[go: up one dir, main page]

CN105420406B - 用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的srap分子标记引物及其方法和应用 - Google Patents

用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的srap分子标记引物及其方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105420406B
CN105420406B CN201610039736.9A CN201610039736A CN105420406B CN 105420406 B CN105420406 B CN 105420406B CN 201610039736 A CN201610039736 A CN 201610039736A CN 105420406 B CN105420406 B CN 105420406B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bermuda grass
sequence
seq
primer
curved
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610039736.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105420406A (zh
Inventor
黄春琼
刘国道
白昌军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Original Assignee
Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS filed Critical Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Priority to CN201610039736.9A priority Critical patent/CN105420406B/zh
Publication of CN105420406A publication Critical patent/CN105420406A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105420406B publication Critical patent/CN105420406B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的SRAP分子标记引物，选自下述引物组合之一：E1M4、E1M5、E1M6、E1M7、E1M8、E2M3、E2M4、E2M5、E2M6、E2M7、E3M1、E3M3、E3M4、E3M6、E3M9、E4M1、E4M3、E4M4、E4M5、E4M6、E5M9、E6M1、E6M2、E6M3、E6M4、E6M7、E6M8、E6M9、E7M2、E7M3、E7M4、E7M5、E7M7、E10M9，各引物如序列所示。本发明所公开的SRAP分子标记引物用于狗牙根鉴定，所得到的条带清晰、多态性好、重复性高，且操作简单，应用前景广阔。

Description

用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的SRAP分子标记引物及其 方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学DNA标记检测技术领域，具体涉及一种用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的SRAP分子标记引物及其方法和应用。
背景技术
狗牙根(Cynodon Richard)又名百慕大草、铺地草、咸沙草、铁线草及绊根草，属禾本科(Poaceae/Gramineae)画眉草亚科(Chloridoideae)虎尾草族(Cynodonteae)狗牙根属(Cynodon Richard)C4型多年生草本植物。它是世界暖季型草坪草中得到评用价值最好，在应用上也是最使用广泛的草坪草之一，当然也是家畜的优质饲料。狗牙根属植物现当前全球共有9种和10变种，而在我国有2种和1变种，分别是普通狗牙根(Cynodon dactylon)、弯穗狗牙根(Cynodon arcuatus)，变种是双花狗牙根(Cynodon dactylon var.biflorusMerino)。在我国主要分布于黄河流域以南，近些年来北京等地区也有种植。狗牙根是比较优秀草坪草，具有成坪快、耐修剪、耐践踏、恢复力强、有很好色泽和密度等诸多优点，可以用于高尔球场等运动草坪、城市绿植、公路护坡、公园观赏等地方，具有很大的实用、经济、生态价值。
随着科学技术的蓬勃发展，生物技术也发生了翻天覆地的变化，这种变化为人们研究狗牙根遗传多样性、分子育种、种质资源鉴定等带来了便捷，促使人们对于研究狗牙根遗传基因的多态性到了一个新的领域。分子标记技术的应用和推广为人们研究狗牙根遗传多样性提供了方法和科学依据，通过分子标记特异性基因可以直接筛选出不同品种狗牙根的优良性状，从而提高了狗牙根品种鉴别的真实性。可以预测，DNA分子标记技术可以为狗牙根种质资源鉴定和选育优良品种做出杰出贡献。凌瑶等通过采用SRAP分子标记技术，对来自于我国的44份狗牙根和8份非洲狗牙根材料进行遗传多样性分析，表明选用的材料之间具有较大的遗传差异。但是目前对于分布在我国的普通狗牙根和弯穗狗牙根尚无这方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中在狗牙根种质资源鉴定和选育优良品种的不足，提供一种用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的SRAP分子标记引物及其方法和应用。
