[go: up one dir, main page]

PL182212B1 - Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowychdo stosow ania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Fusarium oraz sposób ilosciow ego,kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL - Google Patents

Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowychdo stosow ania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Fusarium oraz sposób ilosciow ego,kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL

Info

Publication number
PL182212B1
PL182212B1 PL95342644A PL34264495A PL182212B1 PL 182212 B1 PL182212 B1 PL 182212B1 PL 95342644 A PL95342644 A PL 95342644A PL 34264495 A PL34264495 A PL 34264495A PL 182212 B1 PL182212 B1 PL 182212B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
type
nucleic acid
sequences
fungal
Prior art date
Application number
PL95342644A
Other languages
English (en)
Inventor
James M Ligon
James J Beck
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of PL182212B1 publication Critical patent/PL182212B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1. Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika wybrana z grupy zlozonej z SEK NR ID: 82, SEK NR ID: 83 i SEK NR ID: 84 oraz SEK NR ID: 85. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka DNA zawierająca sekwencję Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowy ch do stosowania w wykrywaniu bazującym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Fusarium oraz sposób ilościowego, kolorytmetrycznego wykrywania patogenów grzybowych.
Wynalazek jest stosowany do wykrywania patogenów grzybów przy zastosowaniu specyficznych dla poszczególnych gatunków starterów, w testach z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy. Użycie starterów umożliwia wykrywanie specyficznych izolatów patogenów grzybowych i śledzenie rozwoju choroby w populacji roślinnej.
Choroby roślin powodują z roku na rok istotne obniżenie plonów, prowadzące w rezultacie zarówno do zubożenia ekonomicznego rolników, jak i dodatkowo w wielu częściach świata do niedoborów w dostarczaniu żywności dla lokalnych populacji. Szerokie zastosowanie fungicydów dostarczyło znaczącej ochrony przeciw atakowi patogenów roślinnych. Jednakże pomimo wydatków na fungicydy równowartości 1 biliona $, światowe straty plonów wzrosły do około 10% wartości plonów w 1981 r. (James, 1981; Seed Sci. & Technol. 9: 679-685.
Ostrość procesu niszczącego choroby zależy od agresywności patogenu i odpowiedzi gospodarza. Jednym z celów większości programów hodowlanych jest zwiększenie odporności gospodarza roślinnego na chorobę. Typowo różne rodzaj e patogenów oddziały wuj ą w różny sposób z różnymi odmianami tego samego gatunku rośliny uprawnej, a wiele źródeł odporności gospodarza chroni jedynie przed określonymi rodzajami patogenu. Ponadto, niektóre rodzaje patogenów wykazują wczesne objawy choroby, ale powodująniewielkie zniszczenie plonów. Jones i Clifford (1983; Cereal Diseases, John Wiley) donoszą, że wzrost liczebności formy wirulentnej patogenu w populacji patogenu jest spodziewany w odpowiedzi na wprowadzenie oporności do
182 212 odmian hodowlanych gospodarza, a zatem jest konieczne śledzenie populacji patogenów. Dodatkowo istnieje szereg udokumentowanych przypadków ewolucji szczepów grzybowych, które są oporne na poszczególne fungicydy. Już w 1981 Fletcher i Wolfe (1981; Proc. 1981 Brit. Crop Prot. Conf.) zauważyli, że 24% populacji proszkowej pleśni z jęczmienia jarego i 53% z jęczmienia ozimego wykazywało znaczące różnice w odpowiedzi na fungicyd triadimenol oraz, że rozkład tych populacji jest zróżnicowany dla różnych odmian, przy czym naj bardziej podatna odmiana daje również najwyższy zasięg mniej wrażliwych rodzajów. Podobne zróżnicowanie wrażliwości grzybów na fimgicydy udokumentowano dla pleśni pszenicy (również na triadimenol), Botrytis (na benomyl), Pyrenophora (na związek rtęcioorganiczny), Pseudocercosporella (na fungicydy typu MBC) i Mycosphaerella fijiensis na triazole, żeby wspomnieć tylko kilka (Jones and Clifford; Cereal Diseases, John Wiley, 1983).
Zboża są uprawiane na całym świecie i reprezentują główną część produkcji spożywczej. Jakkolwiek straty w plonach są powodowane przez wiele patogenów, patogeny wywołujące nekrozę, Septoria i Pseudocercosporella, są szczególnie ważne w głównych obszarach uprawy zbóż Europy i Ameryki Północnej (Jones and Clifford; Cereal Diseases, John Wiley, 1983). W szczególności, rozmaitość objawów powodowanych przez różne izolaty i gatunki tych grzybów czyni bardzo trudnym dokładne przewidywanie potencjalnych strat powodowanych przez chorobę. W konsekwencji, dostępne ulepszone sposoby diagnozowania do szybkiej i dokładnej identyfikacji specyficznych patogenów będą bardzo przydatne dla badaczy patogenów upraw.
Cztery gatunki Septoria są pasożytami gatunków o małych ziarnach. Septoria tritici jest czynnikiem powodującym plamistość liści i jest wirulentny wobec pszenicy, ale również pasożytuje na pszenżycie i na życie. Typowo powoduje on nekrozę liści. Septoria nodorum jest czynnikiem sprawczym plamistości plewy kłosowej i jest pasożytem pszenicy, pszenżyta, żyta i jęczmienia i jakkolwiek głównie ogranicza się do plewy kłosowej, jest również znajdywany na liściach i osłonach liściowych. Septoria avenae jest pasożytem owsa, pszenicy i pszenżyta, a Septoria passerinii ogranicza się do jęczmienia. Choroby wywołane przez Septoria występują na wszystkich obszarach uprawy pszenicy mających znaczenie ekonomiczne. Różne choroby wywołane przez Septoria często występująna polach i na pojedynczych roślinach jednocześnie i określa się je jako „kompleks Septoria ”. Typowo, najczęściej występującymi gatunkami są S. tritici iS. nodorum. Według Wiese (1977; Compendiumof Wheat Diseases, Amer. Phytopath. Soc. strony 42-45), „kompleks Septoria ” w chwili obecnej niszczy rocznie około 2% światowej pszenicy, przy czym straty w plonach są wynikiem uszkodzonego wnętrza ziaren. Traktowanie fungicydami może uratować do 20% w przypadkach poważnych infekcji Septoria, ale czasami trudno jest odróżnić od siebie różne gatunki Septoria na początku infekcji i to czyni trudnym decyzję czy inwestować, czy też nie w użycie fungicydów ze względu na to, iż różne odmiany hodowlane wykazują różny stopień odporności na różne gatunki Septoria .
Choroba oczkowatej plamistości zbóż jest powodowana przez grzyba Pseudocercosporella herpotrichoides i ogranicza się do nasady łodygi rośliny. Pszenica, żyto, jęczmień i inne trawy są wrażliwe na oczko watąplamistość, która ma miejsce w chłodnych, wilgotnych klimatach i jest dominująca w Europie, Ameryce Północnej i Południowej, Afryce i Australii. Pszenica jest najbardziej podatnym gatunkiem zboża, ale zidentyfikowano izolaty wirulentne w stosunku do innych zbóż. Przykładowo szczepy R grzybów były również izolowane z żyta i rosły wolniej na pszenicy niż szczepy W, które były izolowane z pszenicy. Jakkolwiek oczkowata plamistość może całkowicie zabijać pędy korzeniowe lub rośliny, częściej powoduje kładzenie się i/lub prowadzi do zmniejszenia rozmiaru i ilości ziarna. Straty plonów związane z oczko watą plamistością są nawet większych rozmiarów niż te związane z Septoria tritici i Septoria nodorum. Typowa kontrola brana pod uwagę przy oczkowatej plamistości obejmuje traktowanie regulatorami wzrostu dla wzmocnienia między węźli i działanie fungicydami. Jednakże różna podatność odmian hodowlanych na różne szczepy grzybów czyni przewidywanie skuteczności działania fungicydami trudnym.
Sigatoka - plamistość liści bananowca występuje w dwóch formach, z których każda jest powodowana przez innego grzyba. Ważna z punktu widzenia ekonomicznego Sigatoka Czarna
182 212 jest powodowana przez Mycosphaerella fijiensis , podczas gdy mniej znacząca Sigatoka Żółta jest powodowana przez Mycosphaerella musicola (Johanson i Jeger, 1993; Mycol. Res. 97: 670-674). Sigatoka Czarna stanowi największy problem przy uprawie bananów, powodując poważne 30% i wyższe straty. Z powodu występowania u Mycosphaerella fijiensis oporności na fungicydy, użycie fungicydów powinno być ograniczone dla zapobiegania dalszego rozprzestrzeniania się oporności. W konsekwencji, dostępność narzędzi diagnostycznych dostarczy ważnych środków do identyfikacji odpowiednich warunków stosowania fungicydów, bez konieczności ryzykowania rozwoju dalszej oporności.
A zatem istnieje realna potrzeba rozwoju technologii, która pozwoli na identyfikację specyficznych rodzajów patogenów grzybów we wczesnym etapie procesu infekcji. Poprzez identyfikację specyficznych rodzajów patogenu, zanim pojawią się wyraźne symptomy choroby w uprawach, rolnik może oszacować prawdopodobne skutki dalszego rozwoju patogenu w odmianie uprawy, w której został on zidentyfikowany i wybrać odpowiedni fungicyd, jeżeli takie stosowanie uzna się za konieczne.
Zgodnie z wynalazkiem izolowana cząsteczka DNA zawiera sekwencję Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika wybraną z grupy, obejmującej SEK NR ID: 82, SEK NR ID: 83 i SEK NR ID: 84 oraz SEK NR ID: 85.
Zgodnie z wynalazkiem starter oligonukleotydowy do stosowania w wykrywaniu bazującym na powielaniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika jest wybrany z grupy obejmującej SEK NR ID: 53do 65.
Para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu bazującym na powielaniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika jest, zgodnie z wynalazkiem wybrana z SEK NR ID: 53 do 65 oraz SEK NR ID: 38 do 41.
Korzystnie para starterów oligonukleotydowych według wynalazku jest wybrana z następujących par starterów:
SEK NR ID: 53 i SEK NR ID: 41,
SEK NR ID: 53 i SEK NR ID: 59,
SEK NR ID: 56 i SEK NR ID: 41,
SEK NR ID: 56 i SEK NR ID: 59
SEK NR ID: 38 i SEK NR ID: 59,
SEK NR ID: 53 i SEK NR ID: 58,
SEK NR ID: 56 i SEK NR ID: 58,
SEK NR ID: 57 i SEK NR ID: 41,
SEK NR ID: 57 i SEK NR ID: 58,
SEK NR ID: 57 i SEK NR ID: 65,
SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 41,
SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 58,
SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 59,
SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 65,
SEK NR ID: 55 i SEK NR ID: 41,
SEK NR ID: 55 i SEK NR ID: 58,
SEK NR ID: 55 i SEK NR ID: 59,
SEK NR ID: 63 i SEK NR ID: 41,
SEK NR ID: 63 i SEK NR ID: 65,
SEK NR ID: 64 i SEK NR ID: 41,
SEK NR ID: 64 i SEK NR ID: 58,
SEK NR ID: 64 i SEK NR ID: 65,
SEK NR ID: 38 i SEK NR ID: 58,
SEK NR ID: 38 i SEK NR ID: 65,
SEK NR ID: 38 i SEK NR ID: 62,
SEK NR ID: 56 i SEK NR ID: 62,
SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 62,
182 212
SEK NR ID: 61 i SEK NR ID: 41 oraz
SEK NR ID: 61 i SEK NR ID: 59.
Sposób wykrywania patogenu grzybowego według wynalazku charakteryzuje się tym, że (a) izoluje się DNA z liścia zainfekowanego patogenem, (b) powiela się część regionu Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika takiego patogenu przy zastosowaniu tego DNA jako matrycy w reakcji łańcuchowej polimerazy z parą starterów wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID: 53 do 65 oraz SEK NR ID: 38 do 41 i następnie (c) wizualizuje się tak powieloną część regionu Transkrybowanego Wewnętrznego Przerywnika.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się patogen grzybowy wybrany spośród Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium moniliforme i Microdochium nivale.
Zestaw do wykrywania Fusarium według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera nośnik umieszczony w bliskim sąsiedztwie jednego lub większej liczby pojemniczków, z których jeden zawiera starter wybrany z grupy obejmującej SEKNR ID: 53 do 65oraz SEKNR ID: 38 do 41.
Sposób ilościowego, kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych, według wynalazku charakteryzuje się tym, że (a) izoluje się DNA z liścia rośliny zainfekowanej patogenem grzybowym, (b) powiela się w reakcji łańcuchowej polimerazy część sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika tego patogenu grzybowego zastosowanej jako matryca z parą starterów wybranych z grupy obejmującej SEK NR ID: 53 do 65 oraz SEK NR ID: 38 do 41, jako starterów diagnostycznych i następnie (c) wizualizuje się powieloną część regionu Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika przy zastosowaniu startera wyłapującego wybranego z grupy, obejmującej SEK NR ID: 19, 20, 39 i 66-81.
Wynalazek jest stosowany do identyfikacji różnych typów patogenów wśród grzybów patogennych dla roślin. Sekwencje DNA, które wykazują zróżnicowanie pomiędzy różnymi typami grzybowych patogenów, mogąbyć stosowane przy wytwarzaniu starterów do zastosowania w testach diagnostycznych, opierających się na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Startery te wytwarzają unikalne fragmenty w reakcjach PCR, w których matrycowy DNA jest dostarczany przez specyficzne rodzaje patogenów grzybowych i mogąbyć zatem użyte do identyfikacji obecności lub braku obecności specyficznych rodzajów patogenów w materiale z gospodarza roślinnego zanim pojawią się objawy choroby.
Zidentyfikowanie rodzaju patogenu w materiale z gospodarza roślinnego pozwala na ocenę potencjalnego uszkodzenia przy oddziaływaniu specyficznej odmiany rośliny uprawnej z patogenem i rozsądnego zastosowania szerokiego asortymentu dostępnych fungicydów. Ponadto, pozwala na uzyskanie szczegółowej informacji o rozwoju i rozprzestrzenianiu się specyficznych rodzajów patogenu na rozległych obszarach geograficznych. Sposób wykrywania patogenu grzybowego według wynalazku jest szczególnie przydatny przy chorobach z długą fazą utajoną, takich j ak te wywoływane przez Septoria nodorum lub Septoria tritici u pszenicy i Mycospharella fijiensis u bananowców. Szczególnie też przydatne są zestawy do wykrywania patogenów, według wynalazku, szczególnie przy identyfikacji patogenów: Septoria , Pseudocercosporella, Fusarium i Mycosphaerella.
