CN1683565A - 一套检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途 - Google Patents

Abstract

一套用于检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途，属于微生物检测领域(生物工程类检测产品)。探针分别设计在细菌16S rRNA和23S rRNA以及痢疾杆菌中大质粒上编码侵袭质粒抗原H(ipaH)和伤寒沙门氏菌调控Vi抗原表达(VipR)等基因序列上，探针长度在25－50碱基之间，具有较高的灵敏度和特异性。适用于基于核酸杂交原理的检测技术，尤其适用于基因芯片原理的检测。在一定的使用条件下，能够检测出实验样品中的李氏菌属、副溶血性弧菌、弯曲菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、耶尔森氏菌属、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢菌属、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、痢疾杆菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌、布鲁氏菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7和霍乱弧菌。可用于多种方面，如疾病诊断、环境检测、食物中毒检测、进出口食品检疫、细菌学分类、流行病学调查、生物战剂检测等。

Description

一套检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途

技术领域

本发明属于微生物检测技术、尤其是肠道致病菌的核酸检测技术范畴。本发明涉及一套能够检测李氏菌属、副溶血性弧菌、弯曲菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、耶尔森氏菌属、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢菌属、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、痢疾杆菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌、布鲁氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌的寡核苷酸探针，该套探针的序列及用途。

背景技术

肠道致病菌是临床上引起以腹泻、呕吐为症状传染病的主要病原体。常见的致病菌有李氏菌属、副溶血性弧菌、弯曲菌属、小肠结肠炎耶尔森氏菌、耶尔森氏菌属、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、蜡样芽孢菌属、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、痢疾杆菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌、布鲁氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌等十七个种属，其中蜡样芽孢杆菌、炭疽杆菌等作为一类细菌进行检出；李氏菌属主要以单增李氏菌最为常见；耶尔森氏菌属主要以鼠疫耶尔森氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌为主；弯曲菌属中最为常见的是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。这些细菌可通过食物和饮水等途径导致大规模暴发，严重威胁人类的饮食安全和正常生活，并且给社会带来了沉重的经济负担。据世界卫生组织(WHO)不完全统计报告，2000年全球有210万人死于腹泻，大部分归因于食物和饮用水中致病菌的污染；而且尤其是近几年肠道疾病的实际发病率要比报告的病例数多300-500倍，全世界的患病者以达数亿，并且每年的统计数值都居高不下。美国每年约有7600万例肠道致病菌导致的疾病，其中有32500人住院治疗，5000人死亡；细菌污染造成的肠道疾病(食物中毒)也是我国食品安全和临床诊断中最突出的问题。据国家卫生部统计，2000年共收到重大食物报告达150起，中毒6237人死亡135人；2001共发生重大食物中毒事件185起，15715人中毒，146人死亡。这些由于多种致病菌导致的肠道疾病影响的国家范围之广、危急健康人群之多都是其他原因引起疾病所不及的。

16S rRNA和23S rRNA在细菌的分类鉴定学上具有重要的生物学意义，在生物进化过程中比其他基因演变得慢，真细菌的16S rRNA和23S rRNA保守性强，被称之为“细菌进化的活化石”。但是这种保守性也是相对的，也就是说在16S rRNA和23S rRNA序列上存在着每种细菌特异性的片段。通过对各种细菌的16S rDNA和23S rDNA序列进行比对的结果发现其上的序列可变区和恒定区是交错排布的。因此本专利中分别在16S rDNA和23S rDNA序列上选取的一对引物作为通用引物，在其间选取特异性序列作为探针，对上述十七个种属的细菌进行鉴别。

细菌性痢疾是由痢疾杆菌导致的一种疾病。在临床上病历较多，且传染性强。ipaH是大质粒上编码侵袭质粒抗原H的一段基因，其特异性的存在于痢疾杆菌中，包括志贺氏菌属的四种致病菌和侵袭性大肠杆菌，因此针对ipaH设计引物和探针，可以对细菌性痢疾进行鉴别。

沙门氏菌是一种在临床上常见的肠道致病菌，根据临床症状和生化特征分为伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等。其中伤寒沙门氏菌是该菌属中最具有代表性的，它可以导致伤寒热，在临床上症状不是很明显，这就给诊断带来一定的麻烦；而且它还是生物反恐任务中的重要项目。VipR是位于伤寒沙门氏菌染色体ViaB区域中的一种编码调控Vi抗原表达的基因，与其他肠道致病菌中的序列进行对比，具有很高的特异性。因此选取该基因作为检测的目的片段，设计引物和探针，在经过16S rDNA序列上的探针鉴定为沙门氏菌的前提下，进一步对伤寒沙门氏菌进行甄别。

长期以来，对于肠道致病菌的实验室金标准鉴定手段还停留在培养、血清和生化方面等传统的细菌学检测水平，步骤繁琐且需要数天才能得到结果，在一定的程度上限制了对肠道致病菌的快速鉴定，也给临床治疗带来诸多不便。免疫学方法的应用缩短了实验操作的时间，但是该方法也存在其实验样品的特殊性以及结果的假阳性率偏高等问题。近年来，PCR和核酸杂交技术的应用以其操作简单、快速和结果直观等特点极大地促进了细菌检测技术的发展。对于将多数量的肠道致病菌同时进行鉴定的要求，目前常用的方法都无法达到。因此DNA芯片技术以其特有的优势被应用到了肠道致病菌的检测鉴定中。