本发明的第一个方面是提供一种SRAP分子标记引物，选自下述引物组合之一：E1M4、E1M5、E1M6、E1M7、E1M8、E2M3、E2M4、E2M5、E2M6、E2M7、E3M1、E3M3、E3M4、E3M6、E3M9、E4M1、E4M3、E4M4、E4M5、E4M6、E5M9、E6M1、E6M2、E6M3、E6M4、E6M7、E6M8、E6M9、E7M2、E7M3、E7M4、E7M5、E7M7、E10M9，其中，
E1为反向引物，序列如SEQIDNO：1所示；E2为反向引物，序列如SEQIDNO：2所示；E3为反向引物，序列如SEQIDNO：3所示；E4为反向引物，序列如SEQIDNO：4所示；E5为反向引物，序列如SEQIDNO：5所示；E6为反向引物，序列如SEQIDNO：6所示；E7为反向引物，序列如SEQIDNO：7所示；E10为反向引物，序列如SEQIDNO：10所示；M1为正向引物，序列如SEQIDNO：11所示；M2为正向引物，序列如SEQIDNO：12所示；M3为正向引物，序列如SEQIDNO：13所示；M4为正向引物，序列如SEQIDNO：14所示；M5为正向引物，序列如SEQIDNO：15所示；M6为正向引物，序列如SEQIDNO：16所示；M7为正向引物，序列如SEQIDNO：17所示；M8为正向引物，序列如SEQIDNO：18所示；M9为正向引物，序列如SEQIDNO：19所示。
优选地，所述SRAP分子标记引物选自下述引物组合之一：E2M3、E2M4、E2M5、E2M7、E3M3、E3M6、E4M3、E4M4、E4M5、E4M6、E5M9、E6M1、E6M2、E6M4、E6M7、E6M8、E6M9、E7M3、E7M4、E7M5、E7M7、E10M9。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的任意一种SRAP分子标记引物在鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根中的应用。
本发明的第三个方面是提供一种利用SRAP分子标记引物组合鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的方法：采用本发明第一个方面所述的任意一种SRAP分子标记引物，对普通狗牙根和弯穗狗牙根DNA进行扩增、检测和分析。
其中，普通狗牙根和弯穗狗牙根DNA可采用本领域常规技术手段获取。
优选地，本发明中DNA提取步骤如下：
1)液氮保护下磨样成粉；
2)立刻加入预冷的CTAB-free缓冲液，冰浴5～15min；
3)离心，去掉上清液；
4)加入预热至50-80℃的3×CTAB提取缓冲液，50-80℃的水浴30-50min；
5)离心，取上清液，加入有机溶剂洗涤后，取水层，干燥。
优选地，每100ml的3×CTAB提取缓冲液中含有：3％CTAB(W/V)2～4g，NaCl8～10g，EDTA2～3mmol和Tris-HCl8～12mmol，pH为7.5～8.5。
进一步优选地，每100ml的3×CTAB提取缓冲液中含有：3％CTAB(W/V)3g，NaCl8.8g，EDTA2.5mmol和Tris-HCl10mmol，pH为7.5～8.5。
优选地，每100ml的CTAB-free缓冲液中含有：NaCl1～2g，ddH2O40～60ml，EDTA4～6mmol和Tris-HCl18～22mmol，β-巯基乙醇0.8～1.2ml，PVP1.5～2.5g，pH为7.5～8.5。
进一步优选地，每100ml的CTAB-free缓冲液中含有：NaCl1.5g，ddH2O50ml，EDTA5mmol和Tris-HCl20mmol，β-巯基乙醇1ml，PVP 2g，pH为7.5～8.5。
应用本发明的引物组合和方法进行SRAP分子标记实验，所得到的条带清晰，多态性好，重复性高，可以显著、清晰地显示普通狗牙根和弯穗狗牙根在基因水平上的差异，为狗牙根遗传图谱构建、亲缘关系分析、品种鉴定等诸多研究领域奠定良好的基础。本发明采用的SRAP分子标记，操作简单，正反引物可以自由组合，不仅可以节约成本，同时也大大提高引物的使用率。本发明也表明SRAP分子标记可以在狗牙根种质资源鉴定、优良性状标记等得到更广泛的应用。
附图说明
图1为部分狗牙根的DNA监测图；
图2为引物筛选图，其中，Marker(M)是100bpDNALadder；
图3-24分别为引物组合E2M3、E2M4、E2M5、E2M7、E3M3、E3M6、E4M3、E4M4、E4M5、E4M6、E5M9、E6M1、E6M2、E6M4、E6M7、E6M8、E6M9、E7M3、E7M4、E7M5、E7M7、E10M9以普通狗牙根和弯穗狗牙根DNA为模板扩增效果图，其中，图中标号1-18为普通狗牙根，标号19-46为弯穗狗牙根，Marker(M)是100bpDNALadder。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明做进一步的说明，以更好地理解本发明。
1、植物材料与试剂
18份普通狗牙根与28份弯穗狗牙根：来自海南省儋州市中国热带科学院热带作物品种资源研究所。
1M/L Tris-HCl(PH8.0)200ml。0.5M/L EDTA(PH8.0)400ml。CTAB-free缓冲液100ml：秤取1.5g NaCl，加入50ml ddH2O,搅拌后加入10mlEDTA(0.5M/L，PH8.0)和20mlTris-HCl(1M/L，PH8.0)进行灭菌，灭菌后加入1mlβ-巯基乙醇和2gPVP，灭菌水定容至100ml。3×CTAB缓冲液100ml：秤取3％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)(W/V)3g和NaCl8.8g溶于60ml水中，再加入5mlEDTA(0.5M/L，PH8.0)和10ml Tris-HCl(1M/L,PH8.0)进行灭菌，灭菌后，灭菌水定容至100ml。氯仿/异戊醇(24:1)500ml。酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)500m。TE缓冲液(PH8.0)30ml。
2、DNA提取及检测
(1)DNA提取
①取狗牙根新鲜幼嫩叶片，置于研钵中，剪刀剪碎，加入液氮在液氮挥发完之前迅速研磨成粉末，然后将粉末加入到2mL离心管中，立刻加入1mL预冷的CTAB-free缓冲液，冰浴10min，4℃，7000r/min离心5min，弃上清液；
