CN105567676A - 一种核酸提取方法及其专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸提取方法及其专用试剂盒。本发明提供的方法包括如下步骤：(1)取样本液，与A组分混合并反应；A组分包括氢氧化钠和二硫苏糖醇；(2)取反应体系，与B组分混合，得到核酸提取物；B组分为B-1组分或B-2组分；B-1组分包括硫酸氢钠；B-2组分包括海藻糖和甘露醇。本发明提供的试剂盒，包括A组分和B组分；A组分包括氢氧化钠和二硫苏糖醇；B组分为B-1组分或B-2组分；B-1组分包括硫酸氢钠；B-2组分包括海藻糖和甘露醇。本发明提供的方法具有如下优点：步骤简单；成本低廉；反应条件温和；试剂保存容易；所得到的核酸提取物无需纯化步骤即可应用于后续扩增反应，几乎不会造成核酸的损失，便于集成到微流控芯片内。

Description

一种核酸提取方法及其专用试剂盒

技术领域

本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种核酸提取方法及其专用试剂盒。

背景技术

目前，在临床或科研领域中常规核酸提取方法包括物理法、化学法、酶法以及上述方法的组合。物理法包括煮沸、冻融、微波、超声、颗粒破碎等。化学法为采用十二烷基硫酸钠(SDS)、Trixon、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、螯合树脂、吐温20等裂解后进行提取。酶法为采用蛋白酶K、溶菌酶、植物蛋白酶等裂解后进行提取。

文献1(CN101851617B)、文献2(CN103820431A)和文献3(CN104450684A)公开了用磁珠法提取病毒或细菌中核酸的试剂盒及提取方法。该方法主要是通过裂解液将病毒或细菌破碎，破碎后通过磁珠吸附游离的核酸形成磁珠-核酸复合物，并在配合磁场的作用下完成核酸的纯化。该方法提取的核酸纯度高、完整、可直接用于后续检测，但是存在核酸提取时间较长、操作步骤复杂、成本昂贵，并在利用磁场-磁珠反复纯化核酸的过程中造成核酸流失等问题。

文献4(CN104611324A)公开了一种全血样本快速裂解试剂盒及其检测方法。该方法用月桂酰基肌氨酸钠、二硫苏糖醇、pH7.4的TE，95℃孵育2min，并将反应产物在12000rpm离心3min，收集上清取得了全血样本的核酸提取物。其优点为提取的核酸可直接用于聚合酶链式反应(PCR)检测。但是该方法存在整个裂解过程需要95℃高温加热，并且裂解产物需要离心取上清的纯化步骤，其裂解条件苛刻、较为繁琐，不易被集成到微流控芯片中。

文献5(Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较)公开了用Chelex-100法和碱性裂解法从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中提取核酸的一种方法。Chelex-100法用提取液(5％Chelex-100，1mmol/LEDTA，1％TritonX-100)，56℃水浴30min，95℃加热10min；4℃、12000g离心3min，取上清即为DNA模板。碱裂解法用1mol/LNaOH100μl37℃孵育30min，12000g离心2min，加入1mol/LHCL100μl，12000g离心3min，取上清即为DNA模板。两种方法核酸提取步骤复杂，并且提取的核酸不能直接用于后续扩增，需要离心等步骤，才可以进行后续扩增反应。

不论是上述文献中提到的磁珠法、热裂解、碱裂解的核酸提取方法，还是其他常规核酸提取方法均普遍存在步骤繁琐、耗时长，价格昂贵、试剂保存条件苛刻，以及核酸提取物不能直接用于后续核酸扩增，并且难以集成到微流控芯片上等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸提取方法及其专用试剂盒。

本发明提供了一种核酸提取方法，包括如下步骤：

(1)取样本液，与A组分混合并反应，形成反应体系；所述A组分包括氢氧化钠和二硫苏糖醇；

(2)完成步骤(1)后，取反应体系，与B组分混合，得到核酸提取物；所述B组分为B-1组分或B-2组分；所述B-1组分包括硫酸氢钠；所述B-2组分包括海藻糖和甘露醇。

