CN113637788B

CN113637788B - 一种构建重组质粒对样本中真菌进行绝对定量的方法

Info

Publication number: CN113637788B
Application number: CN202110870832.9A
Authority: CN
Inventors: 王莉; 杜海; 吕锡斌; 郝飞; 陈良强; 杨帆; 王和玉; 徐岩; 周天慈
Original assignee: Kweichow Moutai Co Ltd
Current assignee: Kweichow Moutai Co Ltd
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2024-09-20
Anticipated expiration: 2041-07-30
Also published as: CN113637788A

Abstract

本申请属于生物工程领域，具体涉及一种构建重组质粒对样本中真菌进行绝对定量的方法。方法包括先获得待测样本中真菌的种类，然后以这些真菌的ITS2基因分别构建重组质粒，最后将这些重组质粒进行混合并以混合质粒中各重组质粒的的reads数为依据直接计算得到各真菌在待测样本中的浓度，避免了微生物计数的步骤，操作更为简便，利用本发明的方法对样本中真菌进行绝对定量的目的性较强、准确性较高。

Description

一种构建重组质粒对样本中真菌进行绝对定量的方法

技术领域

本申请属于生物工程领域，具体涉及一种构建重组质粒对样本中真菌进行绝对定量的方法。

背景技术

中国白酒酿造历史悠久，其独特的口感深受国人喜爱。在历史上，与饮酒相关所形成的特色酒文化甚至成为中国传统文化的一部分。如今，白酒已经成为一种日常消费品，销售额逐年攀升。大曲是中国传统酿造必不可少的组成部分，在白酒的酿造生产中扮演着糖化、液化、提供风味物质的重要角色。在白酒的酿造过程中，大曲也是其产品控制的重要指标。酿酒先辈们从酿酒实践中得出结论:“曲乃酒之骨”、“有好酒必有好曲”。常用的大曲原料有小麦、大麦和豌豆，通过将粉碎的原料与一定水分进行混合然后进行压制成型。大曲在培养的过程中微生物的生长与代谢为后期的产品的酿造生产提供了丰富且独特的微生物种群、酶类、发酵前体物质。根据固态发酵过程中最高曲温的不同可以将大曲区分为低温大曲(40-50℃)、中温大曲(50-60℃)和高温大曲(60-65℃)。

在传统的固态白酒酿造工艺中，微生物贯穿于白酒生产过程的始终。在一定程度上可以说酿酒就是培养微生物获取代谢产物的过程。酿酒微生物的种类和比例决定了代谢产物的种类和含量，也就决定了酒中呈香味物质的种类和含量，也就决定了酒的口味和风格。大曲含有丰富的微生物群落，如霉菌、酵母菌、醋酸菌。其中，真菌的作用不容忽视。例如，粟酒裂殖酵母作为核心产酒菌群具有良好的产醇能力，在酱香型白酒中，其作为强化酵母添加到发酵酒醅中，能够在提高乙醇的产率的同时不影响其他风味代谢物质的生成。因此，揭示大曲真菌微生物群落多样性，解析风味物质变化背后的微生物驱动力，改善白酒酿造工艺，生产质量稳定的白酒，具有极大的现实意义。

近些年，高通量测序技术已被广泛应用于白酒样品中微生物群落结构的研究。高通量测序技术可以大大降低测序的成本，能够实现样品中微生物的大规模平行测序，极大地拓展了我们对白酒微生物群落结构的理解。我们可以根据OTU测得的reads数相对于单个样品总reads数的比例来表征各种类在微生物群落的相对丰度。但是，由于高通量测序的技术限制，微生物组成仅以相对丰度来表征，测序结果中缺乏微生物的绝对含量指标。我们可以采用相对丰度判断物种的优势程度，却无法用于比较某物种在不同样品中数量的多少。相对丰度的表征形式使得跨样本、跨域比较存在困难，当不同样本微生物总量不一致时，若误用相对丰度进行跨样本比较，可能会导致错误的结论。因此，绝对含量作为一个恒定的定量指标，不受总量变化的影响，在跨样本比较时，具有不可替代的优势。

