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CN1886521A - Cmv抗性相关分子标志及其用途 - Google Patents

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CN1886521A CNA2004800354015A CN200480035401A CN1886521A CN 1886521 A CN1886521 A CN 1886521A CN A2004800354015 A CNA2004800354015 A CN A2004800354015A CN 200480035401 A CN200480035401 A CN 200480035401A CN 1886521 A CN1886521 A CN 1886521A
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Abstract

本发明涉及与CMV(cucumber mosaic virus)抗性有关的分子标志及其用途，更具体讲，提供一种与植物体的CMV抗性的性状相关程度极高的序列的核酸、含有上述核酸的一部分的核苷酸序列的引物以及利用它们检测CMV抗性植物体的方法。本发明的分子标志具有可以不将CMV直接接种在植物体也可迅速、正确检测CMV抗性植物体，甚至能够决定CMV抗性植物体的遗传型的长处。

Description

CMV抗性相关分子标志及其用途
技术领域
本发明涉及CMV(cucumber mosaic virus：黄瓜花叶病毒)抗性相关分子标志及其用途，详细讲提供具有与植物体的CMV抗性性状相关程度非常高的序列的核酸、含有上述核酸的一部分核苷酸序列的引物以及使用这些引物检测CMV抗性植物体的方法。
背景技术
黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus；以下称为CMV)作为在植物病毒中宿主范围最广泛的植物病原病毒，给全世界的双子叶和单子叶约900余种植物带来很大的经济灾害。植物一旦被CMV感染，在叶、茎和果实中出现花叶症状。特别是染病的叶变小，变得皱皱巴巴，沿着叶脉产生病变。在果实中出现绿色浓淡不均的花叶，呈凹凸不平，商品价值下降。
另一方面，为了培育抗病性品种，不得不通过连续的逆代杂交从具有抗病性因子的其它品种中导入该因子，而在每个导入阶段都必须要经过抵抗性测试后再进行选拔，从这样的选拔阶段开始如果利用与上述抗病性因子密切相关的分子标志(molecular marker)，那就太方便了。因此，与利用了分子标志的CMV诊断方法以及与通过转化的CMV抗性品种开发有关的各种技术正在被开发。例如，在大韩民国专利申请第2000-0025699号中公布了能够用一系列基因扩增用引物来诊断属于黄瓜花叶病毒属的CMV、花生矮化病毒和番茄不孕病毒的黄瓜花叶病毒诊断用引物的核苷酸序列以及利用了该引物的基因诊断和鉴定方法。大韩民国专利登录第0293567号中公布了使在韩国国内分离的CMV膜被蛋白质的基因转化番茄的针对CMV的抗性系统的开发方法。另外，大韩民国专利申请第1993-0029605号中记载了为了制造具有针对引起作物生病的CMV的抗性的转化作物，攻击CMV膜被蛋白质的基因RNA的锤头状核酸酶。
象上述那样，与CMV抗性的诊断以及具有CMV抗性的植物开发有关的现有技术均以CMV膜被蛋白质的基因为对象，针对植物体固有的CMV抗性因子的技术开发的报告还没有。
因此，一直迫切需要来自于含有CMV抗性因子的植物体系统的与上述病毒抗性有关的分子标志的开发，以及利用被开发的分子标志诊断植物体中有无CMV感染的方法的开发。
发明内容
本发明是根据上述那样要求研究出的，本发明在于提供具有与CMV抗性性状相关程度极高的核苷酸序列的分子标志及其用途。
为了达到上述那样的本发明目的，本发明提供由序列2或序列22的核苷酸序列构成的核酸。
为了达到本发明另一个目的，本发明提供含有选自序列2或序列22的核苷酸序列的一系列核苷酸序列的CMV抗性植物体检测用引物。
为了达到本发明另一个目的，本发明提供含有上述核酸或引物的CMV抗性植物体检测用试剂盒。
为了达到本发明另一个目的，本发明提供包括在上述核酸或引物存在的基础上，对植物体的基因组DNA进行分析的检测CMV抗性植物体的方法和决定上述植物体的基因型(genotype)的方法。
另外，为了达到本发明另一个目的，本发明提供通过组织培养无性繁殖的、含有由序列2或序列22的核苷酸序列构成的核酸的CMV抗性植物体以及从该植物体收获的种子。
以下对本发明进行详细说明。
本发明提供与植物体的CMV抗性性状相关程度高的分子标志(以下表示为‘CMV抗性相关分子标志’)。本发明提供的CMV抗性相关分子标志含有由序列2或序列22的核苷酸序列构成的核酸。在上述描述中，核酸包括所有RNA、DNA和cDNA，优选DNA。本发明的分子标志是与CMV的抗性性状密切相关的核苷酸序列，由于位于非常靠近CMV抗性基因的位置，即使使用上述核苷酸序列表现出的任意多态性，也可以把握植物体有无CMV的抗性。
另外，本发明的分子标志包括含有从上述核酸的核苷酸序列中选出的一系列核苷酸序列的CMV抗性植物体的检测用引物。上述引物优选具有从序列2或序列22的核苷酸序列中选出的至少10个以上、更优选12个以上的一系列核苷酸序列。本发明引物可以设计成同行众所周知的适用于各种DNA的多态性分析的RFLP(restriction fragment length polymerphism：限制性片段长度多态性)、RAPD(randomly amplified polymorphic DNA：随机扩增多态DNA)、DAF(DNA amplification fingerprinting：DNA扩增指纹)、AP-PCR(arbitrarilyprimed PCR：随机引物PCR)、STS(sequence tagged site：序列标签位点)、EST(expressed sequence tag：表达序列标签)、SCAR(sequence characterizedamplified regions：序列特异扩增区域)、ISSR(inter-simple sequence repeatamplification：简单序列重复区间扩增)、AFLP(amplified fragment lengthpolymorphism：扩增片段长度多态性)、CAPS(cleaved amplified polymorphicsequence：酶切扩增多型性序列)、PCR-SSCP(single-strand conformationpolymorphism：单链构象多态性)等(Jordan et al.