所述步骤(1)的所述反应中，氢氧化钠的浓度为0.01mol/L-0.05mol/L，二硫苏糖醇的浓度为0.001mol/L-0.01mol/L。

所述步骤(1)的所述反应中，氢氧化钠的浓度可为0.01mol/L-0.02mol/L、0.02mol/L-0.025mol/L、0.025mol/L-0.05mol/L、0.01mol/L、0.02mol/L、0.025mol/L或0.05mol/L，二硫苏糖醇的浓度可为0.001mol/L-0.003mol/L、0.003mol/L-0.005mol/L、0.005mol/L-0.01mol/L、0.001mol/L、0.003mol/L、0.005mol/L或0.01mol/L。

所述A组分由氢氧化钠和二硫苏糖醇组成。所述B-1组分为硫酸氢钠。所述B-2组分由海藻糖和甘露醇组成。所述步骤(1)中，具体将80微升样本液与A组分混合。所述步骤(2)中，将步骤(1)得到的所有反应体系与B组分混合。

所述A组分为含有氢氧化钠和二硫苏糖醇的水溶液。所述B-1组分为硫酸氢钠水溶液。所述B-2组分为含有海藻糖和甘露醇的水溶液。所述步骤(1)中，1体积份A组分与9体积份样本液混合。所述步骤(1)中，具体将10微升A组分与90微升样本液混合。所述步骤(2)中，3体积份反应体系与2体积份B组分混合。

所述步骤(2)的所述混合后，硫酸氢钠的浓度为0.0044mol/L-0.32mol/L。

所述步骤(2)的所述混合后，硫酸氢钠的浓度可为0.0044mol/L-0.032mol/L、0.032mol/L-0.176mol/L、0.176mol/L-0.32mol/L、0.0044mol/L、0.032mol/L、0.176mol/L或0.32mol/L。

所述步骤(2)的所述混合后，海藻糖的浓度为13.5g/L-80g/L，甘露醇的浓度为10.5g/L-80g/L。

所述步骤(2)的所述混合后，海藻糖的浓度可为13.5g/L-20g/L、20g/L-36g/L、36g/L-80g/L、13.5g/L、20g/L、36g/L或80g/L，甘露醇的浓度可为10.5g/L-20g/L、20g/L-28g/L、28g/L-80g/L、10.5g/L、20g/L、28g/L或80g/L。

所述步骤(1)中，所述反应的条件为(b1)或(b2)：

(b1)温度为20℃-105℃；

(b2)温度为50℃-75℃。

所述步骤(1)中，所述反应的条件为：温度为65℃、时间为5-30min(例如5min-15min、15min-30min、5min、15min或30min)。

所述样本液为动物体液和/或微生物培养物。

所述核酸提取方法为提取微生物和/或动物核酸的方法。

所述微生物具体可为鸭瘟病毒或人类疱疹病毒。所述动物体液具体可为离体的动物体液，更具体可为人类唾液。

本发明还提供了一种用于生物核酸提取的试剂盒，包括A组分和B组分；所述A组分包括氢氧化钠和二硫苏糖醇；所述B组分为B-1组分或B-2组分；所述B-1组分包括硫酸氢钠；所述B-2组分包括海藻糖和甘露醇。

所述A组分由氢氧化钠和二硫苏糖醇组成。所述B-1组分为硫酸氢钠。所述B-2组分由海藻糖和甘露醇组成。

所述A组分为含有氢氧化钠和二硫苏糖醇的水溶液。所述B-1组分为硫酸氢钠水溶液。所述B-2组分为含有海藻糖和甘露醇的水溶液。

所述A组分可为A液。所述A液为含有0.1mol/L-0.5mol/L氢氧化钠和0.01mol/L-0.1mol/L二硫苏糖醇的水溶液。所述A液中，所述氢氧化钠的浓度可为0.1mol/L-0.2mol/L、0.2mol/L-0.25mol/L、0.25mol/L-0.5mol/L、0.1mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L或0.5mol/L。所述A液中，所述二硫苏糖醇的浓度可为0.01mol/L-0.03mol/L、0.03mol/L-0.05mol/L、0.05mol/L-0.1mol/L、0.01mol/L、0.03mol/L、0.05mol/L或0.1mol/L。所述A液具体可为含有0.1mol/L氢氧化钠和0.01mol/L二硫苏糖醇的水溶液。所述A液具体可为含有0.2mol/L氢氧化钠和0.05mol/L二硫苏糖醇的水溶液。所述A液具体可为含有0.5mol/L氢氧化钠和0.1mol/L二硫苏糖醇的水溶液。所述A液具体可为含有0.25mol/L氢氧化钠和0.03mol/L二硫苏糖醇的水溶液。

所述B-1组分可为B-1液。所述B-1液为0.08mol/L-0.8mol/L硫酸氢钠水溶液。所述B-1液中，所述硫酸氢钠的浓度为0.08mol/L-0.44mol/L、0.44mol/L-0.8mol/L、0.08mol/L、0.44mol/L或0.8mol/L。所述B-1液具体可为0.08mol/L硫酸氢钠水溶液。所述B-1液具体可为0.44mol/L硫酸氢钠水溶液。所述B-1液具体可为0.8mol/L硫酸氢钠水溶液。

所述B-2组分可为B-2液。所述B-2液为含有50g/L-200g/L海藻糖和50g/L-200g/L甘露醇的水溶液。所述B-2液中，海藻糖的浓度可为50g/L-90g/L、90g/L-200g/L、50g/L、90g/L或200g/L。所述B-2液中，甘露醇的浓度可为50g/L-70g/L、70g/L-200g/L、50g/L、70g/L或200g/L。所述B-2液具体可为含有50g/L海藻糖和50g/L甘露醇的水溶液。所述B-2液具体可为含有90g/L海藻糖和70g/L甘露醇的水溶液。所述B-2液具体可为含有200g/L海藻糖和200g/L甘露醇的水溶液。

所述A组分可为A组件。所述A组件为装有氢氧化钠和二硫苏糖醇的反应容器。所述反应容器中，氢氧化钠和二硫苏糖醇的摩尔配比为(0.2-0.25)：(0.03-0.05)。所述反应容器中，氢氧化钠和二硫苏糖醇的摩尔配比为具体可为0.2：0.05或0.25：0.03。所述反应容器具体可为1.5mlEP管。所述A组件具体可为含有1.6×10^-6mol氢氧化钠和0.4×10^-6mol二硫苏糖醇的1.5mlEP管。所述A组件具体可为含有2×10^-6mol氢氧化钠和0.24×10^-6mol二硫苏糖醇的1.5mlEP管。

所述B-1组分具体可为B-1组件。所述B-1组件为装有硫酸氢钠的反应容器。所述反应容器具体可为1.5mlEP管。所述B-1组件具体可为含有0.352×10^-6mol硫酸氢钠的1.5mlEP管。

所述B-2组分具体可为B-2组件。所述B-2组件为装有海藻糖和甘露醇的反应容器。所述反应容器中，海藻糖和甘露醇的质量配比具体可为90：70。所述反应容器具体可为1.5mlEP管。所述B-1组件具体可为含有1.08×10^-3g海藻糖和0.84×10^-3g甘露醇的1.5mlEP管。

所述生物为微生物或动物。所述微生物具体可为鸭瘟病毒或人类疱疹病毒。所述动物可为人。

本发明还保护以上任一所述的试剂盒在提取生物核酸中的应用。所述生物为微生物或动物。所述微生物具体可为鸭瘟病毒或人类疱疹病毒。所述动物可为人。

步骤(1)中，反应温度可为室温(20℃)至105℃。步骤(1)中：如反应温度偏低，会导致反应时间过长；如反应温度较高，虽然可缩短反应时间，但对配套仪器装置要求较高且有可能导致预埋在微流控芯片上的生物试剂的活性受到影响。综合考虑，优选的反应温度为50℃-75℃。

液态形式的试剂普遍存在需要低温保存和运输的问题。本发明提供的试剂盒中的组分可以以固态形式预先包埋于微流控芯片内或其他密闭容器中，便于保存及运输，同时也简化了使用时的操作。

唾液、痰液等临床样品中富含大量粘蛋白，利用常规碱裂解法裂解，存在裂解时间长且裂解后的样品扩增不理想等问题，组分A成功克服了上述问题，可以有效快速裂解富含大量粘蛋白或其他杂蛋白的临床样品(例如血清、唾液、泪液、痰液或尿液)。将步骤(1)得到的裂解产物与组分B混匀，可直接作为模板，用于后续的核酸反应操作(例如聚合酶链式反应、环介导等温扩增等)，无需进行离心纯化、简便快速。本发明极大程度上解决了因流程复杂而难以集成到微流控芯片的问题。

本发明提供的方法具有如下优点：步骤简单；成本低廉；反应条件温和；试剂保存容易；所得到的核酸提取物无需纯化步骤即可应用于后续扩增反应，几乎不会造成核酸的损失，便于集成到微流控芯片内。

附图说明

图1为实施例1的检测结果。

图2为实施例2的检测结果。

图3为实施例3的检测结果。

图4为实施例4的检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

鸭瘟病毒：美国标准生物品收藏中心(Americantypeculturecollection)即ATCC，毒株编号VR-684。

实施例1、提取鸭瘟病毒核酸

一、试剂盒的制备

分别制备三个试剂盒，每个试剂盒由独立包装的A液和B液组成。

试剂盒I中，A液为含有0.1mol/L氢氧化钠和0.01mol/L二硫苏糖醇的水溶液，B液为0.08mol/L硫酸氢钠水溶液。

试剂盒II中，A液为含有0.2mol/L氢氧化钠和0.05mol/L二硫苏糖醇的水溶液，B液为0.44mol/L硫酸氢钠水溶液。

试剂盒III中，A液为含有0.5mol/L氢氧化钠和0.1mol/L二硫苏糖醇的水溶液，B液为0.8mol/L硫酸氢钠水溶液。

二、试剂盒的应用

1、制备待测样本液

取浓度为1×10⁸个拷贝/ml的鸭瘟病毒原液，用无菌水稀释至1000倍体积，作为待测样本液。

2、将10μL试剂盒I中的A液与90μL待测样本液混合，65℃静置反应30min，得到反应体系I；将10μL试剂盒II中的A液与90μL待测样本液混合，65℃静置反应15min，得到反应体系II；将10μL试剂盒III中的A液与90μL待测样本液混合，65℃静置反应5min，得到反应体系III。

3、将3体积份反应体系I与2体积份试剂盒I中的B液混合，得到核酸提取液I；将3体积份反应体系II与2体积份试剂盒II中的B液混合，得到核酸提取液II；将3体积份反应体系III与2体积份试剂盒III中的B液混合，得到核酸提取液III。

4、取4μL步骤3得到的核酸提取液(核酸提取液I、核酸提取液II或核酸提取液III)，与21μLPCR扩增试剂混匀，然后进行荧光定量PCR反应(反应条件：94℃2min；94℃15s、55℃30s，40个循环)。

PCR扩增试剂为广州维伯鑫生物科技有限公司的“鸭瘟病毒(DPV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”中的组件。

采用每个试剂盒时设置三个重复处理。

结果如图1所示，用试剂盒I得到的测试结果为图1(a)，用试剂盒II得到的测试结果为图1(b)，用试剂盒III得到的测试结果为图1(c)。三组测试曲线中待测样本液的Ct值均有明显梯度，每组待测样本液中的三个重复处理的检测曲线基本一致，说明本发明提供的试剂组分及其提取方法可直接用于对不同浓度的鸭瘟病毒进行准确定量的PCR扩增反应。

实施例2、从唾液中提取人类疱疹病毒核酸

一、试剂盒的制备

试剂盒包括A管和B管。

制备试剂盒Ⅳ，由A管和B管组成。

A管：将8μL的A液(A液为含有0.2mol/L氢氧化钠和0.05mol/L二硫苏糖醇的水溶液)加入1.5mlEP管中，然后干燥至无水，得到含有1.6×10^-6mol氢氧化钠和0.4×10^-6mol二硫苏糖醇的1.5mlEP管。

B管：将0.8μL的B液(B液为0.44mol/L硫酸氢钠水溶液)加入1.5mlEP管中，然后干燥至无水，得到含有0.352×10^-6mol硫酸氢钠的1.5mlEP管。

二、试剂盒的应用

1、已经医院确诊感染人类疱疹病毒第四型(Epstein-Barrvirus)的患者(知情同意的志愿者)，取唾液。

2、取80μl唾液，加入A管中，65℃静置反应30min。

3、完成步骤2后，吸取A管中的所有液相，加入B管中，充分混匀。

4、完成步骤3后，取B管中的所有液相，与等温扩增试剂混合(B管中的所有液相与等温扩增试剂的体积比为3:2)，然后注入到预先包埋人疱疹病毒4型引物的微流控芯片内，然后将芯片放入恒温扩增微流控芯片核酸分析仪内，完成扩增反应。

等温扩增试剂，参见文献“RapiddetectionofEpstein–BarrvirusDNAbyloop-mediatedisothermalamplificationmethod”，SeikoIwata,YukikoShibata,Jun-ichiKawada,ShinyaHara,YukihiroNishiyama,TsuneoMorishima,MasaruIhira,TetsushiYoshikawa,YoshizoAsano,HiroshiKimura,JournalofClinicalVirology37(2006)128–133。

