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TWI753848B - 利用抗-cd19之嵌合抗原受體之癌症治療 - Google Patents

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TWI753848B
TWI753848B TW104111176A TW104111176A TWI753848B TW I753848 B TWI753848 B TW I753848B TW 104111176 A TW104111176 A TW 104111176A TW 104111176 A TW104111176 A TW 104111176A TW I753848 B TWI753848 B TW I753848B
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約翰 拜爾德
傑森 杜伯夫斯基
約瑟夫 芙瑞塔
薩爾 吉兒
大衛 葛瑞斯
愛咪 強森
卡爾 瓊
薩德 肯德雷恩
瓊安 曼尼克
馬瑟拉 茂斯
里昂 墨菲
瑞傑 穆瑟薩米
大衛 波特
瑪寇 魯拉
威廉 瑞傑 薩樂斯
瑪利厄斯 瓦錫克
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瑞士商諾華公司
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Abstract

本發明提供用於治療與CD19之表現相關之疾病之組合物及方法，其係例如藉由投與包含如本文所述之CD19 CAR之重組T細胞與激酶抑制劑、例如本文所述之激酶抑制劑的組合來實施。本發明亦提供本文所述之套組及組合物。

Description

利用抗-CD19之嵌合抗原受體之癌症治療
本申請案主張於2014年4月7日提出申請的美國第61/976,396號、於2014年6月3日提出申請的美國第62/007,309號、於2014年8月12日提出申請的美國第62/036,493號、於2014年11月6日提出申請的美國第62/076,238號、於2014年12月5日提出申請的美國第62/087,888號及於2014年12月29日提出申請的美國第62/097,278號之優先權，該等專利之內容之全文皆以引用方式併入本文中。
序列表
本申請案含有以ASCII格式電子提交之序列表且其全文以引用方 式併入本文中。該ASCII拷貝在2015年4月6日創建，命名為N2067- 7051WO_SL.txt且大小為252,204個位元組。
本發明概言之係關於經改造以表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞與例如另一藥劑(例如激酶抑制劑及/或細胞介素)之組合的用途，其用於治療與分化簇19蛋白(CD19)之表現相關之疾病。
許多B細胞惡性病患者無法利用標準療法來治癒。另外，傳統治療選擇通常具有嚴重副作用。在癌症免疫療法中已進行了多種嘗試，然而，若干障礙使此成為達成臨床有效性之極難目標。儘管業內已鑑 別出數百種所謂的腫瘤抗原，但該等抗原通常源自自身且因此具有較差免疫原性。此外，腫瘤利用若干機制使其自身抵抗免疫攻擊之起始及傳播。
利用嵌合抗原受體(CAR)修飾之自體T細胞(CART)療法之最新研發依賴於將T細胞重定向至癌細胞(例如B細胞惡性病)上之適宜細胞表面分子，其在利用免疫系統之活力治療B細胞惡性病及其他癌症方面展示有希望的結果(例如，參見Sadelain等人，Cancer Discovery 3：388-398(2013))。鼠類源性CART19(即，「CTL019」)之臨床結果已展示有希望在患有CLL之患者以及兒童期ALL中建立完全緩解(例如，參見Kalos等人，Sci Transl Med 3：95ra73(2011)；Porter等人，NEJM 365：725-733(2011)；Grupp等人，NEJM 368：1509-1518(2013))。除經遺傳修飾之T細胞上之嵌合抗原受體識別及破壞靶細胞之能力外，成功的治療性T細胞療法需要隨時間增殖及存留以及進一步監測白血病細胞逃逸之能力。T細胞之可變品質(無論其引起無效能、阻抑抑或耗竭)將對CAR轉化T細胞之性能具有效應，但此時熟習此項技術者對其具有有限控制。為有效，CAR轉化之患者T細胞需要存留且維持因應CAR之抗原增殖之能力。已展示ALL患者T細胞可利用包含鼠類scFv之CART19達成此能力(例如，參見Grupp等人，NEJM 368：1509-1518(2013))。
本發明之特徵至少部分在於利用表現嵌合抗原受體(CAR)分子(例如，結合至B細胞抗原、例如分化簇19蛋白(CD19)(例如，OMIM登錄號107265、Swiss Prot.登錄號P15391)之CAR之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)治療病症(例如癌症，例如血液癌症或其他B細胞惡性病)之組合物及方法。該等組合物包括表現B細胞靶向CAR之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)與激酶抑制劑(例如，CDK4/6抑 制劑、BTK抑制劑、mTOR抑制劑、MNK抑制劑、雙重PI3K/mTOR抑制劑或其組合中之一或多者)之組合，且該等方法包括投與該組合。 在一些實施例中，該組合與任一單獨療法相比維持或具有較佳臨床有效性。本發明另外係關於表現結合至B細胞抗原(例如，CD19)之CAR分子之經改造細胞(例如，免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞))與激酶抑制劑(例如，選自以下中之一或多者之激酶抑制劑：細胞週期蛋白依賴性激酶4(CDK4)抑制劑、布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑、mTOR抑制劑、促分裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制劑、雙重磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)/mTOR抑制劑或其組合)之組合治療與B細胞抗原(例如，CD19)之表現相關之病症(例如癌症，例如血液癌症)的用途。
因此，在一個態樣中，本發明係關於治療患有與B細胞抗原(例如，CD19)之表現相關之疾病之個體(例如，哺乳動物)的方法。該方法包含向哺乳動物投與有效量之表現結合B細胞抗原之CAR分子之細胞(例如，免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞))與激酶抑制劑(例如，本文所述之激酶抑制劑)的組合。在一個實施例中，CAR分子結合至CD19，例如結合本文所述CD19之CAR分子。在其他實施例中，CAR分子結合至CD20、CD22或ROR1中之一或多者。
在一個實施例中，與B細胞抗原之表現(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者之表現)相關之疾病選自增生性疾病，例如癌症、惡性病或癌前病況，例如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期，或係與B細胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者)之表現相關之非癌症相關適應症。在一個實施例中，疾病係實體或液體腫瘤。在一個實施例中，癌症係胰臟癌。在一個實施例中，疾病係血液癌症。在一個實施例中，血液癌症係白血病。在一個實施例中，癌症選自由以下組成之群：一或多種急性白血 病，包括(但不限於)B細胞急性淋巴樣白血病(BALL)、T細胞急性淋巴樣白血病(TALL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性淋巴樣白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)。其他血液癌症或血液病況包括(但不限於)外套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、多毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生性病況、MALT淋巴瘤、邊緣帶淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤及瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)。在某些實施例中，與B細胞抗原(例如，例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者)表現相關之疾病係「白血病前期」，其係因骨髓樣血球之無效產生(或發育不良)而集合在一起之血液病況的不同集合。在一些實施例中，與B細胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者)表現相關之疾病包括(但不限於)表現B細胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者)之非典型及/或非經典癌症、惡性病、癌前病況或增生性疾病。本文所述與B細胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者)表現相關之疾病之任一組合可使用本文所述之方法及組合物來治療。
在一個實施例中，與B細胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者)之表現相關之疾病係淋巴瘤，例如MCL、霍奇金氏淋巴瘤或DLBCL。在一個實施例中，與B細胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者)之表現相關之疾病係白血病，例如SLL、CLL及/或ALL。在一個實施例中，與B細胞抗原之表現相關 之疾病係多發性骨髓瘤(例如，為CD19陰性、例如絕大多數(99.95%)贅瘤性漿細胞具有CD19陰性表型之多發性骨髓瘤，例如如藉由流式細胞術及RT-PCR二者所檢測)。
在一個實施例中，激酶抑制劑係CDK4抑制劑，例如本文所述之CDK4抑制劑，例如CD4/6抑制劑，例如6-乙醯基-8-環戊基-5-甲基-2-(5-六氫吡嗪-1-基-吡啶-2-基胺基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮鹽酸鹽(亦稱為帕博西林(palbociclib)或PD0332991)。在一個實施例中，激酶抑制劑係BTK抑制劑，例如本文所述之BTK抑制劑，例如依魯替尼(ibrutinib)。在一個實施例中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如本文所述之mTOR抑制劑，例如雷帕黴素(rapamycin)、雷帕黴素類似物、OSI-027。mTOR抑制劑可係例如mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑，例如本文所述之mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑。在一個實施例中，激酶抑制劑係MNK抑制劑，例如本文所述之MNK抑制劑，例如4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制劑可係例如MNK1a、MNK1b、MNK2a及/或MNK2b抑制劑。在一個實施例中，抑制劑可係雙重PI3K/mTOR抑制劑，例如PF-04695102。
在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之CDK4抑制劑：阿羅辛A(aloisine A)；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275 2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(3S,4R)-3-羥基-1-甲基-4-六氫吡啶基]-4-
Figure 104111176-A0202-12-0005-40
烯酮；克唑替尼(crizotinib)(PF-02341066)；2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(2R,3S)-2-(羥基甲基)-1-甲基-3-吡咯啶基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮鹽酸鹽(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；因地蘇蘭(indisulam)(E7070)；羅可韋汀(roscovitine)(CYC202)；帕博西林(PD0332991)；地那西布(dinaciclib)(SCH727965)；N-[5-[[(5-第三丁基噁唑-2-基)甲基]硫基]噻唑-2-基]六氫吡啶-4-甲醯胺(BMS 387032)； 4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯氮呯-2-基]胺基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲醯基胺基)-1H-吡唑-3-甲酸N-(六氫吡啶-4-基)醯胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺醯基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；XL281(BMS908662)；及瑞博司可裡布(ribociclib)。
在一個實施例中，激酶抑制劑係CDK4抑制劑，例如帕博西林(PD0332991)，且帕博西林係以每天約50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)之劑量持續一定時間段(例如，每天持續28天週期之14-21天，或每天持續21天週期之7-12天)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個帕博西林週期。
在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之BTK抑制劑：依魯替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。在較佳實施例中，BTK抑制劑不會降低或抑制介白素-2誘導型激酶(ITK)之激酶活性，且選自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。
在一個實施例中，激酶抑制劑係BTK抑制劑，例如依魯替尼(PCI-32765)，且依魯替尼係以之劑量每天約250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)持續一定時間段(例如，每天持續21天週期，或每天持續28天週期)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6 個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個依魯替尼週期。
在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之mTOR抑制劑：替西羅莫司(temsirolimus)；瑞達福羅莫司(ridaforolimus)(1R,2R,4S)-二甲基亞磷酸4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基酯，亦稱為AP23573及MK8669；依維莫司(everolimus)(RAD001)；雷帕黴素(AY22989)；塞馬莫德(semapimod)；(5-{2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反式-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；及N 2-[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸-內鹽(SF1126)；及XL765。
在一個實施例中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如雷帕黴素，且雷帕黴素係以每天約3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg)之劑量持續一定時間段(例如，每天持續21天週期，或每天持續28天週期)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個雷帕黴素週期。在一個實施例中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如依維莫司，且依維莫司係以每天約2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg)之劑量持續一定時間段(例如，每天持續28天週期)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個依維莫司週期。
在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之MNK抑制劑：CGP052088；4-胺基-3-(對-氟苯基胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢醯胺(cercosporamide)；ETC-1780445-2；及4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之雙重磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)及mTOR抑制劑：2-胺基-8-[反式-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基胺基)-1-六氫吡啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384、PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-側氧基-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；阿匹西布(apitolisib)(GDC-0980、RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-嗒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(六氫吡嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮順丁烯二酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-嗎啉基吡啶并[3',2'：4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]酚(PI-103)；5-(9-異丙基-8-甲基-2-嗎啉基-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584、SB2343)；及N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)胺基]喹喏啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]胺基苯基磺醯胺(XL765)。
在一個實施例中，細胞表現包含抗-CD19結合結構域(例如，特異性結合至CD19之鼠類或人類化抗體或抗體片段)、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域(例如，包含共刺激結構域及/或初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域)之CAR分子。在一個實施例中，CAR包含包括本文所述之抗-CD19結合結構域(例如，特異性結合至如本文所述之CD19之鼠類或人類化抗體或抗體片段)、本文所述之跨膜結構域及本文所述之細胞內信號傳導結構域(例如，包含本文所述之共刺激結構域及/或初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域)的抗體 或抗體片段。
在一個實施例中，CAR分子能夠結合CD19(例如，野生型或突變體人類CD19)。在一個實施例中，CAR分子包含抗-CD19結合結構域，其包括本文所述抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及本文所述抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如，包含一或多個(例如，所有三個)LC CDR及一或多個(例如，所有三個)HC CDR之抗-CD19結合結構域。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域包含本文所述抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如抗-CD19結合結構域具有兩個可變重鏈區，其各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域包含本文所述之鼠類輕鏈可變區(例如，在表7中)及/或本文所述之鼠類重鏈可變區(例如，在表7中)。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域係包含表7之胺基酸序列之鼠類輕鏈及鼠類重鏈的scFv。在實施例中，抗-CD19結合結構域(例如，scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有表7中所提供輕鏈可變區之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與表7之胺基酸序列具有95%-99%一致性的序列；及/或重鏈可變區，其包含具有表7中所提供重鏈可變區之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與表7之胺基酸序列具有95%-99%一致性的序列。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域包含SEQ ID NO：59之序列或與其具有95%-99%一致性之序 列。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域係scFv，且包含例如表7中之本文所述胺基酸序列的輕鏈可變區經由連接體(例如，本文所述之連接體)附接至包含例如表7中之本文所述胺基酸序列的重鏈可變區。 在一個實施例中，抗-CD19結合結構域包括(Gly4-Ser)n連接體，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳3或4(SEQ ID NO：53)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。
在一個實施例中，CAR分子包含人類化抗-CD19結合結構域，其包括本文所述人類化抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及本文所述人類化抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如包含一或多個(例如，所有三個)LC CDR及一或多個(例如，所有三個)HC CDR之人類化抗-CD19結合結構域。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包含至少HC CDR2。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包含本文所述人類化抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化抗-CD19結合結構域具有兩個可變重鏈區，其各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包含至少HC CDR2。在一個實施例中，輕鏈可變區包含VK3_L25種系序列之一個、兩個、三個或所有四個框架區。在一個實施例中，輕鏈可變區具有修飾(例如取代，例如在SEQ ID NO：58之鼠類輕鏈可變區之相應位置中發現之一或多個胺基酸之取代，例如，位置71及87中之一或多者處之取代)。在一個實施例中，重鏈可變區包含VH4_4-59種系 序列之一個、兩個、三個或所有四個框架區。在一個實施例中，重鏈可變區具有修飾(例如取代，例如在SEQ ID NO：58之鼠類重鏈可變區之相應位置中發現之一或多個胺基酸之取代，例如位置71、73及78中之一或多者處之取代)。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包含本文所述之輕鏈可變區(例如，在表3中)及/或本文所述之重鏈可變區(例如，在表3中)。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域係包含表3之胺基酸序列之輕鏈及重鏈的scFv。在實施例中，人類化抗-CD19結合結構域(例如，scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有表3中所提供輕鏈可變區之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與表3之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有表3中所提供重鏈可變區之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與表3之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域係scFv，且包含例如表3中之本文所述胺基酸序列的輕鏈可變區經由連接體(例如，本文所述之連接體)附接至包含例如表3中之本文所述胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包括(Gly4-Ser)n連接體，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳3或4(SEQ ID NO：53)。ScFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。
在一個實施例中，CAR分子包含選自由以下組成之群之蛋白質之跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜結構域包含SEQ ID NO：15之序列。在一個實施例中，跨膜結構域包含具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過20個、10個或5個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：15之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。
在一個實施例中，抗-CD19結合結構域藉由鉸鏈區(例如，本文所述之鉸鏈區)聯結至跨膜結構域。在一個實施例中，經編碼鉸鏈區包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或與其具有95%-99%一致性之序列。
在一個實施例中，CAR分子進一步包含編碼共刺激結構域(例如，本文所述之共刺激結構域)之序列。在一個實施例中，共刺激結構域包含選自由以下組成之群之蛋白質之功能性信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)。在一個實施例中，共刺激結構域包含SEQ ID NO：16之序列。在一個實施例中，共刺激結構域包含SEQ ID NO：51之序列。在一個實施例中，共刺激結構域包含具有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過20個、10個或5個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。
在一個實施例中，CAR分子進一步包含編碼細胞內信號傳導結構域(例如，本文所述之細胞內信號傳導結構域)之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含4-1BB之功能性信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能性信號傳導結構域。在一個實施例中，細胞內信號傳導 結構域包含SEQ ID NO：16之序列及/或SEQ ID NO：17之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含SEQ ID NO：16之序列及/或SEQ ID NO：43之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含CD27之功能性信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能性信號傳導結構域。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含SEQ ID NO：51之序列及/或SEQ ID NO：17之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含SEQ ID NO：51之序列及/或SEQ ID NO：43之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含具有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過20個、10個或5個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之序列及SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列，其中包含細胞內信號傳導結構域之序列係在同一框架中且以單一多肽鏈形式表現。
在一個實施例中，CAR分子進一步包含前導序列，例如本文所述之前導序列。在一個實施例中，前導序列包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列或與SEQ ID NO：13之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。
在一個實施例中，CAR分子包含前導序列，例如本文所述之前導序列，例如SEQ ID NO：13之前導序列或與其具有95%-99%一致性；本文所述之抗-CD19結合結構域，例如包含LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3、本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3之抗-CD19結合結構域，例如表7中所述之鼠類抗-CD19結合結構域、表3中所述之人類化抗-CD19結合結構域或與其具有95%-99%一致性之序列；鉸鏈區，例如本文所述之鉸鏈區，例如SEQ ID NO：14之鉸鏈區或與其具 有95%-99%一致性；跨膜結構域，例如本文所述之跨膜結構域，例如具有SEQ ID NO：15之序列或與其具有95%-99%一致性之序列的跨膜結構域；細胞內信號傳導結構域，例如本文所述之細胞內信號傳導結構域(例如，包含共刺激結構域及/或初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域)。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含共刺激結構域，例如本文所述之共刺激結構域，例如具有SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之序列或與其具有95%-99%一致性之4-1BB共刺激結構域；及/或初級信號傳導結構域，例如本文所述之初級信號傳導結構域，例如具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列或與其具有95%-99%一致性之CD3 ζ刺激結構域。
在一個實施例中，CAR分子包含以下胺基酸序列(例如，由其組成)：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42之胺基酸序列，或具有SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42之胺基酸序列之至少1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個或30個修飾(例如，取代)但不超過60個、50個或40個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42之胺基酸序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列。
在一個實施例中，表現CAR分子之細胞包含包括編碼CAR分子之 核酸序列之載體。在一個實施例中，載體選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。在一個實施例中，載體係慢病毒載體。在一個實施例中，載體進一步包含啟動子。在一個實施例中，啟動子係EF-1啟動子。在一個實施例中，EF-1啟動子包含SEQ ID NO：100之序列。在一個實施例中，載體係活體外轉錄之載體，例如轉錄本文所述核酸分子之RNA之載體。在一個實施例中，活體外載體中之核酸序列進一步包含聚(A)尾，例如本文所述之聚A尾，例如包含約150個腺苷鹼基(SEQ ID NO：104)。在一個實施例中，活體外載體中之核酸序列進一步包含3’UTR，例如本文所述之3’UTR，例如包含源自人類β-球蛋白之3’UTR之至少一個重複。在一個實施例中，活體外載體中之核酸序列進一步包含啟動子，例如T2A啟動子。
在本文所揭示組合物及方法之某些實施例中，表現CAR分子之細胞(在本文中亦稱為「CAR表現細胞」)係如本文所述之細胞或細胞群，例如人類免疫效應細胞或細胞群(例如，人類T細胞或人類NK細胞，例如本文所述之人類T細胞或本文所述之人類NK細胞)。在一個實施例中，人類T細胞係CD8+ T細胞。在一個實施例中，細胞係自體T細胞。在一個實施例中，細胞係同種異體T細胞。在一個實施例中，細胞係T細胞，且T細胞缺乏二醯基甘油激酶(DGK)。在一個實施例中，細胞係T細胞，且T細胞缺乏伊卡洛斯(Ikaros)。在一個實施例中，細胞係T細胞，且T細胞缺乏DGK及伊卡洛斯二者。應理解，陳述術語「細胞」之本文所揭示之組合物及方法涵蓋包含一或多個細胞(例如細胞群)之組合物及方法。
在另一實施例中，表現CAR分子之細胞(例如如本文所述)可進一步表現另一藥劑，例如增強CAR表現細胞之活性之藥劑。
在一個實施例中，該方法進一步包括投與如本文所述視情況與 激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之表現CAR分子之細胞與增強CAR表現細胞之活性之藥劑的組合。在某些實施例中，藥劑為細胞介素，例如IL-7、IL-15、IL-21或其組合。在一個實施例中，該方法包括向個體投與IL-7。細胞介素可與例如CAR表現細胞之投與同時或在其後不久組合遞送。另一選擇為，細胞介素可在投與CAR表現細胞後之延長時間段後、例如在評價個體對CAR表現細胞之反應後遞送。
在其他實施例中，增強CAR表現細胞之活性之藥劑可係抑制免疫抑制分子之藥劑。免疫抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。在一個實施例中，抑制免疫抑制分子之藥劑包含例如免疫抑制分子之與向細胞提供正信號之第二多肽(例如，本文所述之細胞內信號傳導結構域)締合之第一多肽。在一個實施例中，該藥劑包含例如抑制分子(例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β或該等分子中任一者之片段(例如，該等分子中任一者之細胞外結構域之至少一部分))之第一多肽，及為本文所述之細胞內信號傳導結構域(例如，包含共刺激結構域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)及/或初級信號傳導結構域(例如，本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域))的第二多肽。 在一個實施例中，該藥劑包含PD1或其片段(例如，PD1之細胞外結構域之至少一部分)的第一多肽，及本文所述之細胞內信號傳導結構域(例如，本文所述之CD28信號傳導結構域及/或本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。
在一個實施例中，利用淋巴球輸注(例如同種異體淋巴球輸注)來 治療癌症，其中淋巴球輸注包含至少一種結合至B細胞抗原(例如，CD19)之CAR表現細胞(在本文中亦稱為CD19 CAR表現細胞)，如本文所述。在一個實施例中，利用自體淋巴球輸注來治療癌症，其中自體淋巴球輸注包含至少一種CD19表現細胞。
在一個實施例中，將CD19 CAR表現細胞(例如，T細胞)投與已接受先前幹細胞移植(例如，自體幹細胞移植)之個體。
在一個實施例中，將CD19 CAR表現細胞(例如，T細胞)投與已接受先前劑量之美法侖(melphalan)之個體。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係與改善一或多種與投與表現CAR分子之細胞相關之副作用的藥劑(例如，本文所述之藥劑)組合投與。
在一個實施例中，激酶抑制劑係與改善一或多種與投與激酶抑制劑相關之副作用的藥劑(例如本文所述之藥劑)組合投與。
在一個實施例中，表現CAR分子之細胞(例如，本文所述之CAR分子)及激酶抑制劑係與治療與CD19相關之疾病的另一藥劑(例如，本文所述之另一藥劑)組合投與。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係以本文所述之劑量及/或投藥時間表來投與。
在一個實施例中，例如利用活體外轉錄將CAR分子引入T細胞中，且使個體(例如，人類)接受包含CAR分子之細胞之初次投與及包含CAR分子之細胞的一或多次後續投與，其中一或多次後續投與係在先前投與後不到15天、例如14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天時投與。在一個實施例中，向個體(例如，人類)每週投與包含CAR分子之細胞之一次以上的投與，例如每週投與包含CAR分子之細胞之2次、3次或4次投與。在一個實施例中，使個體(例如，人類個體)每週接受包含CAR分子之細胞之一次 以上的投與(例如，每週2次、3次或4次投與)(在本文中亦稱為週期)，隨後一週不投與包含CAR分子之細胞，且然後向個體投與包含CAR分子之細胞之一或多次額外投與(例如，每週包含CAR分子之細胞之一次以上的投與)。在另一實施例中，使個體(例如，人類個體)接受包含CAR分子之細胞之一個以上的週期，且每一週期之間之時間少於10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一個實施例中，包含CAR分子之細胞係每隔一天來投與，每週持續投與3次。在一個實施例中，將包含CAR分子之細胞投與至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或更長。
在一個實施例中，投與激酶抑制劑與表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞的組合作為疾病(例如癌症，例如本文所述之癌症)之第一線治療。在另一實施例中，投與激酶抑制劑與表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞的組合作為疾病(例如癌症，例如本文所述之癌症)之第二、第三、第四線治療。
在一個實施例中，向個體投與本文所述之細胞(例如，細胞群)。
在一個實施例中，該方法包括投與細胞群，其中之複數個包含本文所述之CAR分子。在一些實施例中，CAR表現細胞群包含表現不同CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群可包括第一細胞，其表現具有本文所述抗-CD19結合結構域之CAR；及第二細胞，其表現具有不同抗-CD19結合結構域(例如，本文所述不同於第一細胞所表現之CAR之抗-CD19結合結構域的抗-CD19結合結構域)之CAR。作為另一實例，CAR表現細胞群可包括第一細胞，其表現包括抗-CD19結合結構域(例如如本文所述)之CAR；及第二細胞，其表現包括針對除CD19外之靶(例如，CD123或美索色林(mesothelin))之抗原結合結構域之CAR。在一個實施例中，CAR表現細胞群包括例如第一細胞，其表現包括初級細胞內信號傳導結構域之 CAR；及第二細胞，其表現包括次級信號傳導結構域之CAR。
在一個實施例中，該方法包括投與其中群中之至少一個細胞表現具有本文所述抗-CD19結構域之CAR的細胞群及增強CAR表現細胞(例如，表現增強CAR表現細胞之活性之藥劑之第二細胞)之活性的藥劑。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可係抑制免疫抑制分子之藥劑。免疫抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。在一個實施例中，抑制免疫抑制分子之藥劑包含例如抑制分子之與向細胞提供正信號之第二多肽(例如，本文所述之細胞內信號傳導結構域)締合之第一多肽。在一個實施例中，藥劑包含例如抑制分子(例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β或該等分子中任一者之片段(例如，該等分子中任一者之細胞外結構域之至少一部分))的第一多肽，及為本文所述之細胞內信號傳導結構域(例如，包含共刺激結構域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)及/或初級信號傳導結構域(例如，本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。在一個實施例中，藥劑包含PD1或其片段(例如，PD1之細胞外結構域之至少一部分)之第一多肽，及本文所述細胞內信號傳導結構域(例如，本文所述之CD28信號傳導結構域及/或本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)之第二多肽。
在另一態樣中，本發明係關於表現本文所述CAR分子之細胞作為藥劑與激酶抑制劑(例如本文所述之激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼))組合使用。在另一態樣中，本發明係關於本文所述之激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)作為藥劑與表現本文所述 CAR分子之細胞組合使用。
在另一態樣中，本發明係關於表現本文所述CAR分子之細胞與激酶抑制劑(例如本文所述之激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼))組合使用來治療表現B細胞抗原(例如，CD19)之疾病。在另一態樣中，本發明係關於本文所述之激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)與表現本文所述CAR分子之細胞組合使用來治療表現B細胞抗原(例如，CD19)之疾病。疾病可係例如癌症，例如血液癌症。癌症可係例如淋巴瘤、CLL、MCL、ALL、DLBCL、多發性骨髓瘤或本文所述之另一癌症。
在另一態樣中，本發明係關於表現本文所述CAR分子之細胞作為藥劑與細胞介素(例如如本文所述之IL-7、IL-15及/或IL-21)組合使用。在另一態樣中，本發明係關於本文所述之細胞介素作為藥劑與表現本文所述CAR分子之細胞組合使用。
在另一態樣中，本發明係關於表現本文所述CAR分子之細胞與細胞介素(例如，如本文所述之IL-7、IL-15及/或IL-21)組合使用來治療表現CD19之疾病。在另一態樣中，本發明係關於本文所述之細胞介素與表現本文所述CAR分子之細胞組合使用來治療表現CD19之疾病。
在另一態樣中，本發明係關於治療患有霍奇金氏淋巴瘤之哺乳動物之方法，其包含向哺乳動物投與有效量之表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞(例如，多個細胞)。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係與增加表現CAR分子之細胞的效能之藥劑(例如，本文所述之藥劑)組合投與。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係與改善一或多種與投與表現CAR分子之細胞相關的副作用之藥 劑(例如，本文所述之藥劑)組合投與。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係與治療霍奇金氏淋巴瘤之藥劑(例如，本文所述之藥劑)組合投與。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑(例如本文所述之mTOR抑制劑)組合投與。儘管不希望受限於理論，但人們認為使用低免疫增強劑量(例如，不足以完全阻抑免疫系統但足以改良免疫功能之劑量)治療伴隨有PD-1陽性T細胞減少或PD-1陰性細胞增加。PD-1陽性T細胞而非PD-1陰性T細胞可藉由與表現PD-1配體(例如，PD-L1或PD-L2)之細胞接合而耗竭。
在實施例中，此方式可用於最佳化本文所述CAR細胞在個體中之性能。儘管不希望受限於理論，但人們認為在實施例中，改良未經修飾之內源免疫效應細胞(例如，T細胞)之性能。儘管不希望受限於理論，但人們認為在實施例中，改良CD19 CAR表現細胞之性能。在其他實施例中，具有或經改造以表現CAR之細胞(例如，T細胞)可藉由與一定量之增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)之數量或增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)之比率的mTOR抑制劑接觸來離體治療。
在實施例中，在投與本文所述之CAR表現細胞(例如，T細胞)之前起始低免疫增強劑量之mTOR抑制劑(例如別位抑制劑，例如RAD001，或催化抑制劑)的投與。在實施例中，mTOR抑制劑係RAD001或雷帕黴素。在實施例中，CAR細胞係在mTOR抑制劑之足夠時間或足夠投藥後來投與，使得PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)之含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如，T細胞)之比率至少瞬時增加。
在實施例中，經改造以表現CAR之細胞(例如，免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞))係在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之足夠時間後或足夠投藥後收穫，使得個體中或自個體收穫之PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)之含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如，T細胞)的比率至少瞬時增加。
在實施例中，本文所述之任一方法進一步包含例如在投與一或多個表現本文所述之CAR分子(例如，結合CD19之CAR分子)的細胞之前對個體實施淋巴清除。淋巴清除可包含例如投與美法侖、癌得星(cytoxan)、環磷醯胺及氟達拉濱(fludarabine)中之一或多者。
在一些實施例中，所投與之CAR表現細胞包含可調控CAR(RCAR)，例如如本文所述之RCAR。RCAR可包含例如包含細胞內信號傳導結構域及第一開關結構域之細胞內信號傳導構件、包含結合CD19之抗原結合結構域及第二開關結構域之抗原結合構件；及跨膜結構域。該方法可進一步包含投與例如足以引起第一開關結構域與第二開關結構域之二聚化之量的二聚化分子。
在一些實施例中，同時或實質上同時投與CAR表現細胞及激酶抑制劑，例如作為第一線療法。在一些實施例中，該方法包含向個體投與BTK抑制劑(例如，依魯替尼)及CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)之組合作為第一線療法。
在其他實施例中，依序投與CAR表現細胞及激酶抑制劑。舉例而言，在CAR表現細胞之前投與激酶抑制劑，或在激酶抑制劑之前投與CAR表現細胞。
在一些實施例中，與CD19之表現相關之疾病係血液癌症(例如，本文所述之血液癌症，例如CLL、MCL或ALL)，且個體係或經鑑別為血液癌症之一或多種療法(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)之部分反應者、非反應者或復發者。在一些實施例中，個體具有或經鑑別具 有BTK突變。突變可為例如點突變、插入或缺失。突變可為例如BTK抑制劑之結合位點處(例如ATP結合囊袋處或其附近)之突變。突變可賦予對BTK抑制劑減小的反應(例如，抗性)。
在本文所揭示之任一方法之一些實施例中，該方法包含向個體投與BTK抑制劑(例如，依魯替尼)，減小(例如，停止投與)BTK抑制劑之量，及隨後向個體投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。
在一些實施例中，該方法包含向個體投與BTK抑制劑(例如，依魯替尼)，及隨後向個體投與BTK抑制劑及CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)之組合。
在一些實施例中，該方法包含向個體投與BTK抑制劑(例如，依魯替尼)，減小(例如，停止或中斷投與)BTK抑制劑之量，及隨後向個體投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)及第二BTK抑制劑(例如，除第一BTK抑制劑外、例如除依魯替尼外之BTK抑制劑)之組合。在一些實施例中，第二BTK抑制劑係選自依序各項中之一或多者：GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13或其組合。
在一些實施例中，與B細胞抗原(例如，CD19)之表現相關之疾病係血液癌症(例如，本文所述之血液癌症，例如CLL、MCL或ALL)，且該方法延遲或減小對投與個體之激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)、CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)或二者之抗性。 在一些實施例中，與CD19之表現相關之疾病係血液癌症(例如，本文所述之血液癌症，例如CLL、MCL或ALL)，且其中該方法延長血液癌症之緩解或延遲其復發。舉例而言，與在使用激酶抑制劑或CAR表現細胞之單一療法治療時之預期疾病進程相比，可延長緩解，可延遲復發，可延遲抗性，或可減小抗性。
可用於任一上述方法中之實例性治療方案包括以下中之一或多 者：在一個實施例中，向個體(例如，哺乳動物)投與激酶抑制劑及CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)，作為第一線療法。
在另一實施例中，在投與激酶抑制劑後，向個體(例如，哺乳動物)投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。
在其他實施例中，在停止投與激酶抑制劑後投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。
在其他實施例中，在投與CAR19表現細胞之前開始投與激酶抑制劑，且CAR19表現細胞係與激酶抑制劑之持續投與組合投與。
在一個實施例中，向個體投與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)，例如作為第一線療法。在預定時間間隔(例如，1或2個月亦及2週、3週、1個月、1.5個月、2個月、3個月、4個月、6個月、9個月、12個月、15個月或18個月)後，將CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)單獨或與激酶抑制劑組合投與個體。在一些實施例中，在預定時間間隔下、例如在使用激酶抑制劑及/或CAR表現細胞治療之前或期間評價個體對治療之反應。若評價展示個體係完全反應者，則不投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。若評價展示個體係部分反應者或患有對激酶抑制劑有反應之穩定疾病，則組合投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)與例如如本文所述之激酶抑制劑。若評價展示個體係非反應者或復發者，則組合投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)與激酶抑制劑或第二激酶抑制劑，例如如本文所述之第二激酶抑制劑。
在其他實施例中，個體(例如，哺乳動物)係或經鑑別為BTK抑制劑(例如，依魯替尼)之完全或部分反應者，或CAR19表現細胞之完全或部分反應者。
在一些實施例中，當個體係(或經鑑別為)激酶抑制劑(例如BTK 抑制劑，例如依魯替尼)之完全反應者時，在完全反應時段期間不向該個體投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。在其他實施例中，當個體係(或經鑑別為)激酶抑制劑之完全反應者(例如，依魯替尼之完全反應者)時，在完全反應時段期間向該個體投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。在實施例中，在CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)後，個體經歷延長反應或延遲復發(例如，與不使用CAR療法治療時之預期疾病進程相比)。
在一些實施例中，當個體係(或經鑑別為)激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)之部分反應者時，在部分反應時段期間不向個體投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。在其他實施例中，當個體係(或經鑑別為)激酶抑制劑之部分反應者時，在部分反應時段期間向該個體投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)(單獨或與BTK抑制劑組合)。在實施例中，在CAR療法後，個體經歷完全反應及/或延長反應或延遲復發(例如，與不使用CAR療法治療時之預期疾病進程相比)。
在一些實施例中，當個體在使用激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)治療後患有(或經鑑別患有)穩定疾病時，在穩定疾病時段期間不向該個體投與CAR療法。在其他實施例中，當個體在使用激酶抑制劑治療後患有(或經鑑別患有)穩定疾病時，在穩定疾病時段期間向該個體投與CAR療法。在實施例中，在CAR療法後，個體經歷部分反應、完全反應及/或延長反應或延遲復發(例如，與不使用CAR療法治療時之預期疾病進程相比)。
在一些實施例中，當個體在使用激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)治療後患有(或經鑑別患有)進行性疾病時，在進行性疾病時段期間不向該個體投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。在其他實施例中，當個體在使用激酶抑制劑治療後患有(或經鑑別患 有)進行性疾病時，在進行性疾病時段期間向該個體投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。在實施例中，在CAR療法後，個體經歷穩定疾病、部分反應、完全反應及/或延長反應或延遲復發(例如，與不使用CAR療法治療時之預期疾病進程相比)。
在其他實施例中，當哺乳動物係或經鑑別為依魯替尼之非反應者或復發者時，組合投與CAR表現細胞與第二激酶抑制劑，其中第二激酶抑制劑不包括依魯替尼。第二激酶抑制劑可選自以下各項中之一或多者：GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13或其組合。
在其他實施例中，個體(例如，哺乳動物)係(或經鑑別為)激酶抑制劑之部分反應者，且在部分反應時段期間向該個體投與單獨或與BTK抑制劑組合之CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。
在其他實施例中，個體(例如，哺乳動物)係(或已經鑑別為)在使用依魯替尼治療後具有進行性或穩定疾病之非反應者，且在進行性或穩定疾病時段期間向該個體投與單獨或與第二BTK抑制劑組合之CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)，其中第二激酶抑制劑不包括依魯替尼。
在另一態樣中，本文提供治療患有與B細胞抗原(例如，CD19)之表現相關之疾病的個體(例如，哺乳動物)之方法。該方法包含向個體組合(例如同時(或實質上同時)或依序)投與有效量之如本文所述之激酶抑制劑(例如，本文所述之BTK激酶抑制劑，例如依魯替尼)及CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。
在一些實施例中，組合投與激酶抑制劑及CAR表現細胞(例如，CAR19細胞)例如作為第一線療法。
在一些實施例中，初始投與激酶抑制劑，例如單一療法或第一線療法；在減小(例如，停止或中斷投與)激酶抑制劑之量後，向個體 投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。
在其他實施例中，初始投與激酶抑制劑，例如單一療法或第一線療法；及隨後向個體投與激酶抑制劑及CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)之組合。
在其他實施例中，初始投與激酶抑制劑，例如單一療法或第一線療法；在減小(例如，停止或中斷投與)激酶抑制劑之量後，向個體投與第二激酶抑制劑及CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)之組合。
在一些實施例中，在預定時間間隔下、例如在使用激酶抑制劑及/或CAR表現細胞治療之前或期間評價個體對治療之反應。若評價展示個體係完全反應者，則不投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)。若評價展示個體係部分反應者或患有對激酶抑制劑有反應之穩定疾病，則組合投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)與例如如本文所述之激酶抑制劑。若評價展示個體係非反應者或復發者，則組合投與CAR表現細胞(例如，CAR19表現細胞)與激酶抑制劑或第二激酶抑制劑，例如如本文所述之第二激酶抑制劑。
在一些實施例中，與B細胞抗原(例如，CD19)之表現相關之疾病係血液癌症、白血病、淋巴瘤、MCL、CLL、ALL、霍奇金氏淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
在一些實施例中，激酶抑制劑係BTK抑制劑，其選自依魯替尼、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13；CDK4抑制劑，其選自帕博西林、阿羅辛A、夫拉平度、2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(3S,4R)-3-羥基-1-甲基-4-六氫吡啶基]-4-
Figure 104111176-A0202-12-0027-41
烯酮；克唑替尼(PF-02341066)、P276-00、RAF265、因地蘇蘭、羅可韋汀、地那西布、BMS387032、MLN8054、AG-024322、AT7519、AZD5438、BMS908662；或瑞博司 可裡布；mTOR抑制劑，其選自雷帕黴素、雷帕黴素類似物，例如依維莫司、替西羅莫司、瑞達福羅莫司、塞馬莫德、AZD8055、PF04691502、SF1126、XL765或OSI-027；或MNK抑制劑，其選自：CGP052088、CGP57380、尾孢醯胺或ETC-1780445-2或4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在一些態樣中，本發明之特徵在於治療患有霍奇金氏淋巴瘤之個體(例如，哺乳動物)或在該個體中提供抗腫瘤免疫性的方法。該方法包含向個體投與單獨或與第二療法組合之有效量之表現結合CD19之CAR分子的細胞。
在另一態樣中，本發明之特徵在於治療患有多發性骨髓瘤(例如，CD19陽性多發性骨髓瘤或CD19陰性骨髓瘤)之個體(例如，哺乳動物)或向該個體提供抗腫瘤免疫性之方法。在一個實施例中，多發性骨髓瘤為CD19陰性，例如絕大多數(99.95%)贅瘤性漿細胞具有CD19陰性表型，例如如藉由流式細胞術及RT-PCR二者所檢測。該方法包含向個體投與單獨或與第二療法(例如，多發性骨髓瘤之標準護理療法)組合之有效量之表現結合CD19之CAR分子的細胞。該方法可進一步包含投與如本文所述之激酶抑制劑。
在與霍奇金氏淋巴瘤或多發性骨髓瘤相關之方法之實施例中，CAR分子係人類化CAR分子，例如如本文所述。在實施例中，CAR分子係如本文所述之CAR分子。例如，在實施例中，CAR分子包含抗-CD19結合結構域，其包含以下各項中之一或多者(例如，2者、3者、4者、5者或所有)：SEQ ID NO：5之LC CDR1、SEQ ID NO：26之LC CDR2及SEQ ID NO：27之LC CDR3；SEQ ID NO：19之HC CDR1、SEQ ID NO：20-23中任一者之LC CDR2及SEQ ID NO：24之HC CDR3。
在與霍奇金氏淋巴瘤或多發性骨髓瘤相關之方法之一些實施例 中，CAR分子(例如，CART19或CTL019)係作為單一療法來投與。在一些實施例中，該方法進一步包含投與激酶抑制劑，例如BTK抑制劑(例如依魯替尼)、CDK4抑制劑、mTOR抑制劑或MNK抑制劑。
在與多發性骨髓瘤相關之方法之一些實施例中，CAR分子(例如，CART19或CTL019)係與多發性骨髓瘤之標準護理療法(例如，與骨髓清除性化學療法及/或自體幹細胞移植營救(例如，在美法侖投與(例如，高劑量美法侖)後))組合投與。
在另一態樣中，本發明之特徵在於包含表現結合B細胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者)之CAR分子之細胞及一或多種激酶抑制劑的組合物，其中激酶抑制劑係選自布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑、細胞週期蛋白依賴性激酶4(CDK4)抑制劑、mTOR抑制劑或促分裂原活化蛋白激酶相互作用激酶(MNK)抑制劑。CAR表現細胞及一或多種激酶抑制劑可以單一劑型或以兩種或更多種劑型存在。
在實施例中，本文所揭示之組合物用作藥劑。
在實施例中，本文所揭示之組合物用於治療與B細胞抗原(例如，CD19)之表現相關之疾病。
用於產生CAR表現細胞之方法及組合物
在某些態樣中，本發明亦提供製備可經改造以表現CAR(例如，本文所述之CAR)之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)群的方法，該方法包含：提供免疫效應細胞群；及在足以抑制激酶抑制劑之靶(例如，BTK及/或ITK)的條件下使免疫效應細胞與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)接觸。該方法可進一步包含使免疫效應細胞與編碼CAR分子之核酸接觸(例如轉導)。
在一些態樣中，本發明提供製備CAR表現細胞(例如，表現CAR之免疫效應細胞或細胞群)之方法，其包含：使細胞或細胞群與激酶 抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)接觸；及在使CAR分子表現之條件下將編碼CAR分子之核酸引入(例如，轉導)細胞或細胞群中。
在產生CAR表現細胞之方法之某些實施例中，由核酸編碼之CAR分子係結合CD19之CAR分子。在實施例中，該方法進一步包含在容許細胞或至少細胞亞群表現CAR分子之條件下培養細胞。在實施例中，細胞係T細胞或NK細胞，或細胞群包括T細胞、NK細胞或二者。 在實施例中，該方法包含使細胞與激酶抑制劑接觸(例如，持續10-20分鐘、20-30分鐘、30-40分鐘、40-60分鐘或60-120分鐘)及隨後自細胞移除大部分或所有激酶抑制劑。在實施例中，激酶抑制劑係在收穫細胞之後或刺激細胞之前添加。在實施例中，激酶抑制劑係BTK抑制劑、CDK4抑制劑、mTOR抑制劑或MNK抑制劑。在實施例中，激酶抑制劑係依魯替尼。在實施例中，細胞群亦包含癌細胞，例如白血病或淋巴瘤細胞。癌細胞可係例如CLL、MCL或ALL細胞。在實施例中，激酶抑制劑抑制癌細胞中之靶(例如，BTK)，例如使其活性降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。在實施例中，激酶抑制劑抑制免疫效應細胞中之靶(例如，ITK)，例如使其活性降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。
在一些態樣中，本發明亦提供包含激酶抑制劑(例如，BTK抑制劑)及CAR分子或編碼CAR分子之核酸的反應混合物。在一些實施例中，反應混合物進一步包含免疫效應細胞群。
在一些實施例中，一或多種免疫效應細胞表現CAR分子或包含編碼CAR分子之核酸。在一些實施例中，激酶抑制劑係選自BTK抑制劑、CDK4抑制劑、mTOR抑制劑或MNK抑制劑。在一些實施例中，BTK抑制劑係選自：依魯替尼、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13。在實 施例中，反應混合物包含癌細胞，例如血液學癌細胞。在自個體收穫免疫效應細胞時，癌細胞可係例如自個體收穫之細胞。
在某些態樣中，本發明亦提供包含免疫效應細胞群及CAR分子或編碼CAR分子之核酸的反應混合物，其中免疫效應細胞包含共價失活之ITK。在實施例中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%之ITK為共價失活的。在一些實施例中，反應混合物進一步包含癌細胞。在實施例中，癌細胞包含共價失活之BTK。在實施例中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%之BTK為共價失活的。在實施例中，BTK或ITK在其ATP結合結構域處或其附近與小分子(例如依魯替尼)形成共價鍵。在實施例中，BTK在其半胱胺酸-481處或其附近與小分子(例如依魯替尼)形成共價鍵。
在實施例中，如本文所述之反應混合物進一步包含緩衝液或其他試劑，例如含有PBS之溶液。在實施例中，反應混合物進一步包含活化及/或擴增該群之細胞之藥劑，例如刺激CD3/TCR複合物相關信號之藥劑及/或刺激細胞表面上之共刺激分子之配體。在實施例中，藥劑係與抗-CD3抗體或其片段及/或抗-CD28抗體或其片段偶聯之珠粒。在實施例中，反應混合物進一步包含一或多種用於增殖及/或活力之要素，包括血清(例如，胎牛或人類血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α或用於細胞生長之任何其他添加劑。在實施例中，反應混合物進一步包含IL-15及/或IL-7。在實施例中，反應混合物中之群中之複數個細胞包含包括CAR編碼序列(例如，CD19 CAR編碼序列，例如如本文所述)之核酸分子，例如本文所述之核酸分子。在實施例中，反應混合物中之群中之複數個細胞包含包括編碼CAR(例如，本文所述之CAR，例如本文所述之CD19 CAR)之核酸序列之載體。在實施例 中，載體係本文所述之載體，例如選自由以下組成之群之載體：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。在實施例中，反應混合物進一步包含低溫保護劑或穩定劑，例如糖、寡糖、多糖及多元醇(例如，海藻糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖及聚葡萄糖)、鹽及冠醚。在一個實施例中，低溫保護劑係葡聚糖。
在一些實施例中，本文所揭示之製備方法進一步包含使免疫效應細胞群與編碼端粒酶亞單位(例如，hTERT)之核酸接觸。編碼端粒酶亞單位之核酸可為DNA。
在一些實施例中，本文所揭示之製備方法進一步包含在包含2% hAB血清之血清中培養免疫效應細胞群。
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本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻之全部內容皆以引用方式併入本文中。
根據本描述及圖式以及申請專利範圍，本發明之其他特徵、目標及優點將變得顯而易見。
圖1A、1B及1C係如在經小鼠抗-CD19 CAR或本發明之人類化抗-CD19 CAR轉導且與不表現CD19之對照K562細胞(K562cc)(如圖1A中所展示)、經CD19轉化之K562細胞(K562.CD19(如圖1B中所展示)或自CLL患者分離之惡性B細胞(Pt 14 B細胞分離物)(如圖1C中所展示)一起培養的ND317(正常供體)T細胞中分析之細胞毒性的圖示。
圖2A及2B係展示人類化及小鼠抗-CD19 CAR表現細胞對CD19+細胞之增殖性反應之圖，其中活CAR+ T細胞之較高量與展示針對原 代CLL細胞之最大CD4+及CD8+ T細胞增殖之群相關聯。
圖3係本發明scFv之解捲積HPLC質譜之圖示，其中頂列繪示未經處理之scFv，且底列繪示同源去糖基化scFv。
圖4係如藉由差示掃描螢光測定所量測之構象穩定性之圖示。小鼠scFv之Tm為57℃(粗線)。與親代小鼠scFv相比，所有人類化scFv變體展示約70℃之較高Tm。藉由人類化引入之殘基已使Tm改良10℃以上。
圖5係CD19 CAR轉導之T細胞增殖之圖示，其中CART19細胞針對(a)對CD19之表現呈陰性、且因此用作陰性對照之慢性骨髓性白血病(「CML」)細胞系；(b)對CD19之表現呈陽性、且因此用作陽性對照之重組K562細胞；或(c)自CLL患者分離且表現細胞表面上之CD19之Pt14 B細胞。
圖6A及6B係代表性CAR之示意圖。
圖7繪示使用CD19轉導之CAR T細胞治療後之NSG小鼠中之HALLX5447原發性ALL疾病進展。使用特異性針對CD19之CAR T細胞治療後之NSG小鼠中之原代人類ALL細胞的生長展示對疾病進展之控制。CD19+人類ALL細胞之平均百分比指示至腫瘤植入後第65天之NSG小鼠中末梢血中之疾病負荷。黑色圓形：經100μl PBS經由尾靜脈治療之小鼠；紅色方形：經模擬物轉導之T細胞治療之小鼠；藍色三角形：經鼠類CD19 CAR轉導之T細胞治療之小鼠；及紫色倒三角形：經人類化CD19 CAR轉導之T細胞治療之小鼠。藉由ANOVA計算顯著性；*表示P<0.01。
圖8繪示CD19在患者腫瘤細胞中之表現。針對CD19(x軸)及CD38(y軸)對CD138+ CD45暗腫瘤細胞染色。約1%-2%之腫瘤細胞表現CD19抗原。
圖9A及9B係展示在使用遞增濃度之依魯替尼(10nM、100nM及 1000nM)治療時CART19細胞之細胞增殖及細胞大小的兩個圖。
圖10A及10B展示在依魯替尼存在或不存在的同時經MCL細胞系刺激之CART19細胞之增殖。圖10A係一系列展示在遞增濃度之依魯替尼(10nM、100nM及1000nM)存在或不存在下，經腫瘤細胞系MOLM14、JEKO-1及RL刺激之CART19細胞之增殖的直方圖。藉由CFSE對細胞染色且藉由流式細胞術分析以確定增殖細胞之百分比，由每一直方圖中之條表示。圖10B係圖10A中之代表性直方圖之量化。
圖11A及11B展示在依魯替尼存在或不存在下，經MCL細胞系刺激之CART19細胞的CD107a脫粒。圖11A係一系列展示在遞增濃度之依魯替尼(10nM、100nM及1000nM)存在或不存在下，經腫瘤細胞系(MOLM14、JEKO-1及RL)刺激之CART19細胞之CD107a脫粒的流式細胞術圖譜。CD107a表現於y軸中量測。圖11B係圖11A結果之量化。
圖12係一系列展示在遞增濃度之依魯替尼(10nM、100nM及1000nM)存在或不存在下，藉助經腫瘤細胞系(MOLM14、JEKO-1及RL)刺激之CART19細胞之細胞質內IL-2產生的流式細胞術圖譜。y軸代表IL-2表現。
圖13係一系列展示在遞增濃度之依魯替尼(10nM、100nM及1000nM)存在或不存在下，藉助經腫瘤細胞系(MOLM14、JEKO-1及RL)刺激之CART19細胞之細胞質內TNF-a產生的流式細胞術圖譜。y軸代表TNF-a表現。
圖14係一系列展示在遞增濃度之依魯替尼(10nM、100nM及1000nM)存在或不存在下，藉助經腫瘤細胞系(MOLM14、JEKO-1及RL)刺激之CART19細胞細胞質內IFN-g產生的流式細胞術圖譜。y軸代表IFN-g表現。
圖15-1至15-10係一系列展示在遞增濃度之依魯替尼(10nM、100 nM及1000nM)存在或不存在下，經腫瘤細胞系(MOLM14、JEKO-1及RL)刺激之CART19細胞之細胞介素分泌的圖。
圖16A、16B、16C、16D、16E及16F係展示腫瘤細胞MOLM14(圖16A及16D)、JEKO(圖16B及16E)及RL(圖16C及16F)單獨或在遞增濃度之依魯替尼存在下之CART19殺死的圖。將未經轉導(UTD)或CART19細胞與腫瘤細胞以不同比率一起培育，且評價細胞之總通量(圖16A、16B及16C)及死細胞之百分比(16D、16E及16F)。
圖17A、17B及17C係在24小時後如藉由流式細胞術所量測之腫瘤細胞之CART19殺死以對總細胞數進行計數的圖示。將腫瘤細胞系MOLM14(圖17A)、JEKO(圖17B)及RL(圖17C)與未經轉導(UTD)或CART19細胞單獨(單獨)或與不同濃度之依魯替尼組合培育。
圖18A、18B、18C及18D係RL MCL小鼠模型中之CART19劑量發現之圖示。藉由生物發光成像(BLI)隨時間監測腫瘤負荷(圖18A及18B)。隨時間監測總存活期(圖18C)。
圖19A及19B係JEKO-1 MCL小鼠模型中之CART19劑量發現之圖示。藉由生物發光成像隨時間監測腫瘤大小(BLI)(圖19A)，且亦隨時間監測總存活期(圖19B)。
圖20係在活體內小鼠模型中展示投與方案且評價CART19及依魯替尼組合療法之示意圖。
圖21A、21B、21C及21D係展示在轉導之前使用依魯替尼治療細胞時，用於產生CART19 T細胞之PBMC之轉導效率的圖示。分析轉導前(圖21A)及轉導後(圖21C)未經治療之PBMC之CAR19表現。分析轉導前(圖21B)及轉導後(圖21D)經依魯替尼治療之PBMC之CAR19表現。
圖22A、22B、22C、22D及22E係依魯替尼治療對CD3/CD28刺激之T細胞增殖之效應的圖示。評價遞增濃度之依魯替尼：未經治療(圖 22A)；0.1μM依魯替尼(圖22B)；0.5μM依魯替尼(圖22C)，1μM依魯替尼(圖22D)及5μM依魯替尼(圖22E)。
圖23係展示依魯替尼並不影響CART19細胞毒性之圖示。
圖24係一系列展示依魯替尼治療不會促進CART19細胞中之TH1/TH2細胞介素偏移之圖示。
圖25A及25B係展示連續投與依魯替尼並不影響CART19在活體內清除腫瘤細胞方面之功能的圖示。圖25A展示在每一治療方案期間在末梢血中檢測之Nalm/6細胞。圖25B展示比較具或不具依魯替尼投藥之接受CART19之小鼠的存活率之卡本-麥爾(Kaplan-Meier)存活率曲線。
圖26A、26B、26C、26D、26E及26F係展示在依魯替尼治療期間在所指示時間點下CLL患者細胞中之CAR19轉導效率的圖示。細胞未經CAR19轉導(圖26A、26B及26C)或經CAR19轉導(圖26D、26E及26F)。經GAM染色之細胞表現CAR19且存在於每一圖譜中之框中。
圖27-1至27-3係一系列繪示在依魯替尼治療期間在所指示時間點下來自患者組之未經轉導細胞與經CAR19轉導之細胞相比之增殖速率的圖示。
圖28A、28B及28C係展示CLL患者中之依魯替尼治療引起淋巴球增多症之圖示。在所指示時間點下分離患者之細胞：基線(圖28A)；第2週期第1天(圖28B)；及第12週期第1天(圖28C)。
圖29A、29B及29C係展示三個CLL患者中之依魯替尼治療隨時間降低CLL腫瘤細胞上之CD200表現之圖示。每一圖譜皆含有在所指示時間點下分離之細胞的CD200表現直方圖之疊加：基線(篩選)；第2週期第1天；及第12週期第1天。
圖30A、30B及30C係展示CLL患者中之依魯替尼治療隨時間減小PD1+ T細胞之頻率之圖示。在所指示時間點下分離患者之細胞：基 線(圖30A)；第2週期第1天(圖30B)；及第12週期第1天(圖30C)。
圖31A及31B係展示MCL細胞系RL(圖31A)及JEKO-1(圖31B)對依魯替尼治療之敏感性之圖示。
圖32係展示依魯替尼治療在活體內MCL模型中之效應之圖示。
圖33A及B係展示存在於腫瘤中之CD19表現細胞之霍奇金氏淋巴瘤之免疫組織化學分析的影像。圖33A處在1×放大倍數且圖33B處在20×放大倍數。
圖34係針對評價CART19治療在霍奇金氏淋巴瘤患者中之治療效能之研究的實驗設置之示意圖。
圖35A、35B、35C及35D展示T細胞上之PD1及CAR19表現之流式細胞術分析。圖35A及35B係展示為CART療法之完全反應者(CR)或非反應者(NR)的個體之CD4+ T細胞上之PD-1及CAR19表現之分佈的代表性流式細胞術圖譜。圖35C係展示對CART療法具有不同反應之個體組之CD4+ T細胞群中之PD1細胞%的圖。圖35D係展示對CART療法具有不同反應之個體組之CD8+ T細胞群中之PD1細胞%的圖。
圖36A及36B展示對CART療法具有不同反應之個體組之CD4及CAR19表現細胞(圖36A)或CD8及CAR19表現細胞(圖36B)中之PD1表現之分佈。
圖37展示為CART療法之完全反應者(CR)或非反應者(NR)之個體的T細胞上之PD1、CAR19、LAG3及TIM3表現之流式細胞術分析。
圖38A及38B展示對CART療法具有不同反應之個體組的PD1及LAG3表現(圖38A)或PD1及TIM3表現(圖38B)之分佈。
圖39展示接受CART19之骨髓瘤患者之漿細胞IgA免疫表型分型，此展示對CART19療法之反應。
圖40A及40B係展示與安慰劑相比針對流行性感冒疫苗株之效價增加之圖。在圖40A中，展示治療意向群中之每一RAD001投藥隊列 之在疫苗接種後4週時，針對3個流行性感冒疫苗株(H1N1 A/California/07/2009、H3N2 A/Victoria/210/2009、B/Brisbane/60/2008)中之每一者之流行性感冒病毒幾何平均效價在基線上方之增加相對於安慰劑隊列之增加。黑色粗線指示效價相對於安慰劑增加1.2倍，此為2/3之流行性感冒疫苗株滿足研究之主要終點所需滿足之條件。星號「*」指示GMT效價相對於安慰劑之增加超過1且事後機率為至少80%。圖40B係與圖40A中針對基線流行性感冒病毒效價<=1：40之個體之亞組的數據相同之圖。
圖41展示在疫苗接種後4週時RAD001濃度對每一流行性感冒疫苗株之幾何平均效價之增加倍數的散佈圖。在已向個體投藥達4週後量測RAD001濃度(投藥後1小時)。已經藥物動力學量測之所有個體包括於分析集合中。在疫苗接種後4週時幾何平均效價相對於基線之增加倍數展示於y軸上。
圖42係展示針對異源流行性感冒病毒株之效價與安慰劑相比之增加的圖示。展示治療意向群中之每一RAD001投藥隊列之在疫苗接種後4週時，針對2個不含於流行性感冒疫苗中之異源流行性感冒病毒株(A/H1N1株A/New Jersey/8/76及A/H3N2株A/Victoria/361/11)之流行性感冒病毒幾何平均效價在基線上方之增加相對於安慰劑隊列之增加。*指示效價相對於安慰劑之增加超過1且事後機率為至少80%。
圖43A及43B係流行性感冒疫苗接種之前及之後IgG及IgM含量之圖示。量測在流行性感冒疫苗接種之前及疫苗接種後4週時自個體獲得之血清中抗A/H1N1/California/07/2009流行性感冒病毒IgG及IgM之含量。在RAD001與安慰劑隊列之間檢測到抗H1N1流行性感冒病毒IgG及IgM含量自基線至疫苗接種後4週時之變化無顯著差異(藉助Kruskal-Wallis等級總和測試之所有p值>0.05)。
圖44A、44B及44C係在RAD001治療後PD-1陽性CD4及CD8之減 小百分數以及PD-1陰性CD4 T細胞增加的圖示。在基線處、在6週研究藥物治療後(第6週)及研究藥物中斷後6週以及流行性感冒疫苗接種後4週(第12週)時，藉由PBMC樣品之FACS分析測定PD-1陽性CD4、CD8及PD-1陰性CD4 T細胞之百分數。圖44A展示在第12週時在接受劑量值0.5mg/天(n=25)、5mg/週(n=29)及20mg/週(n=30)之RAD001之隊列中與安慰劑隊列(n=25)相比，PD-1陽性CD4 T細胞顯著減少(-37.1%- -28.5%)，且分別具有p=0.002(0.02)、p=0.003(q=0.03)及p=0.01(q=0.05)。圖44B展示在第12週時在接受劑量值0.5mg/天(n=25)、5mg/週(n=29)及20mg/週(n=30)之RAD001(n=109)之隊列中與安慰劑隊列(n=25)相比，PD-1陽性CD8 T細胞顯著減少(-43.3%- -38.5%)，且分別具有p=0.01(0.05)、p=0.007(q=0.04)及p=0.01(q=0.05)。圖44C展示在第12週時在接受劑量值0.5mg/天(n=25)、5mg/週(n=29)及20mg/週(n=30)之RAD001(n=109)之隊列中與安慰劑隊列(n=25)相比，PD-1陰性CD4 T細胞顯著增加(3.0%-4.9%)，且分別具有p=0.0007(0.02)、p=0.03(q=0.07)及p=0.03(q=0.08)。
圖45A及45B係在RAD001治療後針對基線PD-1表現之差異調節之PD-1陽性CD4及CD8之減小百分數及PD-1陰性CD4 T細胞增加的圖示。在基線處、在6週研究藥物治療後(第6週)及研究藥物中斷後6週以及流行性感冒疫苗接種後4週(第12週)時，藉由PBMC樣品之FACS分析測定PD-1陽性CD4、CD8及PD-1陰性CD4 T細胞之百分數。圖45A展示在第6週時在所彙集RAD隊列(n=84)中與安慰劑隊列(n=25)相比，PD-1+CD4 T細胞顯著減少30.2%，且p=0.03(q=0.13)。在第12週時在所彙集RAD中與安慰劑隊列相比，PD-1陽性CD4 T細胞減少32.7%，且p=0.05(q=0.19)。圖45B展示在第6週時在所彙集RAD001隊列(n=84)中與安慰劑隊列(n=25)相比，PD-1陽性CD8 T細胞顯著減少37.4%，且p=0.008(q=0.07)。在第12週時在所彙集RAD001中與安慰 劑隊列相比，PD-1陽性CD8 T細胞減少41.4%，且p=0.066(q=0.21)。圖45A及45B代表圖44A、44B及44C中之數據，但在圖45A及45B中圖44A、44B及44C之不同RAD001劑量組彙集於單一RAD001治療組中。
圖46繪示對RAD001有反應之老年個體之運動及活力的增加。
圖47A及47B繪示RAD001對細胞中之P70 S6K活性之預測效應。圖47A繪示使用較高劑量之每週及每天RAD001之P70 S6激酶抑制；圖47B繪示使用較低劑量之每週RAD001之P70 S6激酶抑制。
圖48A及48B展示癌細胞系及CART細胞上之IL-7受體(CD127)表現。藉由三種癌細胞系中之流式細胞術分析來量測CD127之表現：RL(外套細胞淋巴瘤)、JEKO(亦稱為Jeko-1、外套細胞淋巴瘤)及Nalm-6(B-ALL)(圖48A)。藉由已輸注且在NSG小鼠中循環之CD3陽性(CART)細胞上之流式細胞術分析來量測CD127表現(圖48B)。
圖49A、49B及49C展示在CART19治療及後續IL-7治療後之抗腫瘤反應。在第6天時，使用不同劑量之CART19細胞治療在第0天時植入表現螢光素酶之外套淋巴瘤細胞系(RL-luc)之NSG小鼠，且監測腫瘤負荷。將小鼠分成4組且使其不接受CART19細胞、接受0.5×106個CART19細胞(CART19 0.5E6)、1×106個CART19細胞(CART19 1E6)或2×106個CART19細胞(CART19 2E6)。藉由檢測生物發光(平均BLI)量測CART治療後之腫瘤負荷(圖49A)。使接受0.5×106個CART19細胞(CART19 0.5E6)或1×106個CART19細胞(CART19 1E6)之小鼠隨機化以接受重組人類IL-7(rhIL-7)或不接受。監測在第85天時開始用IL-7治療之圖49A之三隻小鼠(編號3827、編號3829及編號3815，接受所指示之初始CART19劑量)的腫瘤負荷，在此處由平均生物發光(BLI)表示(圖49B)。IL-7係經由每週IP注射3次來投與。比較未接受IL-7之小鼠(對照)及接受IL-7治療之小鼠(IL-7)之間在第85天之前(前)及在第115天之後(後)的腫瘤負荷，在此處由平均生物發光(BLI)表示(圖49C)。
圖50A及50B展示IL-7治療後之T細胞動力學。監測接受IL-7之小鼠或對照小鼠中之每一者之在血液中檢測到的人類T細胞之含量(圖50A)。在起始IL-7治療之前(前)及起始IL-7治療後14天(第14天)時量測在血液中檢測到的CART19細胞(CD3+細胞)之含量(圖50B)。
圖51繪示兩種實例性RCAR構形之結構。抗原結合構件包含抗原結合結構域、跨膜結構域及開關結構域。細胞內結合構件包含開關結構域、共刺激信號傳導結構域及初級信號傳導結構域。兩種構形展示本文所述之第一及第二開關結構域可相對於抗原結合構件及細胞內結合構件呈不同定向。其他RCAR構形進一步闡述於本文中。
圖52A係RL細胞系之影像。
圖52B係流式細胞術散佈圖之集合，其展示CD19及CD5在RL原代及RL細胞系中之表現。
圖52C係展示藉由螢光原位雜交(FISH)之t(11；14)轉座之影像。
圖52D係展示不同細胞系中之依魯替尼抑制之IC50(以MTT轉換百分比表示)的圖。
圖52E係展示NOD-SCID-γ鏈基因敲除(NSG)小鼠中之RL細胞植入及所得腫瘤負荷的影像及圖之集合。
圖52F係展示在小鼠中MCL細胞針對不同器官之定位的組織學影像之集合。
圖52G係已注射有MCL-RL細胞之小鼠之組織學影像之集合。
圖53A係展示在暴露於多種MCL細胞系時CD107a+CART19細胞之數量的圖之集合。
圖53B係展示在暴露於多種MCL細胞系時由CART19細胞產生之IL-2及TNF-α之量的圖之集合。
圖53C係展示在不同效應物：靶細胞比率下CART19細胞對多種MCL細胞系之殺死%之圖。
圖53D係展示在暴露於多種MCL細胞系之CART19細胞中羧基螢光黃琥珀醯亞胺基酯(CFSE)之量(其為增殖之量度)的圖。
圖53E係展示擴增之前及之後T細胞之百分比的圖之集合。
圖53F係展示表現或產生多種生物分子(例如，細胞介素)之未經轉導或經CAR-19轉導之T細胞之百分比的圖之集合。
圖54A係展示當特異性或非特異性刺激CART19細胞時介白素-2誘導型T細胞激酶(ITK)之活化的影像之集合。
圖54B係展示在不同濃度之依魯替尼下藉由CART19細胞之CD107a表面表現(脫粒之量度)、IL-2產生及TNF-α產生的圖之集合。
圖54C係展示在不同濃度之依魯替尼且暴露於多種MCL細胞系下CART19細胞中之CFSE量的直方圖之集合。
圖54D係展示當與不同濃度之依魯替尼組合時作為CART19細胞之Th1或Th2狀態之指標的多種細胞介素及生物標記物之表現或產生之圖之集合。
圖54E係展示當與不同濃度之依魯替尼組合時CART19細胞對多種MCL細胞系之殺死百分比的圖之集合。
圖54F係展示當與不同濃度之依魯替尼組合時CART19細胞之多種固有細胞毒性功能標記物之表現的條形圖。
圖55係測試CART19及/或依魯替尼對注射MCL-RL之小鼠之效應之活體內小鼠模型實驗設置的示意圖，其中讀出為發光(腫瘤細胞數之量度)。
圖56係測試CART19及/或依魯替尼對注射MCL-RL之小鼠之效應之活體內小鼠模型實驗設置的示意圖，其中讀出為發光(腫瘤細胞數之量度)。
圖57係展示經不同濃度之依魯替尼治療之小鼠中之發光(量測腫瘤細胞數之量度)及其治療後總存活期的圖之集合。
圖58係展示經依魯替尼或CART19細胞治療之小鼠中之發光(腫瘤細胞數之量度)以及其治療後總存活期的圖之集合。
圖59係展示在經依魯替尼、未經轉導之T細胞、依魯替尼與未經轉導之T細胞、CART19細胞及CART19細胞與依魯替尼治療後之小鼠中之發光(腫瘤細胞數之量度)的圖。
圖60係展示在經依魯替尼單獨、CART19細胞單獨或依魯替尼與CART19細胞之組合治療後之小鼠中之發光(腫瘤細胞數之量度)的圖。
圖61A係展示在經依魯替尼及/或CART19細胞治療之小鼠中產生之Th1細胞介素之含量的圖之集合。圖61B係展示在經依魯替尼及/或CART19細胞治療之小鼠中產生之Th2細胞介素之含量的圖之集合。
圖61C係展示在經CART19細胞或CART19細胞加依魯替尼治療之小鼠中表現增殖標記物Ki67之細胞之百分比的圖。
圖61D係展示在經CART19細胞或CART19細胞加依魯替尼治療之小鼠中表現抗細胞凋亡標記物BCL-2之細胞之百分比的圖。
定義
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習此項技術者通常所理解的含義相同之含義。
術語「一」(「a」及「an」)係指一個或一個以上(例如指至少一個)的該冠詞之文法受詞.舉例而言，「一個元件」意指一個元件或一個以上元件。
術語「約」在提及諸如量、時間長度及諸如此類等可量測值時意欲涵蓋自指定值±20%、或在一些情況下為±10%、或在一些情況下為±5%、或在一些情況下為±1%、或在一些情況下為±0.1%的變化，只要該等變化適於實施所揭示之方法即可。
術語「嵌合抗原受體」或另一選擇為「CAR」係指多肽之集合，在最簡單實施例中通常為兩種多肽之集合，其在免疫效應細胞中時向該細胞提供針對靶細胞(通常為癌細胞)之特異性及細胞內信號產生。在一些實施例中，CAR包含至少細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及包括源自如下文所定義之刺激分子及/或共刺激分子之功能性信號傳導結構域之細胞質信號傳導結構域(在本文中亦稱為「細胞內信號傳導結構域」)。在一些態樣中，多肽之集合彼此鄰接，例如在同一多肽鏈中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些實施例中，多肽之集合並不彼此鄰接，例如在不同多肽鏈中。在一些實施例中，多肽之集合包括二聚化開關，其在二聚化分子存在時可使多肽彼此偶合，例如可使抗原結合結構域偶合至細胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，刺激分子係與T細胞受體複合物締合之ζ鏈。在一個態樣中，細胞質信號傳導結構域進一步包含一或多個源自至少一個如下文所定義之共刺激分子之功能性信號傳導結構域。在一個態樣中，共刺激分子選自本文所述之共刺激分子，例如4-1BB(即，CD137)、CD27及/或CD28。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及包括源自刺激分子之功能性信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及包括源自共刺激分子之功能性信號傳導結構域及源自刺激分子之功能性信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及包括兩個源自一或多個共刺激分子之功能性信號傳導結構域及源自刺激分子之功能性信號傳導結構域的細胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及包括至少兩個源自一或多個共刺激分子之功能性信號傳導結構域及源自刺激分子之功能性信號 傳導結構域的細胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR包含處於CAR融合蛋白之胺基末端(N-ter)之可選前導序列。在一個態樣中，CAR進一步包含處於細胞外抗原結合結構域之N末端之前導序列，其中前導序列在細胞處理及CAR針對細胞膜定位期間視情況自抗原結合結構域(例如，scFv)裂解。
術語「信號傳導結構域」係指蛋白質之藉由在細胞內傳送資訊經由所定義信號傳導途徑藉由產生第二信使或藉由因應該等信使發揮效應物作用來起調控細胞活性作用的功能部分。
如本文所用術語「CD19」係指分化簇19蛋白，其係可在白血病前體細胞上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD19之胺基酸序列可參見UniProt/Swiss-Prot登錄號P15391，且人類CD19之核苷酸序列編碼可參見登錄號NM_001178098。如本文所用之「CD19」包括包含全長野生型CD19之突變(例如，點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。CD19在大部分B譜系癌症上表現，包括例如急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球白血病及非霍奇金氏淋巴瘤。表現CD19之其他細胞提供於下文「與CD19之表現相關之疾病」之定義中。其亦係B細胞祖細胞之早期標記物。例如，參見Nicholson等人，Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)。在一個態樣中，CART之抗原結合部分識別並結合CD19蛋白之細胞外結構域內之抗原。在一個態樣中，CD19蛋白在癌細胞上表現。
如本文所用術語「CD20」係指已知可在B細胞上檢測到之抗原決定子。人類CD20亦稱為跨膜4結構域子家族A成員1(MS4A1)。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD20之胺基酸序列可參見登錄號NP_690605.1及NP_068769.2，且編碼人類CD20之轉錄本變體1及3之 核苷酸序列可分別參見登錄號NM_152866.2及NM_021950.3。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD20蛋白之細胞外結構域內之抗原。在一個態樣中，CD20蛋白在癌細胞上表現。
如本文所用術語「CD22」係指已知可在白血病前體細胞上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD22之同種型1-5之胺基酸序列可分別參見登錄號NP 001762.2、NP 001172028.1、NP 001172029.1、NP 001172030.1及NP 001265346.1，且編碼人類CD22之變體1-5之核苷酸序列可分別參見登錄號NM 001771.3、NM 001185099.1、NM 001185100.1、NM 001185101.1及NM 001278417.1。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD22蛋白之細胞外結構域內之抗原。在一個態樣中，CD22蛋白在癌細胞上表現。
如本文所用術語「ROR1」係指已知可在白血病前體細胞上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類ROR1之同種型1及2前體之胺基酸序列可分別參見登錄號NP_005003.2及NP_001077061.1，且編碼其之mRNA序列可分別參見登錄號NM_005012.3及NM_001083592.1。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合ROR1蛋白之細胞外結構域內之抗原。在一個態樣中，ROR1蛋白在癌細胞上表現。
如本文所用之術語「抗體」係指源自與抗原特異性結合之免疫球蛋白分子之蛋白質或多肽序列。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈或完整免疫球蛋白，且可源自天然來源或重組來源。抗體可係免疫球蛋白分子之四聚體。
術語「抗體片段」係指抗體之保留與(例如，藉由結合、位阻、 穩定/去穩定、空間分佈)抗原之表位特異性相互作用能力之至少一個部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗體片段、二硫鍵連接之Fv(sdFv)、由VH及CH1結構域組成之Fd片段、直鏈抗體、單一結構域抗體(例如sdAb(VL或VH))、駱駝科動物VHH結構域、自抗體片段(例如包含在鉸鏈區由二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段)形成之多特異性抗體及經分離CDR或抗體之其他表位結合片段。亦可將抗原結合片段納入單一結構域抗體、馬克西抗體(maxibodies)、微小抗體、奈米抗體、胞內抗體、二價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR及雙-scFv中(例如，參見Hollinger及Hudson，Nature Biotechnology 23：1126-1136,2005)。亦可基於多肽(例如III型纖連蛋白(Fn3))將抗原結合片段移植至支架中(參見美國專利第6,703,199號，其闡述纖連蛋白多肽微小抗體)。
術語「scFv」係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段的融合蛋白，其中輕鏈及重鏈可變區例如經由合成連接體(例如，短撓性多肽連接體)以鄰接方式連接，且能夠表現為單鏈多肽，且其中scFv保留衍生出其之完整抗體之特異性。除非說明，否則如本文所用之scFv可具有例如關於多肽之N末端及C末端呈任一順序之VL及VH可變區，scFv可包含VL-連接體-VH或可包含VH-連接體-VL。
包含抗體或其抗體片段之本發明CAR部分可以眾多種形式存在，其中抗原結合結構域表現為鄰接多肽鏈之一部分，包括例如單一結構域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)、人類化抗體或雙特異性抗體(Harlow等人，1999，Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人，1989，Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988, Science 242：423-426)。在一個態樣中，本發明CAR組合物之抗原結合結構域包含抗體片段。在另一態樣中，CAR包含包括scFv之抗體片段。給定CDR之精確胺基酸序列邊界可利用多種熟知方案中之任一者來確定，該等方案包括Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(「Chothia」編號方案)或其組合所述之彼等。
如本文所用術語「結合結構域」或「抗體分子」係指包含至少一個免疫球蛋白可變結構域序列之蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段。術語「結合結構域」或「抗體分子」涵蓋抗體及抗體片段。在實施例中，抗體分子係多特異性抗體分子，例如其包含複數個免疫球蛋白可變結構域序列，其中該複數個中第一免疫球蛋白可變結構域序列具有針對第一表位之結合特異性，且該複數個中第二免疫球蛋白可變結構域序列具有針對第二表位之結合特異性。在實施例中，多特異性抗體分子係雙特異性抗體分子。雙特異性抗體具有針對不大於兩種抗原之特異性。雙特異性抗體分子之特徵在於具有針對第一表位之結合特異性之第一免疫球蛋白可變結構域序列及具有針對第二表位之結合特異性的第二免疫球蛋白可變結構域序列。
包含抗體或其抗體片段之本發明CAR部分可以眾多種形式存在，其中抗原結合結構域表現為鄰接多肽鏈之一部分，包括例如單一結構域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)、人類化抗體、或雙特異性抗體(Harlow等人，1999，Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人，1989，Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988, Science 242：423-426)。在一個態樣中，本發明CAR組合物之抗原結合結構域包含抗體片段。在另一態樣中，CAR包含包括scFv之抗體片段。
術語「抗體重鏈」係指以其天然構象存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較大者，且該抗體重鏈通常決定抗體所屬之類別。
術語「抗體輕鏈」係指以其天然構象存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較小者。卡帕(κ)及蘭姆達(λ)輕鏈係指兩種主要的抗體輕鏈同型。
術語「重組抗體」係指利用重組DNA技術產生之抗體，例如由噬菌體或酵母表現系統表現之抗體。該術語亦應理解為意指已藉由合成編碼抗體之DNA分子產生且該DNA分子表現抗體蛋白或指定該抗體之胺基酸序列的抗體，其中DNA或胺基酸序列已利用業內可用且熟知之重組DNA或胺基酸序列技術獲得。
術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或二者皆有。熟習此項技術者將理解，包含幾乎所有蛋白質或肽在內之任何大分子皆可用作抗原。此外，抗原可源自重組或基因組DNA。熟習此項技術者將理解，任何包含編碼誘發免疫反應之蛋白質之核苷酸序列或部分核苷酸序列之DNA由此編碼「抗原」(在該術語用於本文中時)。此外，熟習此項技術者將理解，抗原無需僅由基因之全長核苷酸序列編碼。容易地明瞭，本發明包括(但不限於)一個以上基因之部分核苷酸序列之用途及該等核苷酸序列係以多種組合排列以編碼引發期望免疫反應之多肽。此外，熟習此項技術者將理解抗原完全不必由「基因」編碼。容易地明瞭，抗原可以合成方式產生或可源自生物樣品，或可係除多肽外之大分子。此一生物樣品可包括(但不限於)組織樣品、腫瘤樣品、細胞或含有其他生物組份之流體。
術語「抗癌效應」係指可以多種方式呈現之生物效應，該等方式包括(但不限於)例如腫瘤體積減小、癌細胞數減少、轉移數減少、預期壽命增加、癌細胞增殖減少、癌細胞存活期縮短或與癌性病況相關之各種生理症狀之改善。「抗癌效應」亦可呈現為肽、多核苷酸、細胞及抗體在第一時間預防癌症發生之能力。術語「抗腫瘤效應」係指可以多種方式呈現之生物效應，該等方式包括(但不限於)例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活期縮短。
術語「自體」係指源自同一個體且後來再引入該個體中之任何材料。
術語「同種異體」係指源自與材料欲引入之個體同一物種之不同動物之任何材料。當一或多個基因座處之基因不同時，認為兩個或更多個個體互為同種異體。在一些態樣中，來自同一物種之個體之同種異體材料可在遺傳學上足夠不同以在抗原上相互作用。
術語「異種」係指源自不同物種之動物之移植物。
術語「癌症」係指特徵在於異常細胞之不受控生長之疾病。癌細胞可在局部擴散或通過血流及淋巴系統擴散至身體其他部分。各種癌症之實例闡述於本文中，且包括(但不限於)乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及諸如此類。術語「腫瘤」及「癌症」在本文中可互換使用，例如兩個術語涵蓋實體及液體，例如瀰漫性或循環腫瘤。如本文所用術語「癌症」或「腫瘤」包括癌前以及惡性癌症及腫瘤。
片語「與CD19之表現相關之疾病」包括(但不限於)與CD19之表現相關之疾病或與表現或在任何時間表現CD19之細胞相關之病況，包括例如增生性疾病，例如癌症或惡性病或癌前病況，例如骨髓發育 不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期；或與表現CD19之細胞相關之非癌症相關適應症。為免生疑問，與CD19之表現相關之疾病可包括與當前不表現CD19之細胞相關之病況，例如，此乃因CD19表現例如因使用靶向CD19、但不同時表現CD19之分子(例如，CD19 CAR)治療而下調。在一個態樣中，與CD19之表現相關之癌症係血液癌症。在一個態樣中，血液癌症係白血病或淋巴瘤。在一個態樣中，與CD19之表現相關之癌症包括癌症及惡性病，包括(但不限於)例如一或多種急性白血病，包括(但不限於)例如B細胞急性淋巴樣白血病(BALL)、T細胞急性淋巴樣白血病(TALL)、急性淋巴樣白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴樣白血病(CLL)。與CD19之表現相關之其他癌症或血液病況包含(但不限於)例如B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、多毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生性病況、MALT淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣帶淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症及「白血病前期」(其係因骨髓樣血球之無效產生(或發育不良)集合在一起之血液病況之不同集合)及諸如此類。與CD19之表現相關之其他疾病包括(但不限於)例如非典型及/或非經典癌症、惡性病、癌前病況或與CD19之表現相關之增生性疾病。與CD19之表現相關之非癌症相關適應症包括(但不限於)例如自體免疫疾病(例如，狼瘡)、發炎性病症(過敏及氣喘)及移植。 在一些實施例中，腫瘤抗原表現細胞表現或在任何時間表現編碼腫瘤抗原之mRNA。在實施例中，腫瘤抗原表現細胞產生腫瘤抗原蛋白(例如，野生型或突變體)，且腫瘤抗原蛋白可以正常含量或降低的含 量存在。在實施例中，腫瘤抗原表現細胞在一點處產生可檢測含量之腫瘤抗原蛋白，且隨後產生實質上無法檢測之腫瘤抗原蛋白。
片語「與B細胞抗原之表現相關之疾病」包括(但不限於)與CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者之表現相關之疾病或與表現或在任何時間表現CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者的細胞相關之病況，包括例如增生性疾病，例如癌症或惡性病或癌前病況，例如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期；或與表現CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者之細胞相關之非癌症相關適應症。為免生疑問，與B細胞抗原之表現相關之疾病可包括與當前不表現B細胞抗原之細胞相關之病況，例如，此乃因抗原表現例如因使用靶向B細胞抗原、但不同時表現該抗原之分子(例如，B細胞靶向CAR)治療而下調。片語「與B細胞抗原之表現相關之疾病」包括與CD19之表現相關之疾病，如本文所述。
術語「保守序列修飾」係指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體或抗體片段之結合特徵的胺基酸修飾。該等保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。可藉由業內已知之標準技術(例如定點誘變及PCR介導之誘變)將修飾引入本發明抗體或抗體片段中。保守胺基酸取代係其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基替代者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分枝側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，本發明CAR內 之一或多個胺基酸殘基可經來自同一側鏈家族之其他胺基酸殘基替代，且可利用本文所述之功能分析來測試經改變CAR。
術語「刺激」係指藉由刺激分子(例如，TCR/CD3複合物或CAR)與其同源配體(或CAR情形下之腫瘤抗原)結合、由此調介信號轉導事件(例如(但不限於)藉助TCR/CD3複合物之信號轉導或藉助適宜NK受體或CAR之信號傳導結構域之信號轉導)引起的初級反應。刺激可調介某些分子之經改變表現。
術語「刺激分子」係指由提供細胞質信號傳導序列之免疫細胞(例如，T細胞、NK細胞、B細胞)表現之分子，該(等)細胞質信號傳導序列以刺激免疫細胞信號傳導路徑之至少一些態樣之方式來調控免疫細胞的活化。在一個態樣中，信號係藉由例如TCR/CD3複合物與加載有肽之MHC分子結合起始之初級信號，且此可調介T細胞反應，包括(但不限於)增殖、活化、分化及諸如此類。以刺激方式起作用之初級細胞質信號傳導序列(亦稱為「初級信號傳導結構域」)可含有信號傳導基序，其稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。尤其用於本發明中之含有ITAM之細胞質信號傳導序列之實例包括(但不限於)源自以下各項之彼等：CD3 ζ、共有FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。在本發明之特定CAR中，本發明之任一或多個CARS中之細胞內信號傳導結構域包含細胞內信號傳導序列，例如CD3-ζ之初級信號傳導序列。在本發明之特定CAR中，CD3-ζ之初級信號傳導序列係以SEQ ID NO：17提供之序列或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。在本發明之特定CAR中，CD3-ζ之初級信號傳導序列係如SEQ ID NO：43中所提供之序列或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。
術語「抗原呈遞細胞」或「APC」係指在其表面上顯示與主要組織相容性複合物(MHC)複合之外源抗原之免疫系統細胞(例如輔助細胞，例如B細胞、樹突狀細胞及諸如此類)。T細胞可利用其T細胞受體(TCR)識別該等複合物。APC處理抗原且將其呈遞至T細胞。
在「細胞內信號傳導結構域」用於本文中時該術語係指分子之細胞內部分。細胞內信號傳導結構域產生促進含有CAR之細胞(例如，CART細胞)之免疫效應物功能之信號。例如CART細胞中免疫效應物功能之實例包括細胞溶解活性及輔助活性，包括分泌細胞介素。
在實施例中，細胞內信號傳導結構域可包含初級細胞內信號傳導結構域。實例性初級細胞內信號傳導結構域包括源自負責主要刺激或抗原依賴性模擬之分子之彼等。在實施例中，細胞內信號傳導結構域可包含共刺激細胞內結構域。實例性共刺激細胞內信號傳導結構域包括源自負責共刺激信號或非抗原依賴性刺激之分子之彼等。舉例而言，在CART之情形下，初級細胞內信號傳導結構域可包含T細胞受體之細胞質序列，且共刺激細胞內信號傳導結構域可包含來自共受體或共刺激分子之細胞質序列。
初級細胞內信號傳導結構域可包含信號傳導基序，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。含有ITAM之初級細胞質信號傳導序列之實例包括(但不限於)源自以下各項之彼等：CD3 ζ、共有FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。
術語「ζ」或另一選擇「ζ鏈」、「CD3-ζ」或「TCR-ζ」定義為以GenBan登錄號BAG36664.1提供之蛋白質或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基，且「ζ刺激結構域」或另一選擇「CD3-ζ刺激結構域」或「TCR-ζ刺激結構域」定義為來自ζ鏈之細胞質結構域或其功能衍生物之足以發揮傳送T細胞活化 所需初始信號功能的胺基酸殘基。在一個態樣中，ζ之細胞質結構域包含基因庫登錄號BAG36664.1之殘基52至164或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之為其功能直向同源物之等效殘基。在一個態樣中，「ζ刺激結構域」或「CD3-ζ刺激結構域」係以SEQ ID NO：17提供之序列。在一個態樣中，「ζ刺激結構域」或「CD3-ζ刺激結構域」係以SEQ ID NO：43提供之序列。
術語「共刺激分子」係指在T細胞上與共刺激配體特異性結合、由此調介T細胞之共刺激反應(例如(但不限於)增殖)之同源結合伴侶。 共刺激分子係有助於有效免疫反應之除抗原受體或其配體外之細胞表面分子。共刺激分子包括(但不限於)I類MHC分子、BTLA及鐸配體受體以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。該等共刺激分子之其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配體。
共刺激細胞內信號傳導結構域可係共刺激分子之細胞內部分。 共刺激分子可表示於以下蛋白家族中：TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球活化分子(SLAM蛋白)及活化NK細胞受體。該等分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3及與CD83特異性結合之配體及諸如此類。
細胞內信號傳導結構域可包含衍生出其之分子之整個細胞內部分或整個天然細胞內信號傳導結構域或其功能片段或衍生物。
術語「4-1BB」係指具有以基因庫登錄號AAA62478.2提供之胺基酸序列或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基的TNFR超家族之成員；且「4-1BB共刺激結構域」定義為基因庫登錄號AAA62478.2之胺基酸殘基214-255或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。在一個態樣中，「4-1BB共刺激結構域」係以SEQ ID NO：16提供之序列或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。
在「免疫效應細胞」用於本文中時該術語係指參與免疫反應(例如，促進免疫效應物反應)之細胞。免疫效應細胞之實例包括T細胞(例如α/β T細胞及γ/δ T細胞)、B細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T(NKT)細胞、肥大細胞及骨髓源性吞噬細胞。
當「免疫效應物功能或免疫效應物反應」用於本文中時該術語係指例如免疫效應細胞之增強或促進靶細胞之免疫攻擊之功能或反應。例如，免疫效應物功能或反應係指T細胞或NK細胞之促進靶細胞之殺死或抑制其生長或增殖之性質。在T細胞之情形下，主要刺激及 共刺激係免疫效應物功能或反應之實例。
術語「編碼」係指多核苷酸中核苷酸之特異性序列(例如基因、cDNA或mRNA)用作合成生物過程中具有所定義核苷酸序列(例如rRNA、tRNA及mRNA)或所定義胺基酸序列之其他聚合物及大分子的模板之固有性質及源自其之生物性質。因此，若對應於基因之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則該基因、cDNA或RNA編碼蛋白質。編碼鏈(與mRNA序列一致且通常提供於序列列表中之核苷酸序列)及非編碼鏈(用作基因或cDNA轉錄之模板)二者皆可稱為編碼該基因或cDNA之蛋白質或其他產物。
除非另有說明，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為彼此之簡併形式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。就編碼蛋白質之核苷酸序列可在某一形式中含有內含子而言，編碼蛋白質或RNA之片語核苷酸序列亦可包括內含子。
術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，且係指如本文所述可有效地達成具體生物結果之化合物、調配物、材料或組合物之量。
術語「內源」係指來自生物體、細胞、組織或系統或在其內部產生之任何材料。
術語「外源」係指自生物體、細胞、組織或系統引入或在其外部產生之任何材料。
術語「表現」係指由啟動子驅動之具體核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。
術語「轉移載體」係指包含經分離核酸且可用於將經分離核酸遞送至細胞內部之物質之組合物。多種載體為業內已知，包括(但不限於)直鏈多核苷酸、與離子型或兩親性化合物締合之多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製之質體或病毒。該 術語亦應理解為進一步包括幫助核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、脂質體及諸如此類。病毒轉移載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體及諸如此類。
術語「表現載體」係指包含包括可操作地連接至欲表現核苷酸序列之表現控制序列之重組多核苷酸的載體。表現載體包含用於表現之足夠順式作用元件；用於表現之其他元件可由宿主細胞或在活體外表現系統中供應。表現載體包括所有業內已知納入重組多核苷酸之彼等，包括黏粒、質體(例如，裸露或含於脂質體中)及病毒(例如，優病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「慢病毒」係指逆轉錄病毒科家族之屬。慢病毒在逆轉錄病毒中之獨特之處在於，能夠感染未分裂細胞；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其係基因遞送載體之最有效方法之一。HIV、SIV及FIV皆係慢病毒之實例。
術語「慢病毒載體」係指源自慢病毒基因組之至少一部分之載體，尤其包括如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中所提供之自失活慢病毒載體。可用於臨床中之慢病毒載體之其他實例包括(但不限於)例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAXTM載體系統及諸如此類。慢病毒載體之非臨床類型亦可用且將為熟習此項技術者已知。
術語「同源」或「一致性」係指兩個聚合物分子之間、例如兩個核酸分子(例如兩個DNA分子或兩個RNA分子)之間或兩個多肽分子之間的亞單位序列一致性。當兩個分子二者中之亞單位位置經相同單體亞單位佔據時；例如若在兩個DNA分子中每一者中之位置經腺嘌呤佔據，則其在該位置處同源或一致。兩條序列之間之同源性係匹配或同源位置數之直接函數；例如若兩條序列中之一半(例如聚合物10個 亞單位長度上之5個位置)位置同源，則該兩條序列為50%同源；若90%之位置(例如10個中之9個)匹配或同源，則該兩條序列為90%同源。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式係嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)，其含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列。在極大程度上，人類化抗體及其抗體片段係人類免疫球蛋白(接受者抗體或抗體片段)，其中來自接受者之互補決定區(CDR)的殘基經來自諸如小鼠、大鼠或兔等非人類物種(供體抗體)之CDR且具有期望特異性、親和力及能力的殘基替代。在某些情況下，人類免疫球蛋白之Fv框架區(FR)殘基經相應的非人類殘基替代。此外，人類化抗體/抗體片段可包含在接受者抗體與導入之CDR或框架序列中皆未發現之殘基。該等修飾可進一步完善且最佳化抗體或抗體片段性能。通常，人類化抗體或其抗體片段將包含實質上所有的至少一個、且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且FR區之全部或重要部分為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體或抗體片段亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常為人類免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。其他細節參見Jones等人，Nature,321：522-525,1986；Riechmann等人，Nature,332：323-329,1988；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596,1992。
「全人類」係指免疫球蛋白，例如抗體或抗體片段，其中整個分子為人類來源或由與抗體或免疫球蛋白之人類形式一致之胺基酸序列組成。
術語「經分離」意指自天然狀態改變或移除。舉例而言，天然存在於活動物中之核酸或肽未「經分離」，但部分或全部自其天然狀態之共存材料分離之相同核酸或肽為「經分離」。經分離核酸或蛋白 質可以實質上純化之形式存在，或可存在於非天然環境(例如宿主細胞)中。
在本發明上下文中使用普遍存在核酸鹼基之以下縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸苷，且「U」係指尿苷。
術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調控序列與異源核酸序列之間之功能連接，以使後者表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列位於功能關係中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此鄰接，且例如在需要連結兩個蛋白質編碼區時處在同一閱讀框中。
術語免疫原性組合物之「非經腸」投與包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌內(i.m.)或胸骨內注射、腫瘤內或輸注技術。
術語「核酸」或「多核苷酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有與參考核酸具有類似結合性質且以類似於天然核苷酸之方式代謝之天然核苷酸已知類似物的核酸。除非另外指明，否則具體核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如，簡併密碼子取代)、等位基因、直向同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定地，藉由產生其中一或多個所選(或全部)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧次黃嘌呤核苷殘基取代的序列可達成簡併密碼子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指包含藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩 個胺基酸，且對可包含蛋白質或肽序列之胺基酸之最大數量無限制。 多肽包括包含藉由肽鍵彼此連接之兩個或更多個胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文所用術語係指例如兩條短鏈(業內亦通常稱為肽、寡肽及寡聚物)及較長鏈(業內通常稱為蛋白質，其具有許多類型)。「多肽」尤其包括例如生物活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽之變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。
術語「啟動子」係指由細胞之合成機構或所引入合成機構所識別之起始多核苷酸序列之特定轉錄所需之DNA序列。
術語「啟動子/調控序列」係指為表現可操作地連接至啟動子/調控序列之基因產物所需之核酸序列。在一些情況下，此序列可為核心啟動子序列，且在其他情況下此序列亦可包括增強子序列及為表現基因產物所需之其他調控元件。啟動子/調控序列可係例如以組織特異性方式表現基因產物之序列。
術語「組成型」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，在細胞中在細胞之大多數或所有生理學條件下產生基因產物之核苷酸序列。
術語「誘導型」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，在細胞中實質上僅在對應於啟動子之誘導劑存在於細胞中時產生基因產物之核苷酸序列。
術語「組織特異性」啟動子係指當與由基因編碼或指定之多核苷酸可操作地連接時，在細胞中實質上僅在細胞係對應於啟動子之組織類型之細胞時產生基因產物的核苷酸序列。
如在scFv背景下使用之術語「撓性多肽連接體」係指將可變重鏈與可變輕鏈區連接在一起之由單獨或以組合使用之諸如甘胺酸及/或絲胺酸等胺基酸殘基組成之肽連接體。在一個實施例中，撓性多肽連 接體係Gly/Ser連接體，且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n係等於或大於1之正整數。舉例而言，n=1，n=2，n=3，n=4，n=5且n=6，n=7，n=8，n=9且n=10(SEQ ID NO：105)。在一個實施例中，撓性多肽連接體包括(但不限於)(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO：106)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO：107)。在另一實施例中，連接體包括多個(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)重複(SEQ ID NO：108)。 WO2012/138475中所述之連接體亦包括在本發明範疇內，該專利以引用方式併入本文中。
如本文所用之5'帽(亦稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m7G帽)係在轉錄起始後不久即添加至真核信使RNA之「前面」或5'端之經修飾鳥嘌呤核苷酸。5'帽係由連接至第一個轉錄核苷酸之端基組成。其存在對於核糖體之識別及針對RNA酶之保護至關重要。帽添加與轉錄偶合且以共轉錄方式發生，以使其相互影響。轉錄起始後不久，所合成mRNA之5'端藉由與RNA聚合酶締合之帽合成複合物結合。此酶複合物催化為mRNA加帽所需之化學反應。合成以多步驟生物化學反應進行。加帽部分可經修飾以調節mRNA之功能，例如其穩定性或轉譯效率。
如本文所用之「活體外轉錄RNA」係指已在活體外合成之RNA，較佳mRNA。通常，活體外轉錄RNA係自活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄RNA之模板。
如本文所用之「聚(A)」係藉由多聚腺苷酸化附接至mRNA之一系列腺苷。在用於瞬時表現之構築體之較佳實施例中，聚A係介於50與5000(SEQ ID NO：109)之間，較佳大於64，更佳大於100，最佳大於300或400。聚(A)序列可經化學或酶促修飾以調節諸如定位、穩定性或轉譯效率等mRNA功能。
如本文所用之「多聚腺苷酸化」係指將多腺苷醯基部分或其經 修飾變體共價連接至信使RNA分子。在真核生物體中，大部分信使RNA(mRNA)分子在3'端經多腺苷酸化。3'聚(A)尾係經由酶(多腺苷酸化聚合酶)之作用添加至mRNA前體之長腺嘌呤核苷酸序列(通常數百個)。在高等真核生物中，聚(A)尾添加至含有特異性序列(多腺苷酸化信號)之轉錄本上。聚(A)尾及其結合之蛋白質幫助保護mRNA免於外切酶降解。多腺苷酸化對於轉錄終止、mRNA自核之輸出及轉譯亦至關重要。多腺苷酸化在核中DNA轉錄成RNA後立即發生，但此外亦可後來在細胞質中發生。在轉錄終止後，mRNA鏈經由與RNA聚合酶締合之核酸內切酶複合物之作用裂解。裂解位點之特徵通常在於在裂解位點附近存在鹼基序列AAUAAA。在mRNA裂解後，腺苷殘基添加至裂解位點處之游離3'端。
如本文所用之「瞬時」係指非整合轉基因經數小時、數天或數週時段之表現，其中該表現時間段小於基因在宿主細胞中整合至基因組中或含於穩定質體複製子內時表現之時間段。
術語「信號轉導路徑」係指在信號自細胞之一部分傳遞至細胞之另一部分中起作用之多種信號轉導分子之間的生物化學關係。片語「細胞表面受體」包括能夠接收信號且穿過細胞膜傳送信號之分子及分子複合物。
術語「個體」意欲包括其中可引發免疫反應之活生物體(例如，哺乳動物、人類)。
術語「實質上經純化」之細胞係指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上純化之細胞亦指已與在其天然狀態下與其天然締合之其他細胞類型分離之細胞。在一些情況下，實質上純化之細胞群係指細胞之同源群。在其他情況下，此術語僅僅指已與在其天然狀態下與其天然締合之細胞分離之細胞。在一些態樣中，細胞係在活體外培養。在其他態樣中，細胞並非在活體外培養。
如本文所用之術語「治療(therapeutic)」意指治療(treatment)。治療效應係藉由減輕、阻抑、緩解或消滅疾病狀態來獲得。
如本文所用之術語「預防」意指疾病或疾病狀態之預防或保護性治療。
在本發明上下文中，「腫瘤抗原」或「過度增生性病症抗原」或「與過度增生性病症相關之抗原」係指為特定過度增生性病症所共有之抗原。在某些態樣中，本發明之過度增生性病症抗原源自癌症，包括(但不限於)原發性或轉移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌及腺癌，例如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌及諸如此類。
術語「轉染」或「轉化」或「轉導」係指將外源核酸轉移或引入宿主細胞中之過程。「轉染」或「轉化」或「轉導」之細胞係經外源核酸轉染、轉化或轉導之細胞。該細胞包括原代個體細胞及其子代。
術語「特異性結合」係指識別並與存在於樣品中之結合伴侶(例如，刺激腫瘤抗原)蛋白結合之抗體或配體，但該抗體或配體實質上並不識別或結合樣品中之其他分子。
當「可調控嵌合抗原受體(RCAR)」用於本文中時該術語係指多肽之集合，在最簡單實施例中通常為兩種多肽之集合，其在RCARX細胞中時向RCARX細胞提供針對靶細胞(通常為癌細胞)之特異性及可調控細胞內信號產生或增殖，此可最佳化RCARX細胞之免疫效應物性質。RCARX細胞至少部分取決於抗原結合結構域以提供針對包含由抗原結合結構域結合之抗原之靶細胞的特異性。在實施例中，RCAR包括在二聚化分子存在時可使細胞內信號傳導結構域偶合至抗原結合結構域之二聚化開關。
當「膜錨定」或「膜系鏈結構域」用於本文中時該術語係指足以使細胞外或細胞內結構域錨定至漿膜之多肽或部分，例如肉豆蔻醯基。
當「開關結構域」用於本文中時，該術語例如在提及RCAR時係指在二聚化分子存在下與另一開關結構域締合之實體，通常基於多肽之實體。締合產生連接至(例如，融合至)第一開關結構域之第一實體與連接至(例如，融合至)第二開關結構域之第二實體之功能偶合。第一及第二開關結構域統稱為二聚化開關。在實施例中，第一及第二開關結構域彼此相同，例如，其係具有相同的主要胺基酸序列之多肽，且統稱為同二聚化開關。在實施例中，第一及第二開關結構域彼此不同，例如，其係具有不同的主要胺基酸序列之多肽，且統稱為異二聚化開關。在實施例中，交換在細胞內。在實施例中，交換在細胞外。 在實施例中，開關結構域係基於多肽之實體，例如基於FKBP或FRB，且二聚化分子為小分子，例如雷帕黴素類似物(rapalogue)。在實施例中，開關結構域係基於多肽之實體，例如結合myc肽之scFv，且二聚化分子為多肽、其片段或多肽之多聚體，例如myc配體或myc配體之結合至一或多個myc scFv之多聚體。在實施例中，開關結構域係基於多肽之實體，例如myc受體，且二聚化分子為抗體或其片段，例如myc抗體。
當「二聚化分子」用於本文中時，該術語例如在提及RCAR時係指促進第一開關結構域與第二開關結構域締合之分子。在實施例中，二聚化分子並非天然存在於個體中，或並不以將產生顯著二聚化之濃度存在。在實施例中，二聚化分子為小分子，例如雷帕黴素或雷帕黴素類似物，例如RAD001。
術語「生物等效」係指產生與由參考化合物(例如，RAD001)之參考劑量或參考量產生之效應等效的效應所需之除參考化合物(例 如，RAD001)外之藥劑之量。在實施例中，效應係mTOR抑制之程度，例如如藉由P70 S6激酶抑制所量測，例如如在活體內或活體外分析中所評估，例如如藉由本文所述之分析(例如，Boulay分析)所量測，或藉由西方墨點(western blot)量測磷酸化S6含量。在實施例中，效應係改變PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率，如藉由細胞分選所量測。在實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量係與參考化合物之參考劑量或參考量達成相同P70 S6激酶抑制程度之量或劑量。在實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量係與參考化合物之參考劑量或參考量達成相同的PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率變化程度之量或劑量。
術語「低免疫增強劑量」在與mTOR抑制劑(例如別位mTOR抑制劑，例如RAD001或雷帕黴素，或催化mTOR抑制劑)結合使用時係指mTOR抑制劑之部分、而非完全抑制mTOR活性之劑量，例如如藉由P70 S6激酶活性之抑制所量測。例如藉由抑制P70 S6激酶評估mTOR活性之方法論述於本文中。該劑量不足以產生完全免疫阻抑，但足以增強免疫反應。在實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑會使PD-1陽性T細胞數減少及/或使PD-1陰性T細胞數增加或使PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率增加。在實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑會使原初T細胞數增加。在實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑會產生以下中之一或多者：增加以下標記物中之一或多者在例如記憶T細胞(例如，記憶T細胞前體)上之表現：CD62L高、CD127高、CD27+及BCL2；減少KLRG1例如在記憶T細胞(例如，記憶T細胞前體)上之表現；及增加記憶T細胞前體(例如，具有以下特徵中之任一者或該等特徵之組合之細胞)數：增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、 減少的KLRG1及增加的BCL2；其中例如與未經治療之個體相比，例如至少瞬時出現上述任一變化。
如本文所用之「難治性」係指不因應治療之疾病，例如癌症。在實施例中，難治性癌症可在治療前或治療開始時抵抗治療。在其他實施例中，難治性癌症可在治療期間變得難治。
如本文所用之「完全反應者」係指對治療展現完全反應(例如完全緩解)之患有疾病(例如，癌症)之個體。完全反應可利用例如如本文所述之Cheson準則來鑑別。
如本文所用之「部分反應者」係指對治療展現部分反應(例如，部分緩解)之患有疾病(例如，癌症)之個體。部分反應可利用例如Cheson準則來鑑別。
如本文所用之「非反應者」係指對治療不展現反應之患有疾病(例如，癌症)之個體，例如患者患有穩定疾病或進行性疾病。非反應者可利用例如如本文所述之Cheson準則來鑑別。
如本文所用之術語「復發」係指在初始反應(例如，完全反應或部分反應)時段後疾病(例如，癌症)之再現。初始反應時段可涉及癌細胞含量降低至某一臨限值以下，例如20%以下、1%以下、10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下或1%以下。再現可涉及癌細胞含量升高至某一臨限值以上，例如20%以上、1%以上、10%以上、5%以上、4%以上、3%以上、2%以上或1%以上。復發可利用例如如本文所述之Cheson準則來鑑別。
範圍：在本發明通篇中，本發明之多個態樣可以範圍格式呈現。應理解，呈範圍格式之描述僅出於方便及簡潔之目的，且不應理解為對本發明範疇之硬性限制。因此，範圍之描述應視為特定揭示所有可能的子範圍以及該範圍內之個別數值。例如，諸如1至6等範圍之 描述應視為特定揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子範圍以及該範圍內之個別數值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。 作為另一實例，諸如95%至99%一致性之範圍包括具有95%、96%、97%、98%或99%一致性之範圍，且包括諸如96%至99%、96%至98%、96%至97%、97%至99%、97%至98%及98%至99%一致性等子範圍。此無論範圍之寬度如何皆適用。
描述
本文提供利用表現嵌合抗原受體(CAR)(例如靶向B細胞標記物之CAR，例如CD19)之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)治療疾病(例如癌症(例如，血液癌症或其他B細胞惡性病))之物質之組合物及使用方法。該等方法尤其包括投與表現本文所述之靶向B細胞之CAR的免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)與另一藥劑(例如激酶抑制劑，例如本文所述之激酶抑制劑)之組合。
本發明至少部分地提供支持CAR療法(例如，B細胞靶向CAR療法)及激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)之組合之高效能的實驗。相對於激酶抑制劑之單一療法或CAR表現細胞之劑量或二者，激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)與CAR療法之組合可增加組合療法之效能。該等有益效應可例如容許較低劑量之激酶抑制劑或CAR表現細胞或二者，同時維持效能。本文結果適用於寬範圍之癌症，例如血液癌症及其他B細胞惡性病。舉例而言，依魯替尼會抑制在大部分淋巴瘤中升高之BTK。表現CAR19之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)靶向具有CD19表面表現之癌症，CD19在大部分B細胞惡性病中表現。另一選擇為或在與CAR19之組合中，任何其他B細胞靶向CAR(例如，靶向以下中之一或多者之CAR：CD20、CD22或ROR1)可用於本文所述之組合療法中。因此，CAR療法(例如，CD19 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR或ROR1 CAR療法中之一或多者)與 BTK抑制劑(例如，依魯替尼)之組合適於治療寬範圍之涉及B細胞過度增殖之癌症，包括淋巴瘤(例如，霍奇金氏淋巴瘤)、MCL、CLL、DLBCL及多發性骨髓瘤。
根據本發明，依魯替尼可減少腫瘤團塊且動員末梢血中之贅瘤性B細胞(例如，參見本文實例8)。不希望受限於理論，某些淋巴瘤(例如MCL)之特徵在於淋巴結之增殖中心中之癌細胞團塊。表現CAR之免疫效應細胞有時難以穿透該等緻密堆積之團塊。因此，BTK抑制劑(例如依魯替尼)可減少腫瘤團塊且動員末梢血中之贅瘤性B細胞，從而使淋巴瘤細胞更易受CAR表現細胞攻擊。
另一選擇為或組合地，BTK抑制劑(例如依魯替尼)亦可影響CAR表現細胞。本發明展示依魯替尼治療增加循環CART19細胞之含量(例如，參見實例8中所展示之數據)。不希望受限於理論，循環CART19細胞之含量增加可引起例如增殖增加、T細胞表型改變或其他要素。 舉例而言，依魯替尼可抑制與BTK同源之激酶ITK。ITK在T細胞中表現，且其抑制可改變T細胞表型。使用激酶抑制劑(例如依魯替尼)治療可改變T細胞表型(自Th2表型變成Th1表型)，且因此增加T細胞增殖能力。向個體預治療或共投與BTK抑制劑可增加個體中之T細胞增殖能力，因此增加循環CAR表現細胞之含量。另外，經BTK抑制劑(例如依魯替尼)預治療之個體可具有在其血球分離用於CAR製造方面具有較高增殖能力之T細胞群。
在一個態樣中，本發明提供多種嵌合抗原受體(CAR)，其包含經改造用於特異性結合至B細胞抗原(例如，選自CD19、CD20、CD22或ROR1蛋白中之一或多者)之抗體或抗體片段。在一個態樣中，本發明提供經改造以表現CAR之細胞(例如，T細胞)，其中CAR T細胞(「CART」)展現抗癌性質。在一個態樣中，使用CAR轉化細胞且使CAR在細胞表面上表現。在一些實施例中，使用編碼CAR之病毒載體 轉導細胞(例如，T細胞)。在一些實施例中，病毒載體係逆轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體係慢病毒載體。在一些該等實施例中，細胞可穩定地表現CAR。在另一實施例中，使用編碼CAR之核酸(例如，mRNA、cDNA、DNA)轉染細胞(例如，T細胞)。在一些該等實施例中，細胞可瞬時表現CAR。
在一個態樣中，CAR之抗-CD19蛋白結合部分係scFv抗體片段。 在一個態樣中，該等抗體片段之功能在於其保留等效結合親和力，例如其以與衍生出其之IgG抗體相當之親和力結合相同抗原。在一個態樣中，該等抗體片段之功能在於其提供生物反應，該生物反應可包括(但不限於)活化免疫反應、抑制源自其靶抗原之信號轉導、抑制激酶活性及諸如此類，如熟習此項技術者將理解。在一個態樣中，CAR之抗-CD19抗原結合結構域係與衍生出其之scFv鼠類序列相比經人類化之scFv抗體片段。在一個態樣中，親代鼠類scFv序列係PCT公開案WO2012/079000(以引用方式併入本文中)中所提供且在本文中以SEQ ID NO：59提供之CAR19構築體。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域係WO2012/079000中所述且提供於SEQ ID NO：59中之scFv。
在一些態樣中，將本發明抗體納入嵌合抗原受體(CAR)中。在一個態樣中，CAR包含於PCT公開案WO2012/079000中以SEQ ID NO：12提供且在本文中以SEQ ID NO：58提供之多肽序列，其中scFv結構域經一或多條選自SEQ ID NO：1-12之序列取代。在一個態樣中，SEQ ID NO：1-12之scFv結構域係SEQ ID NO：59之scFv結構域之人類化變體，其係特異性結合至人類CD19之鼠類來源之scFv片段。此小鼠scFv之人類化可期望用於臨床環境，其中小鼠特異性殘基可誘導接受CART19治療(例如，使用經CAR19構築體轉導之T細胞治療)之患者中之人類-抗-小鼠抗原(HAMA)反應。