然而，现有的构建重组质粒对白酒样品中的真菌进行绝对定量的方法很少，在白酒样品中真菌普遍存在与绝对丰度相比，相对丰度被高估或者低估的现象。因此，在白酒样品中真菌定量方面还存在很多亟待解决的问题。白酒样本中真菌绝对定量的方法对填补该领域的空白，提升我们对大曲微生物群落结构认识的深度，弥补高通量测序技术中绝对含量的缺失，进一步解析大曲微生物群落结构是十分必要且具有重要意义的。

发明内容

本发明弥补了现有的对于白酒样品(如大曲、酒醅)中真菌绝对定量方法的缺失，在现有的白酒样品中真菌定量方法的基础上，提出了另外一种利用重组质粒和内参相结合的真菌定量方法，该定量方法具有准确性更高、针对性更强的特点。

一方面，本申请提供了一种对样本中的真菌进行绝对定量的方法，包括以下步骤：

S1、提取待测样本的基因组DNA；

S2、对步骤S1提取的基因组DNA进行测序，获得样本中真菌种类；

S3、向待测样本中加入内参，所述内参如SEQ ID NO.：1所示；

S4、将待测样本中各真菌的ITS2分别导入质粒中，构建携带真菌ITS2基因的重组质粒；

S5、将步骤S4构建的各重组质粒与步骤S3所述的内参混合，得到混合物；

S6、检测：

S6.1、检测S3制备的含有内参的待测样本的以下参数：含有内参的待测样本中此真菌的reads数R1，和含有内参的待测样本中内参的reads数R2；

S6.2、检测S5制备的混合物中的以下参数：携带某真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的reads数r1，和内参在混合物中的reads数r2；

S7、计算步骤S2测得的各真菌在待测样本中的浓度，计算公式为：

样本中某一真菌的浓度＝(R1/R2)×某一真菌的矫正因子；

某一真菌的矫正因子＝携带此真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的浓度c×(r1/r2)。

在一些实施方案中，携带此真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的浓度使用蛋白核酸测定分光光度计测定。

在一些实施方案中，所述步骤S2中为进行高通量测序；在一些实施方案中，所述高通量测序的引物与SEQ ID NO.：2和3所示。

在一些实施方案中，所述步骤S3中向待测样本中加入内参，至内参的浓度为1×10⁶-1×10⁸copies/mL；在一些实施方案中，加入内参至内参的浓度为1×10⁷copies/mL。

在一些实施方案中，所述真菌选自库德里阿兹氏毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的至少一种。

在一些实施方案中，所述步骤S4中的IT2如SEQ ID NO.:4-12中的至少一种所示。

在一些实施方案中，所述步骤S5中的各重组质粒与内参等比例混合。

在一些实施方案中，所述样本选自大曲、酒醅中的至少一种；在一些实施方案中，所述样本选自大曲。

在一些实施方案中，所述重组质粒的载体选自pET-28a(+)质粒、pET-21a(+)、和PGEX-6P质粒中的至少一种；在一些实施方案中，所述重组质粒的载体为pET-28a(+)质粒。

在一些实施方案中，所述重组质料转化的宿主细胞选自真菌或细菌；在一些实施方案中，所述宿主细胞选自细菌；在一些实施方案中，所述宿主细胞选自大肠杆菌。

在一些实施方案中，所述reads数通过高通量测序测定。

本发明的方法为先获得待测样本中真菌的种类，然后带有针对性的将这些真菌的ITS2基因分别构建重组质粒，最后将这些重组质粒进行混合并以混合质粒中各重组质粒的的reads数为依据直接计算得到各真菌在待测样本中的浓度，避免了微生物计数的步骤，操作更为简便，具有更强的目的性。

本发明相比较于之前一种内标定量样品中的所有真菌的方法，本专利为每一个真菌构建了一个重组质粒，并引入了矫正因子的概念，用一种重组质粒定量一种真菌，可以对目的真菌的绝对丰度进行准确评估，具有更高的准确性。

本发明弥补了利用高通量测序技术只能获得样品相对丰度，可以准确判定真菌的绝对丰度，从而有效避免真菌丰度值被高估或低估的现象。真菌丰度的准确评估有利于提升对微生物群落结构认识的深度，弥补高通量测序技术中绝对含量的缺失。

附图说明

图1：pET-28a(+)质粒和合成的分别用于检测库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母绝对含量的内参DNA片段的双酶切验证结果。

图2：分别用于检测库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母绝对含量的重组质粒的PCR验证结果。

图3：分别用于检测库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母绝对含量的重组质粒的质粒图谱。

图4：相对丰度与绝对丰度的比较。

图5：绝对定量测序结果。

表4：丰度差异。

图6：标准曲线。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109以及大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pET-28a(+)质粒购自Novagen公司(上述菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)；下述实施例中涉及的大曲购自贵州地区某酱香型白酒公司；下述实施例中涉及的Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒购自根生化科技(北京)有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g L^-1、胰蛋白胨10.0g L^-1、NaCl 10.0g L^-1、氨苄青霉素100μg L^-1。

LB固体培养基：酵母粉5.0g L^-1、胰蛋白胨10.0g L^-1、NaCl 10.0g L^-1、琼脂粉15gL^-1、氨苄青霉素100μg L^-1。

实施例1：可用于检测样本中真菌绝对含量的方法的构建

具体步骤如下：

提取待测样本的基因组DNA，根据参考文献“Fungi Sailing the Arctic Ocean:Speciose Communities in North Atlantic Driftwood as Revealed by High-Throughput Amplicon Sequencing”所提供的上下游引物，以核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA片段作为上游引物、以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA片段作为下游引物对混合物进行高通量测序，得到待测样本中真菌的种类；将内参添加至待测样本中，至待测样本中内参的浓度为1×10⁷copies/mL，得到含有内参的待测样本；将待测样本中各真菌的ITS2基因分别导入构建的重组质粒中，得到分别携带各真菌ITS2基因的重组质粒；将各重组质粒和内参进行混合，得到混合物；检测混合物中各重组质粒的reads数和内参的reads数，检测含有内参的待测样本中各真菌的reads数和内参的reads数，根据各重组质粒在混合物中的浓度利用公式计算得到各真菌在待测样本中的浓度，其中，公式如下：

样本中某一真菌的浓度＝(含有内参的待测样本中此真菌的reads数/含有内参的待测样本中内参的reads数)×此真菌的矫正因子；

某一真菌的矫正因子＝携带此真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的浓度/(携带此真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的reads数/内参在混合物中的reads数)。

携带此真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的浓度使用蛋白核酸测定分光光度计测定，根据Dhanasekaran描述的方法计算质粒拷贝数。

实施例2：可用于检测样本中真菌绝对含量的方法的应用

使用实施例1的方法检测大曲中真菌的绝对含量，具体步骤如下：

使用Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取待测大曲的基因组DNA，以核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA片段作为上游引物、以核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的DNA片段作为下游引物对混合物进行高通量测序(高通量测序由北京奥维森基因科技有限公司完成)，根据高通量测序结果，选取库德里阿兹氏毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)、德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，比较库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母的ITS2基因(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.12所示)与pET-28a(+)质粒中的多克隆位点(MCS)，确定酶切位点为BamHⅠ、SalⅠ。

按照公开号为CN111172256A的专利申请文本，制备得到内参；将内参添加至待测大曲中，至待测大曲中内参的浓度为1×10⁷copies/mL，得到含有内参的待测大曲。

化学合成库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母的ITS2基因，并在ITS2基因的两端加上BamH、SalⅠ的酶切位点，得到分别用于检测库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母绝对含量的内参DNA片段。

以pET-28a(+)质粒和合成的分别用于检测库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母绝对含量的内参DNA片段为模板，使用BamHⅠ、SalⅠ进行双酶切(酶切体系见表1，双酶切之后，取5μL内参DNA片段的双酶切产物用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定结果见图1)。

表1双酶切体系

Reaction mixture	Volume(μL)
		Buffer	5
BamhⅠ	1
		SalⅠ	1
模板DNA	25
		dd H₂O	18
Total volume	50

双酶切产物加入4倍体积的CP buffer，加入上层管中12000r/min离心2min，重复上样一次；加入700μL DNA Wash Buffer，12000r/min离心2min，倒掉下层收集管的液体，重复一次；将空吸附柱空离一次，12000r/min离心2min，换上1.5mL新的离心管装上柱子；空离之后加热挥发酒精，60℃，1～2min；吸30-50μL ddH₂O(60℃预热)，12000r/min离心2min洗脱DNA；将柱纯化产物使用T4连接酶，16℃连接16h(连接体系见表2)；

表2连接体系

Reaction mixture	Volume(μL)
		Buffer	2
片段1(真菌的ITS2序列)	2
		片段2(pET-28a(+)序列)	1
T4 ligase	1
		dd H₂O	14
Total volume	20

连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒以ITS2F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为上游引物、以ITS2R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)为下游引物进行PCR验证以及测序，获得验证正确的分别用于检测库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母绝对含量的重组质粒，其中，PCR反应参数：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，25个循环之后，72℃延伸30s，PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定(验证体系见表3，结果见图2)。

表3 PCR验证体系

Reaction mixture	Volume(μL)
		Mixture	10
上游引物	1
		下游引物	1
模板DNA	1
		dd H₂O	7
Total volume	20

将验证正确的重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，即获得分别含有用于检测库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母绝对含量的重组质粒的重组大肠杆菌；将获得的重组大肠杆菌涂布于LB固体培养基，于37℃培养8～10h，获得单菌落；挑取单菌落接入LB液体培养基，于37℃培养12～14h，获得种子液；将种子液按照4％(v/v)的接种量接入LB液体培养基，于37℃、200rpm培养8h，得到发酵液；将发酵液于4℃、1000rpm离心20min后，收集菌体；从菌体中提取扩增得到的分别用于检测库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母绝对含量的重组质粒(质粒图谱将图3)。

将获得的分别用于检测库德里阿兹氏毕赤酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、扣囊复膜酵母、德尔布有孢圆酵母、小孢根霉、酿酒酵母、宛氏拟青霉和粟酒裂殖酵母绝对含量的重组质粒与内参按照等数量比等比例(1:1:1:1:1:1:1:1:1:1)进行混合，得到混合物，混合物中各重组质粒和内参的含量均为1×10⁷copies/g；将混合物以ITS2F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为上游引物、以ITS2R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)为下游引物进行高通量测序(高通量测序由北京奥维森基因科技有限公司完成)，得到混合物中各重组质粒的reads数和内参的reads数，将含有内参的待测大曲以ITS2F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)为上游引物、以ITS2R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)为下游引物进行高通量测序(高通量测序由北京奥维森基因科技有限公司完成)，得到含有内参的待测大曲中各真菌的reads数和内参的reads数，根据各重组质粒在混合物中的浓度利用公式计算得到各真菌在待测大曲中的浓度，其中，公式如下：

样本中某一真菌的浓度＝(含有内参的待测样本中此真菌的reads数R1/含有内参的待测样本中内参的reads数R2)×此真菌的矫正因子；

某一真菌的矫正因子＝携带此真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的浓度c/(携带此真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的reads数r1/内参在混合物中的reads数r2)。

通过测序可知，大曲中含有库德里阿兹氏毕赤酵母、扣囊复膜酵母、小孢根霉、酿酒酵母、胶红酵母、异常威克汉姆酵母、德尔布有孢圆酵母、宛氏拟青霉，而粟酒裂殖酵母在此大曲样本中不涵盖。

表4重组质粒混合物中的r1、r2数值，以及矫正因子的计算

表5大曲样本中的R1、R2数值，以及各真菌的浓度定量结果

经过绝对定量计算，我们在大曲中含有的8种真菌视作整体，我们根据以下公式比较了它们相对丰度与绝对丰度之间的差异(丰度比较结果见图4)。

某一真菌的丰度差异＝此真菌相对丰度在8种真菌中的占比-此真菌的绝对丰度在8种真菌中的占比。

其中，丰度差异数值为正数表示，与绝对丰度相比，相对丰度高估了多少；丰度差异数值为负数表示，与绝对丰度相比，相对丰度低估了多少。我们发现，与绝对丰度相比，库德里阿兹氏毕赤酵母高估了50.73％，而扣囊复膜酵母则被低估了13.42％，酿酒酵母被低估了28.62％(详细结果见表6)。

表6

同时，定量结果显示，酿酒酵母在大曲中的绝对含量为5.89×10⁷copies/g，扣囊复膜酵母在大曲中的绝对含量为4.85×10⁷copies/g，小孢根霉在大曲中的绝对含量为1.93×10⁷copies/g，库德里阿兹氏毕赤酵母在大曲中的绝对含量为8.59×10⁶copies/g(定量结果见表5，图5)。

实施例3：可用于检测样本中真菌绝对含量的方法的验证

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有良好的产乙醇能力，是白酒酿造体系的核心真菌，所以从定量的8种真菌中选择酿酒酵母进行定量方法的验证。

具体实施方法如下：从样本中筛选得到酿酒酵母，采用血球计数板法查细胞数为1.0×10⁹cells/g，将其分别稀释到对应细胞数为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴cells/g后，使用Plant Genomic Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取酿酒酵母的基因组DNA，并设计酿酒酵母特异性引物ScAIRIF-CACAATGGGGCAAAGGCTTC，ScAIRIR-GCCAGAACTGAAGCACAAGC，然后对提取的基因组通过StepOnePlus仪(购自赛默飞)进行荧光定量PCR。反应体系为：总体系20μL:2×Fast qPCR Master Mix10μL，上下游引物各0.4μL，基因组1μL，超纯水8.2μL。反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃10s，退火50℃0.5min，延伸70℃1min，共40个循环，70℃10min。

以qPCR测得的CT值为横坐标，以稀释浓度对应的细胞数值为纵坐标，绘制标准曲线(标准曲线见图6)。将获得的CT值19.02代入图6标准曲线，最终得到大曲样本中酿酒酵母的含量为：10⁷cells/g。因为酿酒酵母细胞里基因的拷贝数不唯一，所以样本中酿酒酵母含量应高于10⁷copies/g。

公开号CN111172256A的专利申请文本对成品高温曲粉中各真菌进行了绝对定量，检测结果中酿酒酵母的绝对含量为10⁶copies/g左右。在实施例2的结果中显示应用本方法得到酿酒酵母在高温大曲中的绝对含量为5.89×10⁷copies/g。可见，应用本方法得到的酿酒酵母绝对含量更接近真实值。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 贵州茅台酒股份有限公司

<120> 一种构建重组质粒对样本中真菌进行绝对定量的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 272

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcatcgatga agaacgcagc gtcgtagtta accgtcatat tcgctgacca gtagtaagtt 60

agattgtggt ctagcggtaa ggtgaagagt ggtcggaccg gcgcatccga gggttctcgt 120

agcccgcgca gtcctaggat tctagcgaca tcagggttct gattgtagac agcagttgtc 180

tcgttagcct cgttagagag gcagtagttg gtagtgtaga ctccatgtgg tgtattcgtt 240

acgagactga tggcatatca ataagcggag ga 272

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcatcgatga agaacgcagc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 4

<211> 308

<212> DNA

<213> Pichia kudriavzevii

<400> 4

cgaaatgcga tacctagtgt gaattgcagc catcgtgaat catcgagttc ttgaacgcac 60

attgcgcccc tcggcattcc ggggggcatg cctgtttgag cgtcgtttcc atcttgcgcg 120

tgcgcagagt tgggggagcg gagcggacga cgtgtaaaga gcgtcggagc tgcgactcgc 180

ctgaaaggga gcgaagctgg ccgagcgaac tagacttttt ttcagggacg cttggcggcc 240

gagagcgagt gttgcgagac aacaaaaagc tcgacctcaa atcaggtagg aatacccgct 300

gaacttaa 308

<210> 5

<211> 364

<212> DNA

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<400> 5

gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac 60

cttgcgctcc atggtattcc gtggagcatg cctgtttgag tgtcatgaat acttcaaccc 120

tcctctttct taatgattga agaggtgttt ggtttctgag cgctgctggc ctttagggtc 180

tagctcgttc gtaatgcatt agcatccgca atcgaacttc ggattgactt ggcgtaatag 240

actattcgct gaggaattct agtcttcgga ctagagccgg gttgggttaa aggaagcttc 300

taatcagaat gtctacattt taagattaga tctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac 360

ttaa 364

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> Wickerhamomyces anomalus

<400> 6

cgaaatgcga tacgtattgt gaattgcaga ttttcgtgaa tcatcgaatc tttgaacgca 60

cattgcaccc tctggtattc cagagggtat gcctgtttga gcgtcatttc tctctcaaac 120

cttcgggttt ggtattgagt gatactctgt caagggttaa cttgaaatat tgacttagca 180

agagtgtact aataagcagt ctttctgaaa taatgtatta ggttcttcca actcgttata 240

tcagctaggc aggtttagaa gtattttagg ctcggcttaa caacaataaa ctaaaagttt 300

gacctcaaat caggtaggac tacccgctga acttaa 336

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> Saccharomycopsis fibuligera

<400> 7

cgaattgcga taagtaatgt gaattgcaga ttttcgtgaa tcatcgaatc tttgaacgca 60

tattgcgctc tatagtattc tatagagcat gcctgtttga gcgtcatttc tctcttaaac 120

ctttgggttt agtattgaag gttgtgttag cttctgctaa ctcctttgaa atgacttggc 180

aattgattga gttttccata tatttgctta aggatttaat attaggttct accaacttat 240

taaataccct tttgcgaagg acttactcgt gtatcaaggc cttataactt tgtcattaat 300

tttgacctca aatcaggtaa ggatacccgc tgaacttaa 339

<210> 8

<211> 406

<212> DNA

<213> Torulaspora delbrueckii

<400> 8

cgaaatgcga tacgtaatgt gaattgcaga attccgtgaa tcatcgaatc tttgaacgca 60

cattgcgccc cttggtattc cagggggcat gcctgtttga gcgtcatttc cttctcaaac 120

aatcatgttt ggtagtgagt gatactctgt caagggttaa cttgaaattg ctagcctgtt 180

atttggttgt gattttgctg gcttggatga ctttgtccag tctagctaat accgaattgt 240

cgtattaggt tttaccaact tcggcagact gtgtgttggc tcgggcgctt taaagacttt 300

gtcgtaaacg atttatcgtt tgtttgagct tttcgcatac gcaatccggc gaacaatact 360

ctcaaagttt gacctcaaat caggtaggaa tacccgctga acttaa 406

<210> 9

<211> 348

<212> DNA

<213> Rhizopus microsporus

<400> 9

aaagtgcgat aactagtgtg aattgcatat tcgtgaatca tcgagtcttt gaacgcagct 60

tgcactctat ggatcttcta tagagtacgc ttgcttcagt atcataacca acccacacat 120

aaaatttatt ttatgtggtg atggacaagc tcggttaaat ttaattatta taccgattgt 180

ctaaaataca gcctctttgt aattttcatt aaattacgaa ctacctagcc atcgtgcttt 240

tttggtccaa ccaaaaaaca tataatctag gggttctgct agccagcaga tattttaatg 300

atctttaact atgatctgaa gtcaagtggg actacccgct gaacttaa 348

<210> 10

<211> 382

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 10

gaaatgcgat acgtaatgtg aattgcagaa ttccgtgaat catcgaatct ttgaacgcac 60

attgcgcccc ttggtattcc agggggcatg cctgtttgag cgtcatttcc ttctcaaaca 120

ttcatgtttg gtagtgagtg atactctttg gagttaactt gaaattgctg gccttttcat 180

tggatgtttt ttttttccaa agagaggttt ctctgcgtgc ttgaggtata atgcaagtac 240

ggtcgtttta ggttttacca actgcggcta atctttttta tactgagcgt attggaacgt 300

tatcgataag aagagagcgt ctaggcgaac aatgttctta aagtttgacc tcaaatcagg 360

taggagtacc cgctgaactt aa 382

<210> 11

<211> 311

<212> DNA

<213> Paecilomyces variotii

<400> 11

gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgagtct ttgaacgcac 60

attgcgcccc ctggtattcc ggggggcatg cctgtccgag cgtcatttct gccctcaagc 120

acggcttgtg tgttgggccc cgtcctccga tcccggggga cgggcccgaa aggcagcggc 180

ggcaccgcgt ccggtcctcg agcgtatggg gctttgtcac ccgctctgta ggcccggccg 240

gcgcttgccg atcaacccaa atttttatcc aggttgacct cggatcaggt agggataccc 300

gctgaactta a 311

<210> 12

<211> 422

<212> DNA

<213> Schizosaccharomyces pombe

<400> 12

gaaatgcgat acgtaatgtg aattgcagaa ttccgtgaat catcgaatct ttgaacgcac 60

attgcgcctt tgggttctac caaaggcatg cctgtttgag tgtcattaca atcttctcac 120

aaaaatgttt ttgatgaggt gttgaacgaa aatttgtttt ttttttaaaa taaatttagt 180

ttgaaatcga ttggtgaaaa caaaaggaag attgaaatta tttttctata ccttttttca 240

ttttttttct attgaacgta ataggtttta ccactttgtt tgatagaaaa agaaattagg 300

aaagaaaaat aactaaagtt ttaatctctt ttatatttga accttaacga aaaaaaatat 360

atttttttca cagcactctt ttatttgacc tcaaatcagg taggactacg cgctgaactt 420

aa 422

Claims

1.一种对样本中的真菌进行绝对定量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取待测样本的基因组DNA；

S3、向待测样本中加入内参，所述内参的序列如SEQ ID NO.：1所示，加入内参至内参的浓度为1×10⁷copies/mL；

S4、将待测样本中在步骤S2测得的各真菌的ITS2分别导入质粒中，构建携带真菌ITS2基因的重组质粒；

S5、将步骤S4构建的各重组质粒与步骤S3所述的内参按照数量比等比例混合，得到混合物，混合物中各重组质粒和内参的含量均为1×10⁷copies/g；

S6、检测：

样本中某一真菌的浓度=（R1/R2）×某一真菌的矫正因子；

某一真菌的矫正因子=携带此真菌ITS2基因的重组质粒在混合物中的浓度c×（r1/r2）；

所述真菌选自库德里阿兹氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）、小孢根霉（Rhizopus microsporus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中的至少一种；

所述步骤S4中的IT2的序列如SEQ ID NO.:4-12中的至少一种所示；

所述样本为大曲。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中为进行高通量测序。

3.如权利要求2所述的方法，所述高通量测序的引物的序列如SEQ ID NO.：2和3所示。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述重组质粒的载体选自pET-28a(+)质粒、pET-21a(+)、和PGEX-6P质粒中的至少一种。

5.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET-28a(+)质粒。

6.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述重组质粒转化的宿主细胞选自真菌或细菌。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞选自细菌。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌。