CN106939351A - 快速筛选黄瓜有/无果瘤性状的显性分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速筛选黄瓜有/无果瘤性状的显性分子标记，其特征在于：命名为Y177，由序列表中SEQ ID NO.1所示的359个核苷酸组成，有果瘤品种含有这359个核苷酸，无果瘤品种不含有这359个核苷酸。该显性分子标记在苗期就可以快速筛选、鉴定有瘤/无瘤黄瓜果实类型，进而缩短育种周期，加快黄瓜育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，具体是开发的是一个在苗期就可以快速筛选、鉴定有瘤/无瘤黄瓜果实类型的显性分子标记。
背景技术
黄瓜(Cucumissativus L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(cucumis)一年蔓生的草本植物，黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一。
果实是黄瓜经济性状最重要的部分，黄瓜果实属于瓠果，由子房和花托共同发育而成。在黄瓜果实上有一个重要的性状是果瘤，果瘤是黄瓜果实表面的瘤状突起。果瘤性状是黄瓜作物非常重要的农艺性状之一，是果实表面的瘤状突起，瘤的上面是刺，这一性状是模式生物拟南芥、水稻以及甜瓜、西瓜和冬瓜等常见的葫芦科作物等不具有的性状。果瘤基因的研究始于1913年，有果瘤是黄瓜的野生性状，果瘤性状是由Tu(Tuberculate fruit)基因调控，有果瘤(Tu)为显性，无果瘤(Tu)为隐性。在经典遗传图谱上，果瘤基因(Tu,Tuberculate fruit)和无光泽果皮基因(D)及一致果皮颜色基因(u,uniform immaturefruit color)紧密连锁在一起。曹辰兴通过分离群体的遗传分析结果表明控制茎、叶、果实表皮毛性状的无毛基因对控制果瘤性状的果瘤基因存在隐性上位作用(曹辰兴等.黄瓜茎叶无毛性状与果实瘤刺性状的遗传关系.园艺学报,2001,28(6):565-566)。因此，果瘤基因Tu的研究将有助于揭示黄瓜果刺基因形成的分子机制，为黄瓜遗传和育种工作奠定基础。
2009年张微微等得出黄瓜果瘤性状属于单基因显性性状，利用247个F2群体将果瘤基因初步定位于SSR标记16203和SCAR标记C_SC933之间，遗传距离分别为1.3cM和5.9cM，详细结果可以参看：Zhang W W等在《Theoretical and Applied Genetics》(理论应用遗传学)2009年第120卷第3期645－654页发表的题为《Identification and mapping ofmolecular markers linked to the tuberculate fruit gene in the cucumber(Cucumissativus L.)》(黄瓜果瘤基因紧密连锁分子标记初步定位)一文，上述标记还存在分析群体相对较小，连锁距离相对较远等问题，候选区间存在100多个候选基因，也没有对候选基因分析。2014年，Yang X Q等利用使用2808株F2(S06×S52)大群体，利用图位克隆技术将Tu基因定位于第五染色体物理距离41.6kb区间内，该候选区域含有两个候选基因，通过分析确定Csa016861基因为果瘤基因，详细结果可以参看2014年78卷1034-1046页发表的《Tuberculate fruit gene Tu encodes a C2H2zinc finger proteinthat is requiredfor the warty fruit phenotype in cucumber(Cucumissativus L.)》一文。
随着人们生活水平的提高，品质育种已提到重要位置。黄瓜果实刺瘤性状属于感观品质范畴。欧美温室类型的黄瓜为无果瘤、少刺的果皮，称其为水果黄瓜，其市场价格为普通黄瓜的2-3倍。外观光滑黄瓜污染少，清洗方便，食用卫生，是无公害蔬菜的理想品种。果实是黄瓜经济性状最重要的部分，人们首先关心的是黄瓜果实的外部形态性状，所以，感观性状是引起消费者购买欲望的直接因素。黄瓜果实重要的农艺性状有很多，比如果实大小、瓜把长短、果瘤有无、果刺多少、果实光泽度、果皮颜色，等等。因此，我们迫切需要针对符合我国黄瓜育种目标的重要农艺性状开展研究。随着分子标记技术的发展，利用与目标基因紧密连锁、共分离的分子标记追踪目标性状，可在苗期正确筛选有/无果瘤的黄瓜材料，缩短育种周期，加快黄瓜育种进程。
发明内容
本发明的目的在于克服现有传统育种技术的不足，提供一种快速筛选黄瓜有/无果瘤性状的显性分子标记，该标记稳定性高、可靠性强，进而可以缩短育种周期，加快黄瓜有/无果瘤性状育种进程。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
快速筛选黄瓜有/无果瘤性状的显性分子标记，命名为Y177，由序列表中SEQ IDNO.1所示的359个核苷酸组成，有果瘤品种含有这359个核苷酸，无果瘤品种不含有这359个核苷酸。世界各地有瘤黄瓜品种均含有该显性分子标记，无瘤黄瓜品种不含有该显性分子标记，该显性分子标记可以简便、快速、高通量地应用于世界各地黄瓜有瘤/无瘤类型的筛选。其中，所述无果瘤品种不包括突变体无毛无瘤品种gl。
所述显性分子标记Y177由SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物扩增得到。所述上游引物来自于黄瓜果瘤基因Tu的启动子区域，下游引物来自于黄瓜果瘤基因Tu的CDS区域。引物由上海生工合成。
黄瓜果瘤基因Tu的cDNA区域来自于已经公布的黄瓜品种9930基因组序列Scaffold000083和Gy14黄瓜基因组序列Scaffold02633。
本发明利用多种有瘤亲本和无瘤亲本杂交获得F1，F1再自交获得多种F2分离群体，确定黄瓜果瘤性状属于单基因显性性状。利用果瘤基因存在于SSR标记分子标记SSR42和分子标记SNP18之间的41.6kb的序列，进行基因预测。这41.6kb的序列同时存在于已经公布的黄瓜品种9930Scaffold000083和Gy14黄瓜基因组序列Scaffold02633中(http://cucumber.vcru.wisc.edu/wenglab/gy14-9930/index.html)。对其中含有基因的cDNA区设计引物，查找多态性位点。该候选区域含有两个候选基因，分别是编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Csa016922和C2H2锌指蛋白基因Csa016861：Csa016922序列在两亲本S52(有果瘤)和S06(无果瘤)之间没有任何差异，呈现出100％序列同源性；而Csa016861基因序列在两亲本S52和S06呈现很大差异，S06共缺失4888bp片段，即S06完全缺失Csa016861，包括其启动子和CDS区。进而确定控制黄瓜果瘤性状的Tu基因为Csa016861。根据有瘤亲本和无瘤亲本之间果瘤基因Tu的序列差异，在启动子与CDS区域分别设计引物开发出果瘤基因共分离的显性分子标记。再通过搜集多种世界黄瓜果实有瘤/无瘤品种对该显性分子标记进行验证。
本发明具有如下的有益效果：本发明的一种显性分子标记Y177与黄瓜有果瘤性状完全共分离，可以快速所有世界各地的黄瓜有瘤/无瘤品种(除无毛无瘤黄瓜品种，因为无毛基因对瘤性状起到隐形上位的作用)品种均可以用这一个显性分子标记筛选。本发明克服黄瓜传统育种带来的弊端，尽管以前也有类似专利公开，但本发明设计的引物位置一端位于Tu基因启动子区域，一端位于Tu基因CDS位置，该分子标记稳定性高，可靠性强。该显性分子标记在苗期就可以快速筛选、鉴定有瘤/无瘤黄瓜果实类型，进而缩短育种周期，加快黄瓜育种进程。
本发明中涉及的很多分子标记数据处于未公开状态。
附图说明
图1为显性分子标记Y177对世界不同黄瓜品种的筛选效果：M代表Marker DL2000；S52为有瘤品种；S06为无瘤品种；12种有瘤品种均出现显性分子标记Y177条带；10种无瘤品种均未出现该显性分子Y177标记条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。
实施例
一、遗传分离群体的构建与黄瓜果瘤基因的鉴定
1.多种F2群体的构建
黄瓜亲本：有果瘤自交系—S52、S94，无果瘤自交系—S06、SB。为了进一步确认果瘤性状遗传规律特点，本研究中构建了6个杂交组合：有果瘤和无果瘤亲本间—S52×S06和S94×S06；无果瘤和有果瘤亲本间—S06×S52和S06×S94；有果瘤和有果瘤亲本间—S52×S94；无果瘤和无果瘤亲本间—S06×SB。在6个杂交组合中，F1植株自交产生F2群体。与此同时，S06×S52和S52×S06杂交组合的F1分别同无瘤亲本S06和有瘤亲本S52回交得到BC1群体。8个群体包括6个F2群体和2个BC1群体，，卡方分析法进行验证，最后得出黄瓜果瘤性状属于单基因控制的显性性状。同时通过统计分析F2(S06×gl)和F2(gl×S06)群体性状分离比得出，经过卡方分析法进行验证，有毛有瘤、有毛无瘤、无毛无瘤表型分离比符合9：3：4，说明无毛基因对果瘤基因起到隐性上位的作用。本发明利用2808株F2(S06×S52)作为果瘤基因Tu的精细定位群体。
2.黄瓜果瘤基因的鉴定
2.1黄瓜基因组DNA的提取
用CTAB法提取亲本及F2分离群体的叶片总DNA。
2.2确定果瘤基因序列
在张微微等对Tu基因初步定位的基础上，利用已经公布的黄瓜品种9930和Gy14黄瓜基因组序列(http://cucumber.vcru.wisc.edu/wenglab/gy14-9930/index.html)，能够将SCAR标记C_SC933和SSR标记16203之间的序列兼并拼接。拼接后的序列总长度为1300kb，Tu基因位于该区域内。首先用已经公布的SCAR标记C_SC933和SSR标记16203筛选该2808株精细定位的群体，找出交换株。使用SSRHunter分析软件(http://www.bio-soft.net)寻找SSR位点，SNP标记的开发参照已经公布的第五染色体候选区域的SNP位点(http:// cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/mapview.jsp？dbKey＝Cucumber&refId＝5)，本研究总共选取了328个SSR位点和20个SNP位点，使用Primer Premier 6.0软件设计引物，所有引物通过在亲本S52和S06之间PCR扩增筛选多态性引物，对1300kb序列分析设计了大量引物，找出亲本间有多态性的引物，位于基因两侧的多态性再次扫描剩余的交换单株，多态性标记向交换株逐渐减少的方向步移，最后确定最近的两侧标记SSR42和SNP18距Tu/tu基因位点间分别还剩余3和2个交换单株。上述黄瓜果瘤基因Tu染色体步移的详细情况如图1所示。所有SSR标记及SNP标记PCR反应体系均为：黄瓜DNA 20ng，双向引物各0.2μmol/L，200μmol/L dNTPs，2mmol/L MgCl2，1×Taq缓冲液，0.5U TaqDNA聚合酶，总反应体系为10μl，其中TaqDNA聚合酶购于Promega公司。扩增程序为：94℃3min；35cycles，94℃20s，55℃30s，72℃30s；72℃5min。
SSR42和SNP18之间的41.6kb序列经过黄瓜基因组第五染色体基因预测网站，仅含有两个候选基因，编号分别为Cas016992的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和Cas016861的C2H2锌指蛋白。经过测序后发现在S52和S06之间的编号为Cas016992基因序列没差别，编号为Cas016861中在S52中存在但在S06却完全缺失，包含该基因的启动子序列和cDNA序列，共缺失4888bp序列，因此确定编号为Cas016861即为控制果瘤性状的果瘤基因，本发明中涉及的分子标记SSR标记16203和SCAR标记C_SC933已公开。详细参看Zhang WW等在《Theoretical and Applied Genetics》(理论应用遗传学)2010年第120卷第3期645－654页发表的题为《Identification and mapping of molecular markers linked to thetuberculate fruit gene in the cucumber(Cucumissativus L.)》(黄瓜果瘤基因紧密连锁分子标记定位)一文。本发明中涉及的分子标记SSR42和SNP18已公开。详细参看利用图位克隆技术将Tu基因定位于第五染色体物理距离41.6kb区间内，该候选区域含有两个候选基因，通过分析确定Csa016861基因为果瘤基因，详细结果可以参看2014年78卷1034-1046页发表的《Tuberculate fruit gene Tu encodes a C2H2zinc finger proteinthat isrequired for the warty fruit phenotype incucumber(Cucumissativus L.)》一文。
根据果瘤基因Tu在S52和S06之间的4888bp序列差异差别，本发明在启动子部位设计上游引物及CDS区域设计下游引物构成显性分子标记Y177，由序列表中SEQ ID NO.1所示的359个核苷酸组成。其特征在于：由SEQ ID NO.2所示的Tu基因启动子上游引物和SEQ IDNO.3所示的Tu基因CDS区域下游引物扩增得到，其扩增程序：94℃5min；35cycles，94℃25s；54℃25s；72℃30s；72℃5min。
2.3多态性片段的回收、克隆和测序
在PCR产物中加入goldview荧光染料3ul，4℃下放置10min让染料同DNA结合，然后加入上样缓冲液2ul，混匀后通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目标片段放入1.5ml的离心管中，用DNA回收试剂盒回收，其中DNA回收试剂盒为上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，产品号为Cat.No.SK1132。将回收产物与载体连接采用上海申能博彩公司的pUCm-T vector系统。用电击法将连有目标片段的T-vector转化进入E.coli DH5α感受态细胞，将菌液均匀涂布于LB固体培养基的平板上，涂好的平板倒置于37℃培养箱培养过夜，挑菌、摇菌及PCR菌液检测，进行相关序列的测定。
二、多种黄瓜品种验证显性分子标记Y177
1、选取多种黄瓜有瘤/无瘤品种
由于推测C2H2锌指蛋白基因是控制果瘤性状的目的基因，随机选取自世界各地的22个黄瓜自交系品种对,显性分子标记Y177进行验证，其中无瘤品种有：以色列亲本的S06、荷兰的S46-2、S49-1、S49-2和S51-2，以色列的S03、S04和S05，西班牙的S75和S76，欧洲的H34，共11个无瘤黄瓜品种；有瘤品种有：中国的S52、S94、S110、Gl、M3、M12、419和S124-5，韩国的S53，美国的83G，日本的S66、S67和S74，共13个有瘤黄瓜品种。
2、显性分子标记Y177验证24种黄瓜有瘤/无瘤品种
而13种有果瘤品种均出现显性标记Y177的清晰特异性条带，11种无果瘤品种均没出现Y177标记(参见图1)。
以上新开发的显性分子标记Y177一端引物存在于果瘤基因Tu的启动子序列中，一端引物存在于CDS区域，经过分离群体验证和品种验证，是特异性PCR扩增，故该显性分子标记具有高稳定性、可靠性。所以本发明的显性分子标记Y177可以在苗期快速、高通量地应用于世界各地黄瓜有瘤/无瘤类型(除了突变体无毛无瘤品种gl)的筛选，进而加快黄瓜果瘤性状品质育种过程。
本发明中PCR产物克隆测序中所使用的E.coli DH5α菌株已在文献《李欣等，电转化法制备高转化效率的E.coli感受态细胞研究。食品与生物技术学报,2007,26(6)48～51》中公开；本发明中涉及的E.coli DH5α菌株可通过公开市售的商业渠道取得，购于宝生物工程(大连)有限公司，公司地址：大连经济技术开发区东北二街19号。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>江苏师范大学
<120>快速筛选黄瓜有/无果瘤性状的显性分子标记
<160>3
<210> 1
<211>359
<212> DNA
<213>黄瓜（Cucumissativus L.）
<400> 1
acctccccttgcatttcctaccttccttcctttctctctctcactcttaacccttttatt 60
ttattttattttttctctctctctcttatcatcttccatttttccatggcagctctagaa 120
aaccattaccaaaccaaacaaaacaacaataatccggccaccactcgcttaaagcttttt 180
gggtttgacgttcaagaagatcttgatcaagacgattccacccccacctcctccgactca 240
ggcgccgccgttccatcctccggcgaccgcaaatacgagtgtcagtactgctatagagag 300
tttgccaattcccaagctctcggcggccaccaaaatgcccacaagaaagagcgtcaaca 359
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
acctccccttgcatttccta c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
tgttgacgctctttcttgtg g 21
Claims (4)
1.一种快速筛选黄瓜有/无果瘤性状的显性分子标记，其特征在于：命名为Y177，由序列表中SEQ ID NO.1所示的359个核苷酸组成，有果瘤品种含有这359个核苷酸，无果瘤品种不含有这359个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的快速筛选黄瓜有/无果瘤性状的显性分子标记，其特征在于：所述无果瘤品种不包括突变体无毛无瘤品种gl。
3.根据权利要求1所述的快速筛选黄瓜有/无果瘤性状的显性分子标记，其特征在于：所述显性分子标记Y177由SEQ ID NO.2所示的上游引物和SEQ ID NO.3所示的下游引物扩增得到。
4.根据权利要求3所述的快速筛选黄瓜有/无果瘤性状的显性分子标记，其特征在于：所述上游引物来自于黄瓜果瘤基因Tu的启动子区域，下游引物来自于黄瓜果瘤基因Tu的CDS区域。
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