JPH10501965A

JPH10501965A - ポリメラーゼ連鎖反応を使用する菌類病原体の検出

Info

Publication number: JPH10501965A
Application number: JP7527703A
Authority: JP
Inventors: リゴン，ジェームズ，エム．; ベック，ジェームズ，ジェイ．
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-19
Publication date: 1998-02-24
Also published as: DE69515029T2; WO1995029260A3; DE69534933T2; EP0955381A3; PL182212B1; BR9507513A; EP0758404B1; RU2161196C2; DE69534933D1; CN1147276A; AU699766B2; EP0955381A2; PT758404E; EP0758404A1; US5585238A; GR3032928T3; DE69515029D1; WO1995029260A2; PL316962A1; AU2424495A

Abstract

(57)【要約】リボソームＲＮＡ遺伝子領域の内在性転写スペーサーからのＤＮＡ配列はセプトリア、シュードセルコスポレラ、フサリウムおよびマイコスフェレラの異なる種および菌株に対して記載されている。これらの配列の中の特異的なプライマーはＰＣＲに基づいた方法を用いる菌類単離体の同定のために有用であることが確認されている。

Description

【発明の詳細な説明】ポリメラーゼ連鎖反応を使用する菌類病原体の検出技術分野本発明は菌類病原体の検出のためのポリメラーゼ連鎖反応アッセイにおける種特異的なプライマーの使用に関するものである。これらのプライマーの使用は菌類病原体の特定の単離体の検出および植物集団における病害発生の追跡を可能にする。発明の背景植物における病害は毎年毎年かなりの量の作物の損失を引き起し、結果として農業従事者に経済的な損失や、それとは別に世界の多くの地域において一部の人々のための食物供給の不足を生じている。殺菌剤の広範囲の使用は植物病原体の攻撃に対してかなりの安全性をもたらした。しかしながら、１億ドル分の殺菌剤を消費したにもかかわらず、１９８１年における世界規模の作物損失は作物価格の約１０％のぼった（James，1981; Seed Sci．& Technol．9: 679-685）。病害の破壊的な経過の過酷さは病原体の攻撃の程度や宿主の応答に応じて決まる。多くの植物育種計画の一つの目的は病害に対する宿主植物の耐性を高めることである。典型的には、異なる品種の病原体は同じ栽培種の異なる変種とは別様式で相互作用し、そして宿主耐性の多くの供給源だけが特定の病原体品種から保護する。さらに、いくつかの病原体品種は病害の徴候を初期に示すが、作物に対する損害をほとんど引き起こさない。ジョーンズおよびクリフォード（ 1983; Cereal Diseases，John Wiley）は、病原体のビルレント体は宿主の栽培変種中への耐性の導入に応答して病原体集団で出現すると予測されること、およびそれ故に病原体集団を追跡する必要性があることを報告している。さらに、特定の菌類に対して耐性である菌株の進化についていくつかの証明された事例がある。１９８１年に早くもフレッチャーおよびウォルフ（1981; Proc．1981 Brit ．Crop．Prot．Conf．）は、春大麦からの粉状のカビの個体群の２４％および冬大麦からの５３％が殺菌剤トリアジメノールに応答してかなりの量の変動を示すこと、およびこれら個体群の分布が最も感受性の変種を有する変種間で変化し、感受性が低いタイプの最高の発生頻度を与えることを強く主張した。殺菌剤に対する菌類の感受性における同様の変動が小麦カビ（ウドンコ病菌）（これもまたトリアジメノールに対して）、ボトリチス（Botrytis）（ベノミルに対して）、ピレノフォラ（Pyrenophora）（有機水銀に対して）、シュードセルコスポレラ（Pseudocercosporella）（ＭＢＣ型殺菌剤に対して）およびトリアゾールに対するマイコスフェレラ・フィジエンシス（Mycosphaerella fijiensis）に対してほんの少し言及されて立証されている（Jones and Clifford; Cereal Diseases ，John Wiley，1983）。穀物種は世界中で栽培され、そして世界の食物生産の主要な部分を占める。収量損失は多くの病原体により引き起こされるけれども、壊死性病原体セプトリア（Septoria）およびシュードセルコスポレラはヨーロッパおよび北米の主な穀物栽培地域において特に重要である（Jones and Clifford ; Cereal Diseases，John Wiley，1983）。特に、異なる単離体およびこれら菌類の種により惹起される異なる徴候論は可能性のある病害損失の正確な予測を困難にしている。結果的に、特定の病原体の迅速かつ正確な同定のための改良された診断技術の能力は農場の病害研究者に対してかなりの用途があるであろう。４つのセプトリア種は小さい穀粒種に寄生する。セプトリア・トリチシ（Sept oria tritici）は葉斑の原因菌であり、小麦に有毒であるが、ライ小麦やライ麦にも寄生する。それは典型的には葉壊死を引き起こす。セプトリア・ノドルム（ Septoria nodorum）は頴斑の原因菌であり、小麦、ライ小麦、ライ麦および大麦に寄生性であり、そして包頴に主として限定されるけれども、葉身および葉鞘上にも見られる。セプトリア・アベナエ（Septoria avenae）はオート麦、小麦およびライ小麦に寄生性であり、そしてセプトリア・パッセリニイ（Septoria pas serinii）は大麦に限定されている。セプトリア病害は全ての小麦栽培地域において経済的に重要なレベルで発生する。異なるセプトリア病害はしばしば農場内および個々の植物に同時に頻発し、その場合の病害の徴候は「セプトリア・コンプレックス」と集合的に呼称され得る。典型的に最も共通して見られる種はセプトリア・トリチシおよびセプトリア・ノドルムである。バイス（1977; Compendium of Wheat Diseases，Amer．Ph ytopath．Soc．pages 42-45）によれば、現在、セプトリア・コンプレックスは世界の小麦を毎年２％近く破壊し、収量の損失は主として損なわれた穀粒充填に起因する。殺菌剤処理は厳しいセプトリア感染の場合に２０％まで節約し得るが、感染の初期に異なるセプトリア種間を区別することはしばしば困難であり、そしてこのことは異なる栽培変種が様々なセプトリア種に対して異なる程度の耐性を示すので、殺菌剤使用に踏み切るか否かの決定を困難にしている。穀類の眼状斑点病は真菌のシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（Sp eudocercosporella herpotrichoides）により引き起こされ、そして植物の茎基部に限定されている。小麦、ライ麦、オート麦およびその他のイネ科植物は寒冷多湿気候で発生する眼状斑点病に感受性であり、そしてヨーロッパ、北および南アメリカ、アフリカおよびオーストラリアにおいて流行する。小麦は最も感受性の穀物種であるが、その他の穀類にも有害である単離体が同定されている。菌類のＲ株は例えばライ麦から単離され、そして小麦から単離されたＷ株に比べ小麦上でより緩慢に増殖する。眼状斑点病は分蘖または植物体を完全に殺し得るけれども、それはより頻繁に倒伏を引き起し、および／または結果として穀粒の大きさや数の減少を招く。眼状斑点病と関連する収量減少はセプトリア・トリチシおよびセプトリア・ノドルムと関連する収量減少に比べ相当に大規模である。眼状斑点病に対する典型的な防除手段は節間を強化する生長調節剤での処理や殺菌剤処理を包含する。菌類の異なる株に対する栽培品種の異なる感受性は殺菌剤処理の効果予測を困難にしている。バナナのシガトカ葉斑は各々が異なる菌類により引き起こされる２形態で発生する。経済的に重大なブラックシガトカはマイコスフェレラ・フィジエンシスにより引き起こされ、一方経済的な重大さが少ないイエローシガトカはマイコスフェレラ・ムシコラ（Mycosphaerella musicola）により引き起こされる（Johanso n and Jeger，1993; Mycol．Res．97: 670-674）。ブラックシガトカは３０％以上の過酷な損失を引き起こし、バナナにおいて主要な問題である。マイコスフェレラ・フィジエンシスにおける殺菌剤耐性が出現するために、殺菌剤の使用は耐性がさらに出現するのを防止するために限定されるのべきである。結果的に、治療用具の有用性はさらに耐性を発生させる危険を不必要におかすことなく殺菌剤を利用するための適当な環境を同定する重要な手段を提供する。従って、感染過程の初期に病原体菌類の特定品種の同定を可能にする技術の開発に対して真の要望がある。病害の徴候が作物に明らかになる前に、病原体の特定品種を同定することにより、農業従事者は同定された栽培品種における病原体のさらなる進行の可能性のある影響を評価し得、そして処理が必要と考えられるならば適当な殺菌剤を選択できる。発明の要約本発明は植物病原性菌類の異なる病原型の同定方法に関するものである。本発明は異なる菌類の病原型の間の変異性を示すＤＮＡ配列を提供する。そのようなＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく診断アッセイに使用するためのプライマーを誘導するために使用され得るので、本発明の方法に有用である。上記プライマーはＤＮＡ鋳型が特定の菌類病原型により与えられるＰＣＲ反応において独特な断片（ユニーク断片）を生成し、そしてそれ故に病害の徴候が見られる前に宿主植物材料において特定の病原型の存在または不在を同定するために使用され得る。本発明は特定の栽培品種−病原体菌株関係における潜在的な損傷を評価する可能性および利用可能である菌類の多様な攻撃材料を上手く利用する可能性を提供する。さらに、本発明は拡大した地理的領域に及ぶ特定の病原体品種の発生や蔓延に詳しい情報を提供するために使用され得る。本発明は長い潜伏期を有する病害、例えば小麦へのセプトリア・ノドルムまたはセプトリア・トリチシおよびバナナへのマイコスフェレラ・フィジエンシスにより引き起こされる病害に特に適している検出方法を提供する。本発明の実施に有用なキットもまた提供される。該キットにはセプトリア、シュードセルコスポレラ、フサリウムおよびマイコスフェレラ病原体の同定における特定の用途がある。図面の説明図１セプトリア・トリチシ、セプトリア・ノドルム、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスＷ株（２変種）、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスＲ株、マイコスフェレラ・フィジエンシスおよびマイコスフェレラ・ムシコラからの内在性転写スペーサー配列のアラインメント。図２セプトリア・ノドルムおよびセプトリア・アベナエ亜種トリチセアからの内在性転写スペーサー配列のアラインメント。図３フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フサリウム・クルモルム（Fusarium culmorum）、フサリウム・モニリフォルメ（Fusarium moni liforme）およびミクロドチウム・ニバレ（Microdochium nivale）からの内在性転写スペーサー配列のアラインメント。発明の詳細な説明本発明は植物病原菌の異なる病原型の同定に有用であるユニークＤＮＡ配列を提供する。特に該ＤＮＡ配列は菌類病原型の同定のためのＰＣＲに基づく分析においてプライマーとして使用され得る。本発明のＤＮＡ配列は特定の菌類病原体のリボソームＲＮＡ遺伝子領域の内在性転写スペーサー（ＩＴＳ）ならびに上記の特定の病原体を同定することができるこれらの領域から誘導されるプライマーを包含する。種または属の異なる構成員の間で変化する病原体種または属内の異なる病原型からの上記ＩＴＳＤＮＡ配列はそれらの特定の構成員を同定するために使用され得る。生体臨床医学研究者は感染動物組織内の病原体を検出するためにＰＣＲに基づく技術を長い間ある程度の成功を収めて使用してきた。しかしながら、ごく最近、この技術は植物病原体を検出するために適用されている。感染された小麦におけるガウマンノマイセス・グラミニス（Gaumannomyces graminis）の存在は病原体ミトコンドリアゲノムに特異的な配列のＰＣＲを用いて検出されており（Schl esser 等，1991; Applied and Environ．Microbiol．57: 553-556）、そしてランダム増幅多型性ＤＮＡ（すなわちＲＡＰＤ）マーカーは針葉樹における硬皮性癌腫病（scleroderris canker）の原因菌であるグレメニエレ・アビエチナ（Gre mmeniella abietina）の多数の品種を区別することができた。リボソーム遺伝子はコピー数が多いことにより分子プローブ標的としての使用に適している。成熟ｒＲＮＡ配列の間の高い保存にもかかわらず、非転写および転写スペーサー配列は通常あまり保存されず、従って最近の進化的分岐の検出のための標的配列として適している。菌類のｒＲＮＡ遺伝子はユニット内に組織化されており、その各ユニットは１８Ｓ、５．８Ｓおよび２８Ｓの３種の成熟サブユニットをそれぞれコード化する。これらのサブユニットは約３００ｂｐの２種の内在性転写スペーサーＩＴＳ１およびＩＴＳ２により分断されている（White 等，1990; PCR Protocols; Innes等編 ; 315-322頁）。さらに、転写ユニットは非転写スペーサー配列（ＮＴＳ）により分断されている。ＩＴＳおよびＮＴＳ配列は異なる菌類病原体の特定の病原型の検出に特に適している。本発明のＤＮＡ配列は異なる植物病原体のリボソームＲＮＡ遺伝子領域の内在性転写スペーサー（ＩＴＳ）に由来する。病原体種または属内の異なる病原型からのＩＴＳＤＮＡ配列は種または属の異なる構成員間で変化する。病原体のＩＴＳ配列を一旦決定したら、これらの配列はその他のＩＴＳ配列と並べられ得る。このようにしてプライマーはＩＴＳ配列から誘導され得る。すなわちプライマーは菌類の病原型の間で配列の最大の相違を含有するＩＴＳ領域内の領域に基づいて設計され得る。これらの配列およびそれらの配列に基づいたプライマーは特定の病原体構成員を同定するために使用され得る。当該の特定のＤＮＡ配列はセプトリア、特にセプトリア・ノドルムおよびセプトリア・トリチシ；マイコスフェレラ、特にマイコスフェレラ・フィジエンシスおよびマイコスフェレラ・ムシコラ；シュードセルコスポレラ、特にシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス、とりわけシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスのＷ株およびＲ株、フサリウム、特にフサリウム・グラミネアルム、フサリウム・クルモルム、フサリウム・モニリフォルメおよびミクロドチウム・ニバレからのＩＴＳＤＮＡ配列を包含する。上記ＩＴＳＤＮＡ配列ならびに当該プライマーは配列番号：１−４７および配列番号：５０− ８６に示されている。該配列は当該病原型のＰＣＲをベースとする同定における用途を見出す。ＰＣＲ分析において本発明のプライマー配列を使用する方法は当業界で十分に知られている。例えば米国特許第４６８３１９５号および同第４６８３２０２号ならびにSchlesser 等（1991）Applied and Environ．Microbiol．57: 553-556 参照。また、ベルチシリウム・アルボ−アトラム（Verticillium albo-atrum）およびベルチシリウム・ダーリアエ（Verticillium dahliae）のＩＴＳ領域における相違を活用し、それ故に２種間の区別を行うためにＰＣＲ増幅を用いたNaza r 等（1991; physiol．and Molec．Plant Pathol．39: 1-11）；およびバナナ病原体であるマイコスフェレラ・フィジエンシスとマイコスフェレラ・ムシコラとを区別するために同様の方法を用いたJohansonおよびJeger（1993; Mycol．Res ．97: 670-674）参照。本発明のＩＴＳＤＮＡ配列は当業界で公知の方法により菌類病原体からクローン化され得る。一般に菌類単離体からＤＮＡを単離するための方法は公知である。ReaderおよびBroda（1985 ）Letters in Applied Microbiology 2: 17-20 ； Lee等（1990）Fungal geneti cs Newsletter 35: 23-24; およびLee およびTaylor(1990): PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications; Inners等（編）； 282-287頁参照。また、当該ＩＴＳ領域はＰＣＲ増幅により決定され得る。全体のＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーはWhite 等（1990; PCR Protocols; Innes等編; 315- 322頁）に従って設計され、そして増幅されたＩＴＳ配列はｐＣＲIIクローニングベクター中にサブクローニングされた。サブクローニングされた配列は左側ＩＴＳ（ＩＴＳ１）、右側ＩＴＳ（ＩＴＳ２）ならびに中央に位置する５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子を包含していた。これはセプトリア・ノドルムおよびセプトリア・トリチシ、多数のシュードセルコスポレラ単離体およびマイコスフェレラ・フィジエンシス、マイコスフェレラ・ムシコラ、セプトリア・アベナエ・トリチセア、フサリウム・グラミネアルム、フサリウム・クルモルム、フサリウム・モニリフォルメおよびミクロドチウム・ニバレに対して行われた。ＩＴＳ配列が決定され、そして各病原体群の中で異なる種および／または菌株を区別するためにＰＣＲで試験するのに有用であり得る上記配列が分岐位置を確認するために比較された。決定されたＩＴＳ領域の配列は配列番号１〜６、４７および８２〜８６として示され、そして図１、２および３にも示されている。分岐の同定から、多数のプライマーは合成され、そしてＰＣＲ増幅において試験された。ＰＣＲ増幅試験のために使用された鋳型は最初に精製病原体ＤＮＡであり、次いで感染宿主植物組織から単離されたＤＮＡであった。従って、診断的である、すなわち１つの特定の病原体種または菌株を同定するが、同一病原体の別の種や菌株を同定しないプライマーの対を同定することが可能だった。好ましいプライマーの組合せは感染宿主組織、すなわち特定の病原体種または菌株に前もって感染された宿主組織における異なる種または菌株の間を区別することができる。本発明はセプトリア、マイコスフェレラおよびフサリウムの異なる種およびシュードセルコスポレラの異なる菌株に対して上記基準を満たす多くのプライマーの組合せを提供する。本発明のプライマーは菌類ＩＴＳ領域間の配列の相違に基づいて設計されている。配列間の塩基対の最低１つの相違は区別し得るプライマーの設計を可能にする。特定の菌類のＤＮＡのＩＴＳ領域に対して設計されたプライマーは種特異的ＰＣＲ断片を増幅するためのリボソームＤＮＡコード領域内の保存配列領域に対して作成されたプライマーと組み合わせて使用されてもよい。通常、プライマーは良好な感度を得るために約６０〜約７０℃の間の理論的融点を有するべきであり、そして顕著な２次構造およびプライマー組合せ間の３’ オーバーラップを欠いているべきである。プライマーは一般に少なくとも約５ないし約１０ヌクレオチド塩基である。診断目的のためのプライマーの選択に対するクローン化ＩＴＳ配列の有用性はそれらの急速な進化的分岐に大きく起因する。例えば病原体シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスのＷ型およびＲ型単離体は、診断的プライマーが開発される分岐ＩＴＳ配列を有することが見出された。しかしながら、ＩＴＳ配列内の急速分岐は、Ｗ型の２つの異なる配列変種が同定された観察から明白である。Ｗ型内の配列同一性は９９．４％であり、他方、ＷおよびＲ型は９８．６％であり、ＷおよびＲ型間に見出されたものに比べ、２種のＷ変種の間のより近い進化的関係を示唆している。このより近い関係はまた、分岐ＩＴＳ配列を有する２種の単離体のそれらの類似の宿主病原性から明らかである。菌類の単離体のＰＣＲ診断のためのＩＴＳ誘導配列からのプライマーの開発に加え、本発明はまた、ＰＣＲに使用される場合に、セプトリア・ノドルムとセプトリア・トリチシとを区別し得るＲＡＰＤプライマーライブラリーからのプライマーの同定を包含する。スクリーニングされるプライマーは市販されて利用可能であり、そしてオペロン・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（カリフォルニア州アラメダ）から入手された。セプトリアゲノムＤＮＡに対するスクリーニングにより、セプトリア・トリチシのみを検出することができる２種のプライマーおよびセプトリア・ノドルムのみを検出することができる３種のプライマーを同定した。本発明は上記方法を実施するのに必要な要素を含有する「キット」の調製にそれ自体容易に導く。そのようなキットはその中に１またはそれ以上の容器手段、例えばチューブまたはバイアルを密閉して収容するために区画されているキャリア（担体）からなっていてもよい。上記容器手段の１つは非標識または検出可能に標識されたＤＮＡプライマーを含有し得る。標識ＤＮＡプライマーは凍結乾燥形態で存在してもよいし、必要に応じて適当な緩衝剤中に存在してもよい。１またはそれ以上の容器手段はＰＣＲ反応において利用されるべき酵素または試薬を１種またはそれ以上含有してもよい。これらの酵素はそれのみで、または混合物で、凍結乾燥された形態または適当な緩衝剤中に存在してもよい。最後に、キットは本発明の技術を実施するのに必要な全ての追加の要素、例えば緩衝剤（液）、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、ヌクレオシド三リン酸塩、濾紙、ゲル剤、移送材料、オートラジオグラフィーサプライ等を含有してもよい。以下の限定されない実施例はＩＴＳ配列の単離、適当なプライマー配列の選択、選択的および診断的効力のためのプライマーの試験、および病害や菌類単離体検出のための上記プライマーの使用に用いられる得る典型的な実験プロトコルを示す。そのような実施例は説明のためのものであって限定のためのものではない。実施例実施例１：菌類単離体およびゲノムＤＮＡ抽出セプトリア・ノドルム、セプトリア・トリチシ、セプトリア・パッセリニ、セプトリア・グリシネス、シュードセルコポレラ・ヘルポトリコイデス、シュードセルコポレラ・アエスチバ、マイコスフェレラ・シトリ、マイコスフェレラ・グラミニコラ、マイコスフェレラ・フィジエンシスおよびマイコスフェレラ・ムシコラの生存可能な菌単離体はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られた。フサリウム・クルモルムおよびフサリウム・グラミネアルム単離体はペン・ステート・ユニバーシティのポール・ニルソン博士から得られた。ミクロドチウム・ニバレ（異名フサリウム・ニバレ）の単離体はチバ−バーゼルから受領され、そしてフサリウム・モニリフォルメの単離体はロラル・カストル博士から受領された。菌類はＰＤＡ（ポテト・デキストロース・アガー）培地からの菌糸断片を接種したポテトデキストロースブロス１５０ｍｌ中で増殖させた。培養体は軌道シェーカー上２８℃で７−１１日間保温された。Lee およびTaylor（ 1990; PCR Protocol: A Guide to Methods and Applications ; Innes 等編; 28 2-287頁）のプロトコルを用いて、菌糸が遠心分離によりペレット化され、次に液体窒素中で粉砕され、そして全ゲノムＤＮＡが抽出された。テキサスＡ＆Ｍユニバーシティのブルース・マクドナルド博士はセプトリア・ノドルムの１０種の単離体およびセプトリア・トリチシの９種の単離体からのゲノムＤＮＡを提供した。バーギンガム・ユニバーシティのクリス・ケイトン博士はセプトリア・ノドルムの精製菌体ＤＮＡの６種の単離体を提供した。シュードセルコポレラ・ヘルポトリコイデスの１２種の単離体からの精製ゲノムＤＮＡは英国ノーウィッチ，ザ・ジョン・イネス・センターのポール・ニコルソン博士から得られた。これらの単離体のうち６種はＷ型由来であり、その他の６種はＲ型由来である。これらの単離体は病原性およびＲＦＬＰ法に基づいて分類された。ザ・ナチュラル・リソーシーズのアンドレア・ヨハンソンはマイコスフェレラ・ムシコラの６種の単離体、マイコスフェレラ・フィジエンシスの６種の単離体およびマイコスフェレラ・ムサエの１種の単離体のゲノムＤＮＡを供給した。セプトリア・アベナエ亜種トリチセアＡＴＣＣ＃２６３８０からの精製ゲノムＤＮＡはメリーランド州ベルツビレにあるＵＳＤＡのピーター・エング博士により供給された。実施例２：内在性転写スペーサー（ＩＴＳ）領域の単離約５５０ｂｐの内在性転写スペーサー領域の断片は、セプトリア・ノドルム（ＡＴＣＣ＃２４４２５）、セプトリア・トリチシ（ＡＴＣＣ＃２６５１７）、シュードセルコポレラ・ヘルポトリコイデス単離体Ｒ１，Ｒ２，Ｗ２およびＷ５、マイコスフェレラ・フィジエンシス（ＡＴＣＣ＃２２１１５）およびマイコスフェレラ・ムシコラ（ＡＴＣＣ＃２２１１５）から単離されたゲノムＤＮＡ２５ｎｇからプライマーＩＴＳ１（５’−ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ− ３’；配列番号：３８）およびＩＴＳ４（５’−ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’；配列番号：４１）５０ピコモルを用いてＰＣＲ増幅された。ＰＣＲは反応が１００μｌ中で行われ、そしてアニーニングが５０℃で行われた以外は実施例４に記載されるように行われた。ＩＴＳ断片はManiatis等（1982 ; Molecular Cloning ; Maniatis等編； 461-462頁）に従ってイソプロパノール沈澱により精製された。ＤＮＡはｄＨ₂Ｏ５０μｌ中に再懸濁され、そしてｐＣＲIIクローニングベクターを用いるザ・インビトロゲン・コーポレーション（カリフォルニア州サンディエゴ）のＴＡクローニングキット（部品番号Ｋ２０００ −０１）を使用してクローニングされた。ＩＴＳ領域のＤＮＡ配列はザ・アプライド・バイオシステムズ（カリフォルニア州フォスターシティ）の自動化シーケンサー３７３Ａ型を用いるジデオキシ法によりプライマーＩＴＳ１（上記参照）、ＩＴＳ２（５’−ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ−３’；配列番号：３９）、ＩＴＳ４（上記参照）およびＭ１３ユニバーサル−２０（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’；配列番号：４８）およびリバース（５’−ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’；配列番号：４９）プライマーを使用して決定された。ＩＴＳ領域をクローニングするために使用されたＩＴＳプライマーＩＴＳ１（配列番号：３８）、ＩＴＳ２（配列番号：３９）、ＩＴＳ３（配列番号：４０）およびＩＴＳ４（配列番号：４１）はWhite 等（1990; PCR Protocols; Innes等編，315-322 頁）に詳細に記載されている。さらに、内在性転写スペーサー領域はセプトリア・アベナエ亜種トリチセア、ミクロドチウム・ニバレ、フサリウム・モニリフォルメ（♯４５５１）、フサリウム・グラミネアルム単離体Ｒ−８４１７，Ｒ−８５４６およびＲ−８４２２およびフサリウム・クルモルム単離体Ｒ−５１２６，Ｒ−５１０６およびＲ−５１４６からのゲノムＤＮＡ２５ｎｇからＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物はプロメガのウイザードＤＮＡクリーンアップキット（ウイスコンシン州マジソン）を用いて精製された。ＩＴＳ領域のＤＮＡ配列は上記のようにＩＴＳ１（配列番号：３８）、ＩＴＳ２（配列番号：３９）、ＩＴＳ３（配列番号：４０）およびＩＴＳ４（配列番号：４１）プライマーを用いて決定された。配列決定反応はフサリウム・クルモルムおよびフサリウム・グラミネアルムの３種の単離体を組合せ、フサリウム・クルモルムおよびフサリウム・グラミネアルムに対するコンセンサス配列を生成した。実施例３：小麦およびバナナの葉からのＤＮＡ抽出マイクロプローブコーポレーション（カリフォルニア州ガーデン・グローブ）のイソクイック・ヌクレイックアシッド・エクストラクション・キット（カタログ番号ＭＸＴ−０２０−１００）からの急速ＤＮＡ抽出プロトコルの変法を用いて小麦の葉からＤＮＡは抽出された。全ＤＮＡ約１００ｎｇが各ＰＣＲアッセイにおいて使用された。変形された急速ＤＮＡ抽出：初めてキットを使用する前に、試薬２Ａ（２０ｘ染料原液）の全内容物が試薬２（抽出マトリックス）に添加された。（１）試料緩衝液Ａ５０μｌおよび♯１溶菌溶液５０μｌを含有する１．５ｍｌエッペンドルフチューブに葉試料約０．２ｇを添加する。（２）試薬２（抽出マトリックス）を激しく攪拌する。３５０μｌの試薬２を試料溶菌液に添加する。（３）２００μｌの試薬３を試料に添加する（抽出緩衝液）。試料を２０秒間攪拌する。（４）１２０００×ｇで５分間微量遠心分離。（５）水相（上層）を新しい微量遠心チューブに移す。この容量は典型的には約２００μｌである。（６）水相試料へ試薬４（酢酸ナトリウム）の水相０．１倍容量。（７）同容量のイソプロパノールを水相試料に添加し、次に攪拌。（８）１２０００×ｇで１０分間微量遠心分離。（９）核酸ペレットを乱すことなく上清を廃棄する。２０℃の７０％エタノール０．５ｍｌをペレットに添加する。チューブを攪拌し混合する。（１０）１２０００×ｇで５分間微量遠心分離。（１１）上清を廃棄し、そしてペレットを乾燥させる。（１２）核酸ペレットを５０μｌの試薬５（ＲＮアーゼ無水物）中に溶解させる。実施例４：ポリメラーゼ連鎖反応増幅ポリメラーゼ連鎖反応はパーキン−エルマー／シータスからのジーンアンプ・キット（コネチカット州ノーウォーク；カタログ番号Ｎ８０８−０００９）を用い、５０ｍＭＫＣｌ，２．５ｍＭＭｇＣｌ₂，各々１００μＭのＴＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰを含有する１０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．３，５０ｐＭプライマー，Taq ポリメラーゼ２．５単位およびゲノムＤＮＡ２５ｎｇを最終的な容量５０μｌで使用して行われた。反応はパーキン−エルマー／シータスモデル９６００サーマルサイクラーにおいて９４℃で１５秒、５０℃、６０℃または７０℃で１５秒および７２℃で４５秒を３０サイクル行った。生成物は１．１−１．２％アガロースゲルに各ＰＣＲ試料を２０μｌ供試し、そして電気泳動することにより分析した。実施例５：オリゴヌクレオチドの合成および精製オリゴヌクレオチド（プライマー）はＢ−シアノチル−ホスホロアミダイト化学を利用するアプライド・バイオシステムズ３８０ＡＤＮＡシンセサイザー上で合成された。実施例６：種特異的プライマーの選択セプトリア・ノドルム、セプトリア・トリチシ、シュードセルコポレラ・ヘルポトリコイデスＲ株およびＷ株、マイコスフェレラ・フィジエンシスおよびマイコスフェレラ・ムシコラのＩＴＳ配列を並列させアラインメントを作成した（図１）。セプトリア・ノドルムおよびセプトリア・アベナエのＩＴＳ配列を並列させアラインメントを作成した（図２）。アラインメントはまた、フサリウム・グラミネアルム、フサリウム・クルモルム、フサリウム・モニリフォルメおよびミクロドチウム・ニバレからのＩＴＳ配列についても作成された（図３）。プライマー群は並列された配列の分析に基づき実施例５に従って合成された。図１−２に対する菌種の間の配列において最大の相違を含む領域に対してプライマーは設計された。図３において、プライマーはフサリウムに対するＩＴＳ内で最大の相同性を示す領域に対して設計された。さらに、公にされたリボソーム遺伝子特異的プライマーＩＴＳ１（配列番号：３８）、ＩＴＳ２（配列番号：３９）、ＩＴＳ３（配列番号：４０）およびＩＴＳ４（配列番号：４１）（White 等（1990; PCR Protocol s; Innes等編，315-322頁）はＩＴＳ領域に特異的なプライマーと組み合わせて試験するために合成された。実施例７：ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）プライマーの選択２０種のオリゴヌクレオチドの２種のＲＡＰＤプライマーライブラリー（キットＢおよびＥ）は各々オペロン・テクノロジーズ・インコーポレーテッド（カリフォルニア州アラメダ）から購入した。プライマーはセプトリア・ノドルム、セプトリア・トリチシ、マイコスフェレラ・フィジエンシスおよびマイコスフェレラ・ムシコラの精製ゲノムＤＮＡを区別し得る能力が試験された。ＰＣＲ条件は、ＰＣＲサイクルの数が３５に増加され、アーリング温度が３０℃であり、そして各プライマー５ピコモルだけが使用される以外は実施例４の記載と実質的に同じだった。セプトリア・ノドルム、セプトリア・トリチシ、マイコスフェレラ・フィジエンシスおよびマイコスフェレラ・ムシコラの精製ゲノムＤＮＡを区別する５種のＲＡＰＤプライマーが同定された。プライマーＯＰＢ−１２およびＯＰＥ−６はセプトリア・トリチシゲノムＤＮＡで増幅された場合単一断片を製造した。プライマーＯＰＥ−１２、ＯＰＢ−１９およびＯＰＥ−１５はセプトリア・ノドルムゲノムＤＮＡから単一断片を製造した。プライマーＯＰＢ−１２およびＯＰＥ−６はセプトリア・ノドルム、マイコスフェレラ・フィジエンシスおよびマイコスフェレラ・ムシコラゲノムＤＮＡから何らかの増幅産物を製造しなかった。プライマーＯＰＥ−１２、ＯＰＢ−１９およびＯＰＥ−１５はセプトリア・トリチシ、マイコスフェレラ・フィジエンシスまたはマイコスフェレラ・ムシコラのゲノムＤＮＡから何らかの断片を増幅しなかった。実施例８：精製菌類ゲノムＤＮＡに対するプライマー特異性の決定単一の種特異的断片を増殖させる試みで異なるプライマーの組合せを用いてＰＣＲが実施例４に準拠して行われた。種特異的ＰＣＲ増幅産物は当該各菌株の１８Ｓと２５ＳリボソームＤＮＡサブユニットの間のＩＴＳ領域から設計されたプライマーから製造された。実施例９：菌類に感染した植物組織に対するプライマー特異性の検出全ゲノムＤＮＡは実施例３に記載したプロトコルを用いて健康な小麦の葉、セプトリア・ノドルムに感染した小麦の葉、セプトリア・トリチシに感染した小麦の葉およびセプトリア・ノドルムおよびセプトリア・トリチシの両方に感染した小麦の葉から単離された。ＰＣＲは実施例４に記載したように小麦の葉からのＤＮＡに対して実施例８に挙げたプライマーの組合せを試験して行われた。セプトリア・トリチシ特異的プライマーＪＢ４４６（配列番号：１２）およびＩＴＳ１（配列番号：３８）（ＪＢ４１０）は、精製したセプトリア・トリチシＤＮＡから、セプトリア・トリシチに感染した小麦の葉の組織から、そしてセプトリア・トリチシセプトリア・ノドルムの両方に感染した小麦の葉の試料から３４５ｂｐ断片を増幅した。プライマーセットは健康な小麦の葉の組織やセプトリア・ノドルムに感染した小麦の組織から診断に有用な断片を増幅しなかった。同様に、セプトリア・トリチシ特異的プライマーＪＢ４４５（配列番号：１１）およびＩＴＳ４（配列番号：４１）（ＪＢ４１５）はプライマー組合せＪＢ４４６（配列番号：１２）およびＩＴＳ１（配列番号：３８）（ＪＢ４１０）と同じ組織から４０７ｂｐ断片を増幅し、そして診断上有用であった。同様に、診断上有用な結果は、セプトリア・ノドルム特異的プライマーＪＢ４３３（配列番号：７）およびＪＢ４３４（配列番号：８）を用いて得られた。プライマーはセプトリア・ノドルムに感染した小麦の組織から、セプトリア・ノドルムおよびセプトリア・トリチシの両方に感染した小麦の葉の試料から、ならびにセプトリア・ノドルムの精製ゲムノＤＮＡから４４８ｂｐ断片を増幅した。プライマー組合せＪＢ４３３（配列番号：７）およびＪＢ４３４（配列番号：８）は健康な小麦の組織から、セプトリア・トリチシに感染した小麦の組織から、またはセプトリア・トリチシの精製ゲノムＤＮＡからいずれの断片も増幅しなかった。セプトリア・ノドルム特異的プライマーＪＢ５２７（配列番号：１０）およびＪＢ５２５（配列番号：９）はＪＢ４３３（配列番号：７）およびＪＢ４３４（配列番号：８）の組合せと同じゲノムＤＮＡおよび小麦組織から４５８ｂｐ断片を増幅した。実施例８に挙げたシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスプライマーの組合せは実施例１２で得られたような小麦の茎からの抽出物に対してＰＣＲ試験が行われた。ＰＣＲは実施例４の記載に以下の変更を加えて行われた：９４℃１５秒および７０℃４５秒からなる３５サイクルが行われ、１．５−２．５ｍＭＭｇＣｌ₂および２００μＭ各ｄＮＴＰが使用された。小麦抽出物１μｌが各ＰＣＲで使用された。プライマー組合せＪＢ５３７（配列番号：１５）およびＪＢ５４１（配列番号：１９）はシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスのＷ型病原型に感染した小麦抽出物から４１３ｂｐ断片を増幅した。増幅生成物は健康な小麦抽出物からの増幅からも、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスのＲ型病原型に感染した小麦抽出物からの増幅からも産生されなかった。Ｒ型に感染した小麦から、プライマー組合せＪＢ５３９（配列番号：１７）およびＪＢ５４４（配列番号：２２）は４８７ｂｐ断片を増幅し、そしてプライマー組合せＪＢ５４０（配列番号：１８）およびＪＢ５４２（配列番号：２０）は４１３ｂｐ断片を増幅したが、Ｗ型に感染した小麦から増幅しなかった。全ゲノムＤＮＡは実施例３に記載したプロトコルを用いてまた健康なバナナの葉から、およびマイコスフェレラ・フィジエンシスに感染したバナナの葉から単離された。ＰＣＲは実施例４に記載したようにバナナの葉からのＤＮＡに対して実施例８に挙げたマイコスフェレラ・フィジエンシスプライマーの組合せを試験して行われた。マイコスフェレラ・フィジエンシス特異的プライマーＪＢ５４９（配列番号：２９）およびＩＴＳ１（配列番号：３８）（ＪＢ４１０）は精製マイコスフェレラ・フィジエンシスＤＮＡから、およびマイコスフェレラ・フィジエンシスに感染したバナナの葉の組織から４８９ｂｐ断片を増幅した。プライマーセットは健康なバナナの葉の組織から診断に有用な断片を増幅しなかった。マイコスフェレラ・フィジエンシス特異的プライマー組合せＪＢ４４３（配列番号：２６）／ＩＴＳ４（配列番号：４１）（ＪＢ４１５）およびＩＴＳ１（配列番号：３８）（ＪＢ４１０）／ＪＢ４４４（配列番号：３０）は、ＪＢ５４９（配列番号：２９）およびＩＴＳ１（配列番号：３８）（ＪＢ４１０）プライマー組合せと同じゲノムＤＮＡおよびバナナの葉の組織から４１８ｂｐ断片および４８２ｂｐ断片をそれぞれ増幅した。実施例１０：その他の種および単離体との種特異的プライマーの交差反応性の検出精製された菌類のゲノムＤＮＡは実施例１に記載したように得られ、そして種特異的プライマーを用いて実施例４に記載されたようにＰＣＲがアッセイされた。その他の菌類のＤＮＡ種および単離体はそれらと交差反応する能力を種特異的プライマーに対して試験された。セプトリア・トリチシ特異的プライマーＪＢ４４６（配列番号：１２）およびＩＴＳ１（配列番号：３８）（ＪＢ４１０）は実施例１に挙げたセプトリア・トリチシ単離体の全てから３４５ｂｐ断片を増幅した。セプトリア・ノドルム、セプトリア・グリシネスまたはセプトリア・パッセリニの精製ゲノムＤＮＡと交差反応性はなかった。これらのその他の菌類種はいずれもセプトリア・トリチシ特異的プライマーで増幅生成物を産生しなかった。４４８ｂｐ断片はセプトリア・ノドルム特異的プライマーＪＢ４３３（配列番号：７）およびＪＢ４３４（配列番号：８）を用いて実施例１に挙げたセプトリア・ノドルム単離体の全てから増幅された。同様に、セプトリア・ノドルム特異的プライマーＪＢ５２７（配列番号：１０）およびＪＢ５２５（配列番号：９）は実施例１に挙げたセプトリア・ノドルム単離体の全てから４５８ｂｐ断片を増幅した。セプトリア・トリチシ、セプトリア・グリシネスおよびセプトリア・パッセリニは、セプトリア・ノドルム特異的プライマーセットＪＢ４３３（配列番号：７）およびＪＢ４３４（配列番号：８）またはプライマーＪＢ５２７（配列番号：１０）およびＪＢ５２５（配列番号：９）のいずれかとアッセイが行われた場合、増幅生成物を産生しなかった。ＰＣＲは実施例９に記載した条件、その他の菌類ＤＮＡ種に対する実施例８に挙げたシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス特異的プライマー組合せおよび実施例１に挙げた単離体を用いて行われた。プライマー組合せＪＢ５３７（配列番号：１５）およびＪＢ５４１（配列番号：１９）は、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス単離体および以下の穀類病原体：シュードセルコポレラ・アエスチバ、セラトバシディウム・セレアレ、ドレシュスレラ・ソロキニアナ、セプトリア・トリチシおよびセプトリア・ノドルムに対して試験された場合にのみ、Ｗ型シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス単離体から４１３ｂｐ断片を産生した。プライマー組合せＪＢ５３９（配列番号：１７）およびＪＢ５４４（配列番号：２２）は同じＤＮＡに対して試験された場合にのみ、Ｒ型シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス単離体から４８７ｂｐ断片を増幅した。プライマー組合せＪＢ５４０（配列番号：１８）およびＪＢ５４２（配列番号：２０）は同じＤＮＡに対して試験された場合にのみ、Ｒ型シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス単離体から４１３ｂｐ断片を産生した。実施例１１：シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスに感染した小麦の供給源眼状斑点病に感染した小麦の茎はチバ・バーゼルのステージ１ｃ菌類スクリーニングプログラムから受理した。８日齢の小麦植物体は小麦の茎の基部に０．２％ツイーン２０中の分生子懸濁液（５×１０⁵分生子／ｍｌ）を噴霧することによりシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスに感染させた。接種の後、植物体をプラスチックで覆い、そして２０℃および９５−１００％の相対湿度で１日間保温した。植物体を生長チャンバーに移し、そこで１２℃および６０％の相対湿度で４週間保温した。この保温の後、植物体を温室に移し、そして１８℃および６０％の相対湿度で保温した。Ｗ型シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス３１１株を感染させた小麦植物体を感染８−９週間後試料採取し、一方Ｒ型３０８株病原体に感染したものを感染９−１０週間後集めた。実施例１２：シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスアッセイのために小麦の茎からＤＮＡの抽出 Klimyuk 等（The Plant Journal 3(3):493-494）に記載されたプロトコルにいくつかの変更を加えてＤＮＡを小麦の茎から抽出した。基部の稈の上０．５ｃｍを切断した２ｃｍの小麦の茎を０．２５ＭＮａＯＨ１６０μｌ中に入れ、そしてコンテス乳棒で完全に分解するまで粉砕した。試料を３０秒間煮沸した。０．２５ＭＨＣｌ１６０μｌおよび０．５ＭトリスＣｌ，ｐＨ８．０／０．２５％ｖ／ｖノニデットＰ−４０８０μｌを試料に添加した。試料をさらに２分間煮沸し、次に氷水浴中に入れた。抽出物１μｌをＰＣＲアッセイに使用した。実施例１３：定量的比色アッセイフォーマットへの診断アッセイの組み込み比色アッセイはNikiforov 等（PCR Methods and Applications 3: 285-291）に以下の変更を加えて行われた：１）Ｒ型ＰＣＲ生成物３０μｌおよび３ＭＮａＣｌ／２０ｍＭＥＤＴＡ混合物を捕獲プライマーウエルに添加した。Ｗ型ＰＣＲ生成物５０μｌおよび３ＭＮａＣｌ／２０ｍＭＥＤＴＡ混合物をハイブリダイゼーション反応に使用した。２）エキソヌクレアーゼ処理およびハイブリダイゼーション反応を３７℃に保温した。３）抗ビオチン西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）モノクローナル抗体１：１０００希釈物を使用した。４）Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド（ＯＰＤ）基質との２分間の保温の後、３ＮＨＣｌ５０μｌを各アッセイウエルに添加した。９６ウエルプレートを４９２ｎｍで読み、そして慣用のＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５７０ｎｍで参照した。表５に挙げたプライマーは、比色アッセイのための捕獲プライマーとして試験するために実施例５に記載したように合成された。セプトリア・ノドルム診断用プライマーＪＢ５２７（配列番号：１０）およびＪＢ５２５（配列番号：９）は定量的比色アッセイフォーマットに組み込まれた。プライマーＪＢ５２７（配列番号：１０）はミッドランド・サーティファイド・リージェント・カンパニー（テキサス州ミッドランド）により合成され、ビオチンラベルを含有し、５’末端に４個のヌクレオチド内ホスホロチオエート結合を含有する。健康な小麦から、低度、中程度および高度にセプトリア・ノドルムに感染した小麦からの収縮されたＪＢ５２７（配列番号：１０）およびＪＢ５２５（配列番号：９）を用いる実施例４に記載したようなＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ生成物捕獲プライマーとしてＩＴＳ２（配列番号：３９）を用いて比色アッセイを行った場合、それぞれ、Ａ₄₉₂値を示さない、該値が低い、中程度および高かった。シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスＲ型特異的５’プライマー、ＪＢ５３９（配列番号：１７）およびＪＢ５４０（配列番号：１８）およびシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスＷ型特異的５’プライマー、ＪＢ５３７（配列番号：１５）はまた、ビオチンラベルおよび４個のヌクレオチド内ホスホロチオエート結合を含有するように修飾された。シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスＲ型ＰＣＲアッセイの比色法は修飾ＪＢ５４０（配列番号：１８）プライマー、ＪＢ５４２（配列番号：２０）プライマーおよび捕獲プライマーＪＢ５３９’１５を用いて開発された。修飾ＪＢ５４０（配列番号：１８）プライマーおよびＪＢ５４２（配列番号：２０）プライマーを用いてＲ型感染小麦およびＲ型ゲノムＤＮＡからの増幅から産生された生成物は比色的にアッセイされた場合に陽性の比色値を示した。陽性の比色値はまた、ＪＢ５３８’１５が捕獲プライマーとして使用された場合に、Ｗ型感染小麦およびＷ型ゲノムＤＮＡと共に、修飾ＪＢ５３７（配列番号：１５）プライマーおよびＷ型特異的プライマーＪＢ５４１（配列番号：１９）を用いる増幅からのＰＣＲ生成物の比色的分析により得られた。さらに、比色信号の強度はアガロースゲル上に可視化されたＰＣＲ生成物の断片強度に相当する。＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊従来、異なるセプトリア種は顕微鏡での実験により同定可能であり、そして異なるシュードセルコスポレラ菌株の同定は病原体学的試験によってのみ可能であった。同様に、マイコスフェレラ・ムシコラおよびマイコスフェレラ・フィジエンシスの明白な同定は困難であり、そして成熟被子器の単離さえも正確な同定を常に可能にするわけではない（Pons，1990; Sigatoka Leaf Spot Diseases of B anana，RA Fullerton and RH Stover 編，Inteenational Network for the Impr ovement of Banana and Plantain，France）。ＥＬＩＳＡ法を利用する現在の免疫学的診断キットはセプトリア・トリチシ、セプトリア・ノドルム、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスおよびその他の病原体を同定するために通常のものとして使用されているが、この方法には、本発明の異なる単離体を区別する精度、検出限界および能力を持っていない。結果的に、上記菌類の異なる株の迅速な同定のためのＤＮＡ試験の開発は、菌類分類だけでなく、この分野において病害の処理および選択的殺菌剤の使用に有用性を発揮する。本発明は特定の態様を参照して記載されてきたけれども、多くの変形、変更およびその他の態様が可能であり、従って、そのような全ての変形、変更および態様が本発明の範囲内であると見なされるべきであることは理解されるであろう。寄託以下の寄託は１９９４年３月２８日、アメリカ合衆国イリノイ州６１６０４，ペオリア，ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５，ノーザン・リージョナル・リサーチ・センター，アグリカルチュラル・リサーチ・サービス，パテント・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）に行われた。１．ＨＢ１０１ＤＨ５ｄ（ｐＣＲＷ２−１；配列番号：３）受託番号ＮＲＲＬＢ−２１２３１２．ＨＢ１０１ＤＨ５ｄ（ｐＣＲＷ５−１；配列番号：４７）受託番号ＮＲＲＬＢ−２１２３２３．大腸菌ＤＨ５ｄ（ｐＣＲＳＴＲＩＴ１；配列番号：１）受託番号ＮＲＲＬＢ−２１２３３４．大腸菌ＤＨ５ｄ（ｐＣＲＲ１−２１；配列番号：４）受託番号ＮＲＲＬＢ −２１２３４５．大腸菌ＤＨ５ｄ（ｐＣＲＳＮＯＤ３１；配列番号：２）受託番号ＮＲＲＬＢ−２１２３５

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年４月１１日【補正内容】明細書および請求の範囲の補正 (1) 出願用紙第２２頁（明細書）を添付のものに差し替える〔特許法第１８４条の５第１項の規定による書面に添付した明細書の翻訳文のうち、第３６頁および第３７頁を添付のものに差し替える。〕 (2) 出願用紙第５８頁ないし第６１頁（請求の範囲）を添付の請求の範囲と差し替える〔特許法第１８４条の５第１項の規定による書面に添付した請求の範囲の翻訳文を別紙のとおり補正する。〕。ラ・ヘルポトリコイデス単離体から４１３ｂｐ断片を産生した。プライマー組合せＪＢ５３９（配列番号：１７）およびＪＢ５４４（配列番号：２２）は同じＤＮＡに対して試験された場合にのみ、Ｒ型シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス単離体から４８７ｂｐ断片を増幅した。プライマー組合せＪＢ５４０（配列番号：１８）およびＪＢ５４２（配列番号：２０）は同じＤＮＡに対して試験された場合にのみ、Ｒ型シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス単離体から４１３ｂｐ断片を産生した。実施例１１：シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスに感染した小麦の供給源眼状斑点病に感染した小麦の茎はチバ・バーゼルのステージ１ｃ菌類スクリーニングプログラムから受理した。８日齢の小麦植物体は小麦の茎の基部に０．２％ツイーン（登録商標）２０中の分生子懸濁液（５×１０⁵分生子／ｍｌ）を噴霧することによりシュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスに感染させた。接種の後、植物体をプラスチックで覆い、そして２０℃および９５−１００％の相対湿度で１日間保温した。植物体を生長チャンバーに移し、そこで１２℃および６０％の相対湿度で４週間保温した。この保温の後、植物体を温室に移し、そして１８℃および６０％の相対湿度で保温した。Ｗ型シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス３１１株を感染させた小麦植物体を感染８−９週間後試料採取し、一方Ｒ型３０８株病原体に感染したものを感染９−１０週間後集めた。実施例１２：シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスアッセイのために小麦の茎からＤＮＡの抽出 Klimyuk 等（The Plant Journal 3(3): 493-494）に記載されたプロトコルにいくつかの変更を加えてＤＮＡを小麦の茎から抽出した。基部の稈の上０．５ｃｍを切断した２ｃｍの小麦の茎を０．２５Ｍ．ＮａＯＨ１６０ｌ中に入れ、そしてコンテス乳棒で完全に分解するまで粉砕した。試料を３０秒間煮沸した。０．２５ＭＨＣｌｌ６０ｌおよび０．５ＭトリスＣｌ，ｐＨ８．０／０．２５％ｖ／ｖノニデットＰ−４０（登録商標）８０ｌを試料に添加した。試料をさらに２分間煮沸し、次に氷水浴中に入れた。抽出物１ｌをＰＣＲアッセイに使用した。実施例１３：定量的比色アッセイフォーマットへの診断アッセイの組み込み比色アッセイはNikiforov 等（PCR Methods and Applications 3: 285-291）に以下の変更を加えて行われた：１）Ｒ型ＰＣＲ生成物３０μｌおよび３ＭＮａＣｌ／２０ｍＭＥＤＴＡ混合物を捕獲プライマーウエルに添加した。Ｗ型ＰＣＲ生成物５０μｌおよび３ＭＮａＣｌ／２０ｍＭＥＤＴＡ混合物をハイブリダイゼーション反応に使用した。２）エキソヌクレアーゼ処理およびハイブリダイゼーション反応を３７℃に保温した。３）抗ビオチン西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）請求の範囲１．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：４７、配列番号：８２、配列番号：８３および配列番号：８４、配列番号：８５および配列番号：８６からなる群から選択される介在転写配列をコード化するＤＮＡ分子。２．プライマー分子5'-GGG CTA CCC TAC TTG GTA G-3'および5'-GGG CCA CCC TAC TTC GGT AA-3'とは異なるオリゴヌクレオチドプライマーであって、そのヌクレオチド配列は請求項１記載のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列から誘導される、上記オリゴヌクレオチドプライマー。３．前記プライマーが配列番号：７ないし３７および配列番号５０ないし６５からなる群から選択される請求項２記載のオリゴヌクレオチド。４．少なくとも１種のプライマーは配列番号：７ないし３７および配列番号５０ないし６５からなる群から選択される、オリゴヌクレオチドプライマーの対。５．１種のプライマーが配列番号：７ないし３７および配列番号５０ないし６５からなる群から選択され、そしてその他のプライマーが配列番号：３８ないし４１からなる群から選択される請求項４記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。６．前記対が表４の対からなる群から選択される請求項４記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。７．前記対が配列番号：７および配列番号：８からなる群から選択される請求項４記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。８．前記対が (a) 配列番号：１０と配列番号：９； (b) 配列番号：１２と配列番号：３８； (c) 配列番号：１１と配列番号：４１； (d) 配列番号：２９と配列番号：３８； (e) 配列番号：７と配列番号：４１； (f) 配列番号：３０と配列番号：３８； (g) 配列番号：１５と配列番号：１９； (h) 配列番号：１７と配列番号：２２； (i) 配列番号：１８と配列番号：２０；および (j) 配列番号：２６と配列番号：４１からなる群から選択される請求項５記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。９．配列番号：４２ないし４６からなるプライマーの群から選択される、オリゴヌクレオチドプライマー。１０．以下の工程： (a) 病原体に感染させた植物の葉からＤＮＡを単離し、 (b) 請求項４または５記載のプライマーの対とのポリメラーゼ連鎖反応において鋳型として上記ＤＮＡを用いて上記病原体の介在転写領域の一部を増幅し、そして (c) 上記の介在転写領域の増幅した一部を可視化する、からなる菌類病原体の検出方法。１１．上記菌類病原体がセプトリア・ノドルム、セプトリア・トリチシ、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス、マイコスフェレラ・フィジエンシス、マイコスフェレラ・ムシコラ、フサリウム・クルモルム、フサリウム・グラミネアルム、ミクロドチウム・ニバレおよびフサリウム・モニリフォルメから選択される請求項１０記載の方法。１２．上記シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスがＷ株およびＲ株から選択される請求項１１記載の方法。１３．以下の工程： (a) 病原体に感染させた植物の葉からＤＮＡを単離し、 (b) 請求項１３記載の少なくとも１種のプライマーを用いて上記ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応増幅に供し、そして (c) 上記ポリメラーゼ連鎖反応増幅の生成物を可視化する、からなる菌類病原体の検出方法。１４．１またはそれ以上の容器手段をその中に密閉して収容するために区画されているキャリアを有するキットであって、上記容器手段の１つは請求項２記載のプライマーを含有する上記キット。１５．１またはそれ以上の容器手段をその中に密閉して収容するために区画されているキャリアを有するキットであって、上記容器手段の１つは請求項３記載のプライマーを含有する上記キット。１６．１またはそれ以上の容器手段をその中に密閉して収容するために区画されているキャリアを有するキットであって、上記容器手段の１つは請求項４記載のプライマーを含有する上記キット。１７．１またはそれ以上の容器手段をその中に密閉して収容するために区画されているキャリアを有するキットであって、上記容器手段の１つは請求項５記載のプライマーを含有する上記キット。１８．１またはそれ以上の容器手段をその中に密閉して収容するために区画されているキャリアを有するキットであって、上記容器手段の１つは請求項１３記載のプライマーを含有する上記キット。１９．以下の工程：（ａ）病原体に感染させた植物の葉からＤＮＡを単離し、（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応において上記病原体のＤＮＡ領域を増幅し、そして（ｃ）介在転写領域の上記増幅部分を可視化する、からなる菌類病原体を検出するための定量的比色アッセイであって、（ｉ）工程（ａ）において単離されるＤＮＡは工程（ｂ）の増幅において鋳型ＤＮＡとして使用され、（ii）上記増幅は請求項４記載の診断上のプライマーの対の存在下で行われ、そして（iii）上記増幅されたＤＮＡは表５の捕獲プライマーの１つを用いてを可視化されることからなる、上記定量的比色アッセイ。２０．上記診断上のプライマーが配列番号：１０および配列番号：９から選択され、そして捕獲プライマーが配列番号：３９である請求項１９記載のアッセイ。２１．上記診断上のプライマーが配列番号：１８および配列番号：２０から選択され、そして捕獲プライマーが配列番号：７１である請求項１９記載のアッセイ。２２．上記診断上のプライマーが配列番号：１５および配列番号：１９から選択され、そして捕獲プライマーが配列番号：７１である請求項１９記載のアッセイ。２３．菌類の植物病原体を検出するために請求項２記載のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：４７、配列番号：８２、配列番号：８３および配列番号：８４、配列番号：８５および配列番号：８６からなる群から選択される介在転写配列をコード化するＤＮＡ配列。２．請求項１記載のＤＮＡ配列から誘導される、菌類の介在転写配列の増幅に基づく検出に使用するためのオリゴヌクレオチドプライマー。３．前記プライマーが配列番号：７ないし３７および配列番号５０ないし６５からなる群から選択される請求項２記載のオリゴヌクレオチド。４．菌類の介在転写配列の増幅に基づく検出に使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーの対であって、少なくとも１種のプライマーは配列番号：７ないし３７および配列番号５０ないし６５からなる群から選択される、上記オリゴヌクレオチドプライマーの対。５．１種のプライマーが配列番号：７ないし３７および配列番号５０ないし６５からなる群から選択され、そしてその他のプライマーが配列番号：３８ないし４１からなる群から選択される請求項４記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。６．前記対が表４の対からなる群から選択される請求項４記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。７．前記対が配列番号：７および配列番号：８からなる群から選択される請求項４記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。８．前記対が (a) 配列番号：１０と配列番号：９； (b) 配列番号：１２と配列番号：３８； (c) 配列番号：１１と配列番号：４１； (d) 配列番号：２９と配列番号：３８； (e) 配列番号：７と配列番号：４１； (f) 配列番号：３０と配列番号：３８； (g) 配列番号：１５と配列番号：１９； (h) 配列番号：１７と配列番号：２２； (i) 配列番号：１８と配列番号：２０；および (j) 配列番号：２６と配列番号：４１からなる群から選択される請求項５記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。９．配列番号：４２ないし４６からなるプライマーの群から選択される、菌類病原体の同定のためのオリゴヌクレオチドプライマー。１０．以下の工程： (a) 病原体に感染させた植物の葉からＤＮＡを単離し、 (b) 請求項４または５記載のプライマーの対とのポリメラーゼ連鎖反応において鋳型として上記ＤＮＡを用いて上記病原体の介在転写領域の一部を増幅し、そして (c) 上記の介在転写領域の増幅した一部を可視化する、からなる菌類病原体の検出方法。１１．上記菌類病原体がセプトリア・ノドルム、セプトリア・トリチシ、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス、マイコスフェレラ・フィジエンシス、マイコスフェレラ・ムシコラ、フサリウム・クルモルム、フサリウム・グラミネアルム、ミクロドチウム・ニバレおよびフサリウム・モニリフォルメから選択される請求項１０記載の方法。１２．上記シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデスがＷ株およびＲ株から選択される請求項１０記載の方法。１３．以下の工程： (a) 病原体に感染させた植物の葉からＤＮＡを単離し、 (b) 請求項９記載の少なくとも１種のプライマーを用いて上記ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応増幅に供し、そして (c) 上記ポリメラーゼ連鎖反応増幅の生成物を可視化する、からなる菌類病原体の検出方法。１４．１またはそれ以上の容器手段をその中に密閉して収容するために区画されているキャリアを有するキットであって、上記容器手段の１つは請求項２記載のプライマーを含有する上記キット。１５．１またはそれ以上の容器手段をその中に密閉して収容するために区画されているキャリアを有するキットであって、上記容器手段の１つは請求項３記載のプライマーを含有する上記キット。１６．１またはそれ以上の容器手段をその中に密閉して収容するために区画されているキャリアを有するキットであって、上記容器手段の１つは請求項４記載のプライマーを含有する上記キット。１７．１またはそれ以上の容器手段をその中に密閉して収容するために区画されているキャリアを有するキットであって、上記容器手段の１つは請求項５記載のプライマーを含有する上記キット。１８．１またはそれ以上の容器手段をその中に密閉して収容するために区画されているキャリアを有するキットであって、上記容器手段の１つは請求項１３記載のプライマーを含有する上記キット。１９．(a)病原体に感染させた植物の葉からＤＮＡを単離し、(b)ポリメラーゼ連鎖反応において上記病原体のＤＮＡ領域を増幅し、そして(c)介在転写領域の上記増幅部分を可視化することからなる菌類病原体を検出するための定量的比色アッセイにおいて、診断上のプライマーとしての請求項４記載のプライマーの対を鋳型として用いて上記病原体の介在転写領域の一部から上記ＤＮＡを増幅し、そして表５のプライマーからなる群から選択される捕獲プライマーを用いて上記増幅された部分を可視化することからなる、上記定量的比色アッセイ。２０．上記診断上のプライマーが配列番号：１０および配列番号：９から選択され、そして捕獲プライマーが配列番号：３９である請求項１９記載のアッセイ。２１．上記診断上のプライマーが配列番号：１８および配列番号：２０から選択され、そして捕獲プライマーが配列番号：７１である請求項１９記載のアッセイ。２２．上記診断上のプライマーが配列番号：１５および配列番号：１９から選択され、そして捕獲プライマーが配列番号：７１である請求項１９記載のアッセイ。