②在离心管中加1mL 65℃预热的3×CTAB提取缓冲液，轻轻混匀，然后放入到65℃水浴锅中水浴40min，其间大概每隔5min拿出轻轻混匀一次，4℃，10000r/min、离心5min；
③取上清液，加到新的离心管中，然后加入等体的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，轻轻颠倒混匀，4℃、12000r/min，离心10min；
④取上清液体，加到新的离心管中，然后加入等体的氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻颠倒混匀，4℃、12000r/min，离心10min；
⑤重复步骤④一次；
⑥取上清液体，加到新的离心管中，然后加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置于-20℃环境条件下沉淀30min；
⑦4℃，转速7000r/min离心5min，，轻轻倒掉上清；
⑧用70％乙醇洗涤2次，风干；
⑨风干后加入100μL TE溶解DNA沉淀，同时加入1μL RNase A酶(10mg/mL)，37℃水浴30min；水浴后置于4℃冰箱保存。
(2)基因组DNA质量的检测
先制备好1.0％(g/v)的琼脂糖凝胶(其中包含有Gold View核酸染料)，然后取5μL提取的总DNA和1μL上样缓冲液(6×Loading buffer)进行混合，然后将制备好的琼脂凝胶放于装有0.5×TBE缓冲液的电泳槽中，将混合好的DNA液加入点样孔中，140V，30min，用凝胶图像分析系统检测并拍照。结果如图1所示，经1％琼脂糖电泳所检测的样品带型清晰，无杂带和明显拖带，说明本发明提取的DNA完整性较好，杂质少，适用于后面的SRAP分子标记的进行。
3、SRAP引物的筛选
SRAP反应体系：DNA模板50ng/μL，上游引物10μmol/L，下游引物10μmol/L，2×TaqMix 5μL，ddH2O(灭菌后的去离子水)3μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸30s，5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸45s，35cycles，72℃延伸7min，4℃终止
SRAP引物组合设计参考了Li与Quiros的方法，合成了10条正向引物和10条反向引物(如表2)，共组合成100对引物组合，以普通狗牙根基因池和弯穗狗牙根基因池中的DNA为模板进行引物筛选，每对引物组合重复扩增2次。随机选取5个普通狗牙根DNA混合组成的普通狗牙根基因池和5个弯穗狗牙根DNA混合组成的弯穗狗牙根基因池对其进行DNA扩增。筛选出了条带较清晰、多态性较丰富、稳定性较好的34对引物组合(如表3所示)，然后利用上面所述的基因池对这34对引物组合作进一步筛选，最后筛选出22对引物组合(如表4所示)。其中图2表现出SRAP扩增片段的多态性和丰富性。
表2实验中使用的SRAP引物
编号 正向引物序列 编号 反向引物序列
M1 TGAGTCCAAACCGGATA E1 GACTGCGTACGAATTAAT
M2 TGAGTCCAAACCGGAGC E2 GACTGCGTACGAATTTGC
M3 TGAGTCCAAACCGGAAT E3 GACTGCGTACGAATTGAC
M4 TGAGTCCAAACCGGACC E4 GACTGCGTACGAATTTGA
M5 TGAGTCCAAACCGGAAG E5 GACTGCGTACGAATTAAC
M6 TGAGTCCAAACCGGTAG E6 GACTGCGTACGAATTGCA
M7 TGAGTCCAAACCGGTAA E7 GACTGCGTACGAATTCGA
M8 TGAGTCCAAACCGGTCC E8 GACTGCGTACGAATTCAA
M9 TGAGTCCAAACCGGTGC E9 GACTGCGTACGAATTCTG
M10 TGAGTCCAAACCGGT E10 GACTGCGTACGAATTAGC
表3第一次筛选出引物组合
序号 名称 序号 名称 序号 名称
1 E1M4 12 E3M3 23 E6M2
2 E1M5 13 E3M4 24 E6M3
3 E1M6 14 E3M6 25 E6M4
4 E1M7 15 E3M9 26 E6M7
5 E1M8 16 E4M1 27 E6M8
6 E2M3 17 E4M3 28 E6M9
7 E2M4 18 E4M4 29 E7M2
8 E2M5 19 E4M5 30 E7M3
9 E2M6 20 E4M6 31 E7M4
10 E2M7 21 E5M9 32 E7M5
11 E3M1 22 E6M1 33 E7M7
34 E10M9
表4第二次筛选出引物组合
4、普通狗牙根与弯穗狗牙根的SRAP分析
用上述筛选出的引物对前面提取的46份狗牙根DNA(稀释到50ng/μl)进行扩增，然后观察扩增后结果并进行分析。
检测过程先用0.5×TBE(PH8.0)制备1.5％(g/v)的琼脂糖凝胶(其中包含有GoldView核酸染料)，然后将经PCR反应后的产物点入在琼脂凝胶点样孔中，140V电泳45min，电泳需要的缓冲液也为0.5×TBE(PH 8.0)，电泳完毕后要利用凝胶成像系统在凝胶成像仪上观测并拍照。结果如图3-24所示；利用SRAP标记扩增出的条带数目多，并且有明显多态性。可以很好的鉴定两个不同种的狗牙根。并且在某一位点上普通狗牙根有可能存在条带清晰明亮而弯穗狗牙根则不一定存在这样的条带，表现了二者之间多态性差异，同样同一位点表现相同的亮度条带，则说明二者也存在遗传上的相似性：
图3中，弯穗狗牙根扩增结果在300bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性；而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在100bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图4中，弯穗狗牙根扩增结果在200bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。
