因染料标记的，所以适合地它们就可以用在分离的反应中以检测野生型或突变体序列，或可替代地它们可以同时用在相同的反应试管中。当用在相同的反应中，这种测定可以称为多重测定法。在可从AppliedBiosystems(850 Lincoln Centre Drive，Foster City，CA 94404，USA)得到Applied Biosystems User Bulletin：用于等位基因辩别的Primer Express版本1.5和TaqMan MGB探针(May 2000)中描述了TaqMan MGB探针。基于TaqMan的测定法特别用于对试验样品中突变的存在与否提供相对快速“是/否”回答。
这里描述的本发明方法可靠地以每1,000,000个野生型等位基因中1个突变等位基因到每10,000个野生型等位基因中1个突变等位基因，优选每100,000个野生型等位基因中1个突变等位基因到每10,000个野生型等位基因中1个突变等位基因范围的检测水平检测真菌细胞色素b基因中一个或多个单核苷酸多态性突变，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性。本发明方法也可以检测以较高频率存在，例如每100个野生型等位基因中1个突变等位基因，每10个野生型等位基因中1个突变等位基因的频率存在或仅存在突变等位基因时的突变。类似地，本发明方法可以用于检测突变等位基因背景中的野生型等位基因的频率。
由于使用ARMS技术而变得更敏感的等位基因特异引物延伸和用在本发明中的定量检测方法的联合应用使这成为了用于检测以低频率出现的真菌单和/或简单多核苷酸多态性突变的极其有价值的技术。
负责引起给定分离物中存在的对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的真菌抗药性的这些等位基因的检测使得表型生物测定的结果能够与靶基因的DNA轮廓有关。作为抗药性机理的单点突变的发现解释了抗药性的定量特性，并且单孢子分离物序列的确认证实了在测定被测试验样品中抗药性和敏感性分离物频率中筛选的精确性。
如这里所示例的，联合Scorpion系统与等位基因特异引物延伸，ARMS的特异性和实时荧光检测的方法的发展使得能够分析比生物测定程序中可行的样品更多的样品的抗性突变的存在。更多的样品数能够鉴定比通过生物测定可能容易检测到的百分数频率低的百分数频率的抗性突变。在可能从野外数据知晓抗药性以前，这能够在种群中鉴定抗药性。该方法的高处理量特性使得能够比利用生物测定的方法取样和检测更广泛的区域和更多地理上不同的位点。在异质和/或异核细胞中，可以通过生物测定表型地评估基因的作用前，等位基因特异引物延伸如联合实时荧光检测的ARMS允许种群中抗药性基因存在的检测，因此，当样品带有低频率的抗性基因型时，降低了分类样品为敏感型的错误。通过同时读取实时技术获得结果比等待植物中(in planta)疾病发展快得多，使得能够对田地情况快速反应，并且给出关于抗药性处理的意见更快。
本发明的一个或多个诊断引物可以适合地与在本发明方法中使用的说明书及适当包装材料一起包装，作为试剂盒销售。方便地，试剂盒将包含下列的一个或多个：诊断、野生型、对照和普通寡核苷酸引物；适当的核苷三磷酸，例如dATP，dCTP，dGTP，dTTP，如前所述的适当聚合酶，和缓冲溶液。
本发明的一个或多个等位基因选择性杂交探针可以方便地与在本发明方法中使用的说明书和适当包装材料一起包装，作为试剂盒销售。适合地，试剂盒将包含下列的一个或多个：使得包含靶病原体细胞色素b基因区域的DNA片段能够选择性扩增的寡核苷酸引物，所述靶病原体细胞色素b基因区域包含来源于野生型和抗嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的分离物的密码子129，诊断野生型(F129)和抗药性(A129)选择性杂交探针，适合的核苷三磷酸，例如dATP，dCTP，dGTP，dTTP，如前所述的适合聚合酶，和缓冲溶液。
在本发明另一方面提供了检测植物病原真菌对杀真菌剂抗药性的方法，所述方法包括检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术鉴定真菌核酸中所述突变的存在或缺乏。
在本发明该方面的进一步实施方式中提供了检测植物病原真菌对杀真菌剂抗药性的方法，所述方法包括检测等位基因特异杂交探针的杂交，其中所述探针杂交的检测直接与真菌细胞色素b基因中突变的存在或缺乏有关，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了对杀真菌剂的真菌抗药性，该杀真菌剂的靶蛋白质由线粒体基因编码。
在本发明该方面的进一步实施方式中提供了检测植物病原真菌对杀真菌剂抗药性的方法，所述方法包括检测PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述的PCR反应包括在适合的核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用诊断引物接触含有真菌核酸的试验样品，其中所述扩增子的检测直接与真菌细胞色素b基因中突变的存在或缺乏相关，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了对杀真菌剂的真菌抗药性，该杀真菌剂的靶蛋白质由线粒体基因编码。
在本发明该方面的优选实施方式中提供了检测植物病原真菌对杀真菌剂抗药性的方法，该杀真菌剂的靶蛋白质由细胞色素b基因编码，该方法包括在适合的核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，以用于真菌细胞色素b基因中一个或多个特异突变的诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了对杀真菌剂的真菌抗药性，以致当在样品中存在所述突变时，延伸诊断引物；通过参照诊断引物延伸产物的存在或缺乏检测所述突变的存在或缺乏。
在本发明该方面进一步优选的实施方式中提供了检测植物病原真菌对杀真菌剂抗药性的方法，该杀真菌剂的靶蛋白质由线粒体基因编码，该方法包括在适合的核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用针对真菌细胞色素b基因中一个或多个特异突变的诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了对所述杀真菌剂的真菌抗药性，以致仅当在样品中存在所述突变时，才延伸诊断引物；通过参照诊断引物延伸产物的存在或缺乏检测所述突变的存在或缺乏。
在上述方面和实施方式中描述的本发明方法特别适合与植物病原真菌株系一起使用，其中细胞色素b基因中一个或多个突变的存在引起了真菌抗药性，最特别地是引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物的抗药性，其中真菌DNA中的突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸残基的置换，更特别地引起了编码蛋白质中F129L置换，特别地，其中在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129位置的密码子第一位置，突变是T到C碱基的改变，或在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129位置的密码子第三位置突变是从T或C到A或G碱基的改变。
本发明另一方面提供了检测和定量真菌细胞色素b基因中一个或多个突变的频率的方法，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了对嗜球果伞素类似物的真菌抗药性，所述方法包括在真菌基因组中检测突变的存在或缺乏，其中所述突变的存在引起了对所述杀真菌剂的真菌抗药性，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术鉴定和定量真菌核酸中所述突变的存在和缺乏。
在本发明该方面的进一步优选实施方式中提供了检测和定量真菌细胞色素b基因中一个或多个突变的频率的方法，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了对杀真菌剂的真菌抗药性，该杀真菌剂靶蛋白质由线粒体基因编码，所述方法包括在真菌基因中检测突变的存在或缺乏，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中任何其它化合物的抗药性，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术鉴定和定量真菌核酸中所述突变的存在和缺乏。
在本发明该方面的进一步实施方式中提供了检测和定量真菌细胞色素b基因中一个或多个突变的频率的方法，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了植物病原真菌对真菌杀虫剂的抗药性，该杀真菌剂靶蛋白质由线粒体基因编码，所述方法包括：通过用适合的诊断性野生型(F129)和抗药性(A129)选择性杂交探针接触含有真菌核酸的试验样品检测等位基因选择性探针的杂交，其中所述等位基因特异性探针的杂交的检测直接与所述核酸中所述突变的存在和缺乏两者有关，其中所述突变的存在引起了对杀真菌剂的抗药性，该杀真菌剂靶蛋白质由线粒体基因编码，并通过参照PCR反应期间产生的扩增子的存在或缺乏检测和定量所述突变的相对存在和缺乏。
在本发明该方面的进一步实施方式中提供了检测和定量真菌细胞色素b基因中一个或多个突变的频率的方法，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了植物病原真菌对真菌杀虫剂的抗药性，该杀真菌剂靶蛋白质由线粒体基因编码，所述方法包括：检测PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述的PCR反应包括在适合的核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用适合引物接触含有真菌核酸的试验样品，其中所述扩增子的检测直接与所述核酸中突变的存在和缺乏两种有关，其中所述突变的存在引起了对杀真菌剂的真菌抗药性，该杀真菌剂靶蛋白质由线粒体基因编码，并通过参照PCR反应期间产生的扩增子的存在或缺乏，检测和定量所述突变的相对存在和缺乏。
在本发明该方面的进一步优选实施方式中提供了检测和定量真菌细胞色素b基因中一个或多个突变的频率的方法，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了植物病原真菌对真菌杀虫剂的抗药性，该杀真菌剂靶蛋白质由线粒体基因编码，所述方法包括在适合核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品以检测所述核酸中特定突变的存在和缺乏，特定突变的存在引起了对所述杀真菌剂的抗药性，使得仅当样品中存在适合的真菌模板时，才延伸与特定突变缺乏和存在有关的诊断引物；并通过参照诊断引物延伸产物的存在或缺乏，检测和定量所述突变的相对存在和缺乏。
在上述方面和实施方式中描述的本发明方法特别适合用于植物病原真菌株系，其中细胞色素b基因中突变的存在引起了真菌抗药性，最特别地是引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物的抗药性，最特别地是由于在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的密码子第一位置从T到C碱基改变的突变，和/或在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的密码子第三位置从T或C到A或G碱基改变的突变，优选地，由于在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的密码子第一位置从T到C碱基改变的突变，或优选地，由于在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的密码子第三位置从T或C到A或G碱基改变的突变，最优选地，由于在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的密码子第三位置从C到A碱基改变的突变，所以真菌DNA中的突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了苯丙氨酸残基的置换。
然而，本发明另一个方面提供了筛选应用于农作物的活性杀真菌剂和其最佳施用水平的方法，包括：分析具有感染所述农作物能力的的真菌样品，和检测和/或定量所述真菌的细胞色素b基因中一个或多个突变的存在和/或缺乏，所述突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换，其中所述突变的存在可以引起对杀真菌剂的抗药性，该杀真菌剂的靶蛋白质由线粒体基因编码，然后筛选活性杀真菌剂和其最佳施用水平。这可以例如通过用本发明方法首先测试目的植物病原真菌中F129L突变出现的频率来完成。一旦对F129L突变出现的天然出现频率进行了最初的评估，就可以试验不同真菌控制方案。例如，可以将一定范围不同比率和/或数量和/或施用频率的杀真菌剂(优选作为嗜球果伞素杀真菌剂)施用于真菌的进一步试验样品(优选谨慎维持恒定的疾病选择压力)，并且对于每一个方案，可以用本发明方法评估F129L突变出现的频率。然后可以绘出所使用的真菌控制方案和F129L突变的介导的抗药性的出现频率之间的相关性。本领域技术人员从该相关性能容易地评估最好的真菌控制方案以维持真菌控制和对所用真菌试剂的低水平抗药性。
在本发明该方面特别优选的实施方式中，检测方法包括任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术，更优选地，包括在适合的核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，利用用于特定突变的诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品，这样当在样品中存在所述突变时，延伸诊断引物；通过参照诊断引物延伸产物的存在或缺乏，检测所述突变的存在或缺乏，并且定量通过如下方式来实现：在适合核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用诊断引物接触含有真菌核酸的试验样品以检测所述核酸中特定突变的存在和缺乏，所述突变的存在引起了对杀真菌剂的抗药性，该杀真菌剂靶蛋白质由线粒体基因编码，使得当在样品中存在适合的真菌模板时，延伸与特定突变缺乏和存在有关的诊断引物；通过参照诊断引物延伸产物的存在或缺乏，检测和定量所述突变的相对存在和缺乏。
在本发明该方面进一步特别优选的实施方式中，检测方法包括：在适合的核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，将用于特定突变的诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品，这样仅当在样品中存在所述突变时，才延伸诊断引物；通过参照诊断引物延伸产物的存在或缺乏，检测所述突变的存在或缺乏，并且，通过如下方式实现定量：在适合核苷三磷酸和聚合试剂存在的情况下，用诊断引物接触含有真菌核酸的试验样品以检测所述核酸中特定突变的存在和缺乏，所述突变的存在引起了对杀真菌剂的抗药性，该杀真菌剂的靶蛋白质由线粒体基因编码，以致仅当在样品中存在适合的真菌模板时，才延伸与特定突变缺乏和存在有关的杂交诊断引物；和通过参照诊断引物延伸产物的存在或缺乏，检测和定量所述突变的相对存在和缺乏。
在本发明该方面特别优选的实施方式中，检测方法包括任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术，更优选地，包括将用于特定突变的等位基因特异性杂交探针接触包含真菌核酸的试验样品，以致当在样品中存在所述突变时，杂交探针杂交；通过试验样品中野生型(F129)植物病原体细胞色素b基因量的检测和定量，检测所述突变的存在或缺乏，而定量通过如下方式来实现：在适合核苷三磷酸和聚合试剂存在的情况下，用等位基因特异性探针接触含有真菌核酸的试验样品以检测所述核酸中特定突变的存在和缺乏，所述突变的存在引起了对杀真菌剂的抗药性，线粒体基因编码该杀真菌剂的靶蛋白质，以致当在样品中存在适合的真菌模板时，与特定突变缺乏和存在有关的杂交探针杂交；通过参照杂交产物的存在或缺乏，检测和定量所述突变的相对存在和缺乏。
这里描述的本发明方法特别适合用于植物病原真菌株系，其中细胞色素b基因中突变的存在引起了杀真菌剂抗药性，最特别地是引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物的抗药性，并且其中真菌DNA中的突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸残基的置换，更特别地引起了编码蛋白质中F129L置换，特别地，其中在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的密码子第一位置，突变是T到C碱基的改变，或其中在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的密码子第三位置，突变是从T或C到A或G碱基的改变，优选C到A碱基改变。
本发明另一方面提供了控制农作物真菌感染的方法，包括给农作物施用杀真菌剂，其中根据上述本发明的任何筛选方法筛选所述杀真菌剂。
上述本发明的方法特别适合用于植物病原真菌株系，其中真菌细胞色素b基因中一个或多个突变的存在引起了编码蛋白质中F129L的置换，其中所述突变的存在引起了杀真菌剂抗药性，最特别地，所述突变的存在引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物的抗药性。
本方面的另一方面提供了用于杀真菌活性化合物检测的测定法，包括：对真菌株系筛选化合物，其中已根据这里描述的本发明方法检测了该真菌的真菌细胞色素b基因中一个或多个突变的缺乏或存在，该突变引起了编码蛋白质中F129L的置换，引起了杀真菌剂抗药性，该杀真菌剂的靶蛋白质由线粒体基因编码；然后确定对所述真菌株系的杀真菌活性。
这里描述的本发明方法特别适合用于植物病原性真菌株系，其中细胞色素b基因中一个或多个突变的存在引起了杀真菌剂抗药性，最特别地是引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物的抗药性，其中真菌DNA中的突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸残基的置换，更特别地引起了编码蛋白质中F129L置换，特别地，其中突变是在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基143的位置的密码子第一位置T到C碱基的改变，或突变是在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的密码子第三位置从T或C到A或G碱基的改变，优选从C到A碱基的改变。
通过应用这里描述的本发明方法，可以确定待施用于农作物的杀真菌剂的适合的施用率和/或杀真菌剂的适当联合。
这里描述的本发明方法特别适用于在作物中监测真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗药性组中化合物的抗药性，所述农作物如谷类，水果和蔬菜如菜籽油菜(canola)，向日葵，烟草，甜菜，棉花，大豆，玉米，小麦，大麦，稻，高粱，西红柿，芒果，桃，苹果，梨，草莓，香蕉，瓜，马铃薯，胡萝卜，莴苣，甘蓝，洋葱，葡萄树和草坪草。
这里描述的本发明方法对于检测真菌细胞色素b基因中低频率的一个或多个突变特别敏感，所述突变在编码蛋白质中引起了F129L的置换，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物的抗性，或使其成为筛选植物病原真菌是否发生杀真菌抗药性的特别有用的和商业上重要的方式，其中抗药性是由于上面描述的突变引起的。
ARMS和其它基于等位基因选择性扩增的定量PCR检测系统与技术如Taqman和Molecular Beacons等之间的关键不同是后面的方法依赖于等位基因辩别性杂交探针提供荧光信号的能力，该荧光信号与那时存在的靶PCR产物量成比例地相关。这意味着可以用单一，非选择性和常规的引物对扩增靶基因的野生型/亲本和变异体/突变体等位基因然后从来源于等位基因辩别性杂交探针的荧光信号读取来源于每个等位基因的PCR产物量，和在每轮PCR循环中与起始样品中存在的量直接相关的量。在Taqman测定法情况下，通过DNA聚合酶相关的5’外切核酶“释放”该信号，该5’外切核酶介导从杂交等位基因选择性探针的释放荧光团，而在Molecular Beacons情况下，通过5’和3’偶联荧光团和猝灭剂类在Beacon对靶等位基因杂交中的分离释放该信号。
