DE19615934C1

DE19615934C1 - Verfahren zur qualitativen und quantitativen analytischen Erfassung des Schimmelpilzes Fusarium Graminearum in Reinkulturen und in jeglichem Probenmaterial

Info

Publication number: DE19615934C1
Application number: DE19615934A
Authority: DE
Inventors: Martin Ludwig Dr Niessen; Rudi F Prof Dr Vogel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-04-22
Filing date: 1996-04-22
Publication date: 1997-10-02
Anticipated expiration: 2016-04-23

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren, die auf der Grundlage der enzymatischen Aktivität, der Proteinstruktur, sowie der für das Protein kodierenden Gensequenz des Enzyms Galaktose- Oxidase, für den qualitativen und quantitativen Nachweis des Pilzes Fusarium graminearum in Reinkulturen sowie in jeglichem Probenmaterial eingesetzt werden.

Stand der Technik Fusarium graminearum als Problemkeim in der Landwirtschaft und in der Lebensmittelherstellung

Fusarium graminearum ist ein seit langem bekannter Pilz mit weltweiter Verbreitung. Er kommt vornehmlich in Böden der gemäßigten bis wärmeren Klimazonen vor. In Süddeutschland tritt er verbreiteter auf als in Norddeutschland. Er befällt Getreide und Mais. An diesen Pflanzen verursacht er bekannte Krankheiten, die sich als Augenflecken an den Halmen, Blattnekrosen, Wurzelschädigungen und Weißährigkeit bei Getreide sowie als Kolbenfäule bei Mais äußern. Der jährliche Verlust an Erntegut durch diesen Pilz ist bedeutend. Wirksame Fungizide stehen zur Zeit nicht zur Verfügung. Neben den Schäden durch Ertragseinbußen durch befallenes Getreide führt der Pilz auch zu einer erheblichen Kontamination des Getreides mit giftigen Stoffwechselprodukten (Mykotoxinen). Diese können bei Verzehr durch Mensch und Tier zu ernsten Vergiftungen führen, die insbesondere im Bereich der Tiererzeugung immer wieder zu massiven wirtschaftlichen Schäden führen. Beim Menschen sind durch die Wirkung von Trichothecen-Mykotoxinen, die insbesondere durch Fusarium graminearum gebildet werden, verschiedene Krankheitsbilder bekannt (red mold disease, Kashin-Beck-Syndrom, Alimentäre toxische Aleukie). Auch im Bereich der Biererzeugung verursacht der Pilz Qualitätsmängel durch in das Bier gelangende Mykotoxine.

Auch an dem in manchen Jahren in verschiedenen Ländern der Welt verstärkt auftretenden Überschäumen von Bieren (Gushing) ist Fusarium graminearum als Auslöser maßgeblich beteiligt.

Zur Bedeutung des Enzyms Galaktose-Oxidase (EC 1.1.3.9)

Galaktose-Oxidase ist ein Enzym, welches die Oxidation der am C-6 Atom des Zuckers D-Galaktose vorhandenen Hydroxylgruppe zur Ketogruppe katalysiert. Das entstehende Produkt ist D-Galactohexodialdose. Die genaue ökologische Funktion des Enzyms ist bisher nicht bekannt. Ein Zusammenhang mit Infektionsmechanismen des produzierenden Pilzes wurde diskutiert, blieb jedoch bisher unbewiesen. Das Enzym wird häufig in Stämmen des Pilzes Fusarium graminearum gefunden, wie dies in einer brasilianischen Studie an 48 Stämmen gezeigt wurde (Dias, D., Kemmelmeier, C. (1987): Galaktose oxidase occurrence in Fusarium graminearum, Rev. Microbiol. 18, 276-278). Dabei wiesen 18 der 48 untersuchten Stämmen eine Aktivität dieses Enzyms auf. Neben der Oxidase Aktivität konnte eine Lectin Aktivität des Enzyms aufgezeigt werden (Zakharova, I.Ya., Kovalenko, E. A., Buglova, T. T. (1986): Lectin properties of Galaktose oxidase of Fusarium graminearum IMV-F-1060, Biokhimiya (Moskau), 51, 1249-1255). Der Hauptproduzent für kommerziell hergestellte Präparate der Galaktose-Oxidase ist der Pilzstamm Cladobotryum dendroides NRRL 2903 (identisch mit ATCC 46032). Dieser Stamm ist der einzige dieser Art, für den die Bildung von Galaktose-Oxidase gezeigt werden konnte. Die Namengebung des Stammes NRRL 2903 wurde mehrfach geändert, da er infolge fehlender Sporulation mit den Mitteln der klassischen Taxonomie bisher nicht exakt klassifiziert werden konnte. Durch die Verwendung spezieller Nährböden konnte das Isolat zur Produktion weniger, morphologisch nicht eindeutig einzuordnender Konidien gebracht werden (Ögel, Z. B., Brayford, D., McPherson, M. J. (1994): Cellulose-triggered sporulation in the Galaktose oxidase-producing fungus Cladobotryum (Dactylium) dendroides NRRL 2903 and its re-identification as a species of Fusarium, Mycol. Res. 98, 474-480). In der zitierten Arbeit wurde vermutet, daß es sich bei dem Pilzstamm um Fusarium chlamydosporum handelt. Dies konnte jedoch in der genannten Arbeit nicht bewiesen werden. Insbesondere eine Verbindung zwischen dem untersuchten Stamm und Fusarium graminearum wurde dort nicht hergestellt und auch nicht vermutet.

Bereits in früheren Arbeiten wurde die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz des Enzyms Galaktose Oxidase aus Cladobotryum dendroides NRRL 2903 beschrieben (McPherson, M. J., Ögel, Z. B., Stevens, C., Yadav, K. D. S., Keen, J. N. und Knowles, P. F. (1992): Galaktose oxidase of Dactylium dendroides - gene cloning and sequence analysis. Journal of Biological Chemistry 267, 8146-8152; GenBank Accession No. M86819). Auch in dieser Arbeit wurde keine Verbindung zwischen Cladobotryum dendroides NRRL 2903 und Fusarium graminearum hergestellt oder auch nur vermutet.

Bisher eingesetzte Verfahren für die Analyse von Fusarium graminearum in Lebensmitteln, Pflanzenproben und im Boden

Da eine Bekämpfung des Pilzes auf dem Feld oder im Boden derzeit nicht möglich ist und der Einsatz präventiver chemischer Behandlungsmaßnahmen in Lebensmittelbereich sich ausschließt, kann ein Schutz des Verbrauchers vor den negativen Folgen des Befalles von Getreide mit Fusarium graminearum nur durch eine Qualitätsprüfung von Lebensmittelrohstoffen und auch von Saatgut in der Landwirtschaft gewährleistet werden. Aus diesem Grunde muß eine Untersuchung auf den Befall mit dem Pilz vorgenommen werden. Dazu wurden verschiedene Verfahren beschrieben:

1. Mikrobiologische Methoden.

Ausplattieren gemahlener Getreide- Pflanzen- oder Bodenproben auf mikrobiologische Nährböden mit anschließender mikroskopischer Analyse der nach Bebrütung wachsenden Pilzmyzelien.

Auslegen von ganzen Körnern, Wurzeln oder Erdpartikeln auf mikrobiologische Nährböden mit anschließender mikroskopischer Analyse der nach Bebrütung wachsenden Pilzmyzelien. Ausplattieren von Getreide-, Pflanzen- oder Bodenproben auf mikrobiologische Nährböden, auf denen das Pilzmyzel eine bestimmte spezifizierende Eigenschaft aufweist wie z. B. eine Verfärbung des Mediums durch Ausscheidung von farbigen Stoffwechselprodukten.

Nachteile der oben genannten Methoden sind die lange Analysendauer von etwa zwei Wochen sowie die oftmals sehr weitgehenden Spezialkenntnisse, die für die Auswertung und Interpretation der Ergebnisse mikrobiologischer Methoden notwendig sind. Darüber hinaus eignen sich mikrobiologische Methoden ausschließlich für die Analyse von lebenden Schimmelpilzen. Abgestorbene Myzelien, die insbesondere für die Beurteilung der Qualität von Lebensmitteln und deren Rohstoffen von besonderer Bedeutung sind, können nicht erfaßt werden. Als weiterer Nachteil mikrobiologischer Methoden kommt hinzu, daß eine Quantifizierung des Pilzbefalles sehr schwierig ist und stark von der verwendeten Methode der Probenaufbereitung (z. B. Mahlen mit unterschiedlicher Drehzahl) abhängt.

2. Immunchemische Methoden.

Hier werden Antiseren verwendet, die gegen das Pilzmyzel oder gegen vom Pilz gebildete Substanzen gerichtet sind. Die in Verfahren bisher beschriebenen Antigene waren vor allem extrazelluläre Polysaccharide. Auch gegen Proteine, die sowohl aus dem Medium als auch aus dem Myzel von Pilzen isoliert wurden, konnten Antiseren gewonnen werden. In den genannten Fällen handelte es sich jedoch stets um gattungsspezifische Antiseren, die keine einzelne Art spezifisch erfassen konnten. Auch wurde eine deutliche Abhängigkeit der Antigenproduktion von den Wachstumsbedingungen festgestellt. Für einen monoklonalen Antikörper, der sich ebenfalls für den Nachweis der Gattung Fusarium eignet, wurde Patentschutz beantragt (Chemical Patents Indes, Documentation Abstracts Journal, Sect. D, Derwent Publications, London 1993; Nr. 92-384725/47; JP 04281796 A). Auch ein mit diesem Antikörper erstelltes Verfahren, bei dem Pilze aus Bodenproben nach dem Durchwachsen einer Gelschicht an einer Membran fixiert und anschließend mit Antikörpern nachgewiesen werden, wurde zum Patent angemeldet (Chemical Patents Index, Documentation Abstracts Journal, Sect. D, Derwent Publications, London 1994; Nr. 94- 211680/26; JP 06148194 A). Ein streng artspezifisches immunchemisches Nachweisverfahren für Fusarium graminearum wurde bisher jedoch noch nicht beschrieben.

3. Chemische Methoden.

Direkte Analyse von Stoffwechselprodukten, die von dem Pilz produziert werden (z. B. Mykotoxine, Ergosterin) mit Hilfe chromatographischer Methoden. Bei der direkten Analyse von Stoffwechselprodukten führt die oft starke Umweltabhängigkeit der Bildung solcher Substanzen sowie ihre meist bei mehreren Arten vorkommende Produktion zu Unsicherheiten bei der Interpretation der Ergebnisse. Ergosterin kommt in allen pilzlichen Zellmembranen vor, was lediglich seine Verwendung für eine summarische Abschätzung der Belastung von Probenmaterial mit Pilzen erlaubt.

4. Molekularbiologische Methoden.

Ziel eines Nachweises mit molekularbiologischen Methoden ist die DNA von Organismen. Diese Art der Analytik ist im Bereich der medizinischen Diagnostik sowie in der Forensik und zunehmend auch in der Mikrobiologie weit verbreitet. Die bisher vorhandenen Nachweisverfahren beruhen nahezu ausschließlich auf der Verwendung von DNA Sequenzen, die durch die Analyse von Fragmenten erhalten wurden, die mit Zufallsprimern erzeugt werden (sog. RAPD Fragmente). Sie sind daher keinem bestimmten Gen zuzuordnen. Für den Nachweis von pflanzenpathogenen Pilzen, unter denen auch verschiedene Fusarium-Arten eine Bedeutung haben, wurden jedoch auch PCR-gestützte Nachweisverfahren zum Patent angemeldet, die auf der Nukleotid-Sequenz der ITS Segmente 1 und 2 (Internal Transcribed Spacer) von verschiedenen Pilzen, unter anderem auch von Fusarium graminearum, beruhen (WO 95/29260 A2). Eine weitere Patentanmeldung bezieht sich auf ein Verfahren, das mit Hilfe von Oligonukleotidsonden und PCR Primern pflanzenpathogene Pilze wie Pseudocercosporella herpotrichoides (eyespot), Septoria oder Fusarium nachweisen kann (WO 94/19489 A2). Die dort beschriebenen DNA-Sequenzen wurden aus den für 18S ribosomale RNA kodierenden Genen der betreffenden Pilze abgeleitet. Die Verwendung von Sequenzen aus den ITS Segmenten der pilzlichen rDNA birgt jedoch die allgemeine Gefahr, daß sich in diesen Teilen des Gen-Clusters hochvariable Bereiche befinden. Von diesen Bereichen abgeleitete Oligonukleotidsequenzen sind deshalb mit großer Wahrscheinlichkeit nicht für eine ganze Art charakteristisch, sondern nur für einzelne Stämme oder gar Individuen. Die Verwendung von DNA-Sequenzen, die aus wohlbekannten und definierten Genen stammen, die für eine Art charakteristisch sind, umgeht die genannten Nachteile, indem von vornherein Sequenzen verwendet werden, die nur der Zielorganismus hat. Da die Sequenz aus einem funktionierenden Gen stammt, ist die zu erwartende Variabilität in der Basenfolge zwischen einzelnen Stämmen sehr gering. Damit steigt die Wahrscheinlichkeit, daß alle Stämme der zu erfassenden Art in positiver Weise reagieren, deutlich an. Ein solcher Weg wurde in der Erfindung gemäß vorliegendem Anspruch 1 gewählt.

Problem

Der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, daß bisher keine Methode existiert, mit der in Forschung und Praxis eine einfache und sichere Identifizierung des Schadpilzes Fusarium graminearum mit vertretbarem Aufwand an Zeit und Kosten bei absoluter Selektivität auch in Mischungen, mit hoher Sensitivität und bei einfacher Überprüfbarkeit gelingt. Aufgabe der Erfindung ist es, einfach handhabbare und ohne Spezialkenntnisse im betrieblichen Labor, in der Forschung oder auf dem Feld durchführbare Verfahren bereitzustellen, die mit einem deutlich geringeren als dem bisher notwendigen Aufwand an Zeit bei verbesserter Genauigkeit eine Aussage über den Kontaminationsgrad von Probenmaterialien mit Fusarium graminearum als wichtigem Qualitätsparameter gestatten.

Lösungsvorschlag

Dieses Problem wird durch die Erfindung "VERFAHREN ZUR QUALITATIVEN UND QUANTITATIVEN ANALYTISCHEN ERFASSUNG DES SCHIMMELPILZES FUSARIUM GRAMINEARUM IN REINKULTUREN UND IN JEGLICHEM PROBENMATERIAL" gelöst.

Der besondere Vorteil des hier beschriebenen Lösungsweges ist die Tatsache, daß die Messung der Pilzbelastung auf einem Parameter beruht, der mit den verschiedenen in den Unteransprüchen aufgeführten Verfahren und Verfahrensvarianten nur in Verbindung mit Fusarium graminearum eine im Sinne des Verfahrens positive Reaktion zeigt. Weiterhin bietet die Erfindung die Möglichkeit, durch die Kombination verschiedener Verfahren wie etwa der Messung der Enzymaktivität und der zusätzlichen Amplifikation von Teilen der Gensequenz eines zu testenden Pilzisolates, Messergebnisse abzusichern. Diese Sicherheit in der Analyse in Verbindung mit einer relativ kurzen Analysenzeit wird von keinem der bisher verwendeten Verfahren erreicht.

Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von als Anspruch 4 aufgeführten Verfahren, bei denen Teile der Gensequenz des Galaktose-Oxidase-Gens von Fusarium graminearum enzymatisch in hochspezifischer Weise in einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Das Auftreten eines solchen Amplifikates wird dabei als sicheres Indiz für das Vorhandensein von DNA aus dem Zielorganismus in einer Probe gewertet. Dabei ist es besonders vorteilhaft, daß nicht nur lebende Zellen von Fusarium graminearum erfaßt werden, sondern auch solche, die z. B. durch Lagerung oder Verarbeitung von Lebensmittelrohstoffen abgetötet wurden. Da diese abgetöteten Zellen vor ihrem Tod qualitätsmindernde oder auch toxische Stoffe gebildet haben könnten, bietet ein Verfahren nach Anspruch 4 die bisher nicht vorhandene Möglichkeit, tote und lebende Zellen gemeinsam zu erfassen. Dies gelingt in spezifischer Weise auch dann, wenn Fusarium graminearum in Mischung mit anderen Pilzen, Bakterien oder auch pflanzlichen Zellen vorliegt.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Verfahren nach den Unteransprüchen zum Hauptanspruch angegeben. Die Weiterbildung nach diesen Unteransprüchen ermöglicht die Entwicklung von praxistauglichen Analyseverfahren, die in Form von vorgefertigten diagnostischen Test-Systemen in besonders Anwender-freundlicher Form hergestellt werden können. Ein Vorteil der Verwendung des in Anspruch 3 genannten Nachweisreagenzes ist, daß es die für den Anwender hochgiftigen Alkohole, die bei einem Direktnachweis der Galaktose-Oxidase-Aktivität verwendet werden, durch geringgiftige Substanzen ersetzt.

Ausführungsbeispiele für die Unteransprüche 2, 3 und 4 sind in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt und werden im folgenden näher beschrieben. Das Ausführungsbeispiel für Unteranspruch 5 enthält keine Figuren.

Es zeigen

Fig. 1 kolorimetrische Messung der Aktivität von Galaktose-Oxidase mit einer nach Anspruch 2 hergestellten Meßanordnung unter Verwendung der Indikatorlösung nach Anspruch 3. Es wurde als Standard eine Verdünnungsreihe von käuflicher Galaktose-Oxidase verwendet. Als Proben wurde Kulturüberstand aus Flüssigkulturen von Fusarium graminearum DSM 4527 und Cladobotryum dendroides NRRL 2903 (=Fusarium graminearum NRRL 2903) verwendet. Die Kontrolle enthielt nur die enzymfreie Indikatorlösung nach Anspruch 3.

Fig. 2 mit Hilfe der Polymerase Chain Reaction (PCR) amplifizierte Fragmente aus der DNA verschiedener, nahe mit Fusarium graminearum verwandter Schimmelpilze. Die obere Bande zeigt ein Fragment, welches als interne Kontrolle mit jeder Pilz-DNA erzeugt wird. Die untere Bande entsteht zusätzlich nur dort, wo DNA von Fusarium graminearum Stämmen eingesetzt wurde. Der nicht spezifisch reagierende Stamm von Fusarium graminearum konnte als zu einer anderen Art gehörig identifiziert werden.

Fig. 3 Nukleotidsequenz des Galaktose-Oxidase-Gens (GaoA) und angrenzender Regionen, wie sie für Dactylium dendroides NRRL 2903 (Synonym Cladobotryum dendroides, Hauptfruchtform Hypomycess rosellus) in GenBank hinterlegt wurde (Accession No. M866819 vom 4.2.1994; siehe auch McPherson et al., Journal of Biological Chemistry 267, 8146-8152 (1992)).

Zu Anspruch 2 in Verbindung mit Anspruch 3 Identifizierung von Fusarium graminearum in Reinkulturen durch Aktivitätsmessung von Galaktose-Oxidase

Galaktose-Oxidase (EC 1.1.3.9) ist ein Enzym, dessen Bildung bei wenigen Schimmelpilzarten beobachtet wurde. Die Ordnungszahl weist es als ein Enzym aus der Gruppe der Oxido-Reduktasen aus. Es katalysiert spezifisch die Oxidation der 6′- Hydroxylgruppe des Zuckers Galaktose zum entsprechenden Keton. Dabei wird in Lösung vorhandener Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid (H₂O₂) reduziert. Bei den verschiedenen bekannten Meßmethoden macht man sich sowohl die Abnahme der O₂-Konzentration (manometrische Verfahren) als auch die Entstehung von H₂O₂ und die Möglichkeit der Reduktion anderer Alkohole zu gefärbten Substraten zunutze. In den beiden letzten Fällen erfolgt die Messung mit kolorimetrischen Verfahren. Diese Art der Messung ist gegenüber der manometrischen deutlich empfindlicher und genauer. Man unterscheidet direkte Verfahren, die die Farbveränderung einer Lösung eines organischen Alkohols (z. B. 3- Methoxybenzylalkohol) hervorgerufen durch die Oxidation in Anwesenheit des Enzyms zur Messung verwenden. Daneben sind gekoppelte Verfahren bekannt, die indirekt das entstehende H₂O₂ durch Einschaltung eines weiteren Enzyms, der Peroxidase, messen. Dabei führt Peroxidase eine Spaltung des Wasserstoffperoxid zu Sauerstoff und Wasser durch, wobei stets ein Elektronendonator vorhanden sein muß. In dem hier beispielhaft aufgezeigten System wird eine Probe aus dem Überstand einer in einem Sorbose-haltigen Medium gewachsenen Kultur entnommen und mit einem Galaktose-Oxidase Nachweisreagenz gemischt. Sorbose induziert die Produktion von Galaktose-Oxidase, wird jedoch selber von dem Enzym nicht oxidiert. Das verwendete Nachweisreagenz (Anspruch 3) enthält Galaktose als Enzym-Substrat, Peroxidase als ein Enzym zur Umsetzung des Produktes der Galaktose Oxidase sowie 3,5-Dichlor-2-hydroxysulfonsäure und 4-Amino-2,3-dimethyl-1-phenyl-3- pyrazolin-5-on als elektronenlieferndes Cosubstrat der Peroxidase. Durch die Oxidation dieser Substanzen durch Peroxidase werden diese in ihrer Struktur so verändert, daß sie ein farbiges Produkt ergeben. Die Menge dieses Produktes ist der Extinktionsänderung der Lösung proportional, weshalb sie als Maß für die Aktivität an Galaktose-Oxidase verwendet werden kann (siehe Fig. 1). Mit diesem Testsystem reagieren ausschließlich solche Pilzisolate, die mit Referenzmethoden (PCR, Mannit-PCNB-Agar, Morphologie) als Fusarium graminearum charakterisiert wurden. Durch Verwendung verschiedener Substrate für die Peroxidase kann das Prinzip der hier beschriebenen Messung an unterschiedliche Problemstellungen angepaßt werden.

Zu Anspruch 4 Identifizierung und Quantifizierung von Fusarium graminearum mit molekularbiologischen Methoden

Die Anordnung der Nukleotide Guanin, Cytosin, Tymidin und Adenin in der Nukleinsäure von Organismen (Nukleotid-Sequenz) kann ein für eine Organismenart charakteristisches Merkmal sein. Diese Sequenz kommt in identischer Weise bei keiner anderen Art vor und eignet sich daher sehr gut für die Identifizierung. Eine weitverbreitete Methode für die Charakterisierung von Organismen ist die Polymerase Chain Reaction (PCR). Dabei binden sich unter experimentellen Bedingungen kurze Oligonukleotide an komplementäre Bereiche eines Nukleinsäure (DNA)-Einzelstranges. Diese Bindung ist bei optimalen Bedingungen hoch spezifisch und kommt nur in Verbindung mit der DNA vor, von der diese Oligonukleotide abgeleitet wurden. Das Enzym DNA-Polymerase kann sich an das gebundene Oligonukleotid anlagern und entsprechend der Sequenz des DNA-Einzelstranges einen dazu komplementären Strang synthetisieren. Wird dieser Vorgang mehrmals zyklisch wiederholt, so nimmt die Anzahl synthetisierter Stränge exponentiell zu (Amplifikation). Durch Übertragung des Reaktionsansatzes auf ein Agarosegel mit anschließender elektrophoretischer Trennung und Färbung der DNA kann das amplifiziert DNA-Fragment sichtbar gemacht werden (siehe Fig. 2). Die Entstehung eines Fragmentes mit der richtigen Länge gilt dabei als Nachweis des Pilzes. Es wird gezeigt, daß bei Verwendung eines Primer Paares, welches aus der in Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz von Cladobotryum dendroides abgeleitet wurde, mit DNA Proben aus einer Anzahl sehr nahe mit Fusarium graminearum verwandter Pilze aus der Gattung Fusarium sowie aus anderen Pilzen, Bakterien und Pflanzen, nur dort eine positives Signal erhalten wird, wo die DNA aus dem Zielorganismus stammt. Verfahren nach dem in dem Beispiel gezeigten Schema können sehr gut für eine schnelle, genaue und spezifische Erfassung des Pilzes, auch aus Mischungen verschiedener Organismen heraus, verwendet werden.

Zu Anspruch 5 Identifizierung von Fusarium graminearum durch Verwendung von Anti-Galaktose-Oxidase Antikörpern

Galaktose-Oxidase kann leicht aus Kulturüberständen von Fusarium graminearum gewonnen werden. Mit dem gereinigten Enzym können Tiere immunisiert werden, die gegen die Strukturen des Enzyms (Epitope) Antikörper bilden. Durch Gewinnung von Serum der immunisierten Tiere werden die Antikörper für analytische Zwecke erhalten. Diese Antikörper sind in der Lage, sich spezifisch an Galaktose-Oxidase zu binden. Durch Verwendung geeigneter Detektionsverfahren kann diese Bindung nachgewiesen werden. Mit einem solchen System können Proben auf das Vorhandensein von Galaktose-Oxidase untersucht werden. Das Auftreten des Enzyms z. B. in Lebensmittel- oder Futtermittelproben wird als Nachweis für das Vorhandensein von Fusarium graminearum in der untersuchten Probe gewertet. Durch Variation des Testaufbaues nach verschiedenen immunchemischen Standardmethoden kann eine Anpassung des Systems an unterschiedliche Problemstellungen erreicht werden.

Neben der Gewinnung von monoklonalen oder auch polyklonalen Antikörpern können unter Einsatz moderner gentechnologischer Methoden auch Teile von Antikörpern in Bakterien zur Expression gebracht und aus den Zellen oder dem Kulturüberstand in reiner Form gewonnen werden.

Claims

1. Verfahren zur qualitativen und quantitativen analytischen Erfassung des Schimmelpilzes Fusarium graminearum in Reinkulturen und in jeglichem Probenmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die enzymatische Aktivität des Enzyms Galaktose-Oxidase (EC 1.1.3.9), das durch Fusarium graminearum gebildet wird,
b) die Bindung von Antikörpern oder deren Derivaten an die Proteinstruktur dieses Enzyms und/oder
c) die Nukleotidsequenz des für dieses Enzym codierenden Genes alleine oder in Kombination zum gezielten Nachweis des Schimmelpilzes Fusarium graminearum eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Stoffe zugesetzt werden, die die Produktion des Enzyms Galaktose-Oxidase in Fusarium graminearum auf festen oder in flüssigen Wachstumsmedien anregen, und die Bildung des Enzyms mit Hilfe einer detektierbaren enzymatischen Reaktion direkt oder auch indirekt unter Verwendung einer oder mehrerer weiterer enzymatischer oder chemischer Reaktionen qualitativ oder quantitativ nachgewiesen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis der Aktivität von Galaktose-Oxidase ein Nachweisreagenz, bestehend aus Galaktose als Enzym-Substrat, Peroxidase als ein Enzym zur Umsetzung des Produktes der Galaktose-Oxidase sowie 3,5-Dichlor-2-hydroxysulfonsäure und 4-Amino-2,3- dimethyl-1-phenyl-3-pyrazolin-5-on als elektronenlieferndes Cosubstrat der Peroxidase, verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für den Nachweis des Pilzes Fusarium graminearum die Gesamtheit oder auch Teile der Nukleotidsequenz des Galaktose-Oxidase-Gen und seiner angrenzenden Regionen, wie sie in diesem Pilz oder auch in andersnamigen Pilzen, die sich eindeutig als zur Art Fusarium graminearum gehörig charakterisieren lassen, vorliegt, sowie aus diesem Gen durch enzymatische Reaktion in vivo oder in vitro abgeleitete RNA- und DNA-Sequenzen verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die strukturellen Eigenschaften des Enzyms Galaktose-Oxidase sowie seine Aminosäuresequenz oder deren Teile für die Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern jeglichen Subtyps benutzt werden und diese Antiköper als Serum, als Serumfraktion oder in gereinigter Form für den Nachweis von Fusarium graminearum mit Hilfe beliebiger Testformate eingesetzt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Gene oder Teile von Genen, die für Antikörper oder auch Teile von Antikörpern kodieren, die gegen Galaktose-Oxidase aus Fusarium graminearum gerichtet sind, auch wenn Teile dieser Gene gegenüber ihrer Ursprungssequenz künstlich verändert worden sind, in heterologer oder homologer Weise in anderen als den diese Antikörper sezernierenden Zellen zur Expression gebracht und für den Nachweis des Pilzes mit Hilfe beliebiger Testformate verwendet werden.