Opis figur:
Figura 1. Zestawienie Wewnętrznych Transkrybowanych Sekwencji z Septoria tritici, Septoria nodorum, Pseudocercosporella herpotrichoides szczep W (dwa warianty), Pseudocercosporella herpotrichoides szczep R, Mycosphaerellafijiensis oraz Mycosphaerella musicola.
Figura 2. Zestawienie Wewnętrznych Transkrybowanych Sekwencji z Septoria nodorum i Septoria avenae f.sp. triticea.
Figura 3. Zestawienie Wewnętrznych Transkrybowanych Sekwencji z Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium moniliforme i Microdochium nivale.
Unikalne sekwencje DNA, według wynalazku, są stosowane przy identyfikacji różnych rodzajów patogenów wśród grzybów patogennych dla roślin, w szczególności są stosowane jako
182 212 startery w analizie opartej o PCR. Sekwencje DNA według wynalazku obejmują Wewnętrzny Transkrybowany Przerywnik (ITS, ang. Intemal Transcribed Spacer) z regionów genu dla rybosomaInego RNA z poszczególnych patogenów. Te sekwencje DNA ITS z różnych typów patogenów w obrębie gatunku lub rodzaju różniąsię między różnymi przedstawicielami gatunków lub rodzajów i z tego powodu, mogąbyć stosowane do identyfikacji tych poszczególnych przedstawicieli.
Badacze w dziedzinie biomedycyny stosowali techniki opierające się o PCR od pewnego czasu i z umiarkowanymi sukcesami przy wykrywaniu patogenów w zainfekowanych tkankach zwierzęcych. Jednakże dopiero ostatnio technika ta została zastosowana do wykrywania patogenów roślin. Obecność Gaumannomyces graminis w zainfekowanej pszenicy została wykryta przy zastosowaniu reakcji PCR dla sekwencji specyficznych dla genomu mitochondrialnego patogenu (Schlesser i wsp., 1991, Applied and Environ. Microbiol. 57: 553-556), a wzór uzyskany dla losowo powielonego polimorficznego DNA (tj. RAPD, ang. random amplified polymorphic DNA) umożliwił rozróżnienie różnych typów Gremmeniella abietina, sezonowego czynnika stwardniałych narośli rakowatych u drzew iglastych.
Geny rybosomalne są odpowiednie do zastosowania jako sekwencje docelowe dla sond molekularnych z powodu ich wysokiej liczby kopii. Pomimo dużego stopnia konserwacji między sekwencjami dojrzałego rRNA, nie transkrybowane i transkrybowane sekwencje przerywników są zwykle słabo konserwowane, a zatem są odpowiednimi sekwencjami docelowymi dla wykrywania zróżnicowania mającego miejsce na niedawnym etapie ewolucji. Grzybowe geny rRNA są zorganizowane w jednostki, z których każda koduje trzy dojrzałe podjednostki odpowiednio, 18S, 5.85 i 28S. Podjednostki te są rozdzielone przez dwa wewnętrzne transkrybowane przerywniki, ITS1 i ITS2, o długości około 300 bp (White et al., 1990, W: PCR Protocols; Eds.: Innes et al.; strony 315-322). Dodatkowo, jednostki transkrypcyjne są oddzielone poprzez nie transkrybowane sekwencje przerywników (NTS, ang. non-transctibed spacer). Sekwencje ITS i NTS są szczególnie przydatne do wykrywania specyficznych rodzajów różnych grzybowych patogenów.
Sekwencje DNA według wynalazku pochodząz Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika (ITS) z regionu genu dla rybosomalnego RNA. Sekwencje DNA z różnych typów patogenów w obrębie gatunków lub rodzajów patogenów różnią się pomiędzy różnymi przedstawicielami rodzaju lub gatunku. Kiedy sekwencje ITS patogenu zostajązidentyfikowane, sekwencje te mogąbyć zestawione z innymi sekwencjami ITS. W ten sposób na podstawie sekwencji ITS można utworzyć startery. To znaczy, startery mogąbyć zaplanowane w oparciu o te regiony w obrębie regionów ITS, które zawierająnajwiększe różnice w sekwencji pomiędzy typami patogenów grzybowych. Sekwencje te i startery opierające się na tych sekwencjach mogą być stosowane do identyfikacji specyficznych przedstawicieli patogenów.
Konkretne sekwencje DNA będące przedmiotem zainteresowania obejmują sekwencje DNA ITS z Septoria, a w szczególności Septoria nodorum i Septoria tritici\ Mycosphaerella, szczególnie Mycosphaerella fijiensis i Mycosphaerella musicola ; Pseudocercosphorella, dokładniej Pseudocercosporella herpotrichoides, ajeszcze dokładniej ze szczepu W i szczepu R Pseudocercosporella herpotrichoides, Fusarium, a w szczególności F. graminearum, F. culmorum, F. moniliforme i Microdochium nivale. Takie sekwencje DNA ITS, jak również startery będące przedmiotem zainteresowania, są podane w SEK NR ID: 1-47 oraz SEK NR ID: 50-86. Sekwencje znajdują zastosowanie przy identyfikacji w oparciu o PCR typów patogenów będących przedmiotem zainteresowania.
Sposoby stosowania sekwencji starterów według wynalazku są dobrze znane w tej dziedzinie. Przykładowo, patrz Patenty USA Nr 4,683,195 i 4,683,202, jak również Schlesser i wsp. (1991) Applied and Environ. Microbiol. 57:553-556. Patrz również, Nazar i wsp. (1991; Physiol. and Molec. Plant Pathol. 39:1-11), który stosuje powielanie przy użyciu PRC dla zbadania różnic w regionach ITS Verticillium albo-atrum i Verticillium dahliae, a zatem rozróżnienia pomiędzy dwoma gatunkami; oraz Johanson i Jeger (1993; Mycol. Res. 97: 670-674), którzy zastosowali podobny sposób dla rozróżnienia patogenów bananowca Mycosphaerella fijiensis i Mycospharella musicola.
182 212
Sekwencje DNA ITS według wynalazku mogą być klonowane z grzybowych patogenów metodami znanymi w tej dziedzinie. W ogólności znane są sposoby izolowania DNA z izolatów grzybów. Patrz, Raeder & Broda (1985) Letters in Applied Microbiology 2: 17-20; Lee i wsp. 1990) Fungal GeneticsNewsletter 35:23-24; i Lee i Taylor (1990) W: PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications, Innes et al. (Eds); strony 282-287. Alternatywnie, regiony ITS będące przedmiotem zainteresowania mogą być ustalone poprzez powielanie PCR. Startery do powielania całego regionu ITS zostały zaprojektowane zgodnie z White i wsp. (1990; W: PCR Protocols; Eds.: Innes et al. pages 315-322), a zwielokrotnione sekwencje ITS były klonowane w wektorze do klonowania pCRII. Klonowane sekwencje obejmowały lewy ITS (ITS 1), prawy ITS (ITS2), jak również centralnie położony gen 5,8S rRNA. Zostało to przeprowadzone dla Septoria nodorum i Septoria tritici; licznych izolatów Pseudocercosporella i Mycosphaerellafijiensis, Mycosphaerella musicola ; Septoria avenae triticea, E graminearum, F. culmorum, F. moniliforme oraz Microdochium nivale.
Sekwencje ITS zostały ustalone i sekwencje w obrębie każdej grupy patogenu porównano celem zlokalizowania różnic, które mogłyby być użyteczne przy testowaniu różnych gatunków lub/i szczepów z zastosowaniem PCR. Sekwencje regionów ITS, które zostały ustalone, sąpokazane jako Sekwencje o NR ID od 1 do 6,47 i 82-86, a także na figurach 1,2 i 3. Na podstawie identyfikacji różnic, dokonano syntezy licznych starterów i testowano je w reakcji powielania PCR. Matrycami stosowanymi przy testowaniu powielania poprzez PCR były, najpierw oczyszczony DNA patogenu, a potem DNA izolowany z zainfekowanej tkanki gospodarza roślinnego. A zatem było możliwe zidentyfikowanie pary starterów, które były diagnostyczne, to jest które identyfikowały jeden specyficzny gatunek lub szczep patogenu, ale nie inny gatunek lub szczep tego samego patogenu. Korzystna kombinacja starterów była w stanie odróżnić dwa różne gatunki lub szczepy w zainfekowanej tkance gospodarza tj. tkance gospodarza, która była uprzednio infekowana specyficznym gatunkiem lub szczepem.
Wynalazek dostarcza licznych kombinacji starterów, które spełniają to kryterium dla różnych gatunków Septoria, Mycosphaerella i Fusarium oraz różnych szczepów Pseudocercosporella. Startery według wynalazku są zaprojektowane w oparciu o różnice sekwencji pomiędzy grzybowymi regionami ITS. Różnica przynajmniej jednej pary zasad pomiędzy sekwencjami pozwala na zaprojektowanie rozróżniającego startera. Startery zaprojektowane dla specyficznych regionów ITS z grzybowego DNA mogą być stosowane w kombinacji ze starterem utworzonym dla regionu o sekwencji konserwowanej w obrębie regionu, kodującego rybosomalne DNA, celem powielania poprzez PCR fragmentów specyficznych gatunkowo. Generalnie, startery powinny mieć teoretyczną temperaturę topnienia pomiędzy około 60 do około 70 stopni C dla osiągnięcia dobrej czułości i nie powinny posiadać znaczących struktur drugorzędowych, a także końce 3' w kombinacji starterów nie powinny na siebie zachodzić. Startery mają na ogół długość około 5 do 10 nukleotydów.
Przydatność sklonowanych sekwencji ITS przy wyborze starterów do celów diagnostycznych wynika w dużej mierze z ich szybkiego różnicowania się w czasie ewolucji. Przykładowo, stwierdzono, że izolaty typu W i R patogenu Pseudocercosporella herpotrichoides mają zróżnicowane sekwencje ITS, na podstawie czego opracowano diagnostyczne startery. Jednakże, szybkie powstawanie różnic w obrębie sekwencji ITS jest wyraźne także na podstawie obserwacji, że zidentyfikowano dwa warianty sekwencji typu W. Identyczność sekwencji w obrębie typu W była 99,4%, podczas gdy pomiędzy typami W i R była 98,6% sugerując bliższy związek ewolucyjny pomiędzy dwoma wariantami W, niż stwierdzony między typami W i R. Ten bliższy związek jest również widoczny z podobnej patogenności dla gospodarza dwóch izolatów z odmiennymi sekwencjami ITS.
Dodatkowo, oprócz opracowania na podstawie sekwencji pochodzących z ITS starterów dla diagnozowania izolatów grzybowych opartych o PCR, wynalazek obejmuje również identyfikację starterów z bibliotek starterów RAPD, które, gdy są zastosowane w reakcji PCR, mogą
182 212 rozróżniać pomiędzy Septoria nodorum i Septoria tritici. Przeszukiwane startery są handlowo dostępne i były otrzymane z Operon Technologies Incorporated (Alameda, CA). Przeszukiwanie genomowego DNA Septoria doprowadziło do zidentyfikowania dwóch starterów, które miały zdolność wykrywania jedynie S. tritici i trzech, które były zdolne do wykrywania tylko S. nodorum .
Zidentyfikowanie starterów pozwala na wytworzenie „zestawów”, zawierających elementy niezbędne do przeprowadzenia procesu identyfikacji. Takie zestawy zawierająnośnik umieszczony tak, aby w bliskości znalazł się jeden lub więcej pojemniczków, korzystnie takich jak probówki czy buteleczki. Jeden z takich pojemniczków zawiera niewyznakowane lub możliwe do wykrycia wyznakowane startery DNA. Startery są obecne w postaci zliofilizowanej lub, jeżeli trzeba, znajdują się w odpowiednim buforze. Jeden lub więcej pojemniczków może zawierać jeden lub więcej enzymów lub odczynników, które mająbyć zastosowane w reakcjach PCR. Enzymy te mogą być obecne same lub w mieszaninach, w postaci zliofilizowanej lub w odpowiednich buforach.
Wreszcie zestaw może zawierać wszystkie dodatkowe elementy, konieczne do przeprowadzenia sposobu według wynalazku, takie jak bufory, odczynniki do ekstrakcji, enzymy, pipety, płytki, kwasy nukleinowe, trifosforany nukleotydów, bibułę filtracyjną, materiały do żeli, materiały do przenoszenia na filtry, materiały do autoradiografii i temu podobne.
Poniższe przykłady pokazują, bez ograniczenia, typowe protokoły doświadczalne, które mogą być stosowane przy izolacji sekwencji ITS, wyborze odpowiednich sekwencji starterów, testowania starterów pod kątem skuteczności selektywnej i diagnostycznej oraz zastosowanie takich starterów do wykrywania choroby i izolatu grzybowego. Takie przykłady są przedstawione celem zilustrowania, a nie ograniczenia wynalazku.
Przykłady
Przykład 1. Izolaty grzybowe i ekstrakcja genomowego DNA
Żywotne izolaty grzybowe S. nodorum , S. tritici, S. passerini, S. glycines, Pseudocercosporella herpotrichoides, Pseudocercosporella aestiva, Mycosphaerella citri, Mycosphaerella graminicola, Mycosphaerella fijiensis i Mycospaerella musicola otrzymano z kolekcji American Type Culture Collection. Izolaty Fusarium culmorum i Fusarium graminearum otrzymano od Dr Paula Nelsona z Uniwersytetu Penn State. Izolat z Michrodochium nivale (syn. Fusarium nivale) został otrzymany z Ciba-Basel, a izolat Fusarium moniliforme został otrzymany od Dr Loral Castor. Grzyby hodowano w 150 ml podłoża Potato Dextrose Broth zaszczepionego fragmentami grzybni z hodowli na PDA (Potato Dextrose Agar). Hodowle inkubowano w orbitalnej wytrząsarce w 28°C przez 7-11 dni. Grzybnie były osadzane poprzez wirowanie, a następnie mielone w ciekłym azocie i totalny DNA genomowy ekstrahowany przy zastosowaniu protokołu według Lee i Taylor (1990; W: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications; Wyd.: Innes et al.; strony 282-287).
Dr Bruce McDonald z Uniwersytetu Teksas A&M dostarczył genomowy DNA z 10 izolatów 5. nodorum i dziewięciu izolatów 5. tritici. Dr Chris Caten z Uniwersytetu Birmingham dostarczył sześciu oczyszczonych grzybowych DNA z izolatów Septoria nodorum. Oczyszczony genomowy DNA z 12 izolatów Pseudocercosporella herpotrichoides otrzymano od Dr Paula Nicholsona z John Innes Centre, Norwich, Wielka Brytania. Sześć z tych izolatów było typu W; pozostałe sześć izolatów było typu R. Izolaty te były typowane na podstawie patogenności i badań RFLP. Andrea Johanson z Natural Resources Institute dostarczyła DNA genomowy z sześciu izolatów M. musicola, sześciu izolatów M. fijiensis i jednego izolatu z Mycosphaerella musae. Oczyszczony DNA genomowy z Septoria avenae f. sp. triticea ATCC#263 80 był dostarczony przez Dr Petera Uenga z USDA w Beltsville, Maryland.
182 212
Tabela 1
Źródło testowanych izolatów
Izolat Gatunek Pochodzenie Źródło
ATCC#24425 S. nodorum Montana ATCC 1
ΧΑΙ.1 S. nodorum Teksas B. McDonald2
XaSA.2 S. nodorum Teksas B. McDonald
YA3.1 S. nodorum Teksas B. McDonald
XD2.1 S. nodorum Teksas B. McDonald
YB2.2 S. nodorum Teksas B. McDonald
93HBh6a S. nodorum Oregon B. McDonald
93A3a S. nodorum Oregon B. McDonald
93AYa S. nodorum Oregon B. McDonald
93HBh8a S. nodorum Oregon B. McDonald
93C5a S. nodorum Oregon B. McDonald
ATCC#26517 S.tritici Minnesota ATCC
BS3 S. nodorum Irlandia C. Caten3
BS6 S.nodorum Irlandia C. Caten
BS 175 S. nodorum Anglia C. Caten
B5425 S.nodorum Anglia C. Caten
alpha'5 S.nodorum Francja C. Caten
m300 S.nodorum Anglia C. Caten
TKV2a S.tritici Turcja B. McDonald
SYK2 S.tritici Syria B. McDonald
ISZC36.2 S.tritici Izrael B. McDonald
CNRC4a.1 S. tritici Kanada B. McDonald
ALAIa S.tritici Algieria B. McDonald
ETKI S. tritici Etiopia B. McDonald
GEB2a.1 S. tritici Niemcy B. McDonald
UK92D2 S. tritici Wlk.Brytania B. McDonald
DNB 1 a S. tritici Dania B. McDonald
ATCC#38699 S.glycines Illinois ATCC
182 212 cd. tabeli 1
ATCC#22585 S.passerini Minnesota ATCC
ATCC#42040 P.herpotnchoides-pszenica ATCC
ATCC#62012 P.aestiva Niemcy ATCC
ATCC#60972 P.herp. var. herp. -jęczmień Niemcy ATCC
W 1 P.herpotrichoides Wlk.Brytania P. Nicholson4
W2 P.herpotrichoides Wlk.Brytania P. Nicholson
W3 P. herpotrichoides Wlk.Brytania P. Nicholson
W4 P.herpotrichoides Wlk.Brytania P. Nicholson
W5 P. herpotrichoides Nowa Zelandia P.Nicholson
W6 P. herpotrichoides Włochy P. Nicholson
R1 P. herpotrichoides Belgia P. Nicholson
R2 P. herpotrichoides Nowa Zelandia P. Nicholson
R3 P. herpotrichoides Niemcy P. Nicholson
R4 P.herpotrichoides Szwecja P. Nicholson
R5 P. herpotrichoides Wlk.Brytania P. Nicholson
R6 P.herpotrichoides Wlk.Brytania P. Nicholson
ATCC#22116 M. fijiensis Filipiny ATCC
ATCC#22115 M. musicola Filipiny ATCC
ATCC#24046 M.citri Floryda ATCC
ATCC#62714 M.graminicola Montana ATCC
PA92 M. fijiensis Panama A. Johanson5
PNG291 M. fijiensis Papua Nowa Gwinea A.Johanson
GH6-3 M. fijiensis Ghana A.Johanson
TG 120 M. fijiensis Tonga A.Johanson
HSB4 M. fijiensis Honduras A. Johanson
RT689 M. fijiensis Rarotonga Wyspy Cook'a A.Johanson
CR548 M. musicola Kosta Rica A.Johanson
CM61 M. musicola Kamerun A. Johanson
CU823 M. musicola Kuba A.Johanson
MQ 103 M. musicola Martynika A.Johanson
CI31 M. musicola Wybrzeże Kości Słoniowej A.Johanson
182 212 cd. tabeli 1
CB90 M. musicola Kolumbia A. Johanson
BD1-4 M.musae Barbados A. Johanson
ATCC#44234 Ceratobasidium cereale Holandia ATCC
ATCC#11404 Drechslera sorokiniana Minnesota ATCC
R-5126 F.culmorum Minnesota P. Nelson6
R-5106 F.culmorum Michigan P. Nelson
R-5146 F.culmorum Finlandia P. Nelson
R-8417 F.graminearum Włochy P. Nelson
R-8422 F.graminearum Kanada P. Nelson
R-8546 F.graminearum Bułgaria P. Nelson
4551 F.moniliforme Indiana L. Castor7
92 M.nivale ----- Ciba Basel8
ATCC#26380 S.avenae f.sp.triticea Minnesota P. Ueng9
1 Kolekcja American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA 2 Dr. Bruce McDonald, Uniwersytet Teksas A&M, USA 3 Dr Chris Caten, Uniwersytet Birmingham, UK 4 Dr Paul Nicholson, John Innes Centre, UK 5 Dr Andrea Johanson, Natural Resources Institute, UK 6 Dr Paul Nelson, Uniwersytet Penn State 7 Dr Loral Castor, Ciba Seeds Research, Bloomington, Illinois 8 Ciba-Geigy Limited, Basel, Switzerland 9 Dr Peter Ueng, USDA, Beltsville, Maryland
Przykład 2. Izolacja regionów wewnętrznego transkrybowanego przerywnika (ITS).
Fragmenty regionu wewnętrznego transkrybowanego przerywnika o długości około 550 bp były powielane poprzez reakcję PCR z 25 ng DNA genomowego wyizolowanego z S. nodorum (ATCC#24425), S. tritici (ATCC#26517), izolatów Rl, R2, W2 i W5 z Pseudocercosporella herpotrichoides, M. fijiensis (ATCC&22115) oraz M. musicola (ATCC#22115) przy zastosowaniu 50pmoli startera ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'; SEK NR ID: 38) iITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'; SEK NR ID: 41). Reakcje PCR wykonywano jak opisano w przykładzie 4, z tą różnicą, że reakcje przeprowadzano w 100 μΐ, a przyłączenie starterów przeprowadzano w 50°Ć. Fragmenty ITS oczyszczano poprzez wytrącanie izopropanolem według Maniatis i wsp. (1982; Molecular Cloning; Wyd.: Maniatis et. al.; strony 461-462). DNA zawieszano w 50 μΐ dH2O i klonowano, stosując zestaw TA Cloning Kit (part no. K2000-O1) z Invitrogen Corporation's (San Diego, CA) z użyciem wektora do klonowania pCRII. Sekwencje DNA regionów ITS ustalano poprzez zastosowanie metody dideoksy z użyciem automatycznego urządzenia do sekwencjonowania firmy Applied Biosystems (Foster City, CA), model 373A, oraz starterów ITS1 (patrz sekwencja powyżej), ITS2 (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'; SEK NR ID: 39), ITS4 (patrz sekwencja powyżej) oraz starterów Ml3:
uniwersalnego -20 (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'; SEK NR ID: 48) i Reverse (5'-AACAGCTATGACCATG-3'; SEK NR ID: 49).
Startery dlaITS: ITS1 (SEKNR ID: 38), ITS2 (SEK NR ID: 39), ITS3 (SEKNR ID: 40) i ITS4 (SEK NR ID: 41) używane do klonowania regionów ITS są wyszczególnione w White i wsp. (1990; W: PCR Protocols; Eds.: Innes i wsp., str. 315-322).
182 212
Dodatkowo, regiony wewnętrznego transkrybowanego przerywnika były powielane poprzez reakcję PCR z 25 ng genomowego DNA z S. avenae f. sp. triticea, M. nivale, F. moniliforme (#4551), izolatów R-8417, R-8546 i R-8422 F. graminearum oraz izolatów R-5126, R- 5106 i R-5146 F. culmorum. Produkty PCR oczyszczano stosując zestaw Promega Wizard DNA Clean-up (Madison, WI). Sekwencje DNA regionów ITS ustalano, jak opisano powyżej, używając starterów ITS1 (SEKNRID: 38), ITS2 (SEKNRID: 39), ITS3 (SEKNRID: 40) i ITS4 (SEK NR ID: 41). Reakcje sekwencjonowania były kombinowane z trzema izolatami pochodzącymi z F. culmorum i F. graminearum dla ustalenia sekwencji największej zgodności dla F. culmorum i F. graminearum.
Przykład 3. Ekstrakcja DNA z liści pszenicy i bananowca
DNA ekstrahowano z liści pszenicy stosując zmodyfikowaną wersję protokołu Rapid DNA Extraction z zestawu IsoQuick Nucleic Acid Extraction Kit (cat# ΜΧΤ-020-100) firmy MicroProbe Corporation's (Garden Grove, CA). Typowa wydajność wynosiła 5-10 pg całkowitego DNA z 0,2 g tkanki liściowej. W każdym teście PCR używano około 100 ng całkowitego DNA.
Zmodyfikowana szybka ekstrakcja DNA:
Przed zastosowaniem zestawu po raz pierwszy, całą zawartość odczynnika Reagent 2 A (20 x Dye Concentrate) dodawano do odczynnika Reagent 2 (Extraction Matrix).
(1) Około 0,2 g próbki liścia dodawano do 1,5 ml probówki Eppendorfa, zawierającej 50 μΐ buforu A i 50 μΐ roztworu do lizy #1. Próbka liścia była rozdrabniana w moździeżu Kontes.
(2) Odczynnik 2 (Reagent 2; Extraction Matrix) był energicznie mieszany. 350 μΐ odczynnika 2 dodawano do lizatu próbki.
(3) Do próbki dodawano 200 μΐ odczynnika 3 (Reagent 3; Extraction Buffer). Próbka była mieszana na worteksie przez 20 sek.
(4) Wirowanie w mikrowirówce przy 12000 x g przez 5 min.
(5) Fazę wodną (górną warstwę) przenoszono do nowej probówki do mikrowirówki. Objętość wynosiła zwykle około 200 μΐ.
(6) Do fazy wodnej dodawano 0,1 x objętość fazy wodnej odczynnika 4 (Reagnet 4; Sodium Acetate).
(7) Do fazy wodnej dodawano równą objętość izopropanolu, po czym próbkę mieszano na worteksie.
(8) Wirowanie w mikrowirówce przy 12000 x g przez 10 min.
(9) Supematant odrzucano nie naruszając osadu kwasu nukleinowego. Do osadu dodawano 0,5 ml 70% etanolu o temp. -20°C. Probówki były mieszane na worteksie.
(10) Wirowanie w mikrowirówce przy 12000 x g przez 5 min.
(11) Supematant odrzucano, a osad pozostawiano do wyschnięcia.
(12) Osad kwasu nukleinowego rozpuszczano w 50 μΐ odczynnika 5 (Reagnet 5; RNasefree water).
Przykład 4. Powielanie DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy
Reakcje łańcuchowe polimerazy prowadzono przy użyciu zestawu GeneAmp Kit z firmy Perkin-Elmer/Cetus (Norwalk, CT; nr kat. N808-0009), stosując 50 mM KC1,2,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, zawierający 100 μΜ każdego: TTP, dATP, dCTP i dGTP, 50 pM startera, 2,5 jednostek polimerazy Taq i 25 ng genomowego DNA w końcowej objętości 50 μΐ. Reakcje prowadzono przez 30 cykli: 15 sek w 94°C, 15 sek w 50°C, 60°C lub 70°C i 45 sek w 72°C w termocyklerze firmy PerkinElmer/Cetus Model 9600. Produkty analizowano poprzez nakładanie 20 μΐ każdej próbki PCR na 1,1-1,2% żel agarozowy i przeprowadzenie elektroforezy.
Przykład 5. Synteza i oczyszczanie oligonukleotydów
Oligonukleotydy (startery) były syntetyzowane w syntetyzatorze DNA Applied Biosystems 380A przy użyciu chemii β-cyjanotylo-fosforamidytu.
Przykład 6. Wybór starterów specyficznych gatunkowo
Zestawiono sekwencje ITS S. nodorum, S. tritici, szczepów R i W P. herpotrichoides, M. fijiensis i M. musicola. (fig. 1). Zestawiono sekwencje ITS S. nodorum i S. avenae. triticea (fig. 2). Zestawienie zostało również wykonane dla sekwencji ITS E graminearum, F culmorum,
182 212
F. moniliforme oraz M. nivale (fig. 3). Zestaw starterów zsyntetyzowano zgodnie z przykładem 5, w oparciu o analizę zestawionych sekwencji. Zaprojektowano startery dla regionów, zawierających największe różnice sekwencji pomiędzy gatunkami grzybów z figur 1-2. Na figurze 3 przedstawiono zaprojektowane startery dla regionów o najwyższej homologii w obrębie ITS dla Fusarium. Ponadto zsyntetyzowano opublikowane, specyficzne dla rybosomalnych genów, startery ITS 1 (SEK NR ID: 38), ITS2 (SEK NR ID: 39), ITS3 (SEK NR ID: 40) i ITS4 (SEK NR ID: 41) (White i wsp., 1990; W: PCR Protocols; Wyd.: Innes i wsp., strony 315-322) celem wykonania testu w kombinacji ze starterami specyficznymi dla regionu ITS.
Tabela 2 Zaprojektowane startery do wykrywania grzybów
Matryca dla startera Nazwa Sekwencja startera startera
S. nodorum JB433 5' ACACTCAGTAGTTTACTACT 3' (SEK NR 1D: 7)
S. nodorum JB434 5' TGTGCTGCGCTTCAATA 3' (SEK NR ID: 8)
S. nodorum JB525 5' GCGACTTGTGCTGCGCTTCAATA 3' (SEK NR ID: 9)
S. nodorum JB527 5' CATTACACTCAGTAGTTTACTACT 3' (SEK NR ID:10)
S. tritici JB445 5' CTGCGTCGGAGTTTACG 3' (SEK NR ID:11)
S. tritici JB446 5' CGAGGCTGGAGTGGTGT 3' (SEK NR ID:12)
S. tritici JB526 5’ CCCAGCGAGGCTGGAGTGGTGT 3' (SEK NR ID: 13)
P. herp. P. herp. P. herp. P. herp. P. herp. JB536 5' CTGGGGGCTACCCTACTTGGTAG 3' (SEK NR ID: 14) JB537 5’ GGGGGCTACCCTACTTGGTAG 3' (SEK NR ID: 15) JB538 5' ACTTGGTAGGGTTTAGAGTCGTCA 3' (SEK NR ID: 16) JB539 5' CTTCGGTAAGGTTTAGAGTCGTCG 3' (SEK NR ID: 17) JB540 5' GGGGGCCACCCTACTTCGGTAA 3' (SEK NR ID:18)
P. herp. P. herp. P. herp. P. herp. JB541 5' CCACTGAI I I IAGAGGCCGCGAG 3' (SEK NR ID: 19) JB542 5' CCACTGAI I I IAGAGGCCGCGAA 3' (SEK NR ID: 20) JB543 5' CCTGTAAAAAATTGGGGGTTA 3' (SEK NR ID: 21) JB544 5' CCTGTAAAAAATTGGGGGTTG 3' (SEK NR ID: 22)
M. fijiensis M. fijiensis M. fijiensis M. fijiensis M. fijiensis JB547 5' ATTACCGAGTGAGGGCTCACGC 3' (SEK NR ID: 23) JB548 5' GTTGCTTCGGGGGCGACCTG 3' (SEK NR ID: 24) JB442 5' TCGGGGGCGACCTGCCG 3' (SEK NR ID: 25) JB443 5' CCGGAGGCCGTCTA 3' (SEK NR ID: 26) JB545 5' CCACAACGCTTAGAGACGGACAG 3' (SEK NR ID: 27)
M. fijiensis M. fijiensis M. fijiensis JB546 5' CACCCGCACTCCGAAGCGAATT 3' (SEK NR ID: 28) JB549 5' GATCCGAGGTCAACC1 1 1 GAATAA 3' (SEK NR ID: 29) JB444 5' GGTCAACCTTTGAATAA 3' (SEK NR ID: 30)
M. musicola JB451 182 212 15 cd. tabeli 2 5' CC 1 1 1GTGAACCACACCT 3' (SEK NR ID: 31)
M. musicola JB440 5' CTGCCGGCGAACTT 3' (SEK NR ID: 32)
M. musicola JB449 5' ACCCTGCCGGCGAACTT 3' (SEK NR ID: 33)
M. musicola JB448 5' GCGACCCTGCCGGCGAAC 3' (SEK NR ID: 34)
M. musicola JB441 5’ TAGCCGGGAGACTTTGG 3' (SEK NR ID: 35)
M. musicola JB450 5’ TCTGCGTCGGAGTTCC 3' (SEK NR ID: 36)
M. musicola JB452 5' CCGCGCTCCGGAGCGAAC 3' (SEK NR ID: 37)
18S rDNA ITS1 5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3' (SEK NR ID: 38)
5.8S rDNA ITS2 5' GCTGCGTTCTTCATCGATGC 3' (SEK NR ID: 39)
5.8S rDNA ITS3 5' GCATCGATGAAGAACGCAGC 3' (SEK NR ID: 40)
25S rDNA ITS4 5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’ (SEK NR ID: 41)
S. nodorum JB563 5' CTTGCCTGCCGGTTGGACAAATT 3' (SEK NR ID: 50)
S. nodorum JB564 5' CTCAGTAGTTTACTACTGTAAAAGG 3' (SEK NR ID: 51)
S. nodorum JB565 5' CTTCTGGACGCAAGTGI I IGTTAC 3' (SEK NR ID: 52)
Fusarium spp JB566 5' GI I I I IAGTGGAACTTCTGAGT 3' (SEK NR ID: 53)
Fusarium spp JB567 5' CGCAGGAACCCTAAACTCT 3' (SEK NR ID: 54)
Fusarium spp JB568 5' GCCCGCCGCAGG 3' (SEK NR ID: 55)
Fusarium spp. JB569 5' RTWWTTWRTGGAMYYTCTGAGT 3' (SEK NR ID: 56)
Fusarium spp. JB570 5' TATGTTGCCTCGGCGG 3' (SEK NR ID: 57)
Fusarium spp. JB571 5’ TAACGATATGTAAATTACTACGCT 3' (SEK NR ID: 58)
Fusarium spp. JB572 5’ AAGTTGGGGTTTAACGGC 3' (SEK NR ID: 59)
Fusarium spp. JB573 5’ AGCGAGCCCGCCAC 3' (SEK NR ID: 60)
Fusarium spp. JB574 5' CCATTGTGAACGTTACCTATAC 3' (SEK NR ID: 61)
Fusarium spp. JB575 5' CGACCAGAGCGAGATGTA 3' (SEK NR ID: 62)
Fusarium spp. JB576 5' GTGAACATACCTTATGTTGCC 3' (SEK NR ID: 63)
Fusarium spp. JB577 5' GTTGCCTCGGCGGATC 3' (SEK NR ID: 64)
Fusarium spp. JB578 5’ CCGCGACGATTACCAG 3' (SEK NR ID: 65)
Uwaga: Fusarium spp. obejmuje F. graminearum, F. culmorum, F moniliforme i Microdochium nivale (syn. F. nivale).
Przykład 7. Wybór starterów do losowego powielania polimorficznych DNA (RAPD)
Dwie biblioteki starterów do RAPD (zestawy B i E), każdą złożoną z dwudziestu oligonukleotydów, otrzymano z Operon Technologies Incorporated (Alameda, CA). Startery testowano pod kątem ich zdolności do różnicowania oczyszczonych genomowych DNA z S. nodorum, S. tritici, M. fijiensis i M. musicola. Warunki PCR były zasadniczo takie same, jak opisano w przykładzie 4, z tą różnicą, że liczbę cykli zwiększono do 35, temperatura przyłączania startera była 30°C i użyto jedynie 5 pikomoli każdego ze starterów. Zidentyfikowano pięć starterów do RAPD, które różnicowały oczyszczony genomowy DNA z S. nodorum, S. tritici, M. fijiensis
182 212 i M. musicola. Startery OPB-12 i OPE-6 wytwarzały pojedynczy fragment przy powielaniu genomowego DNA S. tritici. Startery OPE-12, OPB-19 i OPE-15 wytwarzały pojedynczy fragment na genomowym DNA S. nodorum. Startery OPB-12 and OPE-6 nie dawały żadnego produktu powielania na genomowym DNA z S. nodorum, M. fijiensis i M. musicola.
Tabela 3
Startery RAPD do diagnozowania Septoria
Źródło ma- Starter Sekwencja startera Przybliżona
trycowego powielonego DNA S. tritici OPB-12 5'-CCTTGACGCA-3' (SEK NR ID:42) wielkość fragmentu 1,3 kb
S. tritici OPE-6 5'-ΑΑΟΑΟΟΟΟΤΟ-3’ (SEK NR ID:43) 1,0 kb
S. nodorum OPE-12 S-TTATCGCCCC-S' (SEK NR ID:44) 2,2 kb
S. nodorum OPB-19 5’-ACCCCCGAAG-3’ (SEK NR ID:45) 1,1 kb
S. nodorum OPE-15 5'-ACGCACAACC-3' (SEK NR ID:46) 1,3 kb
Przykład8. Określenie specyficzności wobec oczyszczonego genomoweg DNA grzybów Reakcje PCR wykonywano według przykładu 4, stosując różne kombinacje starterów z zamiarem powielenia pojedynczego fragmentu specyficznego gatunkowo. Specyficzne gatunkowo produkty powielania w reakcji PCR były wytwarzane ze starterów zaprojektowanych dla regionu ITS pomiędzy podjednostkami 18S i 25S rybosomalnego DNA dla każdego szczepu grzybowego, będącego przedmiotem zainteresowania.
Tabela 4
Startery diagnostyczne do PCR pochodzące z ITS
Źródło ma- Starter5‘ trycowego DNA
Starter 3'
Przybliżona wielkość amplifikowanego fragmentu
Septoria nodorum
JB433(SEK NR ID: 7) JB434(SEK NR ID: 8) 448bp
JB433(SEK NR ID: 7) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 553bp
ITS 1(SEK NR ID:38)(JB410)
TTS3 (SEK NR ID:40)(JB414)
JB527(SEK NR ID:10)
JB434(SEK NR ID: 8)
JB434(SEK NR ID: 8)
JB525(SEK NR ID: 9)
478bp
232bp*
458bp
JB564(SEK NR ID:51) JB565(SEK NR ID:52) 480bp
JB563(SEK NR ID:50)
JB565(SEK NR ID:52) 368bp
182 212
Septoria tritici cd. tabeli
JB445(SEK NR ID:11) ITS4 (SEK NR ID:41 )(JB415) 407bp
ITS 1(SEK NR ID:38)(JB410) JB446(SEK NR ID. 12) 345bp
ITS3 (SEK NR ID:40)(JB414) JB446(SEK NR ID: 12) 143bp*
JB445(SEK NR ID:11) JB446(SEK NR ID. 12) 204bp
M. fijiensis
JB443(SEK NR ID:26) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 418bp
ITS 1(SEK NR ID:38)(JB410) JB444(SEK NR ID:30) 482bp
JB443(SEK NR ID:26) JB444(SEK NR ID:30) 366bp’
ITS3 (SEK NR ID:40)(JB414) JB444(SEK NR ID:30) 281 bp*
ITS 1(SEK NR ID:38)(JB410) JB549(SEK NR ID:29) 489bp
M. musicola
JB449(SEK NR ID: 33) ITS4(SEK NR ID:41)(JB415) 430bp
JB448(SEK NR ID.34) ITS4(SEK NR ID:41)(JB415) 449bp*
JB448(SEK NR ID: 34) ITS2(SEK NR ID:39)(JB411) 138bp*
JB450(SEK NR ID: 36) ITS4(SEK NR ID:41)(JB415) 390bp*
P.herpotrichoides
JB536(SEK NR ID:14) JB541(SEK NR ID:19) 415bpł
JB536(SEKNRID:14) JB543(SEK NR ID:21) 502bp*
JB537(SEK NR ID: 15) JB541(SEKNR ID:19) 413bp*
JB537(SEK NR ID:15) JB543(SEK NR ID:21) 500bp'
JB538(SEK NR ID: 16) JB541(SEK NR ID:19) 401bp+
JB538(SEK NR ID:16) JB543(SEK NR ID:21) 488bpł
JB536(SEK NR ID:14) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 560bp’
JB537(SEK NR ID:15) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 558bp+
JB538(SEK NR ID:16) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 546bp’
ITS 1 (SEK NR ID:38)(JB410) JB541(SEKNR ID:19) 482bp+
ITS 1 (SEK NR ID:38)(JB410) JB543(SEKNRID:21) 569bp
ITS 1(SEK NR ID:38)(JB410) JB542(SEK NR ID:20) 482bpł
ITS 1(SEK NR ID:38)(JB410) JB544(SEK NR ID:22) 569bp”
JB540(SEKNRID:18) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 558bp”
JB539(SEK NR ID: 17) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 545bp’ł
JB540(SEK NR ID:18) JB542(SEK NR ID:20) 413bpł+
JB540(SEK NR ID:18) JB544(SEK NR ID:22) 500bpłł
JB539(SEK NR ID:17) JB542(SEK NR ID:20) 400bp
JB539(SEK NR ID:17) JB544(SEK NR ID:22) 487bp+’
18 182 212
cd. tabeli 4
Fusarium spp.
JB566(SEK NR ID:53) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 430bp1
JB566(SEK NR ID:53) JB572(SEK NR ID:59) 346bp’
JB569(SEK NR ID:56) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 430bp1
JB569(SEK NR ID:56) JB572(SEK NR ID:59) 346bp’
ITS 1 (SEK NR ID:38)(JB410) JB572(SEK NR ID:59) 485bp1
JB566(SEK NR ID:53) JB571(SEK NR ID:58) 308bp2
JB569(SEK NR ID:56) JB571(SEK NR ID:58) 308bp2
JB570(SEK NR ID:57) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 501 bp2
JB570(SEK NR ID:57) JB571(SEK NR ID:58) 379bp2
JB570(SEK NR ID:57) JB578(SEK NR ID:65) 395bp2
JB567(SEK NR ID:54) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 450bp2
JB567(SEK NR ID:54) JB571(SEKNR ID:58) 328bp2
JB567(SEK NR ID:54) JB572(SEK NR ID:59) 366bp2
JB567(SEK NR ID:54) JB578(SEK NR ID:65) 344bp2
JB568(SEK NR ID:55) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 459bp2
JB568(SEK NR ID:55) JB571(SEKNR ID:58) 337bp2
JB568(SEK NR ID:55) JB572(SEK NR ID:59) 375bp2
JB576(SEK NR ID:63) ITS4 (SEKNRID:41)(JB415) 510bp2
JB576(SEK NR ID:63) JB578(SEK NR ID:65) 404bp2
JB577(SEK NR ID:64) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 495bp2
JB577(SEK NR ID:64) JB571(SEK NR ID:58) 373bp2
JB577(SEK NR ID:64) JB578(SEK NR ID:65) 389bp2
ITS 1(SEKNRID:38)(JB4W) JB571(SEK NR ID:58) 447bp2
ITS 1 (SEK NR ID:38)(JB410) JB578(SEK NR ID:65) 463bp2
ITS 1(SEK NR ID:38)(JB410) JB575(SEK NR ID:62) 479bp2
M. nivale
JB569(SEK NR ID:56) JB575(SEK NR ID:62) 340bp
JB567(SEK NR ID:54) JB575(SEK NR ID:62) 360bp
JB574(SEK NR ID:61) ITS4 (SEK NR ID:41)(JB415) 520bp
JB574(SEK NR ID:61) JB572(SEK NR ID:59) 436bp
182 212 * ... Kombinacja starterów powielała pewne fragmenty poprzez nieprawidłowe przyłączenie startera, pczy czym żadne z nich nie miały żądanej wielkości.
5 + ... Startery powielały fragment o właściwej wielkości zarówno w typie R,jaki i w typie W Pseudocercosporella herpotrichoides.
++... Kombinacja starterów powielała fragment o właściwej wielkości w jedynie w typie RP herptrichoides.
1. .. Kombinacja starterów powielała fragment o właściwej wielkości w F. graminearum, F culmorum, F. moniliforme i M. nivale.
2. .. Kombinacja starterów powielała fragment o właściwej wielkości w F grami nearum, F. culmorum i F moniliforme.
Przykład 9. Ustalenie specyficzności starterów wobec tkanek roślinnych infekowanych przez grzyby
Całkowity genomowy DNA izolowano ze zdrowych liści pszenicy, liści pszenicy infekowanych S. nodorum, liści pszenicy infekowanych S. tritici oraz liści pszenicy infekowanych zarówno S. nodorum , jak i S. tritici, stosując protokół opisany w przykładzie 3. Reakcje PCR wykony wano, jak opisano w przykładzie 4, testując kombinacje starterów wymienionych w przykładzie 8, z DNA z liści pszenicy.
Startery specyficzne dlaS. tritici, JB446(SEKNRID: 12) i ITS1 (SEKNRID: 38) (JB410) powielały fragment o wielkości 345 bp z oczyszczonego DNA S. tritici, z tkanki liściowej pszenicy infekowanej S. tritici i zpróbki tkanki liściowej pszenicy infekowanej zarówno S. tritici Jak i S. nodorum . Zestaw starterów nie powielał fragmentu diagnostycznego ze zdrowej tkanki liściowej ani z tkanki pszenicy infekowanej S. nodorum. Podobnie, startery specyficzne dla S. tritici , JB445 (SEK NR ID: 11) i ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) powielały fragment o wielkości 407 bp z tych samych tkanek, co kombinacja starterów JB446 (SEK NR ID: 12) i ITS 1 (SEK NR ID: 38) (JB410) i również były diagnostyczne.
Podobnie diagnostyczne wyniki otrzymano dla starterów specyficznych dla S. nodorum , JB443 (SEK NR ID: 7) i JB434 (SEK NR ID: 8). Startery powielały fragment o wielkości 448 bp z tkanki liściowej pszenicy infekowanej S. nodorum , z próbki tkanki liściowej infekowanej zarówno S. nodorum Jak i S. tritici, S. nodorum Jak również z oczyszczonego genomowego DNA S. nodorum. Kombinacja starterów JB443 (SEK NR ID: 7) i JB434 (SEK NR ID: 8 nie powielała żadnego fragmentu ze zdrowej tkanki liściowej, z tkanki pszenicy infekowanej S. tritici, ani z oczyszczonego genomowego DNA S. tritici. Startery specyficzne dla S. nodorum, JB527 (SEK NR ID: 10) i JB525 (SEK NR ID: 9), powielały fragment o wielkości 458 z tego samego genomowego DNA i tkanek pszenicy, co kombinacja JB433 (SEK NR ID: 7) i JB434 (SEK NR ID: 8).
Kombinację starterów dla P. herpotrichoides, wymienionych w przykładzie 8, testowano wobec ekstraktów z łodyg pszenicy tak, jak w przykładzie 12. Reakcje PCR wykonywano, jak opisano w przykładzie 4, z następującymi zmianami: 35 cykliprowadzono w94°Cprzez 15 sek i 70°C przez 45 sek, stosowano 1,5-2,5 mM MgCl2 i 200 μΜ każdeg dNTP. W każdej reakcji PCR używano 1 ml ekstraktu pszenicy.
Kombinacja starterów JB537 (SEKNRID: 15)and JB541 (SEKNRID: 19) powielała fragment o długości 413 bp w ekstrakcie pszenicy infekowanej typem W patogenu P. herpotrichoides. Żaden produkt powielania nie był wytwarzany przy powielaniu w ekstrakcie ze zdrowej pszenicy, ani w ekstrakcie z pszenicy infekowanej typem R patogenu P. herpotrichoides.
Kombinacja starterów JB539 (SEK NR ID: 17) i JB544 (SEK NR ID: 22) powielała fragment o długości 487 bp, a kombinacja starterów JB540 (SEK NR ID: 18) i JB542 (SEK NR ID: 20) powielała fragment o długości 413 bp w ekstrakcie pszenicy infekowanej typem R, ale nie ze zdrowej pszenicy lub pszenicy infekowanej typem W.
Całkowity genomowy DNA izolowano również ze zdrowych liści bananowca i z liści bananowca infekowanych M. fijiensis przy użyciu protokołu opisanego w przykładzie 3. Reakcje PCR wykonywano jak w przykładzie 4, testując kombinację starterów specyficznych dla M. fijiensis. wymienionych w przykładzie 8, wobec liści bananowca.
Startery specyficzne dla Ni. fijiensis: JB549 (SEK NR ID: 29) i ITS1 (SEK NR ID: 38) (JB410) powielały fragment o długości 489 bp na oczyszczonym DNA M. fijiensis i tkance li
182 212 ściowej bananowca infekowanej M. fijiensis. Zestaw starterów nie powielał fragmentu diagnostycznego ze zdrowej tkanki liściowej bananowca. Kombinacja starterów specyficznych dla M. fijiensis JB443 (SEK NR ID: 26)/ITS4 (SEK NR ID: 41) (JB415) i ITSI (SEK NR ID: 38) (JB410)/JB444 (SEK NR ID: 30) powielała fragment o długości odpowiednio, 418 bp i 482 bp, na tym samym genomowym DNA i tkance liściowej bananowca, co kombinacja starterów (SEK NR ID: 20) i ITS 1 (SEKNRID: 38) (JB410). . .
Przykład 10. Badanie reakcj i krzyżowej starterów specyficznych gatunkowo z innymi gatunkami i izolatami.
Oczyszczony genomowy DNA grzybowy otrzymano, jak opisano w przykładzie 1 i testowano w reakcji PCR, jak opisano w przykładzie 4, stosując startery specyficzne gatunkowo. Testowano DNA z innych gatunków grzybów i izolatów pod kątem krzyżowego reagowania z nimi starterów specyficznych gatunkowo.
Startery specyficzne dla S. tritici, JB446 (SEK NR ID: 12) i ITSI (SEK NR ID: 38) (JB410) powielały fragment o wielkości 345 bp dla wszystkich izolatów S. tritici wymienionych w przykładzie 1. Nie było reakcj i krzyżowej z oczyszczonym genomowym DNA z X nodorum, S. glycines lub S. passerini. Żaden z tych innych gatunków grzybów nie wytwarzał produktu powielania ze starterami specyficznymi dla S. tritici.
Fragment o wielkości 448 bp był powielany dla wszystkich izolatów S. nodorum wymienionych w przykładzie 1 przy zastosowaniu starterów specyficznych dla S. nodorum JB 433 (SEK NR ID: 7) i JB434 (SEK NR ID: 8). Podobnie, startery specyficzne dla S. nodorum JB527 (SEK NR ID: 10) i JB525 (SEK NR ID: 9) powielały fragment o wielkości 458 bp we wszystkich izolatach S. nodorum wymienionych w przykładzie 1.
S. tritici, 5. glycines i S. passerini nie wytwarzały żadnego produktu powielania, gdy były testowane z jednym z zestawów starterów specyficznych dla S. nodorum : bądź JB433 (SEK NR ID: 7) i JB434 (SEK NR ID: 8), bądź JB527 (SEK NR ID: 10) i JB525 (SEK NR ID: 9).
Reakcje PCR przeprowadzano stosując warunki opisane w przykładzie 9, z kombinacją starterów specyficznych dla P. herpotrichoides opisanych w przykładzie 8, z DNA innych gatunków grzybów i izolatów, wymienionych w przykładzie 1.
Kombinacja starterów JB537 (SEK NR ID: 15) i JB541 (SEKNRID: 19) dawała fragment o wielkości 413 z izolatów P. herpotrichoides typu W jedynie w przypadku testowania wobec izolatów P. herpotrichoides i następujących patogenów zbóż: P. aestiva, C. cereale, P. sorokiniana, S. tritici i S. nodorum. Kombinacja starterów JB539 (SEK NR ID: 17) i JB544 (SEKNRID: 22) powielała fragment o wielkości 487 bp z izolatu P. herpotrichoides typu R jedynie wtedy, gdy była testowana wobec tych samychDNA. Kombinacja starterów JB540 (SEKNRID: 18) i JB542 (SEK NR ID: 20) powielała fragment o wielkości 413 bp z izolatu P. herpotrichoides typu R jedynie wtedy, gdy była testowana wobec tych samych DNA.
Przykład 11. Źródła pszenicy infekowanej Pseudocercosporella herpotrichoides
Łodygi pszenicy infekowane oczkowatą plamistością otrzymano z etapu 1 c programu przesiewowego dla fungicydów z Ciba Basie. Ośmiodniowe rośliny pszenicy infekowano P. herpotrichoides poprzez rozpylenie zawiesiny konidiów (5 χ 105 konidiów/ml) w 0,2% Tween 20 u nasady łodyg pszenicy. Po inokulacji, rośliny pokrywano plastykiem i inkubowano przez jeden dzień w 20°C i przy względnej wilgotności 95-100%. Rośliny przenoszono do komory hodowlanej, gdzie były inkubowane przez cztery tygodnie w 12°C i przy względnej wilgotności 60%. Po takiej inkubacji, rośliny przenoszono do szklarni i inkubowano w 18°C i przy względnej wilgotności 60%. Z roślin pszenicy infekowanych szczepem 311 P. herpotrichoides typu W pobierano próbki po 8-9 tygodniach po iniekcji, podczas gdy te infekowane szczepem 308 patogenu typu R zbierano po 9-10 tygodniach po infekcji.
Przykład 12. Ekstrakcja DNA z łodyg pszenicy do testu na P. herpotrichoides
DNA ekstrahowano z łodyg pszenicy stosując protokół opisany przez Klimyuk i wsp. (The Plant Journal 3 (3): 493-494) z pewnymi modyfikacjami. 2 cm skrawki łodygi, ścięte 0,5 cm powyżej nasady łodygi umieszczano w 16010,25 M NaOH i rozcierano stosując moździerz Kontes pestle, aż do całkowitego zmacerowania. Próbkę gotowano przez 30 sek. Do próbki dodawano 16010,25 M HCl i 8010,5 M Tris-Cl, pH 8,0/0,25% obj./obj. Nonidet P-40. Próbka była gotowa
182 212 na przez dodatkowe 2 min, a następnie umieszczana w lodowej łaźni wodnej. W każdym teście PCR używano 1 1 ekstraktu.
Przykład 13. Włączenie testów diagnostycznych do ilościowych testów kolorymetrycznych
Test kolorymetryczny wykonywano zgodnie z Nikiforov i wsp. (PCR Methods and Applications 3:285-291), z następującymi zmianami:
1) 30μϊ produktu PCR typu R i mieszaninę 3 M NaCL/20 mM EDTA dodawano do studzienki ze starterem wyłapującym. 50 μϊ produktu PCRtypu W i mieszaninę 3 M NaCl/20 mM EDTA używano w reakcji hybrydyzacji.
2) Działanie egzonukleazą i reakcję hybrydyzacji prowadzono w 37°C.
3) Użyto rozcieńczenia 1:1000 monoklonalnych przeciwciał przeciw kompleksowi biotyna-peroksydaza chrzanu (HRP).
4) Po 2 min inkubacji z substratem dichlorowodorkiem O-fenylenodiaminy (OPD), do każdej studzienki testowej dodawano 50 μϊ 3N HCI. Odczyt z płytek z 96 studzienkami był wykonywany przy 492 nm, z odniesieniem do 570 nm, stosując standardowy czytnik płytek ELISA.
Startery zebrane w tabeli 5 były syntetyzowane tak, jak opisano w przykładzie 5, do testowania jako startery wyłapujące w teście kolorymetrycznym.
Tabela 5
Projekt startera wyłapującego do testu kolorymetrycznego
Nazwa startera Matryca dla startera Sekwencja startera
ITS 5.8S rDNA 5OCTGCGTTCTTCATCGATGC3’ (SEK NR ID:39)
JB541 P.herp. typ W 5’CCACTGAI I I IAGAGGCCGCGAG3’ (SEK NR ID: 19)
JB542 P.herp. typ R 5’CCACTGAI I I I AGAGGCCGCGAA3'(SEK NR ID:20)
JB538' P.herp. typ W 5’TGACGACTCTAAACCCTACCA3' (SEK NR ID:66)
JB539’ P.herp. typ R 5’CGACGACTCTAAACCTTACCG3’ (SEK NR ID:67)
W 130 P.herp. typ W 5’ATTCAAGGGTGGAGGTCTGA3’ (SEK NR ID:68)
R130 P.herp. typ R 5’ATTCAAGGGTGGAGGTCTGG3' (SEK NR 1D:69)
JB538' P.herp. typ 15W 5'CTCTAAACCCTACCA3’ (SEK NR ID:70)
JB539’ P.herp. typ 15R 5'CTCTAAACCTTACCG3’ (SEK NR ID:71)
JB553 typy R & W 5'GTGGTCCTCTGGCAG3’ (SEK NR ID:72)
JB554 typy R & W 5’CTCAACAGCCGAAGC3’ (SEK NR ID:73)
JB555 P.herp. typ W 5’GGGTGGAGGTCTGA3' (SEK NR ID:74)
JB556 P.herp. typ R 5’GGTGGAGGTCTGG3’ (SEK NR ID:75)
JB561 P.herp. typ R 5'TGGAGGTCTGGACCA3’ (SEK NR ID:76)
JB562 P.herp. typ W 5’TGGAGGTCTGAACCA3’ (SEK NR ID:77)
JB559 P.herp. typ W 5’AGGGTGGAGGTCTGA3’ (SEK NR ID:78)
JB560 P.herp. typ R 5’AGGGTGGAGGTCTGG3’ (SEK NR ID:79)
JB557 P.herp. typ W 5’TTCTCCGAGAGGCCT3’ (SEK NR ID:80)
JB558 P.herp. typ R 5’TTCTCCGAGAGGCCC3’ (SEK NR ID:81)
182 212
Startery diagnostyczne dla S. nodorum : JB527 (SEK NR ID: 10) i JB 525 (SEK NR ID: 9) włączono do ilościowego testu kolorymetrycznego. Starter JB527 (SEK NR ID: 10) był syntetyzowany przez Midland Certified Reagent Complany (Midland, Teksas) tak, aby zawierał piętno biotynowe oraz aby zawierał na końcu 5' cztery wewnątrznukleotydowe wiązania fosforowosiarkowe. Reakcję powielania PCR prowadzono, jak opisano wprzykładzie 4, stosując zmodyfikowane startery: JB527 (SEKNRID: 10) i JB525 (SEKNRID: 9), dlapszenicy zdrowej i infekowanej S. nodorum w stopniu niewielkim, średnim i dużym, dającej odpowiednio zerowe, niskie, średnie i wysokie wartości A492 w prowadzonych testach kolorymetrycznych przy zastosowaniu startera ITS2 (SEK NR ID: 39) jako startera wyłapującego produkt PCR.
Startery z końca 5' specyficzne dla typu R P. herpotrichoides, JB539 (SEK NR ID: 17) i JB540 (SEK NR ID: 18) oraz starter z końca 5' specyficzny dla typu W P. herpotrichoides JB53 7 (SEK NR ID: 15), były również modyfikowane tak, aby zawierały piętno biotynowe oraz cztery wewnątrznukleotydowe wiązania fosforowosiarkowe. Opracowano kolorymetryczną wersję testu PCR dla typu R P. herpotrichoides, stosując zmodyfikowany starter JB540 (SEK NR ID: 18), starter JB542 (SEKNRID: 20) i starter wyłapujący JB539' 15. Produkty wytwarzane poprzez powielanie z pszenicy infekowanej typem R i z genomowego DNA stosując zmodyfikowany starter JB540 (SEK NR ID: 18) i starter JB542 (SEK NR ID: 20) dawały pozytywne wartości kolorymetryczne w czasie testów kolorymetrycznych. Pozytywne wartości kolorymetryczne otrzymywano również poprzez analizę kolorymetryczną produktów PCR z procesu powielania przy zastosowaniu zmodyfikowanego startera JB537 (SEK NR ID: 15) i specyficznego dla typu W startera JB541 (SEK NR ID: 19) dla pszenicy infekowanej typem W i genomowego DNA typu W, gdy JB538' 15 był używany jako starter wyłapujący. Ponadto, intensywność sygnału kolorymetrycznego pozostawała w zgodności z intensywnością fragmentu będącego produktem PCR, uwidacznianego w żelu agarozowym.
Uprzednio, różne gatunki Septoria można było identyfikować poprzez badanie mikroskopowe, a identyfikacja różnych szczepów Pseudocercosporella była możliwa jedynie poprzez testy patologiczne. Podobnie, nie zostawiająca wątpliwości identyfikacja Mycosphaerella musicola i Mycosphaerella fijiensis była trudna i nawet izolacja dojrzałych peritecjów nie zawsze pozwalała na dokładnąidentyfikację (Pons, 1990; W. Sigatoka Leaf Spot Diseases of Banana, Wyd. R.A. Fullerton and R.H. Stover, International Network for the Improvement of Banana and Plantain, France). Obecnie zestawy immunodiagnostyczne stosujące technikę ELISA są rutynowo stosowane do identyfikacji Septoria tritici, Septoria nodorum, Pseudocercoporella herpotrichoides i innych patogenów, ale technologia ta jest pozbawiona dokładności, granic wykrywania i zdolności rozróżniania różnych izolatów bieżącego wynalazku. W konsekwencji, rozwój testu DNA do szybkiej identyfikacji różnych szczepów tych grzybów przynosi realne korzyści nie tylko dla badaczy taksonomii grzybów, ale również dla postępowania przy chorobach i wybiórczego stosowania fungicydów w uprawach.
Jakkolwiek niniejszy wynalazek został opisany w odniesieniu do specyficznego wykonania, będzie uznane, że możliwe są liczne odmiany, modyfikacje oraz inne wykonania i, zgodnie z tym, wszystkie takie odmiany, modyfikacje i wykonania uważa się za pozostające w zakresie niniejszego wynalazku.
Depozyty
Następujące depozyty zostały złożone 28 marca 1994 r. w kolekcji Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604. U.S.A.:
1. HB101 DHSd(pCRW2-l; SEKNR ID: 3) Nr Dostępu NRRL B-21231
2. HB101 DHSd(pCRWS-l; SEKNRID: 47) Nr Dostępu NRRL B-21232
3. E. coli DHSd(pCRSTRITI; SEK NR ID:l)Nr Dostępu NRRL B-21233
4. E. coli DHSd(pCRRI-21; SEK NR ID:4) Nr Dostępu NRRL B-21234
5. E. coli DHSd(pCRSNOD31; SEK NR ID:2) Nr Dostępu NRRL B-21235
182 212
ZESTAWIENIE SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) WNIOSKUJĄCY: Ligon, James M Beck, James J (ii) TUTUŁ WYNALZKU: Wykrywanie patogenów grzybowych przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy.
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 86 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRES: Ciba-Geigy Corporation (B) ULICA: 7 Skyline Drive (C) MIASTO: Hawthome (D) STAN: NY (E) PAŃSTWO: USA (F) KOD: 10532 (v) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:
(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release#1.0, Version#1.25 (vt) DANE BIEŻĄCEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US TBA (B) DATA ZAREJESTROWANIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/233,608 (B) DATA ZAREJESTROWANIA: 4 kwietnia 1994 (viii) INFORMACIE O PEŁNOMOCNIKU/AGENCIE:
(A) NAZWISKO: Walsh, Andrea C.
(B) NUMER REJESTRACJI: 34,988 (C) ODNOŚNIK/NUMER SPRAWY: CGC 1739 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
182 212 (A) TELEFON: 919-541-8666 (B) TELEFAKS: 919-541-6689 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 548 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA : 1... 548 (D) Pozostałe informacje: /uwaga= Sekwencja DNA Wewnę trznego Transkrybowanego Przerywnika Septoria tritici (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR1:
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGCGAGG GCCTCCGGGT CCGACCTCCA 60
ACCCTTTGTG AACACATCCC GTTGCTTCGG GGGCGACCCT GCCGGGCGCC CCCGGAGGAC 120
CACCAAAAAA CACTGCATCT CTGCGTCGGA GTTTACGAGT AAATCGAAAC AAAACTTTCA 180
ACAACGGATC TCTTGGTTCT GGCATCGATG AAGAACGCAG CGAAATGCGA TAAGTAATGT 240
GAATTGCAGA ATTCAGTGAA TGATCGAATC TTTGAACGCA CATTGCGCCC CCTGGTATTC 300
CGGGGGGCAT GCCCGTTCGA GCGTCATTAC ACCACTCCAG CCTCGCTGGG TATTGGGCGT 360
CTTTTCGCGG GGGATCACTC CCCCGCGCGC CTCAAAGTCT CCGGCTGAGC GGTCTCGTCT 420
CCCAGCGTTG TGGCATCACG TCTCGCCGCG GAGTTCACGA GCCCTGACGG CCGTTAAATC 480
ACACCTCAGG TTGACCTCGG ATCGGGTAGG GATACCCGCT GAACTTAAGC ATATCAATAA 540
GCGGAGGA 548 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 583 base pairs (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 212 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM : Septoria nodorum (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA : 1...583 (D) Pozostałe informacje : /note= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Septoria tritici (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:2:
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATGATTA CACTCAGTAG TTTACTACTG TAAAAGGGGC 60
TGTTAGTCTG TATAGCGCAA GCTGATGAGC AGCTGGCCTC TTTTATCCAC CCTTGTCTTT 120
TGCGTACCCA CGTTTCCTCG GCAGGCTTGC CTGCCGGTTG GACAAATTTA TAACCTTTTT 180
AATTTTCAAT CAGCGTCTGA AAAACTTAAT AATTACAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG 240
TTCTGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAAGTA GTGTGAATTG CAGAATTCAG 300
TGAATCATCG AATCTTTGAA CGGACATTGC GCCCCTTGGT ATTCCATGGG GCATGCCTGT 360
TCGAGCGTCA TTTGTACCCT CAAGCTCTGC TTGGTGTTGG GTGTTTGTCC TCTCCCTAGT 420
GTTTGGACTC GCCTTAAAAT AATTGGCAGC cagtgttttg GTATTGAAGC GCAGCACAAG 480
TCGCGATTCG TAACAAACAC TTGCGTCCAC AAGCCTTTTT AACTTTTGAC CTCGGATCAG 540
GTAGGGATAC CCGCTGAACT TAAGCATATC AATAAGCGGA GGA 583
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 626 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie
182 212 (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM : Pseudocercosporella herpotrichoides (B) SZCZEP: Szczep R (C) INDYWIDUALNY IZOLAT: Wariant W2-1 (ix) CECHY :
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA : 1..626 (D) Pozostałe informacje: /note= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Pseudocercosporella herpotrichoides szczepu W (wariant W2-1) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:3:
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ATAGAGGAAT GAACAGACAG CGCCCCGGGA 60
GAAATCCTGG GGGCTACCCT ACTTGGTAGG GTTTAGAGTC GTCAGGCCGC TCGGAGAAGC 120
CTGGTTCAGA CCTCCACCCT TGAATAAATT ACCTTTGTTG CTTTGGCAGG GCGCCTCGCG 180
CCAGCGGCTT CGGCTGTTGA GTACCTGCCA GAGGACCACA ACTCTTGTTT TTAGTGATGT 240
CTGAGTACT.A TATAATAGTT AAAACTTTCA ACAACGGATC TCTTGGTTCT GGCATCGATG 300
AAGAACGCAG CGAAATGCGA TAAGTAATGT GAATTGCAGA ATTCAGTGAA TCATCGAATC 360
TTTGAACGCA CATTGCGCCC TCTGGTATTC CGGGGGGGAT GCCTGTTCGA GCGTCATTAT 420
AACCACTCAA GCTCTCGCTT GGTATTGGGG TTCGCGTCCT CGCGGCCTCT AAAATCAGTG 480
GCGGTGCCTG TCGGCTCTAC GCGTAGTAAT ACTCCTCGCG ATTGAGTCCG GTAGGTTTAC 540
TTGCCAGTAA CCCCCAATTT TTTACAGGTT GACCTCGGAT CAGGTAGGGA TACCCGCTGA 600
ACTTAAGCAT ATCAATAAGC GGAGGA 626
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 627 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie
182 212 (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM : Pseudocercosporella herpotrichoides (B) SZCZEP: Szczep R (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA: 1..627 (D) POZOSTAŁE INFORMACJE: /note= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Pseudocercosporella herpotrichoides szczepu R (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:4:
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ATAGAGCAAT GGATAGACAG CGCCCCGGGA 60
GAAATCCTGG GGGCCACCCT ACTTCGGTAA GGTTTAGAGT CGTCGGGCCT CTCGGAGAAG 120
CCTGGTCCAG ACCTCCACCC TTGAATAAAT TACCTTTGTT GCTTTGGGAG GGCGCCTCGC 180
GCCAGCGGCT TCGGCTGTTG AGTACCTGCC AGAGGACCAC AACTCTTGTT TTTAGTGATG 240
TCTGAGTACT ATATAATAGT TAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGTTC TGGCATCGAT 300
GAAGAACGCA GCGAAATGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAAT 360
CTTTGAACGC ACATTGCGCC CTCTGGTATT CCGGGGGGCA TGCCTGTTCG AGCGTCATTA 420
TAACCACTCA AGCTCTCGCT TGGTATTGGG GTTCGCGTCT TCGCGGCCTC TAAAATCAGT 480
GGCGGTGCCT GTCGGCTCTA CGCGTAGTAA TACTCCTCGC GATTGAGTCC GGTAGGTTTA 540
CTTGCCAGCA ACCCCCAATT TTTTACAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG 600
AACTTAAGCA TATCAATAAG CGGAGGA 627
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 534 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM : Mycosphaerella fijiensis
182 212 (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA: 1..534 (D) Pozostałe informacje: /hote= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Mycosphaerella fijiensis (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:5:
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGTGAGG GCTCACGCCC GACCTCCAAC60
CCTTTGTGAA CCACAACTTG TTGCTTCGGG GGCGACCTGC CGTCGGCGGG CGCCCCCGGA120
GGCCGTCTAA ACACTGCATC TTTGCGTCGG AGTTTAAAAC AAATCGAACA AAACTTTCAA180
CAACGGATCT CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC GAAATGCGAT AAGTAATGTG240
AATTGCAGAA TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCT TTGGTATTCC300
GAAGGGCATG CCTGTTCGAG CGTCATTTCA CCACTCAAGC CTGGCTTGGT ATTGGGCGTC360
GCGGTTCTTC GCGCGCCTTA AAGTCTCCGG CTGAGCTGTC CGTCTCTAAG CGTTGTGGAT420
CTTTCAATTC GCTTCGGAGT GCGGGTGGCC GCGGCCGTTA AATCTTTATT CAAAGGTTGA480
CCTCGGATCA GGTAGGGATA CCCGCTGAAC TTAAGCATAT CAATAAGCGG AGGA534 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 540 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM: Mycosphaerella musicola (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA: 1...540 (D) Pozostałe informacje: /note= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Mycosphaerella musicola
182 212 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:6:
TCCGTAGGTG AACCTGCGGG GGGATCATTA CCGAGTGAGG GCTCACCCCC GACCTCCAAC 60
CCTTTGTGAA CCACACCTGT TGCTTCGGGG GCGACCCTGC CGGCGAACTT GTCGCCGGGC 120
GCCCCCGGAG GTCTCCTTAA CACTGCATCT CTGCGTCGGA GTTCCAAACA AATCGGACAA 180
AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCG AAATGCGATA 240
AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGCGCCCTT 300
TGGCATTCCG AAGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCAC CACTCAAGCC TAGCTTGGTA 360
TTGGGCGCCG CGGTGCTCCG CGCGCCCCAA AGTCTCCCGG CTAAGCCGTC CGTCTCTAAG 420
CGTTGTGGAT TTTTCAGTTC GCTCCGGAGC GCGGGTGGCC GCGGCCGTTA AATCTTCAAA 480
GGTTGACCTC GGATCAGGTA GGGATACCCG CTGAACTTAA GCATATCAAT AAGCGGAGGA 540
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB433 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:7:
ACACTCAGTA GTTTACTACT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB434 ii) IPOTETYCZNA: Nie iv) NTYSENSOWNA: Nie
182 212 xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:8:
TGTGCTGCGC TTCAATA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :9:
i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB525 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:9:
GCGACTTGTG CTGCGCTTCA ATA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB527 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:10:
CATTACACTC AGTAGTTTAC TACT
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB445 iii) IPOTETYCZNA: Nie iv) NTYSENSOWNA: Nie xi) PIS SEKWENCJI: SEK ID NR:11:
CTGCGTCGGA GTTTACG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :12:
i) HARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Imy kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB446 (iii) HIPOTETYCZNA:Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:12:
CGAGGCTGGA GTGGTGT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 212 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB526 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:13:
CCCAGCGAGG CTGGAGTGGT GT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB536 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:14:
CTGGGGGCTA CCCTACTTGG TAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB537 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
182 212 (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 15:
GGGGGCTACC CTACTTGGTA G (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA-.liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB538 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:16:
ACTTGGTAGG GTTTAGAGTC GTCA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB539 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:17:
CTTCGGTAAG GTTTAGAGTC GTCG
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID : 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB540 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
0v) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:18:
GGGGGCCACC CTACTTCGGT AA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB541 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:19:
CCACTGATTT TAGAGGCCGC GAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 212 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB542 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:20:
CCACTGATTT TAGAGGCCGC GAA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB543 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:21:
CCTGTAAAAA ATTGGGGGIT A (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB544 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
182 212 (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:22:
CCTGTAAAAA ATTGGGGGTT G (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB547 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:23:
ATTACCGAGT GAGGGCTCAC GC 22 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB548 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:24:
GTTGCTTCGG GGGCGACCTG 20
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 base pairs (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB442 (iii) HIPOTETYCZNA:Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:25:
TCGGGGGCGA CCTGCCG 17 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :26:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 base pairs (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
Cii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB443 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:26:
CCGGAGGCCG TCTA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :27:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 212 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB545
Ciii) HIPOTETYCZNA:Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:27:
CCACAACGCT TAGAGACGGA CAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID ;28;
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB546 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:28:
CACCCGCACT CCGAAGCGAA TT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :29:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB549 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
182 212 (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:29:
GATCCGAGGT CAACCTTTGA ATAA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :30:
fi) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB444 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:30:
GGTCAACCTT TGAATAA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :31:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB451 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:31:
CCTTTGTGAA CCACACCT
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :32:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB440 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:32:
CTGCCGGCGA ACTT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :33:
fi) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB449 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:33:
ACCCTGCCGG CGAACTT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :34:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 212 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB448 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:34:
GCGACCCTGC CGGCGAAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :35:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy JB441 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:35:
TAGCCGGGAG ACTTTGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :36:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy JB450 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
182 212 (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 36:
TCTGCGTCGG AGTTCC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :37:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy J8452
Ciii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:37:
CCGCGCTCCG GAGCGAAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :38:
0) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy ITS1 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:38:
TCCGTAGGTG AACCTGCGG
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :39:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy ITS2 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 39:
GCTGCGTTCT TCATCGATGC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :40:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy ITS3 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 40:
GCATCGATGA AGAACGCAGC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :41:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza
182 212 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy ITS4 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:41:
TCCTCCGCTT ATTGATATGC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID : 42:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy OPB-12 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 42:
CCTTGACGCA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 43:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) ΤΎΡ: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy OPE-6 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie
182 212 (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:43:
AAGACCCCTC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :44:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA-.liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy OPE-12
Ciii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 44:
TTATCGCCCC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 45:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: Starter oligonukleotydowy OPE-19 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:45:
ACCCCCGAAG
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 46:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Starter oligonukleotydowy OPE-15 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 46:
ACGCACAACC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :47:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 627 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM : Pseudocercosporella herpotrichoides (B)STRAIN: Szczep W (C) POJEDYNCZY IZOLAT: Wariant W5-1 (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA : 1..627 (D) Pozostałe informacje: /note= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Pseudocercosporella herpotrichoides szczepu W (wariant W5-1)
182 212 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:47:
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA ATAGAGCAAT GAACAGACAG CGCCCTGGGA 60
GAAATCCTGG GGGCTACCCT ACTTCGGTAG GGTTTAGAGT CGTCAGGCCT CTCGGAGAAG 120
CCTGGTTCAG ACCTCCACCC TTGAATAAAT TACCTTTGTT GCTTTGGCAG GGCGCCTCGC 180
GCCAGCGGCT TCGGCTGTTG AGTACCTGCC AGAGGACCAC AACTCTTGTT TTTAGTGATG 240
TCTGAGTACT ATATAATAGT TAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGTTC TGGCATCGAT 300
GAAGAACGCA GCGAAATGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAAT 360
CTTTGAACGC ACATTGCGCC CTCTGGTATT CCGGGGGGCA TGCCTGTTCG AGCGTCATTA 420
TAACCACTCA AGCTCTCGCT TGGTATTGGG GTTCGCGTCC TCGCGGCCTC TAAAATCAGT 480
GGCGGTGCCT CTCGGCTCTA CGCGTAGTAA TACTCCTCGC GATTGAGTCC GGTAGGTTTA 540
CTTGCCAGTA ACCCCCAATT TTTTACAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGG ATACCCGCTG 600
AACTTAAGCA TATCAATAAG CGGAGGA 627
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 48:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Uniwersalny 20 oligonukleotydowy starter M13 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 48:
GTAAAACGAC GGCCAGT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 49:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 212 ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : Uniwesalny odwrócony (reverse) starter oligonukleotydowy M13 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie ii) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 49:
AACAGCTATG ACCATG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :50:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB563 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:50:
CTTGCCTGCC GGTTGGACAA ATT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :51:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Oligonukleotyd JB564 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:51:
CTCAGTAGTT TACTACTGTA AAAGG
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 52:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA : liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /desc = Oligonukleotyd JB565 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:52:
CTTCTGGACG CAAGTGTTTG TTAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :53:
fi) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI;
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Oligonukleotyd JB566 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:53:
GTTTTTAGTG GAACTTCTGA GT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :54:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 212 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Oligonukleotyd JB56 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:54:
CGCAGGAACC CTAAACTCT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 55:
fi) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB568 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:55:
GCCCGCCGCAGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :56:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB569 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:56:
RTWWTTWRTG GAMYYTCTGA GT
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 57:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = Starter oligonukleotydowy JB57O (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:57:
TATGTTGCCT CGGCGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :58:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB571 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:58:
TAACGATATG TAAATTACTA CGCT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :59:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 212 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB572 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:59:
AAGTTGGGGT TTAACGGC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 60:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB 573 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:60:
AGCGAGCCCG CCAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :61:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = Starter oligonukleotydowy JB574 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:61:
CCATTGTGAA CGTTACCTAT AC
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :62:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis= Starter oligonukleotydowy JB575 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:62:
CGACCAGAGC GAGATGTA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :63:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA . liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB576 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:63:
GTGAACATAC CTTATGTTGC C (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :64:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 212 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB577 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:64:
GTTGCCTCGG CGGATC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :65:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI:. pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB578
Cii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:65:
CCGCGACGAT TACCAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :66:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB538 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 66:
TGACGACTCT AAACCCTACC A
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 67:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB539' iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:67:
CGACGACTCT AAACCTTACC G (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :68:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = Starter oligonukleotydowy W130 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:68:
ATTCAAGGGT GGAGGTCTGA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :69:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 212 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy R130 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 69:
ATTCAAGGGT GGAGGTCTGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :70:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB539'15 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:70:
CTCTAAACCC TACCA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :71:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis= Starter oligonukleotydowy JB539'15 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:71:
CTCTAAACCTTACCG
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :72:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB553 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR :72:
GTGGTCCTCT GGCAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 73:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA . liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /desc = Starter oligonukleotydowy JB554 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 73:
CTCAACAGCC GAAGC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 74:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 14 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 212 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB555 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 74:
GGGTGGAGGT CTGA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :75:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 13 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /desc = Starter oligonukleotydowy JB556 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 75:
GGTGGAGGTC TGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 76:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /opis = Starter oligonukleotydowy JB561 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 76:
TGGAGGTCTG GACCA
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID : 77:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = Starter oligonukleotydowy JB562 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:77:
TGGAGGTCTG AACCA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 78:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = Starter oligonukleotydowy JB559 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 78:
AGGGTGGAGG TCTGA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 79:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
182 212 (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = Starter oligonukleotydowy JB560 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:79:
AGGGTGGAGG TCTGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :80:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /opis = Starter oligonukleotydowy JB557 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:80:
TTCTCCGAGA GGCCT 15 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :81:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D)TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Inny kwas nukleinowy (A) OPIS : /desc = Starter oligonukleotydowy JB558 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 81:
TTCTCCGAGA GGCCC 15
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 82:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 504 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1...504 (D) Pozostałe informacje : /uwaga=H Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Fusarium culmorum (fculm.con) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:82:
GAGGGATCAT TACCGAGTTT ACTRACTCCC AAACCCCTGT GAACDTACCT TATGTTGCCT 60
CGGCGGATCA GCCCGCGCCC CGTAAAAAGG GACGGCCCGC CGCAGGAACC CTAAACTCTG 120
TTTTTAGTGG AACTTCTGAG TATAAAAAAC AAĄT?AATCA AAACTTTCAA CAACGGATCT 180
CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC AAAATGCGAT AAGTAATGTG AATTGCAGAA 240
TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCG CCAGTATTCT GGCGGGCATG 300
CCTGTTCGAG CGTCATTTCA ACCCTCAAGC CCAGCTTGGT GTTGGGAGCT GCAGTCCTGC 360
TGCACTCCCC AAATACATTG GCGGTCACGT CGRAGCTTCC ATAGCGTAGT AATTTACATA 420
TCGTTACTGG TAATCGTCGC GGCYACGCCG TTAAACCCCA ACTTCTGAAT GTTGACCTCG 480
GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAA 504
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID :83:
0) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 503 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
182 212 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1..5.03 (D) Pozostałe informacje: /uwaga= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Fusarium graminearum (fgram.con) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:83:
GGATCATTAC CGAGTTTACW SACTCCCAAA CCCCTGTGAA CATACCTTAT GTTGCCTCGG 60
CGGATCAGCC CGCGCCCCGA AAGGGACGGC CCGCCGCAGG AACCCTAAAC TCTGTTTTTA 120
GTGGAACTTC TGAGTATAAA AAACAAATAA ATCAAAACTT TCAACAACGG ATCTCTTGGT 180
KCTGGCATCG ATGAAGAACG CASCRAAATG CGATAAGTAA TGTGWATTGC AGAATTCAGT 240
GAATCAWCGA ATCTTTGAAC GCWSATTGCK MCCRCCAGTA TTCTGGCGGG CATGCCTGTT 300
CGAGCGTCAT TTCAACCCTC AAGCCCAGVT TGGTGTKGGG GARYTGCAGK CCTRYTKCAC 360
TCCCCAAATA ARTTGGCGGT CACGTCGAAC TTCCATAGCG TAGTAAGTTA CACATCGTTA 420
CTGGTAATCG TCGCGGCTAC GCCGTTAAAC CCCAACTTCT GAATGTTGAC CTCGGATCAG 480
GTAGGAATAC CCGCTGAAGG TAA 503
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 84:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 353 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
Ciii) HIPOTETYCZNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1...353 (D) Pozostałe informacje: /ywaga= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Fusarium moniliforme (fmono.con)
182 212 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:84:
TCCGTAGGTG AACCTGCGGA TAGGRGTCAT TASMGAGTTT ACWACTSCCA AACCCCTGTG 60
AAYATACCTT ATGTTGCSTC GGCGGATCAG CCCGCGCSCC GTARFAAGGG ACGGCCCGCC 120
GCAGGAACCC TAAACTCTGT TTTTAGTGGA ACTTCTGAGT ATAAAAAACA AMAAATCAA 180
AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGGAGCA AAATGCGATA 240
AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGYGMCCGC 300
CAGTATTCTG GCGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCAA CCCTCAAGCC CAG 353
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 85:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 545 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
Ciii) HIPOTETYCZNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA: 1...545 (D) Pozostałe informacje: /uwaga= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Microdochium nivale (mnivale.txt) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR:85:
GCGGATCATT ACAGAGTTGC AAAACTCCCT AAACCATTGT GAACGTTACC TATACCGTTG60
CTTCGGCGGG CGGCCCCGGG GTTTACCCCC CGGRAGYCCC TGGKMCCCAC CGCGGGSGCC120
MGCCGGAGGT CACCAAACTC TTGATAATTT ATGGCCTCTC TGAGTCTTCT GTACTGAATA180
AGTCAAAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG TTCTGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT240
GCGATAAGTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGC300
GCCCGCCAGC ATTCTGGCGG GCATGCCTGT TCGAGCGTCA TTTCAACCAT CAAGCCCCCG360
GGCTTGTGTT GGGGACCTRC GGCTGCCGCA GGCCCTGAAA AGCAGTGKCG GGCTCGCTGT420
CGCACCGAGM GTAGTAGSAT ACATCTCGCT CTGGTCGCGC CGCGGGTTCC GGCCGTTAAA480
CCACCTTTTT AACCCAAGGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGA AGACCCGCTG AACTTACGCA540
TATCA
545
182 212 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 86:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 563 par zasad (B) TYP : kwas nukleinowy (C) RODZAJ NICI : pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (ix) CECHY:
(A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA: 1...563 (D) Pozostałe informacje: /uwaga= Sekwencja DNA Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika Septoria avenae
f. sp. tricicea ATCC# 26380 (satits.con) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 86:
TCCCGTAGGT GAACCTGCGG AAGGATCATT ACACTCAGTA GTTTACTACT GTAAAGGAGG 60
CTGTTAGTCT GTATAGCGCA AGCTGATGAG CAGCTAGCCT CTTTTATCCA CCCTTGTCTT 120
TTGCGTACCC ACGTTTCCTC GGCAGGCTTG CCTGCCGATT GGACAAACCT ATAACCTTTT 180
TAATTTTCAA TCAGCGTCTG AAAAACTTAA TAATTACAAC TTTCAACAAC GGATCTCTTG 240
GTTCTGGCAT CGATGAAGAA CGCAGCGAAA TGCGATAAGT AGTGTGAATT GCAGAATTCA 300
GTGAATCATC GAATCTTTGA ACGCACATTG CGCCCCTTGG TATTCCATGG GGCATGCCTG 360
TTCGAGCGTC ATTTGTACCC TCAAGCTCTG CTTGGTGTTG GGTGTTTGTC CTCTCCCTAG 420
TGTTTGGACT CGCCTTAAAA TAATTGGCAG CCAGTGTTTT GGTAYTGAAG CGCAGCACAA 480
GTCGCGATTC TTATCAAATA CTTGCGTCCA CAAGCCCTTT TTTAACTTTT GACCTCGGAT 540
CAGGTAGGAG ACCGCTGACT TAA
563
182 212
FIG. 1
182 212
182 212
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (8)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Izolowana cząsteczka DNA zawierająca sekwencję Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika wybranąz grupy złożonej z SEK NR ID: 82, SEK NR ID: 83 i SEK NR ID: 84 oraz SEKNRID: 85.
  2. 2. Starter oligonukleotydowy do stosowania w wykrywaniu bazującym na powielaniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika wybrany z grupy składającej z SEK NR ID:53 do 65.
  3. 3. Para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu bazującym na powielaniu grzybowej sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika wybrana z SEK NR ID:53 do 65 oraz SEK NR ID: 38 do 41.
  4. 4. Para starterów oligonukleotydowych według zastrz. 3, znamienna tym, że jest wybrana z następujących par starterów:
    SEK NR ID: 53 i SEK NR ID: 41,
    SEK NR ID: 53 i SEK NR ID: 59,
    SEK NR ID: 56 i SEK NR ID: 41,
    SEK NR ID: 56 i SEK NR ID: 59
    SEK NR ID: 38 i SEK NR ID: 59,
    SEK NR ID: 53 i SEK NR ID: 58,
    SEK NR ID: 56 i SEK NR ID: 58,
    SEK NR ID: 57 i SEK NR ID: 41,
    SEK NR ID: 57 i SEK NR ID: 58,
    SEK NR ID: 57 i SEK NR ID: 65,
    SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 41,
    SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 58,
    SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 59,
    SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 65,
    SEK NR ID: 55 i SEK NR ID: 41,
    SEK NR ID: 55 i SEK NR ID: 58,
    SEK NR ID: 55 i SEK NR ID: 59,
    SEK NR ID: 63 i SEK NR ID: 41,
    SEK NR ID: 63 i SEK NR ID: 65,
    SEK NR ID: 64 i SEK NR ID: 41,
    SEK NR ID: 64 i SEK NR ID: 58,
    SEK NR ID: 64 i SEK NR ID: 65,
    SEK NR ID: 38 i SEK NR ID: 58,
    SEK NR ID: 38 i SEK NR ID: 65,
    SEK NR ID: 38 i SEK NR ID: 62,
    182 212
    SEK NR ID: 56 i SEK NR ID: 62,
    SEK NR ID: 54 i SEK NR ID: 62,
    SEK NR ID: 61 i SEK NR ID: 41 oraz
    SEK NR ID: 61 i SEK NR ID: 59.
  5. 5. Sposób wykrywania patogenu grzybowego, znamienny tym, że (a) izoluje się DNA z liścia rośliny zainfekowanego patogenem, (b) powiela się część regionu Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika takiego patogenu przy zastosowaniu tego DNA jako matrycy w reakcji łańcuchowej polimerazy z parą starterów wy braną z grupy obejmującej SEK NR ID: 53 do 65 oraz SEK NR ID: 38 do 41 i następnie (c) wizualizuje się powielonączęść regionu Transkrybowanego Wewnętrznego Przerywnika.
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że patogen grzybowy jest wybrany spośród Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium moniliforme i Microdochium niw ale.
  7. 7. Zestaw do wykrywania Fusarium, znamienny tym, że zawiera nośnik umieszczony w bliskim sąsiedztwie jednego lub większej liczby pojemniczków, z których jeden zawiera starter wybrany z grupy obejmującej SEK NR ID: 53 do 65 oraz SEK NR ID: 38 do 41.
  8. 8. Sposób ilościowego, kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych, znamienny tym, że (a) izoluje się DNA z liścia rośliny zainfekowanej patogenem grzybowym, (b) powiela się w reakcji łańcuchowej polimerazy część sekwencji Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika tego patogenu grzybowego zastosowanej jako matryca z parą starterów wybranych z grupy obejmującej SEK NR ID: 53 do 65 oraz SEK NR ID: 38 do 41, jako starterów diagnostycznych i następnie (c) wizualizuje się tak powielonączęść regionu Wewnętrznego Transkrybowanego Przerywnika przy zastsowaniu startera wyłapującego wybranego z grupy obejmującej SEK NR ID: 19, 20,39 i 66-81.
    * * *
PL95342644A 1994-04-25 1995-04-19 Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowychdo stosow ania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Fusarium oraz sposób ilosciow ego,kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL PL182212B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/233,608 US5585238A (en) 1994-04-25 1994-04-25 Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction
PCT/US1995/004712 WO1995029260A2 (en) 1994-04-25 1995-04-19 Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL182212B1 true PL182212B1 (pl) 2001-11-30

Family

ID=22877959

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95342644A PL182212B1 (pl) 1994-04-25 1995-04-19 Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowychdo stosow ania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Fusarium oraz sposób ilosciow ego,kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL
PL95316962A PL182002B1 (pl) 1994-04-25 1995-04-19 Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu, bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Septoria oraz sposób ilosciowego, kolorymetrycznego wykrywania grzybowych patogenów PL
PL95342643A PL182188B1 (pl) 1994-04-25 1995-04-19 Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Pseudocercosporella herpotrichoides oraz sposób ilosciowego, kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95316962A PL182002B1 (pl) 1994-04-25 1995-04-19 Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu, bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Septoria oraz sposób ilosciowego, kolorymetrycznego wykrywania grzybowych patogenów PL
PL95342643A PL182188B1 (pl) 1994-04-25 1995-04-19 Izolowana czasteczka DNA zawierajaca sekwencje Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowych do stosowania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Pseudocercosporella herpotrichoides oraz sposób ilosciowego, kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL

Country Status (16)

Country Link
US (2) US5585238A (pl)
EP (2) EP0955381B1 (pl)
JP (1) JPH10501965A (pl)
CN (1) CN1072726C (pl)
AT (2) ATE189703T1 (pl)
AU (1) AU699766B2 (pl)
BR (1) BR9507513A (pl)
CA (1) CA2185560A1 (pl)
DE (2) DE69534933T2 (pl)
DK (1) DK0758404T3 (pl)
ES (1) ES2143051T3 (pl)
GR (1) GR3032928T3 (pl)
PL (3) PL182212B1 (pl)
PT (1) PT758404E (pl)
RU (1) RU2161196C2 (pl)
WO (1) WO1995029260A2 (pl)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585238A (en) * 1994-04-25 1996-12-17 Ciba-Geigy Corporation Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US6180339B1 (en) * 1995-01-13 2001-01-30 Bayer Corporation Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi
DE19615934C1 (de) * 1996-04-22 1997-10-02 Martin Ludwig Dr Niessen Verfahren zur qualitativen und quantitativen analytischen Erfassung des Schimmelpilzes Fusarium Graminearum in Reinkulturen und in jeglichem Probenmaterial
US5792611A (en) * 1996-05-23 1998-08-11 Natural Resources Canada, Canadian Forest Service Detection of plant pathogenic fungi
US6326485B1 (en) * 1996-07-26 2001-12-04 University Of Maryland Biotechnology Institute Assay for perkinsus in shellfish
US5874221A (en) * 1996-08-28 1999-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Species specific method for the PCR detection of phythophthora
US5814453A (en) * 1996-10-15 1998-09-29 Novartis Finance Corporation Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US5800997A (en) * 1996-11-01 1998-09-01 Novartis Finance Corporation Detection of maize fungal pathogens using the polymerase chain reaction
WO1998021571A1 (en) * 1996-11-11 1998-05-22 Novartis Ag Use of biosensors to diagnose plant diseases
JP4425354B2 (ja) * 1997-05-02 2010-03-03 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種および他の糸状菌を検出するための核酸
US5827695A (en) * 1997-08-04 1998-10-27 Novartis Finance Corporation Detection of wheat fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US6080543A (en) * 1997-12-08 2000-06-27 E. & J. Gallo Winery Detection of fungal pathogens
US6358680B1 (en) * 1998-02-20 2002-03-19 Syngenta Participations Ag Detection of wheat and barley fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US6248519B1 (en) * 1998-03-11 2001-06-19 E & J Gallo Winery Detection of fermentation-related microorganisms
US6387652B1 (en) * 1998-04-15 2002-05-14 U.S. Environmental Protection Agency Method of identifying and quantifying specific fungi and bacteria
FR2781812B1 (fr) * 1998-07-30 2002-12-20 Lallemand Sa Procede d'identification specifique de levures
DE19840531C2 (de) * 1998-08-28 2003-05-15 Roboscreen Ges Fuer Molekulare Mit Nukleinsäuren beschichtete Reaktionsräume, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US6221595B1 (en) * 1999-03-01 2001-04-24 Syngenta Participations Ag Detection of Monilinia spp. using the polymerase chain reaction
US6469156B1 (en) 1999-04-20 2002-10-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rapid and sensitive method for detecting histoplasma capsulatum
WO2000073499A2 (en) * 1999-05-28 2000-12-07 Innogenetics N.V. Nucleic acid probes and methods for detecting clinically important fungal pathogens
CN1249253C (zh) * 1999-08-10 2006-04-05 辛根塔参与股份公司 基于PCR检测和定量Tapesia yallundae和Tapesia acuformis
US6319673B1 (en) * 1999-08-10 2001-11-20 Syngenta Participations Ag PCR-based detection and quantification of Tapesia yallundae and Tapesia acuformis
GB2354764A (en) * 1999-09-30 2001-04-04 Mini Agriculture & Fisheries Detection of microorganisms in plant material
US6485907B1 (en) * 2000-01-11 2002-11-26 Syngenta Participations Ag PCR-based detection of Rhizoctonia cerealis
US6287779B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 E. & J. Gallo Winery Detection of fermentation-related microorganisms
CN1436248A (zh) * 2000-06-16 2003-08-13 辛根塔参与股份公司 利用聚合酶链式反应对球腔菌属的检测
US6645720B2 (en) * 2001-03-09 2003-11-11 Syngenta Participations Ag Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US6846631B2 (en) * 2001-09-24 2005-01-25 Syngenta Participations Ag Detection of Fusarium species infecting corn using the polymerase chain reaction
DE60234461D1 (de) * 2001-09-26 2009-12-31 Us Gov Health & Human Serv Nukleinsäuren zur identifizierung von pilzen und verfahren zu deren verwendung
ES2193861B1 (es) * 2001-12-20 2005-03-01 Universidad De Cordoba Metodo para la identificacion molecular de fusarium oxysporum f. sp. ciceris y sus razas patogenicas 0,5 y 6 mediante pcr especifica.
ES2193862B1 (es) * 2001-12-20 2005-03-01 Universidad De Cordoba Metodo para el analisis molecular de la diversidad genetica en razas de fusarium oxysporum f. sp. ciceris mediante rep-pcr.
US20040166492A1 (en) * 2002-02-05 2004-08-26 Engel Stacia R. Quantitative detection of dekkera and saccharomyces
AU2003230759A1 (en) * 2002-04-03 2003-10-20 Syngenta Participations Ag Detection of wheat and barley fungal pathogens which are resistant to certain fungicides using the polymerase chain reaction
UY28769A1 (es) 2004-03-30 2005-09-30 Monsanto Technology Llc Métodos para controlar agentes patógenos en plantas usando n-fosfonometilglicina
EP3167900B1 (en) 2006-03-29 2018-11-21 Merial Limited Vaccine against streptococci
DE102007010311A1 (de) * 2007-02-23 2008-08-28 Thines, Marco, Dr. Organismusspezifisches hybridisierbares Nucleinsäuremolekül
RU2465332C1 (ru) * 2011-08-08 2012-10-27 Общество с ограниченной ответственностью "Лесная диагностика" Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя болезней лиственных пород - гриба polyporus squamosus методом полимеразной цепной реакции
CN104630369B (zh) * 2015-02-13 2016-02-24 湖南农业大学 水稻恶苗病菌的pcr检测方法
CN104846094A (zh) * 2015-05-13 2015-08-19 青岛农业大学 草莓根腐病害多种病原菌分子快速检测方法及应用
PE20211635A1 (es) 2018-07-17 2021-08-24 Bayer Sas Metodos biologicos para controlar hongos fitopatogenicos
JP7399451B2 (ja) * 2019-10-02 2023-12-18 国立大学法人九州大学 バラタナゴ類の判別方法及び判別キット
RU2735911C1 (ru) * 2020-06-01 2020-11-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный лесотехнический университет имени Г.Ф. Морозова" Способ идентификации гриба Heterobasidion annosum
CN113637788B (zh) * 2021-07-30 2024-09-20 贵州茅台酒股份有限公司 一种构建重组质粒对样本中真菌进行绝对定量的方法
CN115838639B (zh) * 2022-12-17 2024-02-13 昆明理工大学 白茅种子内生真菌df101及其应用
CN116790779A (zh) * 2023-08-14 2023-09-22 广东美格基因科技有限公司 一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5447848A (en) * 1986-01-22 1995-09-05 Amoco Corporation Detection of campylobacter with nucleic acid probes
CA2025181A1 (en) * 1989-10-12 1991-04-13 William G. Weisburg Nucleic acid probes and methods for detecting fungi
US5126239A (en) * 1990-03-14 1992-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences
US5585238A (en) * 1994-04-25 1996-12-17 Ciba-Geigy Corporation Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction

Also Published As

Publication number Publication date
EP0758404A1 (en) 1997-02-19
US5955274A (en) 1999-09-21
WO1995029260A2 (en) 1995-11-02
DE69515029T2 (de) 2000-09-21
CN1147276A (zh) 1997-04-09
CN1072726C (zh) 2001-10-10
EP0955381B1 (en) 2006-04-12
PT758404E (pt) 2000-06-30
JPH10501965A (ja) 1998-02-24
CA2185560A1 (en) 1995-11-02
DE69515029D1 (de) 2000-03-16
ATE189703T1 (de) 2000-02-15
DE69534933D1 (de) 2006-05-24
GR3032928T3 (en) 2000-07-31
US5585238A (en) 1996-12-17
DE69534933T2 (de) 2006-09-07
RU2161196C2 (ru) 2000-12-27
BR9507513A (pt) 1997-09-02
EP0758404B1 (en) 2000-02-09
EP0955381A2 (en) 1999-11-10
EP0955381A3 (en) 2003-06-11
WO1995029260A3 (en) 1995-12-28
PL182002B1 (pl) 2001-10-31
DK0758404T3 (da) 2000-07-24
AU699766B2 (en) 1998-12-17
PL316962A1 (en) 1997-02-17
ATE323177T1 (de) 2006-04-15
PL182188B1 (pl) 2001-11-30
ES2143051T3 (es) 2000-05-01
AU2424495A (en) 1995-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL182212B1 (pl) Przerywnika, starter oligonukleotydowy i para starterów oligonukleotydowychdo stosow ania w wykrywaniu bazujacym na powieleniu grzybowej sekwencji Wewnetrznego Transkrybowanego Przerywnika, sposób wykrywania patogenu grzybowego, zestaw do wykrywania Fusarium oraz sposób ilosciow ego,kolorymetrycznego wykrywania patogenów grzybowych PL
US5800997A (en) Detection of maize fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US5827695A (en) Detection of wheat fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US5874221A (en) Species specific method for the PCR detection of phythophthora
US5814453A (en) Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US6846631B2 (en) Detection of Fusarium species infecting corn using the polymerase chain reaction
AU744803B2 (en) Detection of wheat and barley fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US20030190658A1 (en) Diagnostics for the detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli, causal agent of bacterial fruit blotch in melons
US6221595B1 (en) Detection of Monilinia spp. using the polymerase chain reaction
US6733972B2 (en) Detection of mycosphaerella using the polymerase chain reaction
US6319673B1 (en) PCR-based detection and quantification of Tapesia yallundae and Tapesia acuformis
Evans et al. Genetic markers in rust fungi and their application to weed biocontrol.
AU6440500A (en) Pcr-based detection and quantification of tapesia yallundae and tapesia acuformis
US5811240A (en) Species-specific mitochondrial sequences for identification of Tilletia indica, the karnal bunt wheat fungus and methods of using said sequences
Catal Development and testing of oligonucleotide probes for detection and identification of some fungal pathogens and endophytes of conifers
AU2004210551A1 (en) PCR-based detection and quantification of Tapesia yallundae and Tapesia acuformis

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20070419