图5中，弯穗狗牙根扩增结果在600bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性；而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在300bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图6中，弯穗狗牙根扩增结果在400bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性；而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在300bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图7中，弯穗狗牙根扩增结果在400bp和700bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。
图8中，弯穗狗牙根扩增结果在400bp和700bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。
图9中普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在300bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图10中，普通狗牙根扩增结果在600bp左右的地方有明显亮带而弯穗狗牙根则没有，普通狗牙根扩增结果在300bp左右的地方有明显亮带而弯穗狗牙根则不明显，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。
图11中，普通狗牙根扩增结果在200bp左右的地方有明显亮带而弯穗狗牙根则没有，弯穗狗牙根扩增结果在1000-1100bp之间的地方有明显亮带而普通狗牙根则不明显，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在1100bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图12中，普通狗牙根扩增结果在400bp和500bp左右的地方有明显亮带而弯穗狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。
图13中，弯穗狗牙根扩增结果在600bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。
图14中，普通狗牙根扩增结果在1100bp左右的地方有明显亮带而弯穗狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在300bp、600bp和800bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图15中，普通狗牙根扩增结果在1100bp左右的地方有明显亮带而弯穗狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在200bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图16中，普通狗牙根扩增结果在400bp左右的地方有明显亮带而弯穗狗牙根则没有，弯穗狗牙根扩增结果在200bp和300bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在900bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图17中，普通狗牙根扩增结果在1100bp左右的地方有明显亮带而弯穗狗牙根则没有，弯穗狗牙根扩增结果在200bp和300bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在800bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图18中，普通狗牙根扩增结果在1100bp左右的地方有明显亮带而弯穗狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在300bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图19中，弯穗狗牙根扩增结果在100-200bp之间的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在300-400bp之间的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图20中，弯穗狗牙根扩增结果在800bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在1100bp左右的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
图21中，普通狗牙根扩增结果在900bp左右和100-200bp之间的地方有明显亮带而弯穗狗牙根则没有，弯穗狗牙根扩增结果在200bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。
图22中，弯穗狗牙根扩增结果在800bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。
图23中，弯穗狗牙根扩增结果在800bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。
图24中，弯穗狗牙根扩增结果在900bp左右的地方有明显亮带而普通狗牙根则没有，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在的遗传多态性和差异性。而普通狗牙根和弯穗狗牙根扩增结果在200bp左右和1000-1100bp之间的地方均有明显亮带，表现出弯穗狗牙根和普通狗牙根之间存在遗传上的相似性。
本发明利用筛选出的22对引物组合对46份狗牙根进行了扩增，从实验结果看，普通狗牙根与弯穗狗牙根之间的SRAP分子标记呈现多态性，具有明显特异性，可以用于普通狗牙根与弯穗狗牙根的鉴定，同时也表现了狗牙根的遗传多样性。更加说明了SRAP是在狗牙根多样性研究方面具备较高效率的分子标记，在狗牙根的种属鉴定方面具有重大的意义。实验筛选出的34对引物组合(尤其是第二次筛选出的22对引物组合)也可用于以后狗牙根遗传图谱的构建、亲缘关系的分析、品种的鉴定等诸多研究领域。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种利用SRAP分子标记引物组合鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的方法，其特征在于，采用SRAP分子标记引物，对普通狗牙根和弯穗狗牙根DNA进行扩增、检测和分析；所述的SRAP分子标记引物选自下述引物组合之一：E2M3、E2M4、E2M5、E2M7、E4M4、E6M4、E7M4；其中，
E2为反向引物，序列如SEQIDNO：2所示；
E4为反向引物，序列如SEQIDNO：4所示；
E6为反向引物，序列如SEQIDNO：6所示；
E7为反向引物，序列如SEQIDNO：7所示；
M3为正向引物，序列如SEQIDNO：13所示；
M4为正向引物，序列如SEQIDNO：14所示；
M5为正向引物，序列如SEQIDNO：15所示；
M7为正向引物，序列如SEQIDNO：17所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，DNA提取步骤如下：
1）液氮保护下磨样成粉；
2）立刻加入预冷的CTAB-free缓冲液，冰浴5~15min；
3）离心，去掉上清液；
4）加入预热至50-80℃的3×CTAB提取缓冲液，50-80℃的水浴30-50min；
5）离心，取上清液，加入有机溶剂洗涤后，取水层，干燥。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每100ml的3×CTAB提取缓冲液中含有：3%CTAB（W/V）2~4g，NaCl8~10g，EDTA2~3mmol和Tris-HCl8~12mmol，pH为7.5~8.5。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，每100ml的CTAB-free缓冲液中含有：NaCl1~2g，ddH2O40~60ml，EDTA4~6mmol和Tris-HCl18~22mmol，β-巯基乙醇0.8~1.2ml，PVP1.5~2.5g，pH为7.5~8.5。
5.一种用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的SRAP分子标记引物组合，其特征在于，选自下述引物组合之一：E2M3、E2M4、E2M5、E2M7、E4M4、E6M4、E7M4；其中，
E2为反向引物，序列如SEQIDNO：2所示；
E4为反向引物，序列如SEQIDNO：4所示；
E6为反向引物，序列如SEQIDNO：6所示；
E7为反向引物，序列如SEQIDNO：7所示；
M3为正向引物，序列如SEQIDNO：13所示；
M4为正向引物，序列如SEQIDNO：14所示；
M5为正向引物，序列如SEQIDNO：15所示；
M7为正向引物，序列如SEQIDNO：17所示。
6.权利要求5中所述的SRAP分子标记引物组合在鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根中的应用。
CN201610039736.9A 2016-01-21 2016-01-21 用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的srap分子标记引物及其方法和应用 Active CN105420406B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610039736.9A CN105420406B (zh) 2016-01-21 2016-01-21 用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的srap分子标记引物及其方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610039736.9A CN105420406B (zh) 2016-01-21 2016-01-21 用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的srap分子标记引物及其方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105420406A CN105420406A (zh) 2016-03-23
CN105420406B true CN105420406B (zh) 2024-03-26

Family

ID=55498941

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610039736.9A Active CN105420406B (zh) 2016-01-21 2016-01-21 用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的srap分子标记引物及其方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105420406B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105803093A (zh) * 2016-05-06 2016-07-27 上海市农业科学院 一种朱顶红srap-pcr反应体系及其应用
CN106434971B (zh) * 2016-11-17 2019-12-06 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 分析禾本科植物遗传多样性的pcr引物、方法及试剂盒
CN107577920B (zh) * 2017-08-31 2020-10-13 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 利用形态标构建狗牙根核心种质的方法和装置
CN108456720A (zh) * 2018-04-03 2018-08-28 福建师范大学福清分校 一种基于srap标记鉴定蝴蝶兰品种的方法
CN109112230B (zh) * 2018-09-30 2021-05-07 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 能够鉴定柱花草花粉不育基因的issr-scar标记及其鉴定方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005040426A1 (en) * 2003-10-27 2005-05-06 Fnp Corp., Ltd. Molecular marker associated with cmv resistance and use thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005040426A1 (en) * 2003-10-27 2005-05-06 Fnp Corp., Ltd. Molecular marker associated with cmv resistance and use thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
狗牙根种质资源研究与改良进展;黄春琼等;《草地学报》;20110531;第19卷(第3期);第531-538页 *
狗牙根种质资源遗传多样性分析及评价;黄春琼;《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》;20101015(第10期);摘要，第1页第1节，表1-1，第12页第1.2.1.3.4.6节，第20页第2节，表2-2，第29-33页第2.6节，表2-5，第54-66页第3.3节，表3-12，图3-11，表3-13，第93页第1段，第100页第5.3节，第149页试剂配置 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105420406A (zh) 2016-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105420406B (zh) 用于鉴定普通狗牙根和弯穗狗牙根的srap分子标记引物及其方法和应用
CN105969767B (zh) 一种基于杜鹃花转录组数据的ssr分子标记引物及其筛选方法与应用
CN103320437B (zh) 稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP及制备与应用
CN107586867B (zh) 薄壳山核桃品种Pawnee的特征序列、标记引物及鉴定方法
CN108034754B (zh) 利用ssr指纹图谱鉴别紫嫣茶树新品种的方法
CN110205404A (zh) 基于石榴全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用
KR101912196B1 (ko) 모란과 작약 구별을 위한 분자마커와 프라이머 세트 및 이의 용도
CN108330163B (zh) 薄壳山核桃品种Nacono和Sumner的特征序列、引物及鉴定方法
CN111926098B (zh) 与茄子果色的上位性基因Y紧密连锁的InDel分子标记与应用
CN107475418B (zh) 与谷子分蘖性状紧密连锁的分子标记、引物及应用
CN104846093A (zh) 基于转录组序列开发的榨菜est-ssr标记引物组
CN114891910A (zh) 一种杜鹃杂交种鉴定的ssr引物及其应用
CN111926104B (zh) 一种鉴定甘蔗与斑茅杂交后代真实性的ssr分子标记及其方法
CN109295247A (zh) 大白菜抗根肿病CRd基因的紧密连锁分子标记yau403、引物及应用
CN109207620A (zh) 一种宝华鹅耳枥issr-pcr分子标记体系
CN113801959A (zh) 浙江楠核基因组ssr分子标记的多态性引物及其应用
CN105349539B (zh) 9号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性qtl紧密连锁的ssr标记及其应用
CN103695418A (zh) 玉米低磷胁迫响应基因内含子长度多态性标记
CN105969881A (zh) 大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541、引物及应用
KR101807623B1 (ko) 방풍, 식방풍 및 해방풍의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 dna 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도
CN108624710A (zh) 一种与黄瓜果实长度性状相关的ssr标记及其应用
KR101732486B1 (ko) 독활, 중치당귀, 구당귀 및 어수리의 감별용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20160099179A (ko) 국화 흰녹병 저항성 검출용 스카마커 및 이의 용도
CN112941230B (zh) 利用多态性ssr引物鉴定韭菜品种的方法及引物及应用
CN110283931B (zh) 6个安徽淮北石榴优良品种的ssr指纹图谱及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant