CN101200761B - 产气荚膜梭状芽孢杆菌快速检测试剂盒的制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种产气荚膜梭状芽孢杆菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。其中试剂盒内包括环介导等温扩增反应液A、Bst DNA聚合酶B、显色剂C；反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-TTGCCATTCATATCTAGCTAATGCTCTATACCTGACACAGGGGA-3、下游内引物5-CAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGGATTAGCAGGATGATATGGAGTA-3、上游外引物5-TTTCTCAAAGGATAATAGTTGGT-3、下游外引物5-ATGTCCTGCGCTATCAAC-3和甜菜碱；检测创伤弧菌的方法包括待测样品或者细菌DNA的提取、创伤弧菌的环介导等温扩增反应和显色检测。本发明的优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种产气荚膜梭状芽孢杆菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。
背景技术
产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)广泛分布于自然生境中，如土壤、干草、沙、一些大型动物(牛、驴和马)的粪便，及狗、猫、啮齿动物和人的粪便。该菌是人和动物肠道的正常菌群，亦是条件性致病菌。该菌感染主要由毒素导致的毒血症致病，是导致坏死性肠炎的一种普遍存在的厌氧性微生物。在一定的条件下，该菌能在肠道中繁殖，产生毒性较强的α毒素。家禽对α毒素很敏感。患临床性或亚临床性坏死性肠炎的家禽还会发现有严重胆管性肝炎的病症。只有在加工生产线上才发现鸡肉颜色差和黄疸、肝肿大，外观呈褐色和表面有结节或斑点、肉质等级明显下降(3％至5％)。梭状芽孢杆菌通常栖息于盲肠，但是如果肠道菌群的平衡发生改变，梭状芽孢杆菌在消化道前段大量增殖，导致坏死性肠炎和鸡的死亡，由于胆管连结着胆囊与肠道，梭状芽孢杆菌可能会转移到肠道上部而进入胆管，随后阻塞胆囊或进入肝脏，导致上述症状。C型产气荚膜芽孢杆菌产生的B毒素可致肠道组织坏死，造成急性出血性坏死性肠炎。
诊断产气荚膜梭状芽孢杆菌单独依靠观察症状还很难判断，必须采用血清学方法或通过病原的分离鉴定。目前病原性产气荚膜梭状芽孢杆菌的检测方法主要有、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验和16srRNA基因探针杂交技术，这些方法在检测时间、稳定性、敏感性等方面存在着一些不足。以往检测产气荚膜梭状芽孢杆菌的主要方法有三种：1.生理生化鉴定技术，该法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要；2.酶联免疫吸附试验，3.聚合酶链式反应法(PCR法)，该方法较前两种方法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未见用环介导等温扩增方法检测产气荚膜梭状芽孢杆菌的试剂盒及方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种产气荚膜梭状芽孢杆菌快速检测试剂盒的制备和使用方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。
本发明涉及的创伤弧菌快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液A：
其中包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8-1.2μmol/L上游引内物(FIP)、0.8-1.2μmol/L下有内引物(BIP)、0.2-0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2-0.3μmol/L下游内引物(B3)和1-1.5mol/L甜菜碱；
其中所述的上游内引物5-TTGCCATTCATATCTAGCTAATGCT-CTATACCTGACACAGGGGA-3
下游内引物5-CAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGG-ATTAGCAGGATGATATGGAGTA-3
上游外引物5-TTTCTCAAAGGATAATAGTTGGT-3
下游外引物5-ATGTCCTGCGCTATCAAC-3
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、20mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶B：8U/μL；
(4)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液A每管23μL的最佳组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、1.0μL 20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2M甜菜碱和4μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
使用上述试剂盒检测产气荚膜梭状芽孢杆菌的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：
(1)样品(待检样品或者培养菌液)DNA的提取
A.取200mg待检样品或者1.0-1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；
B.加入1.0-1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，弃上清液；
C.加入100-150μL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴中加热10-15min；
D.用台式离心机10000-12000转/分离心5-10min，取上清至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA；
(2)进行产气荚膜梭状芽孢杆菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液A的反应管中加入1μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温金属浴上50℃放置3min，于恒温金属浴上95℃放置3-5min，立即置于冰上1-3min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶B；
C.于恒温金属浴上60-65℃放置45-90min；
D.将金属浴调到80-95℃中止反应，3-5min后取出待检；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含或者不是产气荚膜梭状芽孢杆菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品或者细菌含有或者为产气荚膜梭状芽孢杆菌。
本发明建立了产气荚膜梭状芽孢杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，本试剂盒根据产气荚膜梭状芽孢杆菌的plc基因的基本保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为产气荚膜梭状芽孢杆菌各不同血清型和菌株型所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的产气荚膜梭状芽孢杆菌株的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于产气荚膜梭状芽孢杆菌的检测，特别适用于基层医疗机构以及养殖场现场应用。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
实施例1
按下列配方制作产气荚膜梭状芽孢杆菌的环介导等温扩增试剂盒：
(1)LAMP反应液A：
含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物5-TTGCCATTCATATCTAGCTAATGCT-CTAT ACCTGACAC AGGGGA-3、
下游内引物5-CAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGG-ATTAGCAGGATG ATATGGAGTA-3、
上游外引物5-TTTCTCAAAGGATAATAGTTGGT-3、
下游外引物5-ATGTCCTGCGCTATCAAC-3
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶B：8U/μL；
(4)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。
按照以下程序进行检测：
(1)细菌DNA的提取
A.取200mg待检样品或者1.0-1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000转/分离心10min，弃上清液；
B.加入1.0-1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000转/分离心10min，弃上清液；
C.加入100μL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴中加热10min；
D.用台式离心机10000转/分离心10min，取上清至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA；
(2)进行产气荚膜梭状芽孢杆菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液A的反应管中加入1μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温金属浴上50℃放置3min，于恒温金属浴上95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶B；
C.于恒温金属浴上65℃放置1小时；
D.将金属浴调到80℃中止反应，3min后取出；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含或者不是产气荚膜梭状芽孢杆菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品或者细菌含有或者为产气荚膜梭状芽孢杆菌。
实施例2
按下列配方制作产气荚膜梭状芽孢杆菌的环介导等温扩增试剂盒：
(1)LAMP反应液A：
含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物(FIP)、1.0μL 20μmol/L下游内引物(BIP)、0.25μL 20μmol/L上游外引物(F3)、0.25μL 20μmol/L下游外引物(B3)、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL ddH2O(灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。上述dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶B：8U/μL；
(4)显色剂C：为10％的荧光染料或者DNAGreen。
按照以下程序进行检测：
(1)细菌DNA的提取
A.取200mg待检样品或者1.0mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机2000转/分离心5min，弃上清液；
B.加入1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心5min，弃上清液；
C.加入150μL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴中加热15min；
D.用台式离心机12000转/分离心5min，取上清至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA；
(2)进行产气荚膜梭状芽孢杆菌的环介导等温扩增反应：
A.在装有23μL LAMP反应液A的反应管中加入1μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温金属浴上50℃放置3min，于恒温金属浴上95℃放置5min，立即置于冰上1min；
B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶B；
C.于恒温金属浴上65℃放置1小时；
D.将金属浴调到80℃中止反应，3min后取出；
(3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含或者不是产气荚膜梭状芽孢杆菌，如果颜色变为绿色，则说明待检样品或者细菌含有或者为产气荚膜梭状芽孢杆菌。
Claims (3)
1.一种产气荚膜梭状芽孢杆菌快速检测试剂盒，其特征是其中的试剂包括下列(1)-(4)：
(1)环介导等温扩增反应液A：
包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol/L上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；
其中所述的上游内引物5-TTGCCATTCATATCTAGCTAATGCTCTATACCTGACACAGGGGA-3、
下游内引物5-CAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGGATTAGCAGGATGATATGGAGTA-3、
上游外引物5-TTTCTCAAAGGATAATAGTTGGT-3、
下游外引物5-ATGTCCTGCGCTATCAAC-3；
(2)UNG酶：1U/μL；
(3)Bst DNA聚合酶B：8U/μL；
(4)显色剂C：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2.根据权利要求1中所述的产气荚膜梭状芽孢杆菌快速检测试剂盒，其特征是上述的混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝2∶1∶1∶1。
3.根据权利要求1中所述的产气荚膜梭状芽孢杆菌快速检测试剂盒，其特征是环介导等温扩增反应液A每管23μL的组成为：2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0μL 10mmol/L dNTP、1.0μL 20μmol/L上游内引物、1.0μL 20μmol/L下游内引物、0.25μL 20μmol/L上游外引物、0.25μL 20μmol/L下游外引物、0.5μL 100mmol/L MgSO4、12.5μL 2mol/L甜菜碱和4μL dd H2O。
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