，Theor.Appl.Genet.，106：559-567、2003；Martins M.、R.et al.、Plant Cell Reports，22：71-78、2003；Williams，J.G.K.et al.、Nucl.Acids Res.、18：6531-6535、1990；Michelmore，R.W.、et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88：9828-9832、1991；Martins et al.、PlantCell Rep.、22：71-79、2003；Orita et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2766-2770、1989)。为了进行DAF分析，可以设计使用由5-8个核苷酸构成的引物。例如，用于STS分析的引物可以设计成与RFLP标志的末端核苷酸序列一致，而用于SCAR分析的引物可以根据RAPD标志的末端核苷酸序列进行设计。另外，用于CAPS分析的引物可以设计成含有合适的限制性内切酶位点。本发明中提供的引物可以具有由序列1和从序列23至序列26构成的序列组中选出的核苷酸序列。另外，本发明的引物可以在不影响有关CMV抗性性状的多态性检测的范围内进行改变(例：附加、缺失、置换)。能够对从序列2或序列22的核苷酸序列中选出的最少12个一系列核苷酸序列附加和/或置换任意核苷酸来进行改变。例如，可以具有序列27或序列28的核苷酸序列。
本发明的分子标志对于CMV抗性植物体的检测非常有用。因此，本发明提供包括在上述核酸或上述引物存在下对植物体的基因组DNA进行分析的CMV抗性植物体的检测方法。上述方法并不受此限制，可以使用如RFLP(restriction fragment length polymerphism)、RAPD(randomly amplifiedpolymorphic DNA)、DAF(DNA amplification fingerprinting)、AP-PCR(arbitrarily primed PCR)、STS(sequence tagged site)、EST(expressed sequencetag)、SCAR(sequence characterized amplified regions)、ISSR(inter-simplesequence repeat amplicafition)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)、PCR-SSCP(single-strandconformation polymorphism)等那样的同行都众所周知的各种DNA多态性分析来进行分析。(Jordan et al.，Theor.Appl.Genet.，106：559-567、2003；MartinsM.、R.et al.、Plant Cell Reports，22：71-78、2003；Williams，J.G.K.et al.、Nucl.Acids Res.、18：6531-6535、1990；Michelmore，R.W.、et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88：9828-9832、1991；Martins et al.、Plant Cell Rep.、22：71-79、2003；Oritaet al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2766-2770、1989)。最好是使用RFLP、RAPD或CAPS分析。
具体来说，上述的方法可以通过包括下述步骤的CAPS分析来进行。
(a)以从CMV抗性植物体和CMV易感性植物体得到的各基因组DNA作为模板，使用含有从序列2或序列22的核苷酸序列中选出的一系列碱基的引物来进行PCR的步骤；
(b)将PCR产物用限制性内切酶进行酶切的步骤；
(c)将被酶切的DNA片段加到琼脂糖凝胶上进行电泳的步骤；以及
(d)对电泳结束后的凝胶的DNA带型进行比较的步骤。
上述(a)步骤的引物最好选自由序列23至序列28构成的群组。最好是使用从由序列23/24；序列23/25；序列23/26；以及序列27/28构成的群组中选出的引物组合。另外，上述(b)步骤的限制性内切酶只要是存在于序列2或序列22的核苷酸序列内的限制性内切酶，可以无限制地使用，优选使用XbaI或EcoR I。
另外，上述方法可以通过包括下面步骤的RAPD分析进行：
(a)以从CMV抗性植物体和CMV易感性植物体得到的各基因组DNA作为模板，利用可扩增序列2记载的核苷酸序列的引物进行PCR的步骤；
(b)将PCR产物加到琼脂糖凝胶上进行电泳的步骤；以及
(c)对电泳结束后的凝胶的DNA带型进行比较的步骤。
上述(a)步骤的引物为了扩增序列2记载的核酸，可以具有同行能够设计的所有的核苷酸序列，优选具有序列1记载的核苷酸序列。
因此，上述方法可以通过包括下面步骤的RFLP分析进行：
(a)将从CMV抗性植物体和CMV易感性植物体得到的各基因组DNA用适当的限制性内切酶进行酶切的步骤；
(b)将被酶切的DNA片段在琼脂糖凝胶上进行电泳的步骤；
(c)使凝胶上的DNA转移到尼龙膜上的步骤；
(d)以具有序列2记载的核苷酸序列的核酸作为探针进行Southern blot的步骤；以及
(e)暴露于X-ray胶片上，对DNA带型进行比较的步骤。
