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CN118389720B - 一种用于检测食源性梭菌的引物探针组合、试剂盒及方法 - Google Patents

一种用于检测食源性梭菌的引物探针组合、试剂盒及方法 Download PDF

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CN118389720B CN202410832482.0A CN202410832482A CN118389720B CN 118389720 B CN118389720 B CN 118389720B CN 202410832482 A CN202410832482 A CN 202410832482A CN 118389720 B CN118389720 B CN 118389720B
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Abstract

本发明公开一种用于检测食源性梭菌的引物探针组合、试剂盒及方法,属于致病性梭菌检测技术领域。本发明基于实时荧光定量PCR技术,通过对引物和探针进行筛选和优化,获得扩增特异性好,灵敏度高,并且在扩增体系中不会产生扩增干扰的引物探针组合物,实现对肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌和丁酸梭菌同时进行检测和定量分析。

Description

一种用于检测食源性梭菌的引物探针组合、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于致病性梭菌检测技术领域,具体涉及一种用于检测食源性梭菌的引物探针组合、试剂盒及方法。
背景技术
食源性疾病是全球公共卫生领域面临的重大挑战之一,这些疾病通常由摄入被病原体污染的食物或水引起。其中,梭菌(Clostridium)是一组重要的食源性致病菌,包括肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)等。
尽管已有多种方法用于检测梭菌,如培养法、免疫学方法和分子生物学方法等,但这些方法往往存在检测时间长、操作复杂、灵敏度和特异性有限等不足。培养法是传统的金标准,但需要长时间的培养,而且对于某些条件苛刻的梭菌种类,其灵敏度和特异性不足。免疫学方法,如酶联免疫吸附试验(ELISA),虽然比培养法快,但可能受到交叉反应的影响,减少了特异性。分子生物学方法,尤其是聚合酶链式反应(PCR)技术,提高了检测灵敏度和特异性,常规PCR可以实现对微生物尤其是致病菌的快速检测,但不能实现定量检测,且检测效率低;定量PCR可以对待检致病菌进行定量检测,但一次实验只能检测一种待检致病菌,不能实现对致病菌的高通量检测。实时荧光定量PCR(real-time fluorescentquantitative polymerase chain reaction,qPCR)技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。qPCR能够实时定量检测致病病原体基因核酸,因此比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具优势。
中国专利文献CN101928773A公开了一种基于荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物、检测方法和用途,所述致病菌为存在于血液、痰液、水、食品、大气、土壤环境中的致病菌。再如中国专利文献CN109022550A、CN109022603A、CN110055311A、CN111518923A分别公开了一种基于荧光定量PCR技术检测A型肉毒梭菌、B型肉毒梭菌、艰难梭菌和产气荚膜梭菌的方法。但是,现有技术中还没有出现采用荧光定量PCR技术对肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌和丁酸梭菌同时进行检测和定量的报道。基于此,本发明提供一种基于荧光定量PCR技术同时检测和定量肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌和丁酸梭菌的方法,本发明通过对引物探针的筛选和优化,显著提高扩增效率,灵敏度和特异性好,实现准确检测和定量分析。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测用于检测食源性梭菌的引物探针组合;本发明的第二个目的是提供所述引物探针组合在制备用于检测食源性梭菌的产品中的用途;本发明第三个目的是提供一种用于检测食源性梭菌的试剂盒;本发明还有一个目的是提供一种检测食源性梭菌的方法。
若没有特别说明,本发明所述的食源性梭菌为肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的组合。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
第一方面,本发明提供一种用于检测食源性梭菌的引物探针组合,所述引物探针组合由1)-4)所示的上下游引物和探针组成:
1)用于检测肉毒梭菌的上下游引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示,探针如SEQIDNO:3所示;
2)用于检测艰难梭菌的上下游引物如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示,探针如SEQIDNO:6所示;
3)用于检测产气荚膜梭菌的上下游引物如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示,探针如SEQIDNO:9所示;
4)用于检测产丁酸梭菌的上下游引物如SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示,探针如SEQIDNO:12所示。
进一步的,所述探针的5’端标记有荧光报告基团,且所述探针的荧光报告信号互不干扰;所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
本发明所述的“信号互不干扰”是指:上述各探针所用的荧光基团不同,且不会影响彼此的检测,即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用 FAM、HEX、ROX、Cy5,这些基团吸光值不接近,能选择不同的通道,不同通道的信号不会互相干扰;另外,每一种荧光通道的三个信号可以通过加入不同的探针浓度进行荧光值的区分,从而形成不同的聚类信号,并通过聚类分析软件进行进一步的区分,不会相互干扰。
在本发明的具体实施方式中,用于检测所述四种食源性梭菌的探针5’端标记的荧光报告基团分别选自FAM、HEX、ROX和Cy5。
第二方面,本发明提供一种本发明第一方面提供的引物探针组合在制备用于检测食源性梭菌产品中的用途。
所述用于检测食源性梭菌的产品包括但不限于试剂、试剂盒、芯片、试纸、膜条或检测平台。
第三方面,本发明提供一种用于检测食源性梭菌的试剂盒,所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物探针组合。
进一步的,所述试剂盒还包括酶混合液、阴性质控品、阳性质控品、PCR缓冲液。
所述酶混合液中含有高保真Taq酶、UDG酶、镁离子、dNTP中的至少一种。
所述阴性质控品为经焦炭酸乙二脂(DEPC)处理的纯水;阳性质控品为含有本发明所述的肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的特定序列的质粒。
第四方面,本发明提供一种检测食源性梭菌的方法,所述方法包括如下步骤:
(1)提取待测样本DNA或RNA;
(2)配置含有本发明第一方面所述的引物探针组合的PCR扩增体系进行PCR扩增反应;
(3)根据扩增曲线判断待测样本中是否存在相应的食源性梭菌及所述食源性梭菌的初始浓度。
在步骤(2)中所述的扩增体系中,上游引物的终浓度为0.1-0.2µM,下游引物的终浓度为0.2-0.3µM,探针的终浓度为0.1-0.15µM。
本发明所述的待测样本为任何可能含有食源性梭菌的物质,包括但不限于食品、粪便、口腔拭子、肛拭子。
本发明提供的检测方法基于实时荧光定量PCR技术,通过检测荧光信号的强弱从而实时检测PCR产物扩增量,可以对肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)同时进行检测和定量分析,并且检测灵敏度高。进一步的,本发明对设计得到的引物进行筛选和优化,选择特异性好,灵敏度高的引物对作为候选,在多重PCR体系中剔除形成引物二聚体的引物组,最终优选得到特异性强、扩增效果好的引物对组合制备得到可检测所述四种食源性梭菌的试剂盒。
附图说明
图1实施例4的粪便样本在荧光PCR仪上的扩增曲线图;
图2 特异性检测实验中,仅加入肉毒梭菌基因模板的扩增曲线图;
图3 特异性检测实验中,仅加入艰难梭菌基因模板的扩增曲线图;
图4特异性检测实验中,仅加入产气荚膜梭菌基因模板的扩增曲线图;
图5 特异性检测实验中,仅加入丁酸梭菌基因模板的扩增曲线图;
图6 特异性检测实验中,仅加入破伤风梭菌基因模板的扩增曲线图;
图7 肉毒梭菌灵敏度实验结果图;
图8 艰难梭菌灵敏度实验结果图;
图9 产气荚膜梭菌灵敏度实验结果图;
图10 丁酸梭菌灵敏度实验结果图;
图11 实施例7中出现相互干扰的扩增曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的部分实施例,而不是全部。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1引物探针组合
本发明提供的引物探针的核苷酸信息如下表所示。
表1 用于检测4种食源性梭菌的引物探针组合
若无特别解释,表1中的“F”表示上游引物;“R”表示下游引物;“P”表示探针。
进一步的,上表中探针的5’端标记有荧光报告基团,探针的3’端标记有荧光淬灭基团。具体的,
检测肉毒梭菌的探针为:
5’-FAM-ATTAAGAAGCTATGATATGAAGGGAAAGAG-BHQ1-3’;
检测艰难梭菌的探针为:
5’-HEX-GATTCTTCTGGAAATGTATAAGTTTC-BHQ1-3’;
检测产气荚膜梭菌的探针:
5’-ROX-AGAAGGGAGCCTGACTGCGACACC-BHQ2-3’;
检测丁酸梭菌的探针:
5’- Cy5-CATTATATAATTTACAATCTGGAGCAACGC-BHQ2-3’;
实施例2检测食源性梭菌的试剂盒
本发明提供如下表所示的试剂盒:
表2 检测食源性梭菌的试剂盒
在上述试剂盒中,引物探针混合液的上游引物的终浓度选自0.1-0.2µM,下游引物的终浓度选自0.2-0.3µM,探针的终浓度选自0.1-0.15µM。本领域技术人员可通过常规技术配置酶混合液或者通过商业途径购买。
实施例3检测食源性梭菌的方法
(1)待检样本的获取
(2)待检样本中DNA的提取
使用市售DNA提取试剂盒或本领域技术人员熟知的方法提取待检样本中的基因组DNA。
(3)PCR扩增反应
a)将实施例2提供的试剂盒中的引物探针混合液和酶混合液按照体积比1:5混合,形成PCR扩增体系,分装至反应管中,在所述扩增体系中,上游引物的终浓度为0.1µM,下游引物的终浓度为0.2µM,探针的终浓度为0.1µM;
b)将待检样品(或阴、阳性质控品)的核酸提取物加入反应管,盖紧管盖,瞬时离心后,放入扩增仪,按照下表所示的扩增程序进行PCR扩增反应,在FAM、HEX、ROX、Cy5对应的通道分别读取荧光。
表3 PCR扩增程序
(4)结果判定
如果扩增无S型曲线,则判定该样品为阴性;
如果扩增曲线呈明显S型,则判定为阳性样品。
试剂盒中提供的阳性质控品和阴性质控品,用于临床试验中质量控制,操作方法同待检样本。质量控制标准如下:
阴性质控品扩增曲线无明显S型增长;阳性质控品扩增曲线呈S型;
以上要求须在同一次实验中同时满足,否则,本次实验视作无效,需重新进行。
实施例4粪便样本的检测实例
(1)样本采集、运送和保存
将待检粪便样本装入干燥的专用小盒中,保存期不要超过一个月,如需运输常温即可。
(2)样本处理
a)取适量样本放入盛有300μl Trizol及100μl氯仿的离心管中,折盖好管盖,用振荡器强力振荡20秒后静置3分钟,然后12,000rpm离心2分钟;
b)小心取出无色上层液体(注意不可触及中间絮状层),转移至新灭菌的1.5ml离心管,然后加入10μl磁珠(充分混匀后吸取),再用振荡器充分混匀,8,000rpm离心1分钟后,小心弃去所有液体;
c)加入75%DEPC乙醇400μl,充分振荡混匀,8,000rpm离心1分钟,尽可能将液体抽干(残液利用枪头引流,避免触及沉淀颗粒);
d)将装有沉淀的离心管摆在通风橱中风干15分钟(也可使用开放式加热器于60℃干燥5分钟,需防止样本交叉污染),然后加入30μl 无核酸酶的H2O,用适当的移液器充分重悬,静置1分钟后8,000rpm离心1分钟,处理过的样品可直接用于PCR检测或暂存于-20℃,若保存一个月以上,可存于-70℃。
采用实施例3提供的方法进行PCR扩增反应,检测结果如图1所示,从图中可以看到,本实施例检测的粪便样本中4种食源性梭菌均是阳性。
实施例5试剂盒特异性检测
在四重PCR扩增体系中,仅加入肉毒梭菌基因模板,其余三种梭菌模板未加入,按照实施例3提供的方法进行PCR扩增,结果如图2所示,可看到扩增结果仅有FAM通道出现S型扩增曲线,其他通道未出现扩增。
在四重PCR扩增体系中,仅加入艰难梭菌基因模板,其余三种梭菌模板未加入,按照实施例3提供的方法进行PCR扩增,结果如图3所示,可看到扩增结果仅有HEX通道出现S型扩增曲线,其他通道未出现扩增。
在四重PCR扩增体系中,仅加入产气荚膜梭菌基因模板,其余三种梭菌模板未加入,按照实施例3提供的方法进行PCR扩增,结果如图4所示,可看到扩增结果仅有ROX通道出现S型扩增曲线,其他通道未出现扩增。
在四重PCR扩增体系中,仅加入丁酸梭菌基因模板,其余三种梭菌模板未加入,按照实施例3提供的方法进行PCR扩增,结果如图5所示,可看到扩增结果仅有Cy5通道出现S型扩增曲线,其他通道未出现扩增。
上述结果表明本发明提供的试剂盒和检测方法能够较好地区分本发明所述的4种致病性梭菌。
选择与本发明所述的4种梭菌较为接近的破伤风梭菌作为待检细菌,向扩增体系中加入破伤风梭菌基因模板,按照实施例3提供的方法进行PCR扩增,结果如图6所示,扩增曲线无明显S型增长,说明本发明提供的引物探针组合与本发明所述的4种食源性梭菌种属相近的破伤风梭菌无交叉反应,具有较好的特异性。
实施例6试剂盒灵敏度检测
取一定量的含有本发明所述的四种梭菌的阳性质粒溶于适量超纯水,通过测定OD值,以公式OD260×50µg/ml测算出其浓度,根据质粒的摩尔质量计算出每毫升含有的拷贝数,然后依次用超纯水稀释至 5×103拷贝/ml,1×103拷贝/ml,2×102拷贝/ml,5×101拷贝/ml。由于每个质粒上每种弧菌的基因片段都是1拷贝,所以每一种弧菌的浓度都是相同的。
在反应管中,加入酶混合液10µl,引物探针混合液0.5µl,初步混匀后分别加入各种梯度的10µl质粒模板,每个梯度进行三个重复,采用50℃ 2分钟,95℃ 3分钟,接40个循环(95℃ 10秒,58℃ 35秒)的温控程序,在宏石SLAN-96S 五通道荧光定量PCR仪上进行实验。
肉毒梭菌灵敏度实验结果如图7所示,FAM通道,三个重复,5×101拷贝/ml为阴性;艰难梭菌灵敏度实验结果如图8所示,HEX通道,三个重复,5×101拷贝/ml为阴性;产气荚膜菌灵敏度实验结果如图9所示,ROX通道,三个重复,5×101拷贝/ml为阴性;丁酸梭菌灵敏度实验结果如图10所示,Cy5通道,三个重复,5×101拷贝/ml为阴性。综合上述实验结果,本发明提供的食源性梭菌检测试剂盒的灵敏度为2×102拷贝/ml。
实施例7用于检测食源性梭菌的引物设计及优化过程
根据现有技术获得每一种食源性梭菌基因或DNA片段作为候选扩增基因;使用premier6 软件针对所有候选扩增基因或DNA片段设计多对备用引物;在Genbank中对所有引物方案进行Blast分析,获得特异性较高的引物方案作为实验验证用方案(每一种梭菌会选择多个候选扩增基因,针对每个候选扩增基因会设计多对备用引物,经过Blast分析后每一种梭菌的一个候选扩增基因出现1-2个实验验证方案);对每一个实验验证方案进行单重PCR验证,确定引物的可用性,包括特异性评估和敏感性评估,将效果不好的备用引物剔除;将所有经过验证的引物混合进行多重 PCR,验证引物共同扩增时的可用性,除去形成引物二聚体的引物对,最终获得本发明实施例1提供的用于检测4种食源性梭菌的引物探针组合。
由于本发明所述的4种梭菌基因相似度很高,不易挑选特异性区域,在多重引物的设计中,往往会导致特异性不佳。初次引物设计时发现,加入产气荚膜梭菌模板时,也会带来丁酸梭菌的扩增,经过多次优化,才将特异性及相互干扰现象消除。示例性的,本发明提供一组出现上述问题的引物探针组合,具体如下表所示:
表4 出现相互干扰现象的引物探针组合
在四重PCR扩增体系中,仅加入产气荚膜梭菌基因模板,其余3种弧菌模板未加入,按照实施例3提供的方法进行PCR扩增,结果如图11所示,由于引物设计不佳,导致扩增出现相互干扰的现象,在仅有产气荚膜梭菌的扩增体系中出现了明显的丁酸梭菌的扩增。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种用于检测食源性梭菌的引物探针组合,所述引物探针组合由1)-4)所示的上下游引物和探针组成:
1)用于检测肉毒梭菌的上下游引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示,探针如SEQ IDNO:3所示;
2)用于检测艰难梭菌的上下游引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示,探针如SEQ IDNO:6所示;
3)用于检测产气荚膜梭菌的上下游引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示,探针如SEQ ID NO:9所示;
4)用于检测产丁酸梭菌的上下游引物如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示,探针如SEQ ID NO:12所示;
所述的食源性梭菌为肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的组合。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合,其特征在于,所述探针的5’端标记有荧光报告基团,且所述探针的荧光报告信号互不干扰;所述探针的3’端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的引物探针组合,其特征在于,用于检测所述肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌和丁酸梭菌的探针5’端标记的荧光报告基团分别选自FAM、HEX、ROX和Cy5。
4.一种权利要求1-3任一所述的引物探针组合在制备用于检测食源性梭菌产品中的用途,所述用于检测食源性梭菌的产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸、膜条或检测平台。
5.一种用于检测食源性梭菌的试剂盒,所述试剂盒包括权利要求1-3任一所述的引物探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括酶混合液、阴性质控品、阳性质控品、PCR缓冲液,所述酶混合液中含有高保真Taq酶、UDG酶、镁离子、dNTP中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述阴性质控品为经焦炭酸乙二脂处理的纯水。
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CN1683565A (zh) * 2005-03-15 2005-10-19 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 一套检测常见肠道致病菌的寡核苷酸探针及其用途

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