DNA芯片(DNA microarrays)是近年来发展成熟的一种高通量基因检测技术，是分子生物学发展史上的又一重大技术突破，其特点是实验操作和数据处理的集成化、微型化、自动化。DNA芯片的一个主要用途是多基因平行检测，是一种发展前景广阔的多基因大规模检测新技术。DNA芯片技术检测的关键之处在于设计、筛选一系列高特异性、高灵敏度、高稳定性的匹配探针，固定于玻璃片等固相载体上，利用样品与探针的杂交反应，经扫描、分析后即可得出正确的结果。就本实验而言，通过一次实验操作就可确定样品中肠道致病菌的种类，极大地提高了检测效率，为临床诊断及食品鉴定提供了简便、快捷的技术手段。

发明内容

本发明提供了一套用于检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针，包含以下各组探针的全部或为部分探针的组合，各部分的探针长度在25-50碱基之间。

a.金黄色葡萄球菌的16S rDNA基因检测探针

b.李斯特氏菌属的16S rDNA基因检测探针

c.肠出血性大肠杆菌O157:H7的23S rDNA基因检测探针

d.霍乱弧菌的16S rDNA基因检测探针

e.耶尔森氏菌属的16S rDNA基因检测探针

f.小肠结肠炎耶尔森氏菌的16S rDNA基因检测探针

g.沙门氏菌属的16S rDNA基因检测探针

h.伤寒沙门氏菌的对Vi抗原表达基因ViaB起到正调控作用的基因VipR检测探针

i.志贺氏菌属的16S rDNA基因检测探针

j.痢疾杆菌的大质粒上编码侵袭质粒抗原H基因ipaH检测探针

k.副溶血性弧菌的16S rDNA基因检测探针

l.副溶血性弧菌的23S rDNA基因检测探针

m.志贺氏菌属、沙门氏菌属和大肠杆菌共有的16S rDNA基因检测探针

n.产气荚膜梭菌的16S rDNA基因检测探针

o.弯曲菌属的16S rDNA基因检测探针

p.变形杆菌的16S rDNA基因检测探针

q.蜡样芽孢菌属的16S rDNA基因检测探针

r.肉毒梭菌的16S rDNA基因检测探针

s.真细菌通用的16S rDNA基因检测探针

t.布鲁氏菌的16S rDNA基因检测探针

本发明还提供了各部分探针的核苷酸序列，详见表1-1。还提供了一套可以同时检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针，包含上述a～t二十个部分。

本发明通过优选，进一步提供了一套特异性好，灵敏度高的探针，其中a探针为SA5，b探针为LI2和LI3，c探针为O157:H7-1和O157:H7-2，d探针为VC1，e探针为YE1，f探针为ye-2e，g探针为SHI1，h探针为V2和V3，i探针为SAL1，j探针为I-1和I-2，k探针为VP1，1探针为VP23，m探针为SS5，n探针为CP-new-1，o探针为Cam-5，p探针为PR-2，q探针为B-6，r探针为CB-1，s探针为common-2-1和common-3-1，t探针为Bru-2。

此外，本发明还提供了上述寡核苷酸探针的用途，利用一套探针可通过核酸杂交反应对样品中的常见肠道致病菌进行检测，尤其适用于基于基因芯片技术的检测。利用探针还可以在鉴定出沙门氏菌和志贺氏菌的同时，进一步确定出是否为伤寒沙门氏菌和痢疾杆菌。

具体的说，本发明内容是这样实现的：

根据选取的近三十种肠道致病菌及其相关近源种属的16S rDNA、23S rDNA的全序列(每种菌至少要三种不同的Genebank序列号，以免所选区域个别碱基出现差别)，使用clustalx1.8.msw Alignment程序将从Genebank的核酸数据库中检索到的近三十种细菌的16S rDNA、23S rDNA基因序列进行比对，得到碱基对齐图和聚类分析的结果。根据碱基对齐图可以划分出16S rDNA、23S rDNA基因中的保守区和差异较大的变化区，然后再使用primer5.0软件在保守区寻找通用引物，在变化区寻找特异性的探针，使得各个探针的Tm值及两对引物间的Tm值基本相同。然后分别在痢疾杆菌(包括志贺氏菌属内的四种致病菌和侵袭性大肠杆菌)的大质粒上编码侵袭质粒抗原H基因(ipaH)上和伤寒沙门氏菌的对Vi抗原表达基因ViaB起到正调控作用的基因(VipR)上设计引物和探针，共设计91条寡核苷酸探针，探针长度在25-50碱基之间。寡核苷酸探针序列与上述基因特定区域DNA正链的碱基序列一致(探针序列见表1-1)。

利用上述的一套探针，可以通过杂交反应对样品中的相应病原菌进行检测，尤其适用于基于DNA芯片原理的检测，具有较高的灵敏度和特异性。在进行基于DNA芯片原理的检测时，需要把探针全部或其中一部分用适当的方法固定于固向载体上(如玻璃片、硅基片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)，成为M×N排布的探针阵列，即为DNA芯片。然后利用优化的相应的PCR引物扩增待检样品中的致病菌，选择引物的要求是能够扩增出所有细菌的包含探针所在区域的片段。在扩增的同时引入荧光标记、生物素标记或其他合适的标记物。扩增产物作为探针检测的靶分子，在一定条件下与芯片共保温30分钟至数小时，利用荧光扫描仪或其他相应的检测设备即可以检测到杂交信号。根据探针出现信号的位置可以判定出样品中致病菌的种类。

除了基于DNA芯片原理的检测外，这套探针也可以用于基于反相斑点杂交的检测：首先将探针固定于合适的载体上，提取待检细菌核酸，并对细菌的核酸进行标记，然后，将标记好的核酸与载体上的探针进行杂交反应，最后，提供合适的仪器设备进行检测。

本发明提供的探针能够快速、准确、高效地检测出样品中的致病菌的种类。如果制备成相应的试剂盒，可以广泛用于临床细菌感染性疾病的诊断、抗菌素筛选、环境监测与评价、卫生监督与食品检疫、细菌学分类、流行病学调查等方面。

附图说明

图1为致病菌16S rDNA引物PCR产物电泳检测结果。1：DL2000 Marker，2：单增李氏菌，3：空肠弯曲菌，4：小肠结肠炎耶尔森氏菌，5：霍乱弧菌，：副溶血性弧菌，7：变形杆菌，8：金黄色葡萄球菌，9：腊样芽孢杆菌，10：产气荚膜梭菌，11：志贺氏菌，12沙门氏菌。

图2为致病菌23S rDNA引物PCR产物电泳检测结果。1：100bp DNA Ladder Marker，2：单增李氏菌，3：空肠弯曲菌，4：小肠结肠炎耶尔森氏菌，5：霍乱弧菌，6：副溶血性弧菌，7：变形杆菌，8：金黄色葡萄球菌，9：腊样芽孢杆菌，10：产气荚膜梭菌，11：志贺氏菌，12沙门氏菌。

图3为16S rDNA、ipaH和23S rDNA、vipR二重PCR结果。1：伤寒沙门氏菌23S rDNA引物扩增结果，2：伤寒沙门氏菌vipR引物扩增结果，3：伤寒沙门氏菌23S rDNA和vipR引物二重PCR扩增结果，4：DL2000 Marker，5-9：痢疾杆菌(志贺氏菌属四种细菌和侵袭性大肠杆菌)16S rDNA、ipaH二重PCR扩增结果，10：痢疾杆菌ipaH引物扩增结果，11：痢疾杆菌16S rDNA引物扩增结果。

图4为十七种肠道致病菌检测基因芯片探针排列位置。

图5为基因芯片分别与十七种肠道致病菌及其他阴性细菌的荧光标记PCR产物杂交结果。其中伤寒沙门氏菌和痢疾杆菌杂交图均系二重PCR扩增产物杂交结果。

具体实施方式：

为了进一步说明一套用于同时检测上述十七个种属常见肠道致病菌寡核苷酸探针的实施方式和用途，参照以下实施例进行说明。实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明的范围，本领域技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。

实施例1.检测十七个种属肠道致病菌的寡核苷酸探针的筛选和优化

1.检测十七个种属肠道致病菌的寡核苷酸探针的设计

探针分别设计在细菌16S rRNA和23S rRNA以及痢疾杆菌中大质粒上编码侵袭质粒抗原H(ipaH)和伤寒沙门氏菌调控Vi抗原表达等基因序列上，具有较高的灵敏度和特异性，寡核苷酸探针序列与上述基因特定区域DNA正链的碱基序列一致(探针序列见表1-1)。探针长度在25-50碱基之间。探针合成时在其3’端氨基修饰，用于探针与载玻片表面的活性醛基发生反应并固定到载体表面。

             表1-1：检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针备选序列

探针                           探针序列                          探针长

名称                           (5’-3’)                         度(BP)

SA1    aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agc                33

SA2    caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata ga             35

SA3    aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gta            36

SA4    gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acg            36

SA5      aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta            36

SA-6     tga cta ctt gta agc aca cgg ttt cag gtt cta ttt            36

SA-7     aat att ttg aac cgc atg gtt caa aag tga aag                33

SA-8     tac gac caa ata cta aac                                    18

SA-9     caa taa tca tca ctt gag gc                                 20

LI1      aac gga gga aga gct tgc tct tcc aaa gtt agt                33

LI2      tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct            36

LI3      tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc            36

Lis-23   gtg gca tgc gcc aca ctt tat c                              22

VP1      aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg            36

VP23     ggt acg cag tca cag gac aaa gcc                            24

VC1      cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag                33

YE1      gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg                33

ye-3     agg ggt tga gtt taa tac gct caa tca ttg                    30

ye-2e    cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t                  31

SHI1     ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga                    30

V-1      ctg gcc tcc gaa tga tat cta ttt                            24

V-2      ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga ta         38

V-3      aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt         38

V-4      cgt tat cat ttc aag ttc gcg act a                          25

V-5      cgg caa cat cag tcc agg ata tta tca gaa atg                33

SAL1     ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga                    30

I-1      gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c      40

I-2      gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct    42

I-3      agt ctt tcg ctg ttg ctg ctg atg cca c                      28

I-4      cct ctg cgg agc ttc gac agc agt ctt tcg ctg tt             35

I-5      ata ccg tct ctg cac gca ata cct ccg gat tcc gt             35

I-6      tcc gga ttc cgt gaa cag gtc gct gca tgg ct                 32

H7-1     gca gtc acc cca taa aag agg ct                             23

H7-2     tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc                        27

Cam-1    act cct gct taa cac aag ttg agt ag                         26

Cam-2      tcg gtg tag gat gag act ata tag                                     24

Cam-3      act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g               40

Cam-4      ggt ata gtt aat ctg ccc tac aca aga                                 27

Cam-5      ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at              41

Cam-6      act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa ag                          32

Cam-7      gat ttg cct gta taa cct cct acg acc tta gac tag                     36

Cam-8      cgg agt aaa tcc taa tac aaa gct aac ca                              29

Cam-9      ttc tat cca tcc gaa gac ttc aaa aag cct t                           31

Cam-3-1    act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g               40

B-1        cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa ttg aaa ggc                         33

B-2        gga taa cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa                             30

B-3        ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c                               28

B-4        tgc tag ttg aat aag ctg gca cct                                     24

B-5        ggc ttc ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c                       34

B-6        tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg                              29

B-41       tgc gta gcc gac ctg aga ggg tgt                                     24

CP-1       cga gct caa agt atg t                                               16

CP-2       gcc gag ctc aaa gta tgt                                             18

CP-3       gcc gag ctc aaa gta tgt ggc att                                     24

CP-4       act act cat act cga cgc tag c                                       22

CP-5       gtg ata agg ttc ggt aag cgc tat gcc                                 27

CP-6       ggc ata gcg ctt acc gaa cct tat cac                                 27

cp-16      aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat c                       34

CP-16-1    aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cgc tat g               40

CP1        gaa aga tgg cat cat cat tca acc aaa gga gca atc                     36

CP-new-1   atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga ccc     48

CP-new-2   atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga         45

common-1   cca gac tcc tac ggg agg cag cag t                                   25

common-2   ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat                                 27

common-3   cac act gga act gag aca cgg tc                                      23

common21   act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat attg    49

Common31     cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga               38

SS3          tgt ctg gga aac tgc ctg atg gag g                                25

SS4          cgt cgc aag acc aaa gag ggg gac ctt cgg g                        31

SS5          ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g                        31

SS6          aac ctg ccc atg gct aga tca ccg ggt ttc ggg tct ata ccc t        43

SS7          aat ttt tca aca tta gtc ggt tcg gtc ctc cag tta gtg              39

SS8          cct ctt gcc atc gga tgt gcc cag atg                              27

CB-1         tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat              39

CB-2         atg aag ctt cct tcg gga agt gga tta gcg gc                       32

CB-3         ggg ata gcc ttc cga aag gaa gat taa tac                          30

SAL，SHI1    gaa cgg taa cag gaa gca gct tgc tgt ttg ctg                      33

SAL，SHI2    aac gtc gca aga cca aag agg                                      21

Bru-1        gtg ccc ttc ggg gga aag att tat cgg caa atg atc ggc ccg cgt t    46

Bru-2        cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg               38

PR1          taa cag gag aaa gct tgc ttt ctt gct gac                          30

PR-2         cgt cga gtt cac aat aac agc atc ttc aga                          30

pr-2         cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga                  36

pr-3         cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt t                            28

pr-4         gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga cga gc                   35

pr-5         gtc tac gga cca aag cag ggg ctc ttc gga cct tgc                  36

pr-6         gtg ata aag tta ata cct tta tca att g                            28

pr-7         att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga                  36

pr-8         att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt t                            28

pr-9         taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga ctg agc                  36

pr-10        gtg ata aag tta ata cct ttg tca att g                            28

2.扩增含有靶基因片断的PCR引物的设计和优化

根据细菌16S rRNA和23S rRNA以及痢疾杆菌中大质粒上编码侵袭质粒抗原H(ipaH)和伤寒沙门氏菌调控Vi抗原表达(VipR)基因序列设计引物，引物序列见表1-2。利用引物扩增的PCR产物序列中包含各靶基因片段上的探针序列。所有反向引物序列5’端用荧光素Cy3标记，以保证PCR产物经杂交反应后，带有荧光的反向互补链与核苷酸探针结合产生可检测信号。分别对16S rDNA、ipaH和23S rDNA、VipR引物进行两套二重PCR扩增条件的优化(优化的PCR反应电泳检测结果见附图3)。

           表1-2：用于扩增含有探针序列靶基因片段的引物序列

基因            引物序列(5’---3’)             产物长度         备注

名称                                             (bp)

16S rDNA    cgc tgg cgg cag gcc taa cac atg c    500             正向引物

            cgc ggc tgc tgg cac gga gtt agc c                    反向引物

23S rDNA    tta aat gat ggc tgc ttc taa gcc      500             正向引物

            acc gat agt gaa cca gta ccg tga g                    反向引物

ipaH        gtt cct tga ccg cct ttc cga tac      330             正向引物

            gag agt tct gac ttt atc ccg                          反向引物

VipR        ggt ttc atc att tct ggc ctc cg       337             正向引物

            ctc tgc tcc gtc aag atc ttt tca cc                   反向引物

3.寡核苷酸基因芯片的制备和探针的筛选优化

将备选寡核苷酸探针纯化、定量后，用基因芯片点样仪点到醛基活化的载玻片上，制成探针微阵列。用荧光标记的PCR扩增产物与基因芯片杂交，得到各探针的杂交图。针对不同病原菌的基因片段，根据芯片杂交结果选择各自特异性好，灵敏度高的探针。筛选得到的探针序列见表1-3。

         表1-3：检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针优化序列

探针                            探针序列                          探针长度

名称                                                              (BP)

SA5      aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta           36

LI2      tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct           36

LI3      tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc           36

VC1      cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag               33

YE1      gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg               33

ye-2e    cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t                 31

SHI1     ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga                   30

V-2      ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga ta        38

V-3        aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt              38

SAL1       ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga                         30

I-1        gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c           40

I-2        gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct         42

VP1        aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg                 36

VP23       ggt acg cag tca cag gac aaa gcc                                 24

H7-1       gca gtc acc cca taa aag agg ct                                  23

H7-2       tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc                             27

SS5        ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g                       31

CP-new-1   atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga     48

           ccc

Cam-5      ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at          41

pr-2       cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga                 36

CB-1       tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat             39

com21      act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat     49

           attg

com31      cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga              38

Bru-2      cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg              38

B-6        tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg                          29

实施例2.寡核苷酸探针的特异性和灵敏度评价

1.基因芯片制备  将寡核苷酸探针用点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μmol/L，取5ul转移至384孔板。用Cartesian芯片制备仪将探针点到醛基片上(探针排列见附图4，芯片分别与十七个种属肠道致病菌的荧光标记PCR产物杂交结果见附图5)。在该探针微阵列中，以荧光引物的反向互补序列作为阳性对照，以无关随机序列作为阴性探针对照，以不含探针的空白点样液做为阴性对照。探针序列见表2-1。

                  表2-1常见肠道致病菌的检测基因芯片探针序列

探针名称                          探针序列                                探针长度

                                                                          (BP)

SA5        aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta                36

LI2        tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct                36

LI3           tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc             36

VC1           cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag                 33

YE1           gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg                 33

ye-2e         cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t                   31

SHI1          ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga                     30

V-2           ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga ta          38

V-3           aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt          38

SAL1          ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga                     30

I-1           gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c       40

I-2           gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct     42

VP1           aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg             36

VP23          ggt acg cag tca cag gac aaa gcc                             24

H7-1          gca gtc acc cca taa aag agg ct                              23

H7-2          tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc                         27

SS5           ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g                   31

CP-ncw-1      atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat     48

              gga ccc

Cam-5         ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at      41

pr-2          cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga             36

CB-1          tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat         39

com21         act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg     49

              aat attg

com31         cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga          38

Bru-2         cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg          38

B-6           tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg                      29

阴性探针对照  ccg ctg tat cac aag ggc tgg tac c                           25

阵列探针对照  荧光引物反向互补序列                                        25

3.肠道致病菌寡核苷酸芯片特异性检测

在优化好的两套二重PCR扩增和杂交反应条件下，检测了146株不同血清型的标准肠道致病菌。其中所包括的常见肠道致病菌：大肠杆菌O157：H7W933、882364；侵袭性大肠杆菌48017、大肠杆菌、霍乱弧菌O139、O1型、金黄色葡萄球菌6538、沙门氏菌、耶尔森氏菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌、李斯特氏菌、假单胞菌、变性杆菌、布鲁氏菌、弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、副溶血性弧菌、枸橼酸杆菌、爱德华氏菌、创伤弧菌、克雷伯氏菌、沙雷氏菌等共146株。以细菌DNA为模板进行两套二重PCR扩增，产物与芯片杂交。其中除阳性对照探针common21和common31在全部细菌的杂交结果中出现信号外，其他出现信号的探针均与其杂交的细菌对应，而一些阴性细菌的杂交则无任何信号产生(见表2-2)。这说明所选取的用于鉴别上述十七种肠道致病菌的探针是特异的，也说明本实验建立在两套二重PCR基础上，同时定性检测十七个种属肠道致病菌的基因芯片是可靠的。

以上实施例的技术要点如下：

1.寡核苷酸合成寡核苷酸(引物或探针)采用标准亚磷酰胺化学方法在自动合成仪(ABI8909)上合成。所有荧光引物在合成中用Cy3亚磷酰化试剂在5’端进行标记。所有寡核苷酸探针在3′端进行氨基修饰，氨基与探针序列之间以间隔臂(聚乙二醇磷酰化试剂)相连。合成完毕用浓氨水55℃作用15小时脱保护/切割，OPC柱纯化。紫外定量，冻存备用。

2.多重PCR扩增20ul常规PCR反应体系中，正、反向引物浓度均0.5μM，dNTP为100μM，1U Taq DNA聚合酶，1×PCR反应缓冲液，50-100ng模板DNA；扩增条件为：预变性(94℃，5min)；35个循环：变性(94℃，30sec)，退火(56℃，30sec)延伸(72℃，30sec)；延伸(72℃，5min)；4℃，∞。

多重不对称PCR反应中，四对引物之间浓度的改变对目的基因的扩增效率有明显的影响，每个基因的正向与反向荧光引物的比例和杂交信号的强弱密切相关。经过多次实验优化，使一个反应管中四个产物均能达到相近而且较好的扩增效率和杂交信号。优化的结果为：两套二重PCR反应中16S rDNA、ipaH和23S rDNA、vipR基因的正向引物浓度分别为0.25μM、0.25μM，反向荧光标记引物浓度分别为0.75μM、0.75μM。20ul反应体系中，dNTP为200μM，MgCl₂为3mmol，2U TaqDNA聚合酶，1×PCR反应缓冲液；扩增条件为：预变性(94℃，5min)；40个循环：变性(94℃，30sec)，退火(56℃，30sec)延伸(72℃，30sec/)；延伸：(72℃，5min/)。

3.常见肠道致病菌寡核苷酸芯片制备  寡核苷酸探针用点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μmol/L，取5ul转移至384孔板。用Cartesian芯片制备仪将探针点到醛基片(Telechem)上，点样仪内保持温度为23℃，相对湿度大于85％。寡核苷酸芯片制备完毕后，置于载玻片盒内室温放置备用。点样后的芯片在使用前至少在室温放置24h。

4.常见肠道致病菌寡核苷酸芯片杂交与检测

4.1寡核苷酸基因芯片预处理  寡核苷酸芯片用0.2％SDS清洗2次，接着以水清洗2次，晾干后用于杂交。

4.2杂交和杂交后处理  荧光标记的PCR产物变性(98℃、5min，冰浴、5min)后与杂交液(5×SSC，5％甲酰胺，0.1％SDS)混匀，取12μ1转移至芯片反应区，芯片置于杂交盒内，连同杂交盒浸入50℃水浴中反应60分钟，杂交后的芯片依次在洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中于室温各洗涤1min。置室温晾干。

4.3扫描和结果判定  芯片用芯片扫描仪GenePix 4000B进行扫描，用GenePix Pro 4.0软件分析结果。

表2-2：应用基因芯片检测146株肠道菌结果

I-2	VP1	VP23	H7-1	H7-2	SS5	CP1	Cam5	pr2	B6	CB1	Bru1	Bru2	Neg	COM21
															-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
															-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
															-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	+
															-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	+
-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	+
															+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	+
-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
															-	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	+
-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	+
															-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+
-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+
															-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	+
-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	-	+
															-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	+
-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
															-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

菌株	数量	SA5	LI2	LI3	VC1	YE1	ye-2e	SHI1	V1	V2	SAL1	I-1
													金黄色葡萄球菌		+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
李斯特氏菌		-	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-
													霍乱弧菌		-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-
耶尔森氏菌		-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-
													小肠结肠炎耶尔森氏菌		-	-	-	-	+	+	-	-	-	-	-
沙门氏菌		-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-
													伤寒沙门氏菌		-	-	-	-	-	-	+	+	+	-	-
志贺氏菌		-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-
													痢疾杆菌		-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+
副溶血性弧菌		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
													O157:H7		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
产气荚膜梭菌		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
													弯曲杆菌		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
变形杆菌		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
													肉毒梭菌		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
布鲁氏菌		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
													腊样芽孢菌属		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
其他肠道菌		-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-
													其他非肠道菌		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

                                  序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所

<120>一套用于检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途

<160>91

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agc 33

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata ga 35

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gta 36

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acg 36

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta 36

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tga cta ctt gta agc aca cgg ttt cag gtt cta ttt 36

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

aat att ttg aac cgc atg gtt caa aag tga aag 33

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tac gac caa ata cta aac 18

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

caa taa tca tca ctt gag gc 20

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

aac gga gga aga gct tgc tct tcc aaa gtt agt 33

<210>11

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct 36

<210>12

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc 36

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gtg gca tgc gcc aca ctt tat c 22

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg 36

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ggt acg cag tca cag gac aaa gcc 24

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag 33

<210>17

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg 33

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

agg ggt tga gtt taa tac gct caa tca ttg 30

<210>19

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t 31

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga 30

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

ctg gcc tcc gaa tga tat cta ttt 24

<210>22

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

tat cta ttt cgg ggt tgg agc tgc tgg cat tat tga ag 38

<210>23

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt 38

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

cgt tat cat ttc aag ttc gcg act a 25

<210>25

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

cgg caa cat cag tcc agg ata tta tca gaa atg 33

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga 30

<210>27

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c 40

<210>28

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct 42

<210>29

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

agt ctt tcg ctg ttg ctg ctg atg cca c 28

<210>30

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

cct ctg cgg agc ttc gac agc agt ctt tcg ctg tt 35

<210>31

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

ata ccg tct ctg cac gca ata cct ccg gat tcc gt 35

<210>32

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

tcc gga ttc cgt gaa cag gtc gct gca tgg ct 32

<210>33

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

gca gtc acc cca taa aag agg ct 23

<210>34

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc 27

<210>35

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

act cct gct taa cac aag ttg agt ag 26

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

tcg gtg tag gat gag act ata tag 24

<210>37

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>37

act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g 40

<210>38

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>38

ggt ata gtt aat ctg ccc tac aca aga 27

<210>39

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>39

ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at 41

<210>40

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>40

act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa ag 32

<210>41

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>41

gat ttg cct gta taa cct cct acg acc tta gac tag 36

<210>42

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>42

cgg agt aaa tcc taa tac aaa gct aac ca 29

<210>43

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>43

ttc tat cca tcc gaa gac ttc aaa aag cct t 31

<210>44

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>44

act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g 40

<210>45

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>45

cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa ttg aaa ggc 33

<210>46

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>46

gga taa cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa 30

<210>47

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>47

ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c 28

<210>48

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>48

tgc tag ttg aat aag ctg gca cct 24

<210>49

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>49

ggc ttc ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c 34

<210>50

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>50

tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg 29

<210>51

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>51

tgc gta gcc gac ctg aga ggg tgt 24

<210>52

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>52

cga gct caa agt atg t 16

<210>53

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>53

gcc gag ctc aaa gta tgt 18

<210>54

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>54

gcc gag ctc aaa gta tgt ggc att 24

<210>55

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>55

act act cat act cga cgc tag c 22

<210>56

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>56

gtg ata agg ttc ggt aag cgc tat gcc 27

<210>57

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>57

ggc ata gcg ctt acc gaa cct tat cgc 27

<210>58

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>58

aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat c 34

<210>59

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>59

aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cgc tat g 40

<210>60

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>60

gaa aga tgg cat cat cat tca acc aaa gga gca atc 36

<210>61

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<400>61

atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg ctatga gat gga ccc 48

<210>62

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>62

atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga 45

<210>63

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>63

cca gac tcc tac ggg agg cag cag t 25

<210>64

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>64

ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat 27

<210>65

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>65

cac act gga act gag aca cgg tc 23

<210>66

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<400>66

act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat attg 49

<210>67

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>67

cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga 38

<210>68

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>68

tgt ctg gga aac tgc ctg atg gag g 25

<210>69

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>69

cgt cgc aag acc aaa gag ggg gac ctt cgg g 31

<210>70

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>70

ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g 31

<210>71

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>71

aac ctg ccc atg gct aga tca ccg ggt ttc ggg tct ata ccc t 43

<210>72

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>72

aat ttt tca aca tta gtc ggt tcg gtc ctc cag tta gtg 39

<210>73

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>73

cct ctt gcc atc gga tgt gcc cag atg 27

<210>74

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>74

tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat 39

<210>75

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>75

atg aag ctt cct tcg gga agt gga tta gcg gc 32

<210>76

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>76

ggg ata gcc ttc cga aag gaa gat taa tac 30

<210>77

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>77

gaa cgg taa cag gaa gca gct tgc tgt ttg ctg 33

<210>78

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>78

aac gtc gca aga cca aag agg 21

<210>79

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>79

gtg ccc ttc ggg gga aag att tat cgg caa atg atc ggc ccg cgt t 46

<210>80

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>80

cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 38

<210>81

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>81

taa cag gag aaa gct tgc ttt ctt gct gac 30

<210>82

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>82

cgt cga gtt cac aat aac agc atc ttc aga 30

<210>83

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>83

cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36

<210>84

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>84

cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt t 28

<210>85

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>85

gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga cga gc 35

<210>86

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>86

gtc tac gga cca aag cag ggg ctc ttc gga cct tgc 36

<210>87

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>87

gtg ata aag tta ata cct tta tca att g 28

<210>88

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>88

att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36

<210>89

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>89

att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt t 28

<210>90

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>77

taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga ctg agc 36

<210>91

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>91

gtg ata aag tta ata cct ttg tca att g 28

Claims (7)

1.一套用于检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针，其特征在于包含以下各组探针的全部或部分探针的组合，各部分的探针长度在25-50碱基之间。

a.金黄色葡萄球菌的16S rDNA基因检测探针

b.李斯特氏菌属的16S rDNA基因检测探针

c.肠出血性大肠杆菌O157：H7的23S rDNA基因检测探针

d.霍乱弧菌的16S rDNA基因检测探针

e.耶尔森氏菌属的16S rDNA基因检测探针

f.小肠结肠炎耶尔森氏菌的16S rDNA基因检测探针

g.沙门氏菌属的16S rDNA基因检测探针

h.伤寒沙门氏菌的对Vi抗原表达基因ViaB起到正调控作用的基因VipR检测探针

i.志贺氏菌属的16S rDNA基因检测探针

j.痢疾杆菌的大质粒上编码侵袭质粒抗原H基因ipaH检测探针

k.副溶血性弧菌的16S rDNA基因检测探针

l.副溶血性弧菌的23S rDNA基因检测探针

m.志贺氏菌属、沙门氏菌属和大肠杆菌共有的16S rDNA基因检测探针

n.产气荚膜梭菌的16S rDNA基因检测探针

o.弯曲菌属的16S rDNA基因检测探针

p.变形杆菌的16S rDNA基因检测探针

q.蜡样芽孢菌属的16S rDNA基因检测探针

r.肉毒梭菌的16S rDNA基因检测探针

s.真细菌通用的16S rDNA基因检测探针

t.布鲁氏菌的16S rDNA基因检测探针。

2.如权利要求1所述的一套寡核苷酸探针，其中

a探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

SA1    aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agc

SA2    caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata ga

SA3    aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gta

SA4    gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acg

SA5    aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta

SA-6   tga cta ctt gta agc aca cgg ttt cag gtt cta ttt

SA-7   aat att ttg aac cgc atg gtt caa aag tga aag

SA-8    tac gac caa ata cta aac

SA-9    caa taa tca tca ctt gag gc

b探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

LI1     aac gga gga aga gct tgc tct tcc aaa gtt agt

LI2     tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct

LI3     tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc

Lis-23  gtg gca tgc gcc aca ctt tat c

c探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

H7-1    gca gtc acc cca taa aag agg ct

H7-2    tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc

d探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

VC1     cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag

e探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

YE1     gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg

ye-3    agg ggt tga gtt taa tac gct caa tca ttg

f探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

ye-2e   cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t

g探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

SHI1    ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga

h探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

V-1     aaa tag ata tca ttc gga ggc cag

V-2     ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga ta

V-3     aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt

V-4     tag tcg cga act tga aat gat aac g

V-5     cat ttc tga taa tat cct gga ctg atg ttg ccg

i探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

SAL1    ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga

j探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

I-1     gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c

I-2     gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct

I-3      agt ctt tcg ctg ttg ctg ctg atg cca c

I-4      cct ctg cgg agc ttc gac agc agt ctt tcg ctg tt

I-5      ata ccg tct ctg cac gca ata cct ccg gat tcc gt

I-6      tcc gga ttc cgt gaa cag gtc gct gca tgg ct

k探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

VP1      aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg

1探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

VP23     ggt acg cag tca cag gac aaa gcc

m探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

SS3      tgt ctg gga aac tgc ctg atg gag g

SS4      cgt cgc aag acc aaa gag ggg gac ctt cgg g

SS5      ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g

SS6      aac ctg ccc atg gct aga tca ccg ggt ttc ggg tct ata ccc t

SS7      aat ttt tca aca tta gtc ggt tcg gtc ctc cag tta gtg

SS8      cct ctt gcc atc gga tgt gcc cag atg

n探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

CP-1     cga gct caa agt atg t

CP-2     gcc gag ctc aaa gta tgt

CP-3     gcc gag ctc aaa gta tgt ggc att

CP-4     act act cat act cga cgc tag c

CP-5     gtg ata agg ttc ggt aag cgc tat gcc

CP-6     ggc ata gcg ctt acc gaa cct tat cac

cp-16    aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat c

CP-16-1  aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cgc tat g

CP1      gaa aga tgg cat cat cat tca acc aaa gga gca atc

CP-new-1 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga ccc

CP-new-2 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga

o探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

Cam-1    act cct gct taa cac aag ttg agt ag

Cam-2    tcg gtg tag gat gag act ata tag

Cam-3    act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g

Cam-4    ggt ata gtt aat ctg ccc tac aca aga

Cam-5    ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at

Cam-6    act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa ag

Cam-7    gat ttg cct gta taa cct cct acg acc tta gac tag

Cam-8    cgg agt aaa tcc taa tac aaa gct aac ca

Cam-9    ttc tat cca tcc gaa gac ttc aaa aag cct t

Cam-3-1  act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg g

Cam-1    act cct gct taa cac aag ttg agt ag

p探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

PR1      taa cag gag aaa gct tgc ttt ctt gct gac

PR-2     cgt cga gtt cac aat aac agc atc ttc aga

pr-2     cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga

pr-3     cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt t

pr-4     gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga cga gc

pr-5     gtc tac gga cca aag cag ggg ctc ttc gga cct tgc

pr-6     gtg ata aag tta ata cct tta tca att g

pr-7     att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga

pr-8     att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt t

pr-9     taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga ctg agc

pr-10    gtg ata aag tta ata cct ttg tca att g

q探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

B-1      cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa ttg aaa ggc

B-2      gga taa cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa

B-3      ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c

B-4      tgc tag ttg aat aag ctg gca cct

B-5      ggc ttc ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt c

B-6      tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg

B-41     tgc gta gcc gac ctg aga ggg tgt

r探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

CB-1     tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat

CB-2     atg aag ctt cct tcg gga agt gga tta gcg gc

CB-3       ggg ata gcc ttc cga aag gaa gat taa tac

s探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

common-1   cca gac tcc tac ggg agg cag cag t

common-2   ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat

common-3   cac act gga act gag aca cgg tc

common-2-1 act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat attg

common-3-1 cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga

t探针选自下列寡核苷酸序列中的1条或数条

Bru-1  gtg ccc ttc ggg gga aag att tat cgg caa atg atc ggc ccg cgt t

Bru-2  cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 。

3.如权利要求1所述的一套寡核苷酸探针，其特征在于同时包含a～t二十组探针。

4.如权利要求3所述的一套寡核苷酸探针，其中a探针为SA5，b探针为LI2和LI3，c探针为O157：H7-1和O157：H7-2，d探针为VC1，e探针为YE1，f探针为ye-2e，g探针为SHI1，h探针为V2和V3，i探针为SAL1，j探针为I-1和I-2，k探针为VP1，l探针为VP23，m探针为SS5，n探针为CP-new-1，o探针为Cam-5，p探针为PR-2，q探针为B-6，r探针为CB-1，s探针为common-2-1和common-3-1，t探针为Bru-2。

5.权利要求1～4所述的任一寡核苷酸探针的用途，其特征在于利用探针可对样品中的常见肠道致病菌的相应基因进行检测，尤其适用于基于基因芯片技术的检测。

6.权利要求5所述的寡核苷酸探针的用途，其特征在于利用探针可以检测出十七种常见肠道致病菌以及对痢疾杆菌和伤寒沙门氏菌进行区分。

7.权利要求5所述的寡核苷酸探针的用途，其特征在于该检测可用于临床疾病诊断、抗菌素筛选、环境监测与评价、卫生监督与进出口食品检疫、细菌学分类与流行病学调查、生物战剂检测等。

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