可用于上述方法的限制性内切酶只要是同行众所周知的限制性内切酶，可以无限制地使用，优选使用诱发DNA的多态性的限制性内切酶。更优选使用选自由EcoR I、EcoR V和Xba I组成的群组中的酶。
另外，本发明的分子标志可用于决定CMV抗性植物体的基因型(genotype)。因此，本发明提供包括在本发明的核酸或引物存在下，对植物体基因组DNA进行分析的决定CMV抗性植物体的基因型的方法。上述方法可以通过同行众所周知的各种DNA多态性分析进行。具体的方法如上所述。
可适用于本发明方法的植物体没有特别限制，包括黄瓜、西瓜、辣椒、香瓜、白菜、烟草、矮牵牛花、棉花和蔷薇。
另外，本发明提供包含含有由序列2或序列22的核苷酸序列构成的核酸或从上述核酸的核苷酸序列中选出的一系列核苷酸序列的引物的CMV抗性植物体检测用试剂盒。在上述试剂盒中还添加含有对于利用上述核酸或引物进行CMV抗性植物体检测所必需的实验过程(例：PCR、Southern blot等)以及结果确认所必需的各种试剂、例如、PCR反应混合物、限制性内切酶、琼脂糖、混合和/或电泳所必需的缓冲溶液等。
另外，本发明提供包含与植物体的CMV抗性性状密切相关的分子标志的由序列2或序列22的核苷酸序列构成的核酸的CMV的抗性植物体。上述CMV抗性植物体指的是对CMV表现出抗性性状的植物体。上述植物体没有限制，包括黄瓜、西瓜、辣椒、香瓜、白菜、烟草、矮牵牛花、棉花和蔷薇。最好是辣椒。另外，对于本发明提供的CMV抗性植物体包括植物的器官、组织、细胞、种子以及愈伤组织。本发明同时对CMV抗性植物体的CMV抗性有无遗传进行了调查，结果查明上述CMV抗性是由显性的单一基因决定的。
本发明的CMV抗性植物体可使用同行众所周知的一般的组织培养方法进行无性繁殖。例如、可以使用通过器官发生的微细增殖法(对没有形成了的器官的叶、叶柄、茎节、子叶、子叶轴等组织进行培养，在上述组织的表面诱导新的芽的方法)或利用通过诱导愈伤组织的再分化方法等进行无性繁殖。另外，本发明提供从上述CMV抗性植物体获得的含有由序列2或序列22的核苷酸序列构成的核酸的种子。
附图说明
图1是表示利用操纵子引物(OPC-04至OPC-08和OPC-10)，使用黄瓜花叶病毒抗性DNA库(pool)(R)和易感性DNA库(S)作为模板进行RAPD分析的结果的照片。
图2a和图2b是表示使用OPC-07的引物(序列1)，对抗性植物体(R0)及其F1(R1)、易感性植物体(S0)及其F2(S1)、抗性F2和易感性的F2进行RAPD分析的结果的照片。
图3是以通过OPC-07的引物进行扩增的DNA片段(序列2)作为探针进行RFLP分析的结果。
R：抗性植物体
S：易感性植物体
图4是表示利用序列23和序列24的引物进行CAPS分析的结果的照片。
图5是表示使用序列23和序列25的引物组合进行CAPS分析的结果的照片。
A：用EcoR I进行酶切的情况
B：用Xba I进行酶切的情况
图6是表示使用序列23和序列26的引物组合进行CAPS分析的结果的照片。
图7是表示使用序列27和序列28的引物组合进行CAPS分析的结果的照片。
具体实施方式
以下、通过实施例对本发明进行详细说明。
但是下面的实施例是本发明的例示，本发明的内容并不限定于实施例。
以下、通过实施例对本发明进行更详细说明。然而，下面的实施例只是用于说明本发明的例子，本发明的技术方案并不限定于本实施例。
<实施例1>
用于CMV抗性辣椒植物体的移入以及分子标志开发的杂交品种的作成和CMV抗性的遗传样式研究
将CMV接种到多样的辣椒植物体，筛选抗性植物体。结果确认艾卢金(elgiencho lien)草系统中的一个植物体为CMV抗性。将被选择的植物体命名为‘FP11’。为了检测被选择的FP11的CMV抗性有无遗传，做成自受粉品种以及杂交品种。上述杂交品种是使FP11与作为易感性系统的FP14杂交做成的。播种杂交的F1种子，使其自受粉，制作F2品种，再使各个F2植物体自受粉，制作F3品种。以F2和F3品种作为对象进行CMV抗性检测，结果表明CMV抗性在F2品种以3∶1的比率被遗传，在F3世代中分离到的同型(homo)和异型(hetero)的比率是1∶2。由此确认CMV抗性由显性的单一基因决定的。
<实施例2>
从植物体分离DNA
DNA提取通过改变的Prince等方法(Prince，J.P.，et al.，HortScience32；937-939，1997)进行。利用液氮磨碎在-80℃保管的辣椒叶，与25ml的DNA提取缓冲液(7M尿素、0.35M氯化钠、0.05M Tris-HCl pH8.0、0.02MEDTA、0.25％N-十二烷基肌氨酸钠、5％苯酚、0.2％硫酸氢钠)混合。然后加入0.75ml的20％SDS，于65℃下每10分摇晃一下，培养30分钟。
将氯仿：异戊醇(24∶1)溶液一直填充到50ml管的端部，搅拌15分钟。将混合液于5,000rpm下离心分离15分钟，利用粗棉布(cheesecloth)将收得的上清液移到新的50mM管。然后向上述管中添加同一体积的异丙醇，混合后、使DNA浸渍一小时。利用U字状的巴斯德吸管，收集沉淀的DNA，加入到1.5ml的微量管中，添加70％的乙醇，使DNA再浸渍。于室温下干燥30-40分钟。向上述干燥的DNA颗粒中添加600-700μl的TE缓冲液(10mM TrisCl、1mM EDTA)，于65℃下培养1小时。重复进行3次离心分离过程。然后将DNA移至1.5ml的管中，添加RNase(100μg/ml)，除去RNA。利用荧光仪测定纯化的DNA的最终浓度。
<实施例3>
CMV抗性相关RAPD的引物的筛选
为了筛选与CMV抗性性状相关的DNA分子标志，使用RAPD(Williams、J.G.K.et al.、Nucl.Acids Res.18、6531-6535、1990)和BSA(Bulked SegregantAnalysis)方法(Michelmore、R.W.et al.、Proc.Nat.Acad.Sci.、88：9828-9832、1991)。以从上述实施例1的F2品种获得的CMV抗性检测结果为基础，制作抗性F2植物体10个体的DNA库(pool)和易感性F2植物体10个体的DNA库，将用库制作的DNA浓度调整到20ng/μl，以此为模板进行PCR。此时，为了制作RAPD引物，以Operon RAPD 10-mer试剂盒(Operon、Alameda、CA、USA)中的从系列A至系列T的约400个引物为对象挑选能很好地进行PCR反应的引物147个，使用被挑选的引物，探索在抗性DNA库和敏感性DNA库之间特异性不同的扩增带。
PCR反应组成物是通过将1X PCR缓冲液、60ng的模板DNA、dNTP0.3mM、引物0.6pM、3.5mM MgCl2、0.6Unit Taq DNA聚会酶(Takara、日本)混合，将总体积调整到25μl。PCR扩增首先在94℃下使模板DNA变性4分钟，然后以在94℃下1分钟、36℃下1分30秒钟和72℃下1分50秒钟为一个循环，反复进行总计45次循环，最后在72℃下反应5分钟，结束反应。结果如图1看到的那样，在利用OPC-07引物(序列1)的PCR中，只在1个抗性库(pool)中挑选出了特异表现的分子标志。
为了研究上述分子标志与CMV抗性性状之间的关系密切到什么样程度，对抗性植物体和易感性植物体以及它们的F1世代、还有抗性F2的183个体以及易感性F2的64个体再进行RAPD分析。结果如图2a和图2b所看到的那样，确认上述分子标志可100％共分离(co-segregation)。
<实施例4>
RAPD分子标志的克隆和核苷酸序列决定
从凝胶中分离·纯化利用具有序列1给出的核苷酸序列的OPC-07引物(10mer)扩增的DNA，克隆到pGEM-T载体(Promega公司)。将克隆的质粒通过电冲击方法导入大腸菌DH10B，从含有抗生素的培养基挑选转化体。从挑选的转化体分离重组质粒，对插入到上述质粒内的DNA的核苷酸序列进行分析。决定的核苷酸序列如序列2所示。
<实施例5>
向CAPS分子标志的转换以及用于进行逆向PCR的Southern blot的实施
准备抗性植物体和易感性植物体的基因组DNA，用DNA限制性内切酶EcoRV、HindIII、XbaI和EcoRI酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳。使DNA转移到尼龙膜上，以实施例4中扩增的CMV抗性特异的DNA(序列2)作为探针，进行Southern blot。其结果如图3所示。就像图3看到的那样，对EcoRI、XbaI、EcoRV表现出多态性，对HindIII没有表现出多态性。以上述RFLP分析结果作为基础，在逆向PCR和CAPS分子标志转换中使用EcoRI、XbaI和EcoRV限制性内切酶。
<实施例6>
CMV抗性基因的附近DNA核苷酸序列的决定
以实施例5的结果(图3)为基础，利用实施例4分析的RAPD的分子标志的核苷酸序列的一部分制作引物。制作的引物的核苷酸序列如下面表1所示。
【表1】逆向PCR中使用的引物
  引物名   核苷酸序列(5’-3’)   序列
  CRSCC07a   GTC CCG ACG ATA GCC CAA AAG   3
  CRINVR65   TTG GCC CTA TGA GTC CGT AC   4
  CRINVR125   ACT GAC TAC GAG TTG TCA CC   5
  CRINVF629   TAG GGG TTC AAG GAT CAC CC   6
  CRINVR796   TAT CCT CTT ATG CAA TGC GC   7
  CRINVR840   AAT CCT TGT ACC TCA CAA CG   8
  CRINVF975   CGA TGC CAC TTC ATA ATG CC   9
  Inv 1030514 R   GAC TTG GGC ACT ACA CTG GA   10
  Inv 1030514 F   ACA TAG GCG TGT GCT CTG GA   11
  CR 1541-3   GGA GTT TCA TCA TAT GAA GCC   12
  InvXbTopF1010   GGT TCA AGG ATC ACC CAA ATA A   13
  InvXbTopR107   TTC ACC TTA GTC CCC AAA CCT A   14
  EV Inver F2   AAC CCA AGC CTA TTT TAG CC   15
  EV-INV-XbaI   GGT AAT AGG GTT CAC CTT AGT C   16
  CRINVF5095   CTT TGA GCC AAA GAA TGG AA   17
  CRINVR4776   TTT GGT AAT GAC CGG AGA CC   18
  INVER0827R   ATA GCA GAG GAG CAC CCT AC   19
  INVER0827F1   GGT ACA AGG ATT CCC CAA AGT G   20
  INVER0827F2   GAT TTA GTC AGT ATG ACG ATG CCA C   21
使用上述表1给出的引物，根据抗性植物体中同行众所周知的方法(Sambrook J.and D.W.Russel.2001.Molecular Cloning.3rd ed.、Cold SpringHarbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York.)进行逆向PCR。
首先，将用HindIII酶切的基因组DNA进行T7DNA连接酶(ligase)处理，使其接合成环形，以此作为模板，使用序列5和序列6的引物组合，进行PCR。使用序列4和序列9的引物组合对PCR产物通过嵌套式(Nested)PCR再进行扩增。结果得到约900bp大小的PCR产物。对上述PCR产物的核苷酸序列通过引物移步(primer walking)方法进行分析。将上述核苷酸序列与序列2的核苷酸序列连接，得到在两个末端含有HindIII位点的1.8kb的核苷酸序列。然后以上述1.8kb大小的核苷酸序列作为基础，制作序列10和序列11的引物。使用上述序列10和序列11的引物组合，以经EcoRV酶切的、接合成环形的基因组DNA作为模板再进行一次逆向PCR。将PCR产物的核苷酸序列与上述1.8kb大小的核苷酸序列连接，得到在两个末端含有EcoRV位点的3.4kb大小的核苷酸序列。再通过同一方法用XbaI酶切，以接合成环形的基因组DNA作为模板，使用序列13和序列14的引物，进行逆向PCR。对PCR产物的核苷酸序列进行分析，将该序列与上述3.4kb大小的核苷酸序列连接。结果决定了含有序列2核苷酸序列的约5.6kb大小的核苷酸序列。该核苷酸序列如序列22所示。
<实施例7>
向CAPS分子标志的转换
研究上述序列22核苷酸序列中众所周知的DNA核苷酸序列的限制性内切酶的位点，对抗性植物体和易感性植物体的基因组DNA的限制性内切酶位点进行比较，选在二个基因组DNA之间表现出多态性的限制性内切酶的XbaI(T′CTAG_A)、EcoRI(G′AATT_C)以及EcoRV(GATATC)作为CAPS中使用的限制性内切酶，制作带有位点的引物，以便能够扩增适当长度的限制性酶切图的DNA片段。即，制作4个由序列22的核苷酸序列中选出的一系列核苷酸序列构成的引物(参照下面的表2)。
【表2】
用于确认CMV抗性的CAPS分子标志开发用引物
 核苷酸序列(5′→3′)   引物名   方向   序列
 1  GTAGTAGGGTACGGACTCATA   SCC07S3   正方向   23
 2  GTCCCGACGATAGCCCAAAAG   SCC07a   逆方向   24
 3  GGAGTTTCATCATATGAAGCC   CR1541-3   逆方向   25
 4  AGTGGAGCTTGGGGTAGTCC   FP5416R   逆方向   26
利用序列23与24、序列23与25以及序列23与26的组合引物，使用从抗性植物体和易感性植物体、以及它们的F2品种提取的DNA作为模板，通过PCR进行扩增。PCR于94℃下使模板DNA变性1分钟，以94℃1分；58℃1分；以及72℃2分作为一个循环，反复进行总计35次循环后，于72℃下再反应10分结束PCR。然后对扩增的DNA从用实施例6选出的限制性内切酶(EcoRI、XbaI、EcoRV)进行酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，确认是否能区分开基因型、即同型(RR)和异型(Rr)型。
图4给出了利用序列23与24的引物组合进行PCR的结果。PCR扩增的DNA片段的大小是1.0kb。将扩增的DNA片段用XbaI进行酶切，结果可以确认易感性与抗性亲本带的图不同。另外，确认该带图与在实施例1中测定F3病抗性后予测的F2植物体的遗传型共分离。
图5给出了利用序列23与25的引物组合进行PCR的结果。PCR扩增的DNA片段的大小是1,477bp。将扩增的DNA片段分别用EcoRI(A)和XbaI(B)进行酶切，结果可以观察到易感性与抗性亲本带的图不同。另外，确认该带图与在实施例1中的抗病性的结果共分离。
图6给出了利用序列23与26的引物组合进行PCR的结果。PCR扩增的DNA片段的大小是1,846bp。将扩增的DNA片段分别用EcoRI进行酶切，结果可以观察到易感性与抗性亲本带的图不同。另外，确认该带图与在实施例1中的抗病性的结果共分离。
上述结果等表示通过引物制作序列22给出的核苷酸序列中的任意的一系列核苷酸序列，进行PCR，将由该结果得到的PCR产物用存在于序列22内的限制性内切酶进行酶切时，可以区分有无CMV抗性基因存在以及其状态(遗传型)、即能够区分是否是同型或异型。即，序列22给出的核苷酸序列非常靠近CMV抗性基因，即使使用上述核苷酸序列等表现出的任意多态性，也可以在把握有无存在CMV抗性基因中使用。
<实施例8>
可转换为CAPS分子标志的一系列的最少核苷酸序列数的决定
为了决定在实施例6中决定的序列22核苷酸序列中可转换为CAPS分子标志的最少的一系列核苷酸序列的数，进行了以下实验。因此，分别将序列23(Forward[SCC07S3]：5′-GTAGTAGGGTACGGACTCATA-3′)的核苷酸序列变换为序列27(Forward[SCC07S3-change]：5′- gGTAGTAGGGTACG-3′)核苷酸序列，以及将序列25(Reverse[CR1541-3]：5′-GGAGTTTCATCATATGAAGCC-3′)的核苷酸序列变换为序列28(Reverse[CR1541-3-change]：5′- gGGAGTTTCATCA gc-3′)的核苷酸序列(小写字母表示可任意附加/置换)。使用上述变换的序列27和序列28的引物进行PCR。PCR首先使模板DNA于94℃下变性1分钟，以94℃1分；50、52、54、56或58℃1分；以及72℃2分作为一次循环，反复进行总计40次循环后，于72℃下反应10分钟，结束反应。扩增的DNA片段的大小为1,477bp。然后将扩增的DNA用EcoRI酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，结果就像图7所示那样，观察到易感性和抗性亲本带的图形不同，确认该带图形也与实施例1中的抗病性结果共分离。
由上述结果可以确认使从序列22的核苷酸序列选出的最少12个一系列核苷酸序列变形的引物也可用于检测CMV抗性用的CAPS标志中。
【产业上利用的可能性】
如上所述，本发明通过提供具有与CMV抗性性状相关程度极高的基因核苷酸序列的分子标志，可以做到无鉴别错误地有效鉴别CMV抗性植物体。另外，本发明的分子标志以及利用该标志的检测方法可以不直接将CMV接种到植物体，而迅速、且正确地检测到CMV抗性植物体，另外还具有能够决定CMV抗性植物体的遗传型的长处。
                                  序列表
<110>FNP有限公司
<120>CMV抗性相关分子标志及其用途
<130>OP04-1077
<150>KR 2003-75272
<151>2003-10-27
<160>28
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RAPD引物(OPC-07)
<400>1
gtcccgacga                                                             10
<210>2
<211>1027
<212>DNA
<213>辣椒
<400>2
gacataatgt gtgactatga gtagtagggt acggactcat agggccaata gtatggatgg     60
cttgtgacat tgcccagaca acaagtcatg gtgacaactc gtartcagtc ttarcgagtc    120
ttcatgtaac ccgtagcgac taggcggtag atttttagct tacatttaag gcatcttact    180
aatttctctc tttcccaaca aaataccccc gacatataac acattgggga ccctattttc    240
ataactttaa caatcaatga cacctchtaa cccccttaaa ytccccactc aaaggcaaga    300
ctagggtttc aagaaattgg tcatctaggg ctctacgagt gatttcttct tcaaatttct    360
tggggattaa ggcatgtatc tctatcccta aacttttttt tcattatgta attaattggt    420
ttattattca catggttttg atgttgggtt tagcatgatg ggttgagtgt tttggatgta    480
atttgtttaa atgcttttcc cttgcttatt atggaataat tttatttgaa ttgatgatta    540
gtaaaatcat ttgggtgctt gggaatggtg aatgaaatag ggggtacaag gattccctaa    600
atttgtaaac aatggaaata ggggttcaag gatcacccaa ataattggat ttttgaataa    660
ttggattttt gtattgaaat tgataagaac ctcaacacac ttgcataatt ggttytagaa    720
tgtgattaat taattttcta ggcctacttt cttaraatta rcgcattgca taagaggata    780
acatayaaga atgatcttaa aaacgttgtg aggtacaagg attcacctaa gtgaatgatt    840
tttcttgaaa accttgtgcg gtacaaggat tctccaaagt gtatgataaa tggagtttgg    900
gtgtacaagg attcttccaa gtaatggatt aattgaattt ctagtaagat ttagtcagta    960
tgacgatgcc acttcataat gccttactta tgtttcagac tatctttcga attcttcttt   1020
tgggcta                                                             1027
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用CRSCC07a引物
<400>3
gtcccgacga tagcccaaaa g                                                21
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用CRINVR65引物
<400>4
ttggccctat gagtccgtac                                                  20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR用CRINVR125引物
<400>5
actgactacg agttgtcacc                                                  20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用CRINVF629引物
<400>6
taggggttca aggatcaccc                                                  20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用CRINVR796引物
<400>7
tatcctctta tgcaatgcgc                                                  20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用CRINVR840引物
<400>8
aatccttgta cctcacaacg                                                  20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用CRINVF975引物
<400>9
cgatgccact tcataatgcc                                                  20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用Inv 1030514 R引物
<400>10
gacttgggca ctacactgga                                                  20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用Inv 1030514 F引物
<400>11
acataggcgt gtgctctgga                                                  20
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用CR 1541-3引物
<400>12
ggagtttcat catatgaagc c                                                21
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用InvXbTopF1010引物
<400>13
ggttcaagga tcacccaaat aa                                               22
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用InvXbTopR107引物
<400>14
ttcaccttag tccccaaacc ta                                               22
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用EV Inver F2引物
<400>15
aacccaagcc tattttagcc                                                  20
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用EV-INV-XbaI引物
<400>16
ggtaataggg ttcaccttag tc                                               22
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用CRINVF5095引物
<400>17
 ctttgagcca aagaatggaa                                                 20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用CRINVR4776引物
<400>18
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<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用INVER0827R引物
<400>19
atagcagagg agcaccctac                                                  20
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用INVER0827F1引物
<400>20
ggtacaagga ttccccaaag tg                                               22
<210>21
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>逆向PCR用INVER0827F2引物
<400>21
gatttagtca gtatgacgat gccac                                            25
<210>22
<211>5591
<212>DNA
<213>辣椒
<400>22
tctagaacta gccagttcat gaggctcaat cctctgacct ttactagctc taaggtttag     60
gaggatcctc aaaggttcat gtatgagata gaaaaaacat ttagagtgat acatgctttc    120
gactctgaag gtgtataatt ttcaaaatat cagctgaagg atgtggtata tcaatggtat    180
gagaagtagg agcagttgag gggggatgat gctgagttag tcatatggga tatttttcta    240
gtacctttct tgattatttc tttcctcagg agataaggaa agcaaatgct gaggagttta    300
tgaataactt gataagggtt tgatccaccc tagtatttct ctgtagggtg ctcctctgct    360
atttatttgt tagaaagatg gttcccttta gatgtgtata gattatcgct agttgaataa    420
ggtgactatg aagaaaaagt accctctccc taagattgat gatttattca tccagcttca    480
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gatgtcctat ggtttgacta atgctccggt ggcaatcaag gatcttatga acatagtatt    660
ctgttagttc ctggatttat ttgttattgt gttaatagat gatattttgg tatattctaa    720
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aggccgttta gattccacca actcaacccc tcaaacctat aatgcttata ctagtggaca    5220
tactcaaaat atttccgcta cgatattcct agaaaccctc caccaaatgt acattcctca    5280
accacaaacc catgaaccca tcacacaaac cactacttat ccacaaaatt taaatctcat    5340
tagcccacta caacctcaat tcaaccaaga agaccacaaa accaagaacc agccatctaa    5400
ttaccctaaa ataaaggact accccaagct ccacttaagc aaaatccact aacccaagcc    5460
tattttagcc aaaataaaca catccaagtt gaagatataa aggaagaggg atctcaagga    5520
gaaaatgaag tgatggatga ggtggttgat aattattgaa ttgaaatatt taatatgtgc    5580
aagatatcga t                                                         5591
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SCC07S3引物
<400>23
gtagtagggt acggactcat a                                                21
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SCC07a引物
<400>24
gtcccgacga tagcccaaaa g                                                21
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CR1541-3引物
<400>25
ggagtttcat catatgaagc c                                                21
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>FP5416R引物
<400>26
agtggagctt ggggtagtcc                                                  20
<210>27
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SCC07S3-转化 引物
<400>27
ggtagtaggg tacgg                                                       15
<210>28
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CR1541-3-转化 引物
<400>28
gggagtttca tcagc                                                       15

Claims (13)

1.一种核酸，其特征在于，由序列2或序列22的核苷酸序列构成。
2.CMV抗性植物体检测用引物，其特征在于，含有从序列2或序列22的核苷酸序列中选出的一系列核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，上述引物具有从由序列1和序列23至序列28构成的群组中选出的核苷酸序列。
4.一种CMV抗性植物体检测用试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述核酸或权利要求2所述引物。
5.一种CMV抗性植物体的检测方法，其特征在于，在权利要求1所述核酸或权利要求2所述引物存在下，对植物体基因组DNA进行分析。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，上述分析通过从由RFLP(限制性片段长度多态性)、RAPD(随机扩增多态DNA)、DAF(DNA扩增指纹)、AP-PCR(随机引物PCR)、STS(序列标签位点)、EST(表达序列标签)、SCAR(序列特异扩增区域)、ISSR(简单序列重复区间扩增)、AFLP(扩增片段长度多态性)、CAPS(酶切扩增多型性序列)和PCR-SSCP(单链构象多态性)组成的群组中选出的任意一个方法进行。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，上述植物体选自由黄瓜、西瓜、辣椒、香瓜、白菜、烟草、矮牵牛花、棉花和蔷薇构成的群组。
8.一种决定CMV抗性植物体的基因型的方法，其特征在于，在权利要求1所述核酸或权利要求2所述引物存在下，对植物体基因组DNA进行分析。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，上述分析通过从由RFLP(限制性片段长度多态性)、RAPD(随机扩增多态DNA)、DAF(DNA扩增指纹)、AP-PCR(随机引物PCR)、STS(序列标签位点)、EST(表达序列标签)、SCAR(序列特异扩增区域)、ISSR(简单序列重复区间扩增)、AFLP(扩增片段长度多态性)、CAPS(酶切扩增多型性序列)和PCR-SSCP(单链构象多态性)组成的群组中选出的任意一个方法进行。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，上述植物体选自由黄瓜、西瓜、辣椒、香瓜、白菜、烟草、矮牵牛花、棉花和蔷薇构成的群组。
11.一种CMV抗性植物体，其特征在于，含有通过组织培养无性繁殖的由序列2或序列22的核苷酸序列构成的核酸。
12.如权利要求11所述的CMV抗性植物体，其特征在于，上述植物体选自由黄瓜、西瓜、辣椒、香瓜、白菜、烟草、矮牵牛花、棉花和蔷薇构成的群组。
13.一种种子，其特征在于，由权利要求11或12所述的CMV抗性植物体获得，且含有由序列2或序列22的核苷酸序列构成的核酸。
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