人疱疹病毒4型引物，参见文献“RapiddetectionofEpstein–BarrvirusDNAbyloop-mediatedisothermalamplificationmethod”，SeikoIwata,YukikoShibata,Jun-ichiKawada,ShinyaHara,YukihiroNishiyama,TsuneoMorishima,MasaruIhira,TetsushiYoshikawa,YoshizoAsano,HiroshiKimura,JournalofClinicalVirology37(2006)128–133。

微流控芯片,参见实用新型专利“多指标检测的微流控芯片”(申请日：CN201420103225.5；公开(公告)号：CN203750554U)。

恒温扩增微流控芯片核酸分析仪：RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪，博奥生物集团有限公司。

扩增反应的条件：65℃，60min。

进行三次重复试验。

结果见图2。结果表明，本发明提供的试剂组分及提取方法可用于唾液样本中人类疱疹病毒的核酸提取，提取产物可直接用于后续LAMP扩增反应。

实施例3、提取鸭瘟病毒核酸

一、试剂盒的制备

分别制备三个试剂盒，每个试剂盒由独立包装的A液和B液组成。

试剂盒Ⅴ中，A液为含有0.1mol/L氢氧化钠和0.01mol/L二硫苏糖醇的水溶液，B液为含有50g/L海藻糖和50g/L甘露醇的水溶液。

试剂盒Ⅵ中，A液为含有0.25mol/L氢氧化钠和0.03mol/L二硫苏糖醇的水溶液，B液为含有90g/L海藻糖和70g/L甘露醇的水溶液。

试剂盒Ⅶ中，A液为含有0.5mol/L氢氧化钠和0.1mol/L二硫苏糖醇的水溶液，B液为含有200g/L海藻糖和200g/L甘露醇的水溶液。

二、试剂盒的应用

1、制备待测样本液

取浓度为1×10⁸个拷贝/ml的鸭瘟病毒原液，用无菌水稀释至1000倍体积，作为待测样本液。

2、将10μL试剂盒Ⅴ中的A液与90μL待测样本液混合，65℃静置反应30min，得到反应体系Ⅴ；将10μL试剂盒Ⅵ中的A液与90μL待测样本液混合，65℃静置反应30min，得到反应体系Ⅵ；将10μL试剂盒Ⅶ中的A液与90μL待测样本液混合，65℃静置反应30min，得到反应体系Ⅶ。

3、将3体积份反应体系Ⅴ与2体积份试剂盒Ⅴ中的B液混合，得到核酸提取液Ⅴ；将3体积份反应体系Ⅵ与2体积份试剂盒Ⅵ中的B液混合，得到核酸提取液Ⅵ；将3体积份反应体系Ⅶ与2体积份试剂盒Ⅶ中的B液混合，得到核酸提取液Ⅶ。

4、取4μL步骤3得到的核酸提取液(核酸提取液Ⅴ、核酸提取液Ⅵ或核酸提取液Ⅶ)，与21μLPCR扩增试剂混匀，然后进行荧光定量PCR反应(反应条件：94℃2min；94℃15s、55℃30s，40个循环)。

PCR扩增试剂为广州维伯鑫生物科技有限公司的“鸭瘟病毒(DPV)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”中的组件。

采用每个试剂盒时设置三个重复处理。

结果如图3所示，用试剂盒Ⅴ得到的测试结果为图3(a)，用试剂盒Ⅵ得到的测试结果为图3(b)，用试剂盒Ⅶ得到的测试结果为图3(c)。三组实验Ct值有明显梯度，每组样本检测曲线的重复性，斜率基本一致且扩增效率高，本发明试剂组分及其提取方法可以对不同浓度的鸭瘟病毒进行准确的定量。

实施例4、从唾液中提取人类疱疹病毒核酸

一、试剂盒的制备

试剂盒包括A管和B管。

制备试剂盒Ⅷ，由A管和B管组成。

A管：将8μL的A液(A液为含有0.25mol/L氢氧化钠和0.03mol/L二硫苏糖醇的水溶液)加入1.5mlEP管中，然后干燥至无水，得到含有2×10^-6mol氢氧化钠和0.24×10^-6mol二硫苏糖醇的1.5mlEP管。

B管：将12μL的B液(B液为含有90g/L海藻糖和70g/L甘露醇的水溶液)加入1.5mlEP管中，然后干燥至无水，得到含有1.08×10^-3g海藻糖和0.84×10^-3g甘露醇的1.5mlEP管。

二、试剂盒的应用

1、已经医院确诊感染人类疱疹病毒第四型(Epstein-Barrvirus)的患者(知情同意的志愿者)，取唾液。

2、取80μl唾液，加入A管中，65℃静置反应30min。

3、完成步骤2后，吸取A管中的所有液相，加入B管中，充分混匀。

4、完成步骤3后，取B管中的所有液相，与等温扩增试剂混合(B管中的所有液相与等温扩增试剂的体积比为3:2)，然后注入到预先包埋人疱疹病毒4型引物的微流控芯片内，然后将芯片放入恒温扩增微流控芯片核酸分析仪内，完成扩增反应。

等温扩增试剂，参见文献“RapiddetectionofEpstein–BarrvirusDNAbyloop-mediatedisothermalamplificationmethod”，SeikoIwata,YukikoShibata,Jun-ichiKawada,ShinyaHara,YukihiroNishiyama,TsuneoMorishima,MasaruIhira,TetsushiYoshikawa,YoshizoAsano,HiroshiKimura,JournalofClinicalVirology37(2006)128–133。

人疱疹病毒4型引物，参见文献“RapiddetectionofEpstein–BarrvirusDNAbyloop-mediatedisothermalamplificationmethod”，SeikoIwata,YukikoShibata,Jun-ichiKawada,ShinyaHara,YukihiroNishiyama,TsuneoMorishima,MasaruIhira,TetsushiYoshikawa,YoshizoAsano,HiroshiKimura,JournalofClinicalVirology37(2006)128–133。

微流控芯片,参见实用新型专利“多指标检测的微流控芯片”(申请日：CN201420103225.5；公开(公告)号：CN203750554U)。

恒温扩增微流控芯片核酸分析仪：RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪，博奥生物集团有限公司。

扩增反应的条件：65℃，60min。

进行三次重复试验。

结果见图4。结果表明，本发明提供的试剂组分及提取方法可用于唾液样本中人类疱疹病毒的核酸提取，提取产物可直接用于后续LAMP扩增反应。

Claims (11)

1.一种核酸提取方法，包括如下步骤：

(1)取样本液，与A组分混合并反应，形成反应体系；所述A组分包括氢氧化钠和二硫苏糖醇；

(2)完成步骤(1)后，取反应体系，与B组分混合，得到核酸提取物；所述B组分为B-1组分或B-2组分；所述B-1组分包括硫酸氢钠；所述B-2组分包括海藻糖和甘露醇。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)的所述反应中，氢氧化钠的浓度为0.01mol/L-0.05mol/L，二硫苏糖醇的浓度为0.001mol/L-0.01mol/L。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述A组分由氢氧化钠和二硫苏糖醇组成；

所述B-1组分为硫酸氢钠；

所述B-2组分由海藻糖和甘露醇组成。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述A组分为含有氢氧化钠和二硫苏糖醇的水溶液；

所述B-1组分为硫酸氢钠水溶液；

所述B-2组分为含有海藻糖和甘露醇的水溶液。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述步骤(1)中，1体积份A组分与9体积份样本液混合；

所述步骤(2)中，3体积份反应体系与2体积份B组分混合。

6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤(2)的所述混合后，硫酸氢钠的浓度为0.0044mol/L-0.32mol/L。

7.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤(2)的所述混合后，海藻糖的浓度为13.5g/L-80g/L，甘露醇的浓度为10.5g/L-80g/L。

8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：

所述步骤(1)中，所述反应的温度为如下(b1)或(b2)：

(b1)温度为20℃-105℃；

(b2)温度为50℃-75℃。

9.如权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：

所述样本液为动物体液和/或微生物培养物；

所述核酸提取方法为提取微生物和/或动物核酸的方法。

10.一种用于生物核酸提取的试剂盒，包括A组分和B组分；

所述A组分包括氢氧化钠和二硫苏糖醇；

所述B组分为B-1组分或B-2组分；所述B-1组分包括硫酸氢钠；所述B-2组分包括海藻糖和甘露醇。

11.权利要求10所述试剂盒在提取生物核酸中的应用。