在等位基因选择性扩增技术的情况下，如ARMS，基于引物特异性的差异PCR反应确定了反应中任何时候出现的特异性PCR产物的量，其又直接与起始样品中存在的等位基因的量相关。然后，通过非特异性技术，如嵌入双链DNA特异染料，如SYBRGreen I(MolecularProbes Inc.，4849 Pitchford Ave.，Eugene，Oregon，USA)或靶基因特异但等位基因非选择性的探针，如Scorpions实现存在的PCR产物量的定量测定。
如本领域技术人员将理解的，这些差异和它们的相关特征提供了区别性的优点和潜在的缺点，包括：-
●一旦得到常规靶基因选择性PCR引物，仅需要设计和验证单对SNP辩别性Taqman或Molecular Beacon探针。
●对于每个基于等位基因辩别ARMS/Scorpion的测定法，需要设计和验证等位基因选择性引物对(ARMS)和靶基因特异性杂交探针(Scorpions)。
●因为Scorpion探针与靶基因产物杂交的分子内特性，所以当利用Scorpion探针时，有高的信号强度和反应速度(Whitcombe D.，Theaker J.，Guy S.P.，Brown T.&Little S.(1999)NatureBiotechnology 17(1999)，804-807 Thelwell N.，Millington S.，Solinas A.，Booth J.，&Brown T.(2000)Nucleic Acids Research28(2000)3752-3761)。
●如果发生任何非特异性扩增，伴随非序列选择性双链DNA检测技术可能出现的复杂化，这可能是由于田地样品中污染DNA和/或引物二聚体形成的结果。
然而，在许多情况下，这些方法中每一种非常适于，例如检测和测量该申请中所述的细胞色素b基因等位基因F129和/或L129的相对量。当正在评估特定植物病原体相对均一分离物的基因型时，例如，怀疑嗜球果伞素/QoI杀真菌剂失效的各疾病样品，这是特别正确的。
然而，专家将理解，存在很重要的情形，其中基于等位基因选择性扩增的技术，特别是基于ARMS/Scorpions的技术提供的高度敏感和选择性能力，具有实际的优点。与该申请直接相关的特定情况是在来源于群体的核酸制备物的分析中，该群体包含这里描述的可替代SNPs，如F129和L129等位基因的混合物。更具体地，当可替代的SNPs的相对频率在广泛范围变化时就是这种情况。
将理解，正常地植物病原体的田间样品包含这种种群，并且实际上，分析来源于特定地理区域，种植园，葡萄园，农场，田地，果园或小块土地的代表性种群常常是农用化学品性能的最重要指标，该农用化学品性能受靶害虫中存在的SNPs，如编码细胞色素b基因中F129和L129等位基因的SNPs的影响。
本领域技术人员也将理解，线粒体编码的基因，如细胞色素b基因也构成了一种背景，其中分析种群技术的适用性特别重要。虽然生物体如植物病原体在它们营养生长阶段几乎总是单倍体或二倍体，具有0、1、1+1或0+2个拷贝的可替代的核编码的目的基因的等位基因，但是对于线粒体编码的基因，情况可能复杂得多。单个植物病原体每个核可能有数十个，有时数百个线粒体，单个线粒体其自身也可能具有多个线粒体基因组。因此，本质上线粒体基因是群体的成员，即使线粒体基因取自标称是个体的，微生物学纯化的分离物的样品，当与来自于同样样品的核基因比较时，线粒体基因群体更大，更复杂和多样。
用于分析种群，特别是重要的等位基因以相对低水平存在的种群的基于等位基因选择性扩增的定量PCR技术的较大适用性源于PCR方法的内在特性：它是基于指数扩增的技术(参见，例如：Saiki等，Science 230(1985)1350，PCR(Newton & Graham)3-5页(1994)BIOS Scientific Publishers ISBN 1 872748 82 1和The Encyclopediaof Molecular Biology(Kendrew & Lawrence编辑)864-866页(1994)Blackwell Science Ltd.ISBN 0 632 02182 9)。
首先，这意味如果在样品中以显著不同浓度(例如，100倍，1,000倍或10,000倍)存在能用普通引物对扩增的基因的两个等位形式，那么在PCR期间将维持它们相对的丰度。因此，通过等位基因特异性探针，如Taqman或Molecular Beacons退火获得的杂交信号的相对强度将总是反映该差异。低于100倍，1,000倍或10,000倍强度的荧光信号在背景水平上是极其难以检测的。其次，正常地，PCR反应受限于合成PCR产物所需核苷酸的完全利用。因此，在较低丰度种类的显著扩增可能开始前，高丰度种类的指数扩增可能严重地消耗或甚至用尽了核苷酸的供应。此外，杂交是动力学过程，并且在双分子反应，如Taqman和Molecular Beacons中，该速率是反应物浓度的函数。因此，较丰富PCR产物的较高浓度将引起与其相关探针以较高速率退火。作为这些因素的结果，我们发现在混合种群中，Molecular Beacon和Taqman测定法有效范围仅覆盖约10-50倍，并且更具体地，少于10倍的差异。
相比之下，等位基因选择性扩增技术不受由于等位基因/SNPs变化的浓度而引起的这种竞争效应的影响。在反映样品中特定等位基因/SNP存在的信号变得明显时的PCR循环是该等位基因起始浓度的简单函数。因为没有竞争扩增产物存在，所以没有对底物的竞争，并且荧光信号总是可以接近最大值。
结果，在平行反应中用适合的等位基因选择性扩增试剂分析包含不同等位基因/SNPs混合物的DNA群体时，可以在非常广泛的范围获得起始样品中等位基因/SNPs相对浓度的精确评估。典型地，我们发现用基于ARMS/Scorpions的测定法容易获得0.01-99.99％(104)的范围，常常可以获得0.001-99.999％(105)的范围，有时可以获得0.0001-99.9999％(106)的范围。
参考实施例和附图进一步举例说明了本发明。
图1：表描述了瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)分离物的来源和对腈嘧菌酯(azoxystrobin)的敏感性。
图2：表描述了对于腈嘧菌酯处理的草皮的疾病发展。
图3：对应于氨基酸73到283的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b区域的分子特征概述。
图4：两个共有K3758序列与部分野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b基因序列的碱基对对齐。
图5：两个共有K3758序列与部分野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b基因序列的氨基酸对齐。
图6：联合有义等位基因选择性ARMS引物用在瓜果腐霉(P.aphanidermatum)F129L测定中的反义Scorpion引物的茎-环二级结构。
图7：曲线图，表示用引物Pt129-1进行的野生型质粒扩增(孔A3和A4)和突变体质粒的扩增(孔A1和A2)。
图8：曲线图，表示表示用引物Pt129-4进行的突变体质粒的扩增(孔A1和A2)和野生型质粒扩增(孔A3和A4)。
图9：联合反义等位基因选择性ARMS引物用在瓜果腐霉(P.aphanidermatum)F129L测定中的有义Scorpion引物的茎-环二级结构。
图10：ARMS引物Pt129-A14和Pt129-C4在适合模板上的Ct值曲线图。
图11：ARMS引物Pt129-A14和Pt129-A14之间ΔCt对模板浓度的曲线图。
图12：曲线图，表示当向野生型(F129)等位基因恒定背景掺入10倍稀释度的抗药性(L129)等位基因时，用ARMS引物Pt129-A14进行的L129等位基因的扩增。
图13：用于瓜果腐霉(P.aphanidermatum)F129L测定中的log10DNA浓度对ΔCt的作图。
图14：表示用于植物剂量反应测定中的葡萄生单轴霉(P.viticola)样品I112和I116b制备的流程图。
图15：表示分离物I112和I116b的DNA对齐。
图16：表示分离物I112和I116b的氨基酸对齐。
图17：表示用于葡萄生单轴霉(P.viticola)的有义Scorpion引物。
图18：用于葡萄生单轴霉(P.viticola)F129L测定中的log10 DNA浓度对ΔCt的作图。
图19：表示用于葡萄生单轴霉(P.viticola)的反义Scorpion引物。
图20：表示两个马铃薯早疫病链格孢(A.solani)分离物的核苷酸对齐。
图21：表示两个马铃薯早疫病链格孢(A.solani)分离物的氨基酸对齐。
发明的详述
实施例
在下面实施例3，4，5，6，7，8，9，12，13，14，15，16和17中，用ScorpionTM系统(AstraZeneca Diagnostics)作为产物检测系统。在1998年11月25日Zeneca Limited提交的PCT申请号PCT/GB98/03521中充分地描述了该检测系统，这里并入该申请教导作为参考。这个新的检测系统利用具尾引物和整合信号系统。该引物有模板结合区和包含接头及靶结合区的尾部。在应用中，尾部的靶结合区与引物延伸产物的互补序列杂交。该靶特异性杂交事件与信号系统偶联，其中杂交引起了可检测的变化。该系统的检测方法提供了许多优于其它系统的重要优点。仅需要单个引物/检测者类型。基于与引物延伸产物杂交的靶结合区的容易获得，其提供了增加的简单性和增强的特异性。新合成的引物延伸产物是靶物质，因此获得的输出信号与延伸引物的量直接相关。它不取决于其它的杂交事件和酶促步骤。对探针位点的链内和链间竞争是有限的，因此探针设计变得简化。因为相互作用是单分子的，所以信号反应非常迅速，允许增加的循环速率，后者是实验效率的重要特征。
下述实施例中设计的Scorpion引物共同地有下列修饰：
●六乙二醇(hexethylene glycol，HEG)单体作为封闭部分，该封闭部分位于引物的模板结合区和尾部区之间，其中封闭部分阻止了聚合酶介导的引物模板尾部区的链复制。
●向引物5’末端添加FAM荧光分子。FAM是可以例如通过ABI PRISM7700仪器(PE Biosystems)的488nm激光容易检测到的荧光分子之一。
●MR(甲基红)是与尿嘧啶残基附着的非荧光猝灭剂。
在Scorpion引物设计中也可以包含其它的荧光分子和猝灭机制，并且适合用于本发明中。
在实施例18中，示例了依赖于TaqMan测定系统的测定法。
实施例1
对Qo位点抑制剂杀真菌剂显示了高水平抗药性的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分离物的鉴定
在1999年，Iowa State University的G.Peng，M.L.Gleason和F.W.Nutter提供给Zeneca Agricultural Products(现在的Syngenta Crop Protection)一系列22种瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分离物以允许勾画对腈嘧菌酯(azoxystrobin)的敏感性，Iowa State University的Guangbin Peng(Peng，G.等，Phytopathology 89(1999)S59.)以前测定了分离物对杀真菌剂mefenoxam的敏感性和在琼脂平板上分离物的生长速率。图1中显示这些分离物的背景信息和它们的腈嘧菌酯(azoxystrobin)抗药性概述。
为了能够评估上面分离物的腈嘧菌酯(azoxystrobin)(嗜球果伞素)抗药性，在含有砂质土的4×4平方英寸的塑料罐中生长多年生黑麦草(Lolium perenne L.)。用Agsorb吸附粘土(极细红色)固定种子，并且在种子周围提供高水平的湿度以帮助发芽。用喷雾嘴给罐子浇水，并且用纸盖住以减少蒸发。一天用喷雾嘴浇草皮罐子3-5次。当幼苗出现时，从罐子移去纸罩以防止黄化现象，用扇形喷嘴浇水减少到一天两次。处理前，在温室中(17-32℃；14h光周期)维持罐子12-16天。在这个期间，用电的Black and Decker手提式大剪刀剪草皮。
在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上维持图1中概述的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分离物培养物，用0.05g/L硫酸链霉素修改了该马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。在250ml塑料(聚氯乙烯)烧瓶中，用40ml去离子水过夜水合有机生长(organically grown)的黑麦谷粒(50g)。在接下来的期间，高压灭菌烧瓶2次，每次45分钟。麦粒冷却后，向每个烧瓶添加10个1×1cm瓜果腐霉(P.aphanidermatum)琼脂块。在生长室中(26℃；14h光周期)温育含有感染黑麦粒的烧瓶7天以允许真菌定居于黑麦粒。然后通过在每个罐子中心表面放置4个麦粒，用真菌定居的黑麦谷粒接种草皮。
以3美制加仑/1000平方英尺喷雾体积，用定位于草皮上方18英寸的扇形雾锥喷嘴(8004E)在自动喷室中施以腈嘧菌酯(azoxystrobin)处理。为了防止从一个处理到另一个处理的携带，以最低浓度开始，最高浓度结束进行施用。在两次处理间，用丙酮洗喷嘴一次，并且用去离子水(100ml/漂洗)洗两次。用Heritage(腈嘧菌酯)，以0.4，0.133，0.044，0.015，0.005和0盎斯Heritage/1000平方英尺的比率喷雾草皮。施用后，让草皮干燥，并转移到生长室(25-28℃；14 h光周期)过夜。
如前所述施用的一天后，用真菌定居的黑麦粒接种草坪。然后，随机选择所有的处理，放置在露水室中(25-28℃，14h光周期)中4天。在疾病评估前24h，移草皮到生长室中。接种后5天，评估每个罐中腐霉感染的草皮面积百分数。除了分离物99-150外，瓜果腐霉(P.aphanidermatum)的所有分离物都对腈嘧菌酯敏感(表1)。敏感分离物的ED80值落在已确定的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)基线分配的ED80值范围(图1)。发现分离物99-150对腈嘧菌酯是抗药性的。这是植物病原体真菌瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分离物对腈嘧菌酯抗药性的首次报道。
然后，用比Heritage腈嘧菌酯推荐的商用比率高一直到9倍的比率：3.6，1.2，0.4，0.133，0.044，0.015，0.005和0盎斯/1000平方英尺，通过在两个单独实验中实验证实了抗药性分离物99-150和敏感分离物P32R的敏感性。敏感分离物P32R根据所用比率对腈嘧菌酯反应，在最高比率时感染草皮的百分数急剧下降。即使在比Heritage腈嘧菌酯推荐的比率高9倍时，抗药性分离物99-150也不对腈嘧菌酯反应(表2)。
这项工组中研究的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分离物的前处理的信息是有限的。无论如何，我们认为表1中没有收集日期信息的分离物从来没有暴露于嗜球果伞素，因为一些分离物是在这些杀真菌剂商品化引入前，早于6年以前收集的。然而，1998年收集的分离物(包括抗药性分离物99-150)可能曾暴露于嗜球果伞素。施用的数量未知。
为了在分子水平上进一步研究以研究抗药性机理，将抗药性分离物90-150送到英国的the Syngenta Jealott’s Hill InternationalResearch Station。在Jealott’s Hill收到分离物99-150后，分配给分离物99-150保藏号K3758。
实施例2
与野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b基因比较，瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分离物K3758(99-150)细胞色素b基因的定向克隆和测序
用下述方法进行瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分离物K3758(99-150)细胞色素b基因的表征，如表3所概述。
通过最初在25℃，12小时荧光灯下，在马铃薯葡萄糖琼脂(Oxoid)上培养7天制备用于分析的K3758，根据制造商的介绍说明进行制备。然后，在无菌条件下，收获等份的菌丝体生长物，接种到100mls如下制备的甘油肉汤中：
甘油 2ml
酵母提取物 1g
MgSO4·7H2O 0.05g
NaNO3 0.6g
KCl 0.05g
KH2PO4 0.15g
加H2O 到100ml
充分混合，在15磅/平方英寸高压灭菌15分钟。
然后，在25℃，在定轨摇床上温育培养物7天。然后通过在Richardson瓶子中离心收集由此得到的菌丝体生长物，在-80℃作为冷冻沉淀贮藏以备分析。然后，用Qiagen DNeasy植物小量制备试剂盒，除了最初的提取步骤外，基本上根据制造商的方案在两个单独等份的200mg菌丝体上进行基因组DNA的制备。
在第一菌丝体样品的情况下，该提取物是通过在Qiagen试剂盒的400μl缓冲液AP1和4μl Rnase及BIO 101 FastDNATM试剂盒的“裂解基质联合3”″(1/4″sphere+garnet基质)中浸解菌丝体来进行。在FP120 FastPREPTM仪器中(Anachem Ltd.，Anachem House，CharlesStreet，Luton，Bedfordshire LU20EB，UK)以设定速度5进行该提取本身4×40秒(总共160秒)。然后，在13,000rpm离心提取管5分钟以沉淀残渣。然后转移上清液到1.5ml微量离心管，通过依照Qiagen DNeasy植物小量制备试剂盒程序的步骤3-13完成DNA的制备，用2×100μl缓冲液AE进行最终基因组DNA洗脱。
通过向2ml微量离心管中的菌丝体沉淀添加400μl缓冲液AP1和4μl Rnase及无菌钢珠进行第二个样品的提取。然后在SpexCertiPrep 8000 Mixer Mill(Glen Creston Ltd)中搅拌该管10分钟。如前述，然后转移上清液到1.5ml微量离心管，通过依照QiagenDNeasy植物小量制备试剂盒程序的步骤3-13完成DNA的制备，同时用2×100μl缓冲液AE进行最终基因组DNA洗脱。
然后，为了细胞色素b基因的PCR扩增，用无菌蒸馏H2O(纯的，1∶10和1∶100)进行每个基因组DNA制备物的10倍系列稀释。然后用每个稀释度的10μl作为PCRs模板，其中在每种情况下，一式两份地用引物17F和15R进行所述PCRs，引物17F和15R跨越真菌细胞色素b基因氨基酸73到283的编码区(根据酿酒酵母(S.cerevisiae)的编号系统)。
17F： 5’AAATAACGGTTGGTTAATTCG 3’
15R： 5’TCTTAAAATTGCATAAAAAGG 3’)PCR循环条件包括起始在94℃温育3分钟，随后94℃45秒、42℃45秒和72℃1分钟30秒进行30轮循环。为了结束PCR，也包括最终延伸步骤在72℃进行10分钟。在根据制造商(Invitrogen)的程序，克隆反应产物到pCR2.1-TOPO中前，通过凝胶电泳分析反应产物。然后，挑选来源于每个克隆事件的10个转化体用于Wizard Plus质粒DNA制备(Promega)。为了证实PCR产物存在，用限制酶EcoRI消化质粒DNAs，通过凝胶电泳分析。然后，用M13正向和反向引物测序来源于每个起始K3758样品的5个单独质粒中正确大小的插入片段(ABi377XL自动测序仪)。用适合的分析程序(Seqman，Editseq和Macaw)分析序列数据。
然后，对齐两个分离物K3758样品推导的细胞色素b基因序列和先前测定的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)WT(野生型)序列。在图4和图5中显示了核苷酸和氨基酸对齐，其中用如在遗传密码(GeneticCodes)(NCBI分类学)：
Http：//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wprintgc？mode＝t中所述的“Mold，Protozoan and CoelenterateMitochondrial Code-Number 4”预测了氨基酸序列。该分析的显著特征是：
●野生型和K3758细胞色素b序列的高水平同一性，具有仅仅单核苷酸和由此产生的氨基酸的置换。
●发现了野生型和K3758在对应于残基143的区域有相同序列，在上述区域，我们自己和其它人发现了在植物病原性真菌中所有以前Qo靶位点抗药性突变体存在突变(Windass等，WO 00/66773；Sierotzki等，Pest Manag.Sci.56(2000)833-841；Sierotzki等，Pest Biochem.Physiol.68(2000)107-1120).
●在对应于酵母细胞色素b残基129的位置单苯丙氨酸到亮氨酸置换的存在(F129L)。
更详细地考虑该结果：所有10个测序的K3758插入片段都有作为密码子氨基酸129第三碱基的A。分析样品1的5个插入片段，2个含有怀疑是PCR错误的其它序列差异(小量制备2含有3个差异，小量制备3含有2个差异)，而且共有序列2的5个插入片段中，3个含有序列差异(小量制备1含有2个差异，小量制备4含有2个差异，小量制备5含有3个差异)，再一次怀疑该序列差异是通常的PCR错误。因此，只有在对应于密码子129第三碱基位置的A残基的存在是K3758和野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b序列间的一致差异。
有趣地，已经报道了在酿酒酵母(S.cerevisiae)，荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)和Chlamydomonas reinhardtii中F129L置换赋予了对myxothiazol(另一个Qo抑制剂)的抗药性(Esposti等，Biochimica et Biophysica Acta，1143(1993)243-271)。然而，在植物病原真菌中先前没有这种置换的报道。
实施例3
具有区别野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和株系K3758中发现的F129和L129等位基因的能力的ARMS引物的设计
利用根据实施例2获得的野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和分离株K3758的细胞色素b基因的序列，设计各种特异性ARMS引物以检测该F129L点突变的存在或缺乏：
基于野生型序列的三个正向ARMS引物：
Pt129-1 TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT
C
pt129-2 TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT
C
pt129-3 TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT
C
基于F129L突变的三个正向ARMS引物：
Pt129-4 TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT
A
Pt129-5 TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT
A
Pt129-6 TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT
A
及设计的点突变上游的对照引物：
Pt129-S TATTTTTATTTTAATGATGGCAACA
C
在每个上述ARMS引物中，-1碱基(引物序列的3’末端碱基)对应于靶点突变位点。以粗体显示的碱基不同于野生型瓜果腐霉(P,aphanidermatum)细胞色素b序列。在Pt129-1和Pt129-4引物中，-2位置从T变为A碱基。在Pt129-2和Pt129-5引物中，-2位置从T变为C碱基。在Pt129-3和Pt129-6引物中，-2位置从T变为G碱基。对序列进行这些替代将使模板/引物杂合体去稳定，使得任何引物更特异地针对相应的模板延伸。文献中的例子已经表明去稳定ARMS引物降低了引物对错误模板上错误引发的风险(Newton等，Nucleic AcidResearch 17(7)2503-2516 1989)。
通过Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，在每500μl总体积重蒸馏无核酸酶的H2O中，稀释引物到5μM。然后，在PCR中，进一步稀释引物到500nM的终浓度。
实施例4
用在监测瓜果腐霉(P.aphanidermatum)F129和L129等位基因状态中的Scorpion引物的设计
再一次利用根据实施例2获得的野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和分离株K3758的细胞色素b基因的序列，通过向反向PCR引物中掺入检测系统，设计ScorpionTM寡核苷酸以检测野生型和L129等位基因的选择性扩增，所述反向PCR引物被设计与实施例3描述的ARMS SNP检测和标准引物一起使用。用ARMS引物得到的扩增子是172bp长，用对照引物得到的扩增子是176bp长。
更具体地，用Oligo 5和MFold程序(MFold应用Zucker的能量最小化方法预测RNA或DNA分子的最佳和次佳二级结构(Zucker，M.(1989)Science 244，48-52；SantaLucia，J.Jr.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，1460-1465)设计Scorpion引物。
由此得到的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)Scorpion引物序列是：
其中下划线区是发夹形成部分(当Scorpion引物未反应时)；FAM是荧光素染料；MR(甲基红)是与尿嘧啶残基附着的非荧光猝灭剂，HEG是复制阻断六乙二醇单体。斜体序列是反向引物序列，粗体序列是结合反向引物真正的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b延伸产物的Scorpion引物。
用Mfold程序可以观察该Scorpion引物的茎-环二级结构(参见图6)，并且预测当其不与靶细胞色素b基因杂交时，其有-1.9kcal/mol的能量。然而，在延伸产物存在的情况下，因为Scorpion引物的探针序列以预测的-4.9kcal/mol能量结合延伸产物，所以发夹结构分离。这使猝灭剂与FAM染料分离，引起了例如通过ABI Prism 7700仪器可检测的荧光发射。因此，与Scorpion茎-环比较，新合成链与Scorpion成分的退火是能量上有利的。
通过Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成Scorpion引物。在使用前，在500μl总体积重蒸馏无核酸酶的H2O中，稀释引物到5μM。然后，在PCR中，进一步稀释引物到500nM的终浓度。
实施例5
对用于检测和定量株系K3758中发现的F129L SNP的ARMS和Scorpion引物的用途的验证
在所有ARMS/ScorpionTM F129L SNP检测测定法中，AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystems)以1单位/25μl反应包含在反应混合物中。反应混合物还含有1x缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，3.5mM MgCl2，0.01％明胶)和100μM dNTPs(Amersham PharmaciaBiotech)。在ABI Prism 7700仪器中进行扩增用于连续荧光监测。95℃，10分钟进行最初循环，随后通过95℃，15秒和60℃，45秒进行50轮循环。在所有循环的退火/延伸步骤期间检测荧光。
通过利用各种浓度的质粒DNA作为模板，首先验证引物在这种分析中的用途。进行这个以检查引物设计的特异性和灵敏性。如先前实施例2所述，将从两个瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分离物扩增的部分野生型细胞色素b基因序列和含有F129L突变的相应序列段克隆到TA pCR2.1载体(Invitrogen)中。保存挑选用于Wizard Plus质粒DNA制备(Promega)(见实施例2)的来源于每个克隆事件的10个转化体的150μl细菌培养物，在进行这些制备前，4℃贮藏。序列分析后，注意到不含有与共有序列的序列差异的野生型和突变型质粒DNA样品。按照制造商的程序，挑选这些野生型和突变型质粒DNA序列所来源的细菌培养物用于质粒DNA大量制备(Qiagen)。定量由此得到的质粒DNA，并且用无菌重蒸馏H2O稀释到1μg/μl(2×1011分子/μl)的浓度。
在重蒸馏H2O中，进一步稀释野生型和突变型质粒DNA盒子到10pg/μl(或2×106分子/μl)的浓度，并且用其作为模板以验证ARMS引物的特异性。在上述PCR条件下，对野生型和突变模板及没有模板(只有水)的对照试验每种ARMS引物。Pt129-1和Pt129-4引物优选于Pt129-2和Pt129-3及Pt129-5和Pt129-6引物，因为重复两次PCR产生了更一致的结果且更特异。在不适当(突变)模板上出现扩增前，野生型ARMS引物Pt129-1给出15.27循环的窗(window)(图7)。在不适当(野生型)模板上出现扩增前，突变ARMS引物Pt129-4给出16.96循环的窗。
在选择了用于点突变检测的适合ARMS引物后，进一步验证此测定法，这样在用它测试生物样品的L129突变存在前，充分理解了它的检测灵敏性。第一验证步骤在于确立对于选定的ARMS引物，是否特异性窗在野生型和突变型模板DNA浓度的6个数量级范围内变化。在1mg/ml浓度的牛血清白蛋白(BSA)(最少96％V级份粉末，Sigma A9647)中通过10倍稀释度系列稀释前述野生型和突变型质粒DNA盒子。模板浓度覆盖2×108分子/μl到2×102分子/μl的范围。如上所述，用引物Pt129-1，Pt129-4和Pt129-S，在ARMS/Scorpion测定法中试验两个质粒DNA盒子和没有模板(只有水)的对照。
表18：利用ARMS引物129-4(L129等位基因选择性)来自于特异性窗试验的结果
| 质粒浓度 | A Ct(突变体) | C Ct(野生型) | ΔCt |
| 2×108 | 19.68 | 43.17(1rep) | 23.49 |
| 2×107 | 21.96 | 40.74 | 18.78 |
| 2×106 | 26.71 | 无C | n/a |
| 2×105 | 32.55 | 无C | n/a |
| 2×104 | 36.46 | 无C | n/a |
| 2×103 | 39.89 | 无C | n/a |
| 2×102 | 43.45 | 无C | n/a |
表19：利用ARMS引物129-1(F129等位基因选择性)来自于特异性窗试验的结果
| 质粒浓度 | A Ct(突变体) | C Ct(野生型) | ΔCt |
| 2×108 | 41.68 | 19.73 | 21.95 |
| 2×107 | 42.56 | 22.25 | 20.31 |
| 2×106 | 44.24 | 25.86 | 18.38 |
| 2×105 | 47.0 | 29.56 | 17.44 |
| 2×104 | 46.12(1rep) | 33.38 | 12.32 |
| 2×103 | 44.21 | 36.55 | 7.66 |
| 2×102 | 无A | 40.39 | n/a |
这些结果表明ARMS引物Pt129-1和Pt129-4不以相同Ct(循环阈值，荧光的改变增加超过上述背景水平时的PCR循环数)值从它们各自正确的模板扩增，并且看起来该差异取决于质粒DNA的浓度。还有对于引物Pt129-1，在测定法中试验的模板DNA浓度范围内，正确和错误模板扩增之间的Ct不保持恒定。虽然这些起始ARMS引物确实显示了一些必要特征，但是它们没有提供理想测定法的基础，因此决定用点突变上游的正向Scorpion引物联合反向ARMS引物对重新设计测定法。
实施例6
具有区别野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和株系K3758中发现的F129和L129等位基因能力的其它ARMS引物的设计
利用根据实施例2获得的野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和分离物K3758细胞色素b基因的序列，设计第二套特异性ARMS引物以检测该F129L点突变的存在或缺乏：
基于野生型序列的六个反向ARMS引物：
Pt129-C1 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA
G 3’
Pt129-C2 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA
G 3’
Pt129-C3 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA
G 3’
Pt129-C4 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C
T G 3’
Pt129-C5 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C
T G 3’
Pt129-C6 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C
T G 3’
基于F129L突变的的十五个反向ARMS引物：
Pt129-A1 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA
T 3’
Pt129-A2 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA
T 3’
Pt129-A3 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA
T 3’
Pt129-A4 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C
T T 3’
Pt129-A5 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C
T T 3’
Pt129-A6 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C
T T 3’
Pt129-A7 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC
CAC T 3’
Pt129-A8 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC
CAC T 3’
Pt129-A9 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC
CAC T 3’
Pt129-A10 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC
CCT T 3’
Pt129-A11 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC
CCT T 3’
Pt129-A12 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC
CCT T 3’
Pt129-A13 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC
CGT T 3’
Pt129-A14 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC
CGT T 3’
Pt129-A15 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC
CGT T 3’
并设计点突变下游的两个反向对照引物：
Pi129-S4 5’TTG ACCCCA AGGTAATAC ATA ACCC 3’
Pt129-S6 5’TTG ACCCCA AGGTAATAC ATA ACTC 3’
在每个上述ARMS引物中，-1碱基(引物序列3’末端的碱基)对应于靶点突变位点。粗体显示的碱基不同于野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b序列。在Pt129-C1和Pt129-A1引物中，-2位置从T变为A碱基(在反向互补中)。在Pt129-C2和Pt129-A2引物中，-2位置从T变为C碱基(在反向互补中)。在Pt129-C3和Pt129-A3引物中，-2位置从T变为G碱基(在反向互补中)。在Pt129-C4和Pt129-A4引物中，-3位置从A变为T碱基(在反向互补中)。在Pt129-C5和Pt129-A5引物中，-3位置从A变为C碱基(在反向互补中)。在Pt129-C6和Pt129-A6引物中，-3位置从A变为G碱基(在反向互补中)。在Pt129-A7引物中，-5位置从C变为T碱基，-2位置从T变为C碱基(在反向互补中)。在Pt129-A8引物中，-5位置从C变为A碱基，-2位置从T变为C碱基(在反向互补中)。在Pt129-A9引物中，-5位置从C变为G碱基，-2位置从T变为C碱基(在反向互补中)。在Pt129-A10引物中，-5位置从C变为T碱基，-3位置从A变为C碱基(在反向互补中)。在Pt129-A11引物中，-5位置从C变为A碱基，-3位置从A变为C碱基(在反向互补中)。在Pt129-A12引物中，-5位置从C变为G碱基，-3位置从A变为C碱基(在反向互补中)。在Pt129-A13引物中，-5位置从C变为T碱基，-3位置从A变为G碱基(在反向互补中)。在Pt129-A14引物中，-5位置从C变为A碱基，-3位置从A变为G碱基(在反向互补中)。在Pt129-A15引物中，-5位置从C变为G碱基，-3位置从A变为G碱基(在反向互补中)。对序列进行这些替代改变可使模板/引物杂合体去稳定，使得任何引物更特异地针对相应的模板延伸。文献中的例子已经表明去稳定ARMS引物降低了引物在错误模板上错误引发的风险(Newton等，Nucleic Acid Research 17(7)2503-2516 1989)。
通过Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，在每500μl总体积重蒸馏无核酸酶的H2O中，稀释引物到5μM。然后，在PCR中，进一步稀释引物到500nM的终浓度。
实施例7
用在监测瓜果腐霉(P.aphanidermatum)F129和L129等位基因状态中的其它Scorpion引物的设计
再一次利用根据实施例2获得的野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和分离物K3758的细胞色素b基因的序列，通过向正向PCR引物中掺入检测系统，设计ScorpionTM寡核苷酸以检测野生型和L129等位基因的选择性扩增，所述正向PCR引物经设计可以与实施例3描述的ARMS SNP检测和标准引物一起使用。用ARMS引物得到的扩增子是126bp长，用对照引物得到的扩增子是129bp长。
更具体地，用Oligo 5和MFold程序(Mfold使用Zucker的能量减小化方法预测RNA或DNA的最佳和次佳二级结构(Zucker，M.(1989)Science 244，48-52；SantaLucia，J.Jr.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，1460-1465)设计Scorpion引物。
由此得到的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)Scorpion引物序列是：
其中下划线区是发夹形成部分(当Scorpion引物未反应时)；FAM是荧光素染料；MR(甲基红)是与尿嘧啶残基附着的非荧光猝灭剂，HEG是复制阻断六乙二醇单体。斜体序列是正向引物序列，粗体序列是结合正向引物的真正瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b延伸产物的Scorpion序列。
用Mfold程序可以观察该Scorpion引物的茎-环二级结构(参见图9)，并且预测当其不与靶细胞色素b基因杂交时，其有-1.9kcal/mol的能量。然而，在延伸产物存在的情况下，因为Scorpion引物的探针序列以预测的-5.6kcal/mol能量杂交延伸产物，所以发夹结构分离。这使猝灭剂与FAM染料分离，引起了例如通过ABI Prism 7700仪器可检测的荧光发射。因此，与Scorpion茎-环比较，新合成链与Scorpion成分的退火是能量上有利的。
通过Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成Scorpion引物。在使用前，在500μl总体积重蒸馏无核酸酶的H2O中，稀释引物到5μM。然后，在PCR中，进一步稀释引物到500nM的终浓度。
实施例8
对用于检测和定量株系K3758中发现的F129L SNP的ARMS和Scorpion引物的用途验证
在所有ARMS/ScorpionTM F129L SNP检测测定法中，AmpliTaq Gold酶(Perkin-Elmer/ABI)以1单位/25μl反应包含在反应混合物中。反应混合物还含有1x缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，3.5mM MgCl2，0.01％明胶)和100μM dNTPs(Amersham PharmaciaBiotech)。在ABI Prism 7700仪器中进行扩增用于连续荧光监测。95℃，10分钟进行最初循环，随后通过95℃，15秒和60℃，45秒进行50轮循环。在所有循环的退火/延伸步骤期间检测荧光。
涉及验证此测定法的第一步是测试ARMS引物在扩增期间区分F129(野生型)和L129(突变型)等位基因的潜能，在重蒸馏H2O中，将如实施例5所述的野生型和突变型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b质粒DNA构建体稀释到10pg/μl(或2×106分子/μl)的浓度，然后用其作为模板以验证ARMS引物的选择性。在上述PCR条件下，对野生型和突变型模板及在没有模板(只有水)的对照中试验每种ARMS引物。在下表20中概述了该结果。
表20：对设计的ARMS引物的选择性的验证
| 引物 | C Ct | A Ct | ΔCt | 观察到的A∶C比 | NTC扩增 |
| Pt129-C1 | 25.79 | 42.6 | 16.81 | 1∶114898 | 无 |
| Pt129-C2 | 20.42 | 43.57 | 23.15 | 1∶9307743 | 无 |
| Pt129-C3 | 29.7 | 无A | n/a | 全为C | 无 |
| Pt129-C4 | 21.28 | 无A | n/a | 全为C | 无 |
| Pt129-C5 | 20.1 | 42.36 | 22.26 | 1∶5022589 | 无 |
| Pt129-C6 | 19.63 | 44.17 | 24.54 | 1∶24393610 | 无 |
| Pt129-A1 | 32.33 | 26.54 | 5.79 | 55∶1 | 无 |
| Pt129-A2 | 34.01 | 20.87 | 13.14 | 9026∶1 | 无 |
| Pt129-A3 | 40.2 | 31.29 | 8.91 | 481∶1 | 无 |
| Pt129-A4 | 38.8 | 24.42 | 14.38 | 21321∶1 | 无 |
| Pt129-A5 | 32.51 | 21.42 | 11.09 | 2179∶1 | 无 |
| Pt129-A6 | 33.47 | 21.3 | 12.17 | 4608∶1 | 无 |
| Pt129-A7 | 22.28 | 36.33 | 14.05 | 16961∶1 | 无 |
| Pt129-A8 | 22.11 | 35.87 | 13.76 | 13873∶1 | 无 |
| Pt129-A9 | 22.14 | 37.1 | 14.96 | 31871∶1 | 无 |
| Pt129-A10 | 27.2 | 31.4 | 4.2 | 18.4∶1 | 无 |
| Pt129-A11 | 24.85 | 31.25 | 6.4 | 84.4∶1 | 无 |
| Pt129-A12 | 27.46 | 30.16 | 2.7 | 6.5∶1 | 无 |
| Pt129-A13 | 23.19 | 41.99 | 18.8 | 456419∶1 | 无 |
| Pt129-A14 | 23.1 | 43.5 | 20.4 | 1383604∶1 | 无 |
| Pt129-A15 | 30.05 | 无C | n/a | 全为A | 无 |
| Pt129-S4 | 19.06 | 18.98 | - | - | 无 |
| Pt129-S6 | 20.43 | 20.84 | - | - | 无 |
这些结果表明L129等位基因选择性(突变)引物Pt129-A14和引物Pt129-A15在对适当模板和不适当模板扩增之间给出了最大特异性窗(20.4循环，并且各自没有不适当模板的扩增)。引物Pt129-A15不结合不适当模板，然而对正确模板的扩增非常晚，30个循环。因此引物Pt129-A14是优选的L129等位基因选择性(突变)ARMS引物，因为其在正确模板上有较早的Ct值。引物Pt129-C4是优选的F129等位基因选择性(野生型)ARMS引物，因为其不结合不适当模板。引物Pt129-S4是优选的标准引物。因此，利用这些引物完成对测定法的验证。
然而，即使模板在相同浓度，L129等位基因特异性(突变)引物Pt129-A14看来也比F129等位基因选择性(野生型)引物Pt129-C4给出晚约5轮循环的Ct值。通过在一系列模板浓度下检查引物间Ct值差异是否保持恒定进一步评估这个问题。
在选择了用于点突变检测的适合ARMS引物对后，在用测定法测试生物样品的L129突变存在前，进一步验证测定法以充分理解检测的灵敏性。因此，进行的下一步研究是确定在模板DNA浓度的6个数量级范围内，对于选定的ARMS引物，Pt129-C4和Pt129-A14，特异性窗是否变化，及当两个引物均扩增它们各自正确的模板时，在该模板DNA浓度范围内，是否F129和L129等位基因选择性ARMS引物之间的Ct值差异保持恒定。在1mg/ml浓度牛血清白蛋白(BSA)(最少96％V级份粉末，Sigma A9647)中10倍稀释度系列稀释前述野生型和突变Cytb质粒DNA构建体。模板浓度覆盖2×108分子/μl到2×102分子/μ1的范围。如上所述，利用每个浓度的两个质粒DNA盒子作为模板，及在没有模板(只有水)的对照中，在测定法中测试ARMS引物Pt129-C4和Pt129-A14和标准引物Pt129-S4。
表21：在质粒DNA模板稀释范围中引物Pt129-A14的结果
| 质粒浓度 | A(L129)Ct | C(F129)Ct | ΔCt | 观察到的A∶C比 | NTC扩增 |
| 2×108 | 17.9 | 35.42 | 17.52 | 187951∶1 | 无 |
| 2×107 | 20.56 | 38.75 | 18.19 | 299044∶1 | 无 |
| 2×106 | 24.2 | 44.59 | 20.39 | 1374047∶1 | 无 |
| 2×105 | 28.58 | 无C | n/a | 全为A | 无 |
| 2×104 | 31.56 | 无C | n/a | 全为A | 无 |
| 2×103 | 34.63 | 无C | n/a | 全为A | 无 |
| 2×102 | 36.97 | 无C | n/a | 全为A | 无 |
表22：在质粒DNA模板稀释范围中引物Pt129-C4的结果
| 质粒浓度 | A(L129)Ct | C(F129)Ct | ΔCt | 观察到的A∶C比 | NTC扩增 |
| 2×108 | 无A | 13.91 | n/a | 全为C | 无 |
| 2×107 | 无A | 15.51 | n/a | 全为C | 无 |
| 2×106 | 无A | 19.67 | n/a | 全为C | 无 |
| 2×105 | 无A | 23.23 | n/a | 全为C | 无 |
| 2×104 | 无A | 26.15 | n/a | 全为C | 无 |
| 2×103 | 无A | 29.64 | n/a | 全为C | 无 |
| 2×102 | 无A | 33.58 | n/a | 全为C | 无 |
表23：在质粒DNA模板稀释范围中引物Pt129-S4的结果
| 质粒浓度 | A(L129)Ct | C(F129)Ct | NTC扩增 |
| 2×108 | 13.86 | 14.08 | 无 |
| 2×107 | 15.02 | 15.33 | 无 |
| 2×106 | 18.85 | 19.77 | 无 |
| 2×105 | 22.33 | 22.75 | 无 |
| 2×104 | 25.44 | 25.46 | 无 |
| 2×103 | 29.33 | 29.17 | 无 |
| 2×102 | 32.15 | 33.31 | 无 |
这些结果表明对于大多数浓度的质粒DNA模板，用L129等位基因选择性(突变)引物，Pt129-A14对适当和不适当模板扩增之间的ΔCt约是18-20轮循环，但是当质粒DNA模板浓度进-步减少时，观察到对不适当模板的扩增中止。在整个模板浓度范围中，F129等位基因选择性(野生型)引物，Pt129-C4仅结合适当模板。因此，对于L129和F129等位基因选择性引物Pt129-A14和Pt129-C4，在整个模板浓度范围中，特异性窗是恒定的。
表24：对于L129和F129等位基因选择性引物，适当模板上的Ct值比较
| 质粒浓度 | Pt129-A14 Ct(L129模板) | Pt129-C4 Ct(F129模板) | ΔCt(L129-F129) |
| 2×108 | 17.9 | 13.91 | 3.99 |
| 2×107 | 20.56 | 15.51 | 5.05 |
| 2×106 | 24.2 | 19.67 | 4.53 |
| 2×105 | 28.58 | 23.23 | 5.35 |
| 2×104 | 31.56 | 26.15 | 5.41 |
| 2×103 | 34.63 | 29.64 | 4.99 |
| 2×102 | 36.97 | 33.58 | 3.39 |
相对于质粒DNA模板浓度绘制每个等位基因选择性引物的Ct(循环阈值)(图10)。对于此两个引物，标绘图的斜率实际上是相同的，且R2(相关系数)值也大约相同。在整个模板浓度范围中，标绘图也是平行的，表明不管模板DNA的浓度为何，引物间Ct值差异保持恒定。
相对于质粒DNA模板浓度也绘制了在适当模板上L129和F129等位基因选择性引物间的ΔCt(两个Ct值间的差异)(图11)。线的斜率少于0.1，表明在适当模板上，L129和F129等位基因选择性引物之间的ΔCt不随着模板DNA浓度变化。
结合它们的适合模板的两个引物间的平均ΔCt是4.67。因此需要从L129等位基因选择性引物和F129等位基因选择性引物间计算的ΔCt中减去该值，以真实表示样品中两个等位基因的比例。
因此，L129等位基因选择性引物，Pt129-A14和F129等位基因选择性引物，Pt129-C4可以用在该测定法中以直接比较样品中L129和F129等位基因的水平。
第二步验证研究涉及测试选定的ARMS引物Pt129-C4和Pt129-A14的检测灵敏性。将浓度2×107分子/μl的带有L129等位基因的质粒DNA稀释到背景质粒DNA中，所述背景质粒DNA带有F129等位基因，浓度是2×107分子/μl，以产生下列L129比F129的比率：1∶1，1∶10，1∶100，1∶1,000，1∶10,000和1∶100,000。PCR中最终质粒浓度是1×108分子/μl。如上所述，在测定法中，用引物Pt129-A14，Pt129-C4和Pt129-S4测试这些质粒及野生型质粒，突变质粒和仅有水的对照。
表25：来自于野生型和突变质粒DNA对照模板的结果
| 引物 | Ct值-C模板(F129等位基因) | Ct值-A模板(L129等位基因) | ΔCt |
| Pt129-A14 | 43.16 | 27.33 | 15.83 |
| Pt129-C4 | 23.03 | 无A | n/a |
| Pt129-S4 | 20.55 | 21.18 | n/a |
如上所注意到的，引物Pt129-A14和Pt129-C4在它们正确的模板上没有产生相同的Ct值，Ct值的该差值是27.33-23.03＝4.3。需要从峰实验(spiking experiment)中计算的每个ΔCt中减去该值以得出样品中每个等位基因比例的真实表示值。
表26：显示ARMS引物Pt129-A14和Pt129-C4的检测灵敏性的结果
| DNA模板 | A引物Ct | C引物Ct | ΔCt(A Ct-C Ct) | 校准的ΔCt(ΔCt-4.3) | 观察到的A∶C比 | 观察到的％C |
| 1∶1 | 22.1 | 18.3 | 3.8 | -0.5 | 58.6 | |
| 1∶10 | 25.53 | 18.05 | 7.48 | 3.18 | 1∶9.08 | 9.9 |
| 1∶100 | 29.83 | 18.23 | 11.14 | 6.84 | 1∶114 | 0.86 |
| 1∶1000 | 33.47 | 18.33 | 15.14 | 10.84 | 1∶1826 | 0.05 |
| 1∶10000 | 36.09 | 18.41 | 17.68 | 13.38 | 1∶10638 | 0.009 |
| 1∶100000 | 38.95 | 18.12 | 20.83 | 16.53 | 1∶94269 | 0.001 |
| C模板 | 43.16 | 23.03 | 20.13 | n/a | n/a | n/a |
| NTC | 无 | 无 | - | - | - | - |
因此，该结果表明，在A ARMS引物(L129等位基因选择性引物)结合不适当模板前，该测定法可以检测以少于1∶100000的比率位于F129等位基因(C模板)背景中的L129等位基因(A模板)的水平(图12)。
设计进行的第三步验证研究在于测试是否ARMS引物Pt129-C4和Pt129-A14以相同的效率扩增。为了使ARMS/Scorpion测定法可靠，重要的是在模板DNA浓度范围中选定的等位基因选择性ARMS引物以近似相同效率扩增，所述模板DNA浓度范围为此测定法中可能检测到的浓度。这是因为两个引物间的Ct差值直接对应于样品中抗性等位基因的频率。对此进行测试的一个方法是比较ΔCt如何随着模板浓度变化。相对于ΔCt绘制l0g DNA输入量，由此得到的斜率应该小于0.1。
为了检查引物Pt129-A14和Pt129-C4的扩增效率，在约100倍的范围中，通过2倍稀释度系列稀释突变：野生型质粒DNA的1∶10混合物(前述)。在浓度为1mg/ml的BSA中进行所有这些稀释。如上所述，在ARMS/Scorpion测定法中，用引物Pt129-C4，Pt129-A14和Pt129-S4引物测试下列模板稀释物(纯的，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128)，仅有野生型和仅有突变型的质粒DNA对照，和仅有水的对照。
表27：来自于野生型和突变质粒DNA对照模板的结果
| 引物 | Ct值-C模板(F129等位基因) | Ct值-A模板(L129等位基因) | ΔCt |
| Pt129-A14 | 37.77 | 22.6 | 15.17 |
| Pt129-C4 | 19.07 | no A | n/a |
| Pt129-S4 | 18.28 | 17.77 | - |
引物Pt129-A14和Pt129-C4在适合模板上的Ct值的差值是22.6-19.07＝3.53。需要从相对效率试验中计算的每个ΔCt中减去该差值以真实表示样品中每个等位基因的比例。
表28：相对效率试验的结果，显示对于每个模板浓度的ΔCt
| DNA浓度 | Log DNA浓度 | C Ct | A Ct | ΔCt | 校准的ΔCt |
| 128 | 2.107 | 18.46 | 24.92 | 6.46 | 2.93 |
| 64 | 1.806 | 19.14 | 25.74 | 6.6 | 3.07 |
| 32 | 1.505 | 20.86 | 27.92 | 7.06 | 3.53 |
| 16 | 1.204 | 22.1 | 29.52 | 7.42 | 3.89 |
| 8 | 0.903 | 22.39 | 29.43 | 7.04 | 3.51 |
| 4 | 0.602 | 23.45 | 30.5 | 7.05 | 3.52 |
| 2 | 0.301 | 24.31 | 34.44 | 7.13 | 3.6 |
| 1 | 0 | 25.14 | 31.95 | 6.82 | 3.29 |
相对于logDNA浓度绘制ΔCt，用Microsoft Excel计算趋势线(图13)。这显示线的斜率是0.05，小于0.1，因此引物Pt129-A14和Pt129-C4以基本上相同的相对效率扩增。
验证此测定法的第四步骤是研究是否宿主植物DNA(在本例中，多年生黑麦草(Lolium perenne)可以，例如由于含有可以偶然地作为PCR模板的序列而影响测定法。在收集和直接试验的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)感染的叶片材料样品中将存在多年生黑麦草(Loliumperenne)DNA。
为了该研究，用Qiagen Dneasy植物小量制备试剂盒，从多年生黑麦草(L.perenne)样品(100mg)提取基因组DNA(首先，通过在Centriprep搅拌研磨机(mixer mill)中搅拌10分钟，在含有钢珠的1.5ml微量离心管中研磨该样品)，在重蒸馏H2O中，进行5倍系列稀释，以产生下列浓度：“纯的”(直接从小量制备试剂盒制备中获得)，1∶5，1∶25和1∶125(植物DNA母液稀释至H2O中)。也制备了1∶100和1∶10,000的L129等位基因∶F129等位基因质粒DNA的两种混合物(见上文)。这些母液与逐渐降低的植物材料背景混合产生下列PCR输入物：1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+纯植物DNA，1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+1∶5植物DNA，1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+1∶25植物DNA，1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+1∶125植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+纯植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+1∶5植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+1∶25植物DNA，1∶10,000L129等位基因∶F129等位基因+1∶125植物DNA。如上所述，在测定法中，用引物Pt129-C4，Pt129-A14和Pt129-S4测试所有这些输入物及多年生黑麦草(L.perenne)DNA稀释液，单独的各种比率的L129等位基因∶F129等位基因质粒DNA，2×107分子/μl浓度的野生型和突变型质粒DNA和仅有水的对照。
表29：野生型和突变型质粒DNA对照
| 引物 | Ct值-C模板(F129等位基因) | Ct值-A模板(L129等位基因) | ΔCt |
| Pt129-A14 | 37.23 | 22.49 | 14.74 |
| Pt129-C4 | 19.95 | 无A | n/a |
| Pt129-S4 | 19.36 | 18.61 | - |
引物Pt129-A14和Pt129-C4在适当模板上的Ct值的差值是22.49-19.95＝2.54。需要从计算的每个ΔCt中减去该差值以得到样品中每个等位基因比例的真实表示值。
表30：评估宿主植物DNA(多年生黑麦草(L.perenne))对测定法性能影响的验证试验的结果
| 模板 | C Ct | A Ct | S Ct | ΔCt | 校正的ΔCt | 观察到的A∶C比 | 观察到的％A |
| 1∶100(L129∶F129) | 18.61 | 29.27 | - | 10.66 | 8.12 | 1∶277 | 0.36 |
| 1∶100+纯植物 | 20.57 | 30.56 | - | 9.98 | 7.44 | 1∶173 | 0.57 |
| 1∶100+1∶5植物 | 19.41 | 29.09 | - | 9.69 | 7.15 | 1∶142 | 0.7 |
| 1∶100+1∶25植物 | 18.83 | 29.3 | - | 10.47 | 7.93 | 1∶243 | 0.41 |
| 1∶100+1∶125植物 | 18.54 | 29.99 | - | 9.45 | 6.91 | 1∶120 | 0.82 |
| 1∶10000(L129∶F129) | 19.18 | 34.76 | - | 15.58 | 13.05 | 1∶8480 | 0.012 |
| 1∶10000+纯植物 | 21.99 | 36.74 | - | 14.76 | 12.22 | 1∶4764 | 0.02 |
| 1∶10000+1∶5植物 | 20.49 | 34.62 | - | 14.12 | 11.58 | 1∶3069 | 0.03 |
| 1∶10000+1∶25植物 | 19.78 | 36.45 | - | 15.3 | 12.76 | 1∶6936 | 0.014 |
| 1∶10000+1∶125植物 | 20.68 | 35.74 | - | 15.06 | 12.52 | 1∶5877 | 0.017 |
| 纯植物 | - | - | 35.36 | - | - | - | - |
| 1∶5植物 | - | - | 36.27 | - | - | - | - |
| 1∶25植物 | - | - | 38.07(1rep) | - | - | - | - |
| 1∶125植物 | - | - | 无 | - | - | - | - |
当在此测定法中试验真菌质粒DNA和多年生黑麦草(L.perenne)DNA的混合物时，与单独试验真菌质粒DNA时比较，Ct值及因此观察到的C％没有一致的变化。因此，多年生黑麦草(L.perenne)DNA对测定法中抗药性等位基因检测的灵敏性没有显著的影响。
标准引物Pt129-S4和Scorpion引物能与多年生黑麦草(L.perenne)DNA相互作用以产生可检测的PCR产物。然而，联合Scorpion引物的L129或F129等位基因特异性引物都不能与多年生黑麦草(L.perenne)DNA相互作用。
在瓜果腐霉(P.aphanidermatum)样品中多年生黑麦草(L.perenne)DNA的存在对L129或F129等位基因的扩增及由此估计的L129等位基因水平将不会有任何影响。
验证的最后步骤是在生物样品上试验引物Pt129-C4、Pt129-A14和Pt129-S4。可以用作抗药性监测试验的起始材料的生物样品有多种不同的可能形式。这些生物样品包括琼脂平板上生长的菌丝体和瓜果腐霉(P.aphanidermatum)感染的草皮(多年生黑麦草(L.perenne)。为了试验来自于琼脂平板的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)样品，向平板中加少量无菌重蒸馏H2O(约1-2ml)，用无菌一次性刮棒从琼脂上刮下菌丝体。在1.5或2ml无菌微量离心管中收集菌丝体溶液，离心。如实施例2所述，弃去上清液，用FP120 FastprepTM仪器(AnachemLtd.，Anachem House，Charles Street，Luton，BedfordshireLU20EB，UK)或Spex CertiPrep 8000搅拌研磨机(Mixer Mill)(GlenCreston Ltd)研磨由此得到的菌丝体样品，然后，用Qiagen DNeasy植物小量制备试剂盒进行基因组DNA制备，在实施例2中也描述了该制备。可替代地，可以在1.5或2ml无菌微量离心管中收集100mg瓜果腐霉(P.aphanidermatum)感染的多年生黑麦草(L.perenne)草皮，以和上述菌丝体材料相似的方法研磨。然后，用Qiagen DNeasy植物小量制备试剂盒按照制造商的程序提取感染植物的总DNA。
在无菌重蒸馏H2O中，以1∶10和1∶100稀释由此得到的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和/或瓜果腐霉(P.aphanidermatum)/多年生黑麦草(L.perenne)DNA制备物，如上所述，在ARMS/Scorpion测定法中测试这些模板稀释液。用引物Pt129-A14，Pt129-C4和Pt129-S4测试每个模板稀释液；也包含分别作为阳性和阴性对照的野生型和突变型质粒DNA及仅有水的对照。
实施例9
能在任何瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分离物中检测F129和L129等位基因的ARMS/Scorpions测定法的设计。
为了检测能够转换F129为L129的其它单核苷酸多态性，可以利用能够仅区别129密码子第1位(即，在位置1是存在胸腺嘧啶还是胞嘧啶残基)的有义ARMS寡对/反义Scorpion联合。同样地，能够区别129密码子的第3位的所有可能残基，即胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤和鸟嘌呤残基的反义ARMS寡对/有义Scorpion联合可以检测能引起L129介导的抗药性的可替代的位置3置换。在联合中，这些位置1和3的测定法也提供了评估双突变水平的方法，所述双突变可能引起F129到L129的转换(密码子：CTA和CTG)。
有义ARMS寡对/反义Scorpion联合可以利用前面及如实施例4中所述的Scorpion引物设计，其中在反向PCR引物上掺入检测系统，此Scorpion引物与下面SNP检测ARMS引物和对照引物联合使用。
基于129密码子第1位的胸腺嘧啶残基的三个正向ARMS引物：
Pt129-7 TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC
T
Pt129-8 TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC
T
Pt129-9 TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC
T
基于129密码子第1位的胞嘧啶残基的三个正向ARMS引物：
Pt129-10 TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC
C
Pt129-11 TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC
C
Pt129-12 TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC
C
及设计的点突变上游的对照引物：
Pt129-S2 TATTTTTATTTTAATGATGCCAACAGC
在每个上述ARMS引物中，-1碱基(引物序列3’末端碱基)对应于靶点突变位点。粗体显示的碱基不同于野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b序列。在Pt129-7和Pt129-10引物中，-2位置从T变为A。在Pt129-8和Pt129-11引物中，-2位置从T变为G。在Pt129-9和Pt129-12引物中，-2位置从T变为C。再有对序列进行这些改变可使模板/引物杂合体去稳定，使得任何引物可以更特异地针对相应的模板延伸。当与实施例4中描述的反义Scorpion-起使用时，用ARMS引物得到的扩增子将是174bp长，用对照引物得到的扩增子将是176bp长。
为了利用反义ARMS寡对/有义Scorpion联合检测129密码子位置3处的腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和鸟嘌呤残基，前面实施例6中描述的有义Scorpion引物可以与下面的SNP检测反义(反向)ARMS引物和对照引物联合使用，其中在有义Scorpion引物中在有义(正向)PCR引物上掺入了检测系统。
基于129密码子位置3处胸腺嘧啶残基的三个反向ARMS引物：
Pt129-13 ACCCCAAGGTAATACATAACCCA
A
Pt129-14 ACCCCAAGGTAATACATAACCCA
A
Pt129-15 ACCCCAAGGTAATACATAACCCA
A
下面为基于129密码子位置3处腺嘌呤残基的反向ARMS引物：
Pt129-A14 ACCCCAAGGTAATACATAACAC
TT
下面为基于129密码子位置3处胞嘧啶残基的反向ARMS引物：
pt129-C4 ACCCCAAGGTAATACATAACCC
TG
基于129密码子位置3处鸟嘌呤残基的三个反向ARMS引物：
Pt129-16 ACCCCAAGGTAATACATAACCCA
C
Pt129-17 ACCCCAAGGTAATACATAACCCA
C
Pt129-18 ACCCCAAGGTAATACATAACCCA
C
及设计的点突变下游的对照引物：
Pt129-S4 TTGACCCCAAGGTAATACATAACCC
在每个上述ARMS引物中，-1碱基(引物序列3’末端碱基)对应于靶点突变位点。粗体显示的碱基不同于野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)细胞色素b序列。在Pt129-13和Pt129-16引物中，-2位置从A变为T。在Pt129-14和Pt129-17引物中，-2位置从A变为G。在Pt129-15和Pt129-18引物中，-2位置从A变为C。在Pt129-C4引物中，-3位置从T变为A。在Pt129-A14引物中，-3位置从T变为C，-5位置从G变为T。对序列进行这些改变以使模板/引物杂合体去稳定，使得任何引物更特异地针对相应的模板进行延伸。用上述有义Scorpion引物时，用ARMS引物得到的扩增子将是110bp长，用对照引物得到的扩增子将是113bp长。
通过Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，在每500μl总体积重蒸馏无核酸酶的H2O中，稀释引物到5μM。然后，在PCR中，进一步稀释引物到500nM的终浓度。
实施例10
对Qo位点抑制性杀真菌剂显示出降低敏感性的两个新的葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)样品的鉴定
在2000年期间，从欧洲的田地收集约300份葡萄生单轴霉(P.viticola)样品。在植物体内(in planta)辩别剂量生物测定法中测试这些样品以检测对Qo位点抑制性杀真菌剂降低的敏感性，也在ARMS/Scorpion G143A定量PCR测定法中测试这些样品(参见，公开的国际专利申请WO 00/66773)。已证实对QoI的抗药性通常与143位置(根据酿酒酵母(S.cerevisiae)编号系统)丙氨酸的存在有关。在密码子143第二位置处鸟嘌呤到胞嘧啶的单核苷酸多态性引起了细胞色素b中143位置的这种甘氨酸到丙氨酸的改变；在此测定法中监测SNP的水平。在该监测程序期间，在植物辩别剂量生物测定中，发现了两个样品，I112和I116b，它们显示了对QoI有降低的敏感性，但是在位置143的氨基酸仅仅是野生型的甘氨酸。我们对此作了进一步研究。
为了证实辩别剂量生物测定法中检测到的对QoI的降低敏感性，对这些样品进行植物体内剂量反应生物测定。对生长在1.5”罐中的10到14日龄葡萄幼苗进行植物体内剂量反应生物测定。在剂量反应生物测定中，从预备试验中选择6个级别的腈嘧菌酯(azoxystrobin)，它们最适合在剂量反应生物测定中显示出腈嘧菌酯(azoxystrobin)敏感性的任何偏移(表31)。
表31：用在植物体内剂量反应生物测定中的腈嘧菌酯(azoxystrobin)级别
| 级别 | 腈嘧菌酯(azoxystrobin)的浓度 |
| 1 | 8.0ppm |
| 2 | 4.0ppm |
| 3 | 2.0ppm |
| 4 | 1.0ppm |
| 5 | 0.5ppm |
| 6 | 0.25ppm |
用于所有试验中的腈嘧菌酯(azoxystrobin)制备物是P53，工业级粉末，具有＞97％腈嘧菌酯(azoxystrobin)的纯度。所有试验中保持其一致以排除化学纯度或物理状态差异引起的任何变化。每份样品，每个腈嘧菌酯(azoxystrobin)级别用5株幼苗，对于没有腈嘧菌酯(azoxystrobin)的对照用10株幼苗(仅用去离子水喷散)。
用Devilbiss喷枪以10psi喷散化学药品至在每株幼苗第二片真叶(试验叶片)的近轴表面上获得最大滞留量，同时注意不断地漩涡喷枪中的溶液以防止腈嘧菌酯(azoxystrobin)浓度的局部波动。然后，小心放置幼苗在生长室中(白天：24℃，60％RH，4-50001ux；夜间：17℃，95％RH；日长：16小时)24小时。
此后，用样品I112和I116b接种每片测试叶片。自从两个样品移出低温保藏后，两个样品在3″葡萄树上经过了1轮继代培养(图14)。
用干燥的血细胞计数器(改进的Neubayer，深度0.1mm，1/400mm2Hawksley Crystallite，BS 748)将从3”葡萄树获得的每个样品的接种物稀释为每毫升5,000个孢子囊。
用Devilbiss喷枪以10psi接种样品，至在每株幼苗试验叶片的远轴表面上获得最大的滞留量，同时频繁地漩涡喷枪中的悬浮液以避免孢子囊在底部聚集。在周围环境室中孵育试验幼苗24小时。然后，随机选择幼苗并放置在生长室中(白天：24℃，60％RH，4-5000lux；夜间：17℃，95％RH；日长：16小时)6天，之后返回到周围环境室另外24小时以刺激孢子形成。
幼苗第二次从周围环境室移出后，直接对幼苗进行评估。疾病评估是基于孢子形成病斑和褪色所覆盖的叶片百分面积，以5％的增量来记录。给予具有单一小病斑的叶片2％的分数以表示没有显示出对病原体的完全控制。然后，用统计学程序AGSTAT分析数据。在分析中利用了OLS回归和反正弦变换(arcsine trans formation)，计算并在下表32中示出了EC50和EC95值及它们各自的95％置信界限。
表32葡萄生单轴霉分离物I112和I1166的EC50和EC95值
| 变种 | EC50 | 95％置信水平 | EC95 | 95％置信度水平 |
| K2075(敏感基线分离物) | 0.04 | 0.00-0.10 | 0.51 | 0.30-0.72 |
| 00I116B | 0.49 | 0.29-0.73 | 2.84 | 2.06-4.32 |
| 00I112 | 1.98 | 1.10-4.05 | 11.75 | 5.68-53.25 |
两个样品I116B和I112都显示了对腈嘧菌酯(azoxystrobin)有降低的敏感性，与敏感基线分离物比较，具有
较高的EC50和EC95值。然后，在分子水平上进一步研究这两个样品以调查对腈嘧菌酯(azoxystrobin)具有降低的敏感性的机理。
实施例11
与野生型和以前证实的抗药性分离物的细胞色素b基因比较，葡萄生单轴霉(P.viticola)样品I112和I116b的细胞色素b基因的定向克隆和测序。
用下述方法进行葡萄生单轴霉(P.viticola)样品I112和I116b细胞色素b基因的表征。
通过下面方法制备用于分析的葡萄生单轴霉(P.viticola)样品I112和I116b。在玻璃烧杯中放置显示出孢子形成霜霉病症状的葡萄树叶片。然后向每个样品加400ml去离子水，涡漩叶片以释放孢子囊。通过两层细棉布过滤由此得到的孢子囊悬浮液，然后倾倒入无菌塑料50ml通用试管，在台式离心机(MSE，Centaur 2)中，以4000rpm离心约2分钟。2分钟后，在每个试管底部可观察到孢子囊沉淀；倾析上清液，重新合并等同的沉淀物，并且在1ml无菌去离子水中重悬浮。然后，转移孢子囊样品到1.5ml无菌微量离心管中，在13000rpm，离心一分钟。移出上清液，样品置于-80℃备用。
根据具有下列修改的制造商的程序，用Qiagen DNeasy植物小量制备试剂盒(目录号69014)从上述样品分离基因组DNA。向每个样品加400μl缓冲液AP1和4μl RNaseA溶液，重悬浮沉淀。然后转移孢子囊溶液到无菌2ml微量离心管，加钢珠，在Spex CertiPrep 8000搅拌研磨机(Mixer Mill)(Glen Creston Ltd)中搅拌该样品10分钟以研磨样品。然后转移上清液到1.5ml微量离心管中，通过QiagenDNeasy植物小量制备试剂盒操作程序的随后步骤3-13完成DNA的制备，用2×100μl缓冲液AE进行最终基因组DNA洗脱。
为了PCR扩增细胞色素b基因，用无菌重蒸馏H2O对两个基因组DNA制备物进行10倍系列稀释，产生下列稀释度1∶10，1∶100和1∶1000，所有这些都用作PCR的模板。
用引物对17/15，从分离物I112和I116b PCR扩增细胞色素b基因的“热点”区。
引物17＝5’AAA TAA CGG TTG GTT AAT TCG 3’
引物15＝5’TCT TAA AAT TGC ATA AAA AGG 3’
这些引物是葡萄生单轴霉(P.viticola)细胞色素b基因的特异引物，包含氨基酸73-283。除了位置292外，该区域包含科学文献中已知的在模型生物体中赋予对QoI的抗药性的所有氨基酸位置。
用Ready.To.GoTaq聚合酶PCR珠(Amersham Phamacia Biotech)建立PCR。对于每个PCR珠，加入10μl模板、2.5μl正向引物17、2.5μl反向引物15(两种引物浓度都是10pmol/μl以产生1pmol/μl的终浓度)和10μl重蒸馏H2O以产生25μl的总反应体积。PCR循环条件如下：在94℃起始温育10分钟；随后94℃，45秒，52℃，45秒和72℃，1分钟30秒进行30轮循环。为了结束PCR有72℃，10分钟的最终延伸步骤。在1％TBE琼脂糖凝胶上观察PCR产物，在所有泳道(除了仅有水的对照外)中出现了期望大小(～600bp)的产物。
合并从每个样品，即从1∶10，1∶100和1∶1000模板DNA稀释物得到的三个PCR产物，用Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒(K4500-01)，按照制造商的说明，将这些混合物克隆入载体pCR2.1-TOPO中。每个样品挑取16个菌落用于质粒小量制备。在Qiagen Biorobot上进行小量制备。然后，用EcoRI消化质粒DNAs，在1％TBE琼脂糖凝胶上观察消化产物以确定哪个样品含有正确大小的插入片段。然后，用M13正向和反向引物测序每个样品的具有期望大小插入片段的10个克隆(ABI377XL自动测序仪)。用适合的生物信息学软件，Seqman，Editseq和Macaw分析序列数据。
然后，比较样品I112和I116b的推导的细胞色素b基因序列与先前测定的已知野生型和抗药性葡萄生单轴霉(P.viticola)的细胞色素b序列。在图15和16中显示了核苷酸和氨基酸比对，这些氨基酸序列已使用在Genetic Codes(NCBI分类学)：
Http：//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/ wprintgc？mode＝t中所述的“Mold，Protozoan and CoelenterateMitochondrial Code-Number 4”进行过预测。
该分析的关键点是：
●I112-与野生型序列比较，所有10个克隆的细胞色素b序列显示了在密码子129的第1位从T到C的单核苷酸多态性(SNP)。其编码129位置的氨基酸亮氨酸。所有克隆在位置143编码野生型氨基酸，没有其它点突变存在。
野生型129＝TTT(苯丙氨酸，F)突变型129＝CTT(亮氨酸，L)
●I116b-测序的10克隆中4个克隆是相同的-它们与在143位置编码甘氨酸且在129位置编码苯丙氨酸的已知野生型葡萄生单轴霉(P.viticola)序列相同。测序的10克隆中其它6个克隆也是相同的。所有这些在129位置编码氨基酸亮氨酸。再一次，这是由于密码子129第一位置从T到C的SNP引起。所有这6个克隆在位置143编码野生型氨基酸甘氨酸，并且没有其它点突变存在。
●在样品I112和I116b中位置129处苯丙氨酸到亮氨酸的氨基酸改变可能与对嗜球果伞素的抗药性有关，因为在植物体内生物测定中，它们对腈嘧菌酯(azoxystrobin)显示了最大剂量反应。
●在葡萄生单轴霉(P.viticola)中，第一次观察到赋予F到L改变的单核苷酸多态性(SNP)。
●然而，以前，在瓜果腐霉(P.aphanidermatum)大田分离物中曾观察到F129L氨基酸改变，且证明其与对Qo位点抑制性杀真菌剂的抗药性有关(参见上文)。
●在这两种病原体中，不同SNP引起了F129L氨基酸改变
葡萄生单轴霉(P.viticola) TTT到CTT
瓜果腐霉(P.aphanidermatum) TTC到TTA
更详细地考虑该结果，对于样品I112，10个克隆中9个有同一序列，1个克隆由于2个碱基不同而有其它序列差异。再一次，这些差异可能是由于PCR引入的错误造成的。对于样品I116b，具有同一序列的4个克隆中的1个克隆有其它序列差异，该差异为4个碱基不同，具有同一序列的6个克隆中的1个克隆有其它序列差异，该差异是10个碱基不同。这些差异是由于不清楚的测序痕迹引起的。这些显示在图f中。
实施例12
能区别野生型葡萄生单轴霉(P.viticola)及I112和I116b样品中发现的F129和L129等位基因的ARMS引物的设计
利用根据实施例11获得的野生型葡萄生单轴霉(P.viticola)及样品I112和I116b细胞色素b基因的序列，设计各种特异性ARMS引物以检测该F129L点突变的存在或缺乏：
基于野生型序列的六个反向ARMS引物：
PV129-T1 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA
A 3’
PV129-T2 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA
A3’
PV129-T3 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA
A 3’
PV129-T4 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT
AA 3’
PV129-T5 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT
AA 3’
PV129-T6 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT
AA 3’
基于F129L突变的六个反向ARMS引物：
PV129-C1 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA
G 3’
PV129-C2 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA
G 3’
PV129-C3 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA
G 3’
PV129-C4 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT
AG 3’
PV129-C5 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT
AG 3’
PV129-C6 5’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT
AG 3’
及从点突变下游设计的对照反向引物：
PV129-S 5’GTCCCCAAGGCAAAACATAACCCAT 3’
在每个上述ARMS引物中，-1碱基(引物序列的3’末端碱基)对应于靶点突变位点。以粗体显示的碱基不同于野生型葡萄生单轴霉(P.viticola)细胞色素b序列。在PV129-T1和PV129-C1引物中，-2位置从A变为T碱基(反向互补)。在PV129-T2和PV129-C2引物中，-2位置从A变为C碱基(在反向互补中)。在PV129-T3和PV129-C3引物中，-2位置从A变为G碱基(在反向互补中)。在PV129-T4和PV129-C4引物中，-3位置从A变为T碱基(在反向互补中)。在PV129-T5和PV129-C5引物中，-3位置从A变为C碱基(在反向互补中)。在PV129-T6和PV129-C6引物中，-3位置从A变为G碱基(在反向互补中)。如前述，对序列进行这些改变可使葡萄生单轴霉(P.viticola)细胞色素b基因模板/引物杂合体去稳定，使得任何引物可以更特异地针对相应的模板进行延伸。文献中的例子已经表明去稳定ARMS引物降低了引物在错误模板上错误引发的风险(Newton等，Nucleic AcidResearch 17 (7) 2503-2516 1989)。
通过Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，分别在500μl总体积重蒸馏无核酸酶的H2O中，稀释引物到5μM。然后，在PCR中，进一步稀释引物到500nM的终浓度。
实施例13
用于监测葡萄生单轴霉(P.viticola)的F129和L129等位基因状态的Scorpion引物的设计
再一次利用根据实施例11获得的野生型葡萄生单轴霉(P.viticola)及样品I112和I116b细胞色素b基因的序列，通过向正向PCR引物中掺入检测系统设计ScorpionTM寡核苷酸以检测野生型和L129等位基因的选择性扩增，所述正向PCR引物经设计与实施例12描述的ARMS SNP检测和标准引物一起使用。用ARMS引物得到的扩增子是161bp长，用对照引物得到的扩增子是164bp长。
更具体地，用Oligo 5和MFold程序(Mfold用Zucker能量最小化方法预测RNA或DNA分子的最佳和次佳二级结构(Zucker，M.(1989)Science 244，48-52；SantaLucia，J.Jr.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，1460-1465)设计Scorpion引物。
由此得到的葡萄生单轴霉(P.viticola)Scorpion引物序列是：
其中下划线区是发夹形成部分(当Scorpion引物未反应时)；FAM是荧光素染料；MR(甲基红)是与尿嘧啶残基附着的非荧光猝灭剂，HEG是复制阻断六乙二醇单体。斜体序列是反向引物序列，粗体序列是结合反向引物的真正葡萄生单轴霉(P.viticola)细胞色素b延伸产物的Scorpion序列。
用Mfold程序可以观察该Scorpion引物的茎-环二级结构(参见图17)，并且预测当其不与靶细胞色素b基因杂交时，其有-2.3kcal/mol的能量。然而，在延伸产物存在的情况下，因为Scorpion引物的探针序列以预测的-5.1kcal/mol能量杂交延伸产物，所以发夹结构分离。这使猝灭剂与FAM染料分离，引起了例如通过ABI Prism7700仪器可检测的荧光发射。因此，与Scorpion茎-环比较，新合成链与Scorpion成分的退火是能量上有利的。
通过Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成Scorpion引物。在使用前，在500μl总体积重蒸馏无核酸酶的H2O中，稀释引物到5μM。然后，在PCR中，进一步稀释引物到500nM的终浓度。
实施例14
用于检测和定量样品I112和I116b中发现的F129L SNP的ARMS和Scorpion引物的用途的验证
在所有ARMS/ScorpionTM F129L SNP检测测定法中，AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystem)以1单位/25μl反应包含在反应混合物中。反应混合物还含有1x缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，3.5mM MgCl2，0.01％明胶)和100μM dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)。在ABI 7700仪器中进行扩增用于连续荧光监测。循环条件包括95℃，10分钟的最初循环，随后通过95℃，15秒和60℃，45秒进行50轮循环。在所有循环的退火/延伸步骤期间检测荧光。
通过利用各种浓度的质粒DNA作为模板，验证ARMS引物在这种分析中的用途。进行该验证以检查引物设计的特异性和灵敏性。如先前实施例11所述，将部分野生型细胞色素b基因序列和从两个葡萄生单轴霉(P.viticola)样品扩增的含有F129L突变的相应序列段克隆到TA pCR2.1载体(Invitrogen)中。保存挑选用于Qiagen Biorobot质粒DNA制备(Qiagen)的来源于每个克隆事件的10个转化体的150ul细菌培养物，在进行这些制备前4℃贮藏。序列分析后，注意到野生型和突变质粒DNA样品不含有与共有序列的序列差异。按照制造商的程序，挑取这些野生型和突变质粒DNA序列来源的细菌培养物用于质粒DNA大量制备(Qiagen)。定量由此得到的质粒DNA，并且用无菌重蒸馏H2O稀释到1μg/μl(2×1011分子/μl)的浓度。
在重蒸馏H2O中，进一步稀释野生型和突变细胞色素b质粒DNA构建体到10pg/μl(2×106分子/μl)的浓度，并且用其作为模板以验证ARMS引物的特异性。在上述PCR条件下，对野生型和突变质粒DNA模板及没有模板(只有水)的对照测试每种ARMS引物。在表33中给出了结果。
表33：测试ARMS引物特异性的验证试验的结果，其中该ARMS引物经设计扩增葡萄生单轴霉(P.viticola)的F129和L129等位基因。
| 引物 | 野生型Ct | 突变体Ct | ΔCt | 观察到的野生型∶突变体比 | NTC扩增 |
| Pv129-Wt1 | 17.72 | 32.31 | 14.59 | 24662∶1 | 1rep |
| Pv129-Wt2 | 16.96 | 30.88 | 13.92 | 15500∶1 | 无 |
| Pv129-Wt3 | 17.606 | 31.8 | 14.19 | 18690∶1 | 1rep |
| Pv129-Wt4 | 17.10 | 27.26 | 10.16 | 1144∶1 | 无 |
| Pv129-Wt5 | 16.32 | 28.39 | 12.07 | 4300∶1 | 无 |
| Pv129-Wt6 | 18.24 | 32.99 | 14.75 | 27554∶1 | 1rep |
| Pv129-Mut1 | 30.35 | 17.99 | 12.36 | 1∶5257 | 1rep |
| Pv129-Mut2 | 29.56 | 16.45 | 13.11 | 1∶8841 | 1rep |
| Pv129-Mut3 | 27.28 | 16.29 | 10.99 | 1∶2034 | 无 |
| Pv129-Mut4 | 30.8 | 18.44 | 12.36 | 1∶5257 | 2reps |
| Pv129-Mut5 | 28.97 | 16.14 | 12.83 | 1∶7281 | 2reps |
| Pv129-Mut6 | 31.29 | 20.42 | 10.87 | 1∶1872 | 无 |
| Pv129S | 17.0 | 17.22 | - | - | 无 |
F129选择性ARMS引物PV129-Wt6在适当和不适当模板上扩增间产生了最大窗(ΔCt)，L129选择性ARMS引物PV129-Mut5在适合和不适合模板上扩增间产生了第二最大窗(ΔCt)，但在正确模板上的最早Ct被选择用于进一步分析。
选择用于点突变检测的野生型ARMS引物PV129-T6和突变ARMS引物PV129-C5后，在测定法用于测试生物样品L129突变是否存在前，要进一步验证该测定法以充分理解它的检测敏感性。首先通过10倍稀释系列的野生型(F129)和突变体(L129)质粒DNA模板，试验选定的ARMS引物对PV129-T6和PV129-C5以观察特异性窗如何随着模板浓度变化。在1mg/ml浓度的牛血清白蛋白(BSA)(V级份粉末最少96％，Sigma A9647)中通过10倍稀释系列稀释前述野生型和突变体质粒DNA盒，所述10倍稀释度系列跨越6个数量级范围，包括2×108分子/μl到2×102分子/μl的浓度。如上所述，用选定的ARMS引物和对照引物，在ARMS/Scorpion测定中测试质粒DNA模板和没有模板(只要水)的对照。
在表34和35中概述了该结果。
表34：在质粒DNA模板系列稀释中测试的F129选择性ARMS引物，PV129-Wt6
| 质粒浓度 | 野生型(L129)Ct | 突变体(F129)Ct | ΔCt | 观察到的野生型∶突变体比 |
| 2×108 | 15.46 | 30.166 | 14.71 | 26801∶1 |
| 2×107 | 16.88 | 32.66 | 15.78 | 56267∶1 |
| 2×106 | 21.38 | 36.441 | 15.061 | 34183∶1 |
| 2×105 | 23.042 | - | - | - |
| 2×104 | 26.83 | - | - | - |
| 2×103 | 30.938 | - | - | - |
| 2×102 | 35.75 | - | - | - |
表35：在质粒DNA模板系列稀释中测试的L129选择性ARMS引物，PV129-Mut5
| 质粒浓度 | Wt(L129)Ct | 突变体(F129)Ct | ΔCt | 观察到的野生型∶突变体比 |
| 2×108 | 29.96 | 14.90 | 15.06 | 1∶34159 |
| 2×107 | 31.11 | 15.94 | 15.18 | 1∶37122 |
| 2×106 | 32.76 | 17.79 | 14.97 | 1∶32094 |
| 2×105 | 38.26 | 22.55 | 15.71 | 1∶53602 |
| 2×104 | 39.47 | 24.83 | 14.64 | 1∶25532 |
| 2×103 | 45.36 | 28.41 | 16.95 | 1∶126607 |
| 2×102 | 32.927 | - | - |
对于F129和L129等位基因选择性引物PV129-Wt6和PV129-Mut5，在整个模板浓度范围中，特异性范围是恒定的。
第二个验证研究涉及试验选定的F129和L129等位基因选择性引物PV129-Wt6和PV129-Mut5的检测敏感性。将浓度是2×107分子/μl，带有L129等位基因的质粒DNA稀释到背景质粒DNA中，所述背景质粒DNA带有F129等位基因，浓度恒定是2×107分子/μl，以产生L129比F129等位基因的下列比率：1∶1，1∶10，1∶100，1∶1,000，1∶10,000和1∶100,000。PCR中最终质粒浓度是1×108分子/μl。如上所述，在测定中用引物PV129-Wt6和PV129-Mut5检测这些和野生型质粒，突变体质粒和仅有水的对照。结果如表36中所示。
表36：显示ARMS引物Pv129-wt6和Pv129-mut5检测敏感性的结果
| DNA模板 | 突变体等位基因Ct | 野生型等位基因Ct | ΔCt | 校正的ΔCt(2.92) | 观察到的C∶T比 | ％突变体等位基因 |
| 1∶1 | 17.24 | 20.02 | -2.81 | 0.11 | 1∶1.08 | 48.09 |
| 1∶10 | 20.16 | 20.66 | -0.5 | 2.42 | 1∶5.35 | 15.74 |
| 1∶100 | 23.53 | 19.06 | 4.47 | 7.23 | 1∶150 | 0.66 |
| 1∶1000 | 25.45 | 18.87 | 6.58 | 9.5 | 1∶724 | 0.14 |
| 1∶10000 | 27.75 | 18.89 | 8.86 | 11.78 | 1∶3516 | 0.028 |
| 1∶100000 | 29.05 | 20.01 | 9.04 | 11.96 | 1∶3984 | 0.025 |
因此，该结果显示，在引物Pv129-mut5(L129等位基因选择性引物)结合不适合的模板前，该测定法可以检测F129等位基因(野生型)背景中1∶10000比率的L129等位基因(突变体)的水平。
实施例15
用在监测葡萄生单轴霉(P.viticola)F129和L129等位基因状态中的Scorpion引物设计的进一步尝试
当即使从高浓度质粒DNA检测PCR产物时，进行葡萄生单轴霉(P.viticola)中F129L SNP检测的所有ARMS/Scorpion测定的结果显示了低荧光。这在低浓度DNA模板的测定中可能引起不可靠的PCR产物的检测。因此，重新设计Scorpion引物如下。
所得到的葡萄生单轴霉(P.viticola)Scorpion引物的序列是：
其中下划线区是发夹形成部分(当Scorpion引物没有反应时)；FAM是荧光素染料；MR(甲基红)是与尿嘧啶残基附着的非荧光猝灭剂(non-fluorigenic quencher)，HEG是复制阻断性六乙二醇单体。斜体序列是正向引物序列，粗体序列是结合正向引物的真实葡萄生单轴霉(P.viticola)细胞色素b延伸产物的Scorpion序列。
用Mfold程序可以显示该Scorpion引物的茎环二级结构，并且预测当其不与靶细胞色素b基因杂交时，其有-1.3kcal/mol的能量。然而，在延伸产物存在的情况下，因为Scorpion引物的探针序列以预测的-4.5kcal/mol能量结合延伸产物，所以发夹结构分离。这使FAM染料从其猝灭剂分离，引起了例如通过ABI Prism 7700仪器可检测的荧光发射。因此，与Scorpion茎环比较，Scorpion成分在新合成链上的退火是能量上有利的。
通过Oswel DNA服务公司(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成Scorpion引物。在使用前，在500μl总体积重蒸馏无核酸酶的H2O中，稀释引物到5μM。然后，在PCRs中，进一步稀释引物到500nM的终浓度。
实施例16
用于葡萄生单轴霉(P.viticola)中F129L SNP检测和定量的ARMS和Scorpion引物之用途的进一步验证
在下面的验证研究中联合使用实施例15中描述的Scorpion引物与前面实施例14中描述选定的ARMS引物以理解该测定法检测的敏感性。首先，通过10倍稀释系列的野生型(F129)和突变体(L129)质粒DNA模板，试验选定的ARMS引物对PV129-T6和PV129-C5以观察特异性窗如何随着模板浓度变化。在1mg/ml浓度的牛血清白蛋白(BSA)(V级份粉末最少96％，Sigma A9647)中通过10倍稀释系列稀释前述野生型和突变体质粒DNA盒，所述10倍稀释度系列跨越6个数量级范围，包括2×108分子/μl到2×102分子/μl的浓度。如上所述，用选定的ARMS引物和对照引物，在ARMS/Scorpion测定中试验质粒DNA模板和没有模板(只要水)的对照。在表37和38中概述了该结果。
表37：用实施例15中设计的Scorpion引物，在质粒DNA模板系列稀释中试验的L129 ARMS引物，PV129-Mut5
| 浓度 | 突变体Ct | 野生型Ct | Delta Ct | 观察到的突变体∶野生型比 |
| 2×108 | 12.43 | 28.68 | 16.25 | 1∶77936 |
| 2×107 | 16.87 | 30.33 | 13.46 | 1∶11268 |
| 2×106 | 19.85 | 34.25 | 14.41 | 1∶21769 |
| 2×105 | 22.84 | 37.44 | 14.60 | 1∶24834 |
| 2×104 | 25.20 | 40.54 | 15.34 | 1∶41476 |
| 2×103 | 28.17 | 39.65 | 11.48 | 1∶2856 |
| 2×102 | 31.90 | 40.01 | 8.10 | 1∶274 |
表38：用实施例15中设计的Scorpion引物，在质粒DNA模板系列稀释中试验的F129 ARMS引物，PV129-Wt6
| 浓度 | 突变体Ct | 野生型Ct Ct | Delta Ct | 观察到的突变体∶野生型比 |
| 2×108 | 30.50 | 15.69 | 14.81 | 28725∶1 |
| 2×107 | 33.95 | 18.45 | 15.50 | 46341∶1 |
| 2×106 | 37.97 | 23.02 | 14.95 | 31652∶1 |
| 2×105 | 39.57 | 25.76 | 13.81 | 14362∶1 |
| 2×104 | 43.09 | 28.51 | 14.59 | 24662∶1 |
| 2×103 | 45.04 | 32.56 | 12.48 | 5173∶1 |
| 2×102 | 45.32 | 35.40 | 9.92 | 969∶1 |
对于F129和L129等位基因选择性引物PV129-Wt6和PV129～Mut5，除了最低模板浓度外，在整个模板浓度范围中，特异性范围是恒定的。
第二个验证研究涉及用实施例15中描述的Scorpion引物试验选定的F129和L129等位基因选择性引物PV129-Wt6和PV129-Mut5的检测敏感性。如实施例14所述进行试验，结果显示在表39中。
表39：显示和实施例15中设计的Scorpion引物一起，ARMS引物Pv129-wt6和Pv129-mut5检测的敏感性的结果
| DNA模板 | 突变体等位基因Ct | 野生型等位基因Ct | ΔCt | 校正的ΔCt(3.3) | 观察到的C∶T比 | ％突变体等位基因 |
| 1∶1 | 17.04 | 20.35 | -3.32 | -0.02 | 1.01∶1 | 50.31 |
| 1∶10 | 20.23 | 20.37 | -0.14 | 3.16 | 1∶3.74 | 10.08 |
| 1∶100 | 24.29 | 18.93 | 5.37 | 8.66 | 1∶404 | 0.25 |
| 1∶1000 | 26.84 | 18.7 | 8.14 | 11.43 | 1∶2759 | 0.036 |
| 1∶10000 | 30.01 | 19.47 | 10.54 | 13.84 | 1∶14664 | 0.007 |
| 1∶100000 | 31.45 | 19.72 | 11.73 | 15.03 | 1∶33456 | 0.003 |
因此，该结果显示，在引物Pv129-mut5(L129等位基因选择性引物)结合不适合的模板前，该测定法可以检测F129等位基因(野生型)背景中1∶10000比率的L129等位基因(突变体)的水平。
设计第三个验证试验以试验是否优选的ARMS引物以相同的效率扩增。确保扩增效率大约相等是重要的，因为两个引物间Ct的差异直接对应于样品中抗药性等位基因的频率。测试这一点的一个方法是比较ΔCt如何随着模板浓度变化。对ΔCt绘制logDNA输入值，由此得到的斜率应该小于0.1。这按实施例8所述进行。用F129和L129等位基因特异性引物PV129-Wt6和PV129-Mut5及实施例15中描述的Scorpion引物一起试验模板稀释液，使野生型和突变体质粒DNA和仅有水的对照。
表40：用ARMS引物Pv129-wt6和Pv129-mut5及实施例15中设计的Scorpion引物进行的相对效率试验的结果
| DNA模板 | Log DNA浓度 | 突变体Ct | 野生型Ct | ΔCt | 校正的ΔCt(2.54) |
| 128 | 2.107 | 17.78 | 18.58 | -0.8 | 1.74 |
| 64 | 1.806 | 18.53 | 18.42 | 0.11 | 2.65 |
| 32 | 1.505 | 19.2 | 19.66 | -0.45 | 2.09 |
| 16 | 1.204 | 20.7 | 21.23 | -0.53 | 2.01 |
| 8 | 0.903 | 21.07 | 20.82 | 0.25 | 2.79 |
| 4 | 0.602 | 21.38 | 23.57 | -2.2 | 0.34 |
| 2 | 0.301 | 23.24 | 22.63 | 0.61 | 3.15 |
| 1 | 0 | 24.21 | 24.22 | 0.0 | 2.54 |
将Ct对logDNA模板浓度作图，用Excel计算线的斜率。线的斜率小于0.1，因此ARMS引物PV129-mut5和PV129-wt6以大致相同的效率扩增(图18)。
设计第四个验证试验以研究是否宿主植物DNA(这种情况下是葡萄树DNA)，例如由于作为PCR模板，能影响测定。在收集和直接试验感染叶片材料时在任何样品中将存在葡萄树DNA。
为了进行该研究，用Qiagen DNeasy植物小量制备试剂盒，从葡萄树叶片样品提取基因组DNA(首先，通过在Centriprep搅拌研磨机中搅拌10分钟，在含有钢珠的1.5ml微量离心管中研磨100mg材料)。在重蒸馏H2O中，以5倍系列稀释由此得到的DNA，以产生下列浓度：“纯的”(因为直接从小量制备试剂盒制备中获得)，1∶5，1∶25和1∶125(植物DNA以水稀释)。也制备了1∶100和1∶10000的L129等位基因∶F129等位基因质粒DNA的两种混合物(如上所述)。这些母液与渐降的植物材料背景混合产生下列PCR输入：1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+纯植物DNA，1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+1∶5植物DNA，1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+1∶25植物DNA，1∶100L129等位基因∶F129等位基因+1∶125植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+纯植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+1∶5植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+1∶25植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+1∶125植物DNA。如上所述，在测定中用优选的ARMS引物测试所有上述这些及植物稀释液，单独的L129等位基因∶F129等位基因质粒DNA各比率，2×107分子/μl浓度的野生型和突变体质粒DNA和仅有水的对照。
以与这个实施例中所述的验证试验描述的方式相似的方式分析该结果。
验证的最后阶段涉及在生物样品上试验ARMS引物PV129-mut5和PV129-wt6和对照引物。用在该实施例中的生物样品是孢子囊团块。从30片葡萄树叶片样品洗出孢子囊形成孢子囊悬浮液；离心，移出上清液，保留孢子囊沉淀。(葡萄生单轴霉(P.viticola)感染的葡萄树叶片也可以用作起始生物材料)。也如实施例11所述，用SpexCertiPrep 8000搅拌研磨机(Mixer Mill)(Glen Creston Ltd)研磨100mg生物材料。然后，也如实施例11所述，按照制造商的程序，用Qiagen DNeasy植物小量制备试剂盒进行基因组DNA制备，
在无菌重蒸馏H2O中，以1∶10和1∶100稀释由此得到的基因组DNA，如上所述，在ARMS/Scorpion测定中试验这些模板稀释液。用ARMS引物PV129-mut5和PV129-wt6及对照引物试验每个模板稀释液；也包含分别作为阳性和阴性对照的野生型和突变体质粒DNA及仅有水的对照。以和这个实施例中验证试验所述的方式相似的方式分析该结果。
实施例17
能够检测任何葡萄生单轴霉(P.viticola)分离物中F129和L129等位基因的ARMS/Scorpions测定法的设计。
为了检测能够转换F129为L129的其它单核苷酸多态性，可以利用能区别仅129密码子位置1(即，在位置1是存在胸腺嘧啶还是胞嘧啶残基)的有义ARMS寡核苷酸对(oligo pair)/反义Scorpion联合。同样地，能区别129密码子位置3所有可能残基，即胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤或鸟嘌呤残基的反义ARMS寡核苷酸对/有义Scorpion联合可以检测可替代的位置3置换，其中所述置换能引起L129介导的抗性。这些位置1和3的测定法联合起来也提供了评估双突变水平的方法，所述双突变可能引起F129到L129(密码子：CTA和CTG)转换。
反义ARMS寡核苷酸对/有义Scorpion联合可以利用前面实施例13中详细描述的Scorpion引物设计，其中在与下面SNP检测ARMS引物和对照引物联合使用的正向PCR引物上掺入检测系统。
基于129密码子位置3胸腺嘧啶残基的三个反向ARMS引物：
PV129-1 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
A
PV129-2 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
A
PV129-3 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
A
基于129密码子位置3腺嘌呤残基的三个反向ARMS引物：
PV129-4 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
T
PV129-5 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
T
PV129-6 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
T
基于129密码子位置3胞嘧啶残基的三个反向ARMS引物：
PV129-7 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
G
PV129-8 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
G
PV129-9 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
G
基于129密码子位置3鸟嘌呤残基的三个反向ARMS引物：
PV129-10 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
C
PV129-11 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
C
PV129-12 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA
C
及从点突变下游设计的对照引物：
PV129-S2 TTGTCCCCAAGGCAAAACATAACCC
在每个上述ARMS引物中，-1碱基(引物序列3’末端)对应于靶点突变位点。粗体表示的碱基不同于野生型葡萄生单轴霉(P.viticola)细胞色素b序列。在PV129-1，PV129-4，PV129-7和PV129-10引物中，-2位置从A变为T。在PV129-2，PV129-5，PV129-8和PV129-11引物中，-2位置从A变为G。在PV129-3，PV129-6，PV129-9和PV129-12引物中，-2位置从A变为C。对序列进行这些改变以去稳定模板/引物杂合体，使得任何引物延伸对相应的模板更特异。用ARMS引物得到的扩增子将是126bp长，用对照引物得到的扩增子将是129bp长。
通过Oswel DNA服务公司(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，分别在500μl总体积重蒸馏无核酸酶的H2O中，稀释引物到5μM。然后，在PCRs中，进一步稀释引物到500nM的终浓度。
为了利用有义ARMS寡核苷酸对/反义Scorpion联合检测129密码子位置1的胸腺嘧啶或胞嘧啶残基，下面详述另一个Scorpion设计。再一次利用根据实施例11获得的野生型葡萄生单轴霉(P.viticola)及样品I112和I116b细胞色素b基因的序列，在反向PCR引物上掺入检测系统，设计Scorpion寡核苷酸；然后Scorpion引物可以与SNP检测ARMS引物和对照引物一起使用。
更具体地，用Oligo 5和MFold程序(Mfold利用Zucker的能量最小化方法预测RNA或DNA分子的最佳和次佳二级结构(Zucker，M.(1989)Science 244，48-52；SantaLucia，J.Jr.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，1460-1465)设计Scorpion引物。
由此得到的葡萄生单轴霉(P.viticola)Scorpion引物的序列是：
其中下划线区是发夹形成部分(当Scorpion引物未反应时)；FAM是荧光素染料；MR(甲基红)是与尿嘧啶残基附着的非荧光猝灭剂，HEG是复制阻断六乙二醇单体。斜体序列是反向引物序列，粗体序列是结合反向引物的真实葡萄生单轴霉(P.viticola)细胞色素b延伸产物的Scorpion序列。带下划线的粗体碱基参与部分发夹茎和结合反向引物之延伸产物的Scorpion序列。
用Mfold程序可以观察该Scorpion引物的茎-环二级结构(参见图19)，并且预测当其不与靶细胞色素b基因杂交时，其有-2.2kcal/mol的能量。然而，在延伸产物存在的情况下，因为Scorpion引物的探针序列以预测的-6.1kcal/mol能量结合延伸产物，所以发夹结构分离。这使FAM染料和其染料猝灭剂分离，引起了通过例如ABIPrism 7700仪器可检测的荧光发射。因此，与Scorpion茎-环比较，Scorpion成分在新合成链上的退火是能量上有利的。
反义Scorpion引物可以与下面有义ARMS引物联合使用以检测129密码子位置1的胸腺嘧啶或胞嘧啶残基。
基于129密码子位置1胸腺嘧啶残基的三个正向ARMS引物：
PV129-13 TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC
T
PV129-14 TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC
T
PV129-15 TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC
T
基于129密码子位置1胞嘧啶残基的三个正向ARMS引物：
PV129-16 TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC
C
PV129-17 TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC
C
PV129-18 TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC
C
和从点突变上游设计的对照引物：
PV129-S3 TATTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC
在每个上述ARMS引物中，-1碱基(引物序列3’末端碱基)对应于靶点突变位点。粗体的碱基不同于野生型葡萄生单轴霉(P.viticola)细胞色素b序列。在PV129-13和PV129-16引物中，-2位置从A变为T。在PV129-14和PV129-17引物中，-2位置从A变为C。在PV129-15和PV129-18引物中，-2位置从A变为G。对序列进行这些改变以去稳定模板/引物杂合体，使得任何引物延伸对相应的模板更特异。用ARMS引物得到的扩增子将是278bp长，用对照引物得到的扩增子将是280bp长。
通过Oswel DNA服务公司(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，分别在500μl总体积重蒸馏无核酸酶的H2O中，稀释引物到5μM。然后，在PCRs中，进一步稀释引物到500nM的终浓度。
实施例18
用于葡萄生单轴霉(P.viticola)中F129和L129等位基因检测和定量的MGB(小沟结合剂)杂交测定的设计
利用根据实施例11获得的野生型葡萄生单轴霉(P.viticola)及样品I112和I116b细胞色素b基因的序列，设计MGB杂交测定法以检测在密码子129第一位置的T到C点突变(SNP-多核苷酸多态性)，该突变编码苯丙氨酸到亮氨酸的改变。该测定法利用点突变(SNP)上游的普通正向引物，点突变(SNP)下游的普通反向引物和覆盖点突变(SNP)的两个MGB探针，其中一个探针匹配野生型序列，一个探针匹配突变体序列。依据该设计标准用Primer Express vs1.5软件设计该测定。
引物和探针序列如下：
正向引物：5’CGGATCTTATATTACACCTAGAGAAGCTTT 3’
反向引物：5’TTGTCCCCAAGGCAAAACAT 3’
突变体探针(L129等位基因特异性)：5’AACCCATAA
TGCAGTC 3’
野生型探针(F129等位基因特异性)：5’ACCCATAA
TGCAGTCG 3’
针对互补序列设计探针。以粗体和下划线突出的碱基是点突变(SNP)。用荧光团FAM在5’末端标记突变体探针，用荧光团VIC在5’末端标记野生型探针。用MGB单位的附着修饰两个探针的3’末端。通过Applied Biosystems(Kelvin Close，Birchwood Science ParkNorth，Warrington，Cheshire，WA3 7PB)合成引物和探针。
实施例19
用于葡萄生单轴霉(P.viticola)中F129L SNP检测和定量的MGB杂交测定的验证
第一个验证试验包括测试野生型和突变体特异性MGB探针对它们的正确DNA模板与它们的错误DNA模板相比的杂交特异性。用下面反应条件进行所有的MGB杂交测定：反应中正向和反向引物最终浓度是900nM，反应中野生型或突变体MGB杂交探针的终浓度是200nM，以2×浓度提供Taqman通用PCR母混合物(master mix)，使用5μl DNA，用无核酸酶的H2O补充反应液达到25μl总体积。PCR循环条件如下：50℃，2分钟进行一轮循环，随后95℃，10分钟进行一轮循环，随后95℃，15秒和60℃，1分钟进行50轮循环。所有循环的退火/延伸步骤期间监测荧光。
用含有部分细胞色素b基因的质粒DNA构建体试验野生型和突变体MGB探针的特异性，其中部分细胞色素b基因在129位置编码野生型(F129等位基因)或突变体(L129等位基因)序列。如实施例14所述，制备上述这些。以2×108-2×102分子/μl的10倍稀释度系列稀释含有野生型(F129等位基因)细胞色素b基因序列的质粒DNA和含有突变体(L129等位基因)细胞色素b基因序列的质粒DNA。如上所述，在用野生型MGB探针的测定和用突变体MGB探针的测定中测试所有上述这些。也包括仅有水的对照。在表41和42中给出了结果。
表41：在质粒DNA模板系列稀释中试验的突变体MGB探针测定法
| 质粒DNA模板稀释度 | 突变型模板Ct | 野生型模板Ct | ΔCt |
| 2×108 | 10.56 | 无扩增 | n/a |
| 2×107 | 13.73 | 无扩增 | n/a |
| 2×106 | 16.76 | 无扩增 | n/a |
| 2×105 | 20.32 | 无扩增 | n/a |
| 2×104 | 24.03 | 无扩增 | n/a |
| 2×103 | 27.08 | 无扩增 | n/a |
| 2×102 | 30.9 | 无扩增 | n/a |
表42：在质粒DNA模板系列稀释中试验的野生型MGB探针测定法
| 质粒DNA模板稀释度 | 突变型模板Ct | 野生型模板Ct | ΔCt |
| 2×108 | 无扩增 | 10.05 | n/a |
| 2×107 | 无扩增 | 14.22 | n/a |
| 2×106 | 无扩增 | 17.25 | n/a |
| 2×105 | 无扩增 | 20.21 | n/a |
| 2×104 | 无扩增 | 23.24 | n/a |
| 2×103 | 无扩增 | 27.06 | n/a |
| 2×102 | 无扩增 | 29.99 | n/a |
这些结果表明在模板DNA浓度稀释系列中，野生型或突变体MGB杂交探针都不结合它们的错误模板。
第二个验证试验研究了突变体MGB杂交探针和野生型MGB杂交探针的检测敏感性。将浓度是2×107分子/μl、带有L129等位基因(突变体)的质粒DNA稀释到背景质粒DNA中，所述背景质粒DNA带有F129等位基因(野生型)，浓度恒定是2×107分子/μl，以产生L129比F129等位基因的下列比率：1∶1，1∶10，1∶100，1∶1,000，1∶10,000和1∶100,000。PCR中最终质粒浓度是1×108分子/μl。在用野生型MGB探针和突变体MGB探针的两个测定中试验上述这些及野生型质粒、突变体质粒和仅有水的对照。结果表示在表43中。
表43：显示野生型和突变体MGB探针测定法检测敏感性的结果
| DNA模板 | 突变型等位基因Ct | 野生型等位基因Ct | ΔCt | 突变型∶野生型比 | ％突变型等位基因 |
| 1∶1 | 11.47 | 12.26 | -0.79 | 1.72∶1 | 63.4％ |
| 1∶10 | 14.47 | 12.77 | 1.7 | 1∶3.25 | 23.5％ |
| 1∶100 | 无扩增 | 13.01 | n/a | n/a | n/a |
| 1∶1000 | 无扩增 | 13.05 | n/a | n/a | n/a |
| 1∶10000 | 无扩增 | 12.97 | n/a | n/a | n/a |
| 1∶100000 | 无扩增 | 13.03 | n/a | n/a | n/a |
该测定法的检测敏感性仅仅是10个野生型(F129)等位基因背景中的一个突变体(F129)等位基因。联合普通正向和反向引物对，利用TaqMan探针或TaqMan MGB探针用于突变检测的杂交测定法能检测真菌样品中在5～10％水平的突变体等位基因。当需要检测更较水平的突变体等位基因时，更优选利用ARMS引物联合适当的检测系统即Scorpion引物。
实施例20
对QoI位点抑制剂类杀真菌剂显示了降低的敏感性的马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)分离物细胞色素b基因的表征
还已经表征了当在生物测定中试验时对QoI位点抑制剂杀真菌剂显示了降低的敏感性的两个马铃薯早疫病链格孢(A.solani)分离物的细胞色素b基因。从这些分离物提取DNA，用由此得到的gDNA(基因组DNA)作为PCRs模板扩增细胞色素b基因。用下列引物：
正向引物：5’CTG TTA TCT TTA TCT TAA TGA TGG3’
反向引物：5’GGA ATA GAT CTT AAT ATA GCA TAG 3’
在下列条件下：94℃，3分钟进行一轮循环，随后94℃45秒，58℃45秒和72℃1分钟30秒进行30轮循环，随后在72℃，10分钟进行一轮循环，如前述进行PCRs。
通过凝胶电泳观察PCR产物，用Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒克隆正确预测大小的PCR产物，并且转化到大肠杆菌(E.coli)中。如前所述，筛选转化体大肠杆菌(E.coli)的菌落，继代培养，通过小量制备制备质粒DNA。测序质粒DNAs(参见实施例11)，并用适合的生物信息学软件(例如，Seqman，Editseq和Macaw)分析序列数据。推导出的两个分离物的细胞色素b基因序列与已知的野生型细胞色素b系列(以前测定的)比较。核苷酸和氨基酸对齐表示在图20和21中，用如在遗传密码(Genetic Codes)(NCBI分类学)：
Http：//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wprintgc？mode＝t中所述的“Mold，Protozoan and CoelenterateMitochondrial Code-Number 4”预测了氨基酸序列。
在第一个马铃薯早疫病链格孢(A.solani)样品细胞色素b基因密码子129的第一个位置观察到了T到C突变(SNP)的存在。根据酿酒酵母(S.cerevisiae)编号系统，当与基线/亲本样品比较时，该突变在129位置引起了苯丙氨酸到亮氨酸的改变。第二个样品(样品2)在密码子129也显示了突变(SNP)的存在，但是这是在密码子129第三个位置从C到A。根据酿酒酵母(S.cerevisiae)编号系统，这在位置129也引起了苯丙氨酸到亮氨酸的改变。生物测定中观察到的这两个样品的每一个中对QoI位点抑制剂化合物的降低敏感性可能与位置129苯丙氨酸(F)到亮氨酸(L)的氨基酸改变有关。这是首次在马铃薯早疫病链格孢(A.solani)中观察到赋予F到L氨基酸改变的单核苷酸多态性(SNP)。也是首次在任何真菌物种检测到细胞色素b密码子129中两个不同的SNPs，每个SNP编码F到L的氨基酸改变。
Claims (38)
1、真菌细胞色素b基因中一个或多个突变的检测方法，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中氨基酸置换，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗性组中任何其它化合物的抗性，所述方法包括利用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术鉴定真菌核酸中所述突变的存在或缺乏。
2、如权利要求1所述的方法，用于检测真菌细胞色素b基因中一个或多个突变，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸到亮氨酸的置换(F129L)，其中所述突变的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗性组中任何其它化合物的抗性，所述方法包括利用任何(或一种)单核苷酸多态性检测技术鉴定真菌核酸中所述突变的存在或缺乏。
3、如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括检测PCR反应过程中产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在适当核苷三磷酸和聚合用试剂存在的情况下，用诊断引物接触包含真菌核酸的试验样品，其中所述扩增子的检测与所述核酸中所述突变的存在或缺乏直接相关。
4、如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法利用等位基因选择性杂交探针技术。
5、真菌细胞色素b基因中一个或多个核苷酸多态性的诊断方法，该方法包括在对应于如下三联体中一个或多个碱基的位置确定编码真菌细胞色素b蛋白质的真菌核酸的序列，该三联体编码真菌细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，并且通过参照该细胞色素b基因中一个或多个多态性，确定所述真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗性组中化合物的抗性状态。
6、检测真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗性组中任何其它化合物的抗性的方法，所述方法包括鉴定编码真菌细胞色素b基因的真菌核酸中一个或多个突变的存在或缺乏，其中所述突变的存在引起了对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗性组中任何其它化合物的抗药性，所述方法包括鉴定单核苷酸多态性的存在或缺乏，该单核苷酸多态性出现在对应于如下三联体中一个或多个碱基的位置，该三联体编码真菌细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
7、如前述权利要求任一权利要求所述的方法，其中单核苷酸多态性突变出现在三联体第一和/或第三个碱基，该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
8、如前述权利要求任一权利要求所述的方法，其中单核苷酸多态性突变出现在三联体第一或第三个碱基，该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
9、如前述权利要求任一权利要求所述的方法，其中单核苷酸多态性突变出现在三联体第三个碱基，该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
10、如前述权利要求任一权利要求所述的方法，其中单核苷酸多态性突变出现在三联体第一个碱基，该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
11、编码细胞色素b蛋白质之全部或部分的真菌DNA序列，其中当与相应的编码细胞色素b蛋白质的野生型DNA序列对齐所述真菌DNA序列时，在对应于如下三联体一个或多个碱基的DNA位置观察到所述真菌DNA序列含有单核苷酸多态性突变，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，单核苷酸多态性突变引起了可替代的氨基酸对正常苯丙氨酸残基的置换。
12、如权利要求11所述的真菌DNA序列，其中所述可替代的氨基酸是亮氨酸残基。
13、如权利要求11或12所述的真菌DNA序列，获自或可获自真菌，所述真菌选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici)，禾白粉菌大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinulanecator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)。
14、如权利要求13所述的真菌DNA序列，获自或可获自真菌，所述真菌选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici)，禾白粉菌大麦专化型(Erysiphe graminis f.sp.hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporiumsecalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinulanecator)，禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
15、真菌细胞色素b基因中一个或多个突变存在或缺乏的检测方法，该突变在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置引起了编码蛋白质中苯丙氨酸残基的置换，所述方法包括鉴定真菌核酸样品中所述突变的存在或缺乏，其中任何(或一种)单核苷酸多态性检测方法基于对应于如下三联体一个或多个碱基的位置上游和/或下游约30到90个核苷酸的序列信息，该三联体编码野生型或突变体蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
16、如权利要求15所述的方法，其中所述的检测方法基于对应于三联体第一或第三个碱基的位置上游和/或下游约30到90个核苷酸的序列信息，该三联体编码野生型或突变体蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
17、如权利要求16所述的方法，其中所述的检测方法基于对应于三联体第三个碱基的位置上游和/或下游约30到90个核苷酸的序列信息，该三联体编码野生型或突变体蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
18、如权利要求16所述的方法，其中所述的检测方法基于对应于三联体第一个碱基的位置上游和/或下游约30到90个核苷酸的序列信息，该三联体编码野生型或突变体蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
19、能够结合编码野生型细胞色素b蛋白质的真菌核酸序列的等位基因特异性寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含识别编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的苯丙氨酸残基的核酸序列的序列。
20、能够结合编码野生型细胞色素b蛋白质的真菌核酸序列的等位基因特异性寡核苷酸，所述真菌选自：葡萄生单轴霉(Plasmoparaviticola)，禾白粉菌小麦专化型(Erysiphe graminisf.sp.triticii)，禾白粉菌大麦专化型(Erysiphe graminisf.sp.hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercosporaarachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomycescarpophillum，Didymella bryoniae，烟草霜霉菌(Peronosporatabacina)，隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)，其中所述的寡核苷酸包含识别编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的苯丙氨酸残基的核酸序列的序列。
21、能够结合编码突变体细胞色素b蛋白质的真菌核酸序列的等位基因特异性寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含识别核酸序列的序列，所述核酸序列编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，所述氨基酸选自：异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，酪氨酸，最优选亮氨酸。
22、如权利要求21所述的等位基因特异性寡核苷酸，能够结合编码突变体细胞色素b蛋白质的真菌核酸序列，所述真菌选自：葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麦专化型(Erysiphegraminis f.sp.tritici)，禾白粉菌大麦专化型(Erysiphe graminisf.sp.hordei)，黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)，圆核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，苹果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，苍耳单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病钩丝壳霉(Uncinula necator)，禾生刺盘孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)，茄属丝核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercosporaarachidola，尖孢刺盘孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomycescarpophillum，Didymella bryoniae，烟草霜霉菌(Peronosporatabacina)，隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)和堀病柄锈菌(Puccinia horiana)，其中所述寡核苷酸包含识别核酸序列的序列，所述核酸序列编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，所述氨基酸选自：异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，酪氨酸，最优选亮氨酸。
23、具有在对应于三联体一个或多个碱基的DNA位置检测野生型细胞色素b基因序列能力的等位基因特异性寡核苷酸探针，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
24、具有在对应于三联体一个或多个碱基的DNA位置检测真菌细胞色素b基因多态性能力的等位基因特异性寡核苷酸探针，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
25、如权利要求24所述的等位基因特异性寡核苷酸探针，具有在对应于三联体第一和/或第三个碱基的DNA位置检测真菌细胞色素b基因多态性的能力，该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
26、如权利要求24或25所述的等位基因特异性寡核苷酸探针，具有在对应于三联体第一或第三个碱基的DNA位置检测真菌细胞色素b基因多态性的能力，该三联体编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
27、如权利要求24，25或26所述的等位基因特异性寡核苷酸探针，具有在对应于三联体第三个碱基的DNA位置检测真菌细胞色素b基因多态性的能力，该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
28、如权利要求24，25或26所述的等位基因特异性寡核苷酸探针，具有在对应于三联体第一个碱基的DNA位置检测真菌细胞色素b基因多态性的能力，该三联体编码对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
29、具有在对应于三联体一个或多个碱基的DNA位置检测细胞色素b基因多态性的能力的等位基因特异性引物，该三联体编码蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
30、如权利要求29所述的等位基因特异性引物，具有在对应于三联体第一和/或第三个碱基的DNA位置检测细胞色素b基因多态性的能力，该三联体编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
31、如权利要求29或30所述的等位基因特异性引物，具有在对应于三联体第一或第三个碱基的DNA位置检测真菌细胞色素b基因多态性的能力，该三联体编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
32、如权利要求29，30或31所述的等位基因特异性引物，具有在对应于三联体第三个碱基的DNA位置检测真菌细胞色素b基因多态性的能力，该三联体编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
33、如权利要求29，30或31所述的等位基因特异性引物，具有在对应于三联体第一个碱基的DNA位置检测真菌细胞色素b基因多态性的能力，该三联体编码在对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸。
34、能够在对应于三联体第一和/或第三个碱基的位置结合含有突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与所述突变体形式真菌细胞色素b基因中存在的核苷酸对应，并且所述核苷酸的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗性组中任何其它化合物的抗性。
35、能够在对应于三联体第一或第三个碱基的位置结合含有突变体类型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板的诊断引物，该三联体编码细胞色素b蛋白质中对应于酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞色素b残基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸与所述突变体形式真菌细胞色素b基因中存在的核苷酸对应，并且所述核苷酸的存在引起了真菌对嗜球果伞素类似物或相同交叉抗性组中任何其它化合物的抗性。
36、用在权利要求1到10，15和/或16任一权利要求所述的方法中的试剂盒。
37、如权利要求36所述的诊断试剂盒，包含下列的一个或多个：诊断、野生型、对照和普通寡核苷酸引物，适当的核苷三磷酸，例如dATP，dCTP，dGTP，dTTP，适当的聚合酶和缓冲溶液。
38、如权利要求36所述的试剂盒，包括等位基因选择性杂交探针和下列的一个或多个：使得包含靶病原体细胞色素b基因中包括密码子129的区域的DNA区段能够选择性扩增的寡核苷酸引物，所述靶病原体细胞色素b基因来自野生型和抗嗜球果伞素类似物或相同交叉抗性组中任何其它化合物的抗性分离物，诊断野生型(F129)和抗性(A129)选择性杂交探针，适当的核苷三磷酸，例如dATP，dcTP，dGTP，dTTP，如前所述的适当聚合酶和缓冲溶液。
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