在一個態樣中，抗-CD19結合結構域(例如，人類化scFv，本發明 CAR之一部分)係由序列已經密碼子最佳化用於在哺乳動物細胞中表現之轉基因編碼。在一個態樣中，本發明之整個CAR構築體係由整個序列已經密碼子最佳化用於在哺乳動物細胞中表現之轉基因編碼。密碼子最佳化係指以下發現：同義密碼子(即編碼相同胺基酸之密碼子)在編碼DNA中之出現頻率在不同物種中有所不同。該密碼子簡併性容許相同多肽經多條核苷酸序列編碼。多種密碼子最佳化方法為業內已知，且包括例如至少美國專利第5,786,464號及第6,114,148號中所揭示之方法。
在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：1中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：2中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：3中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：4中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：5中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：6中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：7中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：8中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：9中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：10中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：11中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類化CAR19包含SEQ ID NO：12中所提供之scFv部分。
在一個態樣中，本發明CAR組合特異性抗體之抗原結合結構域與細胞內信號傳導分子。舉例而言，在一些態樣中，細胞內信號傳導分子包括(但不限於)CD3-ζ鏈、4-1BB及CD28信號傳導模組及其組合。在一個態樣中，CD19 CAR包含選自SEQ ID NO：31-42中之一或多者中所提供之序列之CAR。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：31中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：32中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：33中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：34中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：35中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：36中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：37中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：38中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：39中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：40中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：41中所提供之序列。在一個態樣中，CD19 CAR包含SEQ ID NO：42中所提供之序列。
此外，本發明提供CD19 CAR組合物及其於藥劑或方法中之用途，其用於治療涉及表現CD19之細胞或組織之疾病，尤其癌症或任何惡性病或自體免疫疾病。
在一個態樣中，本發明CAR可用於消滅表現CD19之正常細胞，由此適於用作細胞移植前之細胞調理療法。在一個態樣中，表現CD19之正常細胞係表現CD19之正常幹細胞，且細胞移植係幹細胞移植。
在一個態樣中，本發明提供經改造以表現嵌合抗原受體(CAR)之細胞(例如，T細胞)，其中CAR表現細胞(例如，CAR T細胞(「CART」))展現抗癌性質。較佳抗原係CD19。在一個態樣中，CAR之抗原結合結構域包含經部分人類化之抗-CD19抗體片段。在一個態樣中，CAR之抗原結合結構域包含經部分人類化之抗-CD19抗體片段(包含scFv)。因此，本發明提供包含人類化抗-CD19結合結構域且改造至免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)中之CD19-CAR，及其用 於授受性療法之方法。
在一個態樣中，CD19-CAR包含至少一個選自以下之群之細胞內結構域：CD137(4-1BB)信號傳導結構域、CD28信號傳導結構域、CD3ζ信號結構域及其任一組合。在一個態樣中，CD19-CAR包含至少一個來自一或多種除CD137(4-1BB)或CD28外之共刺激分子之細胞內信號傳導結構域。
嵌合抗原受體(CAR)
本發明涵蓋包含編碼CAR之序列之重組DNA構築體，其中CAR包含特異性結合至B細胞抗原(例如CD19，例如人類CD19)之抗體或抗體片段，其中抗體片段之序列與編碼細胞內信號傳導結構域之核酸序列鄰接且處在同一閱讀框中。細胞內信號傳導結構域可包含共刺激信號傳導結構域及/或初級信號傳導結構域，例如ζ鏈。共刺激信號傳導結構域係指包含共刺激分子之細胞內結構域之至少一部分的CAR部分。在一個實施例中，抗原結合結構域係本文所述之鼠類抗體或抗體片段。在一個實施例中，抗原結合結構域係人類化抗體或抗體片段。
在特定態樣中，本發明之CAR構築體包含選自由SEQ ID NO：1-12組成之群之scFv結構域或SEQ ID NO：59之scFV結構域，其中scFv之前可為例如SEQ ID NO：13中所提供之可選前導序列，且其後可為例如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49中所提供之可選鉸鏈序列、例如SEQ ID NO：15中所提供之跨膜區、包括SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51及CD3 ζ序列(包括SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43)之細胞內信號傳導結構域，其中該等結構域鄰接且處在同一閱讀框中以形成單一融合蛋白。本發明亦包括編碼選自由以下組成之群之scFv片段中之每一者的多肽之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59。本發明亦包括編碼選自由以下組成之群之scFv片段中之每一者的多肽之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59以及SEQ ID NO：13-17之每一結構域加所編碼之本發明CD19 CAR融合蛋白。在一個態樣中，實例性CD19CAR構築體包含可選前導序列、細胞外抗原結合結構域、鉸鏈、跨膜結構域及細胞內刺激結構域。在一個態樣中，實例性CD19CAR構築體包含可選前導序列、細胞外抗原結合結構域、鉸鏈、跨膜結構域、細胞內共刺激結構域及細胞內刺激結構域。本發明之含有人類化scFv結構域之特異性CD19 CAR構築體係以SEQ ID NO：31-42提供，或鼠類scFv結構域係以SEQ ID NO：59提供。
全長CAR序列在本文中亦以SEQ ID NO：31-42及58提供，如表7及表3中所展示。
實例性前導序列係以SEQ ID NO：13提供。實例性鉸鏈/間隔體序列係以SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49提供。實例性跨膜結構域序列係以SEQ ID NO：15提供。4-1BB蛋白之實例性細胞內信號傳導結構域序列係以SEQ ID NO：16提供。CD27之實例性細胞內信號傳導結構域序列係以SEQ ID NO：51提供。實例性CD3ζ結構域序列係以SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43提供。
在一個態樣中，本發明涵蓋包含編碼CAR之核酸分子之重組核酸構築體，其中核酸分子包含與編碼細胞內信號傳導結構域之核酸序列鄰接且處在同一閱讀框中之編碼抗-CD19結合結構域(例如，本文所述)之核酸序列。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域選自SEQ ID NO：1-12及58中之一或多者。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係 由SEQ ID NO：61-72及59中之一或多者中所提供之序列的核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：61之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：62之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：63之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：64之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：65之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：66之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：67之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：68之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：69之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：70之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：71之核苷酸殘基64至813編碼。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係由SEQ ID NO：72之核苷酸殘基64至813編碼。
在一個態樣中，本發明涵蓋包含編碼CAR之轉基因之重組核酸構築體，其中核酸分子包含選自SEQ ID NO：61-72中之一或多者之編碼抗-CD19結合結構域之核酸序列，其中該序列與編碼細胞內信號傳導結構域之核酸序列鄰接且處在同一閱讀框中。可用於CAR中之實例性細胞內信號傳導結構域包括(但不限於)例如CD3-ζ、CD28、4-1BB及諸如此類之一或多個細胞內信號傳導結構域。在一些情況下，CAR可包含CD3-ζ、CD28、4-1BB及諸如此類之任一組合。在一個態樣中，本發明之CAR構築體之核酸序列選自SEQ ID NO：85-96中之一或多者。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：85。在一 個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：86。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：87。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：88。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：89。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：90。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：91。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：92。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：93。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：94。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：95。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：96。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：97。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：98。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列係SEQ ID NO：99。
編碼期望分子之核酸序列可利用業內已知之重組方法來獲得，例如利用標準技術藉由自表現該基因之細胞篩選文庫、自已知包括該基因之載體衍生出基因或自含有該基因之細胞及組織直接分離來獲得。另一選擇為，所關注核酸可以合成方式而非選殖來產生。
本發明包括可直接轉導至細胞中之表現CAR之逆轉錄病毒及慢病毒載體構築體。
本發明亦包括可直接轉染至細胞中之RNA構築體。產生用於轉染之mRNA之方法涉及使用特殊設計之引子在活體外轉錄(IVT)模板，然後添加聚A，以產生長度通常為50-2000個鹼基之含有以下各項之構築體(SEQ ID NO：118)：3’及5’非轉譯序列(「UTR」)、5’帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、欲表現之核酸及聚A尾。由此產生之RNA可有效地轉染不同種類之細胞。在一個實施例中，模板包括針對CAR之序列。在實施例中，藉由電穿孔將RNA CAR載體轉導至T細胞中。
抗原結合結構域
在一個態樣中，本發明CAR包含靶特異性結合元件，亦稱為抗原結合結構域。部分之選擇端視界定靶細胞表面之配體之類型及數量而定。舉例而言，抗原結合結構域可經選擇以識別用作靶細胞上與具體疾病狀態相關之細胞表面標記物之配體。因此，可用作本發明CAR中之抗原結合結構域之配體的細胞表面標記物之實例包括與病毒、細菌及寄生蟲感染、自體免疫疾病及癌細胞相關之彼等。
在一個態樣中，可藉助將特異性結合期望抗原之抗原結合結構域改造至CAR中使CAR介導之T細胞反應針對所關注抗原。
在一個態樣中，包含抗原結合結構域之CAR部分包含靶向CD19之抗原結合結構域。在一個態樣中，抗原結合結構域靶向人類CD19。在一個態樣中，CAR之抗原結合結構域具有與Nicholson等人，Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)中所述之FMC63 scFv片段相同或類似之結合特異性。在一個實施例中，CAR之抗原結合結構域包括Nicholson等人，Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)中所述之scFv片段。
抗原結合結構域可係結合至抗原之任何結構域，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、重組抗體、鼠類抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能片段，包括(但不限於)單一結構域抗體，例如重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)及駱駝科動物源性奈米抗體之可變結構域(VHH)，及業內已知用作抗原結合結構域之替代性支架，例如重組纖連蛋白結構域及諸如此類。
在一個實施例中，CAR分子包含抗-CD19結合結構域，其包含本文所述抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及本文所述抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有 三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如包含一或多個(例如，所有三個)LC CDR及一或多個(例如，所有三個)HC CDR之抗-CD19結合結構域。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域包含本文所述抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如抗-CD19結合結構域具有兩個可變重鏈區，其各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域包含本文所述之鼠類輕鏈可變區(例如，在表7中)及/或本文所述之鼠類重鏈可變區(例如，在表7中)。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域係包含表7之胺基酸序列之鼠類輕鏈及鼠類重鏈的scFv。在實施例中，抗-CD19結合結構域(例如，scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有表7中所提供輕鏈可變區之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與表7之胺基酸序列具有95%-99%一致性的序列；及/或重鏈可變區，其包含具有表7中所提供重鏈可變區之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與表7之胺基酸序列具有95%-99%一致性的序列。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域包含SEQ ID NO：59之序列或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域係scFv，且包含例如表7中之本文所述胺基酸序列之輕鏈可變區經由連接體(例如，本文所述之連接體)附接至包含例如表7中之本文所述胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域包括(Gly4-Ser)n連接體，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳3或4(SEQ ID NO：53)。ScFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或 重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。
在一些情況下，使抗原結合結構域源自其中最終將使用CAR之同一物種有益。例如，對於人類中之使用，CAR之抗原結合結構域包含抗體或抗體片段之抗原結合結構域之人類或人類化殘基可能有益。
因此，在一個態樣中，抗原結合結構域包含人類化抗體或抗體片段。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包含本文所述鼠類或人類化抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及/或本文所述鼠類或人類化抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如包含一或多個(例如，所有三個)LC CDR及一或多個(例如，所有三個)HC CDR之人類化抗-CD19結合結構域。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包含本文所述鼠類或人類化抗-CD19結合結構域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)，例如人類化抗-CD19結合結構域具有兩個可變重鏈區，其各自包含本文所述之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包含本文所述之人類化輕鏈可變區(例如，在表3中)及/或本文所述之人類化重鏈可變區(例如，在表3中)。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包含本文所述之人類化重鏈可變區(例如，在表3中)，例如至少兩個本文所述之人類化重鏈可變區(例如，在表3中)。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域係包含表3胺基酸序列之輕鏈及重鏈的scFv。在實施例中，抗-CD19結合結構域(例如，scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有表3中所提供輕鏈可變區之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例 如，取代)的胺基酸序列，或與表3之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有表3中所提供重鏈可變區之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列，或與表3之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，編碼人類化抗-CD19結合結構域之核酸序列包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：72或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域係scFv，且包含例如表3中之本文所述胺基酸序列之輕鏈可變區經由連接體(例如，本文所述之連接體)附接至包含例如表3中之本文所述胺基酸序列的重鏈可變區。在一個實施例中，人類化抗-CD19結合結構域包括(Gly4-Ser)n連接體，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳3或4(SEQ ID NO：53)。ScFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。
在一個態樣中，抗原結合結構域部分包含一或多條選自SEQ ID NO：1-12之序列。在一個態樣中，人類化CAR選自一或多條選自SEQ ID NO：31-42之序列。在一些態樣中，非人類抗體經人類化，其中抗體之特定序列或區域經修飾以增加與在人類中天然產生之抗體或其片段之相似性。
人類化抗體可利用眾多種業內已知之技術來產生，該等技術包括(但不限於)CDR移植(例如，參見歐洲專利第EP 239,400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號，該等專利中每一者之全文皆以引用方式併入本文中)、鑲飾或表面重修(例如，參見歐洲專利第EP 592,106號及第EP 519,596號；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498；Studnicka等人，1994,Protein Engineering,7(6)：805-814；及Roguska等人，1994,PNAS,91：969-973，該等文獻中之每一者之全文皆以引用方式併入本文中)、鏈改組(例如，參見美國專利第5,565,332號，其全文以引用方式併入本文中)，及例如以下文獻中所揭示之技術：美國專利申請公開案第US2005/0042664號、美國專利申請公開案第US2005/0048617號、美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、國際公開案第WO 9317105號、Tan等人，J.Immunol.,169：1119-25(2002)；Caldas等人，Protein Eng.,13(5)：353-60(2000)；Morea等人，Methods,20(3)：267-79(2000)；Baca等人，J.Biol.Chem.,272(16)：10678-84(1997)；Roguska等人，Protein Eng.,9(10)：895-904(1996)；Couto等人，Cancer Res.,55(23增刊)：5973s-5977s(1995)；Couto等人，Cancer Res.,55(8)：1717-22(1995)；Sandhu J S,Gene,150(2)：409-10(1994)；及Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235(3)：959-73(1994)，該等文獻中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。通常，框架區中之框架殘基將經CDR供體抗體之相應殘基取代以改變(例如改良)抗原結合。該等框架取代係藉由業內熟知之方法來鑑別，例如藉由對CDR與框架殘基之相互作用建模以鑑別對抗原結合重要之框架殘基，及序列比較以鑑別具體位置處之不尋常框架殘基。(例如，參見Queen等人，美國專利第5,585,089號；及Riechmann等人，1988,Nature,332：323，其全文皆以引用方式併入本文中。)
人類化抗體或抗體片段中保留一或多個來自非人類來源之胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常稱為「導入」殘基，其通常取自「導入」可變結構域。如本文所提供，人類化抗體或抗體片段包含一或多個來自非人類免疫球蛋白分子之CDR及其中包含框架之胺基酸殘基完全或幾乎源自人類種系之框架區。用於人類化抗體或抗體片段之多種技術為業內所熟知，且基本上可遵循Winter及同事之方法(Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988))，藉由用齧齒類動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列，即CDR移植(EP 239,400；PCT公開案第WO 91/09967號；及美國專利第4,816,567號；第6,331,415號；第5,225,539號；第5,530,101號；第5,585,089號；第6,548,640號，該等專利之內容之全文皆以引用方式併入本文中)來實施。在該等人類化抗體及抗體片段中，實質上少於完整的人類可變結構域已經非人類物種之相應序列取代。人類化抗體通常為人類抗體，其中一些CDR殘基及可能一些框架(FR)殘基經來自齧齒類動物抗體中類似位點的殘基取代。抗體及抗體片段之人類化亦可藉由以下方式來達成：鑲飾或表面重修(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498；Studnicka等人，Protein Engineering,7(6)：805-814(1994)；及Roguska等人，PNAS,91：969-973(1994))或鏈改組(美國專利第5,565,332號)，該等文獻之內容之全文皆以引用方式併入本文中。
用於製備人類化抗體之人類可變結構域(輕鏈及重鏈二者)之選擇係用於降低抗原性。根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知人類可變結構域序列之整個文庫篩選齧齒類動物抗體之可變結構域之序列。最接近齧齒類動物序列之人類序列則公認為人類化抗體之人類框架(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol. Biol.,196：901(1987)，該等文獻之內容之全文皆以引用方式併入本文中)。另一方法利用源自輕鏈或重鏈之具體亞組之所有人類抗體共有序列之具體框架。同一框架可用於若干不同的人類化抗體(例如，參見Nicholson等人，Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993)，該等文獻之內容之全文皆以引用方式併入本文中)。在一些實施例中，重鏈可變區之框架區(例如，所有四個框架區)係源自VH4_4-59種系序列。在一個實施例中，框架區可包含一個、兩個、三個、四個或五個例如來自相應鼠類序列(例如，SEQ ID NO：59)之胺基酸之修飾，例如取代。在一個實施例中，輕鏈可變區之框架區(例如，所有四個框架區)係源自VK3_1.25種系序列。在一個實施例中，框架區可包含一個、兩個、三個、四個或五個例如來自相應鼠類序列(例如，SEQ ID NO：59)之胺基酸之修飾，例如取代。
在一些態樣中，包含抗體片段之本發明CAR組合物部分經人類化以保留針對靶抗原之高親和力及其他有利生物性質。根據本發明之一態樣，人類化抗體及抗體片段係利用親代及人類化序列之三維模型藉由分析親代序列及各種概念型人類化產物之製程來製備。三維免疫球蛋白模型通常可購得且為彼等熟習此項技術者所熟知。可使用電腦程式，該等電腦程式可說明並顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能的三維構象結構。藉由檢查該等顯示內容可分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能發揮中之可能作用，例如分析影響候選免疫球蛋白結合靶抗原之能力的殘基。以此方式，可自接受序列及導入序列中選擇並組合FR殘基以達成期望抗體或抗體片段特徵，例如對靶抗原之親和力增加。一般而言，CDR殘基直接且最為實質性地參與影響抗原結合。
人類化抗體或抗體片段可保留與原始抗體相似之抗原特異性，例如在本發明中結合人類CD19之能力。在一些實施例中，人類化抗 體或抗體片段可具有經改良之與人類CD19結合之親和力及/或特異性。
在一個態樣中，抗-CD19結合結構域之特徵在於抗體或抗體片段之具體功能特徵或性質。舉例而言，在一個態樣中，包含抗原結合結構域之本發明CAR組合物部分特異性結合人類CD19。在一個態樣中，抗原結合結構域具有與Nicholson等人，Mol.Immun.34(16-17)：1157-1165(1997)中所述之FMC63 scFv相同或相似的與人類CD19之結合特異性。在一個態樣中，本發明係關於包含抗體或抗體片段之抗原結合結構域，其中抗體結合結構域特異性結合至CD19蛋白或其片段，其中抗體或抗體片段包含包括SEQ ID NO：1-12或SEQ ID NO：59之胺基酸序列之可變輕鏈及/或可變重鏈。在一個態樣中，抗原結合結構域包含選自SEQ ID NO：1-12或SEQ ID NO：59之scFv之胺基酸序列。在某些態樣中，scFv與前導序列鄰接且處在同一閱讀框中。在一個態樣中，前導序列係以SEQ ID NO：13提供之多肽序列。
在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一個態樣中，抗-CD19結合結構域係Fv、Fab、(Fab')2或雙功能(例如雙特異性)雜交抗體(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一個態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強的親和力結合CD19蛋白。
在一些情況下，scFv可根據業內已知之方法製備(例如，參見Bird等人，(1988)Science 242：423-426及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。ScFv分子可藉由利用撓性多肽連接體將VH及VL區連接在一起來產生。scFv分子包含具有最佳化長度及/或胺基酸組成之連接體(例如，Ser-Gly連接體)。連接體長度可極大地影響scFv之可變區摺疊及相互作用之方式。事實上，若採用短多肽連接體(例如，介於5-10個胺基酸之間)，則會防止鏈內摺疊。亦需 要鏈間摺疊使兩個可變區一起形成功能表位結合位點。關於連接體定向及大小之實例參見例如Hollinger等人，1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448；美國專利申請公開案第2005/0100543號、第2005/0175606號、第2007/0014794號及PCT公開案第WO2006/020258號及第WO2007/024715號，該等文獻皆以引用方式併入本文中。
scFv可包含在其VL區與VH區之間至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個或更多個胺基酸殘基之連接體。連接體序列可包含任何天然胺基酸。在一些實施例中，連接體序列包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在另一實施例中，連接體序列包含甘胺酸及絲胺酸重複之集合，例如(Gly4Ser)n，其中n係等於或大於1之正整數(SEQ ID NO：18)。在一個實施例中，連接體可係(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：106)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：107)。連接體長度之變化可保留或增強活性，從而在活性研究中產生優異效能。
在一些實施例中，抗原結合結構域(或其他部分或整個CAR)之胺基酸序列可經修飾，例如本文所述胺基酸序列可例如藉由保守取代來修飾。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族，包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、具有β分枝側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。
一致性%在兩個或更多個核酸或多肽序列背景下係指兩條或更多 條相同之序列。在比較窗口內或指定區域內如利用以下序列比較算法中之一者或藉由人工比對及目視檢查所量測針對最大對應比較及比對時，若兩條序列具有相同胺基酸殘基或核苷酸之指定百分比(例如，在指定區域內、或在未指定時在整個序列內60%一致性，視情況70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性)，則兩條序列「實質上一致」。視情況，一致性存在於長度為至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域內，或更佳長度為100個至500個或1000個或更多個核苷酸(或20個、50個、200個或更多個胺基酸)之區域內。
就序列比較而言，一條序列通常用作參考序列與測試序列進行比較。當採用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列坐標，並指定序列算法程式參數。可採用缺省程式參數，或可指定替代參數。隨後，序列比較算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性%。對序列實施比對以供比較之方法為業內所熟知。可藉由(例如)以下方式對序列實施最佳比對以供比較：Smith及Waterman，(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源性算法；Needleman及Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443之同源性比對算法；Pearson及Lipman，(1988)Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA 85：2444之對相似性方法之探索；該等算法之電腦化執行方案(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)或人工比對及目視檢查(例如，參見Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology)。
適用於測定序列一致性及序列相似性百分數之算法之兩個實例 係BLAST及BLAST 2.0算法，其分別闡述於Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402；及Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用於實施BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。
兩條胺基酸序列之間之一致性%可使用已併入ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.4：11-17)之算法、使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來測定。 此外，兩條胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入GCG軟體包(在www.gcg.com上獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法、使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。
在一個態樣中，本發明涵蓋起始抗體或片段(例如，scFv)胺基酸序列之產生功能等效分子之修飾。舉例而言，包含在CAR中之抗-CD19結合結構域(例如，scFv)之VH或VL可經修飾以保留抗-CD19結合結構域(例如，scFv)之起始VH或VL框架區的至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。本發明涵蓋整個CAR構築體之修飾，例如CAR構築體之各個結構域之一或多條胺基酸序列之修飾以產生功能等效分子。CAR構築體可經修飾以保留起始CAR構築體之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。
雙特異性CAR
在實施例中，多特異性抗體分子係雙特異性抗體分子。雙特異性抗體具有針對不大於兩種抗原之特異性。雙特異性抗體分子之特徵在於具有針對第一表位之結合特異性之第一免疫球蛋白可變結構域序列及具有針對第二表位之結合特異性的第二免疫球蛋白可變結構域序列。在實施例中，第一及第二表位處在相同抗原(例如相同蛋白質(或多聚體蛋白之亞單位))上。在實施例中，第一與第二表位重疊。在實施例中，第一與第二表位不重疊。在實施例中，第一及第二表位處在不同抗原(例如，不同蛋白質(或多聚體蛋白之不同亞單位))上。在實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一表位之結合特異性之重鏈可變結構域序列及輕鏈可變結構域序列，及具有針對第二表位之結合特異性之重鏈可變結構域序列及輕鏈可變結構域序列。在實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一表位之結合特異性之半抗體，及具有針對第二表位之結合特異性的半抗體。在實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一表位之結合特異性之半抗體或其片段，及具有針對第二表位之結合特異性的半抗體或其片段。在實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一表位之結合特異性之scFv或其片段，及具有針對第二表位之結合特異性的scFv或其片段。
跨膜結構域
關於跨膜結構域，在多個實施例中，CAR可經設計以包含附接至CAR之細胞外結構域之跨膜結構域。跨膜結構域可包括一或多個毗鄰跨膜區之其他胺基酸，例如一或多個與衍生出跨膜之蛋白質之細胞外區域締合之胺基酸(例如細胞外區域之1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個直至15個胺基酸)及/或一或多個與衍生出跨膜蛋白的蛋白質之細胞內區域締合之其他胺基酸(例如細胞內區域之1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個直至15個胺基酸)。在一個態樣中，跨膜結構域係與CAR之其他結構域中之一 者締合之結構域，例如在一個實施例中，跨膜結構域可來自衍生出信號傳導結構域、共刺激結構域或鉸鏈結構域之相同蛋白質。在另一態樣中，跨膜結構域並非源自衍生出CAR之任何其他結構域之相同蛋白質。在一些情況下，跨膜結構域可藉由胺基酸取代選擇或修飾以避免該等結構域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域結合，例如以最小化與受體複合物之其他成員的相互作用。在一個態樣中，跨膜結構域能夠與CAR表現細胞之細胞表面上之另一CAR同二聚化。在不同態樣中，跨膜結構域之胺基酸序列可經修飾或取代以最小化與存在於同一CAR表現細胞上之天然結合伴侶之結合結構域的相互作用。
跨膜結構域可源自天然或重組來源。在來源為天然時，該結構域可源自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一個態樣中，每當CAR已結合至靶時，跨膜結構域皆能夠信號傳導至細胞內結構域。尤其用於本發明中之跨膜結構域可包括至少例如以下各項之跨膜區：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些實施例中，跨膜結構域可包括至少例如以下各項之跨膜區：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、 SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C。
在一些情況下，跨膜結構域可經由鉸鏈(例如，來自人類蛋白質之鉸鏈)附接至CAR之細胞外區域，例如CAR之抗原結合結構域。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈可係人類Ig(免疫球蛋白)鉸鏈(例如IgG4鉸鏈、IgD鉸鏈)、GS連接體(例如，本文所述之GS連接體)、KIR2DS2鉸鏈或CD8a鉸鏈。在一個實施例中，鉸鏈或間隔體包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列(例如，由其組成)。在一個態樣中，跨膜結構域包含SEQ ID NO：15之跨膜結構域(例如，由其組成)。
在一個態樣中，鉸鏈或間隔體包含IgG4鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔體包含以下胺基酸序列之鉸鏈：
Figure 104111176-A0202-12-0090-436
Figure 104111176-A0202-12-0090-437
(SEQ ID NO：45)。在一些實施例中，鉸鏈或間隔體包含由以下核苷酸序列編碼之鉸鏈：
Figure 104111176-A0202-12-0090-438
Figure 104111176-A0202-12-0091-439
Figure 104111176-A0202-12-0091-440
(SEQ ID NO：46)。
在一個態樣中，鉸鏈或間隔體包含IgD鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔體包含以下胺基酸序列之鉸鏈：
Figure 104111176-A0202-12-0091-441
(SEQ ID NO：47)。在一些實施例中，鉸鏈或間隔體包含由以下核苷酸 序列編碼之鉸鏈：
Figure 104111176-A0202-12-0091-442
Figure 104111176-A0202-12-0091-443
Figure 104111176-A0202-12-0092-444
(SEQ ID NO：48)。
在一個態樣中，跨膜結構域可為重組結構域，在該情形下其將主要包含疏水殘基，例如白胺酸及纈胺酸。在一個態樣中，可發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體位於重組跨膜結構域之每一端。
視情況，例如長度介於2個與10個胺基酸之間之短寡肽或多肽連接體可在CAR之跨膜結構域與細胞質區域之間形成連接。甘胺酸-絲胺酸雙聯體提供尤其適宜之連接體。舉例而言，在一個態樣中，連接體包含胺基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：49)。在一些實施例中，連接體係由核苷酸序列GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO：50)編碼。
在一個態樣中，鉸鏈或間隔體包含KIR2DS2鉸鏈。
細胞質結構域
CAR之細胞質結構域或區域包括細胞內信號傳導結構域。細胞內信號傳導結構域通常負責活化其中已引入CAR之免疫細胞之至少一種正常效應物功能。術語「效應物功能」係指細胞之特殊功能。例如，T細胞之效應物功能可為細胞溶解活性或輔助活性，包括分泌細胞介 素。因此，術語「細胞內信號傳導結構域」係指轉導效應物功能信號且定向細胞以實施特殊功能之蛋白質部分。儘管通常可採用整個細胞內信號傳導結構域，但在許多情形下無需使用整條鏈。就使用細胞內信號傳導結構域之截短部分而言，可使用該截短部分來替代完整鏈，只要其轉導效應物功能信號即可。因此，術語細胞內信號傳導結構域意欲包括細胞內信號傳導結構域之足以轉導效應物功能信號之任何截短部分。
用於本發明CAR中之細胞內信號傳導結構域之實例包括T細胞受體(TCR)及在抗原受體接合後協同起起始信號轉導作用之共受體的細胞質序列，以及該等序列之任何衍生物或變體及具有相同功能性能力之任何重組序列。
已知僅經由TCR產生之信號不足以完全活化T細胞，且亦需要第二次或共刺激信號。因此，可認為T細胞活化係藉由兩類不同的細胞質信號傳導序列來調介：經由TCR(初級細胞內信號傳導結構域)起始抗原依賴性初級活化之彼等，及以非抗原依賴性方式起提供第二次或共刺激信號(第二次細胞質信號傳導結構域，例如共刺激結構域)作用之彼等。
初級信號傳導結構域以刺激方式或以抑制方式調控TCR複合物之初次活化。以刺激方式起作用之初級細胞內信號傳導結構域可含有信號傳導基序，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。
尤其用於本發明中之含有ITAM之初級細胞內信號傳導結構域之實例包括以下各項之彼等：CD3 ζ、共有FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc E R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。在一個實施例中，本發明CAR包含細胞內信號傳導結構域，例如CD3-ζ之初級信號傳導結構域。
在一個實施例中，初級信號傳導結構域包含經修飾ITAM結構 域，例如與天然ITAM結構域相比已經改變(例如，增加或降低)之活性之突變ITAM結構域。在一個實施例中，初級信號傳導結構域包含經修飾含有ITAM之初級細胞內信號傳導結構域，例如最佳化及/或截短含有ITAM之初級細胞內信號傳導結構域。在實施例中，初級信號傳導結構域包含一個、兩個、三個、四個或更多個ITAM基序。
尤其用於本發明中之含有初級細胞內信號傳導結構域之分子之其他實例包括DAP10、DAP12及CD32之彼等。
CAR之細胞內信號傳導結構域可包括CD3-ζ信號傳導結構域本身，或其可與在本發明CAR背景下使用之任何其他期望細胞內信號傳導結構域組合。例如，CAR之細胞內信號傳導結構域可包含CD3 ζ鏈部分及共刺激信號傳導結構域。共刺激信號傳導結構域係指包含共刺激分子之細胞內結構域之CAR部分。共刺激分子係淋巴球有效因應抗原所需之除抗原受體或其配體外之細胞表面分子。該等分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配體及諸如此類。例如已展示，CD27共刺激增強活體外人類CART細胞之擴增、效應物功能及存活率，且增加活體內人類T細胞持久性及抗腫瘤活性(Song等人，Blood.2012；119(3)：696-706)。該等共刺激分子之其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、 2B4)、CD84、CD96(Tactile)、NKG2D、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp及CD19a。
本發明CAR之細胞質部分內之細胞內信號傳導序列可以隨機或指定順序彼此連接。視情況，例如長度介於2個與10個胺基酸(例如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸)之間之短寡肽或多肽連接體可在細胞內信號傳導序列之間形成連接。在一個實施例中，可使用甘胺酸-絲胺酸雙聯體作為適宜連接體。在一個實施例中，可使用單一胺基酸(例如，丙胺酸、甘胺酸)作為適宜連接體。
在一個態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包含兩個或更多個(例如，2個、3個、4個、5個或更多個)共刺激信號傳導結構域。 在實施例中，兩個或更多個(例如，2個、3個、4個、5個或更多個)共刺激信號傳導結構域藉由連接體分子(例如，本文所述之連接體分子)分開。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含兩個共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，連接體分子係甘胺酸殘基。在一些實施例中，連接體係丙胺酸殘基。
在一個態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及CD28之信號傳導結構域。在一個態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及4-1BB之信號傳導結構域。在一個態樣中，4-1BB之信號傳導結構域係SEQ ID NO：16之信號傳導結構域。在一個態樣中，CD3-ζ之信號傳導結構域係SEQ ID NO：17之信號傳導結構域。
在一個態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及CD27之信號傳導結構域。在一個態樣中，CD27之信 號傳導結構域包含胺基酸序列QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：51)。在一個態樣中，CD27之信號傳導結構域係由以下核酸序列編碼：
Figure 104111176-A0202-12-0096-445
Figure 104111176-A0202-12-0096-446
(SEQ ID NO：52)。
在一個態樣中，本文所述之CAR表現細胞可進一步包含第二CAR，例如，包括例如針對相同(CD19)或不同靶(例如，CD123或美索色林)之不同抗原結合結構域之第二CAR。在一個實施例中，當CAR表現細胞包含兩個或更多個不同CAR時，不同CAR之抗原結合結構域可使得抗原結合結構域不彼此相互作用。舉例而言，表現第一及第二CAR之細胞可具有不與第二CAR之抗原結合結構域形成締合之第一CAR之抗原結合結構域(例如，呈片段形式，例如scFv)，例如第二CAR之抗原結合結構域為VHH。
在另一態樣中，本文所述之CAR表現細胞可進一步表現另一藥劑，例如增強CAR表現細胞之活性之藥劑。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可係抑制抑制分子之藥劑。在一些實施例中，抑制分子(例如，PD1)可降低CAR表現細胞引起免疫效應物反應之能力。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。在一個實施例中，抑制抑制分子之藥劑包含例如抑制分子之與向細胞(例如，本文所述之細胞內信號傳導結構域)提供正信號之第二多肽締合之第一多肽。在一個實施例中，藥劑包含例如抑制分子(例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4 或TGFR β)或該等分子中任一者之片段(例如，該等分子中任一者之細胞外結構域之至少一部分)的第一多肽，及為本文所述之細胞內信號傳導結構域(例如，包含共刺激結構域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)及/或初級信號傳導結構域(例如，本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。在一個實施例中，藥劑包含PD1或其片段(例如PD1細胞外結構域之至少一部分)的第一多肽，及本文所述細胞內信號傳導結構域(例如，本文所述之CD28信號傳導結構域及/或本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)之第二多肽。PD1係亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA之受體之CD28家族的抑制成員。PD-1係在活化B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人，1996 Int.Immunol 8：765-75)。已展示針對PD1、PD-L1及PD-L2之兩個配體在結合至PD1後下調T細胞活化(Freeman等人，2000 J Exp Med 192：1027-34；Latchman等人，2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等人，2002 Eur J Immunol 32：634-43)。PD-L1在人類癌症中較為豐富(Dong等人2003 J Mol Med 81：281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother 54：307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10：5094)。免疫阻抑可藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。
在一個實施例中，藥劑包含抑制分子(例如程式化死亡配體1(PD1))之細胞外結構域(ECD)，其可融合至跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域(例如41BB及CD3 ζ)(在本文中亦稱為PD1 CAR)。在一個實施例中，PD1 CAR在與本文所述之CD19 CAR組合使用時會改良T細胞之持久性。在一個實施例中，CAR係包含PD1之細胞外結構域(如SEQ ID NO：121中加下劃線處所指示)之PD1 CAR。在一個實施例中，PD1 CAR包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列。
Figure 104111176-A0202-12-0097-447
Figure 104111176-A0202-12-0098-448
Figure 104111176-A0202-12-0098-449
(SEQ ID NO：121)。
在一個實施例中，PD1 CAR包含下文所提供之胺基酸序列(SEQ ID NO：119)。
Figure 104111176-A0202-12-0098-450
Figure 104111176-A0202-12-0098-451
(SEQ ID NO：119)。
在一個實施例中，藥劑包含編碼PD1 CAR(例如，本文所述之PD1 CAR)之核酸序列。在一個實施例中，針對PD1 CAR之核酸序列展示於下文中，且下文SEQ ID NO：120中加下劃線處為PD1 ECD。
Figure 104111176-A0202-12-0098-452
Figure 104111176-A0202-12-0099-453
Figure 104111176-A0202-12-0099-454
(SEQ ID NO：120)。
在另一態樣中，本發明提供CAR表現細胞(例如，CART細胞)群。在一些實施例中，CAR表現細胞群包含表現不同CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群可包括第一細胞，其表現具有本文所述抗-CD19結合結構域之CAR；及第二細胞，其表現具有不同抗-CD19結合結構域(例如，本文所述不同於第一細胞所表現之CAR之抗-CD19結合結構域的抗-CD19結合結構域)之CAR。作為另一實例，CAR表現細胞群可包括第一細胞，其表現包括抗-CD19結合結構域(例如，如本文所述)之CAR；及第二細胞，其表現包括針對除CD19外之靶(例如，CD123)之抗原結合結構域的CAR。在一個實施例中，CAR表現細胞群包括例如第一細胞，其表現包括初級細胞內信號傳導結構域之CAR；及第二細胞，其表現包括次級信號傳導結構域之CAR。
在另一態樣中，本發明提供細胞群，其中群中之至少一個細胞表現具有本文所述抗-CD19結合結構域之CAR，及表現另一藥劑(例如，增強CAR表現細胞之活性之藥劑)之第二細胞。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可係抑制抑制分子之藥劑。在一些實施例中，抑制分子可例如降低CAR表現細胞引起免疫效應物反應之能力。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如， CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β。在一個實施例中，抑制抑制分子之藥劑包含例如抑制分子之與向細胞(例如，本文所述之細胞內信號傳導結構域)提供正信號之第二多肽締合之第一多肽。 在一個實施例中，藥劑包含例如抑制分子(例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β)或該等分子中任一者之片段(例如，該等分子中任一者之細胞外結構域之至少一部分)的第一多肽，及為本文所述之細胞內信號傳導結構域(例如，包含共刺激結構域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)及/或初級信號傳導結構域(例如，本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。在一個實施例中，藥劑包含PD1或其片段(例如，PD1之細胞外結構域之至少一部分)之第一多肽，及本文所述之細胞內信號傳導結構域(例如，本文所述之CD28信號傳導結構域及/或本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)之第二多肽。
可調控嵌合抗原受體
在一些實施例中，其中可控制CAR活性之可調控CAR(RCAR)期望最佳化CAR療法之安全性及效能。存在可調控CAR活性之許多方式。舉例而言，可使用利用例如融合至二聚化結構域之半胱天冬酶之誘導型細胞凋亡(例如，參見Di Stasa等人，N Engl.J.Med.2011年11月3日；365(18)：1673-1683)作為本發明CAR療法中之安全開關。在一個實施例中，表現本發明CAR之細胞(例如，T細胞或NK細胞)進一步包含誘導型細胞凋亡開關，其中人類半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶9)或經修飾形式融合至人類FKB蛋白之容許條件二聚化之修飾。在小分子(例如雷帕黴素類似物(例如，AP 1903、AP20187))存在下，誘導型半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶9)經活化且引起表現本發明CAR之 細胞(例如，T細胞或NK細胞)快速凋亡及死亡。基於半胱天冬酶之誘導型細胞凋亡開關(或此一開關之一或多個態樣)之實例已闡述於例如US2004040047；US20110286980；US20140255360；WO1997031899；WO2014151960；WO2014164348；WO2014197638；WO2014197638中；該等專利中之全部皆以引用方式併入本文中。
在態樣中，RCAR包含多肽之集合，在最簡單實施例中通常為兩種多肽之集合，其中本文所述標準CAR之組份(例如，抗原結合結構域及細胞內信號傳導結構域)分配在單獨多肽或成員上。在一些實施例中，多肽之集合包括在二聚化分子存在時可使多肽彼此偶合(例如，可使抗原結合結構域偶合至細胞內信號傳導結構域)之二聚化開關。在一個實施例中，本發明CAR利用如例如WO2014127261中所述之彼等二聚化開關，該專利以引用方式併入本文中。
在態樣中，RCAR包含兩條多肽或成員：1)細胞內信號傳導構件，其包含細胞內信號傳導結構域(例如本文所述之初級細胞內信號傳導結構域)及第一開關結構域；2)抗原結合構件，其包含例如如本文所述靶向CD19之抗原結合結構域及第二開關結構域。視情況，RCAR包含本文所述之跨膜結構域。在實施例中，跨膜結構域可佈置於細胞內信號傳導構件上、抗原結合構件上或二者上。(除非另外指明，否則當於本文中闡述RCAR之成員或元件時，順序可如所提供，但亦包括其他順序。換言之，在實施例中，順序係如文中所闡釋，但在其他實施例中，順序可不同。例如，跨膜區一側上之元件之順序可與實例不同，例如開關結構域相對於細胞內信號傳導結構域之位置可不同，例如顛倒)。
在實施例中，第一及第二開關結構域可形成細胞內或細胞外二聚化開關。在實施例中，二聚化開關可係同二聚化開關，例如在第一 與第二開關結構域相同時；或異二聚化開關，例如在第一與第二開關結構域彼此不同時。
在實施例中，RCAR可包含「多開關」。多開關可包含異二聚化開關結構域或同二聚化開關結構域。在第一成員(例如，抗原結合構件)及第二成員(例如，細胞內信號傳導構件)上多開關獨立地包含複數個(例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個)開關結構域。在實施例中，第一成員可包含複數個第一開關結構域，例如基於FKBP之開關結構域，且第二成員可包含複數個第二開關結構域，例如基於FRB之開關結構域。在實施例中，第一成員可包含第一及第二開關結構域，例如基於FKBP之開關結構域及基於FRB之開關結構域，且第二成員可包含第一及第二開關結構域，例如基於FKBP之開關結構域及基於FRB之開關結構域。
在實施例中，細胞內信號傳導構件包含一或多個細胞內信號傳導結構域(例如初級細胞內信號傳導結構域)及一或多個共刺激信號傳導結構域。
在實施例中，抗原結合構件可包含一或多個細胞內信號傳導結構域，例如一或多個共刺激信號傳導結構域。在實施例中，抗原結合構件包含複數個(例如，2個或3個)例如選自41BB、CD28、CD27、ICOS及OX40之本文所述之共刺激信號傳導結構域，且在實施例中，不含初級細胞內信號傳導結構域。在實施例中，抗原結合構件自細胞外至細胞內方向包含以下共刺激信號傳導結構域：41BB-CD27；41BB-CD27；CD27-41BB；41BB-CD28；CD28-41BB；OX40-CD28；CD28-OX40；CD28-41BB；或41BB-CD28。在該等實施例中，細胞內結合構件包含CD3ζ結構域。在一個該實施例中，RCAR包含(1)抗原結合構件，其包含抗原結合結構域、跨膜結構域及兩個共刺激結構域及第一開關結構域；及(2)細胞內信號傳導結構域，其包含跨膜結構 域或膜系鏈結構域及至少一個初級細胞內信號傳導結構域及第二開關結構域。
實施例提供其中抗原結合構件並不系鏈至CAR細胞之表面之RCAR。此容許具有細胞內信號傳導構件之細胞便捷地與一或多個抗原結合結構域配對，而不使用編碼抗原結合構件之序列轉化細胞。在該等實施例中，RCAR包含：1)細胞內信號傳導構件，其包含：第一開關結構域、跨膜結構域、細胞內信號傳導結構域(例如，初級細胞內信號傳導結構域)及第一開關結構域；及2)抗原結合構件，其包含：抗原結合結構域及第二開關結構域，其中抗原結合構件不包含跨膜結構域或膜系鏈結構域，且視情況不包含細胞內信號傳導結構域。 在一些實施例中，RCAR可進一步包含3)第二抗原結合構件，其包含：第二抗原結合結構域，例如結合與抗原結合結構域所結合之抗原不同之抗原的第二抗原結合結構域；及第二開關結構域。
本文亦提供其中抗原結合構件包含雙特異性活化及靶向能力之RCAR。在此實施例中，抗原結合構件可包含複數個(例如，2個、3個、4個或5個)抗原結合結構域，例如scFv，其中每一抗原結合結構域結合至靶抗原，例如不同抗原或相同抗原，例如相同抗原上之相同或不同表位。在實施例中，複數個抗原結合結構域為串聯的，且視情況，連接體或鉸鏈區佈置在每一抗原結合結構域之間。適宜連接體及鉸鏈區闡述於本文中。
實施例提供具有容許增殖轉換之構形之RCAR。在此實施例中，RCAR包含：1)細胞內信號傳導構件，其包含：視情況跨膜結構域或膜系鏈結構域；一或多個例如選自41BB、CD28、CD27、ICOS及OX40之共刺激信號傳導結構域，及開關結構域；及2)抗原結合構件，其包含：抗原結合結構域、跨膜結構域及初級細胞內信號傳導結構域(例如，CD3ζ結構域)，其中抗原結合構件不包含開關結構域，或 不包含與細胞內信號傳導構件上之開關結構域二聚化之開關結構域。 在實施例中，抗原結合構件不包含共刺激信號傳導結構域。在實施例中，細胞內信號傳導構件包含來自同二聚化開關之開關結構域。在實施例中，細胞內信號傳導構件包含異二聚化開關之第一開關結構域，且RCAR包含包括異二聚化開關之第二開關結構域之第二細胞內信號傳導構件。在該等實施例中，第二細胞內信號傳導構件包含與細胞內信號傳導構件相同之細胞內信號傳導結構域。在實施例中，二聚化開關在細胞內。在實施例中，二聚化開關在細胞外。
在本文所述之任一RCAR構形中，第一及第二開關結構域包含如本文所述基於FKBP-FRB之開關。
本文亦提供包含本文所述RCAR之細胞。可使用經改造以表現RCAR之任何細胞作為RCARX細胞。在實施例中，RCARX細胞係T細胞，且稱為RCART細胞。在實施例中，RCARX細胞係NK細胞，且稱為RCARN細胞。
本文亦提供包含RCAR編碼序列之核酸及載體。編碼RCAR之不同元件之序列可佈置於相同核酸分子(例如相同質體或載體，例如病毒載體，例如慢病毒載體)上。在實施例中，(i)編碼抗原結合構件之序列及(ii)編碼細胞內信號傳導構件之序列可存在於同一核酸(例如，載體)上。例如可藉由使用單獨啟動子或藉由使用雙順反子轉錄產物(其可藉由裂解單一轉譯產物或藉由轉譯兩種單獨蛋白質產物產生兩種蛋白質)產生相應蛋白質。在實施例中，編碼可裂解肽之序列(例如，P2A或F2A序列)佈置於(i)與(ii)之間。在實施例中，編碼IRES(例如，EMCV或EV71 IRES)之序列佈置於(i)與(ii)之間。在該等實施例中，(i)及(ii)轉錄為單一RNA。在實施例中，第一啟動子可操作地連接至(i)且第二啟動子可操作地連接至(ii)，使得(i)及(ii)轉錄為單獨mRNA。
另一選擇為，編碼RCAR之不同元件之序列可佈置在不同核酸分子(例如不同質體或載體，例如病毒載體，例如慢病毒載體)上。例如，(i)編碼抗原結合構件之序列可存在於第一核酸(例如，第一載體)上，且(ii)編碼細胞內信號傳導構件之序列可存在於第二核酸(例如，第二載體)上。
二聚化開關
二聚化開關可為非共價或共價的。在非共價二聚化開關中，二聚化分子促進開關結構域之間之非共價相互作用。在共價二聚化開關中，二聚化分子促進開關結構域之間之共價相互作用。
在實施例中，RCAR包含基於FKBP/FRAP或基於FKBP/FRB之二聚化開關。FKBP12(FKBP或FK506結合蛋白)係用作天然產物免疫阻抑藥物雷帕黴素之初始細胞內靶之豐富細胞質蛋白。雷帕黴素結合至FKBP及大PI3K同源物FRAP(RAFT、mTOR)。FRB係FRAP之足以結合FKBP-雷帕黴素複合物之93胺基酸部分(Chen,J.、Zheng,X.F.、Brown,E.J.及Schreiber,S.L.(1995)Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue.Proc Natl Acad Sci USA 92：4947-51.)在實施例中，基於FKBP/FRAP(例如，基於FKBP/FRB)之開關可使用二聚化分子，例如雷帕黴素或雷帕黴素類似物。
FKBP之胺基酸序列如下：
Figure 104111176-A0202-12-0105-455
Figure 104111176-A0202-12-0105-456
(SEQ ID NO：122)
在實施例中，FKBP開關結構域可包含FKBP之在雷帕黴素或雷帕黴素類似物存在下具有與FRB或其片段或類似物結合能力之片段，例如SEQ ID NO：122之加下劃線部分，其係：
Figure 104111176-A0202-12-0106-457
Figure 104111176-A0202-12-0106-458
(SEQ ID NO：123)
FRB之胺基酸序列如下：ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(SEQ ID NO：124)
「基於FKBP/FRAP(例如，基於FKBP/FRB)之開關」當用於本文中時該術語係指包含以下各項之二聚化開關：第一開關結構域，其包含在雷帕黴素或雷帕黴素類似物(例如，RAD001)存在下具有與FRB或其片段或類似物結合能力之FKBP片段或其類似物，且與SEQ ID NO：122或123之FKBP序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與該序列相差不超過30個、25個、20個、15個、10個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸殘基；及第二開關結構域，其包含在雷帕黴素或雷帕黴素類似物存在下具有與FRB或其片段或類似物結合能力之FRB片段或其類似物，且與SEQ ID NO：124之FRB序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與該序列相差不超過30個、25個、20個、15個、10個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸殘基。在實施例中，本文所述之RCAR包含一個包含SEQ ID NO：122(或SEQ ID NO：123)中所揭示之胺基酸殘基之開關結構域，及一個包含SEQ ID NO：124中所揭示之胺基酸殘基的開關結構域。
在實施例中，FKBP/FRB二聚化開關包含在基於FRB之開關結構域(例如，經修飾FRB開關結構域)、基於FKBP之開關結構域與二聚化分子(例如雷帕黴素或雷帕黴素類似物，例如RAD001)之間展現改變的(例如，增強的)複合物形成之經修飾FRB開關結構域。在實施例中，經修飾FRB開關結構域包含一或多個突變，例如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個選自胺基酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105及F2108處之突變，其中野生型胺基酸突變成任何其他天然胺基酸。在實施例中，突變體FRB包含E2032處之突變，其中E2032突變成苯丙胺酸(E2032F)、甲硫胺酸(E2032M)、精胺酸(E2032R)、纈胺酸(E2032V)、酪胺酸(E2032Y)、異白胺酸(E2032I)(例如SEQ ID NO：125)或白胺酸(E2032L)(例如SEQ ID NO：126)。在實施例中，突變體FRB包含T2098處之突變，其中T2098突變成苯丙胺酸(T2098F)或白胺酸(T2098L)，例如SEQ ID NO：127。在實施例中，突變體FRB包含E2032及T2098處之突變，其中E2032突變成任何胺基酸，且其中T2098突變成任何胺基酸，例如SEQ ID NO：128。在實施例中，突變體FRB包含E2032I及T2098L突變，例如SEQ ID NO：129。在實施例中，突變體FRB包含E2032L及T2098L突變，例如SEQ ID NO：130。
Figure 104111176-A0202-12-0107-459
Figure 104111176-A0202-12-0108-460
其他適宜二聚化開關包括基於GyrB-GyrB之二聚化開關、基於赤黴素(Gibberellin)之二聚化開關、標籤/結合劑二聚化開關及halo標籤/snap標籤二聚化開關。遵循本文所提供之指導，熟習此項技術者將明瞭該等開關及相關二聚化分子。
二聚化分子
二聚化分子會促進開關結構域之間之締合。在二聚化分子存在下，開關結構域之間之相互作用或締合容許與第一開關結構域締合(例如，融合)之多肽與第二開關結構域締合(例如，融合)之多肽之間的信號轉導。在非限制性含量之二聚化分子存在下，信號轉導增加1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍，例如如本文所述之系統中所量測。
可使用雷帕黴素及雷帕黴素類似物(有時稱為雷帕黴素類似物)(例如，RAD001)作為本文所述基於FKBP/FRB之二聚化開關中之二聚化分子。在實施例中，二聚化分子可選自雷帕黴素(西羅莫司 (sirolimus))、RAD001(依維莫司)、咗他莫司(zotarolimus)、替西羅莫司、AP-23573(瑞達福羅莫司)、拜爾利莫司(biolimus)及AP21967。適於與基於FKBP/FRB之二聚化開關一起使用之其他雷帕黴素類似物進一步闡述於標題為「組合療法」之部分或標題為「實例性mTOR抑制劑」之子部分中。
分流CAR
在一些實施例中，CAR表現細胞利用分流CAR。分流CAR方式更詳細闡述於公開案WO2014/055442及WO2014/055657中。簡言之，分流CAR系統包含表現具有第一抗原結合結構域及共刺激結構域(例如，41BB)之第一CAR之細胞，且該細胞亦表現具有第二抗原結合結構域及細胞內信號傳導結構域(例如，CD3 ζ)之第二CAR。當該細胞遇到第一抗原時，活化共刺激結構域，且該細胞增殖。當該細胞遇到第二抗原時，活化細胞內信號傳導結構域且起始細胞殺死活性。因此，CAR表現細胞僅在兩種抗原存在下完全活化。
RNA轉染
本文揭示用於產生活體外轉錄RNA CAR之方法。本發明亦包括可直接轉染至細胞中之CAR編碼RNA構築體。產生用於轉染中之mRNA之方法可涉及使用特殊設計之引子活體外轉錄(IVT)模板，然後添加聚A，以產生長度通常為50-2000個鹼基之含有以下各項之構築體(SEQ ID NO：118)：3'及5'非轉譯序列(「UTR」)、5'帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、欲表現之核酸及聚A尾。由此產生之RNA可有效地轉染不同種類之細胞。在一個態樣中，模板包括針對CAR之序列。
在一個態樣中，抗-CD19 CAR係由信使RNA(mRNA)編碼。在一個態樣中，將編碼抗-CD19 CAR之mRNA引入免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)中，用於產生CAR表現細胞(例如，CART細胞或CAR NK細胞)。
在一個實施例中，活體外轉錄RNA CAR可以瞬時轉染形式引入細胞。RNA係利用聚合酶鏈式反應(PCR)產生之模板藉由活體外轉錄產生。來自任何來源之所關注DNA可利用適宜引子及RNA聚合酶藉由PCR直接轉化至模板中用於活體外mRNA合成。DNA之來源可係例如基因組DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或DNA之任何其他適宜來源。用於活體外轉錄之期望模板係本發明CAR。舉例而言，用於RNA CAR之模板包含包括抗腫瘤抗體之單鏈可變結構域之細胞外區域；鉸鏈區、跨膜結構域(例如，CD8a之跨膜結構域)；及包括細胞內信號傳導結構域(例如，包含CD3-ζ之信號傳導結構域及4-1BB之信號傳導結構域)之細胞質區域。
在一個實施例中，欲用於PCR之DNA含有開放閱讀框。DNA可來自生物體基因組之天然DNA序列。在一個實施例中，核酸可包括5'及/或3'非轉譯區(UTR)中之一些或所有。核酸可包括外顯子及內含子。在一個實施例中，欲用於PCR之DNA係人類核酸序列。在另一實施例中，欲用於PCR之DNA係包括5'及3' UTR之人類核酸序列。另一選擇為，DNA可係通常不在天然生物體中表現之人工DNA序列。實例性人工DNA序列係含有基因之連接在一起形成編碼融合蛋白之開放閱讀框之部分者。DNA之連接在一起之部分可來自單一生物體或一種以上之生物體。
使用PCR來產生用於活體外轉錄用於轉染之mRNA之模板。實施PCR之方法為業內所熟知。用於PCR中之引子經設計以具有實質上與欲用作PCR模板之DNA之區域互補的區域。如本文所用之「實質上互補」係指其中引子序列中之大部分或所有鹼基互補、或一或多個鹼基不互補或錯配之核苷酸序列。實質上互補之序列能夠在用於PCR之黏著條件下黏著或與預期DNA靶雜交。引子可經設計以實質上與DNA 模板之任一部分互補。舉例而言，引子可經設計以擴增核酸之通常在細胞中轉錄之部分(開放閱讀框)，包括5'及3' UTR。引子亦可經設計以擴增核酸之編碼所關注具體結構域之部分。在一個實施例中，引子經設計以擴增人類cDNA之編碼區，包括5'及3' UTR之所有或部分。可用於PCR之引子可藉由業內所熟知之合成方法來產生。「順向引子」係在欲擴增DNA序列上游之含有實質上與DNA模板上之核苷酸互補的核苷酸區域之引子。在本文中使用「上游」係指欲擴增DNA序列相對於編碼鏈之位置5。「反向引子」係在欲擴增DNA序列下游之含有實質上與雙鏈DNA模板互補之核苷酸區域之引子。在本文中使用「下游」係指欲擴增DNA序列相對於編碼鏈之位置3'。
可在本文所揭示之方法中使用可用於PCR之任何DNA聚合酶。試劑及聚合酶可自多種來源購得。
亦可使用具有促進穩定性及/或轉譯效率能力之化學結構。RNA較佳具有5'及3' UTR。在一個實施例中，5' UTR之長度介於1個與3000個核苷酸之間。欲添加至編碼區中之5'及3' UTR序列之長度可藉由不同方法來改變，該等方法包括(但不限於)設計黏著至UTR之不同區域之針對PCR之引子。利用此方式，熟習此項技術者可改變在轉錄RNA轉染後達成最佳轉譯效率所需之5'及3' UTR長度。
5'及3' UTR可係所關注核酸之天然內源性5'及3' UTR。另一選擇為，可藉由將UTR序列納入順向及反向引子中或藉由模板之任何其他修飾來添加不為所關注核酸內源之UTR序列。可使用不為所關注核酸內源之UTR序列來改變RNA之穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，已知3' UTR序列中富含AU之元件可降低mRNA之穩定性。因此，可基於業內熟知UTR之性質來選擇或設計3' UTR以增加轉錄RNA之穩定性。
在一個實施例中，5' UTR可含有內源核酸之Kozak序列。另一選擇為，當藉由如上文所述之PCR添加不為所關注核酸內源之5' UTR 時，可藉由添加5' UTR序列重新設計共有Kozak序列。Kozak序列可增加一些RNA轉錄本之轉譯效率，但似乎並不為所有RNA能夠有效轉譯所必需。業內已知對許多mRNA之Kozak序列之要求。在其他實施例中，5' UTR可係RNA基因組在細胞中穩定之RNA病毒之5'UTR。在其他實施例中，各種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR中以阻礙外切酶降解mRNA。
為能夠在不需要基因選殖的情況下自DNA模板合成RNA，應將轉錄之啟動子附接至欲轉錄序列之DNA模板上游。當將用作RNA聚合酶啟動子之序列添加至順向引子之5'端時，RNA聚合酶啟動子被納入欲轉錄開放閱讀框之PCR產物上游中。在一較佳實施例中，啟動子係T7聚合酶啟動子，如本文在別處所述。其他有用啟動子包括(但不限於)T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3及SP6啟動子之共有核苷酸序列為業內已知。
在較佳實施例中，mRNA在5'端及3'聚(A)尾上皆具有決定細胞中之核糖體結合、mRNA轉譯起始及穩定性之帽。在環形DNA模板(例如質體DNA)上，RNA聚合酶產生不適於在真核細胞中表現之長多聯產物。3' UTR端線性化之質體DNA之轉錄產生正常大小之mRNA，該mRNA即使在轉錄後經多腺苷酸化仍在真核轉染中無效。
在直鏈DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可將轉錄本之3'端延伸超出模板之最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf，Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)；Nacheva及Berzal-Herranz，Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003)。
將聚A/T段整合至DNA模板中之習用方法係分子選殖。然而，整合至質體DNA中之聚A/T序列可使質體不穩定，此係自細菌細胞獲得之質體DNA模板通常經缺失及其他畸變高度污染之原因。此使得選殖程序不僅費力且耗時，且通常使其不可靠。此係在不選殖情況下構築 具有聚A/T 3'段之DNA模板之方法高度合意之原因。
轉錄DNA模板之聚A/T區段可藉由以下方式來產生：在PCR期間藉由利用含有聚T尾(例如100T尾(SEQ ID NO：110))之反向引子(大小可為50-5000T(SEQ ID NO：111))，或在PCR後藉助任何其他方法(包括(但不限於)DNA連接或活體外重組)。聚(A)尾亦為RNA提供穩定性且減少其降解。通常，聚(A)尾之長度與轉錄RNA之穩定性呈正相關。在一個實施例中，聚(A)尾介於100個與5000個腺苷之間(SEQ ID NO：112)。
RNA之聚(A)尾可在活體外轉錄後利用聚(A)聚合酶(例如大腸桿菌聚A聚合酶(E-PAP))進一步延伸。在一個實施例中，將聚(A)尾之長度自100個核苷酸增加至介於300個與400個核苷酸之間(SEQ ID NO：90)使得RNA轉譯效率增加約兩倍。另外，不同化學基團至3'端之附接可增加mRNA穩定性。該附接可含有經修飾/人工核苷酸、適配體及其他化合物。例如，可利用聚(A)聚合酶將ATP類似物納入聚(A)尾中。 ATP類似物可進一步增加RNA之穩定性。
5'帽亦為RNA分子提供穩定性。在較佳實施例中，藉由本文所揭示方法產生之RNA包括5'帽。5'帽係利用業內已知及本文所述之技術提供(Cougot等人，Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)；Stepinski等人，RNA,7：1468-95(2001)；Elango等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005))。
藉由本文所揭示方法產生之RNA亦可含有內部核糖體進入位點(IRES)序列。IRES序列可係起始非帽依賴性核糖體與mRNA之結合且幫助轉譯起始之任何病毒、染色體或人工設計序列。可包括任何適用於細胞電穿孔之溶質，該等溶質可含有促進細胞滲透及活力之因子，例如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及表面活性劑。
可利用多種不同方法中之任一者(例如市售方法)將RNA引入靶細 胞中，該等方法包括(但不限於)電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、利用脂質轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚合物囊封、肽介導之轉染或生物彈射粒子遞送系統(例如「基因槍」)(例如，參見Nishikawa等人，Hum Gene Ther.,12(8)：861-70(2001)。
非病毒遞送方法
在一些態樣中，可利用非病毒方法將編碼本文所述CAR之核酸遞送至細胞或組織或個體中。
在一些實施例中，非病毒方法包括利用轉座子(亦稱為可轉座元件)。在一些實施例中，轉座子係可插入自身基因組中之位置處之DNA片段，例如能夠自我複製且將其拷貝插入基因組中之DNA片段，或可自較長核酸剪接出且插入基因組中之另一位置中之DNA片段。舉例而言，轉座子包含由反向重複側接基因構成之DNA序列用於換位。
利用轉座子之核酸遞送之實例性方法包括睡美人轉座子系統(SBTS)及piggyBac(PB)轉座子系統。例如，參見Aronovich等人，Hum.Mol.Genet.20.R1(2011)：R14-20；Singh等人，Cancer Res.15(2008)：2961-2971；Huang等人，Mol.Ther.16(2008)：580-589；Grabundzija等人，Mol.Ther.18(2010)：1200-1209；Kebriaei等人，Blood.122.21(2013)：166；Williams.Molecular Therapy 16.9(2008)：1515-16；Bell等人，Nat.Protoc.2.12(2007)：3153-65；及Ding等人，Cell.122.3(2005)：473-83，該等文獻中之所有皆以引用方式併入本文中。
SBTS包括兩種組份：1)含有轉基因之轉座子及2)轉座酶之來 源。轉座酶可使轉座子自載體質體(或其他供體DNA)換位至靶DNA，例如宿主細胞染色體/基因組。舉例而言，轉座酶結合至載體質體/供體DNA，自質體切割出轉座子(包括轉基因)，並將其插入宿主細胞之基因組中。例如，參見Aronovich等人，參見上文。
實例性轉座子包括基於pT2之轉座子。例如，參見Grabundzija等人，Nucleic Acids Res.41.3(2013)：1829-47；及Singh等人，Cancer Res.68.8(2008)：2961-2971，其皆以引用方式併入本文中。實例性轉座酶包括Tc1/水手(mariner)型轉座酶，例如SB10轉座酶或SB11轉座酶(可自例如巨細胞病毒啟動子表現之過度活性轉座酶)。例如，參見Aronovich等人；Kebriaei等人；及Grabundzija等人，該等文獻中之所有皆以引用方式併入本文中。
使用SBTS允許轉基因(例如編碼本文所述CAR之核酸)之有效整合及表現。本文提供例如利用轉座子系統(例如SBTS)產生穩定地表現本文所述CAR之細胞(例如，T細胞或NK細胞)的方法。
根據本文所述之方法，在一些實施例中，將一或多種含有SBTS組份之核酸(例如，質體)遞送至細胞(例如，T或NK細胞)。舉例而言，核酸係藉由標準核酸(例如，質體DNA)遞送方法(例如本文所述之方法，例如電穿孔、轉染或脂轉染)來遞送。在一些實施例中，核酸含有包含轉基因(例如，編碼本文所述CAR之核酸)之轉座子。在一些實施例中，核酸含有包含轉基因(例如，編碼本文所述CAR之核酸)以及編碼轉座酶之核酸序列的轉座子。在其他實施例中，提供含有兩種核酸之系統，例如雙質體系統，例如其中第一質體含有包含轉基因之轉座子且第二質體含有編碼轉座酶之核酸序列。舉例而言，第一及第二核酸係共遞送至宿主細胞中。
在一些實施例中，表現本文所述CAR之細胞(例如，T或NK細胞)係藉由使用利用SBTS之基因插入及利用核酸酶(例如，鋅指核酸酶 (ZFN)、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系統或經改造大範圍核酸酶重改造之歸巢核酸內切酶)之遺傳編輯的組合來產生。
在一些實施例中，使用非病毒遞送方法允許再程式化細胞(例如，T或NK細胞)，並將細胞直接輸注至個體中。非病毒載體之優點包括(但不限於)製造滿足患者群、儲存期間之穩定性及缺少免疫原性所需之足量之便捷性及相對較低之成本。
編碼CAR之核酸構築體
本發明亦提供編碼一或多種本文所述之CAR構築體之核酸分子。在一個態樣中，核酸分子係以信使RNA轉錄本提供。在一個態樣中，核酸分子係以DNA構築體提供。
因此，在一個態樣中，本發明係關於編碼嵌合抗原受體(CAR)之經分離核酸分子，其中CAR包含抗-CD19結合結構域(例如，人類化抗-CD19結合結構域)、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域(包含刺激結構域(例如共刺激信號傳導結構域)及/或初級信號傳導結構域(例如ζ鏈))。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域係本文所述之抗-CD19結合結構域，例如包含選自由以下組成之群之序列的抗-CD19結合結構域：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，跨膜結構域係選自由以下組成之群之蛋白質之跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜結構域包含SEQ ID NO：15之序列或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，抗-CD19結合結 構域藉由鉸鏈區(例如，本文所述之鉸鏈)聯結至跨膜結構域。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，經分離核酸分子進一步包含編碼共刺激結構域之序列。在一個實施例中，共刺激結構域係選自由以下組成之群之蛋白質之功能性信號傳導結構域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。在一個實施例中，共刺激結構域包含SEQ ID NO：16之序列或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含4-1BB之功能性信號傳導結構域及CD3 ζ之功能性信號傳導結構域。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之序列或與其具有95%-99%一致性之序列，及SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列或與其具有95%-99%一致性之序列，其中包含細胞內信號傳導結構域之序列係在同一框架中且以單一多肽鏈形式表現。
在另一態樣中，本發明係關於編碼CAR構築體之經分離核酸分子，該CAR構築體包含SEQ ID NO：13之前導序列；具有選自由以下組成之群之序列之scFv結構域：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59(或與其具有95%-99%一致性之序列)；SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49(或與其具有95%-99%一致性之序列)之鉸鏈區；具有SEQ ID NO：15之序列(或與其具有95%-99%一致性之序列)之跨膜結構域；具有SEQ ID NO：16之序列之4-1BB共刺激結構域或具有SEQ ID NO：51之序列(或與其具有95%-99%一致性之序列)的CD27共刺激結構域；及具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列(或與其具有95%-99%一致性 之序列)之CD3 ζ刺激結構域。
在另一態樣中，本發明係關於由核酸分子編碼之經分離多肽分子。在一個實施例中，經分離多肽分子包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：59或與其具有95%-99%一致性之序列。
在另一態樣中，本發明係關於編碼嵌合抗原受體(CAR)分子之核酸分子，該嵌合抗原受體(CAR)分子包含抗-CD19結合結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域(包含刺激結構域)，且其中該抗-CD19結合結構域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59或與其具有95%-99%一致性之序列。
在一個實施例中，經編碼CAR分子進一步包含編碼共刺激結構域之序列。在一個實施例中，共刺激結構域係選自由以下組成之群之蛋白質之功能性信號傳導結構域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)。在一個實施例中，共刺激結構域包含SEQ ID NO：16之序列。在一個實施例中，跨膜結構域係選自由以下組成之群之蛋白質之跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜結構域包含SEQ ID NO：15之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含4-1BB之功能性信號傳導結構域及ζ之功能性信號傳導結構域。在一個實施例中，細胞內信號 傳導結構域包含SEQ ID NO：16之序列及SEQ ID NO：17之序列，其中包含細胞內信號傳導結構域之序列係在同一框架中且以單一多肽鏈形式表現。在一個實施例中，抗-CD19結合結構域藉由鉸鏈區聯結至跨膜結構域。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：14。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49。
在另一態樣中，本發明係關於經編碼CAR分子，其包含SEQ ID NO：13之前導序列；具有選自由以下組成之群之序列之scFv結構域：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：59或與其具有95%-99%一致性之序列；SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49之鉸鏈區；具有SEQ ID NO：15之序列之跨膜結構域；具有SEQ ID NO：16之序列之4-1BB共刺激結構域或具有SEQ ID NO：51之序列的CD27共刺激結構域；及具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：43之序列之CD3 ζ刺激結構域。在一個實施例中，經編碼CAR分子包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：59或與其具有95%-99%一致性之序列。
編碼期望分子之核酸序列可利用業內已知之重組方法來獲得，例如利用標準技術藉由自表現該基因之細胞篩選文庫、自已知包括該基因之載體衍生出基因或自含有該基因之細胞及組織直接分離來獲得。另一選擇為，所關注基因可以合成方式而非選殖來產生。
本發明亦提供其中插入本發明DNA之載體。源自逆轉錄病毒(例 如慢病毒)之載體係達成長期基因轉移之適宜工具，此乃因其容許轉基因長期穩定整合及其在子細胞中繁殖。慢病毒載體比源自致癌逆轉錄病毒(例如鼠類白血病病毒)之載體的額外優點在於，其可轉導非增殖細胞(例如肝細胞)。其亦具有低免疫原性之額外優點。逆轉錄病毒載體亦可係例如γ逆轉錄病毒載體。γ逆轉錄病毒載體可包括例如啟動子、封裝信號(ψ)、引子結合位點(PBS)、一或多個(例如，兩個)長末端重複(LTR)及所關注轉基因(例如，編碼CAR之基因)。γ逆轉錄病毒載體可能缺少病毒結構基因，例如gag、pol及env。實例性γ逆轉錄病毒載體包括鼠類白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)及骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)及源自其之載體。其他γ逆轉錄病毒載體闡述於例如Tobias Maetzig等人，「Gammaretroviral Vectors：Biology,Technology and Application」Viruses.2011年6月；3(6)：677-713中。
在另一實施例中，包含編碼本發明期望CAR之核酸之載體係腺病毒載體(A5/35)。在另一實施例中，編碼CAR之核酸之表現可利用轉座子(例如睡美人、crisper、CAS9及鋅指核酸酶)來實現。參見下文June等人，2009 Nature Reviews Immunology 9.10：704-716，其係以引用方式併入本文中。
在簡述中，編碼CAR之天然或合成核酸之表現通常係藉由將編碼CAR多肽或其部分之核酸可操作地連接至啟動子並將構築體納入表現載體中來達成。載體可適於在真核生物中複製及整合。典型選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及可用於調控期望核酸序列表現之啟動子。
本發明之表現構築體亦可利用標準基因遞送方案用於核酸免疫及基因療法。用於基因遞送之方法為業內已知。例如，參見美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，該等專利之全文皆以引用方式併入本文中。在另一實施例中，本發明提供基因療法載 體。
核酸可選殖至多種類型之載體中。舉例而言，核酸可選殖至包括(但不限於)以下各項之載體中：質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏粒。尤其受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及測序載體。
此外，可向細胞提供呈病毒載體形式之表現載體。病毒載體技術為業內所熟知且闡述於例如Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包括(但不限於)逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒及慢病毒。一般而言，適宜載體含有在至少一種生物體中發揮功能之複製起點、啟動子序列、方便的限制性核酸內切酶位點及一或多個選擇標記物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
已研發多種基於病毒之系統用於至哺乳動物細胞中之基因轉移。舉例而言，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供方便的平臺。可利用業內已知技術將所選基因插入載體中且封裝在逆轉錄病毒粒子中。然後可以活體內或離體方式將重組病毒分離並遞送至個體細胞中。多種逆轉錄病毒系統為業內已知。在一些實施例中，使用腺病毒載體。多種腺病毒載體為業內已知。在一個實施例中，使用慢病毒載體。
其他啟動子元件(例如增強子)調控轉錄起始之頻率。通常，該等元件位於起始位點上游之30-110bp區域中，但已顯示多種啟動子亦含有位於起始位點下游之功能元件。啟動子元件之間之間距通常較靈活，以使得在相對於彼此插入或移動元件時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間之間距可在活性開始下降之前增加至50bp。端視啟動子，似乎個別元件可協同或獨立地發揮活化轉 錄之功能。實例性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。
能夠在哺乳動物T細胞中表現CAR轉基因之啟動子之實例係EF1a啟動子。天然EF1a啟動子驅動負責將胺基醯基tRNA酶促遞送至核糖體之延伸因子-1複合物之α亞單位的表現。EF1a啟動子已廣泛地用於哺乳動物表現質體中，且已展示可有效地驅動來自選殖至慢病毒載體中之轉基因之CAR表現。例如，參見Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)。在一個態樣中，EF1a啟動子包含以SEQ ID NO：100提供之序列。
啟動子之另一實例係立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列係係能夠驅動與其可操作地連接之任何多核苷酸序列之高表現量的強組成型啟動子序列。然而，亦可使用其他組成型啟動子序列，包括(但不限於)猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺失病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子以及人類基因啟動子，例如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、延伸因子-1α啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明應不限於使用組成型啟動子。亦涵蓋誘導型啟動子作為本發明之一部分。使用誘導型啟動子提供能夠在期望該表現時啟動可操作地連接之多核苷酸序列的表現或在不期望該表現時關閉表現之分子開關。誘導型啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
載體亦可包括例如促進分泌之信號序列、多腺苷酸化信號及轉錄終止子(例如來自牛生長激素(BGH)基因)、容許進行附加型複製及在原核生物中複製之元件(例如SV40來源及ColE1或其他業內已知者) 以及容許進行選擇之元件(例如胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因及/或博來黴素(zeocin)標記物)。
為評價CAR多肽或其部分之表現，欲引入細胞中之表現載體亦可含有選擇標記物基因或報導基因或二者，以幫助自欲經由病毒載體轉染或感染所尋求之細胞群鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，選擇標記物可攜載於DNA之單獨片段上且用於共轉染程序中。選擇標記物及報導基因二者可側接有適宜調控序列以使得能夠在宿主細胞中表現。有用可選標記物包括(例如)抗生素抗性基因，例如neo及諸如此類。
報導基因係用於鑑別潛在轉染之細胞且用於評估調控序列之功能。一般而言，報導基因係不存在於接受者生物體或組織中或不由其表現且編碼其表現係由一些可容易檢測之性質(例如酶促活性)呈現之多肽的基因。報導基因之表現係在將DNA引入接受者細胞中後在適宜時間下分析。適宜報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479：79-82)。適宜表現系統為一般所熟知且可利用已知技術製備或以商業方式獲得。一般而言，將顯示報導基因之最高表現量之具有最小5'側接區之構築體鑑別為啟動子。可將該等啟動子區域連接至報導基因且用於評估藥劑調節啟動子驅動之轉錄之能力。
業內已知將基因引入細胞中且在細胞中表現之方法。在表現載體之背景下，可藉由業內之任何方法將該載體容易地引入宿主細胞(例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞)中。例如，可藉由物理、化學或生物方式將表現載體轉移至宿主細胞中。
用於將多核苷酸引入宿主細胞中之物理方法包括硫酸鈣沈澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及諸如此類。用於產生包含 載體及/或外源核酸之細胞之方法為業內所熟知。例如，參見Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)。用於將多核苷酸引入宿主細胞中之較佳方法係磷酸鈣轉染。
用於將所關注多核苷酸引入宿主細胞中之生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體且尤其逆轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入哺乳動物(例如人類)細胞中之方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、皰疹單純型病毒I、腺病毒及腺相關病毒及諸如此類。例如，參見美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。
用於將多核苷酸引入宿主細胞中之化學方式包括膠質分散系統，例如大分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之實例性膠質系統係脂質體(例如人工膜囊泡)。可獲得目前最佳技術靶向遞送核酸之其他方法，例如使用靶向微粒子或其他適宜亞微米大小之遞送系統遞送多核苷酸。
在利用非病毒遞送系統之情形下，實例性遞送媒劑係脂質體。 涵蓋使用脂質調配物將核酸引入宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質締合。與脂質締合之核酸可囊封於脂質體之水性內部，散置在脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸二者締合之連接分子附接至脂質體，包埋於脂質體中，與脂質體複合，分散在含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，以懸浮液形式含於脂質中，含有膠束或與其複合或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合之組合物並不限於溶液中之任何具體結構。舉例而言，其可以雙層結構、膠束或「塌陷」結構存在。其亦可簡單地散置於溶液中，可能形成大小或形狀不均勻之聚集物。脂質係可為天然或合成脂質之脂肪物質。舉例而言，脂質包括 天然存在於細胞質中之脂肪小滴以及含有長鏈脂肪族烴及其衍生物之化合物類別，例如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛。
適於使用之脂質可自商業來源獲得。舉例而言，雙十四烷基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可自Sigma,St.Louis,MO獲得；磷酸雙十六烷基酯(「DCP」)可自K & K Laboratories(Plainview,NY)獲得；膽固醇(「Choi」)可自Calbiochem-Behring獲得；雙十四烷基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可自Avanti Polar Lipids公司(Birmingham,AL.)獲得。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中之儲備溶液可儲存在約-20℃下。使用氯仿作為唯一溶劑，此乃因其比甲醇更容易蒸發。「脂質體」係涵蓋多種藉由產生封閉脂質雙層或聚集物形成之單一及多層脂質媒劑的一般術語。脂質體之特徵可在於具有磷脂雙層膜及內部水性介質之囊泡狀結構。多層脂質體具有多個藉由水性介質分開之脂質層。其係在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發形成。脂質組份在閉合結構形成之前經受自我重排且將水及所溶解溶質包埋在脂質雙層之間(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡狀結構不同之結構之組合物。舉例而言，脂質可呈膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋lipofectamine-核酸複合物。
無論將外源核酸引入宿主細胞中所使用之方法抑或以其他方式將細胞暴露於本發明抑制劑下，為確認在宿主細胞中存在重組DNA序列，可實施多種分析。該等分析包括例如彼等熟習此項技術者所熟知之「分子生物學」分析，例如南方墨點(Southern blotting)及北方墨點(Northern blotting)、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，例如檢測具體肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點)或藉由本文所闡述之分析，以鑑別屬本發明範疇內之藥劑。
本發明進一步提供包含編碼CAR之核酸分子之載體。在一個態樣 中，CAR載體可直接轉導至細胞(例如T細胞)中。在一個態樣中，載體係選殖或表現載體，例如包括(但不限於)以下各項之載體：一或多種質體(例如表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、逆轉錄病毒及慢病毒載體構築體。在一個態樣中，載體能夠在哺乳動物T細胞表現CAR構築體。在一個態樣中，哺乳動物T細胞係人類T細胞。
細胞之來源
在擴增及遺傳修飾或其他修飾之前，自個體獲得細胞(例如T細胞或天然殺手(NK)細胞)之來源。術語「個體」意欲包括其中可誘發免疫反應之活的生物體(例如哺乳動物)。個體之實例包括人類、猴、黑猩猩、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。T細胞可自多種來源獲得，該等來源包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、胸膜滲出液、脾組織及腫瘤。
在本發明之某些態樣中，免疫效應細胞(例如T細胞)可自利用任何數量之熟習此項技術者已知之技術(例如FicollTM分離)自個體收集之一單位血液獲得。在一較佳態樣中，來自個體循環血液之細胞係藉由血球分離獲得。血球分離產物通常含有淋巴球(包括T細胞)、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球及血小板。在一個態樣中，藉由血球分離收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分，且視情況使細胞置於適宜緩衝液或培養基中用於後續處理步驟。在一個實施例中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在替代實施例中，洗滌溶液缺少鈣且可缺少鎂或可缺少許多但非所有二價陽離子。
在鈣不存在下之初始活化步驟可使得活化放大。如彼等熟習此項技術者將容易地瞭解，洗滌步驟可藉由彼等業內已知之方法完成，例如根據製造商之說明書藉由利用半自動「無逆流」離心機(例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5) 來完成。洗滌後，可將細胞重懸浮於多種生物相容性緩衝液中，例如不含Ca之PBS、不含Mg之PBS、PlasmaLyte A或其他含或不含緩衝液之鹽水溶液。另一選擇為，可移除血球分離樣品之不期望組份且將細胞直接重懸浮於培養基中。
在一個態樣中，藉由溶解紅血球且清除單核球自外周血淋巴球分離T細胞，例如藉由PERCOLLTM梯度離心或藉由逆流離心淘析來分離。
本文所述之方法可包括例如利用例如陰性選擇技術(例如本文所述)選擇為T調控細胞清除群之特定免疫效應細胞(例如，T細胞)亞群CD25+清除細胞。較佳地，T調控清除細胞之群含有少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%之CD25+細胞。
在一個實施例中，利用抗-CD25抗體或其片段或CD25結合配體IL-2自該群移除T調控細胞(例如，CD25+ T細胞)。在一個實施例中，抗-CD25抗體或其片段或CD25結合配體偶聯至受質(例如，珠粒)，或以其他方式包覆於受質(例如，珠粒)上。在一個實施例中，抗-CD25抗體或其片段偶聯至如本文所述之受質。
在一個實施例中，利用來自MiltenyiTM之CD25清除試劑自該群移除T調控細胞(例如，CD25+ T細胞)。在一個實施例中，細胞對CD25清除試劑之比率為1e7個細胞對20μL、或1e7個細胞對15μL、或1e7個細胞對10μL、或1e7個細胞對5μL、或1e7個細胞對2.5μL、或1e7個細胞對1.25μL。在一個實施例中，例如對於T調控細胞(例如，CD25+清除)使用大於5億個細胞/ml。在另一態樣中，使用6億、7億、8億或9億個細胞/ml之細胞濃度。
在一個實施例中，欲清除之免疫效應細胞群包括約6×109個CD25+ T細胞。在其他態樣中，欲清除之免疫效應細胞群包括約1×109至1×1010個CD25+ T細胞及其間之任一整數值。在一個實施例 中，所得群T調控清除細胞具有2×109個T調控細胞(例如，CD25+細胞)或更少(例如，1×109個、5×108個、1×108個、5×107個、1×107個或更少之CD25+細胞)。
在一個實施例中，利用CliniMAC系統與清除管設置(例如管162-01)自該群移除T調控細胞(例如，CD25+細胞)。在一個實施例中，在清除環境(例如DEPLETION2.1)上運行CliniMAC系統。
不希望受限於具體理論，在血球分離之前或在製造CAR表現細胞產物期間減少個體中免疫細胞之陰性調節劑之含量(例如，減少不期望免疫細胞(例如，TREG細胞)之數量)可降低個體復發之風險。舉例而言，清除TREG細胞之方法為業內已知。減少TREG細胞之方法包括(但不限於)環磷醯胺、抗-GITR抗體(本文所述之抗-GITR抗體)、CD25清除及其組合。
在一些實施例中，製造方法包含在製造CAR表現細胞之前減少(例如，清除)TREG細胞之數量。舉例而言，製造方法包含使樣品(例如，血球分離樣品)與抗-GITR抗體及/或抗-CD25抗體(或其片段或CD25結合配體)接觸，例如以在製造CAR表現細胞(例如，T細胞、NK細胞)產物之前清除TREG細胞。
在實施例中，用一或多種減少TREG細胞之療法預治療個體，然後收集細胞用於CAR表現細胞產物製造，由此降低個體對CAR表現細胞治療復發之風險。在實施例中，減少TREG細胞之方法包括(但不限於)向個體投與環磷醯胺、抗-GITR抗體、CD25清除或其組合中之一或多者。投與環磷醯胺、抗-GITR抗體、CD25清除或其組合中之一或多者可發生在輸注CAR表現細胞產物之前、期間或之後。
在實施例中，用環磷醯胺預治療個體，然後收集細胞用於CAR表現細胞產物製造，由此降低個體對CAR表現細胞治療復發之風險。在實施例中，用抗-GITR抗體預治療個體，然後收集細胞用於CAR表現 細胞產物製造，由此降低個體對CAR表現細胞治療復發之風險。
在一個實施例中，欲移除之細胞群並非調控T細胞或腫瘤細胞，而是以其他方式對CART細胞(例如表現CD14、CD11b、CD33、CD15或由潛在免疫阻抑細胞表現之其他標記物的細胞)之擴增及/或功能造成消極影響的細胞。在一個實施例中，設想該等細胞與調控T細胞及/或腫瘤細胞同時移除，或在該清除後移除，或以另一順序移除。
本文所述之方法可包括一個以上之選擇步驟，例如一個以上之清除步驟。可藉由陰性選擇與例如針對為陰性選擇細胞所獨有之表面標記物之抗體的組合完成T細胞群之富集。一種方法係經由負磁免疫黏附或流式細胞術使用針對存在於陰性選擇細胞上之細胞表面標記物之單株抗體的混合物之細胞分選及/或選擇。舉例而言，為藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物可包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。
本文所述之方法可進一步包括自表現腫瘤抗原(例如不包含CD25、例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b之腫瘤抗原)之群移除細胞，由此提供適於表現CAR(例如，本文所述之CAR)之T調控清除細胞(例如，CD25+清除細胞)及腫瘤抗原清除細胞的群。在一個實施例中，腫瘤抗原表現細胞係與T調控細胞(例如，CD25+細胞)同時移除。舉例而言，抗-CD25抗體或其片段及抗腫瘤抗原抗體或其片段可附接至相同受質(例如，珠粒)，其可用於移除細胞，或抗-CD25抗體或其片段或抗腫瘤抗原抗體或其片段可附接至單獨珠粒，其混合物可用於移除細胞。在其他實施例中，T調控細胞(例如，CD25+細胞)之移除及腫瘤抗原表現細胞之移除係依序進行，且可例如以任一順序進行。
亦提供包括以下步驟之方法：自表現檢查點抑制劑(例如本文所述之檢查點抑制劑)之群移除細胞(例如PD1+細胞、LAG3+細胞及 TIM3+細胞中之一或多者)，由此提供T調控清除細胞(例如，CD25+清除細胞)及檢查點抑制劑清除細胞(例如，PD1+、LAG3+及/或TIM3+清除細胞)之群。實例性檢查點抑制劑包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA及LAIR1。在一個實施例中，檢查點抑制劑表現細胞係與T調控細胞(例如，CD25+細胞)同時移除。舉例而言，抗-CD25抗體或其片段及抗檢查點抑制劑抗體或其片段可附接至相同珠粒，其可用於移除細胞，或抗-CD25抗體或其片段及抗檢查點抑制劑抗體或其片段可附接至單獨珠粒，其混合物可用於移除細胞。在其他實施例中，T調控細胞(例如，CD25+細胞)之移除及檢查點抑制劑表現細胞之移除係依序進行，且可例如以任一順序進行。
本文所述之方法可包括陽性選擇步驟。舉例而言，T細胞可藉由與抗-CD3/抗-CD28(例如，3×28)偶聯之珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以對期望T細胞進行陽性選擇之時間段來分離。在一個實施例中，時間段為約30分鐘。在另一實施例中，時間段介於30分鐘至36小時或更長及其間之所有整數值範圍內。在另一實施例中，時間段為至少1小時、2小時、3小時、4小時、5小時或6小時。在另一實施例中，時間段為10小時至24小時，例如24小時。在與其他細胞類型相比T細胞極少的任何情況下(例如在自腫瘤組織或自免疫受損個體分離腫瘤浸潤淋巴球(TIL)中)，可利用較長培育時間來分離T細胞。此外，利用較長培育時間可增加捕獲CD8+ T細胞之效率。因此，藉由簡單地縮短或延長時間可使T細胞與CD3/CD28珠粒結合，及/或藉由增加或減小珠粒對T細胞之比率(如本文進一步所述)，可在培養起始時或該過程期間之其他時間點優先選擇或不選擇T細胞亞群。另外，藉由增加或減少珠粒或其他表面上之抗-CD3及/或抗- CD28抗體之比率，可在培養起始時或其他期望時間點優先選擇或不選擇T細胞亞群。
在一個實施例中，可選擇表現以下中之一或多者之T細胞群：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B及穿孔蛋白或其他適宜分子，例如其他細胞介素。可藉由例如PCT公開案第WO 2013/126712號中所述之方法來確定用於細胞表現之篩選方法。
為藉由陽性或陰性選擇來分離期望細胞群，可改變細胞及表面(例如粒子，例如珠粒)之濃度。在某些態樣中，可期望顯著減小珠粒及細胞混合在一起之體積(例如增加細胞之濃度)，以確保細胞與珠粒之最大接觸。舉例而言，在一個態樣中，使用100億個細胞/ml、90億/ml、80億/ml、70億/ml、60億/ml或50億/ml之濃度。在一個態樣中，使用10億個細胞/ml之濃度。在另一態樣中，使用75百萬、80百萬、85百萬、90百萬、95百萬或100百萬個細胞/ml之細胞濃度。在其他態樣中，可使用125百萬或150百萬個細胞/ml之濃度。
利用高濃度可增加細胞產率、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可更有效地捕獲可弱表現所關注靶抗原之細胞，例如CD28陰性T細胞，或來自存在許多腫瘤細胞之樣品(例如白血病血液、腫瘤組織等)。該等細胞群可具有治療值且將期望獲得。舉例而言，利用高濃度之細胞可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在相關態樣中，可期望使用較低濃度之細胞。藉由大量稀釋T細胞與表面(例如粒子，例如珠粒)之混合物，最小化粒子與細胞之間之相互作用。此選擇表現大量與粒子結合之期望抗原之細胞。舉例而言，稀釋濃度之CD4+ T細胞比CD8+ T細胞表現更高量之CD28且更有效地被捕獲。在一個態樣中，所用細胞之濃度為5×106/ml。在其他 態樣中，所用濃度可為約1×105/ml至1×106/ml及其間之任一整數值。
在其他態樣中，可在2℃-10℃或在室溫下在旋轉器上以不同速度將細胞培育不同時間長度。
亦可在洗滌步驟後冷凍用於刺激之T細胞。不希望受限於理論，冷凍及後續解凍步驟藉由在細胞群中移除顆粒球且在一定程度上移除單核球來提供更均勻之產物。在移除血漿及血小板之洗滌步驟後，可將細胞懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為業內已知且可用於此背景下，但一種方法涉及利用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO或31.25% PlasmaLyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基或其他含有例如羥乙基澱粉及Plasmalyte A之適宜細胞冷凍培養基，然後以1°/分鐘之速率將細胞冷凍至-80℃且儲存在液氮儲存罐之氣相中。可使用其他受控冷凍方法以及在-20℃下或液氮中之立即不受控冷凍。
在某些態樣中，如本文所述將冷藏保存之細胞解凍且洗滌並在室溫下靜置1小時，然後利用本發明方法進行活化。
本發明亦涵蓋在可能需要如本文所述之擴增細胞之前之一定時間段下自個體收集血液樣品或血球分離產物。因此，可在任何所需時間點下收集欲擴增細胞之來源及期望細胞(例如T細胞)，分離且冷凍，以供後期於免疫效應細胞療法中用於任何數量之將受益於免疫效應細胞療法之疾病或病況(例如本文所述之彼等)。在一個態樣中，血液樣品或血球分離物係取自一般健康個體。在某些態樣中，血液樣品或血球分離物係取自具有罹患疾病之風險、但尚未罹患疾病之一般健康個體，且分離並冷凍所關注細胞以供後期使用。在某些態樣中，T 細胞可在隨後時間擴增、冷凍及使用。在某些態樣中，樣品係自診斷如本文所述之具體疾病後不久但在任何治療之前之患者收集。在另一態樣中，細胞係自在任何數量之相關治療模式之前的個體之血液樣品或血球分離物分離，該等治療模式包括(但不限於)使用以下各項之治療：藥劑，例如那他珠單抗(natalizumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、抗病毒劑；化學療法；輻射；免疫阻抑劑，例如環孢素、硫唑嘌呤、甲胺蝶呤、黴酚酸酯及FK506；抗體或其他免疫燒蝕劑，例如CAMPATH、抗-CD3抗體、癌得星、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228及輻照。
在本發明之另一態樣中，T細胞係在使個體保留功能性T細胞之治療後直接自患者獲得。就此而言，已觀察到，在某些癌症治療後，尤其在使用損害免疫系統之藥物治療後，在治療後不久在患者通常因治療而恢復之時段期間，所獲得T細胞之品質可能最佳或其離體擴增能力得到改良。同樣，利用本文所述之方法進行離體操縱後，該等細胞可處於增強植入及活體內擴增之較佳狀態。因此，本發明涵蓋在此恢復期間收集血細胞，包括T細胞、樹突狀細胞或造血系之其他細胞。此外，在某些態樣中，可使用動員(例如利用GM-CSF之動員)及調理方案在個體中產生其中尤其在治療後所定義時間窗期間有利於具體細胞類型之重建、再循環、再生及/或擴增之條件。說明性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞及免疫系統之其他細胞。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之免疫效應細胞係自已接受低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之個體獲得。在實施例中，在足夠時間後或在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之足夠投藥後收穫經改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如，T細胞)群，使得個體中或自個體收穫之PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)之含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞 (例如，T細胞)之比率至少瞬時增加。
在其他實施例中，具有或經改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如，T細胞)群可藉由與一定量之增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)之數量或增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)之比率的mTOR抑制劑接觸來離體治療。
在一個實施例中，T細胞群為二醯基甘油激酶(DGK)缺乏的。 DGK缺乏細胞包括不表現DGK RNA或蛋白質或具有降低或抑制的DGK活性之細胞。DGK缺乏細胞可藉由遺傳方式(例如投與RNA干擾劑，例如siRNA、shRNA、miRNA，以降低或防止DGK表現)來產生。另一選擇為，DGK缺乏細胞可藉由使用本文所述之DGK抑制劑治療來產生。
在一個實施例中，T細胞群為伊卡洛斯缺乏的。伊卡洛斯缺乏細胞包括不表現伊卡洛斯RNA或蛋白質或具有降低或抑制的伊卡洛斯活性之細胞，伊卡洛斯缺乏細胞可藉由遺傳方式(例如投與RNA干擾劑，例如siRNA、shRNA、miRNA，以降低或防止伊卡洛斯表現)來產生。另一選擇為，伊卡洛斯缺乏細胞可藉由使用伊卡洛斯抑制劑(例如，雷利竇邁(lenalidomide))治療來產生。
在實施例中，T細胞群為DGK缺乏及伊卡洛斯缺乏的，例如不表現DGK及伊卡洛斯或具有降低或抑制的DGK及伊卡洛斯活性。該等DGK及伊卡洛斯缺乏細胞可藉由本文所述之任一方法產生。
在實施例中，NK細胞係自個體獲得。在另一實施例中，NK細胞係NK細胞系，例如NK-92細胞系(Conkwest)。
同種異體CAR
在本文所述之實施例中，免疫效應細胞可係同種異體免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞。舉例而言，細胞可係同種異體T細胞，例如缺少功能性T細胞受體(TCR)及/或人類白血球抗原(HLA)(例如， I類HLA及/或II類HLA)表現之同種異體T細胞。
缺少功能性TCR之T細胞可例如經改造，使得其不在其表面上表現任何功能性TCR，經改造使得其不表現一或多個包含功能性TCR之亞單位，或經改造使得其在其表面上產生極少功能性TCR。另一選擇為，T細胞可例如藉由表現TCR之一或多個亞單位之突變或截短形式來表現實質上受損之TCR。術語「實質上受損之TCR」意指此TCR不會引發宿主中之不利免疫反應。
本文所述之T細胞可例如經改造使得其不在其表面上表現功能性HLA。舉例而言，本文所述之T細胞可經改造使得下調細胞表面表現HLA，例如I類HLA及/或II類HLA。
在一些實施例中，T細胞可缺少功能性TCR及功能性HLA，例如I類HLA及/或II類HLA。
缺少功能性TCR及/或HLA之表現之經修飾T細胞可藉由任何適宜方式(包括敲除或敲低TCR或HLA之一或多個亞單位)來獲得。舉例而言，T細胞可包括利用siRNA、shRNA、成簇規律間隔之短迴文重複(CRISPR)轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)之TCR及/或HLA敲低。
在一些實施例中，同種異體細胞可係藉由例如本文所述之任何方法不表現或表現少量抑制分子之細胞。舉例而言，細胞可係不表現或表現少量例如可降低CAR表現細胞引起免疫效應物反應之能力之抑制分子的細胞。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。抑制抑制分子(例如藉由在DNA、RNA或蛋白質層級上抑制)可最佳化CAR表現細胞性能。在實施例中，可使用抑制核酸，例如抑制核酸，例如dsRNA、例如，siRNA或shRNA、成簇規律間隔之短迴文重複 (CRISPR)、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)，例如如本文所述。
抑制TCR或HLA之siRNA及shRNA
在一些實施例中，在T細胞中TCR表現及/或HLA表現可利用靶向編碼TCR及/或HLA之核酸之siRNA或shRNA來抑制。
siRNA及shRNA在T細胞中之表現可利用任何習用表現系統(例如，例如慢病毒表現系統)來達成。
下調TCR組份之表現之實例性shRNA闡述於例如美國公開案第2012/0321667號中。下調I類HLA及/或II類HLA基因之表現之實例性siRNA及shRNA闡述於例如美國公開案第US 2007/0036773號中。
抑制TCR或HLA之CRISPR
如本文所用之「CRISPR」或「針對TCR及/或HLA之CRISPR」或「抑制TCR及/或HLA之CRISPR」係指成簇規律間隔之短迴文重複之集合或包含此一重複集合之系統。如本文所用之「Cas」係指CRISPR締合之蛋白質。「CRISPR/Cas」系統係指可用於沉默或突變TCR及/或HLA基因之源自CRISPR及Cas之系統。
天然CRISPR/Cas系統發現於約40%之經測序真細菌基因組及90%之經測序古細菌中。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics 8：172。此系統係賦予外源遺傳元件(例如質體及噬菌體)抗性且提供獲得性免疫性形式之原核免疫系統類型。Barrangou等人(2007)Science 315：1709-1712；Marragini等人(2008)Science 322：1843-1845。
CRISPR/Cas系統已經修飾用於真核生物(例如小鼠或靈長類動物)中之基因編輯(沉默、增強或改變特定基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature 482：331-8。此係藉由將含有特殊設計之CRISPR及一或多個適宜Cas之質體引入真核細胞中來實現。
CRISPR序列(有時稱為CRISPR基因座)包含替代性重複及間隔 體。在天然CRISPR中，間隔體通常包含細菌(例如質體或噬菌體序列)之外源序列；在TCR及/或HLA CRISPR/Cas系統中，間隔體源自TCR或HLA基因序列。
來自CRISPR基因座之RNA由Cas蛋白組成型表現且處理成小RNA。該等小RNA包含側接有重複序列之間隔體。RNA引導其他Cas蛋白以在RNA或DNA層級上沉默外源遺傳元件。Horvath等人(2010)Science 327：167-170；Makarova等人(2006)Biology Direct 1：7。因此，間隔體以與siRNA類似之方式用作RNA分子之模板。Pennisi(2013)Science 341：833-836。
由於該等間隔體天然存在於許多不同類型之細菌中，故CRISPR之確切排列及Cas基因之結構、功能及數量及其產物在各物種之間略有不同。Haft等人(2005)PLoS Comput.Biol.1：e60；Kunin等人(2007)Genome Biol.8：R61；Mojica等人(2005)J.Mol.Evol.60：174-182；Bolotin等人(2005)Microbiol.151：2551-2561；Pourcel等人(2005)Microbiol.151：653-663；及Stern等人(2010)Trends.Genet.28：335-340。舉例而言，Cse(Cas亞型，大腸桿菌)蛋白(例如，CasA)形成將CRISPR RNA轉錄本處理成Cascade保留之間隔體重複單元之功能複合物Cascade。Brouns等人(2008)Science 321：960-964。在其他原核生物中，Cas6處理CRISPR轉錄本。大腸桿菌中之基於CRISPR之噬菌體失活需要Cascade及Cas3而非Cas1或Cas2。強烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus)及其他原核生物中之Cmr(Cas RAMP模組)蛋白與識別並裂解互補靶RNA之小CRISPR RNA形成功能複合物。較簡單CRISPR系統依賴於蛋白質Cas9，其係具有兩個活性切割位點、一者針對每一雙螺旋鏈之核酸酶。組合Cas9及經修飾CRISPR基因座RNA可用於基因編輯系統中。Pennisi(2013)Science 341：833-836。
因此，CRISPR/Cas系統可用於編輯TCR及/或HLA基因(添加或缺 失鹼基對)或引入過早終止，因此降低TCR及/或HLA之表現。另一選擇為，CRISPR/Cas系統可如RNA干擾一樣使用，此以可逆方式關閉TCR及/或HLA基因。在哺乳動物細胞中，例如RNA可將Cas蛋白引導至TCR及/或HLA啟動子，從而在空間上阻斷RNA聚合酶。
抑制TCR及/或HLA之人工CRISPR/Cas系統可利用例如美國公開案第20140068797號及Cong(2013)Science 339：819-823中所述之業內已知技術來產生。亦可產生抑制TCR及/或HLA之業內已知之其他人工CRISPR/Cas系統，例如Tsai(2014)Nature Biotechnol.,32：6 569-576；美國專利第8,871,445號；第8,865,406號；第8,795,965號；第8,771,945號；及第8,697,359號中所述。
抑制TCR及/或HLA之TALEN
「TALEN」或「針對HLA及/或TCR之TALEN」或「抑制HLA及/或TCR之TALEN」係指轉錄活化劑樣效應物核酸酶，其係可用於編輯HLA及/或TCR基因之人工核酸酶。
TALEN係以人工方式藉由將TAL效應物DNA結合結構域融合至DNA裂解結構域來產生。轉錄活化劑樣效應(TALE)可經改造以結合任何期望DNA序列，包括HLA或TCR基因之一部分。藉由組合經改造之TALE與DNA裂解結構域，可產生特異性針對任何期望DNA序列(包括HLA或TCR序列)之限制酶。然後可將該等序列引入細胞中，其中其可用於基因組編輯。Boch(2011)Nature Biotech.29：135-6；及Boch等人(2009)Science 326：1509-12；Moscou等人(2009)Science 326：3501二者。
TALE係由黃單胞菌屬(Xanthomonas)細菌分泌之蛋白質。DNA結合結構域含有高度保守之重複33-34胺基酸序列，第12及第13胺基酸除外。該兩個位置高度可變，從而展示與特定核苷酸識別之強相關。因此，其可經改造以結合至期望DNA序列。
為產生TALEN，使TALE蛋白融合至為野生型或突變FokI核酸內切酶之核酸酶(N)。已針對FokI於TALEN中之用途對其作出若干突變；該等突變例如改良裂解特異性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.39：e82；Miller等人(2011)Nature Biotech.29：143-8；Hockemeyer等人(2011)Nature Biotech.29：731-734；Wood等人(2011)Science 333：307；Doyon等人(2010)Nature Methods 8：74-79；Szczepek等人(2007)Nature Biotech.25：786-793；及Guo等人(2010)J.Mol.Biol.200：96。
FokI結構域用作二聚體，此需要兩種具有針對靶基因組中具有正確定向及間距之位點的獨特DNA結合結構域之構築體。TALE DNA結合結構域與FokI裂解結構域之間之胺基酸殘基數及兩個個別TALEN結合位點之間的鹼基數似乎對達成高活性程度至關重要。Miller等人(2011)Nature Biotech.29：143-8。
HLA或TCR TALEN可在細胞內部用於產生雙鏈斷裂(DSB)。若修復機制經由非同源末端連結不正確地修復斷裂，則可在斷裂位點處引入突變。舉例而言，不正確修復可引入移碼突變。另一選擇為，可將外源DNA與TALEN一起引入細胞中；此端視外源DNA之序列及染色體序列而定，此過程可用於校正HLA或TCR基因中之缺陷或將此一缺陷引入wt HLA或TCR基因中，因此減少HLA或TCR之表現。
特異性針對HLA或TCR中之序列之TALEN可利用業內已知之任何方法、包括利用模組組份之各種方案來構築。Zhang等人(2011)Nature Biotech.29：149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE 6：e19509。
抑制HLA及/或TCR之鋅指核酸酶
「ZFN」或「鋅指核酸酶」或「針對HLA及/或TCR之ZFN」或「抑制HLA及/或TCR之ZFN」係指鋅指核酸酶，其係可用於編輯HLA及/或TCR基因之人工核酸酶。
與TALEN一樣，ZFN包含融合至DNA結合結構域之FokI核酸酶結構域(或其衍生物)。在ZFN之情形下，DNA結合結構域包含一或多個鋅指。Carroll等人(2011)Genetics Society of America 188：773-782；及Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1156-1160。
鋅指係由一或多個鋅離子穩定之小蛋白質結構基序。鋅指可包含例如Cys2His2，且可識別約3bp序列。各種已知特異性之鋅指可組合產生識別約6bp、9bp、12bp、15bp或18bp序列之多指多肽。可獲得多種選擇及模組組裝技術來產生識別特定序列之鋅指(及其組合)，該等技術包括噬菌體展示、酵母單雜交系統、細菌單雜交及雙雜交系統以及哺乳動物細胞。
與TALEN一樣，ZFN必須二聚化以裂解DNA。因此，需要ZFN對靶向非迴文DNA位點。兩個個別ZFN必須結合DNA之不同鏈，且利用其核酸酶適當地間隔開。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10570-5。
亦與TALEN一樣，ZFN可在DNA中產生雙鏈斷裂，若不正確地修復則此可產生移碼突變，導致HLA及/或TCR在細胞中之表現及量減少。ZFN亦可與同源重組一起使用來突變HLA或TCR基因。
特異性針對HLA AND/OR TCR中之序列之ZFN可利用業內已知之任何方法來構築。例如，參見Provasi(2011)Nature Med.18：807-815；Torikai(2013)Blood 122：1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.16：1200-7；及Guo等人(2010)J.Mol.Biol.400：96；美國專利公開案2011/0158957；及美國專利公開案2012/0060230。
端粒酶表現
儘管不希望受限於任何具體理論，但在一些實施例中，治療性T細胞在患者中具有短期持久性，此乃因T細胞中之端粒縮短；因此，用端粒酶基因轉染可延長T細胞之端粒且改良T細胞在患者中之持久 性。參見Carl June,「Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic」,Journal of Clinical Investigation,117：1466-1476(2007)。因此，在實施例中，免疫效應細胞(例如，T細胞)異位表現端粒酶亞單位，例如端粒酶之催化亞單位，例如TERT，例如hTERT。在一些態樣中，本發明提供產生CAR表現細胞之方法，其包含使細胞與編碼端粒酶亞單位(例如端粒酶之催化亞單位，例如TERT，例如hTERT)之核酸接觸。細胞可在與編碼CAR之構築體接觸之前、同時或之後與核酸接觸。
在一個態樣中，本發明之特徵在於製備免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)群之方法。在實施例中，該方法包含：提供免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)群，使免疫效應細胞群與編碼CAR之核酸接觸；及在容許CAR及端粒酶表現之條件下，使免疫效應細胞群與編碼端粒酶亞單位(例如，hTERT)之核酸接觸。
在實施例中，編碼端粒酶亞單位之核酸係DNA。在實施例中，編碼端粒酶亞單位之核酸包含能夠驅動端粒酶亞單位表現之啟動子。
在實施例中，hTERT具有如下基因庫蛋白質ID AAC51724.1之胺基酸序列(Meyerson等人，「hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization」Cell，第90卷，第4期，1997年8月22日，第785-795頁)：
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Figure 104111176-A0202-12-0142-463
(SEQ ID NO：131)
在實施例中，hTERT具有與SEQ ID NO：131之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列。在實施例中，hTERT具有SEQ ID NO：131之序列。在實施例中，hTERT在N末端、C末端或二者處包含缺失(例如，不超過5個、10個、15個、20個或30個胺基酸之缺失)。在實施例中，hTERT在N末端、C末端或二者處包含轉基因胺基酸序列(例如，不超過5個、10個、15個、20個或30個胺基酸之轉基因胺基酸序列)。
在實施例中，hTERT係由基因庫登錄號AF018167之核酸序列編碼(Meyerson等人，「hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization」Cell，第90卷，第4期，1997年8月22日，第785-795頁)：
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(SEQ ID NO：132)
在實施例中，hTERT係由具有與SEQ ID NO：132之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列之核酸編碼。在實施例中，hTERT係由SEQ ID NO：132之核酸編碼。
免疫效應細胞(例如，T細胞)之活化及擴增
免疫效應細胞(例如T細胞)通常可利用如例如以下專利中所述之方法來活化及擴增：美國專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；及美國專利申請公開案第20060121005號。
造血幹細胞及祖細胞之離體擴增程序闡述於美國專利第5,199,942號中，該專利以引用方式併入本文中，該程序可應用於本發明之細胞。業內已知其他適宜方法，因此本發明並不限於任何具體的細胞離體擴增方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增可包含：(1)自哺乳動物之末梢血收穫物或骨髓外植體收集CD34+造血幹細胞及祖細胞；及(2)離體擴增該等細胞。除美國專利第5,199,942號中所述之 細胞生長因子外，可使用其他因子(例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體)來培養及擴增細胞。
通常，免疫效應細胞(例如T調控細胞)群可藉由與表面接觸來擴增，該表面具有附接至其之刺激CD3/TCR複合物相關信號之藥劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子之配體。具體而言，T細胞群可如本文所闡述來刺激，例如藉由與固定在表面上之抗-CD3抗體或其抗原結合片段或抗-CD2抗體接觸，或藉由與蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素)以及鈣離子載體接觸來刺激。對於T細胞表面上輔助分子之共刺激，使用結合輔助分子之配體。舉例而言，可在適於刺激T細胞增殖之條件下使T細胞群與抗-CD3抗體及抗-CD28抗體接觸。為刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖，使用抗-CD3抗體及抗-CD28抗體。抗-CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besançon,France)，其可用作業內通常已知之其他方法(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328,1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63,1999)。
在某些態樣中，針對T細胞之主要刺激信號及共刺激信號藉由不同方案來提供。舉例而言，提供每一信號之藥劑可在溶液中或偶合至表面。當偶合至表面時，該等藥劑可偶合至相同表面(即呈「順式」形式)或偶合至單獨表面(即呈「反式」形式)。另一選擇為，一種藥劑可偶合至表面且另一藥劑在溶液中。在一個態樣中，提供共刺激信號之藥劑與細胞表面結合，且提供初級活化信號之藥劑在溶液中或偶合至表面。在某些態樣中，兩種藥劑皆可在溶液中。在一個態樣中，藥劑可呈可溶形式，且然後與表面交聯，例如表現Fc受體之細胞或抗體或將與該等藥劑結合之其他結合劑。就此而言，參見例如美國專利申請公開案第20040101519號及第20060034810號，該等公開案係關於所 涵蓋用於活化及擴增本發明T細胞之人工抗原呈遞細胞(aAPC)。
在一個態樣中，將兩種藥劑固定在珠粒上，固定在同一珠粒上(即「順式」)，或固定在單獨珠粒上(即「反式」)。舉例而言，提供初級活化信號之藥劑係抗-CD3抗體或其抗原結合片段，且提供共刺激信號之藥劑係抗-CD28抗體或其抗原結合片段；且兩種藥劑以等效分子量共固定至同一珠粒。在一個態樣中，使用與用於CD4+ T細胞擴增與T細胞生長之珠粒結合之每一抗體1：1的比率。在本發明之某些態樣中，使用與珠粒結合之抗CD3：CD28抗體之比率使得與利用1：1比率觀察到之擴增相比，觀察到T細胞擴增增加。在一個態樣中，與利用1：1比率觀察到之擴增相比，觀察到約1倍至約3倍的增加。在一個態樣中，與珠粒結合之CD3：CD28抗體之比率介於100：1至1：100及其間所有整數值範圍內。在一個態樣中，與粒子結合之抗-CD28抗體多於抗-CD3抗體，即CD3：CD28之比率小於1。在某些態樣中，與珠粒結合之抗CD28抗體對抗CD3抗體之比率大於2：1。在一個具體態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：100 CD3：CD28比率。在一個態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：75 CD3：CD28比率。在另一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：50 CD3：CD28比率。在一個態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：30 CD3：CD28比率。在一較佳態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：10 CD3：CD28比率。在一個態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1：3 CD3：CD28比率。在另一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之3：1 CD3：CD28比率。
可使用1：500至500：1及其間之任何整數值之粒子對細胞之比率來刺激T細胞或其他靶細胞。如彼等熟習此項技術者可容易地瞭解，粒子對細胞之比率可端視粒子相對於靶細胞之大小而定。舉例而言，大小較小之珠粒僅可結合少數細胞，而較大珠粒可結合許多細胞。在某些態樣中，細胞對粒子之比率介於1：100至100：1及其間之任何整數值 範圍內，且在其他態樣中，該比率包含1：9至9：1及其間之任何整數值，其亦可用於刺激T細胞。引起T細胞刺激之抗-CD3及抗-CD28偶合粒子對T細胞之比率可如上所述來變化，然而某些較佳值包括1：100、1：50、1：40、1：30、1：20、1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1及15：1，且一較佳比率為至少1：1粒子/T細胞。在一個態樣中，使用粒子對細胞1：1或更小之比率。在一個具體態樣中，較佳粒子：細胞比率為1：5。在其他態樣中，粒子對細胞比率可端視刺激時間而變化。舉例而言，在一個態樣中，在第一天時粒子對細胞之比率為1：1至10：1，且每天或每隔一天此後保持10天以1：1至1：10之最終比率(基於添加時間之細胞計數)將其他粒子添加至細胞中。在一個具體態樣中，在第一天刺激時粒子對細胞之比率為1：1，且在第三天及第五天刺激時調節至1：5。在一個態樣中，在第一天時每天或每隔一天基於1：1之最終比率添加粒子，且在第三天及第五天刺激時基於1：5添加。在一個態樣中，在第一天刺激時粒子對細胞之比率為2：1，且在第三天及第五天刺激時調節至1：10。在一個態樣中，在第一天時每天或每隔一天基於1：1之最終比率添加粒子，且在第三天及第五天刺激時基於1：10添加。 熟習此項技術者將瞭解，多種其他比率可適用於本發明中。具體而言，比率將端視粒子大小以及細胞大小及類型而變化。在一個態樣中，在第一天時所使用之最典型比率為約1：1、2：1或3：1。
在其他態樣中，組合細胞(例如T細胞)與藥劑包覆之珠粒，隨後分離珠粒與細胞，且然後培養細胞。在替代態樣中，在培養之前，不分離藥劑包覆之珠粒與細胞但一起培養。在另一態樣中，首先藉由施加力(例如磁力)對珠粒及細胞進行濃縮，從而增加細胞表面標記物之連接，由此誘導細胞刺激。
舉例而言，可藉由使抗-CD3及抗-CD28所附接之順磁珠粒(3×28 個珠粒)與T細胞接觸來連接細胞表面蛋白。在一個態樣中，於緩衝液(例如PBS(不含諸如鈣及鎂等二價陽離子))中組合細胞(例如104至109個T細胞)與珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T順磁珠粒，比率為1：1)。而且，彼等熟習此項技術者可容易地瞭解，可使用任何細胞濃度。舉例而言，在樣品中靶細胞可極其稀少且僅佔樣品的0.01%或全部樣品(即100%)可包含所關注靶細胞。因此，任何細胞數量皆在本發明背景下。在某些態樣中，可期望顯著減小珠粒及細胞混合在一起之體積(即增加細胞之濃度)，以確保細胞與珠粒之最大接觸。舉例而言，在一個態樣中，使用約100億個細胞/ml、90億/ml、80億/ml、70億/ml、60億/ml、50億/ml或20億個細胞/ml之濃度。在一個態樣中，使用大於1億個細胞/ml。在另一態樣中，使用10百萬個、15百萬個、20百萬個、25百萬個、30百萬個、35百萬個、40百萬個、45百萬個或50百萬個細胞/ml之細胞濃度。在另一態樣中，使用75百萬個、80百萬個、85百萬個、90百萬個、95百萬個或100百萬個細胞/ml之細胞濃度。在其他態樣中，可使用125百萬或150百萬個細胞/ml之濃度。利用高濃度可增加細胞產率、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可更有效地捕獲可弱表現所關注靶抗原之細胞，例如CD28陰性T細胞。在某些態樣中，該等細胞群可具有治療價值且將期望獲得。舉例而言，利用高濃度之細胞可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在一個實施例中，經編碼CAR(例如，本文所述之CAR)之核酸轉導之細胞係例如藉由本文所述之方法擴增。在一個實施例中，使細胞在培養物中擴增若干小時(例如，約2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、15小時、18小時、21小時)至約14天(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13或14天)之時段。在一個實施例中，使細胞擴增4 天至9天之時段。在一個實施例中，使細胞擴增8天或更短(例如7天、6天或5天)之時段。在一個實施例中，使細胞(例如，本文所述之CD19 CAR細胞)在培養物中擴增5天，且在相同培養條件下所得細胞比在培養物中擴增9天之相同細胞更強效。可藉由例如多種T細胞功能(例如增殖、靶細胞殺死、細胞介素產生、活化、遷移或其組合)來定義功效。在一個實施例中，在抗原刺激後與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比，擴增5天之細胞(例如，本文所述之CD19 CAR細胞)展示細胞倍增增加至少一倍、兩倍、三倍或四倍。在一個實施例中，使細胞(例如，表現本文所述CD19 CAR之細胞)在培養物中擴增5天，且與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比，所得細胞展現較高的促發炎細胞介素產生(例如，IFN-γ及/或GM-CSF含量)。在一個實施例中，與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比，擴增5天之細胞(例如，本文所述之CD19 CAR細胞)展示促發炎細胞介素產生(例如，IFN-γ及/或GM-CSF含量)增加至少一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更大(以pg/ml表示)。
若干刺激循環亦可能合意，使得T細胞之培養時間可為60天或更長。適用於T細胞培養之條件包括可含有增殖及活力所需因子之適宜培養基(例如最小必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15(Lonza))，該等因子包括血清(例如胎牛或人類血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α或熟習此項技術者已知用於細胞生長之任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括(但不限於)表面活性劑、人血漿蛋白粉及還原劑(例如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇)。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20，最佳者含有所添加胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，不含血清或補充有適量血清(或血漿)或所定義之激素群及/或對於T細胞生 長及擴增足夠之細胞介素量。抗生素(例如青黴素(penicillin)及鏈黴素(streptomycin))僅包括於實驗培養物而非欲輸注至個體中之細胞培養物中。將靶細胞維持在支持生長所需之條件下，例如適宜溫度(例如37℃)及氣氛(例如空氣加5% CO2)。
在一個實施例中，在包括一或多種介白素之適宜培養基(例如，本文所述之培養基)中擴增細胞，該等介白素使細胞在14天擴增時段內增加至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)，例如如藉由本文所述之方法(例如流式細胞術)所量測。在一個實施例中，在IL-15及/或IL-7(例如，IL-15及IL-7)存在下擴增細胞。
在實施例中，本文所述之方法(例如，CAR表現細胞製造方法)包含例如利用抗-CD25抗體或其片段或CD25結合配體IL-2自細胞群移除T調控細胞(例如，CD25+ T細胞)。自細胞群移除T調控細胞(例如，CD25+ T細胞)之方法闡述於本文中。在實施例中，方法(例如，製造方法)進一步包含使細胞群(例如，其中已清除T調控細胞(例如CD25+ T細胞)之細胞群；或先前已接觸抗-CD25抗體其片段或CD25結合配體之細胞群)與IL-15及/或IL-7接觸。舉例而言，在IL-15及/或IL-7存在下擴增細胞群(例如，先前已接觸抗-CD25抗體、其片段或CD25結合配體之細胞群)。
在一些實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間，使本文所述之CAR表現細胞與包含介白素-15(IL-15)多肽、介白素-15受體α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽及IL-15Ra多肽二者之組合(例如，hetIL-15)的組合物接觸。在實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間，使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽之組合物接觸。在實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間，使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽及IL-15 Ra多肽二者之組合的組合物接觸。在實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間，使本文所述之CAR表現細胞 與包含hetIL-15之組合物接觸。
在一個實施例中，在離體擴增期間使本文所述之CAR表現細胞與包含hetIL-15之組合物接觸。在實施例中，在離體擴增期間使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽之組合物接觸。在實施例中，在離體擴增期間，使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽及IL-15Ra多肽二者之組合物接觸。在一個實施例中，接觸使淋巴球亞群(例如，CD8+ T細胞)存活並增殖。
已暴露於多個刺激時間下之T細胞可展現不同特徵。舉例而言，典型血液或血球分離之外周血單核細胞產品具有大於細胞毒性或阻抑劑T細胞群(TC、CD8+)之輔助T細胞群(TH、CD4+)。T細胞藉助刺激CD3及CD28受體之離體擴增產生在約第8-9天之前主要由TH細胞組成而在約第8-9天之後T細胞群包含日益增加之TC細胞群的T細胞群。因此，端視治療之目的，向個體輸注主要包含TH細胞之T細胞群可能有利。類似地，若已分離TC細胞之抗原特異性亞組，則在較大程度上擴增此亞組可能有益。
此外，除CD4及CD8標記物外，其他表型標記物顯著變化，但在很大程度上在細胞擴增過程期間可再生。因此，該可再生性使得可針對特定目的來調適活化T細胞產物。
在其他實施例中，本文所揭示之製備方法進一步包含使免疫效應細胞群與編碼端粒酶亞單位(例如，hTERT)之核酸接觸。編碼端粒酶亞單位之核酸可係DNA。
在一些實施例中，在CAR細胞製造製程期間添加激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)。根據本文之非限制性理論，激酶抑制劑可改良所產生細胞群之品質。例如，CAR表現細胞通常係自癌症患者之可含有癌細胞之自身血漿血球分離樣品產生，且激酶抑制劑可改變彼等癌細胞(例如表現BTK之癌症，例如CLL或MCL)中之信號傳 導，例如減少其增殖或增加細胞凋亡之程度。作為另一實例，激酶抑制劑可例如藉由抑制T細胞中之ITK改變CAR表現細胞(或在其表現CAR前之免疫效應細胞)中之信號傳導。激酶抑制劑可使T細胞平衡自TH2細胞移位至TH1細胞。
激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)可以足以抑制其靶(例如，BTK)之量添加至反應混合物中。在一些實施例中，激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)係以約0.1-0.2μM、0.2-0.5μM、0.5-1μM、1-2μM、2-5μM或5-10μM之濃度添加。在一些實施例中，激酶抑制劑係共價抑制劑(例如依魯替尼)，且短脈衝足以使靶不可逆地失活，同時避免非特異性毒性。因此，可持續例如10-20分鐘、20-30分鐘、30-40分鐘、40-60分鐘或60-120分鐘添加激酶抑制劑。例如若激酶抑制劑具有非共價作用模式，則亦可持續較長時間段添加激酶抑制劑。因此，可持續例如2-4小時、4-6小時、6-8小時、8-12小時、12-18小時或18-24小時或1-2天、2-3天、3-4天、4-6天、6-8天、8-10天或培養細胞之整個時間長度來添加激酶抑制劑。激酶抑制劑可在製造製程期間之不同點下、例如在收穫細胞後、在用珠粒刺激前、在用珠粒刺激後、轉導前、轉導後或將細胞投與患者前添加。在一些實施例中，激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)係在收穫細胞後或例如用珠粒刺激前添加。之前及之後在此上下文中可係指例如在約1分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘或60分鐘之前或之後、或1小時、2小時、3小時、4小時、5小時或6小時之前或之後。
構築CD19 CAR後，可立即使用分析來評估分子之活性，例如(但不限於)在抗原刺激後使T細胞擴增之能力，在再刺激不存在下持續T細胞擴增之能力，及在適宜活體外及動物模型中之抗癌活性。評估CD19 CAR之效應之分析進一步詳細闡述於下文中。
可使用初級T細胞中之CAR表現之西方墨點分析來檢測單體及二 聚體之存在。例如，參見Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。極簡言之，使表現CAR之T細胞(CD4+及CD8+ T細胞之1：1混合物)在活體外擴增10天以上，然後溶解並在還原條件下實施SDS-PAGE。藉由西方墨點利用針對TCR-ζ鏈之抗體檢測含有全長TCR-ζ細胞質結構域及內源TCR-ζ鏈之CAR。在非還原條件下使用相同T細胞亞組進行SDS-PAGE分析以允許評估共價二聚體形成。
可藉由流式細胞術量測抗原刺激後CAR+ T細胞之活體外擴增。 舉例而言，用αCD3/αCD28珠粒刺激CD4+及CD8+ T細胞之混合物，然後在欲分析之啟動子控制下用表現GFP之慢病毒載體轉導。實例性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在培養之第6天時在CD4+及/或CD8+ T細胞亞組中藉由流式細胞術評估GFP螢光。例如，參見Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。另一選擇為，在第0天時用αCD3/αCD28包覆之磁珠刺激CD4+及CD8+ T細胞之混合物，並在第1天時利用表現CAR之雙順反子慢病毒載體以及eGFP利用2A核糖體跳躍序列用CAR轉導。在洗滌後，用CD19+ K562細胞(K562-CD19)、野生型K562細胞(K562野生型)或在抗-CD3及抗-CD28抗體存在下表現hCD32及4-1BBL之K562細胞(K562-BBL-3/28)再刺激培養物。將外源IL-2以100IU/ml每隔一天添加至培養物中。藉由流式細胞術利用基於珠粒之計數來列舉GFP+ T細胞。例如，參見Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。
亦可量測在再刺激不存在下之持續CAR+ T細胞擴增。例如，參見Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。簡言之，在第0天用αCD3/αCD28包覆之磁珠刺激、並在第1天用所指示之CAR轉導後，在培養第8天時利用Coulter Multisizer粒子計數器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter量測平均T細胞體積 (f1)。
亦可使用動物模型來量測CART活性。舉例而言，可使用利用人類CD19特異性CAR+ T細胞之異種移植物模型來治療免疫缺失小鼠之原發性人類前B ALL。例如，參見Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。極簡言之，在建立ALL後，使小鼠隨機化至治療組。將不同數量之經αCD19-ζ及αCD19-BB-ζ改造之T細胞以1：1比率共注射至帶有B-ALL之NOD-SCID-γ-/-小鼠中。在T細胞注射後之不同時間下評估來自小鼠之脾DNA中之αCD19-ζ及αCD19-BB-ζ載體的拷貝數。以每週間隔評價動物之白血病。量測注射αCD19-ζ CAR+ T細胞或模擬物轉導之T細胞後之小鼠中的末梢血CD19+ B-ALL母細胞計數。利用對數秩測試比較各組之存活率曲線。另外，亦可分析NOD-SCID-γ-/-小鼠中在T細胞注射後4週時之絕對末梢血CD4+及CD8+ T細胞計數。向小鼠注射白血病細胞，且3週後注射經改造藉由編碼連接至eGFP之CAR之雙順反子慢病毒載體表現CAR之T細胞。藉由與模擬物轉導之細胞混合將T細胞正規化至45%-50%輸入GFP+ T細胞，然後注射，且藉由流式細胞術確認。以1週間隔評價動物之白血病。利用對數秩測試比較CAR+ T細胞組之存活率曲線。
可評估劑量依賴性CAR治療反應。例如，參見Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。舉例而言，在第21天時注射CAR T細胞、等數量之模擬物轉導之T細胞或不注射T細胞之小鼠中在建立白血病後35-70天獲得末梢血。對每一組之小鼠隨機採血以確定末梢血CD19+ ALL母細胞數，且然後在第35天及第49天時殺死。 在第57天及第70天時評估剩餘動物。
細胞增殖及細胞介素產生之評價先前已闡述於例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)中。簡言之，在微量滴定板上藉由以2：1之最終T細胞：K562比率混合經洗滌之T細胞與表現 CD19(K19)或CD32及CD137之K562細胞(KT32-BBL)來實施CAR介導之增殖之評價。在使用前用γ-輻射輻照K562細胞。將抗-CD3(純系OKT3)及抗-CD28(純系9.3)單株抗體添加至含有KT32-BBL細胞之培養物中以用作刺激T細胞增殖之陽性對照，此乃因該等信號支持長期CD8+ T細胞離體擴增。在培養物中利用CountBrightTM螢光珠粒(Invitrogen,Carlsbad,CA)及流式細胞術如製造商所述列舉T細胞。藉由GFP表現利用經改造具有表現eGFP-2A連接之CAR之慢病毒載體的T細胞鑑別CAR+ T細胞。對於不表現GFP之CAR+ T細胞，用生物素化重組CD19蛋白及二級抗生物素蛋白-PE偶聯物檢測CAR+ T細胞。亦同時用特異性單株抗體(BD Biosciences)檢測T細胞上之CD4+及CD8+表現。根據製造商之說明書利用人類TH1/TH2細胞介素細胞計數珠粒陣列套組(BD Biosciences,San Diego,CA)，對在再刺激24小時時收集之上清液實施細胞介素量測。利用FACScalibur流式細胞儀評價螢光，且根據製造商之說明書分析數據。
可藉由標準51Cr釋放分析來評價細胞毒性。例如，參見Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。簡言之，在37℃下，用51Cr(呈NaCrO4形式，New England Nuclear,Boston,MA)將靶細胞(K562系及初級前B-ALL細胞)加載2小時同時頻繁攪動，在完全RPMI中洗滌兩次且平鋪於微量滴定板中。以效應細胞：靶細胞(E：T)之不同比率將效應T細胞與孔中之完全RPMI中之靶細胞混合。亦製備僅含有培養基(自發釋放，SR)或triton-X 100洗滌劑之1%溶液(總釋放，TR)的其他孔。在37℃下培育4小時後，收穫每一孔之上清液。然後利用γ粒子計數器(Packard Instrument公司，Waltham,MA)量測所釋放之51Cr。以至少一式三份實施每一條件，且利用下式計算溶解百分比：溶解%=(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER表示針對每一實驗條件釋放之平均51Cr。
可使用成像技術來評估CAR在帶有腫瘤之動物模型中之特定輸送及增殖。該等分析已闡述於例如Barrett等人，Human Gene Therapy 22：1575-1586(2011)中。簡言之，向NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠IV注射Nalm-6細胞，7天後在用CAR構築體電穿孔後4小時注射T細胞。用慢病毒構築體穩定轉染T細胞以表現螢火蟲螢光素酶，且使小鼠針對生物發光成像。另一選擇為，可如下量測Nalm-6異種移植物模型中單次注射CAR+ T細胞之治療效能及特異性：向NSG小鼠注射經轉導以穩定表現螢火蟲螢光素酶之Nalm-6，然後在7天後單次尾靜脈注射經CD19 CAR電穿孔之T細胞。使動物在注射後之不同時間點下成像。 舉例而言，可產生在第5天(治療前2天)及第8天(CAR+ PBL後24hr)時代表性小鼠中之螢火蟲螢光素酶陽性白血病之光子密度熱圖。
亦可使用其他分析、包括本文實例部分中所述之彼等以及業內已知之彼等來評估本發明之CD19 CAR構築體。
激酶抑制劑
在一個實施例中，激酶抑制劑係CDK4抑制劑，例如本文所述之CDK4抑制劑，例如CDK4/6抑制劑，例如6-乙醯基-8-環戊基-5-甲基-2-(5-六氫吡嗪-1-基-吡啶-2-基胺基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮鹽酸鹽(亦稱為帕博西林或PD0332991)。在一個實施例中，激酶抑制劑係BTK抑制劑，例如本文所述之BTK抑制劑，例如依魯替尼。在一個實施例中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如本文所述之mTOR抑制劑，例如雷帕黴素、雷帕黴素類似物OSI-027。mTOR抑制劑可係例如mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑，例如本文所述之mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑。在一個實施例中，激酶抑制劑係MNK抑制劑，例如本文所述之MNK抑制劑，例如4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制劑可係例如MNK1a、MNK1b、MNK2a及/或MNK2b抑制劑。
在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之CDK4抑制劑：阿羅辛A；夫拉平度或HMR-1275，2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(3S,4R)-3-羥基-1-甲基-4-六氫吡啶基]-4-
Figure 104111176-A0202-12-0161-42
烯酮；克唑替尼(PF-02341066)；2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(2R,3S)-2-(羥基甲基)-1-甲基-3-吡咯啶基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮鹽酸鹽(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；因地蘇蘭(E7070)；羅可韋汀(CYC202)；帕博西林(PD0332991)；地那西布(SCH727965)；N-[5-[[(5-第三丁基噁唑-2-基)甲基]硫基]噻唑-2-基]六氫吡啶-4-甲醯胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯氮呯-2-基]胺基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲醯基胺基)-1H-吡唑-3-甲酸N-(六氫吡啶-4-基)醯胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺醯基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；及XL281(BMS908662)。
在一個實施例中，激酶抑制劑係CDK4抑制劑，例如帕博西林(PD0332991)，且帕博西林係以約50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)之劑量每天持續一定時間段(例如，每天持續28天週期之14-21天，或每天持續21天週期之7-12天)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個帕博西林週期。
實例性CDK4/6抑制劑係LEE011(亦稱為瑞博司可裡布)，其結構展示於下文中
Figure 104111176-A0202-12-0162-471
不受限於理論，人們認為投與本文所述之CAR表現細胞與CDK4/6抑制劑(例如，本文所述之LEE011或其他CDK4/6抑制劑)可達成例如與單獨CDK4/6抑制劑相比較高之反應，例如較高緩解率及/或較低復發率。
儘管不希望受限於理論，但在一些實施例中，CDK4/6抑制劑用於降低癌細胞(例如，MCL細胞)中之細胞週期蛋白D1活性。一些癌細胞之特徵在於因轉座所致升高的細胞週期蛋白D1含量。CDK4與細胞週期蛋白D複合以促進細胞週期進展。因此，在一些實施例中，投與CK4/6抑制劑會減少癌細胞增殖。例如，參見Marzec等人，「Mantle cell lymphoma cells express predominantly cyclin D1a isoform and are highly sensitive to selective inhibition of CDK4 kinase activity」.Blood.2006年9月1日；108(5)：1744-50.Epub 2006年5月11日。
在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之BTK抑制劑：依魯替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。在實施例中，BTK抑制劑並不降低或抑制介白素-2誘導型激酶(ITK)之激酶活性，且選自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。
在一個實施例中，激酶抑制劑係BTK抑制劑，例如依魯替尼(PCI-32765)，且依魯替尼係以約250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)之 劑量每天持續一定時間段(例如，每天持續21天週期，或每天持續28天週期)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個依魯替尼週期。
在實施例中，將BTK抑制劑(例如，依魯替尼)投與患有CLL、外套細胞淋巴瘤(MCL)或小淋巴球性淋巴瘤(SLL)之個體。舉例而言，投與BTK抑制劑之個體具有染色體17之短臂缺失(del(17p)，例如在白血病細胞中)。在其他實例中，投與BTK抑制劑之個體不具del(17p)。在實施例中，投與BTK抑制劑之個體患有復發的CLL或SLL，例如先前已向該個體投與癌症療法(例如，先前已投與一種、兩種、三種或四種先前癌症療法)。在實施例中，投與之BTK抑制劑個體患有難治性CLL或SLL。在其他實施例中，投與BTK抑制劑之個體患有濾泡性淋巴瘤，例如復發性或難治性濾泡性淋巴瘤。
依魯替尼(1-[(3R)-3-[4-胺基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]六氫吡啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)之結構展示於下文中
Figure 104111176-A0202-12-0163-472
超過約400nM之依魯替尼濃度並非臨床上相關的。在Advani等人(J Clin Oncol 2012；31：88)之研究中，依魯替尼之平均峰值血清濃度為約130ng/ml，此等效於295nM(基於440.5之依魯替尼分子量)。因此，展示依魯替尼在1μM濃度下對T細胞之效應之數據顯著超過臨床上相關之活體內濃度。
在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之mTOR抑制劑：替西羅莫司；瑞達福羅莫司(1R,2R,4S)-二甲基亞磷酸4-[(2R)- 2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基酯，亦稱為AP23573及MK8669；依維莫司(RAD001)；雷帕黴素(AY22989)；塞馬莫德；(5-{2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反式-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；及N 2-[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸-內鹽(SF1126)；及XL765。
在一個實施例中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如雷帕黴素，且雷帕黴素係以約3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg)之劑量每天持續一定時間段(例如，每天持續21天週期，或每天持續28天週期)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個雷帕黴素週期。在一個實施例中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如依維莫司，且依維莫司係以約2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg)之劑量每天持續一定時間段(例如，每天持續28天週期)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個依維莫司週期。
在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之MNK抑制劑：CGP052088；4-胺基-3-(對-氟苯基胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢醯胺；ETC-1780445-2；及4-胺基-5-(4-氟苯胺基)- 吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑(例如本文所述之PI3K抑制劑，例如艾代拉裡斯(idelalisib)或杜威裡斯(duvelisib))及/或利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與艾代拉裡斯及利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與杜威裡斯及利妥昔單抗組合投與個體。艾代拉裡斯(亦稱為GS-1101或CAL-101；Gilead)係阻斷PI3K之δ同種型之小分子。艾代拉裡斯(5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基胺基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮)之結構展示於下文中
Figure 104111176-A0202-12-0165-473
杜威裡斯係阻斷PI3K-δ,γ之小分子。杜威裡斯(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基胺基)乙基]-1(2H)-異喹啉酮)之結構展示於下文中
Figure 104111176-A0202-12-0165-474
在實施例中，個體患有CLL。在實施例中，個體患有復發的CLL，例如先前已向個體投與癌症療法(例如，先前已投與抗-CD20抗 體或先前已投與依魯替尼)。舉例而言，個體具有染色體17之短臂缺失(del(17p)，例如在白血病細胞中)。在其他實例中，個體不具del(17p)。在實施例中，個體包含包括免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因之突變之白血病細胞。在其他實施例中，個體不包含包括免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因之突變之白血病細胞。在實施例中，個體具有染色體11之長臂缺失(del(11q))。在其他實施例中，個體不具del(11q)。在實施例中，艾代拉裡斯係以約100-400mg(例如，100-125mg、125-150mg、150-175mg、175-200mg、200-225mg、225-250mg、250-275mg、275-300mg、325-350mg、350-375mg或375-400mg)之劑量例如BID投與。在實施例中，杜威裡斯係以約15-100mg(例如，約15-25mg、25-50mg、50-75mg或75-100mg)之劑量例如每天兩次投與。在實施例中，利妥昔單抗係以約350-550mg/m2(例如，350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450mg/m2、450-475mg/m2或475-500mg/m2)之劑量例如靜脈內投與。
在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之雙重磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)及mTOR抑制劑：2-胺基-8-[反式-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基胺基)-1-六氫吡啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384、PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-側氧基-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；阿匹西布(GDC-0980、RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-嗒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(六氫吡嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮順丁烯二酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-嗎啉基吡啶并[3',2'：4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]酚(PI-103)；5-(9-異丙基-8-甲基-2-嗎啉基-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺 (VS-5584、SB2343)；及N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)胺基]喹喏啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]胺基苯基磺醯胺(XL765)。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與退行性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑組合投與個體。實例性ALK激酶抑制劑包括(但不限於)克唑替尼(Pfizer)、塞瑞替尼(ceritinib)(Novartis)、艾樂替尼(alectinib)(Chugai)、博瑞替尼(brigatinib)(亦稱為AP26113；Ariad)、恩曲替尼(entrectinib)(Ignyta)、PF-06463922(Pfizer)、TSR-011(Tesaro)(例如，參見臨床試驗標識符第NCT02048488號)、CEP-37440(Teva)及X-396(Xcovery)。在一些實施例中，個體患有實體癌症，例如本文所述之實體癌症，例如肺癌。
克唑替尼之化學名稱係3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-六氫吡啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。塞瑞替尼之化學名稱係5-氯-N 2-[2-異丙氧基-5-甲基-4-(4-六氫吡啶基)苯基]-N 4-[2-(異丙基磺醯基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。艾樂替尼之化學名稱係9-乙基-6,6-二甲基-8-(4-嗎啉基六氫吡啶-1-基)-11-側氧基-6,11-二氫-5H-苯并[b]咔唑-3-甲腈。 博瑞替尼之化學名稱係5-氯-N2-{4-[4-(二甲基胺基)-1-六氫吡啶基]-2-甲氧基苯基}-N4-[2-(二甲基磷醯基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。恩曲替尼之化學名稱係N-(5-(3,5-二氟苄基)-1H-吲唑-3-基)-4-(4-甲基六氫吡嗪-1-基)-2-((四氫-2H-吡喃-4-基)胺基)苯甲醯胺。PF-06463922之化學名稱係(10R)-7-胺基-12-氟-2,10,16-三甲基-15-側氧基-10,15,16,17-四氫-2H-8,4-(次甲基)吡唑并[4,3-h][2,5,11]苯并氧雜二氮雜環十四炔-3-甲腈。CEP-37440之化學結構係(S)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羥基乙基)六氫吡嗪-1-基)-1-甲氧基-6,7,8,9-四氫-5H-苯并[7]輪烯-2-基)胺基)嘧啶-4-基)胺基)-N-甲基苯甲醯胺。X-396之化學名稱係(R)-6-胺基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-N-(4-(4-甲基六氫吡嗪-1-羰基)苯基)嗒嗪-3-甲 醯胺。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)抑制劑組合投與個體。IDO係催化胺基酸L-色胺酸降解成犬尿胺酸之酶。許多癌症過表現IDO，例如前列腺癌、結腸直腸癌、胰臟癌、子宮頸癌、胃癌、卵巢癌、頭癌及肺癌。pDC、巨噬細胞及樹突狀細胞(DC)可表現IDO。不受限於理論，人們認為L-色胺酸(例如，由IDO催化)減少藉由誘導T細胞無效能及細胞凋亡導致免疫阻抑性環境。因此，不受限於理論，人們認為IDO抑制劑可例如藉由減少表現CAR之免疫細胞之阻抑或死亡增強本文所述CAR表現細胞之效能。在實施例中，個體患有實體腫瘤，例如本文所述之實體腫瘤，例如前列腺癌、結腸直腸癌、胰臟癌、子宮頸癌、胃癌、卵巢癌、頭癌或肺癌。IDO之實例性抑制劑包括(但不限於)1-甲基-色胺酸、吲哚莫德(indoximod，NewLink Genetics)(例如，參見臨床試驗標識符第NCT01191216號；第NCT01792050號)及INCB024360(Incyte公司)(例如，參見臨床試驗標識符第NCT01604889號；第NCT01685255號)
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與骨髓樣源性阻抑細胞(MDSC)之調節劑組合投與個體。MDSC在周邊及許多實體腫瘤之腫瘤位點處累積。該等細胞阻抑T細胞反應，由此阻礙CAR表現細胞療法之效能。不受限於理論，人們認為投與MDSC調節劑增強本文所述CAR表現細胞之效能。在實施例中，個體患有實體腫瘤，例如本文所述之實體腫瘤，例如神經膠母細胞瘤。MDSC之實例性調節劑包括(但不限於)MCS110及BLZ945。MCS110係針對巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)之單株抗體(mAb)。例如，參見臨床試驗標識符第NCT00757757號。BLZ945係群落刺激因子1受體(CSF1R)之小分子抑 制劑。例如，參見Pyonteck等人，Nat.Med.19(2013)：1264-72。BLZ945之結構展示於下文中
Figure 104111176-A0202-12-0169-378
在一些實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與以下各項組合投與個體：介白素-15(IL-15)多肽、介白素-15受體α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽及IL-15Ra多肽二者之組合，例如hetIL-15(Admune Therapeutics,LLC)。hetIL-15係IL-15及IL-15Ra之異二聚體非共價複合物。hetIL-15闡述於例如U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413及U.S.2011/0081311中，該等專利以引用方式併入本文中。在實施例中，het-IL-15係經皮下投與。在實施例中，個體患有癌症，例如實體癌症，例如黑色素瘤或結腸癌。在實施例中，個體患有轉移性癌症。
治療性應用 CD19相關之疾病及/或病症
在一個態樣中，本發明提供治療與CD19表現相關之疾病之方法。在一個態樣中，本發明提供治療其中腫瘤之一部分對CD19呈陰性且腫瘤之一部分對CD19呈陽性之疾病的方法。舉例而言，本發明CAR可用於治療已經歷與升高的CD19表現相關之疾病治療之個體，其中已經歷升高的CD19含量治療之個體展現與升高的CD19含量相關之疾病。
本文所述之療法可用於治療例如對激酶抑制劑(例如依魯替尼)有反應(例如，部分反應或完全反應)之個體或對激酶抑制劑(例如依魯替尼)無反應之個體(例如，非反應者或復發者)。不希望受限於理論，多 個經歷激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)治療之患者可展示對治療降低的反應(例如，為治療之部分或非反應者，或在治療期間復發)。因此，投與本文所揭示之CAR療法與激酶抑制劑之組合可產生有益效應。
該等個體之實例性治療方案闡述於下文中。
在一些情形下，當個體係激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)之非反應者或復發者時，戒斷激酶抑制劑且投與CAR療法。 在其他情形下，當個體對激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)無反應時，繼續激酶抑制劑療法且將CAR療法添加至方案中。此應用受例如本文實例8中之實驗支持，該等實驗指示CAR療法可有效地作為依魯替尼抗性細胞中之單一療法。不希望受限於理論，持續激酶抑制劑療法可例如藉由增加血流中之CAR表現細胞數來改良CAR療法之效能(參見本文實例8)。
不受限於理論，為激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)之非反應者或復發者之個體可出於至少兩個原因無反應：個體可具有藥物靶中防止靶抑制之突變(例如BTK，例如C481S突變)，或可在其他路徑中具有即使在靶被充分抑制時仍可驅動增殖之改變(例如PLCγ中之突變，例如PLCγ中引起組成型非BTK依賴性細胞信號傳導之活化突變)。可端視非反應性之原因而改變治療。例如，在第一種情況下(在一些實施例中)，若個體具有(或經鑑別具有)防止激酶抑制劑抑制其靶之突變，則第二激酶抑制劑(例如，針對同一靶)可取代該激酶抑制劑(或與其組合投與)。更特定而言，在患者具有(或經鑑別具有)防止依魯替尼抑制BTK之突變之一些實施例中，第二BTK抑制劑(例如本文所述之BTK抑制劑，例如GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13))可取代依魯替尼。不希望受限於理論，第二激酶抑制劑可作用於不被突變 破壞之靶區域，且因此個體對第二激酶抑制劑敏感。在其他實施例中，維持原始激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)。根據本文之非限制性理論，原始激酶抑制劑可對CAR表現細胞具有有用活性，例如促進TH1表型、促進增殖或以其他方式增加細胞之含量或活性。
如上所述，在一些情形下，個體無反應之原因在於該個體在另一路徑中具有即使在靶被充分抑制時仍可驅動增殖之改變(例如，突變)。因此，若個體具有(或經鑑別具有)在路徑中使激酶抑制劑之活性無效之改變，則可維持激酶抑制劑療法。不希望受限於理論，即使單獨激酶抑制劑不足以減緩增殖，激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)活性仍可促進癌細胞中有用的生物改變。例如，激酶抑制劑可足以動員癌細胞離開淋巴結，使其更易受CAR療法攻擊。
現轉向對激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)有反應之個體，現闡述多個治療方案。在一些實施例中，當個體係(或經鑑別為)激酶抑制劑之完全反應者時，在完全反應時段期間不向該個體投與CAR療法。在其他實施例中，當個體係(或經鑑別為)激酶抑制劑之完全反應者時，在完全反應時段期間向該個體投與CAR療法。在實施例中，在CAR療法後，個體經歷延長反應或延遲復發(例如，與不使用CAR療法治療時之預期疾病進程相比)。例如，經依魯替尼單一療法治療之MCL具有約17.5個月之中值反應持續時間。
在一些實施例中，當個體係(或經鑑別為)激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)之部分反應者時，在部分反應時段期間不向該個體投與CAR療法。在其他實施例中，當個體係(或經鑑別為)激酶抑制劑之部分反應者時，在部分反應時段期間向該個體投與CAR療法。在實施例中，在CAR療法後，個體經歷完全反應及/或延長反應或延遲復發(例如，與不使用CAR療法治療時之預期疾病進程相比)。
在一些實施例中，當個體在開始使用激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)治療後患有(或經鑑別患有)穩定疾病時，在穩定疾病時段期間不向該個體投與CAR療法。在其他實施例中，當個體在開始使用激酶抑制劑治療後患有(或經鑑別患有)穩定疾病時，在穩定疾病時段期間向該個體投與CAR療法。在實施例中，在CAR療法後，個體經歷部分反應、完全反應及/或延長反應或延遲復發(例如，與不使用CAR療法治療時之預期疾病進程相比)。
在一些實施例中，當個體在開始使用激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)治療後患有(或經鑑別患有)進行性疾病時，在進行性疾病時段期間不向該個體投與CAR療法。在其他實施例中，當個體在開始使用激酶抑制劑治療後患有(或經鑑別患有)進行性疾病時，在進行性疾病時段期間向該個體投與CAR療法。在實施例中，在CAR療法後，個體經歷穩定疾病、部分反應、完全反應及/或延長反應或延遲復發(例如，與不使用CAR療法治療時之預期疾病進程相比)。
因此，可在治療之前或期間實施一或多個疾病評價步驟，以確定哪個療程適於給定患者。例如，可向個體投與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)作為第一線療法。然後，可在一定時間段(例如，1個月或2個月亦及2週、3週、1個月、1.5個月、2個月、3個月、4個月、6個月、9個月、12個月、15個月或18個月)後，評價患者之反應。若評價展示個體係完全反應者，則在一些實施例中不投與CAR療法，例如如上文所述。若評價展示個體係部分反應者或患有穩定疾病，則在一些實施例中CAR療法係與激酶抑制劑組合投與，例如如上文所述。若評價展示個體係非反應者或復發者，則在一些實施例中CAR療法係與激酶抑制劑或第二激酶抑制劑組合投與，例如如上文所述。在一些實施例中，激酶抑制劑控制疾病同時製造CAR表現細胞，例如同時患者之自身T細胞經改造以表現CAR及/或其他因子。
用於歸類患者之反應者狀態或復發者狀態之臨床標準為業內已知。作為實例，對於惡性淋巴瘤，標準化反應準則闡述於Cheson等人，J Clin Oncol 17：1244(1999)及Cheson等人，「Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma」,J Clin Oncol 25：579-586(2007)中(該兩篇文獻之全文皆以引用方式併入本文中)。因此，在一些實施例中，根據Cheson準則或經修改之Cheson準則，個體視為完全反應者、部分反應者、患有穩定疾病、非反應者或復發者。用於歸類其他血液惡性病之準則為業內已知。
根據表2中Cheson 2007之準則，完全反應者具有所有疾病證據之消失；部分反應者具有可量測疾病之消退且無新位點；患有穩定疾病之患者無法獲得CR/PR或PD；且患有復發性疾病或進行性疾病之患者具有任何新病灶或先前所涉及位點自最低點增加大於或等於50%。評價可涉及確定疾病是否為嗜FDG、PET陽性或陰性，是否存在例如肝或脾中可觸知之小結，及是否清除骨髓或展示參與。
CAR療法與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)可例如同時或依序投與。在一些實施例中，CAR療法實質上係在開始激酶抑制劑療法的同時開始。在一些實施例中，CAR療法係在開始激酶抑制劑療法之前開始。在一些實施例中，CAR療法係在開始激酶抑制劑療法之後開始。例如，CAR療法可在激酶抑制劑療法開始後例如至少1週、2週、3週或4週、或1個月、2個月、3個月、4個月、6個月、9個月、12個月、15個月、18個月或24個月開始。在一些實施例中，CAR療法係在患者之身體中具有生理上相關之激酶抑制劑含量的同時開始。
在組合投與時，CAR療法及激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)或二者可以高於、低於或等於個別使用之每一藥劑(例如，作為單一療法)之量或劑量的量或劑量投與。在某些實施例中，CAR 療法、激酶抑制劑或二者之所投與量或劑量低於(例如，低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)個別使用之每一藥劑(例如，作為單一療法)之量或劑量。在其他實施例中，CAR療法、激酶抑制劑或二者之產生期望效應(例如，治療癌症)之量或劑量低於(例如，低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)個別使用之每一藥劑(例如，作為單一療法)達成相同治療效應所需的量或劑量。
在組合投與時，CAR療法及激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)或二者可以長於、短於或等於個別使用之每一藥劑(例如，作為單一療法)之持續時間的持續時間來投與。在某些實施例中，投與CAR療法、激酶抑制劑或二者之持續時間短於(例如，短至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)個別使用之每一藥劑(例如，作為單一療法)的持續時間。在其他實施例中，投與CAR療法、激酶抑制劑或二者之產生期望效應(例如，治療癌症)之持續時間短於(例如，短至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)個別使用之每一藥劑(例如，作為單一療法)達成相同效應所需的持續時間。在一些實施例中，向患者投與縮短的激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)進程。例如，縮短的激酶抑制劑進程可持續總共約0-2個月、2-4個月、4-6個月、6-8個月、8-10個月、10-12個月、12-15個月、15-18個月、18-21個月或21-24個月，或可在投與CAR療法後持續約0-2個月、2-4個月、4-6個月、6-8個月、8-10個月、10-12個月、12-15個月、15-18個月、18-21個月或21-24個月。在實施例中，縮短的激酶抑制劑進程在復發之前結束。在實施例中，激酶抑制劑係在縮短進程期間以正常(例如，單一療法)含量投與。
在實施例中，CAR表現細胞之單次劑量包含約5×108個CD19 CART細胞。CAR表現細胞之劑量亦可包含約5×106個、1×107個、2×107個、5×107個、1×108個、2×108個、5×108個、1×109個、2 ×109個或5×109個細胞，例如CD19 CAR細胞，例如CD19 CART細胞。
在一個態樣中，本發明係關於用於在哺乳動物細胞(例如，T細胞)中表現之包含可操作地連接至啟動子之CD19 CAR的載體。在一個態樣中，本發明提供用於治療表現CD19之腫瘤之表現CD19 CAR之重組細胞(例如，T細胞)，其中表現CD19 CAR之重組T細胞稱為CD19 CART。在一個態樣中，本文所述之CD19 CART能夠使腫瘤細胞與至少一個在其表面上表現之CD19 CAR接觸，使得CART靶向腫瘤細胞且抑制腫瘤之生長。
在一個態樣中，本發明係關於抑制表現CD19之腫瘤細胞之生長的方法，其包含使腫瘤細胞與CD19 CAR表現細胞(例如，本文所述之CD19 CART細胞)接觸，使得CART因應抗原而活化且靶向癌細胞，其中抑制腫瘤之生長。CD19 CAR表現細胞(例如，T細胞)係與激酶抑制劑(例如本文所述之激酶抑制劑)組合投與。
如本文所用之「組合」投與意指，在個體患病期間將兩種(或更多種)不同治療遞送至個體，例如在個體已經診斷患有病症之後且在病症治癒或消除之前或治療已出於其他原因停止之前遞送兩種或更多種治療。在一些實施例中，一種治療之遞送仍在第二種治療開始遞送時進行，以使得存在投與重疊。此在本文中有時稱為「同時」或「同步遞送」。在其他實施例中，一次治療之遞送係在開始另一次治療之遞送之前結束。在任一情形之一些實施例中，治療因組合投與而更有效。例如，第二種治療更有效，例如使用較少第二種治療即可觀察到等效效應，或第二種治療在較大程度上減輕症狀，該程度大於在不存在第一種治療下投與第二種治療時觀察到之程度或使用第一種治療觀察到之類似情況。在一些實施例中，遞送應使症狀減輕，或使與病症相關之其他參數大於在另一者不存在下使用所遞送之一種治療觀察到 之參數。兩次治療之效應可為部分加和、完全加和或大於加和。遞送可使得在遞送第二治療時仍可檢測到所遞送第一次治療之效應。在一個實施例中，CAR表現細胞係以本文所述之劑量及/或投藥時間表來投與，且激酶抑制劑或增強CAR表現細胞之活性之藥劑係以本文所述之劑量及/或投藥時間表來投與。
本發明包括一種類型之細胞療法，其中T細胞經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)且將CAR T細胞輸注至有需要之接受者。所輸注細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。與抗體療法不同，CAR修飾之T細胞能夠在活體內複製，從而產生可引起持續腫瘤控制之長期持久性。在多個態樣中，在將T細胞投與患者後，投與患者之T細胞或其子代在患者中存留至少4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、2年、3年、4年或5年。
本發明亦包括一種類型之細胞療法，其中T細胞經例如活體外轉錄之RNA修飾以瞬時表現嵌合抗原受體(CAR)且將CAR T細胞輸注至有需要之接受者。所輸注細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。因此，在多個態樣中，在將T細胞投與患者後，投與患者之T細胞存在小於1個月，例如3週、2週、1週。
不希望受限於任何具體理論，由CAR修飾之T細胞誘發之抗腫瘤免疫反應可為主動或被動免疫反應，或另一選擇為可歸因於直接對間接免疫反應。在一個態樣中，CAR轉導之T細胞展現特異性促發炎細胞介素分泌及強效的因應表現CD19之人類癌細胞之細胞溶解活性，抵抗可溶性CD19抑制，介導旁觀者殺死並介導現有人類腫瘤之消退。舉例而言，表現CD19之腫瘤之異質場內的無抗原腫瘤細胞可能易受CD19重定向T細胞間接破壞之影響，該間接破壞係先前抵抗毗鄰 抗原陽性癌細胞作出之反應。
在一個態樣中，本發明之全人類CAR修飾之T細胞可係用於哺乳動物之離體免疫及/或活體內療法之疫苗類型。在一個態樣中，哺乳動物係人類。
關於離體免疫，在將細胞投與哺乳動物中之前在活體外進行以下中之至少一者：i)擴增細胞，ii)將編碼CAR之核酸引入細胞，或iii)低溫保藏細胞。
離體程序為業內所熟知且更全面論述於下文中。簡言之，自哺乳動物(例如人類)分離細胞，且用表現本文所揭示CAR之載體進行遺傳修飾(例如活體外轉導或轉染)。可向哺乳動物接受者投與CAR修飾之細胞以提供治療益處。哺乳動物接受者可係人類，且CAR修飾之細胞可對於接受者而言可為自體。另一選擇為，細胞對於接受者而言可係同種異體、同基因或異種。除根據離體免疫利用基於細胞之疫苗外，本文所述之方法亦包括用於活體內免疫來誘發針對患者中之抗原之免疫反應的組合物及方法。
通常，如本文所闡述活化及擴增之細胞可用於治療及預防在免疫受損個體中產生之疾病。具體而言，本文所述之CAR表現細胞用於治療與CD19之表現相關之疾病、病症及病況。在某些態樣中，該等細胞用於治療具有罹患與CD19之表現相關之疾病、病症及病況之風險之患者。因此，本發明提供治療或預防與CD19之表現相關之疾病、病症及病況的方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所述之CAR表現細胞與激酶抑制劑(例如本文所述之激酶抑制劑)之組合。
本發明亦提供抑制增殖或減少CD19表現細胞群之方法，該等方法包含使包含CD19表現細胞之細胞群與本文所述結合至CD19表現細胞之抗-CD19 CAR表現細胞接觸，及使CD19表現細胞群與激酶抑制 劑(例如本文所述之激酶抑制劑)接觸。在特定態樣中，本發明提供方法抑制或減少表現CD19之癌細胞群增殖之方法，該等方法包含使表現CD19之癌細胞群與本文所述結合至CD19表現細胞之抗-CD19 CAR表現細胞接觸，及使CD19表現細胞與激酶抑制劑(例如本文所述之激酶抑制劑)接觸。在一個態樣中，本發明提供抑制或減少表現CD19之癌細胞群增殖之方法，該等方法包含使表現CD19之癌細胞群與本文所述結合至CD19表現細胞之抗-CD19 CAR表現細胞接觸，及使CD19表現細胞與激酶抑制劑(例如本文所述之激酶抑制劑)接觸。在某些態樣中，在患有血液癌症或與CD19表現細胞相關之另一癌症之個體或其動物模型中，本文所述之抗-CD19 CAR表現細胞及激酶抑制劑(例如本文所述之激酶抑制劑)之組合使細胞及/或癌細胞之量、數量、量或百分比相對於陰性對照降低至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一個態樣中，個體係人類。
本發明亦提供預防、治療及/或管控與CD19表現細胞相關之疾病(例如，血液癌症或表現CD19之非典型癌症)之方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至CD19表現細胞之抗-CD19 CAR表現細胞及投與激酶抑制劑(例如本文所述之激酶抑制劑)。在一個態樣中，個體係人類。與CD19表現細胞相關之病症之非限制性實例包括自體免疫病症(例如狼瘡)、發炎性病症(例如過敏及氣喘)及癌症(例如血液癌症或表現CD19之非典型癌症)。
本發明亦提供預防、治療及/或管控與CD19表現細胞相關之疾病之方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至CD19表現細胞之本發明抗-CD19 CART細胞。在一個態樣中，個體係人類。
本發明提供預防與CD19表現細胞相關之癌症復發之方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至CD19表現細胞之本發明抗-CD19 表現細胞(例如抗-CD19 CART細胞)。在一個態樣中，該等方法包含向有需要之個體投與有效量之本文所述結合至CD19表現細胞之抗-CD19表現細胞(例如抗-CD19 CART細胞)與有效量之另一療法的組合。
在一個態樣中，本發明係關於治療個體之癌症之方法。該方法包含向個體投與表現本文所述之B細胞靶向CAR之細胞(例如，免疫效應細胞)(例如，T細胞或NK細胞)與激酶抑制劑(例如本文所述之激酶抑制劑)的組合，使得治療個體之癌症。可藉由本文所述之方法治療之癌症之實例係與B細胞抗原(例如，CD19)之表現相關之癌症。在一個實施例中，疾病係實體或液體腫瘤。在一個實施例中，疾病係血液癌症。在一個實施例中，血液癌症係白血病。在一個實施例中，例如根據WHO歸類，血液癌症係成熟B細胞瘤。在一個實施例中，血液癌症之CD19+ B淋巴球源性惡性病。在一個實施例中，癌症選自由以下組成之群：一或多種急性白血病，包括(但不限於)B細胞急性淋巴樣白血病(BALL)、T細胞急性淋巴樣白血病(TALL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性淋巴樣白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)；其他血液癌症或血液病況，包括(但不限於)外套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)(例如，富含T細胞/組織細胞之大B細胞淋巴瘤、原發性CNS DLCBL、原發性皮膚DLBCL腿型或老年EBV+ DLBCL)、與慢性發炎相關之DLBCL、濾泡性淋巴瘤、小兒濾泡性淋巴瘤、多毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生性病況、MALT淋巴瘤(黏膜相關淋巴樣組織之結外邊緣帶淋巴瘤)、邊緣帶淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋 巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、脾邊緣帶淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病(例如，無法歸類)、脾紅髓瀰漫性小B細胞淋巴瘤、多毛細胞白血病變體、淋巴漿細胞性淋巴瘤、重鏈疾病(例如，α重鏈疾病、γ重鏈疾病或μ重鏈疾病)、漿細胞骨髓瘤、孤立性骨骼漿細胞瘤、骨外漿細胞瘤、結節邊緣帶淋巴瘤、小兒結節邊緣帶淋巴瘤、原發性皮膚濾泡中心淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病、原發性縱膈(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK+大B細胞淋巴瘤、在HHV8相關之多中心卡斯特雷曼氏病(multicenric Castleman disease)中出現之大B細胞淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、無法歸類之淋巴瘤(例如，特徵介於DLBCL與伯基特氏淋巴瘤中間或介於DLBCL與經典霍奇金氏淋巴瘤中間)及「白血病前期」(其係因骨髓樣血球之無效產生(或發育不良)集合在一起之血液病況之不同集合)；及與B細胞抗原(例如，CD19)表現相關之疾病，包括(但不限於)非典型及/或非經典癌症、惡性病、癌前病況或表現B細胞抗原(例如，CD19)之增生性疾病；及其任一組合。
在一些實施例中，癌症係霍奇金氏淋巴瘤，且用CAR表現細胞例如作為單一療法或與一或多種其他治療劑組合治療患者。在實施例中，霍奇金氏淋巴瘤為I期、II期、III期或IV期。其他治療劑可包含例如激酶抑制劑，例如BTK抑制劑，如依魯替尼。其他治療劑可包含用於霍奇金氏淋巴瘤之治療。其他治療劑可包含例如輻射療法、MOPP(鹽酸氮芥(Mustargen)、安可平(Oncovin)、普賴松(Prednisone)及丙卡巴肼(Procarbazine))、ABVD(阿德力黴素(Adriamycin)、博來黴素(bleomycin)、長春鹼(vinblastine)及達卡巴嗪(dacarbazine))、Stanford V(使用化學療法及輻射治療之方案)或BEACOPP(博來黴素、依託泊苷(Etoposide)、阿德力黴素、環磷醯胺、安可平、丙卡巴肼、普賴松)。在一些實施例中，個體先前已經輻射療法、MOPP、 Stanford V或BEACOPP中之一或多者治療或對其具有抗性或難治性。
與B細胞抗原(例如，CD19、CD20、CD22或ROR1中之一或多者)之表現相關之非癌症適應症包括(但不限於)例如自體免疫疾病、(例如，狼瘡)、發炎性病症(過敏及氣喘)及移植。
在一些實施例中，可用本文所述之組合治療之癌症係多發性骨髓瘤。多發性骨髓瘤係血液之癌症，其特徵在於漿細胞純系在骨髓中累積。多發性骨髓瘤之當前療法包括(但不限於)使用沙利竇邁之類似物雷利竇邁治療。雷利竇邁具有包括抗腫瘤活性、血管生成抑制及免疫調節之活性。在一些實施例中，可使用例如如本文所述之CD19 CAR靶向骨髓瘤細胞。在一些實施例中，本文所述之組合可與一或多種其他療法(例如，雷利竇邁治療)一起使用。
本文所述之CAR表現細胞可單獨投與，或作為醫藥組合物與稀釋劑及/或其他組份(例如IL-2或其他細胞介素或細胞群)組合投與。
在實施例中，在投與(例如，輸注)CAR細胞(例如，本文所述之CAR表現細胞)之前、與其同時或之後向個體投與淋巴清除化學療法。在實例中，在投與CAR細胞之前向個體投與淋巴清除化學療法。 舉例而言，在CAR細胞輸注之前1-4天(例如1天、2天、3天或4天)結束淋巴清除化學療法。在實施例中，投與多個CAR細胞劑量，例如如本文所述。舉例而言，單次劑量包含約5×108個CAR細胞。在實施例中，在投與(例如，輸注)本文所述之CAR表現細胞之前、與其同時或之後向個體投與淋巴清除化學療法。
血液癌症
血液癌症病況係侵襲血液、骨髓及淋巴系統之癌症類型，例如白血病、淋巴瘤及惡性淋巴組織增生性病況。
白血病可歸類為急性白血病及慢性白血病。急性白血病可進一步歸類為急性骨髓性白血病(AML)及急性淋巴樣白血病(ALL)。慢性 白血病包括慢性骨髓性白血病(CML)及慢性淋巴樣白血病(CLL)。其他相關病況包括骨髓發育不良症候群(MDS，之前稱為「白血病前期」)，其係因骨髓樣血球之無效產生(或發育不良)及轉化成AML之風險而集合在一起之血液病況之不同集合。
淋巴瘤係自淋巴球發育之血球腫瘤之群。實例性淋巴瘤包括非霍奇金氏淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤。
組合療法
本文所述之CAR表現細胞(例如，及本文所述之激酶抑制劑)之組合可與其他已知藥劑及療法組合使用。
本文所述之CAR表現細胞、激酶抑制劑及/或至少一種其他治療劑可同時、在相同或單獨組合物中或依序投與。對於依序投與，可首先投與本文所述之CAR表現細胞，且可其次投與另一藥劑，或可顛倒投與順序。
CAR療法及/或其他治療劑、程序或模式可在活性病症時段期間或在緩解或活性較低之疾病時段期間投與。CAR療法可在另一治療之前、與該治療同時、在治療後或在病症緩解期間投與。
在組合投與時，CAR療法及一或多種其他藥劑(例如，激酶抑制劑及/或第三藥劑)或所有可以高於、低於或等於個別使用之每一藥劑(例如，作為單一療法)之量或劑量的量或劑量投與。在某些實施例中，CAR療法、另一藥劑(例如，激酶抑制劑及/或第三藥劑)或所有之所投與量或劑量低於(例如，低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)個別使用之每一藥劑(例如，作為單一療法)的量或劑量。在其他實施例中，CAR療法、另一藥劑(例如，激酶抑制劑及/或第三藥劑)或所有之產生期望效應(例如，治療癌症)之量或劑量低於(例如，低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)個別使用之每一藥劑(例如，作為單一療法)達成相同治療效應所需的量或劑量。
在其他態樣中，本文所述之CAR表現細胞(例如，及激酶抑制劑)之組合可於治療方案中與組合手術、化學療法、輻射、免疫阻抑劑(例如環孢素、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、黴酚酸酯及FK506)、抗體或其他免疫燒蝕劑(例如CAMPATH、抗-CD3抗體或其他抗體療法)、細胞毒素、氟達拉濱、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228、細胞介素及輻照。例如Izumoto等人，2008 J Neurosurg 108：963-971中所述之肽疫苗。
在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞(例如，及本文所述之激酶抑制劑)之組合可與另一化學治療劑組合使用。實例性化學治療劑包括蒽環(例如，多柔比星(doxorubicin)(例如，脂質體多柔比星))；長春花生物鹼(例如，長春鹼、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine))；烷基化劑(例如，環磷醯胺、達卡巴嗪、美法侖、異環磷醯胺、替莫唑胺(temozolomide))；免疫細胞抗體(例如，阿倫單抗(alemtuzamab)、吉妥單抗(gemtuzumab)、利妥昔單抗、歐法單抗(ofatumumab)、托西莫單抗(tositumomab)、布妥昔單抗(brentuximab))；抗代謝物(包括例如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷去胺酶抑制劑(例如，氟達拉濱))；TNFR糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)激動劑；蛋白酶體抑制劑(例如，阿克拉黴素(aclacinomycin)A、黴膠毒素或硼替佐米(bortezomib))；免疫調節劑，例如沙利竇邁或沙利竇邁衍生物(例如，雷利竇邁)。
認為用於組合療法中之一般化學治療劑包括阿那曲唑(anastrozole，Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide，Casodex®)、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate，Blenoxane®)、白消安(busulfan，Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(capecitabine，Xeloda®)、N4-戊氧基羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑(carboplatin，Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine，BiCNU®)、苯丁酸氮芥 (Leukeran®)、順鉑(cisplatin，Platinol®)、克拉屈濱(cladribine，Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside，Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴嗪(DTIC-Dome®)、更生黴素(dactinomycin，放線菌素D(Actinomycin D)、放線菌素D(Cosmegan))、鹽酸唐黴素(Cerubidine®)、檸檬酸唐黴素脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松(dexamethasone)、多西他賽(docetaxel，Taxotere®)、鹽酸多柔比星(Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®)、氟他胺(flutamide，Eulexin®)、替紮他濱(tezacitibine)、吉西他濱(gemcitabine，雙氟去氧胞苷)、羥基脲(Hydrea®)、艾達黴素(Idamycin®)、異環磷醯胺(IFEX®)、伊立替康(irinotecan，Camptosar®)、L-門冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲硫四氫葉酸鈣、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌昤(Purinethol®)、甲胺蝶呤(Folex®)、米托蒽醌(mitoxantrone，Novantrone®)、滅髓瘤(mylotarg)、太平洋紫杉醇(paclitaxel，Taxol®)、菲尼克斯(phoenix，釔90/MX-DTPA)、噴司他丁(pentostatin)、聚苯丙生20(polifeprosan 20)與卡莫司汀植入物(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate，Nolvadex®)、替尼泊苷(teniposide，Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、塞替派(thiotepa)、替拉紮明(tirapazamine，Tirazone®)、注射用鹽酸托泊替康(topotecan hydrochloride for injection，Hycamptin®)、長春鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞濱(Navelbine®)。
實例性烷基化劑包括(但不限於)氮芥、乙烯亞胺衍生物、磺酸烷基酯、亞硝基脲及三氮烯)：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Mustard®、Chlorethaminacil®、Demethyldopan®、Desmethyldopan®、Haemanthamine®、Nordopan®、Uracil nitrogen mustard®、 Uracillost®、Uracilmostaza®、Uramustin®、Uramustine®)、甲川氯(chlormethine，Mustargen®)、環磷醯胺(Cytoxan®、Neosar®、Clafen®、Endoxan®、Procytox®、RevimmuneTM)、異環磷醯胺(Mitoxana®)、美法侖(Alkeran®)、氮芥苯丁酸(Leukeran®)、哌血生(pipobroman，Amedel®、Vercyte®)、三乙烯三聚氰胺(Hemel®、Hexalen®、Hexastat®)、三乙烯磷醯胺、替莫唑胺(Temodar®)、噻替派(Thioplex®)、白消安(Busilvex®、Myleran®)、卡莫司汀(BiCNU®)、洛莫司汀(lomustine，CeeNU®)、鏈脲菌素(streptozocin，Zanosar®)及達卡巴嗪(DTIC-Dome®)。其他實例性烷基化劑包括(但不限於)奧利沙鉑(Oxaliplatin，Eloxatin®)；替莫唑胺(Temodar®及Temodal®)；放線菌素(亦稱為放線菌素-D，Cosmegen®)；美法侖(亦稱為L-PAM、L-沙可來新(sarcolysin)及苯丙胺酸氮芥，Alkeran®)；六甲蜜胺(亦稱為六甲基三聚氰胺(HMM)，Hexalen®)；卡莫司汀(BiCNU®)；苯達莫斯汀(Bendamustine，Treanda®)；白消安(Busulfex®及Myleran®)；卡鉑(Paraplatin®)；洛莫司汀(亦稱為CCNU、CeeNU®)；順鉑(亦稱為CDDP、Platinol®及Platinol®-AQ)；氮芥苯丁酸(Leukeran®)；環磷醯胺(Cytoxan®及Neosar®)；達卡巴嗪(亦稱為DTIC、DIC及咪唑甲醯胺，DTIC-Dome®)；六甲蜜胺(亦稱為六甲基三聚氰胺(HMM)、Hexalen®)；異環磷醯胺(Ifex®)；普瑞斯汀(Prednumustine)；丙卡巴肼(Matulane®)；甲基二氯乙胺(亦稱為氮芥、莫斯汀(mustine)及甲基二氯乙胺鹽酸鹽，Mustargen®)；鏈脲菌素(Zanosar®)；噻替派(亦稱為硫代磷醯胺、TESPA及TSPA，Thioplex®)；環磷醯胺(Endoxan®、Cytoxan®、Neosar®、Procytox®、Revimmune®)；及苯達莫斯汀HCl(Treanda®)。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯 替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與氟達拉濱、環磷醯胺及/或利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與氟達拉濱、環磷醯胺及利妥昔單抗(FCR)組合投與個體。在實施例中，個體患有CLL。舉例而言，個體具有染色體17之短臂缺失(del(17p)，例如在白血病細胞中)。在其他實例中，個體不具del(17p)。在實施例中，個體包含包括免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因中之突變之白血病細胞。在其他實施例中，個體不包含包括免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因中之突變之白血病細胞。在實施例中，氟達拉濱係以約10-50mg/m2(例如，約10-15mg/m2、15-20mg/m2、20-25mg/m2、25-30mg/m2、30-35mg/m2、35-40mg/m2、40-45mg/m2或45-50mg/m2)之劑量例如靜脈內投與。在實施例中，環磷醯胺係以約200-300mg/m2(例如，約200-225mg/m2、225-250mg/m2、250-275mg/m2或275-300mg/m2)之劑量例如靜脈內投與。在實施例中，利妥昔單抗係以約400-600mg/m2(例如，400-450mg/m2、450-500mg/m2、500-550mg/m2或550-600mg/m2)之劑量例如靜脈內投與。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與苯達莫斯汀及利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中，個體患有CLL。舉例而言，個體具有染色體17之短臂缺失(del(17p)，例如在白血病細胞中)。在其他實例中，個體不具del(17p)。在實施例中，個體包含包括免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因之突變之白血病細胞。在其他實施例中，個體不包含包括免疫球蛋白重鏈可變區(IgV H )基因之突變之白血病細胞。在實施例中，苯達莫斯汀係以約70-110mg/m2(例如，70-80mg/m2、80-90mg/m2、90-100mg/m2或100-110mg/m2)之劑量例如靜脈內投與。在實施例中，利妥昔單抗係以約400-600mg/m2(例如，400-450mg/m2、450-500mg/m2、500-550mg/m2或550-600mg/m2)之劑量例如靜脈內 投與。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與利妥昔單抗、環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及/或皮質類固醇(例如，普賴松)組合投與個體。 在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與利妥昔單抗、環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及普賴松(R-CHOP)組合投與個體。在實施例中，個體患有瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在實施例中，個體患有非大型限制期DLBCL(例如，包含大小/直徑小於7cm之腫瘤)。在實施例中，個體經輻射與R-CHOP組合治療。舉例而言，向個體投與R-CHOP(例如1-6個週期，例如1個、2個、3個、4個、5個或6個R-CHOP週期)，然後實施輻射。在一些情形下，在輻射後，向個體投與R-CHOP(例如1-6個週期，例如1個、2個、3個、4個、5個或6個R-CHOP週期)。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與依託泊苷、普賴松、長春新鹼、環磷醯胺、多柔比星及/或利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與依託泊苷、普賴松、長春新鹼、環磷醯胺、多柔比星及利妥昔單抗(EPOCH-R)組合投與個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與劑量調節之EPOCH-R(DA-EPOCH-R)組合投與個體。在實施例中，個體患有B細胞淋巴瘤，例如Myc重排之侵襲性B細胞淋巴瘤。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與利妥昔單抗及/或雷利竇邁組合投與個體。雷利竇邁((RS)-3-(4-胺基-1-側氧基1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)六氫吡啶-2,6-二酮)係免疫調節劑。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與利妥昔單抗及雷利竇邁組合投與個體。在實施例 中，個體患有濾泡性淋巴瘤(FL)或外套細胞淋巴瘤(MCL)。在實施例中，個體患有FL且先前未經癌症療法治療。在實施例中，雷利竇邁係以約10-20mg(例如，10-15mg或15-20mg)之劑量例如每天投與。 在實施例中，利妥昔單抗係以約350-550mg/m2(例如，350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450mg/m2、450-475mg/m2或475-500mg/m2)之劑量例如靜脈內投與。
實例性免疫調節劑包括例如阿夫土株單抗(afutuzumab)(可以Roche®購得)；非格司亭(pegfilgrastim)(Neulasta®)；雷利竇邁(CC-5013、Revlimid®)；沙利竇邁(Thalomid®)、泊馬度胺(pomelidomide)、艾迪美(actimid)(CC4047)；及IRX-2(人類細胞介素(包括介白素1、介白素2及干擾素γ)之混合物，CAS 951209-71-5，購自IRX Therapeutics)。
實例性蒽環包括例如多柔比星(Adriamycin®及Rubex®)；博來黴素(lenoxane®)；道諾黴素(鹽酸道諾黴素、柔紅黴素及鹽酸紅比黴素(rubidomycin hydrochloride)，Cerubidine®)；道諾黴素脂質體(檸檬酸道諾黴素脂質體，DaunoXome®)；米托蒽醌(DHAD，Novantrone®)；表柔比星(epirubicin，EllenceTM)；伊達比星(idarubicin，Idamycin®、Idamycin PFS®)；絲裂黴素C(Mutamycin®)；格爾德黴素(geldanamycin)；除莠黴素(herbimycin)；灰暗黴素(ravidomycin)；及去乙醯基灰暗黴素(desacetylravidomycin)。
實例性長春花生物鹼包括例如酒石酸長春瑞濱(Navelbine®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春地辛(Eldisine®)；長春鹼(亦稱為硫酸長春鹼、長春花鹼(vincaleukoblastine)及VLB，Alkaban-AQ®及Velban®)；及長春瑞濱(Navelbine®)。
實例性蛋白體抑制劑包括硼替佐米(Velcade®)；卡非佐米(carfilzomib，PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2- 甲基環氧乙烷-2-基)-1-側氧基戊-2-基)胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-嗎啉基乙醯胺基)-4-苯基丁醯胺基)-戊醯胺)；馬瑞佐米(marizomib，NPI-0052)；檸檬酸易賽佐米(ixazomib citrate，MLN-9708)；德蘭佐米(delanzomib，CEP-18770)；及O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-絲胺醯基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-環氧乙烷基]-2-側氧基-1-(苯基甲基)乙基]-L-絲胺醯胺(ONX-0912)。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與布妥昔單抗組合投與個體。布妥昔單抗係抗-CD30抗體及單甲基奧裡斯他汀E(monomethyl auristatin E)之抗體-藥物偶聯物。在實施例中，個體患有霍奇金氏淋巴瘤(HL)，例如復發性或難治性HL。在實施例中，個體包含CD30+ HL。在實施例中，個體已經歷自體幹細胞移植(ASCT)。在實施例中，個體尚未經歷ASCT。在實施例中，布妥昔單抗係以約1-3mg/kg(例如，約1-1.5mg/kg、1.5-2mg/kg、2-2.5mg/kg或2.5-3mg/kg)之劑量例如靜脈內例如每3週投與。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之本文所述之CAR表現細胞係與布妥昔單抗及達卡巴嗪組合或與布妥昔單抗及苯達莫斯汀組合投與個體。達卡巴嗪係化學名稱為5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)咪唑-4-甲醯胺之烷基化劑。苯達莫斯汀係化學名稱為4-[5-[雙(2-氯乙基)胺基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸之烷基化劑。在實施例中，個體患有霍奇金氏淋巴瘤(HL)。在實施例中，個體先前未經癌症療法治療。在實施例中，個體為至少60歲，例如60歲、65歲、70歲、75歲、80歲、85歲或更長。在實施例中，達卡巴嗪係以約300-450mg/m2(例如，約300-325mg/m2、325-350mg/m2、350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2或425-450mg/m2)之劑量例如靜脈內投與。在實施例中，苯達莫斯汀係以約75-125mg/m2 (例如，75-100mg/m2或100-125mg/m2，例如約90mg/m2)之劑量例如靜脈內投與。在實施例中，布妥昔單抗係以約1-3mg/kg(例如，約1-1.5mg/kg、1.5-2mg/kg、2-2.5mg/kg或2.5-3mg/kg)之劑量例如靜脈內例如每3週投與。
在一些實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與CD20抑制劑(例如抗-CD20抗體(例如，抗-CD20單或雙特異性抗體)或其片段)組合投與個體。實例性抗-CD20抗體包括(但不限於)利妥昔單抗、歐法單抗、歐瑞珠單抗(ocrelizumab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、奧比努單抗(obinutuzumab)、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、奧卡珠單抗(ocaratuzumab)及Pro131921(Genentech)。例如，參見Lim等人，Haematologica.95.1(2010)：135-43。
在一些實施例中，抗-CD20抗體包含利妥昔單抗。利妥昔單抗係結合至CD20且引起CD20表現細胞之細胞溶解之嵌合小鼠/人類單株抗體IgG1 κ，例如如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s53111bl.pdf中所述。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中，個體患有CLL或SLL。
在一些實施例中，利妥昔單抗係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。舉例而言，每一輸注提供約500-2000mg(例如，約500-550mg、550-600mg、600-650mg、650-700mg、700-750mg、750-800mg、800-850mg、850-900mg、900-950mg、950-1000mg、1000-1100mg、1100-1200mg、1200-1300mg、1300-1400mg、1400-1500mg、1500-1600mg、1600-1700mg、1700-1800mg、1800-1900mg或1900-2000mg)利妥昔單抗。在一些實施例中，利妥昔單抗係以150mg/m2至750mg/m2、例如約150-175mg/m2、175-200mg/m2、200-225mg/m2、225-250mg/m2、250-300mg/m2、300-325mg/m2、325-350 mg/m2、350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450mg/m2、450-475mg/m2、475-500mg/m2、500-525mg/m2、525-550mg/m2、550-575mg/m2、575-600mg/m2、600-625mg/m2、625-650mg/m2、650-675mg/m2或675-700mg/m2之劑量來投與，其中m2指示個體之身體表面積。在一些實施例中，利妥昔單抗係以至少4天(例如，4天、7天、14天、21天、28天、35天或更長)之投藥間隔來投與。舉例而言，利妥昔單抗係以至少0.5週(例如，0.5週、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週或更長)之投藥間隔來投與。在一些實施例中，利妥昔單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一定時間段(例如至少2週，例如至少2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週或更長)來投與。舉例而言，利妥昔單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔、以每個治療週期總共至少4個劑量(例如，每個治療週期至少4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個或更多個劑量)來投與。
在一些實施例中，抗-CD20抗體包含歐法單抗。歐法單抗係分子量為約149kDa之抗-CD20 IgG1κ人類單株抗體。舉例而言，歐法單抗係利用轉基因小鼠及雜交瘤技術來產生且係自重組鼠類細胞系(NS0)表現及純化。例如，參見www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；及臨床試驗標識符第NCT01363128號、第NCT01515176號、第NCT01626352號及第NCT01397591號。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與歐法單抗組合投與個體。在實施例中，個體患有CLL或SLL。
在一些實施例中，歐法單抗係以靜脈內輸注來投與。舉例而言，每一輸注提供約150-3000mg(例如，約150-200mg、200-250 mg、250-300mg、300-350mg、350-400mg、400-450mg、450-500mg、500-550mg、550-600mg、600-650mg、650-700mg、700-750mg、750-800mg、800-850mg、850-900mg、900-950mg、950-1000mg、1000-1200mg、1200-1400mg、1400-1600mg、1600-1800mg、1800-2000mg、2000-2200mg、2200-2400mg、2400-2600mg、2600-2800mg或2800-3000mg)歐法單抗。在實施例中，歐法單抗係以約300mg之起始劑量、然後2000mg、例如以約11個劑量例如持續24週來投與。在一些實施例中，歐法單抗係以至少4天(例如，4天、7天、14天、21天、28天、35天或更長)之投藥間隔來投與。舉例而言，歐法單抗係以至少1週(例如，1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、24週、26週、28週、20週、22週、24週、26週、28週、30週或更長)之投藥間隔來投與。在一些實施例中，歐法單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一定時間段(例如至少1週，例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更長，或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更長，或1年、2年、3年、4年、5年或更長)投與。舉例而言，歐法單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔、以每個治療週期總共至少2個劑量(例如，每個治療週期至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量)來投與。
在一些情形下，抗-CD20抗體包含歐瑞珠單抗。歐瑞珠單抗係人類化抗-CD20單株抗體，例如如臨床試驗標識符第NCT00077870號、第NCT01412333號、第NCT00779220號、第NCT00673920號、第NCT01194570號及Kappos等人，Lancet.19.378(2011)：1779-87中所 述。
在一些情形下，抗-CD20抗體包含維妥珠單抗。維妥珠單抗係針對CD20之人類化單株抗體。例如，參見臨床試驗標識符第NCT00547066號、第NCT00546793號、第NCT01101581號及Goldenberg等人，Leuk Lymphoma.51(5)(2010)：747-55。
在一些情形下，抗-CD20抗體包含GA101。GA101(亦稱為奧比努單抗或RO5072759)係人類化及經糖基化改造之抗-CD20單株抗體。例如，參見Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009)：588-96；臨床試驗標識符第NCT01995669號、第NCT01889797號、第NCT02229422號及第NCT01414205號；及www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s0001bl.pdf。
在一些情形下，抗-CD20抗體包含AME-133v。AME-133v(亦稱為LY2469298或奧卡珠單抗)係針對CD20之人類化IgG1單株抗體，其具有與利妥昔單抗相比對FcγRIIIa受體增加的親和力及增強的抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)活性。例如，參見Robak等人，BioDrugs 25.1(2011)：13-25；及Forero-Torres等人，Clin Cancer Res.18.5(2012)：1395-403。
在一些情形下，抗-CD20抗體包含PRO131921。PRO131921係經改造以與利妥昔單抗相比具有與FcγRIIIa之較佳結合及增強的ADCC之人類化抗-CD20單株抗體。例如，參見Robak等人，BioDrugs 25.1(2011)：13-25；及Casulo等人，Clin Immunol.154.1(2014)：37-46；及臨床試驗標識符第NCT00452127號。
在一些情形下，抗-CD20抗體包含TRU-015。TRU-015係源自針對CD20之抗體之結構域的抗-CD20融合蛋白。TRU-015比單株抗體小，但保留了Fc介導之效應物功能。例如，參見Robak等人， BioDrugs 25.1(2011)：13-25。TRU-015含有連接至人類IgG1鉸鏈之抗-CD20單鏈可變片段(scFv)、CH2及CH3結構域，但缺少CH1及CL結構域。
在一些實施例中，本文所述之抗-CD20抗體係偶聯或以其他方式結合至本文所述之治療劑，例如化學治療劑，例如癌得星、氟達拉濱、組織蛋白去乙醯酶抑制劑、去甲基化劑、肽疫苗、抗腫瘤抗生素、酪胺酸激酶抑制劑、烷基化劑、抗微管或抗有絲分裂劑)、抗過敏劑、抗惡心劑(或鎮吐劑)、止痛劑或細胞保護劑。
在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與B細胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制劑(例如維奈斯(venetoclax)，亦稱為ABT-199或GDC-0199)及/或利妥昔單抗組合投與個體。在實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與維奈斯及利妥昔單抗組合投與個體。維奈斯係抑制抗細胞凋亡蛋白BCL-2之小分子。維奈斯4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基環己-1-烯-1-基]甲基}六氫吡嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氫-2H-吡喃-4-基甲基)胺基]苯基}磺醯基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲醯胺)之結構展示於下文中
Figure 104111176-A0202-12-0194-379
在實施例中，個體患有CLL。在實施例中，個體患有復發性CLL，例如先前已向個體投與癌症療法。在實施例中，維奈斯係以約15-600mg(例如，15-20mg、20-50mg、50-75mg、75-100mg、100-200mg、200-300mg、300-400mg、400-500mg或500-600mg)之劑量例如每天投與。在實施例中，利妥昔單抗係以約350-550mg/m2(例如，350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450 mg/m2、450-475mg/m2或475-500mg/m2)之劑量例如靜脈內例如每月投與。
在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之表現本文所述CAR之細胞係與減少Treg細胞群之分子組合投與個體。減少(例如，清除)Treg細胞數之方法為業內已知且包括例如CD25清除、環磷醯胺投與、調節GITR功能。不希望受限於理論，人們認為在血球分離之前或投與本文所述之CAR表現細胞之前減少個體中之Treg細胞數會減少腫瘤微環境中之不期望免疫細胞(例如，Treg)數且降低個體復發之風險。在一個實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之表現本文所述CAR之細胞係與靶向GITR及/或調節GITR功能之分子(例如GITR激動劑及/或清除調控T細胞(Treg)之GITR抗體)組合投與個體。在實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之表現本文所述CAR之細胞係與環磷醯胺組合投與個體。在一個實施例中，GITR結合分子及/或調節GITR功能之分子(例如，GITR激動劑及/或清除Treg之GITR抗體)係在投與CAR表現細胞之前投與。舉例而言，在一個實施例中，GITR激動劑可在細胞之血球分離之前投與。在實施例中，在投與(例如，輸注或再輸注)CAR表現細胞之前或在細胞之血球分離之前向個體投與環磷醯胺。在實施例中，在投與(例如，輸注或再輸注)CAR表現細胞之前或在細胞之血球分離之前向個體投與環磷醯胺及抗-GITR抗體。在一個實施例中，個體患有癌症(例如，實體癌症或血液癌症，例如ALL或CLL)。在實施例中，個體患有CLL。在實施例中，個體患有ALL。在實施例中，個體患有實體癌症，例如本文所述之實體癌症。
實例性GITR激動劑包括例如GITR融合蛋白及抗-GITR抗體(例如，二價抗-GITR抗體)，例如美國專利第6,111,090號、歐洲專利第 090505B1號、美國專利第8,586,023號、PCT公開案第WO 2010/003118號及第2011/090754號中所述GITR融合蛋白，或例如美國專利第7,025,962號、歐洲專利第1947183B1號、美國專利第7,812,135號、美國專利第8,388,967號、美國專利第8,591,886號、歐洲專利第EP 1866339號、PCT公開案第WO 2011/028683號、PCT公開案第WO 2013/039954號、PCT公開案第WO2005/007190號、PCT公開案第WO 2007/133822號、PCT公開案第WO2005/055808號、PCT公開案第WO 99/40196號、PCT公開案第WO 2001/03720號、PCT公開案第WO99/20758號、PCT公開案第WO2006/083289號、PCT公開案第WO 2005/115451號、美國專利第7,618,632號及PCT公開案第WO 2011/051726號中所述之抗-GITR抗體。
在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞及本文所述之激酶抑制劑之組合係與GITR激動劑(例如，本文所述之GITR激動劑)組合投與個體。在一個實施例中，GITR激動劑係在CAR表現細胞之前投與。舉例而言，在一個實施例中，GITR激動劑可在細胞之血球分離之前投與。在一個實施例中，個體患有CLL。
亦可使用抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調神經磷酸酶(環孢素及FK506)或抑制對生長因子誘導之信號傳導至關重要之p70S6激酶的藥物(雷帕黴素)。(Liu等人，Cell 66：807-815,1991；Henderson等人，Immun.73：316-321,1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.5：763-773,1993)。在另一態樣中，本發明之細胞組合物可與以下各項結合(例如，之前、同時或之後)投與患者：骨髓移植、利用化學治療劑(例如氟達拉濱)之T細胞剝除療法、外部光束輻射療法(XRT)、環磷醯胺及/或抗體(例如OKT3或CAMPATH)。在一個態樣中，本發明之細胞組合物係在B細胞剝除療法(例如與CD20反應之藥劑，例如瑞圖宣(Rituxan))之後投與。舉例而言，在一個實施例中，個體可經歷高劑 量化學療法然後進行末梢血幹細胞移植之標準治療。在某些實施例中，在移植後，使個體接受本發明之擴增免疫細胞之輸注。在另一實施例中，擴增細胞係在手術之前或之後投與。
在一個實施例中，可向個體投與減輕或改善與投與CAR表現細胞相關之副作用的藥劑。與投與CAR表現細胞相關之副作用包括(但不限於)CRS及嗜血性淋巴組織球血症(HLH)(亦稱為巨噬細胞活化症候群(MAS))。CRS之症狀包括高熱、惡心、瞬時低血壓、低氧及諸如此類。因此，本文所闡之方法可包含向個體投與本文所述之CAR表現細胞且進一步投與管控升高量之可溶性因子的藥劑，從而使用CAR表現細胞治療。在一個實施例中，在個體中升高之可溶性因子係以下中之一或多者：IFN-γ、TNFα、IL-2受體及IL-6。因此，所投與治療此副作用之藥劑可係中和該等可溶性因子中之一或多者之藥劑。該等藥劑之實例包括(但不限於)類固醇(例如，皮質類固醇)、TNFα抑制劑及IL-6抑制劑。TNFα抑制劑之實例係抗TNFα抗體分子，例如英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、賽妥珠單抗(certolizumab pegol)及戈利木單抗(golimumab)。TNFα抑制劑之另一實例係融合蛋白，例如依那西普(entanercept)。TNFα之小分子抑制劑包括(但不限於)黃嘌呤衍生物(例如配妥西菲林(pentoxifylline))及安非他酮(bupropion)。IL-6抑制劑之實例係抗IL-6抗體分子或抗IL-6受體抗體分子，例如托西莫單抗(tocilizumab)(toc)、賽瑞蘆單抗(sarilumab)、依斯利莫單抗(elsilimomab)、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301及FM101。在一個實施例中，抗IL-6受體抗體分子係托西莫單抗.基於IL-1R之抑制劑之實例係阿那白滯素(anakinra)。
在一個實施例中，可向個體投與增強CAR表現細胞之活性之藥劑。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可係抑制抑制分子之藥劑。在 一些實施例中，抑制分子(例如，程式化死亡配體1(PD1))可降低CAR表現細胞引起免疫效應物反應之能力。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。抑制分子之抑制(例如藉由在DNA、RNA或蛋白質層級上抑制)可最佳化CAR表現細胞性能。在實施例中，可使用抑制核酸(例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA、成簇規律間隔之短迴文重複(CRISPR)、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN))來抑制抑制分子在CAR表現細胞中之表現。在實施例中，抑制劑係shRNA。在實施例中，抑制分子係在CAR表現細胞內被抑制。在該等實施例中，抑制抑制分子之表現之dsRNA分子連接至編碼CAR之組份(例如，所有該等組份)的核酸。在一個實施例中，抑制信號之抑制劑可係例如結合至抑制分子之抗體或抗體片段。舉例而言，藥劑可係結合至PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4之抗體或抗體片段(例如，伊匹單抗(ipilimumab，亦稱為MDX-010及MDX-101，且以Yervoy®出售；Bristol-Myers Squibb；曲美木單抗(Tremelimumab，自Pfizer購得之IgG2單株抗體，之前稱為替西莫單抗(ticilimumab)、CP-675,206)。)。在實施例中，藥劑係結合至TIM3之抗體或抗體片段。在實施例中，藥劑係結合至LAG3之抗體或抗體片段。在實施例中，藥劑係結合至CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)之抗體或抗體片段。
PD1係亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA之CD28受體家族之抑制成員。PD1係在活化B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人，1996 Int.Immunol 8：765-75)。已展示兩種針對PD1、PD-L1及PD-L2之配體在結合至PD1後會下調T細胞活化(Freeman等人2000 J Exp Med 192：1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等 人2002 Eur J Immunol 32：634-43)。PD-L1在人類癌症中較為豐富(Dong等人，2003 J Mol Med 81：281-7；Blank等人，2005 Cancer Immunol.Immunother 54：307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10：5094)。免疫阻抑可藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。 PD1、PD-L1及PD-L2之抗體、抗體片段及其他抑制劑為業內已知且可與本文所述之CD19 CAR組合使用。舉例而言，尼沃魯單抗(nivolumab，亦稱為BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)係特異性阻斷PD1之全人類IgG4單株抗體。特異性結合至PD1之尼沃魯單抗(純系5C4)及其他人類單株抗體揭示於US 8,008,449及WO2006/121168中。易普利姆碼(Pidilizumab，CT-011；Cure Tech)係結合至PD1之人類化IgG1k單株抗體。易普利姆碼及其他人類化抗PD1單株抗體揭示於WO2009/101611中。派姆單抗(Pembrolizumab，之前稱為拉波裡單抗(lambrolizumab)，且亦稱為Keytruda、MK03475；Merck)係結合至PD1之人類化IgG4單株抗體。派姆單抗及其他人類化抗PD1抗體揭示於US 8,354,509及WO2009/114335中。MEDI4736(Medimmune)係結合至PDL1之人類單株抗體，且抑制配體與PD1之相互作用。MDPL3280A(Genentech/Roche)係結合至PD-L1之人類Fc最佳化IgG1單株抗體。針對PD-L1之MDPL3280A及其他人類單株抗體揭示於美國專利第7,943,743號及美國公開案第20120039906號中。其他抗PD-L1結合劑包括YW243.55.S70(在WO2010/077634中，重鏈及輕鏈可變區展示於SEQ ID NO 20及21中)及MDX-1 105(亦稱為BMS-936559及例如WO2007/005874中所揭示之抗PD-L1結合劑。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如WO2010/027827及WO2011/066342中所揭示)係阻斷PD1與B7-H1之間之相互作用之PD-L2 Fc融合可溶性受體。其他抗PD1抗體尤其包括AMP 514(Amplimmune)，例如US 8,609,089、US 2010028330及/或US 20120114649中所揭示之抗PD1抗 體。
TIM3(T細胞免疫球蛋白-3)亦負調控T細胞功能，具體而言在分泌IFN-g之CD4+ T輔助1及CD8+ T細胞毒性1細胞中，且在T細胞耗竭中起關鍵作用。抑制TIM3與其配體(例如，半乳糖凝集素-9(Gal9)、磷脂醯絲胺酸(PS)及HMGB1)之間之相互作用可增加免疫反應。TIM3及其配體之抗體、抗體片段及其他抑制劑可在業內獲得且可與本文所述之CD19 CAR組合使用。舉例而言，靶向TIM3之抗體、抗體片段、小分子或肽抑制劑結合至TIM3之IgV結構域以抑制與其配體之相互作用。抑制TIM3之抗體及肽揭示於WO2013/006490及US20100247521中。其他抗TIM3抗體包括RMT3-23之人類化形式(揭示於Ngiow等人，2011,Cancer Res,71：3540-3551中)及純系8B.2C12(揭示於Monney等人，2002,Nature,415：536-541中)。抑制TIM3及PD-1之雙特異性抗體揭示於US20130156774中。
在其他實施例中，增強CAR表現細胞之活性之藥劑係CEACAM抑制劑(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5抑制劑)。在一個實施例中，CEACAM之抑制劑係抗CEACAM抗體分子。實例性抗CEACAM-1抗體闡述於WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251及WO 2014/022332中，例如單株抗體34B1、26H7及5F4；或其重組形式，如例如US 2004/0047858、US 7,132,255及WO 99/052552中所述。在其他實施例中，抗CEACAM抗體結合至CEACAM-5，如例如Zheng等人PLoS One.2010年9月2日；5(9).pii：e12529(DOI：10：1371/journal.pone.0021146)中所述，或與CEACAM-1及CEACAM-5交叉反應，如例如WO 2013/054331及US 2014/0271618中所述。
不希望受限於理論，人們認為癌胚胎抗原細胞黏附分子(CEACAM)(例如CEACAM-1及CEACAM-5)至少部分地調介抗腫瘤免 疫反應之抑制(例如，參見Markel等人J Immunol.2002年3月15日；168(6)：2803-10；Markel等人J Immunol.2006年11月1日；177(9)：6062-71；Markel等人，Immunology.2009年2月；126(2)：186-200；Markel等人Cancer Immunol Immunother.2010年2月；59(2)：215-30；Ortenberg等人Mol Cancer Ther.2012年6月；11(6)：1300-10；Stern等人J Immunol.2005年6月1日；174(11)：6692-701；Zheng等人PLoS One.2010年9月2日；5(9).pii：e12529)。舉例而言，CEACAM-1已闡述為TIM-3之異嗜性配體且在TIM-3介導之T細胞耐受及耗竭中起作用(例如，參見WO 2014/022332；Huang等人(2014)Nature doi：10.1038/nature13848)。在實施例中，已展示在異種移植物結腸直腸癌模型中，共阻斷CEACAM-1及TIM-3會增強抗腫瘤免疫反應(例如，參見WO 2014/022332；Huang等人(2014)，參見上文)。在其他實施例中，共阻斷CEACAM-1及PD-1會降低T細胞耐受，如例如WO 2014/059251中所述。因此，CEACAM抑制劑可與本文所述之其他免疫調節劑(例如，抗PD-1及/或抗TIM-3抑制劑)一起使用來增強針對癌症(例如，黑色素瘤、肺癌(例如，NSCLC)、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌及如本文所述之其他癌症)之免疫反應。
LAG3(淋巴球活化基因-3或CD223)係在活化T細胞及B細胞上表現之細胞表面分子，已展示其在CD8+ T細胞耗竭中起作用。LAG3及其配體之抗體、抗體片段及其他抑制劑可在業內獲得且可與本文所述之CD19 CAR組合使用。舉例而言，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)係靶向LAG3之單株抗體。IMP701(Immutep)係拮抗劑LAG3抗體，且IMP731(Immutep and GlaxoSmithKline)係清除LAG3抗體。其他LAG3抑制劑包括IMP321(Immutep)，其係結合至II類MHC分子且活化抗原呈遞細胞(APC)之LAG3及Ig之可溶性部分的重組融合蛋白。其他抗體揭示於例如WO2010/019570中。
在一些實施例中，CAR療法及激酶抑制劑係與類鐸受體(TLR)激動劑組合投與。TLR激動劑可係TLR9激動劑。在一些實施例中，TLR激動劑係寡去氧核苷酸，例如富含CG之寡去氧核苷酸，例如未經甲基化之富含CG之寡去氧核苷酸。例如，參見Sagiv-Barfi等人，「Ibrutinib enhances the antitumor immune response induced by intratumoral injection of a TLR9 ligand in syngeneic mouse lymphoma model」.Blood.2015年2月6日.pii：blood-2014-08-593137，其全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，TLR激動劑係與表現CAR之NK細胞組合投與。不受限於理論，TLR激動劑可促進NK細胞(例如表現CAR之NK細胞)之活化。在一些實施例中，TLR激動劑係藉由注射(例如，腫瘤內注射)投與。
在一些實施例中，增強CAR表現細胞之活性之藥劑可係例如包含第一結構域及第二結構域之融合蛋白，其中第一結構域係抑制分子或其片段，且第二結構域係與正信號相關之多肽，例如包含如本文所述之細胞內信號傳導結構域之多肽。在一些實施例中，與正信號相關之多肽可包括CD28、CD27、ICOS之共刺激結構域，例如CD28、CD27及/或ICOS之細胞內信號傳導結構域，及/或例如本文所述之例如CD3 ζ之初級信號傳導結構域。在一個實施例中，融合蛋白係由表現CAR之相同細胞表現。在另一實施例中，融合蛋白係由不表現抗-CD19 CAR之細胞(例如，T細胞)表現。
在一個實施例中，增強本文所述CAR表現細胞之活性之藥劑係miR-17-92。
在一個實施例中，增強本文所述CAR之活性之藥劑係細胞介素。細胞介素具有與T細胞擴增、分化、存活及穩態相關之重要功能。可向接受本文所述之CAR表現細胞之個體投與之細胞介素包括：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18及IL-21或其組合。在較佳實施例 中，所投與細胞介素係IL-7、IL-15或IL-21或其組合。細胞介素可以每天一次或每天一次以上(例如，每天兩次、每天三次或每天四次)來投與。可持續一天以上投與細胞介素，例如持續2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週或4週投與細胞介素。舉例而言，細胞介素係以每天一次持續7天來投與。
在實施例中，細胞介素係與CAR表現細胞組合投與。細胞介素可與CAR表現細胞同時或同步投與，例如在同一天投與。細胞介素可在同一醫藥組合物中製備為CAR表現細胞，或可在單獨醫藥組合物中製備。另一選擇為，細胞介素可在投與CAR表現T細胞後不久(例如，在投與CAR表現細胞後1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天)投與。在進行一天以上之投藥方案中投與細胞介素之實施例中，細胞介素投藥方案之第一天可與CAR表現細胞之投與在同一天，或細胞介素投藥方案之第一天可為投與CAR表現T細胞後1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一個實施例中，在第一天時，向個體投與CAR表現細胞，且在第二天時，每天一次持續後續7天投與細胞介素。在較佳實施例中，欲與CAR表現細胞組合投與之細胞介素係IL-7、IL-15及/或IL-21。
在其他實施例中，細胞介素係在投與CAR表現細胞後之足夠時間段投與，例如在投與CAR表現細胞後至少2週、3週、4週、6週、8週、10週、12週、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或1年或更長時間段投與。在一個實施例中，細胞介素係在評價個體對CAR表現細胞之反應後來投與。舉例而言，根據本文所述之劑量及方案向個體投與CAR表現細胞。在投與CAR表現細胞後2週、3週、4週、6週、8週、10週、12週、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月或1年或更長時間段，利用本文所述之任一方法評價個體對CART療法之反應，包括腫瘤生長之抑 制、循環腫瘤細胞之減少或腫瘤消退。可向對CART療法不展現充分反應之個體投與細胞介素。向對CART療法具有次最佳反應之個體投與細胞介素會改良CART效能及/或抗腫瘤活性。在較佳實施例中，在投與CAR表現細胞後投與之細胞介素係IL-7。
與低劑量之mTOR抑制劑之組合
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑組合投與。
在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不大於90%、至少10%但不大於90%、至少15%但不大於90%、至少20%但不大於90%、至少30%但不大於90%、至少40%但不大於90%、至少50%但不大於90%、至少60%但不大於90%、或至少70%但不大於90%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。
在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不大於80%、至少10%但不大於80%、至少15%但不大於80%、至少20%但不大於80%、至少30%但不大於80%、至少40%但不大於80%、至少50%但不大於80%、或至少60%但不大於80%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。
在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不大於70%、至少10%但不大於70%、至少15%但不大於70%、至少20%但不大於70%、至少30%但不大於70%、至少40%但不大於70%、或至少50%但不大於70%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。
在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不大於60%、至少10%但不大於60%、至少15%但不大於60%、至少20%但不大於60%、至少30%但不大於60%、或至少40%但不大於60%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。
在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不大於50%、至少 10%但不大於50%、至少15%但不大於50%、至少20%但不大於50%、至少30%但不大於50%、或至少40%但不大於50%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。
在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不大於40%、至少10%但不大於40%、至少15%但不大於40%、至少20%但不大於40%、至少30%但不大於40%、或至少35%但不大於40%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。
在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不大於30%、至少10%但不大於30%、至少15%但不大於30%、至少20%但不大於30%、或至少25%但不大於30%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。
在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少1%、2%、3%、4%或5%但不大於20%、至少1%、2%、3%、4%或5%但不大於30%、至少1%、2%、3%、4%或5%但不大於35%、至少1%、2%、3%、4%或5%但不大於40%、或至少1%、2%、3%、4%或5%但不大於45%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。
在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少1%、2%、3%、4%或5%但不大於90%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。
如本文所論述，mTOR抑制之程度可表示為P70 S6激酶抑制之程度，例如mTOR抑制之程度可藉由P70 S6激酶活性之減小量、例如藉由P70 S6激酶受質之磷酸化減小量來確定。mTOR抑制之程度可藉由本文所述之方法、例如藉由Boulay分析或藉由西方墨點量測磷酸化S6含量來評估。
實例性 M TOR抑制劑
如本文所用術語「mTOR抑制劑」係指抑制細胞中之mTOR激酶之化合物或其配體或醫藥上可接受之鹽。在實施例中，mTOR抑制劑係別位抑制劑。在實施例中，mTOR抑制劑係催化抑制劑。
別位mTOR抑制劑包括中性三環化合物雷帕黴素(西羅莫司)；雷帕黴素相關化合物，其為與雷帕黴素具有結構及功能相似性之化合物，包括例如抑制mTOR活性之雷帕黴素衍生物、雷帕黴素類似物(亦稱為雷帕黴素類似物)及其他巨環內酯化合物。
雷帕黴素係由吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)產生之已知巨環內酯抗生素，其具有式A中所展示之結構
Figure 104111176-A0202-12-0206-475
例如，參見McAlpine,J.B.等人，J.Antibiotics(1991)44：688；Schreiber,S.L.等人，J.Am.Chem.Soc.(1991)113：7433；美國專利第3,929,992號。業內對雷帕黴素提出多種編號方案。為避免混淆，當在本文中命名特定雷帕黴素類似物時，利用式A之編號方案給出雷帕黴素之名稱。
可用於本發明中之雷帕黴素類似物係例如O-取代類似物，其中雷帕黴素之環己基環上之羥基經OR1替代，其中R1係羥基烷基、羥基烷氧基烷基、醯基胺基烷基或胺基烷基；例如RAD001，亦稱為依維莫司，如US 5,665,772及WO94/09010中所述，該等專利之內容皆以引用方式併入本文中。其他適宜雷帕黴素類似物包括26或28位置處經取 代之彼等。雷帕黴素類似物可係上文所提及類似物之差向異構物，具體而言在位置40、28或26中經取代之類似物之差向異構物，且可視情況進一步氫化，例如如US 6,015,815、WO95/14023及WO99/15530中所述，該等專利之內容皆以引用方式併入本文中，例如ABT578(亦稱為咗他莫司)或US 7,091,213、WO98/02441及WO01/14387中所述之雷帕黴素類似物，該等專利之內容皆以引用方式併入本文中，例如AP23573，亦稱為瑞達福羅莫司。
來自US 5,665,772之適用於本發明中之雷帕黴素類似物之實例包括(但不限於)40-O-苄基-雷帕黴素、40-O-(4’-羥基甲基)苄基-雷帕黴素、40-O-[4’-(1,2-二羥基乙基)]苄基-雷帕黴素、40-O-烯丙基-雷帕黴素、40-O-[3’-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4(S)-基)-丙-2’-烯-1’-基]-雷帕黴素、(2’E,4’S)-40-O-(4’,5’-二羥基戊-2’-烯-1’-基)-雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙氧基羰基甲基-雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素、40-O-(3-羥基)丙基-雷帕黴素、40-O-(6-羥基)己基-雷帕黴素、40-O-[2-(2-羥基)乙氧基]乙基-雷帕黴素、40-O-[(3S)-2,2-二甲基二氧戊環-3-基]甲基-雷帕黴素、40-O-[(2S)-2,3-二羥基丙-1-基]-雷帕黴素、40-O-(2-乙醯氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-(2-菸醯基氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-[2-(N-嗎啉基)乙醯氧基]乙基-雷帕黴素、40-O-(2-N-咪唑基乙醯氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-[2-(N-甲基-N’-六氫吡嗪基)乙醯氧基]乙基-雷帕黴素、39-O-去甲基-39,40-O,O-伸乙基-雷帕黴素、(26R)-26-二氫-40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素、40-O-(2-胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-乙醯胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-菸醯胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-(N-甲基-咪唑并-2’-基乙氧基甲醯胺基)乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-乙氧基羰基胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-甲苯基磺醯胺基乙基)-雷帕黴素及40-O-[2-(4’,5’-二乙氧羰基-1’,2’,3’-三唑-1’-基)-乙基]-雷帕黴素。
可用於本發明中之其他雷帕黴素類似物係其中雷帕黴素之環己基環上之羥基及/或28位置處之羥基經羥基酯基團替代之類似物，例如於US RE44,768中發現之雷帕黴素類似物，例如替西羅莫司。
可用於本發明中之其他雷帕黴素類似物包括以下彼等：其中16位置處之甲氧基經另一取代基、較佳(視情況經羥基取代)炔基氧基、芾基、正甲氧基苄基或氯苄基替代及/或其中39位置處之甲氧基與39碳一起缺失，以使得雷帕黴素之環己基環變成缺少39位甲氧基之環戊基環；例如如WO95/16691及WO96/41807中所述，該等專利之內容皆以引用方式併入本文中。該等類似物可進一步經修飾，使得雷帕黴素之40位置處之羥基經烷基化及/或32-羰基經還原。
來自WO95/16691之雷帕黴素類似物包括(但不限於)16-去甲氧基-16-(戊-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(丁-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(炔丙基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(4-羥基-丁-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-苄基氧基-40-O-(2-羥基乙基)-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-苄基氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-正-甲氧基苄基-雷帕黴素、16-去甲氧基-40-O-(2-甲氧基乙基)-16-戊-2-炔基)氧基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-脫氧基-39-甲醯基-42-nor-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-脫氧基-39-羥基甲基-42-nor-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-脫氧基-39-羧基-42-nor-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-脫氧基-39-(4-甲基-六氫吡嗪-1-基)羰基-42-nor-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-脫氧基-39-(嗎啉-4-基)羰基-42-nor-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-脫氧基-39-[N-甲基，N-(2-吡啶-2-基-乙基)]胺甲醯基-42-nor-雷帕黴素及39-去甲氧基-40-脫氧基-39-(對甲苯磺醯基亞肼基甲基)-42-nor-雷帕黴素。
來自WO96/41807之雷帕黴素類似物包括(但不限於)32-去側氧基-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-去側氧基-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基- 32-去側氧基-40-O-(2-羥基-乙基)-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-(S)-二氫-40-O-(2-羥基乙基)-雷帕黴素、32(S)-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕黴素及32(S)-二氫-40-O-(2-羥基乙基)-雷帕黴素。
另一適宜雷帕黴素類似物係如US2005/0101624中所述之優米莫司(umirolimus)，該專利之內容以引用方式併入本文中。
RAD001(或者稱為依維莫司(Afinitor®))具有化學名稱(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羥基乙氧基)-3-甲氧基環己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧雜-4-氮雜-三環[30.3.1.04,9]三十六-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮。
別位mTOR抑制劑之其他實例包括西羅莫司(雷帕黴素，AY-22989)、40-[3-羥基-2-(羥基甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕黴素(亦稱為替西羅莫司或CCI-779)及瑞達福羅莫司(AP-23573/MK-8669)。別位mTor抑制劑之其他實例包括咗他莫司(ABT578)及優米莫司。
另一選擇或另外，已發現催化ATP競爭性mTOR抑制劑直接靶向mTOR激酶結構域且靶向mTORC1及mTORC2二者。該等化合物亦係比該等別位mTOR抑制劑(如雷帕黴素)更有效之mTORC1抑制劑，此乃因其調節抗雷帕黴素mTORC1輸出，例如4EBP1-T37/46磷酸化及帽依賴性轉譯。
催化抑制劑包括：BEZ235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-側氧基-8-喹啉-3-基-2,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈或單甲苯磺酸鹽形式。BEZ235之合成闡述於WO2006/122806中；CCG168(或者稱為AZD-8055，Chresta,C.M.等人，Cancer Res,2010,70(1),288-298)，其具有化學名稱{5-[2,4-雙-((S)-3-甲基-嗎啉-4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}-甲醇；3-[2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并 [2,3-d]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲醯胺(WO09104019)；3-(2-胺基苯并[d]噁唑-5-基)-1-異丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(WO10051043及WO2013023184)；N-(3-(N-(3-((3,5-二甲氧基苯基)胺基)喹喏啉-2-基)胺磺醯基)苯基)-3-甲氧基-4-甲基苯甲醯胺(WO07044729及WO12006552)；PKI-587(Venkatesan,A.M.,J.Med.Chem.,2010,53,2636-2645)，其具有化學名稱1-[4-[4-(二甲基胺基)六氫吡啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲；GSK-2126458(ACS Med.Chem.Lett.,2010,1,39-43)，其具有化學名稱2,4-二氟-N-{2-甲氧基-5-[4-(4-嗒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺；5-(9-異丙基-8-甲基-2-嗎啉基-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(WO10114484)；(E)-N-(8-(6-胺基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1-(6-(2-氰基丙-2-基)吡啶-3-基)-3-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-亞基)氰胺(WO12007926)。
催化mTOR抑制劑之其他實例包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-六氫吡嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(WO2006/122806)及Ku-0063794(Garcia-Martinez JM等人，Biochem J.,2009,421(1),29-42).Ku-0063794 is a specific inhibitor of the mammalian target of rapamycin(mTOR)。)WYE-354係催化mTor抑制劑之另一實例(Yu K等人(2009).Biochemical,Cellular,and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin.Cancer Res.69(15)：6232-6240)。
可根據本發明使用之mTOR抑制劑亦包括前述任一者之前藥、衍生物、醫藥上可接受之鹽或其類似物。
mTOR抑制劑(例如RAD001)可經調配以基於業內已充分建立之方法基於本文所述之具體劑量來遞送。具體而言，美國專利6,004,973(以引用方式併入本文中)提供可與本文所述之mTOR抑制劑一起使用之調配物之實例。
MTOR抑制之評估
mTOR使激酶P70 S6磷酸化，由此活化P70 S6激酶且容許其磷酸化其受質。mTOR抑制之程度可表示為P70 S6激酶抑制之程度，例如mTOR抑制之程度可藉由P70 S6激酶活性之減小量、例如藉由P70 S6激酶受質之磷酸化減小量來確定。mTOR抑制之程度可藉由在抑制劑不存在下(例如在投與抑制劑之前)及在抑制劑存在下或在投與抑制劑後量測P70 S6激酶活性(P70 S6激酶磷酸化受質之能力)來確定。P70 S6激酶之抑制程度給出mTOR抑制之程度。因此，若P70 S6激酶被抑制40%，則mTOR活性(如藉由P70 S6激酶活性所量測)被抑制40%。本文所提及之抑制程度或抑制度係在劑量間隔內之平均抑制度。舉例而言，若抑制劑係以每週一次給予，則抑制程度係藉由該間隔(即一週)內之平均抑制程度來給出。
Boulay等人，Cancer Res,2004,64：252-61(其以引用方式併入本文中)教示可用於評價mTOR抑制之程度之分析(在本文中稱為Boulay分析)。在實施例中，該分析依賴於在投與mTOR抑制劑(例如RAD001)之前及之後量測生物樣品之P70 S6激酶活性。可在經mTOR抑制劑治療後之預選時間下(例如，在治療後24小時、48小時及72小時)獲取樣品。可使用例如來自皮膚或末梢血單核細胞(PBMC)之生物樣品。自樣品製備總蛋白質提取物。藉由免疫沈澱利用特異性識別P70 S6激酶之抗體自蛋白質提取物分離P70 S6激酶。可在活體外激酶分析中量測經分離P70 S6激酶之活性。可在容許受質磷酸化之條件下，將經分離激酶與40S核糖體亞單位受質(其係P70 S6激酶之內源受質)及γ-32P一起培育。然後，可在SDS-PAGE凝膠上解析反應混合物，且利用磷像儀分析32P信號。對應於40S核糖體亞單位之大小之32P信號指示P70 S6激酶之磷酸化受質及活性。可藉由以下方式計算激酶活性之增加及減小：量化磷酸化受質之32P信號之區域及強度(例如，利用 ImageQuant,Molecular Dynamics)，將任意單位值分配至所量化信號，及比較投與後之值與投與前之值或參考值。舉例而言，激酶活性之抑制%可使用下式來計算：1-(投與後獲得之值/投與前獲得之值)×100。如上文所述，本文所提及之抑制程度或抑制度係劑量間隔內之平均抑制度。
用於評估激酶活性(例如，P70 S6激酶活性)之方法亦提供於US 7,727,950中，該專利以引用方式併入本文中。
mTOR抑制之程度亦可藉由PD1陰性T細胞對PD1陽性T細胞之比率變化來評估。來自末梢血之T細胞可藉由業內已知之方法鑑別為PD1陰性或陽性。
低劑量mTOR抑制劑
本文所述之方法利用低免疫增強劑量之mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，包括雷帕黴素類似物，例如RAD001。相比之下，完全或接近完全抑制mTOR路徑之抑制劑含量為免疫阻抑性且用於例如預防器官移植排斥。另外，完全抑制mTOR之高劑量之雷帕黴素類似物亦抑制腫瘤細胞生長且用於治療多種癌症(例如，Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors.Salvadori M.World J Transplant.2012年10月24日；2(5)：74-83；Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma：Role of mTOR Inhibition.Finn RS.Liver Cancer.2012年11月；1(3-4)：247-256；Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma.Moeini A、Cornellà H、Villanueva A.Liver Cancer.2012年9月；1(2)：83-93；Targeted cancer therapy-Are the days of systemic chemotherapy numbered？Joo WD、Visintin I、Mor G.Maturitas.2013年9月20日.；Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor.Santoni M、 Berardi R、Amantini C、Burattini L、Santini D、Santoni G、Cascinu S.Int J Cancer.2013年10月2日)。
本發明至少部分地基於以下令人驚奇的發現：mTOR抑制劑之遠低於用於當前臨床環境中之彼等之劑量在增加個體之免疫反應及增加PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞比率方面具有優異效應。令人驚奇的是，僅產生mTOR活性之部分抑制之低劑量之mTOR抑制劑能夠有效地改良人類個體中的免疫反應且增加PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率。
另一選擇為或另外，不希望受限於任何理論，人們認為例如與未經治療之個體相比，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑可例如至少瞬時地增加原初T細胞數。另一選擇或另外，儘管亦不希望受限於理論，但人們認為在足量時間或足夠投藥後使用mTOR抑制劑治療會產生以下各項中之一或多者：增加以下標記物中之一或多者在例如記憶T細胞(例如，記憶T細胞前體)上之表現：CD62L高、CD127高、CD27+及BCL2；減少KLRG1例如在記憶T細胞(例如，記憶T細胞前體)上之表現；及增加記憶T細胞前體(例如，具有以下特徵中之任一者或該等特徵之組合之細胞)數：增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、減少的KLRG1及增加的BCL2；且其中例如與未經治療之個體相比，例如至少瞬時出現上述任一變化(Araki,K等人(2009)Nature 460：108-112)。記憶T細胞前體係處在分化程式早期之記憶T細胞。舉例而言，記憶T細胞具有以下特徵中之一或多者：增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、減少的KLRG1及/或增加的BCL2。
在實施例中，本發明係關於mTOR抑制劑(例如別位mTOR抑制 劑，例如雷帕黴素類似物、雷帕黴素或RAD001；或催化mTOR抑制劑)之組合物或劑型，其在所選投藥方案下以例如每天一次或每週一次投與時與以下各項相關：與完全或顯著免疫阻抑不相關、但與免疫反應之增強相關之mTOR抑制程度。
mTOR抑制劑(例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素類似物、雷帕黴素或RAD001；或催化mTOR抑制劑)可於持續釋放調配物中提供。本文所述之組合物或單位劑型中之任一者可於持續釋放調配物中提供。在一些實施例中，持續釋放調配物將具有低於立即釋放調配物之生物利用度。例如，在實施例中，為獲得立即釋放調配物之類似治療效應，持續釋放調配物將具有約2倍至約5倍、約2.5倍至約3.5倍或約3倍的立即釋放調配物中所提供之抑制劑量。
在實施例中，提供例如RAD001之立即釋放形式，其通常係以每週一次投與，每單位劑型具有0.1mg至20mg、0.5mg至10mg、2.5mg至7.5mg、3mg至6mg或約5mg。對於每週一次投與，該等立即釋放調配物對應於持續釋放形式，其分別具有0.3mg至60mg、1.5mg至30mg、7.5mg至22.5mg、9mg至18mg或約15mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。在實施例中，兩種形式皆係基於一次/週來投與。
在實施例中，提供例如RAD001之立即釋放形式，其通常係以每天投與一次來使用，每單位劑型具有0.005mg至1.5mg、0.01mg至1.5mg、0.1mg至1.5mg、0.2mg至1.5mg、0.3mg至1.5mg、0.4mg至1.5mg、0.5mg至1.5mg、0.6mg至1.5mg、0.7mg至1.5mg、0.8mg至1.5mg、1.0mg至1.5mg、0.3mg至0.6mg或約0.5mg。對於每天一次投與，該等立即釋放形式對應於持續釋放形式，其分別具有0.015mg至4.5mg、0.03mg至4.5mg、0.3mg至4.5mg、0.6mg至4.5mg、0.9mg至4.5mg、1.2mg至4.5mg、1.5mg至4.5mg、1.8mg至 4.5mg、2.1mg至4.5mg、2.4mg至4.5mg、3.0mg至4.5mg、0.9mg至1.8mg或約1.5mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。對於每週一次投與，該等立即釋放形式對應於持續釋放形式，其分別具有0.1mg至30mg、0.2mg至30mg、2mg至30mg、4mg至30mg、6mg至30mg、8mg至30mg、10mg至30mg、1.2mg至30mg、14mg至30mg、16mg至30mg、20mg至30mg、6mg至12mg或約10mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。
在實施例中，提供例如RAD001之立即釋放形式，其通常係以每天投與一次來使用，每單位劑型具有0.01mg至1.0mg。對於每天一次投與，該等立即釋放形式對應於持續釋放形式，其分別具有0.03mg至3mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。對於每週一次投與，該等立即釋放形式對應於持續釋放形式，其分別具有0.2mg至20mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。
在實施例中，提供例如RAD001之立即釋放形式，其通常係以每週投與一次來使用，每單位劑型具有0.5mg至5.0mg。對於每週一次投與，該等立即釋放形式對應於持續釋放形式，其分別具有1.5mg至15mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。
如上文所述，mTOR路徑之一個靶係P70 S6激酶。因此，可用於本文所述方法及組合物中之mTOR抑制劑之劑量係在mTOR抑制劑不存在下足以達成相對於P70 S6激酶之活性不大於80%之P70 S6激酶活性抑制的彼等，例如如藉由本文所述之分析(例如，Boulay分析)所量測。在另一態樣中，本發明提供在mTOR抑制劑不存在下足以達成相對於P70 S6激酶活性不大於38%之P70 S6激酶活性抑制之mTOR抑制 劑的量。
在一個態樣中，例如在投與人類個體時，可用於本發明方法及組合物中之mTOR抑制劑之劑量足以達成90+/-5%(即，85%-95%)、89+/-5%、88+/-5%、87+/-5%、86+/-5%、85+/-5%、84+/-5%、83+/-5%、82+/-5%、81+/-5%、80+/-5%、79+/-5%、78+/-5%、77+/-5%、76+/-5%、75+/-5%、74+/-5%、73+/-5%、72+/-5%、71+/-5%、70+/-5%、69+/-5%、68+/-5%、67+/-5%、66+/-5%、65+/-5%、64+/-5%、63+/-5%、62+/-5%、61+/-5%、60+/-5%、59+/-5%、58+/-5%、57+/-5%、56+/-5%、55+/-5%、54+/-5%、54+/-5%、53+/-5%、52+/-5%、51+/-5%、50+/-5%、49+/-5%、48+/-5%、47+/-5%、46+/-5%、45+/-5%、44+/-5%、43+/-5%、42+/-5%、41+/-5%、40+/-5%、39+/-5%、38+/-5%、37+/-5%、36+/-5%、35+/-5%、34+/-5%、33+/-5%、32+/-5%、31+/-5%、30+/-5%、29+/-5%、28+/-5%、27+/-5%、26+/-5%、25+/-5%、24+/-5%、23+/-5%、22+/-5%、21+/-5%、20+/-5%、19+/-5%、18+/-5%、17+/-5%、16+/-5%、15+/-5%、14+/-5%、13+/-5%、12+/-5%、11+/-5%或10+/-5%之P70 S6激酶活性抑制，例如如藉由本文所述之分析(例如，Boulay分析)所量測。
個體中之P70 S6激酶活性可利用業內已知之方法來量測，例如根據美國專利7,727,950中所述之方法、藉由磷酸P70 S6K含量及/或磷酸P70 S6含量之免疫印跡分析或藉由活體外激酶活性分析來量測。
如本文所用提及mTOR抑制劑之劑量之術語「約」係指mTOR抑制劑之量之至多+/- 10%變化，但可包括在所述劑量周圍無變化。
在一些實施例中，本發明提供方法，其包含向個體投與在目標穀值內之劑量之mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。在一些實施例中，該穀值顯著低於與用於器官移植及癌症患者中之投藥 方案相關之穀值。在實施例中，投與mTOR抑制劑(例如RAD001或雷帕黴素)以產生小於產生免疫阻抑或抗癌效應之穀值之½、1/4、1/10或1/20的穀值。在實施例中，投與mTOR抑制劑(例如RAD001或雷帕黴素)以產生小於經FDA批準之用於免疫阻抑或抗癌指示之封裝插頁上提供的穀值之½、1/4、1/10或1/20的穀值。
在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.1ng/ml至10ng/ml、0.1ng/ml至5ng/ml、0.1ng/ml至3ng/ml、0.1ng/ml至2ng/ml或0.1ng/ml至1ng/ml之目標穀值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。
在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.2ng/ml至10ng/ml、0.2ng/ml至5ng/ml、0.2ng/ml至3ng/ml、0.2ng/ml至2ng/ml或0.2ng/ml至1ng/ml之目標穀值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。
在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.3ng/ml至10ng/ml、0.3ng/ml至5ng/ml、0.3ng/ml至3ng/ml、0.3ng/ml至2ng/ml或0.3ng/ml至1ng/ml之目標穀值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。
在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.4ng/ml至10ng/ml、0.4ng/ml至5ng/ml、0.4ng/ml至3ng/ml、0.4ng/ml至2ng/ml或0.4ng/ml至1ng/ml之目標穀值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。
在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.5ng/ml至10ng/ml、0.5ng/ml至5ng/ml、0.5ng/ml至3ng/ml、0.5ng/ml至2ng/ml或0.5ng/ml至1ng/ml之目標穀值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。
在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供1ng/ml至 10ng/ml、1ng/ml至5ng/ml、1ng/ml至3ng/ml或1ng/ml至2ng/ml之目標穀值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。
如本文所用術語「穀值」係指在下一劑量之前血漿中之即刻藥物濃度或兩個劑量之間之最低藥物濃度。
在一些實施例中，RAD001之目標穀值介於約0.1ng/ml與4.9ng/ml之間。在實施例中，目標穀值低於3ng/ml，例如介於0.3ng/ml或更小與3ng/ml之間。在實施例中，目標穀值低於3ng/ml，例如介於0.3ng/ml或更小與1ng/ml之間。
在另一態樣中，本發明可利用與RAD001之指定目標穀值生物等效之目標穀值相關之量的除RAD001外之mTOR抑制劑。在實施例中，除RAD001外之mTOR抑制劑之目標穀值係給出與本文所述RAD001之穀值所給出相同之mTOR抑制程度的含量(例如，如藉由本文所述之方法(例如，P70 S6激酶之抑制)所量測)。
醫藥組合物：mTOR抑制劑
在一個態樣中，本發明係關於醫藥組合物，其包含經調配與本文所述之CAR細胞組合使用之mTOR抑制劑，例如如本文所述之mTOR抑制劑。
在一些實施例中，mTOR抑制劑經調配以與例如如本文所述之另一藥劑組合投與。
一般而言，本發明化合物將以如上文所述之治療有效量經由業內已知之任一常用及可接受之模式、單獨或與一或多種治療劑組合投與。
醫藥調配物可使用習用溶解及混合程序來製備。舉例而言，在一或多種本文所述賦形劑存在下，使散裝藥物物質(例如mTOR抑制劑或該化合物之穩定形式(例如與環糊精衍生物或其他已知複合劑之複合物))溶解於適宜溶劑中。通常將mTOR抑制劑調配成醫藥劑型以提 供藥物之容易控制劑量並給予患者美觀且容易處置之產品。
本發明化合物可以醫藥組合物形式藉由任何習用途徑、具體而言腸內(例如經口，例如以錠劑或膠囊形式)或非經腸(例如以可注射溶液或懸浮液形式)、經局部(例如以洗劑、凝膠、軟膏劑或乳霜形式或以鼻或栓劑形式)來投與。在mTOR抑制劑係與如本文所述之另一藥劑組合投與(同時或單獨)，在一個態樣中，兩種組份可藉由同一途徑(例如，非經腸)來投與。另一選擇為，另一藥劑可藉由相對於mTOR抑制劑不同之途徑來投與。舉例而言，mTOR抑制劑可經口投與，且另一藥劑可非經腸投與。
持續釋放
本文所揭示之mTOR抑制劑(例如，別位mTOR抑制劑或催化mTOR抑制劑)可以醫藥調配物以包含本文所揭示之mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)之經口固體劑型來提供，其與立即釋放(IR)錠劑相比滿足產物穩定性要求及/或具有有利的藥物動力學性質，例如降低的平均血漿峰值濃度、降低的患者間及患者內藥物吸收程度及血漿峰值濃度變化、降低的Cmax/Cmin比率及/或降低的食物效應。所提供之醫藥調配物可容許更精確的劑量調節及/或降低不良事件之頻率，因此為患者提供較安全的本文所揭示mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)治療。
在一些實施例中，本發明提供本文所揭示mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)之穩定延長釋放調配物，其係多顆粒系統且可具有功能層及包衣。
如本文所用之術語「延長釋放多顆粒調配物」係指能夠在延長時間段內(例如在至少1小時、2小時、3小時、4小時、5小時或6小時內)釋放本文所揭示之mTOR抑制劑(例如雷帕黴素或RAD001)之調配物。延長釋放調配物可含有由特殊賦形劑(例如如下文所述)製成之基 質及包衣，其係以使活性成份在攝取後之延長時間段內可利用之方式調配。
術語「延長釋放」可與術語「持續釋放」(SR)或「長期釋放」互換使用。根據藥典Ph.Eur(第7版)專著中對於錠劑及膠囊及USP一般章節<1151>中對於醫藥劑型之定義，術語「延長釋放」係指口服給藥後不立即釋放活性藥物物質而是在延長時間內釋放之醫藥調配物。根據「Guidance for Industry：Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms」(FDA CDER,1997)之定義，如本文所用之術語「立即釋放」係指在小於60分鐘內釋放85%活性藥物物質之醫藥調配物。在一些實施例中，術語「立即釋放」意指在30分鐘時間內自錠劑釋放依維莫司，例如如在下文所述之溶解分析中所量測。
本文所揭示mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)之穩定延長釋放調配物之特徵可在於利用業內已知之分析(例如如本文所述之溶解分析)之活體外釋放圖譜：在37℃下向溶解容器中填充900mL含有0.2%十二烷基硫酸鈉之磷酸鹽緩衝液(pH 6.8)，且藉由分別根據USP測試專著711及Ph.Eur.測試專著2.9.3.根據USP在75rpm下利用槳板方法實施溶解。
在一些實施例中，在活體外釋放分析中，本文所揭示mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)之穩定延長釋放調配物根據以下釋放說明釋放mTOR抑制劑： 0.5h：<45%或<40%，例如<30%
1h：20%-80%，例如30%-60%
2h：>50%或>70%，例如>75%
3h：>60%或>65%，例如>85%，例如>90%。
在一些實施例中，在活體外溶解分析中，本文所揭示mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)之穩定延長釋放調配物不早於45min、 60min、75min、90min、105min或120min釋放50%之mTOR抑制劑。
生物聚合物遞送方法
在一些實施例中，視情況與激酶抑制劑(例如BTK抑制劑，例如依魯替尼)組合之一或多種如本文所揭示之CAR表現細胞可經由生物聚合物支架(例如，生物聚合物植入物)投與或遞送至個體。生物聚合物支架可支持或增強本文所述CAR表現細胞之遞送、擴增及/或分散。生物聚合物支架包含可為天然或合成之生物相容性(例如，實質上不引起發炎性或免疫反應)及/或生物可降解聚合物。
適宜生物聚合物之實例包括(但不限於)任何濃度及任何比率之瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鹽、海藻酸鹽/磷酸鈣水泥(CPC)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、(1,2,3,4,6-五乙醯基a-D-半乳糖)、纖維素、甲殼質、幾丁聚糖、膠原、彈性蛋白、明膠、玻尿酸膠原、羥基磷灰石、聚(丁酸3-羥基酯-共-己酸3-羥基酯)(PHBHHx)、聚(交酯)、聚(己內酯)(PCL)、聚(交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚氧化乙烯(PEO)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚氧化丙烯(PPO)、聚乙烯醇)(PVA)、絲、大豆蛋白及大豆蛋白分離物單獨或與任何其他聚合物組合物之組合。生物聚合物可經促進黏附或遷移之分子(例如，結合至淋巴球之膠原受體之膠原模擬肽及/或刺激分子)加強或修飾，以增強欲遞送細胞之遞送、擴增或功能，例如抗癌活性。生物聚合物支架可係可注射的，例如凝膠或半固體或固體組合物。
在一些實施例中，在遞送至個體之前將本文所述之CAR表現細胞接種至生物聚合物支架上。在實施例中，生物聚合物支架進一步包含一或多種本文所述之其他治療劑(例如，另一CAR表現細胞、抗體或小分子)或增強CAR表現細胞之活性(例如，納入或偶聯至支架之生物聚合物)的藥劑。在實施例中，生物聚合物支架係經例如腫瘤內注射 或手術植入腫瘤處或腫瘤附近，以足以調介抗腫瘤效應。生物聚合物組合物及其遞送方法之其他實例闡述於Stephan等人，Nature Bio Biotechnology,2015,33：97-101；及WO2014/110591中。
醫藥組合物及治療
本發明之醫藥組合物可包含CAR表現細胞(例如複數個如本文所述之CAR表現細胞)與一或多種醫藥上或生理上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。該等組合物可包含緩衝液，例如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及諸如此類；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或聚葡萄糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，例如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，例如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；及防腐劑。在一個態樣中，本發明組合物經調配以供靜脈內投與。
本發明之醫藥組合物可以適用於欲治療(或預防)疾病之方式投與。投與之量及頻率將由諸如患者之病況以及患者疾病之類型及嚴重程度等要素來確定，但適宜劑量可藉由臨床試驗來確定。
在一個實施例中，醫藥組合物實質上不含、例如無可檢測量之例如選自由以下組成之群之污染物：內毒素、微漿菌(mycoplasma)、複製勝任慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘餘抗-CD3/抗-CD28包覆之珠粒、小鼠抗體、所彙集之人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組份、載體封裝細胞或質體組份、細菌及真菌。在一個實施例中，細菌係選自由以下組成之群中之至少一者：鹼性糞便菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A群釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。
當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」 或「治療量」時，欲投與之本發明組合物之精確量可由醫師根據患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及病況之個體差異來確定。通常可陳述，包含本文所述T細胞之醫藥組合物可以104至109個細胞/kg體重、在一些情況下105至106個細胞/kg體重(包括彼等範圍內之所有整數值)之劑量來投與。T細胞組合物亦可以該等劑量投與多次。該等細胞可藉由利用免疫療法中通常已知之輸注技術來投與(例如，參見Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。
在某些態樣中，可期望向個體投與活化T細胞，且然後隨後再抽取血液(或實施血球分離)，根據本發明活化來自其之T細胞，且向患者再輸注該等活化及擴增之T細胞。此過程可每隔數週實施多次。在某些態樣中，T細胞可自10cc至400cc之血液抽取物活化。在某些態樣中，T細胞係自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc之血液抽取物活化。
個別組合物之投與可以任何方便方式實施，包括氣溶膠吸入、注射、攝取、輸液、植入或移植。本文所述之組合物可以下列方式投與患者：經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、鼻內、髓內、肌內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內。在一個態樣中，本發明之T細胞組合物係藉由皮內或皮下注射投與患者。在一個態樣中，本發明之T細胞組合物係藉由i.v.注射投與。T細胞組合物可直接注射至腫瘤、淋巴結或感染位點中。
在具體實例性態樣中，個體可經歷白血球分離，其中以離體方式收集、富集或清除白血球以選擇及/或分離所關注細胞(例如T細胞)。該等T細胞分離物可藉由業內已知之方法來擴增並處理，使得可引入本發明之一或多個CAR構築物，由此產生本發明之CAR T細胞。 隨後可使有需要之個體經歷使用高劑量化學療法然後進行外周血幹細胞移植之標準治療。在某些態樣中，移植後或同時，對個體輸注本發 明之擴增CAR T細胞。在另一態樣中，擴增細胞係在手術之前或之後投與。
欲投與患者之上述治療之劑量將隨所治療病況之精確性質及治療之接受者而變化。用於人類投與之劑量之放大可根據業內接受之實踐來實施。例如，對於成年患者，CAMPATH之劑量通常將介於1mg至約100mg範圍內，通常每天投與持續1天與30天之間之時段。較佳每天劑量係1mg/天至10mg/天，但在一些情況下可使用高達40mg/天之較大劑量(闡述於美國專利第6,120,766號中)。
在一個實施例中，例如利用活體外轉錄將CAR引入T細胞中，且個體(例如人類)接受本發明CAR T細胞之初始投與及本發明CAR T細胞之一或多次隨後投與，其中一或多次隨後投與係在先前投與後小於15天(例如14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天)時投與。在一個實施例中，向個體(例如，人類)每週投與本發明CAR T細胞之一次以上的投與，例如每週投與本發明CAR T細胞之2次、3次或4次投與。在一個實施例中，個體(例如，人類個體)每週接受CAR T細胞之一次以上的投與(例如，每週2次、3次或4次投與)(在本文中亦稱為週期)，最後一週不進行CAR T細胞投與，且然後向個體投與CAR T細胞之一或多次額外投與(例如，每週CAR T細胞之一次以上的投與)。在另一實施例中，個體(例如人類個體)接受一個以上的CAR T細胞週期，且每一週期之間之時間小於10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一個實施例中，CAR T細胞係以每隔一天每週持續3次投與來投與。在一個實施例中，將本發明之CAR T細胞投與持續至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或更長。
在一個態樣中，CAR表現細胞係利用慢病毒病毒載體(例如慢病毒)來產生。以該方式產生之細胞(例如，CART)將具有穩定的CAR表 現。
在一個態樣中，CAR表現細胞(例如，CART)係利用病毒載體(例如γ逆轉錄病毒載體，例如本文所述之γ逆轉錄病毒載體)來產生。利用該等載體產生之CART可具有穩定的CAR表現。
在一個態樣中，CART在轉導後4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天瞬時表現CAR載體。CAR之瞬時表現可藉由RNA CAR載體遞送來實現。在一個態樣中，CAR RNA係藉由電穿孔轉導至T細胞中。
在多次治療後可在利用瞬時表現CAR T細胞(具體而言使用帶有鼠類scFv之CART)治療之患者中出現之潛在問題係過敏反應。
不受限於此理論，人們認為此一過敏性反應可係由發生體液抗CAR反應(即具有抗IgE同型之抗CAR抗體)之患者引起。人們認為當在暴露於抗原時存在10至14天中斷時，患者之產生抗體之細胞經歷自IgG同型(不會引起過敏反應)至IgE同型之類別轉換。
若患者在瞬時CAR療法進程期間具有產生抗CAR抗體反應之高風險(例如藉由RNA轉導產生之彼等)，則CART輸注中斷不應持續10至14天以上。
實例
藉由參考以下實驗實例進一步詳細闡述本發明。除非另有說明，否則該等實例係僅出於說明目的而提供，且並不意欲具有限制性。因此，本發明決不應理解為限制以下實例，而應理解為涵蓋因本文所提供之教示而變得明瞭之任何及所有變化形式。
未加進一步闡述，人們認為，熟習此項技術者可使用前文描述及以下說明性實例來製備及利用本發明化合物並實踐所主張之方法。以下工作實例明確指出本發明之各個態樣，且不應理解為以任何方式限制本發明之其餘部分。
實例1：鼠類抗-CD19抗體之人類化
CD19抗體分子可係例如WO2014/153270中所述之抗體分子(例如，人類化抗-CD19抗體分子)，該專利之全文皆以引用方式併入本文中。鼠類CD19抗體之人類化期望用於臨床環境，其中小鼠特異性殘基可在接受CART19治療(即使用經CAR19構築體轉導之T細胞治療)之患者中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。自所公開文獻提取雜交瘤源性鼠類CD19抗體之VH及VL序列(Nicholson等人，1997，參見上文)。藉由將CDR區自鼠類CD19抗體移植至人類種系受體框架VH4_4-59及VK3_L25(vBASE數據庫)上來完成人類化。除CDR區外，自鼠類序列保留認為支持CDR區之結構完整性之5種框架殘基(即VH編號71，編號73，編號78及VL編號71、編號87)。此外，將人類J元件JH4及JK2分別用於重鏈及輕鏈。人類化抗體之所得胺基酸序列分別命名為FMC63_VL_hz及FMC63_VH_hzl，且展示於下表1中。殘基編號遵循Kabat(Kabat E.A等人，1991，參見上文)。對於CDR定義，使用Kabat以及Chothia等人，1987，參見上文)二者。來自小鼠CD19之殘基以粗體/斜體展示。帶框之位置編號60/61/62指示CDR H2(亦稱為HCDR2)中之潛在轉譯後修飾(PTM)位點。
Figure 104111176-A0202-12-0226-381
Figure 104111176-A0202-12-0227-382
使用該等人類化CD19 IgG產生可溶性scFv以測試完整CART CD19構築體之表現及scFv(參見下文實例)。引人關注的是在人類化期間，CDRH2區中之位置62偏向為存在於鼠類CDRH2中之絲胺酸殘基而非丙胺酸。鼠類序列缺少轉譯後修飾(PTM)，且在CDRH2中之位置60/61/62處分別具有天冬醯胺-絲胺酸-丙胺酸。此在人類化進程期間產生潛在PTM基序(指示為CDRH2中之帶框位點)。測試在人類化過程期間產生之PTM位點實際上為「真實」PTM位點抑或僅係理論位點。假設胺基酸基序天冬醯胺後隨絲胺酸(NS)可能易於轉譯後去醯胺但不易明瞭。亦假設天冬醯胺後隨除脯胺酸外之任何胺基酸且然後後隨絲胺酸(NxS，x≠P)可能易於轉譯後N-糖基化。為測試此假說，產生兩個IgG變體，其中位置60(已知為糖基化位點)處之天冬醯胺突變成絲胺酸或麩醯胺酸，且分別命名為FMC63_VH_hz2(N60S)及FMC63_VH_hz2(N60Q)。產生該等構築體以消除潛在轉譯後修飾位點(PTM)並測試所保留之活性(參見下文實例2)。
選殖：
獲得編碼小鼠及人類化VL及VH結構域之DNA序列，且最佳化構築體之密碼子以在來自智人(Homo sapiens)之細胞中表現。
將編碼VL及VH結構域之序列自選殖載體亞選殖至適於在哺乳動物細胞中分泌之表現載體中。將重鏈及輕鏈選殖至個別表現載體中以容許共轉染。表現載體之元件包括啟動子(巨細胞病毒(CMV)增強子-啟動子)、促進分泌之信號序列、多聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(牛生長激素(BGH)基因)、容許進行附加型複製及在原核生物中複製之元 件(例如SV40起點及ColE1或業內已知之其他元件)及容許進行選擇之元件(胺苄青黴素抗性基因及博來黴素標記物)。
表現：
使嵌合體及人類化IgG候選者以1ml規模在HEK293F哺乳動物細胞中表現。澄清上清液用於FACS結合研究。更精確而言，在補充有青黴素/鏈黴素之FreeStyle培養基中將HEK293F細胞稀釋至5E5個細胞/ml，且將1ml轉移至24孔圓底深板中。將0.5μg輕鏈及0.5μg重鏈哺乳動物表現質體與4μl FuGENE HD(Roche REF 04709705001)一起稀釋於相同培養基中。15min RT培育後，將DNA/Fugene混合物逐滴添加至細胞中，且於5% CO2培育器中在250rpm、37℃下放置5天。然後藉由離心自細胞分離上清液。為量測IgG含量，將200μL等份置於96孔微量滴定板之孔中。利用蛋白質A Dip以一式兩份量測所有樣品及標準物且讀取生物感測器(Fortebio目錄編號18-5010)。將板置於Octet儀器(ForteBio)中且容許在恒溫室中平衡至27℃。利用Octet User軟體3.0版自動處理數據且藉由與IgG標準曲線比較來確定濃度。
藉由FACS之結合分析：
使用流式細胞術結合分析利用細胞系300.19-hsCD19FL評估人類化及嵌合體抗體。此細胞系係藉由使用編碼全長人類CD19編碼序列及天然啟動子以及博來黴素抗性基因之載體(hCD19 FL/pEF4-myc-His A)轉染小鼠preB細胞系300.19來產生。簡言之，使用線性質體對300.19細胞實施電穿孔，且然後利用APC偶聯之抗人類CD19 Ab(來自BD 555415之純系HIB19)鑑別表現高量hsCD19之細胞，並隨後利用FACS Aria流式細胞儀分選。培養所分選之hsCD19+細胞且確認穩定表現高量hsCD19。
可使用含有所表現IgG之無血清培養基直接實施結合分析。將所有經評估之IgG正規化至相同濃度(85nM)，然後藉由3倍連續稀釋稀 釋至1.4pM。然後，在96孔板中，在4℃下將5×105個細胞/孔之等份與所稀釋之IgG一起培育30min。用FACS緩衝液(0.5% BSA於PBS中)將細胞洗滌兩次，然後添加檢測抗體，於FACS緩衝液中以1：1000稀釋之APC偶聯之山羊抗hu IgG Fc片段特異性抗體(Dianova編號109-136-098)。在4℃下將細胞再培育30min，然後於FACS緩衝液中洗滌兩次且利用FACS Calibur(BD Bioscience)進行分析。使用GraphPad PrismTM 3.0軟體與非線性消退分析、S形劑量反應(可變斜率)實施結合曲線繪製(螢光強度對IgG濃度之中值)及EC50測定。
FACS分析展示，所評估所有IgG之表觀結合可廣泛地變化，且一些構築體展現如IgG相對於scFv之EC50之5至10倍變化。基於EC50值，選擇具有與嵌合參考相比在2倍或更佳範圍內之結合親和力的首要候選者。
實例2：源自人類化CD19 IgG抗體之抗-CD19可溶性scFv片段之表徵
利用標準分子生物學技術自實例1中所述之人類化CD19 IgG產生可溶性scFv片段。該等可溶性scFv用於表徵研究以檢查scFv之穩定性、細胞表面表現及結合性質。另外，亦實施實驗來研究在人類化過程期間引入之潛在PTM之影響。
scFv表現及純化
為轉染每一scFv構築體，使用100μg質體利用PEI作為轉染試劑以3：1之比率(PEI：DNA)轉染約3e8個293F細胞。使細胞生長於37℃、125rpm、8% CO2下搖瓶中之100ml EXPi293表現培養基(Invitrogen)中。在6天後收穫培養物且用於蛋白質純化。
藉由在3500g下旋轉20分鐘來收穫293F細胞。收集上清液且經由VacuCap90 PF過濾器單元(w/0.8/0.2μm超級膜，PALL)過濾。將約400μl Ni-NTA瓊脂糖珠粒(Qiagen)添加至上清液中。將混合物旋轉且在4℃下培育4hr。將其加載至純化管柱上且用含有20mM組胺酸之洗滌 緩衝液洗滌。用500μl含有300mM組胺酸之溶析緩衝液溶析蛋白質。 在4℃下針對PBS緩衝液將樣品透析過夜。利用nanodrop 2000c量化蛋白質樣品。
scFv構象及膠質穩定性分析
藉由DSF確定scFv之熱穩定性：混合10-20μl蛋白質樣品與以1：1000最終稀釋之染料Sypro橙(Invitrogen目錄編號S6650)，總體積為25μl於PBS中，運行BioRad CFX1000(25℃ 2min，然後增加0.5℃保持30秒，25℃至95℃)。
對於分析型SEC實驗，在n Agilent 1100系列上將20μl PBS中之約15-20μg scFv蛋白質樣品以0.3ml/min流速注射至TSKgel Super SW2000中。
藉由FACS結合之EC50
使小鼠細胞系300.CD19生長於含有0.5mg/ml博來黴素之RPMI 1640中。將約5e5個細胞/每孔轉移至BD Falcon 96孔板。使細胞在900rpm(Sorval Legend XT離心機)下旋轉3分鐘。移除上清液。將抗-CD19 scFv蛋白樣品稀釋於含有5% FBS之DPBS中。將樣品添加至各孔中，與細胞充分混合且培育1小時。將細胞於含有5% FBS之DPBS中洗滌兩次。將細胞與抗聚His PE(R&D)一起培育1小時，洗滌兩次，然後進行FACS分析(來自BD Biosciences之LSRII)。
藉由Proteon之動力學分析
利用Bio-Rad Proteon測定動力學。在GLC感測器晶片上利用標準胺偶合實施固定。將scFv樣品於乙酸鹽(pH 4.5)中稀釋至0.03mg/mL且以30μL/min之流速持續300秒施加至晶片。然後將CD19配體連續稀釋於PBS-Tween中並以50μL/min之流速注射120秒，且解離時間為480秒。使用甘胺酸(pH 2.5)使晶片表面再生。利用1：1 Langmuir模型擬合數據。
CART19構築體之表面表現及藉由FACS之染色
在轉染後2天收穫經不同抗hCD19 CART瞬時轉染之HEK293F懸浮液細胞。將約1e6個細胞置於V形96孔板(Greiner Bio-One,Germany)之每一孔中，且用0.2ml FACS緩衝液(1×PBS，含有4%牛血清白蛋白(BSA)(BSA部分V,Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)洗滌三次。將細胞重懸浮於含有0.2μg生物素化蛋白L(GenScript,Piscataway,NJ)或100nM hCD19(AA 1-291)-hIgG1 Fc(在NIBRI中產生)之0.2ml FCAS緩衝液中，且在4℃下培育30分鐘。然後用0.2ml FACS緩衝液將細胞洗滌三次，且在4℃下在黑暗中，與用於含有蛋白質L之樣品之0.2ml FACS緩衝液中的1μl鏈黴抗生物素蛋白Alexa Fluor 488(Life Technologies,Grand Island,NY)，或用於含有hCD19-hIgG1 Fc之樣品之0.2ml FACS緩衝液中的2μl PE抗人類Fcγ(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)一起培育30分鐘。用0.2ml FACS緩衝液洗滌三次後，在LSRII(BD Biosciences,San Jose,CA)機器上利用FACSDiva軟體(BD Biosciences,San Jose,CA)分析細胞。根據活細胞之相對log螢光分析免疫螢光染色，且量測Alexa Fluor 488陽性或PE陽性細胞之百分比。
在人類化過程期間產生之潛在PMT之分析
引人關注的是在人類化期間，CDRH2區中之位置62偏向為存在於鼠類CDRH2中之絲胺酸殘基而非丙胺酸，如實例1中所述。測試在人類化過程期間產生之PTM位點實際上為「真實」PTM位點抑或僅係理論位點。產生兩個IgG變體，其中位置60(已知為糖基化位點)處之天冬醯胺突變成絲胺酸或麩醯胺酸，且分別命名為FMC63_VH_hz2(N60S)及FMC63_VH_hz2(N60Q)。產生該等構築體以消除潛在轉譯後修飾位點(PTM)且測試所保留之活性。
結果
使抗-CD19人類化scFv及小鼠scFv在293F細胞中表現且經由His標籤純化。所有人類化scFv之表現及產率遠高於原始小鼠scFv(數據未展示)。
為確認一致性及評價完整性，在與N-聚糖酶F(PNGaseF)一起培育或不一起培育下、然後藉由高效液相層析質譜(HPLC-MS)(參見圖3)及SDS-PAGE二者分析scFV構築體(數據未展示)。PNGaseF係用於自共有序列N-X-S/T/C移除N-連接聚糖結構之特異性酶，其中X係除脯胺酸外之任何胺基酸。簡言之，將樣品於水中稀釋至0.1μg/μL，且不進行處理或在37℃下與PNGaseF以1：2(w/w)PNGaseF：scFV比率一起培育3小時。
利用來自Novex之NuPAGE 4%-12% Bis-Tris凝膠實施SDS-PAGE分析。將約2μg scFV裝載至每一泳道中且在200V恆定電壓下實施40分鐘電泳。電泳後，利用PhastGel藍R 250染色劑(Amersham Pharmacia)對凝膠進行染色且用10%乙酸、30%甲醇脫色。
在偶合至Xevo-Tof質譜儀之Waters Acquity UPLC系統上實施HPLC-MS分析。將每一樣品之約1μg以0.5mL/min之流速裝載至設定為60℃之R 1/10 2.1×100mm 10μm POROS管柱(Applied Biosciences)上。移動相係由0.1%甲酸(A)及0.1%甲酸、75%異丙醇、25%乙腈(B)構成。用25%-90% B之反相梯度在12分鐘內自管柱溶析蛋白質。利用電噴霧正向掃描在600-4000Da之m/z範圍下使用源錐電壓斜升20-50V實施獲取。利用MaxEnt1對所得光譜進行解捲積。
在人類化過程期間引入糖基化位點。非PTM變體(VH：N60S或N60Q)不具此額外形式。構築體係在HC CDR2中唯一具有N-連接糖基化共有位點者。根據SDS-PAGE分析，未經處理之樣品以單一條帶遷移，此與除觀察到雙聯體之103101-WT(S/N)外之所有構築體之序列的大致分子量一致。此構築體係在H-CDR2中唯一具有N-連接糖基化 共有位點者。當使用PNGaseF處理時，雙聯體之較高分子量條帶不再存在，此表明位點之部分佔據。類似地，自解捲積質譜觀察到之分子量與自胺基酸序列預測之彼等一致。然而，儘管其他構築體展示單一初級分子物種，但103101-WT(S/N)亦具有比自經PNGaseF處理後不再存在之序列所預測高1217道爾頓之群。基於質量，此與單一主要N-連接糖型、可能寡甘露糖5之存在一致。藉由MS分析確認糖基化形式之存在，如圖3中所展示。
藉由差示掃描螢光測定(DSF)量測構象穩定性。如圖4中所展示，小鼠scFv之Tm為57℃，而人類變體展示約70℃之較高Tm。所有人類化scFv之Tm遠優於鼠類scFv，此明確展示所有人類化scFv比鼠類scFv更穩定。此穩定性將可能轉移至CART19構築體，此可能改良治療性質。
利用基於SPR之檢測方法藉由與hCD19表現細胞之結合以及與hCD19抗原之結合量測經純化scFv之活性。使用小鼠細胞系300來測定scFv之結合。小鼠scFv針對hCD19之EC50為約06-1.6nM。人類化變體展示低或亞nM EC50範圍內之相同範圍之EC50。
實例3：CD19 CAR構築體
欲用於最終CAR構築體中之scFv係源自實例1中所述之人類化IgG。VL及VH結構域在scFv中出現之順序可變化(即，VL-VH或VH-VL定向)，且其中三個或四個拷貝之「G4S」(SEQ ID NO：18)亞單位(其中每一亞單位包含序列GGGGS(SEQ ID NO：18)(例如，(G4S)3(SEQ ID NO：107)或(G4S)4(SEQ ID NO：106)))聯結可變結構域以產生scFv結構域之整體，如表2中所展示。
表2. 展示VH及VL定向及連接體長度之人類化CD19 scFv構築體(「3G4S」揭示為SEQ ID NO：107且「4G4S」揭示為SEQ ID NO：106)。
Figure 104111176-A0202-12-0234-383
人類化scFv片段之序列(SEQ ID NO：1-12)提供於下表3中。完整CAR構築體係利用SEQ ID NO：1-12與下文所展示之額外序列SEQ ID NO：13-17來產生，以產生具有SEQ ID NO：31-42之完整CAR構築體。
•前導(胺基酸序列)(SEQ ID NO：13)MALPVTALLLPLALLLHAARP
•前導(核酸序列)(SEQ ID NO：54)
Figure 104111176-A0202-12-0234-384
•CD8鉸鏈(胺基酸序列)(SEQ ID NO：14)TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
•CD8鉸鏈(核酸序列)(SEQ ID NO：55)
Figure 104111176-A0202-12-0234-385
GTGAT
•CD8跨膜(胺基酸序列)(SEQ ID NO：15)IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
•跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO：56)
Figure 104111176-A0202-12-0235-386
•4-1BB細胞內結構域(胺基酸序列)(SEQ ID NO：16)KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
•4-1BB細胞內結構域(核酸序列)(SEQ ID NO：60)
Figure 104111176-A0202-12-0235-387
•CD3 ζ結構域(胺基酸序列)(SEQ ID NO：17)
Figure 104111176-A0202-12-0235-388
•CD3 ζ(核酸序列)(SEQ ID NO：101)
Figure 104111176-A0202-12-0235-389
•CD3 ζ結構域(胺基酸序列；NCBI參考序列NM_000734.3) (SEQ ID NO：43)
Figure 104111176-A0202-12-0236-390
•CD3 ζ(核酸序列；NCBI參考序列NM_000734.3)；(SEQ ID NO：44)
Figure 104111176-A0202-12-0236-391
IgG4鉸鏈(胺基酸序列)(SEQ ID NO：102)
Figure 104111176-A0202-12-0236-392
IgG4鉸鏈(核苷酸序列)(SEQ ID NO：103)
Figure 104111176-A0202-12-0236-393
Figure 104111176-A0202-12-0237-394
該等純系在源自4-1BB之共刺激結構域之信號結構域中皆含有Q/K殘基變化。
Figure 104111176-A0202-12-0237-395
Figure 104111176-A0202-12-0238-396
Figure 104111176-A0202-12-0239-397
Figure 104111176-A0202-12-0240-398
Figure 104111176-A0202-12-0241-399
Figure 104111176-A0202-12-0242-400
Figure 104111176-A0202-12-0243-401
Figure 104111176-A0202-12-0244-402
Figure 104111176-A0202-12-0245-403
Figure 104111176-A0202-12-0246-404
Figure 104111176-A0202-12-0247-405
Figure 104111176-A0202-12-0248-406
Figure 104111176-A0202-12-0249-407
Figure 104111176-A0202-12-0250-408
Figure 104111176-A0202-12-0251-409
Figure 104111176-A0202-12-0252-410
Figure 104111176-A0202-12-0253-411
Figure 104111176-A0202-12-0254-412
Figure 104111176-A0202-12-0255-413
Figure 104111176-A0202-12-0256-414
Figure 104111176-A0202-12-0257-415
Figure 104111176-A0202-12-0258-416
Figure 104111176-A0202-12-0259-417
Figure 104111176-A0202-12-0260-418
Figure 104111176-A0202-12-0261-419
Figure 104111176-A0202-12-0262-420
Figure 104111176-A0202-12-0262-421
Figure 104111176-A0202-12-0263-422
Figure 104111176-A0202-12-0264-423
scFv結構域之人類化CDR序列之重鏈可變結構域序列展示於表4中，且輕鏈可變結構域序列展示於表5中。「ID」代表每一CDR之各別SEQ ID NO。
Figure 104111176-A0202-12-0264-424
Figure 104111176-A0202-12-0265-425
Figure 104111176-A0202-12-0265-426
表6係使CD19構築體數字名稱與以下相關聯之鑑別標誌：scFv之輕鏈及重鏈之特定定向、分離重鏈與輕鏈之連接體單元(即，(G4S)3(SEQ ID NO：107)或(G4S)4(SEQ ID NO：106))之數量及重鏈CDR2中之辨別胺基酸序列。
Figure 104111176-A0202-12-0265-427
Figure 104111176-A0202-12-0266-428
然後將CAR scFv片段選殖至慢病毒載體中以產生呈單一編碼框之全長CAR構築體，且利用EF1 α啟動子進行表現(SEQ ID NO：100)。EF1 α啟動子
Figure 104111176-A0202-12-0266-429
Figure 104111176-A0202-12-0267-430
(SEQ ID NO：100)。
如實例4中所述實施人類化CAR構築體之分析。
實例4：CART中之人類化CD19構築體之分析
為評估藉助CAR技術靶向CD19之可行性，將抗-CD19抗體之單鏈可變片段選殖至具有呈4種不同構形之CD3ζ鏈及4-1BB共刺激分子之慢病毒CAR表現載體中，且基於因應CD19+靶之CD19 CAR轉導之T細胞(「CART19」或「CART19 T細胞」)之效應T細胞反應的量及品質來選擇最佳構築體。效應T細胞反應包括(但不限於)細胞擴增、增 殖、倍增、細胞介素產生及靶細胞殺死或細胞溶解活性(脫粒)。
材料及方法 重定向人類化CART19 T細胞之產生
使用人類化CART19慢病毒轉移載體產生封裝於VSVg假型慢病毒粒子中之基因組材料。混合慢病毒轉移載體DNA與三種封裝組份VSVg、gag/pol及rev以及lipofectamine試劑，以使其一起轉染至293T細胞中。24hr及48hr後，收集培養基，過濾且藉由超速離心濃縮。將所得病毒製劑儲存在-80℃下。藉由滴定SupT1細胞來確定轉導單元之數量。重定向之CART19 T細胞係藉由以下方式來產生：藉由與CD3×28珠粒接合24hr活化新鮮原初T細胞，且然後添加適當數量之轉導單元以獲得轉導T細胞之期望百分比。容許該等經修飾之T細胞擴增直至其變得靜止且大小減小，此時將其冷藏保存以供後續分析。利用coulter multisizer III量測細胞數及大小。在冷藏保存之前，在LSRII上藉由流式細胞術分析確定所轉導細胞(表現細胞表面上之CART19)之百分比及該表現之相對螢光強度。根據直方圖，可藉由比較轉導百分比與其相對螢光強度來檢查CAR之相對表現量。
評估人類化CART19重定向T細胞之細胞溶解活性、增殖能力及細胞介素分泌.
為評估人類化CAR19 T細胞殺死、增殖及分泌細胞介素之功能能力，將細胞解凍且容許恢復過夜。除人類化CART19外，出於比較目的使用鼠類CART19，同時使用SS1-BBz作為用於背景CAR/T細胞效應之非靶向表現之CAR。將「對照」黃金標準(GS)CART19用於所有分析中以比較分析變化。重要的是，GS CART19係在研究級(即，非臨床級)製造條件下產生之細胞且包括將IL-2添加至生長培養物中。此可能影響該等細胞之總體活力及功能且不應根據與其他轉導T細胞群之研究級產生之直接比較來評估。T細胞殺死係針對表現或不表現 CD19之慢性骨髓性白血病細胞系K562或自CLL患者分離之B細胞Pt14。對於此基於流式之細胞毒性分析，用CSFE對靶細胞染色以量化其存在。針對CD19表現對靶細胞染色以確認相似的靶抗原含量。 在10：1、3：1、1：1、0.3：1及0：1之效應物：靶細胞比率之滴定下量測CAR19 T細胞之細胞溶解活性，其中效應物定義為表現抗-CD19嵌合受體之T細胞。藉由混合適當數量之T細胞與恆定數量之靶細胞來起始分析。16hr後，移除全部體積之每一混合物且洗滌每一孔並以適當方式合併。針對CD2對T細胞染色且用活/死標記物7AAD對所有細胞染色。最後洗滌後，使用預定數量之計數珠粒將沈澱之細胞重懸浮於特定體積中。藉由LSRII流式細胞術收集細胞染色數據且用FloJo軟體利用珠粒來分析以量化結果。
為量測人類化CAR19 T細胞之細胞增殖及細胞介素產生，將細胞解凍且容許恢復過夜。除人類化CART19外，出於比較目的使用鼠類CART19，同時使用SS1-BBz作為用於背景CAR/T細胞效應之非靶向表現之CAR。將「對照」黃金標準(GS)CART19用於所有分析中以比較分析變化。T細胞係針對表現或不表現CD19之慢性骨髓性白血病細胞系K562或自CLL患者分離之B細胞Pt14。另外，使用CD3×28珠粒來評估T細胞因應內源免疫信號之潛能。為分析增殖，用CSFE對T細胞染色。增殖係CSFE染色之稀釋，其反映親代標記物現分離成兩個子代細胞。該分析僅測試1：1及1：0之效應物：靶比率，其中效應物定義為表現抗-CD19嵌合受體之T細胞。該分析係以一式兩份進行，且在混合細胞後24hr，移除/更換50%培養基以利用人類細胞介素檢測之Luminex 10重面板進行細胞介素分析。5天後，針對CAR表現對T細胞染色，表型分型為CD4或CD8細胞，且用7AAD針對活/死染色。最後洗滌後，使用預定數量之BD計數珠粒將沈澱之細胞重懸浮於特定體積中。藉由LSRII流式細胞術收集細胞染色數據且用FloJo軟體利用珠 粒來分析以量化結果。藉由相對於特定數量之珠粒計數之細胞數乘以欲計數珠粒之分數來確定總細胞計數。
為評估人類化CART19細胞以與當前成功的鼠類CART19類似之方式發揮功能之潛能，意欲評價其在活體外殺死靶細胞、因應靶抗原增殖及展示持久性體徵之能力。藉由封裝每一人類化CART19慢病毒構築體及針對SupT1細胞對其進行滴定，能夠確定將轉導正規化至約50%之病毒之量。此容許自每個細胞之相似平均整合位點開始更直接比較活性。
藉由自正常血球分離之供體之血液開始產生治療性CAR19 T細胞，該供體之原初T細胞係藉由針對T細胞、CD4+及CD8+淋巴球進行陰性選擇來獲得。在10% RPMI中在37℃、5% CO2下藉由CD3×28珠粒活化該等細胞。
24hr後，將T細胞破裂，且添加正規化量之病毒。T細胞開始分成對數生長模式，其係藉由量測每ml細胞計數及細胞大小來監測。在T細胞開始靜止時，對數生長減弱且細胞大小縮小。減緩生長速率及使T細胞大小接近約300fl之組合決定欲冷藏保存或再刺激之T細胞之狀態。
T細胞靜止傾向與依據大小所見極為類似。人類化CART細胞與當前鼠類CART19及UTD群之間之幾乎重疊的圖案指示在活化後人類化CAR19對正常T細胞擴增無不尋常效應。作為對照，使用SS1-BBz來定義不期望非抗原依賴性CAR活性。總細胞數之擴增圖譜展示個體擴增中實際數量之差異可能主要歸因於不同起始細胞數。藉由正規化起始T細胞數，對所有CART19細胞可見緊密簇。另外，在向下且遠離該組前進之線中檢測非抗原依賴性CAR活化之不期望效應。
確定該等CAR19表現細胞中之每一者之表面表現之量。針對轉導正規化之經滴定病毒展示與轉導效率、細胞轉導%相關聯之相當表現 量。一些CAR之效價係自早期封裝推斷，且儘管其轉導百分比較低，但其MFI亦如所預期而減小。該等結果指示，通常在與UTD及鼠類CAR19 T細胞相比時，人類化CAR19對細胞擴增能力無可檢測之負面效應。
分析人類化CART19細胞選擇性辨別在細胞上表現之細胞表面特異性表位及破壞其之能力。野生型K562細胞並不表現CD19，但可經轉導以表現CD19。比較該等殺死曲線，滴定效應細胞之量展示表現CD19之彼等細胞被破壞。來自相同供體且經人類化CART19細胞或當前臨床鼠類CART19細胞修飾之重定向T細胞指示其殺死能力無差別。殺死曲線展示在靶向患者14之CD19+ CLL細胞之人類化CART19細胞中發現極相似殺死能力。有趣的是，總體細胞溶解活性、具體而言GS CART19減小，表明該等細胞可具有特定抑制性質。在靶細胞上表現之CD19之量相似指示表現量並非細胞殺死差異之原因。
在藉由對照CD3×28珠粒及CD19表現靶刺激後，在所有構築體中皆發現人類化CART19細胞在看到靶細胞後增殖之所需性質。靶向Pt14 CLL細胞似乎指示使用具有輕鏈至重鏈定向之scFv之稍大增殖速率，其中在具有3×或4×GGGGS連接(分別為SEQ ID NO 107及106)時未見到偏向。增殖結果反映在5天內累積之總細胞數，此指示人類化CART19、2146、2144、2136、2141及2137將更強增殖性信號驅動至T細胞。令人印象深刻的是，此係在靶向Pt14 CLL細胞之人類化CART19細胞中進行檢測。
總之，人類化CART19構築體展現在針對抗原特異性靶之細胞溶解活性、增殖性反應及細胞介素分泌方面與當前鼠類CART19極相似之特徵。人類化CART19細胞(2146、2144、2136、2141及2137)在靶活化後將更強增殖性信號驅動至T細胞之潛能似乎將為該等新構築體潛在地增強治療反應之額外益處。
結果
利用脫粒及細胞介素產生分析二者，展示經改造之CART19 T細胞特異性靶向CD19+細胞。
分析經本發明之人類化CD19 CAR構築體(即「huCART19」)轉導之ND317細胞。在CD3×28活化並經人類化CART19候選者轉導後，相對於鼠類CART19及未經修飾之(UTD)T細胞，T細胞在其擴增期間之大小具有緊密相似性。
實驗展示在CD3×28活化並經不同的人類化CART19候選者轉導後，相對於鼠類CART19及未經修飾之(UTD)T細胞，T細胞在其擴增期間累積之數量的極小差異。
人類化CART19之細胞表面表現與鼠類CART19相當且其表現量與鼠類CART19極相似。繪製每一人類化CART19轉導之T細胞之細胞表面表現染色圖案的直方圖與自該等圖譜計算之平均螢光強度(MFI)之疊加與細胞轉導之百分比密切相關。
此外，人類化CART19在靶向表現CD19之靶細胞中具有類似之特異性細胞毒性活性且與鼠類CART19相當。來自基於16hr流式之殺死分析之圖，該等分析利用滴定效應物對靶(E：T)比率，使用效應物靶向CSFE標記之K562cc之人類化CART19細胞(圖1A.非表現CD19對照)、K562.CD19(圖1B，經轉導以表現CD19之K562細胞)或Pt14(圖1C，來自CLL患者之B細胞)。所有人類化CART19細胞之細胞溶解活性與鼠類CART19相似且相當。不同靶之間之細胞溶解活性之差異相似且相當，此指示在CART19之人類化形式中保留鼠類CART19之活性。
CFSE標記之人類化CART19細胞與靶細胞混合後6天時之直方圖疊加展示其增殖能力(圖5)。自CAR19遞送之增殖反應係在與靶細胞接合並殺死靶細胞後發生陽性臨床反應之必需反應。SS1-BBz CSFE 染色之稀釋係自親代細胞之染色稀釋之分裂子代細胞的指標，此係未靜止之T細胞在靶向非依賴性機制中維持分裂之結果。
使用模擬TCR及共刺激劑CD28之內源性接合之CD3×28珠粒來評估細胞群總體增殖能力。數據指示每一細胞群皆具有相當的增殖潛能。所有人類化及鼠類CART19細胞在與表現CD19之K562細胞接合後強烈且相當地增殖。人類化CART19細胞亦充分因應自CLL患者獲得之B細胞，但一些因應似乎稍弱。如圖2A及2B中所展示，可觀察到人類化CART19細胞2136、2137、2140、2141、2144及2146具有稍微更穩健的增殖，如藉由CSFE染色之更大稀釋所證實。該等構築體皆具有輕鏈至重鏈之相同可變鏈定向，從而指示此係所選定向。對重鏈CDR2位點(表1)中之胺基酸變化之較密切觀察揭露三種變化形式YSSSL、YQSSL及YNSSL(分別為SEQ ID NO：28、29及30)中之每一者皆呈現於在看到靶後似乎具有更穩健增殖之構築體中。另外，該等所觀察之構築體具有含有3拷貝亞單位之G4S連接體(3G4S)(SEQ ID NO：107)及含有4拷貝亞單位之G4S連接體(4G4S)(SEQ ID NO：106)二者，此指示連接體大小並不影響功能。
根據上述增殖性擴增，測定腫瘤接合後5天後之總細胞數。該細胞展示數量比初始接種之數量減少，此指示需要活化來維持存活。分析內源性活化對照以展示在6天結束時之總細胞計數相似。靶向表現CD19之K562細胞之人類化CART19細胞展示兩種鼠類CART19細胞皆終止於較高細胞數，且2146稍高於具有相似值之所有其他構築體。亦分析暴露於患者14之B細胞(pt14)後6天時之總細胞數，且有趣地展示先前選出之人類化CART19構築體2146、2144、2136、2141及2137(其皆具有輕鏈至重鏈定向且代表三種胺基酸變化YSSSL、YQSSL及YNSSL(分別為SEQ ID NO：28、29及30))產生較高總細胞數，高於鼠類CART19。不同人類化抗-CD19 CAR純系之間之此意外的分化可轉 譯成經該等構築體轉導之CART細胞之較佳臨床效能。
分析在暴露於不表現CD19之對照K562細胞後自人類化CART19細胞產生之細胞介素之背景含量。利用luminex 30重面板分析24hr上清液。來自使用CD3×28珠粒刺激內源性免疫系統之潛在細胞介素圖譜指示每一細胞群具有相當的細胞介素圖譜。
數據亦展示人類化CART19及鼠類CART19在因應相同靶時在相似含量下產生相似的細胞介素圖譜。在靶向Pt14靶細胞時，細胞介素圖譜較低但相似。
實例5：活體內ALL模型中之人類化CD19 CAR T細胞治療.
可使原代人類ALL細胞生長於免疫受損小鼠而無需對其進行在活體外培養。該等小鼠可用於測試嵌合抗原受體(CAR)T細胞在代表將在臨床中發現之患者群之模型中之效能。將此處所用之模型HALLX5447在NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ(NSG)小鼠中傳代兩次，然後用於測試CAR T細胞效能之研究中。
先前已展示在原發性人類ALL之NSG小鼠模型中，鼠類CD19 CAR T細胞靶向且殺死白血病細胞。CD19 scFv(單鏈Fc可變片段)已經人類化，且本發明實例比較表現人類化CD19 CAR(CAR 2)之T細胞與鼠類CD19 CAR T細胞消除活體內ALL腫瘤細胞之能力。在此處，直接比較該等細胞在患有已建立之原發性人類ALL之小鼠中之效能，如藉由人類CD19+細胞之末梢血FACS分析所分析。在靜脈內植入1.5×106個原代ALL細胞後，直至腫瘤植入後2週達成血液中2.5%-4% CD19+人類細胞之疾病負荷。此CD19百分比係相對於小鼠血液中之總細胞。在使用CAR T細胞治療前小鼠中100%之人類細胞係腫瘤細胞。在此模型中，末梢血中大於2% CD19+人類細胞之百分比視為已建立之人類ALL疾病。在腫瘤植入後約兩週至三週在小鼠中建立白血病後，立即使用CAR T細胞治療帶有白血病之小鼠。使用總共5×106 個人類T細胞治療每一組中之小鼠。CAR表現慢病毒對供體人類T細胞之轉導效率介於40%與60%之間。在用T細胞治療後，每週對小鼠採血以分析血液中CD19+人類細胞之百分比作為疾病進展之生物標記物。
材料及方法：
原代人類ALL細胞： 原代細胞在植入前並未在活體外培養。自患有ALL之患者收穫該等細胞，且然後轉移至小鼠用於建立及擴增。在小鼠中擴增腫瘤細胞後，收穫骨髓及脾細胞且以單獨批次活性冷凍以供再植入。將細胞以5×106個細胞/毫升之最低濃度冷凍於90% FBS及10% DMSO中。對於再植入，將所冷凍之ALL細胞解凍，且然後靜脈內注射至NSG小鼠中，以產生患有ALL之小鼠，其用於比較人類化CD19 CAR T細胞與鼠類CD19 CAR T細胞之抗腫瘤效能。
小鼠： 接受來自Jackson實驗室之6週齡NSG(NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ)小鼠(庫存編號005557)。容許動物適應Novartis NIBRI動物設施達至少3天，然後進行實驗。根據Novartis ACUC規章及指導方針處置動物。
腫瘤植入： 將在活體內連續傳代之原代人類ALL細胞模型HALLX5447在37℃中水浴中解凍。然後將細胞轉移至15ml尖底管中，且用冷無菌PBS洗滌兩次。然後對原代ALL細胞計數且以15×106個細胞/毫升PBS之濃度重懸浮。將細胞置於冰上且立即(在1小時內)植入小鼠中。經由尾靜脈以100μl體積、總共1.5×106個細胞/小鼠靜脈內注射ALL細胞。
CAR T細胞投藥： 在腫瘤植入後16天向小鼠投與5×106個T細胞。 將細胞在37℃水浴中部分解凍，且然後藉由將1ml冷無菌PBS添加至含有細胞之管中來完全解凍。將所解凍之細胞轉移至15ml falcon管中且用PBS調節至10ml之最終體積。每次以1000rpm持續10分鐘將細 胞洗滌兩次，且然後在血球計上計數。然後以50×106細胞/ml冷PBS之濃度重懸浮T細胞且將其保持在冰上直至向小鼠投藥。以5×106個T細胞/小鼠之劑量經由尾靜脈向小鼠靜脈內注射100μl CAR T細胞。用100μl單獨PBS(PBS)、未經轉導之T細胞(模擬物)、鼠類CD19 CAR T細胞(muCTL019)或人類化CD19 CAR T細胞(huCTL019)治療5隻小鼠/組。未經轉導之T細胞、muCTL019 T細胞及huCTL019 T細胞皆係自相同人類供體平行製備。
動物監測： 每天監測小鼠之健康狀態，包括每週兩次體重量測。體重變化%計算為(BW當前-BW初始)/(BW初始)×100%。藉由末梢血FACS分析每週監測腫瘤負荷。每週經由尾靜脈將小鼠採血至保持在冰上之EDTA包覆之管中。將來自各管之10-20μl血液平鋪於冰上之96孔板中。用ACK紅血球溶解緩衝液(Life Technologies，目錄編號A10492-01)溶解紅血球，且然後用冷PBS洗滌兩次。將細胞與人類及小鼠Fc封阻劑(Miltenyi Biotec，目錄編號130-059-901及130-092-575)之Fc封阻混合物一起培育30分鐘，且然後與抗人類CD19抗體一起培育30分鐘。用2%多聚甲醛溶液將細胞固定20分鐘，洗滌且在PBS+2% FBS中儲存過夜，然後在BD Canto或Fortessa上分析，隨後利用FlowJo FACS分析軟體進一步分析。分析該等細胞以確定帶有人類HALLX5447 ALL腫瘤之NSG小鼠之血液中之人類CD19+細胞%。血液中之CD19百分比報告為平均值±平均值之標準誤差(SEM)。
利用下式計算治療/對照(T/C)%值：若△T
Figure 104111176-A0202-12-0276-102
0，則T/C%=100×△T/△C；若△T<0，則消退%=100×△T/T初始；其中T=在研究之最後一天時藥物治療組之平均末梢血CD19百分比；T初始=在投藥第一天時藥物治療組之末梢血CD19百分比；△T=在研究之最後一天時藥物治療組之平均末梢血CD19百分比-在投 藥之第一天時藥物治療組之平均末梢血CD19百分比；C=在研究之最後一天時對照組之平均末梢血CD19百分比；且△C=在研究之最後一天時對照組之平均末梢血CD19百分比-在投藥之第一天時對照組之平均末梢血CD19百分比。
介於100%至42%範圍內之T/C值解釋為不具或具有最低抗腫瘤活性；
Figure 104111176-A0202-12-0277-103
42%且>10%之T/C值解釋為具有抗腫瘤活性或腫瘤生長抑制。T/C值
Figure 104111176-A0202-12-0277-104
10%或消退值
Figure 104111176-A0202-12-0277-105
-10%解釋為腫瘤停滯。消退值<-10%報告為消退。
結果：
在人類ALL之初級模型中評估且直接比較鼠類與人類化CD19 CAR T細胞之抗腫瘤活性。在第0天腫瘤植入後，將小鼠隨機化至治療組中，且在第16天時用5×106個T細胞經靜脈內治療。監測ALL疾病負荷及動物健康直至動物達成終點。當對照組中之疾病負荷大於末梢血中80%之人類CD19+細胞時，在腫瘤植入後第65天時對所有組中之小鼠實施安樂死。
自腫瘤植入後第24天且持續至第65天研究結束時，在對照組與經鼠類或人類化CD19 CAR T細胞治療之組之間可見明確的疾病負荷差異，且P<0.01。在NSG小鼠中，鼠類及人類CD19 CAR T細胞展示與對照人類HALLX5447 ALL腫瘤細胞生長相似之能力。兩組皆展示在HALLX5447植入後第21天時12%-15%人類CD19+細胞之峰值末梢血疾病程度。在腫瘤細胞植入後42天，在huCTL019組中無法檢測到人類CD19+細胞，而muCTL019組中人類CD19+細胞之百分比降低至約1%。在此模型中，鼠類及人類化CD19 CAR T細胞二者產生相當之控制原代人類ALL細胞擴增之能力(P>0.05)。模擬物轉導之T細胞組之T/C%值為94.40%，此展示模擬物轉導之T細胞不具抗腫瘤活性。muCTL019組之消退%為-89.75%，且huCTL019組之消退% 為-90.46%，此展示該等治療皆能夠引起HALLX5447腫瘤模型之消退。該等小鼠中作為疾病負荷之量度之末梢血人類CD19+細胞百分比展示於圖7中。在經靜脈內植入之NSG小鼠中，未接受任何T細胞之PBS治療組展示基線原發性ALL腫瘤生長動力學。模擬物治療組接受經歷與CAR T細胞相同之活體外擴增過程之未經轉導T細胞。在此腫瘤模型中，該等細胞用作T細胞對照以展示T細胞之非特異性反應。 PBS及模擬物轉導之T細胞治療組在整個實驗中皆展示持續腫瘤進展。鼠類及人類化CD19 CAR T細胞二者在5×106個T細胞注射之一週內控制疾病之進展，且在此65天研究之進程內展示相似的持續疾病控制能力。
在帶有原發性人類ALL之NSG小鼠模型HALLX5447之效能研究中評價鼠類及人類化CD19 CAR轉導之T細胞之抗腫瘤活性。此研究展示在人類ALL之初級模型中，鼠類及人類化CD19 CAR T細胞(muCTL019及huCTL019)二者皆能夠引起抗腫瘤反應。另外，muCTL019與huCTL019細胞之如藉由末梢血疾病負荷所分析之此反應相同。鼠類及人類化CD19 CAR T細胞二者在用T細胞向小鼠投藥一週內控制原發性ALL生長。在治療後初始時，疾病負荷持續增加，然後減小至實際上無法檢測之程度。在經對照治療之小鼠中，經鼠類或人類化CAR T細胞治療者在65天疾病進展進程內產生持續抗腫瘤反應。人類化CD19 CAR T細胞展示與使用鼠類CD19 CAR T細胞所見相似的引起有效抗-CD19腫瘤反應及控制ALL疾病負荷之能力。
實例6：用於治療多發性骨髓瘤之CD19 CAR T細胞.
即使使用化學療法、靶向療法及自體幹細胞移植之當前方案，骨髓瘤仍視為無法治癒之疾病。本發明實例闡述使用含有嵌合抗原受體之針對CD19之自體T細胞(慢病毒/CD19：4-1BB：CD3ζ；亦稱為「CART19」或CTL019)治療多發性骨髓瘤(MM)。此實例展示CD19定 向CAR療法具有基於靶向表現極低(無法藉由大部分方法檢測)量之CD19之骨髓瘤幹細胞及/或腫瘤細胞建立較深長期耐久緩解的潛能。
在治療患有侵襲性繼發性漿細胞白血病之患者中，發現在救援性自體幹細胞移植後2天投與之CART19會產生漿細胞白血病之快速清除及已經由多線化學療法處理之患者的極佳部分反應。此患者在治療之前數個月具有輸液依賴性；在治療後兩個月時，其已恢復其血液計數(具有正常範圍之血小板計數及白血球計數)，且在停止治療並出院後無需輸液。
由於骨髓瘤細胞並不天然表現CD19，故令人驚奇地發現CART19治療在此腫瘤中會誘導快速且顯著的腫瘤反應。不希望受限於具體理論，CART19可用於治療骨髓瘤之合理原因在於：(1)儘管傳統上藉由流式細胞術認為骨髓瘤細胞對CD19表現呈陰性，但有數據指示骨髓瘤細胞可表現極低量之CD19，使得表現可藉由RNA而非流式細胞術或免疫組織化學檢測到；及(2)靶向選殖型B細胞之概念認為癌性幹細胞導致多發性骨髓瘤，且尤其對化學療法有抗性。B細胞與骨髓瘤腫瘤細胞之間具有純系關係，但傳統骨髓瘤療法旨在惡性漿細胞而非B細胞。因此，用於治療骨髓瘤之CART19靶向與大部分骨髓瘤療法不同之細胞群。
在單一患者經歷中，患者具有循環漿細胞，且能夠測試其腫瘤細胞之CD19表現。其腫瘤細胞之約1%-2%表現CD19抗原。(圖8)。因此，合理的是，CART19可對其腫瘤細胞之極小群具有直接效應；但基於僅靶向極小CD19+腫瘤細胞群尚未預測出極佳部分反應。
在此情形中，在高劑量美法侖後在自體幹細胞移植營救後投與CART19。儘管此係骨髓瘤之標準療法，但其不具治癒性。此外，此患者先前已經歷二次自體幹細胞移植且在移植後早期(<6個月)復發。不希望受限於具體理論，如本發明實例中所述之CART19細胞在與救 援性自體幹細胞移植組合用於治療骨髓瘤時可能具有非重疊機制。
在骨髓清除性化學療法及ASCT後，用CTL019治療患有難治性多發性骨髓瘤之患者。維持緩解但損失可檢測之CTL019及正常CD19陽性B細胞之重構，從而指示此反應無需持續CTL019活性。此外，即使藉由流式細胞術及RT-PCR二者絕大多數(99.95%)贅瘤性漿細胞為CD19陰性，仍獲得此患者之反應。
在此患者之優勢贅瘤性漿細胞群中存在可檢測CD19表現表明CTL019之臨床上相關之靶駐留於此優勢CD19陰性群之外部。多發性骨髓瘤患者中之贅瘤性漿細胞展現遺傳、免疫表型及功能異質性。具體亞群可能為經由抗骨髓瘤療法之純系之存活所必需。在此處所報導之患者中，例如，漿細胞之小CD19表現亞組可能具有相對美法侖抗性但對CTL019敏感。此發現表明以治療方式靶向小純系亞組在與習用抗骨髓瘤療法偶合時可產生耐久性臨床益處。
另一選擇為，此患者中CTL019之臨床上相關之靶可駐留於贅瘤性漿細胞群之外部。例如，CTL019可靶向相對較小但產生贅瘤性漿細胞之幹細胞群。因此，多發性骨髓瘤可係多個晚期B譜系細胞類型、而非僅終末分化之漿細胞之疾病，使得靶向B淋巴球之療法(如CTL019)可係直接靶向漿細胞之療法之有用附加劑。
將在I期試驗中使用CART19治療額外10個多發性骨髓瘤患者，至少三個患者迄今為止已經治療。
劑量原理及風險/益處
已選擇將經由靜脈內投與途徑之單一劑量投藥用於此方案。此方案之主要目標係測試向患有多發性骨髓瘤之患者投與CART-19細胞之安全性及可行性。所預期之主要毒性係(I)在CAR遇到惡性或正常B細胞上之其替代物CD19抗原時之細胞介素釋放；(2)與利妥昔單抗療法類似之正常B細胞清除；(3)在擴增/共刺激之自體T細胞已與 ASCT偶合用於MM時，如先前所見類似於移植物抗宿主病之類固醇反應性皮膚及胃腸症候群。理論性問題在於CART-19 T細胞之轉化或不受控增殖是否可能因應高CD19含量而發生。此在本申請案中與另一CLL患者研究相比不成問題，此乃因預期MM中選殖型B細胞之負荷遠低於在該研究中治療之難治性CLL患者之惡性B細胞之負荷。
劑量原理
利用前3個患者，在介於1.4×107個至1.1×109個CART-19細胞範圍內之劑量下觀察到臨床活性。此觀察展示，至少在所治療之前3個患者中，不存在明顯的劑量反應關係。在投與兩倍log劑量差異之患者中觀察到完全反應。因此，與所代謝之標準藥物不同，CAR T細胞可具有寬劑量反應範圍。此最可能歸因於CAR T細胞能夠在患者中廣泛地增殖。因此，設定1-5×108個CART-19細胞之劑量範圍用於輸注。在此基於恩慈用途提供之單一患者研究中，向患者提供至多5×108個CART19細胞，且無劑量下限。對於10個患者試驗，向患者提供1-5×107個CART-19細胞。
一般設計
此係基於恩慈用途提供之單一患者研究；其在I期研究後經模型化以確定輸注經轉導以表現CART-19之自體T細胞是否安全。該研究之主要目的係確定CART-19 T細胞在第一次ASCT後在早期復發後經歷救援性ASCT之患者中之安全性、耐受性及植入潛能。該方案係由開放標記先導研究組成。
在進入時，個體將經歷骨髓生檢及其MM之常規實驗室及成像評價。合格個體將經歷穩態血球分離以獲得大量末梢血單核細胞(PBMC)用於CART-19製造。自PBMC純化T細胞，使用TCRζ/4-1BB慢病毒載體轉導，在活體外擴增且然後冷凍用於將來投與。記錄與成功製造T細胞之患者數量相比之具有不足T細胞收集、擴增或製造之患 者數量；預期產物製造之可行性在此患者群中不成問題。
個體通常將自其第一次ASCT之準備中實施之動員/收集儲存足量剩餘末梢血幹細胞，以再實施兩次ASCT。彼等未儲存剩餘幹細胞者將以符合治療醫師偏好之方案，在其穩態血球分離之前或之後經歷第二次動員/收集程序。初始白血球分離後約兩週，使個體入院且接受高劑量美法侖(第-2天)，然後在兩天後(第0天)輸注自體幹細胞，且在12至14天後(第+12-14天)使所有個體接受CART-19細胞之輸注。將招募至多10個患者。
所有個體將具有血液測試以以規則間隔至研究之第4週評價CART-19細胞之安全性以及植入及持久性。在第+42天及第+100天時，個體將經歷骨髓抽吸/生檢以評價骨髓漿細胞負荷及CART-19細胞至骨髓之輸送。在第100天時根據國際骨髓瘤工作組(International Myeloma Working Group，IMWG)準則136進行正規反應評價，且根據常規臨床實踐監測患有多發性骨髓瘤之患者之TTP。在此研究中量測之主要效能結果將係比較患者之初始ASCT後之TTP與此研究時ASCT後之TTP。
由於此研究之主要終點係輸注CART-19細胞及ASCT之安全性及可行性，故該研究將採用早期終止規則。簡言之，若在所治療之最初五個個體之間發生少於2個嚴重意外不良事件，則隨後研究將增加額外五個個體，達到10名個體之招收目標。在CART-19輸注後對所治療個體觀察40天(即，至在第42天時第一官方反應評價)，然後招收後續個體直至招收五個個體且如此觀察。對於第二個五患者組之治療，在個體之間無需等待時段。
在強化隨訪6個月後，將在兩年中至少每季度以病歷、體檢及血液測試評估個體。在此評估後，個體將進入累計(roll-over)研究，在之後長達13年中藉由電話及問卷每年隨訪，以評價長期健康問題(例 如罹患新惡性病)之診斷。
主要研究終點
此先導試驗經設計以測試經CD19 TCRζ/4-1BB轉導之自體T細胞在第一次ASCT後在早期復發後經歷MM之救援性ASCT後之患者中的安全性及可行性。
主要安全性及可行性終點包括：研究相關不良事件(定義為NCJ CTC 2：3級體徵/症狀)、實驗室毒性及可能的臨床事件之發生可能或確定地與自輸注直至第24週之任何時間之研究治療相關。此將包括輸注毒性及可能與CART-19細胞相關之任何毒性，包括(但不限於)：
a.發熱
b.疹
c.嗜中性球減少症、血小板減少症、貧血、骨髓再生不全
d.肝功能障礙
e.肺部浸潤或其他肺部毒性
f.侵襲胃腸道或皮膚之GVHD樣症候群。
自患者血球分離產物製造CART-19細胞之可行性。將確定不滿足載體轉導效率、T細胞純度、活力、無菌性及腫瘤污染之釋放準則之所製造產物之數量。
比較使用CART19進行自體幹細胞移植後反應之深度及持續時間與標準自體幹細胞移植後每一患者初始達成之反應的深度及持續時間。
個體選擇及退出 納入準則
個體必須已經歷先前針對MM之ASCT且已在幹細胞輸注365天內經處理。已經歷兩次先前ASCT作為計劃二次ASCT鞏固方案之一部分 之個體合格。根據用於進行性疾病之IMWG準則或在初始ASCT後獲得CR或sCR之患者自CR復發之準則定義進展(Durie等人，Leukemia 2006；20(9)：1467-1473)。N.B.：無需在先前ASCT之365天內招收患者，且患者可在先前ASCT後在此研究招收前在復發/進展後經其他藥劑(包括實驗藥劑)治療。
個體必須簽署書面知情同意書。
個體必須具有足夠生命器官功能以接受高劑量美法侖，如藉由以下準則所定義，在美法侖輸注日期前12週內量測：a.血清肌酸酐
Figure 104111176-A0202-12-0284-106
2.5或估計的肌酸酐清除率
Figure 104111176-A0202-12-0284-108
30ml/min且不具透析依賴性。b.SGOT
Figure 104111176-A0202-12-0284-107
3×正常值上限且總膽紅素
Figure 104111176-A0202-12-0284-109
2.0mg/dl(其中高膽紅素血症歸因於吉伯氏症候群(Gilbert's syndrome)之患者除外)。c.左心室射血分數(LVEF)
Figure 104111176-A0202-12-0284-116
45%，或若LVEF係<45%，則由鑑別非臨床上顯著之心血管功能受損之心臟病專家正規評估。LVEF評價必須已在招收6週內實施。d.利用FEV1、FVC、TLC、DLCO之足夠肺功能(適宜調節肺體積及血紅素濃度後)
Figure 104111176-A0202-12-0284-110
預測值之40%。必須已在招收6週內實施肺功能測試。
個體必須具有0-2之ECOG體能狀態，除非較高體能狀態僅歸因於骨痛。
排除準則 個體不必：
患有任何活性及不受控感染。
患有活性B型肝炎、C型肝炎或HIV感染。
將如所概述排除參與之任何不受控醫學病症。
治療方案
用於復發性/進行性多發性骨髓瘤之療法
患者在招收之前可根據其治療醫師之偏好接受用於復發性/進行性多發性骨髓瘤之療法。療法可在招收後繼續。
患者必須在血球分離前兩週及高劑量美法侖前兩週終止所有療法。若預期在血球分離與高劑量美法侖之間經過兩週以上，則患者可根據其治療醫師之決定在血球分離後重新開始療法。
高劑量美法侖(第-2天)
患者將在第-3天或第-2天時入院且經歷主治醫師檢查及常規實驗室測試，其包括監測腫瘤溶解症候群之參數，然後開始治療方案。若在入院7天內未抽血以供MM監測實驗室測試(SPEP，定量免疫球蛋白及無血清輕鏈分析)，則將在起始療法之前抽血用於該等測試。
高劑量療法將由在第-2天時經約20分鐘靜脈內投與之200mg/m2劑量的美法侖組成。對於>70歲之患者或根據治療醫師之決定可不耐受200mg/m2劑量之任何年齡之患者，美法侖之劑量將減小至140mg/m2。所有患者將接受標準鎮吐劑預防(其可包括地塞米松)及標準抗生素預防。
幹細胞再輸注(第0天)
幹細胞輸注將在第0天投與高劑量美法侖後至少18小時時進行。幹細胞將根據標準院內診療在術前用藥後經約20-60分鐘靜脈內輸注。應輸注至少2×106個CD34+祖細胞/kg體重。另外，在延遲植入或後期植入物喪失之情形下，至少1×106個CD34+祖細胞/kg體重應可作為備份幹細胞產物來輸注。應在第+5天時開始SQ投與G-CSF，根據標準院內診療來配量。將根據標準院內指導方針進行其他支持性護理量測(例如輸液支持)。
CART19細胞輸注(第+12-14天)
將給予由至多5×107個CART-19細胞組成之單次劑量之CART-19轉導之T細胞。用於輸注經CD19 TCRζ4-1BB載體轉導之細胞之最低可接受劑量係1×107。CART-19細胞將在幹細胞輸注後第+12-14天以單次劑量藉由快速i.v.輸注來給予。若患者在12-14天窗口中無法滿足 本文所述之任一納入準則，則CART-19輸注可延遲超過第+12-14天直至滿足準則。
維持雷利竇邁
在其第一次ASCT後接受且耐受維持雷利竇邁之個體將在約第+100天時再起始雷利竇邁維持療法，假設在治療醫師之判斷中不存在禁忌。除非先前經歷指示具體患者之替代性起始劑量，否則起始劑量將為每天10mg。維持療法將持續直至疾病進展或不耐受。
研究藥物之製備及投與
CART-19 T細胞係在CVPF中製備且不自CVPF釋放直至滿足FDA批準用於所輸注細胞之釋放準則(例如，細胞劑量、細胞純度、無菌性、載體之平均拷貝數/細胞等)。釋放後，將細胞帶至床邊用於投與。
細胞解凍. 經冷凍之細胞將於乾冰中運輸至個體之床邊。在床邊利用維持在36℃至38℃下之水浴將細胞解凍。溫和地揉搓袋直至細胞恰好解凍。在容器中不應留下冷凍團塊。若CART-19細胞產物似乎已受損或袋洩漏，或其他方面似乎受損，則不應輸注且應返回至CVPF，如下文所規定。
術前用藥. T細胞輸注後之副作用包括瞬時發熱、風寒及/或惡心；關於綜述參見Cruz等人(Cytotherapy 2010；12(6)：743-749)。建議個體在輸注CART-19細胞之前經對乙醯胺基酚及苯海拉明鹽酸鹽(diphenhydramine hydrochloride)術前用藥。該等藥劑可視需要每6小時重複。若患者持續患有未藉由對乙醯胺基酚減輕之發熱，則可規定非類固醇抗發炎藥劑之進程。建議患者不在任何時間接受全身性皮質類固醇(例如氫化可體松(hydrocortisone)、普賴松、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)或地塞米松)，但危及生命之緊急事件之情形除外，此乃因此可對T細胞具有不利效應。
發熱反應. 在CAR T細胞輸注後個體罹患敗血症或全身性菌血症之不可能情形下，應起始適宜培養及醫學管控。若懷疑CART-19 T細胞產物被污染，則可利用儲存在CVPF中之存檔樣品再測試產物之無菌性。
投與.輸注將在Rhoads之分離室中利用用於免疫阻抑患者之注意事項來進行。將以約10mL至20ml/分鐘之流速藉由快速靜脈內輸注經由具有3向活塞之不含乳膠之18號Y型血液套管投與轉導之T細胞。輸注之持續時間將基於欲輸注之總體積及所建議之輸注速率而定。每一輸注袋將附加有含有以下之標記：「僅供自體使用」。此外，該標記將具有至少兩個獨特的標識符，例如個體之初始、生日及研究編號。在輸注前，兩個個體將在個體存在下獨立地驗證所有此資訊，且因此確認該資訊與參與者正確地匹配。
倘若個體具有過敏反應或重度高血壓危象或任何其他輸注反應，則可在輸注期間使用緊急醫學設備(即，緊急手推車)。在輸注之前及之後獲得生命體徵(溫度、呼吸速率、脈衝及血壓)，然後每15分鐘持續至少一小時且直至該等體徵令人滿意且穩定。要求個體不要離開直至醫師認為此對於其安全為止。
封裝
輸注將包含1-5×107個CA T19轉導細胞之單次劑量，且用於輸注之最低可接受劑量為1×107個CART-19細胞。每一袋將含有等份(體積取決於劑量)含有以下可輸注級試劑(v/v%)之冷藏培養基：31.25% plasmalyte-A、31.25%右旋糖(5%),0.45% NaCl、至多7.5% DMSO、1%聚葡萄糖40、5%人類血清白蛋白。
血球分離
在血球分離中心實施大體積(12-15升或4-6血液體積)血球分離程序。在此程序期間獲得用於CART-19之PBMC。自單一白血球分離， 意欲收穫至少5×109個白血球以製造CART-19 T細胞。亦獲得用於FDA回顧要求及用於研究之基線血液白血球且冷藏保存。預期細胞產物準備用於約2-4週後釋放。流式細胞術淋巴球亞組量化，包括CD19及CD20 B細胞測定。對人類抗VSV-G及抗鼠類抗體(HAMA)進行基線評價。若個體先前已根據臨床細胞及疫苗產生設施之當前良好製造實踐將充分血球分離收集物存庫，則該等細胞可用作製造CART-19之細胞來源。利用存庫的血球分離產物將避免花費、時間及經歷另一血球分離收集之個體之風險。
減積化學療法
淋巴清除化學療法將係如本文所述之高劑量美法侖。
CART-19輸注
輸注將開始於幹細胞再輸注後第+12-14天。
在第一次輸注前第+12-14天時，患者將具有不同CBC以及CD3、CD4及CD8計數之評價，此乃因部分地給予化學療法以誘導淋巴球減少症。
第一劑量將利用單次劑量來投與。在患者之床邊將細胞解凍。經解凍之細胞將以與所耐受一樣快速之輸注速率給予，使得輸注之持續時間為約10-15分鐘。為促進混合，將利用Y形接頭同時投與細胞。如本文所述對個體輸注及術前用藥。在投藥之前、在輸注結束時及此後每15分鐘持續1小時且直至該等體徵穩定且令人滿意為止，評價個體之生命體徵且進行脈衝血氧飽和度分析。在第一次輸注前任何時間及每一輸注後20分鐘至4小時獲得用於測定基線CART-19含量之血液樣品(且發送至TCSL)。
經歷與高劑量美法侖相關之毒性之患者將使其輸注時間表延遲直至該等毒性消退。保證T細胞輸注延遲之特異性毒性包括：1)肺：需要補充性氧以保持大於95%之飽和或在胸部x射線上存在進行性放 射照相異常；2)心臟：不受醫學管控控制之新型心律不整，3)需要血管加壓劑支持之低血壓。4)活性感染：在T細胞輸注之48小時內針對細菌、真菌或病毒之陽性血液培養物。
毒性之管控
不受控T細胞增殖。與同種異體或自體T細胞輸注相關之毒性已利用藥理性免疫阻抑進程進行管控。業內已報導T體相關毒性對全身性皮質類固醇有反應。若發生不受控T細胞增殖(與CART-19細胞相關之3級或4級毒性)，則可使用皮質類固醇來治療個體。個體將使用脈衝式甲基普賴蘇穠(2mg/kg i.v.，分成q8 hr×2天)、然後快速降低劑量來治療。
另外，基於在另一方案上治療之個體之觀察，巨噬細胞活化症候群(MAS)存在一些問題，但預期患有骨髓瘤之患者之CD 19+腫瘤負荷在遠低於患有CLL之患者之CD 19+腫瘤負荷。此毒性之治療及治療時機將根據患者之醫師及研究研究者之決定而定。所建議之管控可包括：若個體患有持續連續2天以上之大於101℉之發熱且不存在感染證據(陰性血液培養物、CXR或其他來源)，則可考慮4mg/kg托西莫單抗。可根據醫師之決定考慮添加皮質類固醇及抗TNF療法。
B細胞清除. 可發生B細胞清除及低γ球蛋白血症。此與抗-CD20定向療法相同。在臨床上顯著之低γ球蛋白血症(即全身性感染)之情形下，將藉由已建立之臨床投藥指導方針給予個體靜脈內免疫球蛋白(IVIG)以使血清免疫球蛋白含量恢復正常含量，如已利用利妥昔單抗所實施。
原發性移植物功能衰竭. 原發性移植物功能衰竭(即，非植入)可能在第二次ASCT後比第一次ASCT後更常見。合格性準則規定，在原發性移植物功能衰竭之情形下根據治療醫師之決定，對於營救再輸注必須獲得足夠幹細胞。 結果
在此正在進行之試驗中，三個治療難治性晚期多發性骨髓瘤患者現已使用CTL019治療。該等患者中之兩者之結果展示基於在三個月時間點時之初次效能評價，二者皆已具有來自CTL019療法之實質性抗腫瘤效應。第三個患者尚未到達三個月時間點。兩個患者之結果更詳細闡述於下文中。
第一個骨髓瘤患者已完成其+100天反應評價且其對CART19療法具有極佳反應。以下測試經實施具有以下結果：-SPEP/免疫固定：陰性
-尿液免疫固定：在其免疫固定上有微弱的無法量測之κ輕鏈條帶(亦在第38天時呈現，因此並非新的)
或者，該患者滿足嚴格完全緩解之準則，其包括：-無血清輕鏈比率：正常
-骨髓生檢：陰性
-IgA免疫表型分型：IgA在檢測限值以下
除來自尿液免疫固定之微弱的無法量測之κ輕鏈結果外，患者滿足「嚴格完全緩解」之所有準則。3個時間點(第-2天、第+38天、第+103天)處之漿細胞免疫表型分型之概述展示於圖39中，且展示患者之IgA在檢測限值以下。該概述展示第-2天時較重之骨髓瘤負荷且在第+38天及第+103天時無法檢測，此藉由流式分析將患者歸類為「MRD陰性」。在第+103天時，概述展示正常多株CD19+漿細胞及B細胞之恢復。患者不具疾病或療法之症狀且與正常人一樣發揮功能。
第二個患者治療尚未到達+100天時間點。然而，在此時間點下，其症狀有所改善且因太早而無法確定CTL019輸注之效應。
實例7：用於外套細胞淋巴瘤之激酶抑制劑/CAR19 T細胞組合療法
授受性T細胞療法具有治療淋巴樣惡性病之相當希望。小淋巴球 性淋巴瘤/慢性淋巴球性白血病(SLL/CLL)及急性淋巴球性白血病(ALL)中之有希望的臨床反應，利用經針對B細胞特異性CD19抗原之嵌合抗原受體(CAR)轉導之自體T細胞(CAR19 T細胞/CART19細胞)的授受性轉移，利用CTL109。最近已報導I期試驗招收之3名患有化學療法難治性SLL/CLL之患者的初始數據，其用於利用CD19特異性CAR(CAR19 T細胞/CART19細胞)治療CD19陽性惡性病。所用方式涉及利用慢病毒對患者源性本體T細胞進行遺傳修飾以表現含有源自CD137及TcRz之信號傳導結構域之CD19靶向CAR。對於此研究，利用抗-CD3及抗-CD28珠粒擴增方法擴增細胞，且在無細胞介素支持下在淋巴清除後早期輸注細胞(Kalos M等人(2011)Sci Transl Med.3：95ra73；及Porter DL等人(2011)N Engl J Med.365：725-733)。該等早期結果極其有希望：(i)在單一療程後，2/3患者達成完全緩解且現在治療後15+個月時保持無疾病，同時在T細胞輸注後不久經皮質類固醇治療之第三個患者展示較強的部分反應。(ii)在該等患者中，能夠重演認為為基於授受性T細胞療法之策略之最終效能所需的元件，即穩健的活體內T細胞擴增、疾病根除、T細胞收縮及長期功能持久性。迄今為止，10個SLL/CLL患者已經治療，且2者保留在完全臨床及分子緩解中，5者經歷部分緩解，且3者顯示缺少可量測反應。在另一研究中，兩個患有B細胞ALL之患者達成完全緩解，且1者復發缺少CD19表現之白血病細胞。
在大細胞轉化之前及之後二者之外套細胞淋巴瘤(MCL)亦將可能受益於基於CART19之授受性療法，具體而言在與激酶抑制劑(例如接侵襲MCL細胞之彼等)組合時。
為進一步分析基於CART19之授受性療法與激酶抑制劑組合之組合，將使用高通量篩選來評估若干靶向對MCL發病機制至關重要之激酶之抑制劑：CDK4/6、BTK及mTOR與CART19細胞之組合。將在 MCL異種移植小鼠模型中在活體外及活體內二者更詳細地評估最有希望的組合，此最終可引導臨床方案之研發以評估MCL患者中小分子激酶抑制劑及CART細胞免疫療法之組合。
在此研究中，將利用CART19細胞單獨或與來自激酶家族之所選蛋白質之小分子抑制劑組合實施臨床前研究以確定此方式在多個MCL亞型中之潛在臨床效能且評估以治療方式靶向MCL細胞之能力，該激酶家族之表現及活性對MCL細胞之存活及生長至關重要。
研究計劃
在臨床前環境中，利用在MCL及CART19細胞中具有所記載致病相關性之激酶抑制劑評估以治療方式靶向MCL細胞(培養型及原代型細胞二者)之能力。將使用高通量MTT分析來確定該等藥劑鑑別藥劑施用之潛在最佳組合、投藥及時機的效應。首先在活體外及隨後在活體內在MCL異種移植模型中將更詳細地評估最有希望的2-3個組合之細胞功能、基於磷酸化之細胞信號傳導及基因表現。
表徵激酶抑制劑/CART-19細胞組合有效地靶向MCL細胞之能力之活體外研究
在此目的中，將檢查上文所列示之詳細功能、表型、生物化學及分子分析以研究活體外小分子激酶抑制劑對MCL細胞之影響以及檢查CART19細胞與MCL細胞之間之相互作用及抑制劑對該等相互作用之影響。
用於實現此目的之基準將產生全面數據組以：i. 記載CART19細胞經所培養及原代MCL細胞活化且溶解該等所培養及原代MCL細胞；ii. 展示所選激酶抑制劑在適宜地施用時(關於劑量，且對於一些抑制劑，抑制劑對CART19細胞投與之時機)，增強彼此及/或CART19細胞消除MCL細胞之能力，而對CART19細胞功能不造成負 面影響；且iii. 利用NSG小鼠建立欲用於活體內MCL異種移植實驗中之BTK抑制劑之時間表及投藥方案。
此研究之目標係例如評估是否鑑別靶向對MCL病理生物學至關重要之激酶之小分子抑制劑的最佳治療組合：CDK4、BTK及mTOR以及CART19細胞，監測CART19活性，且表徵該療法對MCL之功能、生物化學及分子效應。
該等研究應建立欲在目的2中活體內評估之與CART19療法結合之BTK治療激酶抑制劑之時機及劑量時間表的合理方案。
評估CART19細胞單獨及與BTK抑制劑組合靶向濾泡性淋巴瘤之能力之活體內研究
在此目的中，將在動物模型中測試所選抑制劑/CART19細胞組合影響所建立及原代MCL細胞之生長之能力。
用於實現此目的之基準將產生數據組以：i. 展示與對照(經單一藥劑及模擬劑治療之動物)相比，所選抑制劑/CART19細胞組合顯著地增強植入MCL之動物之存活；ii. 建立欲用作將來臨床試驗之基礎之所選激酶抑制劑/CART19組合之時間表及投藥方案。
此研究之目標包括評估目的1中所定義用於經鑑別激酶抑制劑/CART19加BTK抑制劑組合之治療及劑量時間表，及測試在異種移植有MCL細胞(經培養及原代二者)之NSG小鼠中BTK治療是否與CART19協同作用靶向MCL。
將使用以下細胞類型、化合物、動物及實驗方法來實現所提出之目的：
MCL細胞：
四種MCL細胞系(Jeko-1、Mino、SP-49及SP-53)及來自15種原發 性MCL(12種典型及3種母細胞樣)之活性冷凍樣品。儘管細胞系自發地生長良好，但單獨以及在自HS5骨髓基質細胞收集之條件化培養基存在下培養原代細胞以改良其活力。
CART19細胞：
利用慢病毒轉導且利用所建立之方案來產生經改造以表現CAR19之原代人類T細胞((Kalos M等人(2011)Sci Transl Med.3：95ra73；及Porter DL等人(2011)N Engl J Med.365：725-733)。單一轉導事件後，T細胞通常以超過30%之頻率表現CAR19。
研究將利用來自五個SLL/CLL患者之CART19群(已獲得具有1×107個細胞/小瓶之50-100個小瓶/患者)。將利用抗CAR19特異性個體基因型抗體(STM)來鑑別CART19細胞。在活體外及活體內二者在NSG小鼠中以標準化方式利用CD19+ NALM-6、CD19陰性K562及CD19轉導之K562細胞系控制CART19活性。儘管CART19細胞功能並非MHC限制的，但亦將使用來自至少5個MCL患者之CART19細胞。
激酶抑制劑：
將測試以下激酶之抑制劑：CDK4/6(PD0332991)、BTK(PCI-32765)、mTORC1(雷帕黴素)、MNK(4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(Marzec M等人PLoS One 6：e24849)；及來自Eli Lilly之新穎化合物(Gupta M等人(2012)Blood 119：476-487)；mTOR(OSI-027)及雙重PI3K/mTOR(PF-04691502)。
將首先在有效劑量之預定光譜下評估該等化合物，包括患者血清中所達到之非毒性濃度，以確保最佳激酶抑制。
動物：
利用自幹細胞及異種移植物核心(Stem Cell and Xenograft Core)育種且購得之NOD-SCID-IL-2Rgc裸(NSG)小鼠利用自Jackson實驗室(Bar Harbor)獲得之育種者實施活體內實驗。將小鼠圈養於利用HEPA 過濾之微量分離器之無菌條件下且用輻照食物及酸化水飼餵。
用抗生素(新黴素及多黏菌素)治療經移植小鼠達實驗之持續時間。根據實驗動物護理與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)所批準之方案，將6至8週齡動物(雄性及雌性之等混合群)用於所有研究。
已將NSG動物用於先前T細胞授受性轉移研究中以特定評估CART19細胞之差別活性(Witzig TE等人(2010)Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2010：265-270,MTT分析)。將首先實施高通量MTT分析以評估因應單獨或以多種組合施用之激酶抑制劑之MCL細胞生長。此分析能夠同時確定細胞增殖速率及活力，此容許在CART19細胞存在或不存在下有效地評估小分子抑制劑之許多可能組合。此分析之關鍵態樣將表徵關於潛在協同、加和或拮抗效應之藥物效應。另外，將評估小分子抑制劑對CART19細胞之效應。儘管BTK抑制應具有B細胞特異性，但mTOR及CDK4/6抑制將影響CART19細胞。建立藥物施用之正確時機以最小化其對CART19細胞之潛在效應將係該等實驗之目的之一。
為實施該測試，將MCL細胞以1×104個細胞/孔一式三份接種於96孔板中，且暴露於培養基或各種組合之激酶抑制劑及各種濃度之CART-19細胞中。在48hr及74hr時，將藉由使用MTT還原比色分析(Promega)來測定代謝活性細胞之相對數量。
利用司徒登氏t-測試(Student’s t-test)評估對照與不同治療條件之平均值之間之差的顯著性(+/- S.D.)，且P值<0.05視為統計學上顯著。
細胞增殖及細胞凋亡分析：
隨後將在CFSE標記及末端dUTP切口端標記(tunel)分析中評估最有希望的藥物組合以分別確定MCL細胞生長抑制之細胞生長抑制組份及細胞毒性組份二者。在前述分析中，藉由向BTK抑制劑及/或未經 標記之CART-19細胞中添加CFSE來標記MCL細胞。48hr後，藉由MCL型細胞之CFSE標記圖案之FACS分析所培養細胞。根據製造商之方案，利用來自BD Biosciences之ApoAlert DNA片段化分析套組進行tunel分析。
簡言之，將MCL細胞與抑制劑及/或CART19細胞一起培養48小時或72小時。洗滌後，用經標記之抗-CD20抗體對細胞染色並透化，洗滌，且在37℃下在TdT緩衝液中培育1小時。終止反應，洗滌細胞，重懸浮，且藉由流式細胞術利用CellQuest PRO軟體分析。
CART19功能分析：
利用CD107脫粒、細胞內細胞介素分泌(ICS)分析、增殖細胞溶解分析及多倍體細胞介素檢測分析量測CART19細胞對MCL細胞系之效應物活性(32)。對於脫粒及ICS分析，在抗-CD107抗體存在下將效應物(T細胞)與靶(腫瘤細胞)以0.2：1之E：T共培育4小時，然後根據所建立之方案針對表面(CAR19、CD3、CD8、CD4)及細胞內細胞介素標記物染色。利用基於流式細胞術之細胞溶解分析評價MCL細胞之細胞溶解。對於增殖分析，使用CFSE(羧基螢光黃琥珀醯亞胺基酯羧基-螢光素-琥珀醯基酯酶)預加載效應細胞，與靶細胞以0.2：1之E：T混合，在37℃下共培育4天，針對表面標記物(CAR19、CD3、CD8、CD4)染色且藉由流式細胞術分析CFSE之稀釋物。
多倍體細胞介素分析：
利用如(STM32)中所述之基於Luminex之珠粒分析，量測CART19細胞因應MCL靶之細胞介素之產生。對於該等分析，採用Invitrogen 30重套組同時量測血清、血漿或組織培養物上清液中之IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p40/p70)、IL-13、IL-15、IL-17、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β、IP-10、MIG、伊紅趨素、RANTES、MCP-1、 VEGF、G-CSF、EGF、鹼性FGF及HGF。
CART19T細胞之多參數流式細胞術分析：
在與腫瘤細胞一起共培育後，利用四色流式細胞術及經由賓夕法尼亞大學(University of Pennsylvania)艾瑞森癌症中心流式細胞術核心(Abramson Cancer Center Flow Cytometry Core)獲得之配備有4種雷射(藍光(488nM)、紫外(405nM)、綠光(532nM)及紅光(633nM)之定製BD LSR II，量測與CART19細胞上之功能活化及阻抑相關之表面標記物調節。利用FlowJo軟體(TreeStar,San Carlos,CA)分析所有流式細胞術數據。基本上如(STM42)中所述來實施該等分析，其中利用選除(dump)通道排除死細胞及靶細胞(CD19+)，且利用CAR19個體基因型特異性試劑檢測CART19細胞(STM)。視需要在完整或透化細胞上與腫瘤細胞共培育後評估CART19陽性及陰性細胞上之以下標記物(CD3+/CD8+及CD3+/CD4+)。已建立用於該等標記物之多參數面板：
-活化/效應物功能：CD25、CD154、CD134、CD137、CD69、CD57、CD28、T-bet
-抑制：CD152(CTLA4)、PD1、LAG3、CD200
-阻抑(Treg)CD4+/CD25++/CD127-、Fox-P3+
同時，將檢查藉由CD19及CD5染色鑑別之MCL細胞之以下免疫阻抑蛋白之表現：CD174(PD-L1)CD173(PD-L2)及CD152。
對細胞信號傳導之抑制劑影響：
此研究部分將僅致力於所選化合物；在上述功能分析(細胞生長、增殖及細胞凋亡)中經證實最有效者。將單獨研究每一藥物及所選組合之效應且將針對特定化合物調節該等研究。舉例而言，儘管mTORC1及MNK抑制劑組合將評估mTORC1信號傳導、具體而言eIF-4E磷酸化，BTK抑制將致力於PI3K-AKT及MEK-ERK路徑及Rb磷酸化上之CDK4/6抑制。該等研究將藉由西方墨點利用磷酸特異性抗體來 實施，如所述(Marzec M等人(2006)Blood.108：1744-1750；Marzec M等人(2008)Blood 111：2181-2189；Zhang Q等人(2011)Proc Natl Acad Sci USA 108：11977-11982)。簡言之，將溶解MCL細胞，且將利用勞裡方法(Lowry method，Bio-Rad)分析蛋白質提取物並加載至聚丙烯醯胺凝膠中。為檢查蛋白質磷酸化，將印跡膜與磷光體特異性抗體(例如特異性用於S6rp S235/236、eIF4E S209、4E-BP1 T37/46、4E-BP1 T70(細胞信號傳導)者)一起培育，以評估mTORC1及MNK活性及其抑制。隨後，將膜與適宜二級過氧化酶偶聯抗體一起培育。利用來自Amersham之ECL Plus系統使墨點顯影。
基因組規模之基因表現分析：
抑制細胞信號傳導通常會引起基因轉錄之變化。為確定所選抑制劑或極少抑制劑對MCL中之基因轉錄之效應，將如以下文獻中所述實施基因組規模之基因表現分析：Marzec M等人(2008)Blood 111：2181-2189；Zhang Q等人(2011)Proc Natl Acad Sci USA 108：11977-11982。簡言之，用所選抑制劑或其稀釋劑將細胞之一式三份培養物處理0小時、4小時及8小時。進一步純化總RNA以富含mRNA，將其逆轉錄、標記並藉由與針對所有已知基因外顯子之Affimetrix微晶片雜交來檢查。利用RMA如GeneSpring及MAS5算法中所實施將微陣列數據正規化並進行概述。利用錯誤發現率(FDR)藉由Benjamini-Hochberg變數增加方法針對多重測試校正所得p值。利用多種工具(包括SAM及PartekPro)完成差別表現測試。然後基於表現模式(GeneSpring或Spotfire)使所關注之新興基因成簇，且在KEGG、Ingenuity路徑分析及Gene Ontology數據庫中利用NIH-David作為搜索工具分析簇之官能基及路徑。對於基於該數據鑑別之基因，藉由定量RTPCR對不同類型之MCL(標準對母細胞樣及SOX11陽性對SOX11陰性)之較大樣品彙集物(至少20個)實施非依賴性表現構象。
全外顯子組DNA序列分析：
為較佳地表徵MCL病例之其發病機制及在可能程度上因應此處所提出之重組療法，檢查外顯子組DNA之序列。利用NimbleGen序列捕獲2.1M人類外顯子組陣列及HiSeq 2000/1000 Illumina儀器實施MCL及正常末梢血DNA樣品之全外顯子組捕獲及下一代測序。
異種移植腫瘤中之治療效應之評估：
NSG小鼠將攜載MCL腫瘤(源自MCL細胞系：Jeko及Mino及以組織片段植入之原代細胞或較不佳地細胞懸浮液二者)。藉由皮下植入小腫瘤片段使腫瘤繁殖。在腫瘤之直徑達到0.2-0.3cm後立即起始該療法。以在活體外預選之劑量及時機藉由管飼投與激酶抑制劑(例如，鑒於BTK抑制劑之B細胞特異性及預期缺少針對CART19細胞之任何抑制效應，預期BTK抑制劑與CART19細胞同時施用)。將CART-19細胞以1×107個/動物之劑量注射至帶有腫瘤之小鼠之尾靜脈中，將藉由管飼以在活體外預選之劑量及時機投與激酶抑制劑，已確立該劑量足以可複現地消滅惡性細胞且同時不會引起異種移植物抗宿主病。產生且冷凍CART19細胞之大主要儲備溶液(1×1010)以最小化與效應細胞差別相關之變化。該等實驗之主要量度將係存活率，將利用卡本/麥爾曲線對其進行評價。作為二次量測，評估CART19細胞在T細胞輸注後之動物中之差別擴增。此可藉由以下事實來實施：所輸注之T細胞產物將由所定義比率之CART19陽性與陰性細胞構成。對於該等分析，每週藉由尾靜脈採血(每次25微升)對動物採血，然後藉由紅血球溶解且針對人類CD3、CD4、CD8及CART19染色。CART19細胞之優先擴增(CART19+/CART19-比率至少增加2倍)將係選擇性MCL驅動之CART19細胞擴增之證據。為評價治療結果，根據式：體積=0.4ab2，如下量測所植入皮下腫瘤之體積，其中a及b分別表示腫瘤之長直徑及短直徑。利用標準t-測試以統計學方式分析小鼠之治療組與 未經治療組之間的腫瘤體積差異。在實驗之終點(>30天)或若腫瘤之直徑達到>1.2cm或當注意到任何動物窘迫證據時，殺死小鼠。利用標準t-測試以統計學方式分析小鼠之治療組與未經治療組之間的腫瘤體積差異。收穫腫瘤以及內部器官，處理且藉由組織學分析，且對於所選組織，藉由免疫組織化學利用針對B細胞(CD20、CD79a、Pax-5、CD10、BCL-6)及T細胞(CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、TIA-1)之抗體組及增殖標記物Ki-67進行分析。
統計學分析：
在活體外功能研究中，利用司徒登氏t-測試評估對照與不同治療條件之平均值之間之差的顯著性(+/- S.D.)，且P值<0.05視為統計學上顯著。基於先前經歷，預期實驗小鼠組之間之差異較大。因此，每一治療組將使用10隻NSG小鼠，此將確保使用雙側二樣品/-測試在1型誤差值為0.05下，給定治療平均值之差與標準偏差之間之預期比率至少為3時，具有至少90%之檢定力。數據將呈現為平均值±SEM。利用二樣品t-測試進行組間之比較。p<0.05之值視為顯著。對於無腫瘤存活率研究，將10隻小鼠組用於存活率比較，且記錄每一小鼠之疾病狀態(腫瘤對無腫瘤)及無腫瘤時間。繪製卡本-麥爾存活率曲線且實施對數秩測試以比較存活率曲線。將顯著性水準控制在0.05。
實例8：用於外套細胞淋巴瘤之依魯替尼/CAR19 T細胞組合療法
此實例中所述之實驗表徵CART19活性與依魯替尼治療組合在活體外及活體內治療外套細胞淋巴瘤。依魯替尼係通常用於治療一些血液癌症之BTK之小分子抑制劑。本文所述之活體外實驗包括增殖、細胞介素產生、CD107a脫粒及細胞毒性之評價。利用Xenoplant小鼠模型來研究活體內CART19與依魯替尼治療之效能及最佳劑量。儘管依魯替尼在MCL中顯示相當活性，但約30%之患者並不響應，且在反應者中，僅21%至約三分之一經歷完全緩解(Wang等人，NEJM 369.6(2013)：507-16)。完全緩解之達成與經改良之無進展存活期相關。此外，療法可引起中值反應之持續時間為17.5個月之藥物抗性。 在一些環境中，在依魯替尼療法後已觀察到BTK結合位點或緊鄰下游中之突變，此強調可能變得日益頻繁之藥物抗性機制。例如，參見Woyach等人，NEJM.370.24(2014)：2286-94。同樣，阻斷BTK功能可抑制B細胞受體(BCR)信號傳導且並不具有直接細胞毒性。例如，參見Ponader等人，Blood.119.5(2012)：1182-89。缺少細胞毒性及無法消滅惡性純系易於在選擇壓力下選殖進化。同樣，在使用依魯替尼治療CLL之患者中，至侵襲性疾病的轉化增加之初步發現令人關注。例如，參見Byrd等人，NEJM.369.1(2013)：32-42；及Parikh等人，Blood.123.11(2014)：1647-57。
在患有多種B細胞瘤、首要為急性淋巴母細胞性白血病(ALL)之大部分患者中，輸注經針對B細胞特異性CD19抗原之嵌合抗原受體(CAR)轉導之自體T細胞(CTL019、CART19)會引起顯著的臨床反應。例如，參見Maude等人NEJM.371.16(2014)：1507-17；及Ruella等人Expert Opin.Biol.Ther.(2015)：1-6。淋巴結團塊或大包塊疾病之存在可導致T細胞浸潤減少且因此降低抗腫瘤活性。大包塊淋巴腺病似乎並不損害對依魯替尼之反應。Wang等人，NEJM.369.6(2013)：507-16。同樣，依魯替尼已展示在減少腫瘤團塊及動員末梢血中之贅瘤性B細胞方面的具體效能。
方法
細胞系及初級樣品. 自ATCC(Mino、Jeko-1、SP-49)獲得MCL細胞系，同時自MCL患者之進行性胸膜滲出液產生MCL-RL。對於活體外實驗，將細胞系維持在含有補充有10%胎牛血清、青黴素及鏈黴素之RPMI培養基之培養物中。對於一些實驗，使用叩頭蟲綠色螢光素酶/eGFP轉導MCL-RL及Jeko-1細胞，且然後分選以獲得>99%陽性 群。使用急性白血病細胞系MOLM-14、K562或NALM-6及T-ALL細胞系JURKAT作為對照。該等細胞系最初係自ATCC獲得。自賓夕法尼亞大學之臨床實踐獲得未經鑑別之原代人類MCL骨髓(BM)及末梢血(PB)樣本。對於所有功能研究，在實驗前至少12小時將原代細胞解凍且靜置於37℃下。
CAR構築體及CAR T細胞之產生. 如先前所述產生鼠類抗-CD19嵌合抗原受體(含有CD8鉸鏈、41BB共刺激結構域及CD3 ζ信號傳導結構域)。例如，參見Milone等人，Molecular Therapy：the Journal of the American Society of Gene Therapy.17.8(2009)：1453-64。如先前所述實施表現CAR之T細胞之產生。例如，參見Gill等人，Blood.123.15(2014)：2343-54。自賓夕法尼亞大學之人類免疫學核心(Human Immunology Core)獲得正常供體CD4及CD8 T細胞或PB單核細胞(PBMC)。在X-vivo 15培養基(Lonza,04-418Q)、5%人類血清AB(Gemini,100-512)、青黴素/鏈黴素(Gibco,15070063)及Glutamax(Gibco,35050061)中，以1×106個/ml及1：1之CD4：CD8比率平鋪T細胞且擴增，利用在培養第1天時添加且在第6天時移除之抗-CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies,11161D)。在第2天時使用慢病毒轉導T細胞。在培養物中將T細胞擴增8-15天且在中值細胞體積低於300fl時收穫。然後將T細胞冷藏保存於FBS 10% DMSO中用於將來實驗。在所有實驗之前，將T細胞解凍且在37℃下靜置過夜。
依魯替尼. 依魯替尼(PCI-32765)係以粉末或DMSO溶液購自MedKoo(編號202171)或Selleck Biochemicals(編號S2680)。對於活體外實驗，將依魯替尼稀釋至10nM、100nM及1000nM之濃度。對於活體內實驗，將依魯替尼粉末溶解於10% HP-β-環糊精溶液(1.6mg/ml)中且於飲用水中投與小鼠。
多參數流式細胞術分析. 抗人類抗體係購自Biolegend、 eBioscience或Becton Dickinson。自活體外培養物或自動物分離細胞，在補充有2%胎牛血清之PBS中洗滌一次，且在室溫下染色15分鐘。對於細胞數量化，根據製造商之說明書使用Countbright(Invitrogen)珠粒。在所有分析中，基於正向對側向散射特徵對所關注之群設門，然後單重態設門，且利用Live Dead Aqua(Invitrogen)對活細胞設門。包括用於品質控制之時間設門。如先前所述檢測CAR19之表面表現。例如，參見Kalos等人，Science Translational Medicine.3.95(2011)：95ra73。在四雷射Fortessa-LSR流式細胞儀(Becton-Dickinson)上實施流式細胞術且用FlowJo×10.0.7r2(Tree Star)分析。
脫粒分析. 如先前所述實施脫粒分析。例如，參見Kalos等人，Science Translational Medicine.3.95(2011)：95ra73。將T細胞與靶細胞以1：5比率於T細胞培養基中一起培育。將抗-CD107a-PECY7(Biolegend)、抗-CD28(BD Biosciences)、抗-CD49d(BD Biosciences)抗體及孟寧素(monensin，BD Biosciences)添加至共培養物中。4小時後，收穫細胞且針對CAR表現、CD3、CD8及Live Dead aqua染色(Invitrogen)染色。將細胞固定且透化(Invitrogen Fix/Perm緩衝液)，且然後實施細胞內染色以檢測多種細胞介素(IFN、TNFa、IL-2、GM-CSF、MIP1b)。
增殖分析. 洗滌T細胞且以1×107個/ml重懸浮於100μl PBS中，並在37℃下用100μl 2.5μM CFSE(Invitrogen)染色5分鐘。然後用冷培養基驟冷反應物且將細胞洗滌三次。以100Gy之劑量輻照靶。以1：1比率將T細胞與經輻照靶細胞一起培育120小時，在24小時時添加培養基。然後收穫細胞，針對CD3、CAR及Live Dead aqua(Invitrogen)染色，且添加Countbright珠粒(Invitrogen)，然後進行流式細胞術分析以供絕對量化。
細胞毒性分析. 如先前所述將螢光素酶/eGFP+ NALM-6或RL細 胞用於細胞毒性分析。例如，參見Gill等人，Blood.123.15(2014)：2343-54。以所指示比率將靶與效應T細胞一起培育4小時或16小時。藉由Xenogen IVIS-200光譜相機上之生物發光成像計算殺死。
細胞介素量測. 在T細胞培養基中將效應物與靶細胞以1：1比率共培育24h。收穫上清液，且根據製造商之方案(Invitrogen)藉由30重Luminex陣列(Luminex公司，FLEXMAP 3D)分析。例如，參見Kalos等人，Science Translational Medicine.3.95(2011)：95ra73。
活體內實驗. 最初自Jackson實驗室獲得之NOD-SCID-γ鏈-/-(NSG)小鼠係購自賓夕法尼亞大學之幹細胞及異種移植物核心。對經制度性動物護理及使用委員會(IACUC)批準之方案實施所有實驗。所使用異種移植物模型之示意圖論述於本文中。將細胞(MCL細胞系或T細胞)於200μl PBS中以所指示濃度注射至小鼠之尾靜脈中。利用Xenogen IVIS-200光譜相機實施生物發光成像且用LivingImage軟體4.3.1版(Caliper LifeSciencies)分析。在實驗結束時或在動物滿足預定終點時，根據IACUC方案對其實施安樂死。
免疫組織化學. 在Leica Bond-III儀器上利用Bond Polymer Refine檢測系統實施福馬林固定之石蠟包埋組織之免疫組織化學(IHC)染色。針對CD3、CD4、CD8、Pax5及細胞週期蛋白D1之抗體未經稀釋即使用。使用ER2溶液(Leica Microsystems AR9640)進行20分鐘之熱誘導表位修復。利用Aperio ScanScopeTM以數位方式獲取影像。
統計學分析. 利用用於windows 6.04版之GraphPad Prism 6實施所有統計學。
外套細胞淋巴瘤細胞系
大部分現有外套細胞淋巴瘤(MCL)系已在活體外永生且繁殖許多代，因此丟失其對B細胞受體信號傳導之依賴性。因此，其對依魯替 尼具有較差敏感性。實施活體外實驗以確定MCL細胞系對依魯替尼治療之敏感性。該等細胞系亦用於評價依魯替尼/CART19組合治療在此實例中所進一步論述之實驗中的效能。自患有多復發性MCL之患者之胸膜滲出液收穫MCL細胞。原始細胞(RL原代)及源自其(RL)之細胞系二者皆具有母細胞樣形態、典型MCL免疫表型，且對藉由螢光原位雜交(FISH)之經典t(11；14)轉座呈陽性(圖52A、52B、52C)。
將RL及JEKO-1細胞與不同劑量之依魯替尼(0.1nM、1nM、10nM、100nM、1μM及10μM)一起培養，且藉由量測生物發光(BLI)之減少來確定對對依魯替尼之敏感性。如圖31A中所展示，RL細胞以劑量依賴性方式對依魯替尼治療敏感。然而，JEKO-1細胞對依魯替尼治療有抗性(未展示隨增加的依魯替尼劑量變化減少的生物發光)。
亦利用MTT分析來分析RL、Jeko-1及Mino細胞對依魯替尼之敏感性。在活體外使RL暴露於遞增濃度之依魯替尼下產生增殖及下游調介劑磷酸化之劑量依賴性抑制，此指示依魯替尼對靶之效應，且IC50為10nM。相比之下，已建立之MCL細胞系Jeko-1及Mino對依魯替尼具有相對抗性，且IC50結果高達10μM(圖52D)。為確認RL作為活模型用於活體內實驗，向免疫缺失NOD-SCID-γ鏈基因敲除(NSG)小鼠植入1×106個表現螢光素酶之RL細胞(圖52E)。評價其腫瘤負荷及存活率。在靜脈內注射後，MCL植入所有小鼠中且定位至脾及肝，然後傳播至骨髓、血液及淋巴結(圖52F)。受侵襲脾及肝之組織學與MCL之實質浸潤一致。(圖52G)。
該等結果展示該等不同細胞系由此可用於模型依魯替尼敏感性及依魯替尼抗性MCL二者。
外套細胞淋巴瘤細胞對CART19之殺死敏感
大部分臨床前工作展示已利用對依魯替尼不敏感之B-ALL細胞系實施CART19之效能。此外，已在患有B-ALL之患者中報導迄今為止 最佳之臨床反應，而患有惰性B細胞惡性病之患者已報導較弱反應。
為在此模型中展示MCL對CART19之殺死敏感，使用已用於臨床試驗中之抗-CD19 CAR構築體轉導健康供體T細胞。例如，參見Porter,NEJM 2011。實施一系列活體外實驗以展示依魯替尼敏感性細胞系RL及依魯替尼抗性細胞系Jeko-1產生等效的CART-19脫粒、細胞介素產生、殺死及增殖(圖53A、53B、53C、53D)。另外，在白血病期自兩個患有MCL之患者獲得末梢血或骨髓，允許使用抗-CD19 CAR擴增及轉導自體T細胞。自體患者源性CART19細胞對MCL具有反應性，而未經轉導之T細胞對其各別自體MCL無反應性(圖53E、53F)。該等結果指示，MCL對CART19之效應物功能敏感。
活體外依魯替尼/CART19治療之評價
先前已基於短期活性分析低估了依魯替尼對T細胞之效應，如Honigberg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.107(2010)：13075-80中所述。隨後，報導依魯替尼對T細胞激酶ITK之效應之分析以支持依魯替尼藉由抑制Th2型極化對CD4 T細胞之免疫調節作用。參見Dubovsky等人，Blood 122.15(2013)：2539-49。若干組經CART19治療之患者之細胞介素分析指示CART19療法與Th1(IL2、IFNγ、TNF)、Th2(IL-4、IL-5、IL-10)二者及其他細胞介素相關(例如，參見Kalos等人，Science Translational Medicine 3.95(2011)：95ra73)。在此實例中，使用等於、高於及低於在患者中所預期之依魯替尼濃度(血清中之平均峰值濃度為100-150ng/ml)之依魯替尼評估CART19功能之效應。參見Advani等人，J.Clin.Oncol.2013；31：88。
發現CART19細胞含有ITK。在依魯替尼存在下經由TCR非特異性刺激CART19細胞會減少磷酸化的ITK(pITK-Y180)，如先前針對CD4+ T細胞所報導。參見Dubovsky等人，Blood 122.15(2013)：2539-49。相比之下，經由CAR特異性刺激CART19細胞不會降低ITK活化 (圖54A)。此觀察指示可能不會因暴露於依魯替尼而對CART19功能造成不利影響。
另外，確定在依魯替尼存在下CART19細胞之短期及長期活體外功能。臨床上相關濃度之依魯替尼不會損害CART19細胞增殖、脫粒或細胞介素產生；但在上述生理濃度下可抑制CART19細胞功能，可能代表非特異性毒性(圖54B、54C、10B)。
具體而言，使用慢病毒抗-CD19 CAR構築體轉導自正常健康供體分離之PBMC，如上文所述。培養所得表現CAR19之T細胞(CART19)且使其傳代以測定增殖及擴增能力。在具或不具不同濃度之依魯替尼(10nM、100nM及1000nM依魯替尼)下培養1：1比率之CD4：CD8表現T細胞。在每次細胞傳代時添加依魯替尼。在第0天、第5天、第6天、第7天、第9天及第10天時對細胞數進行計數(圖9A)。亦監測細胞體積(圖9B)。
亦使用CFSE染色及流式細胞術分析來評價CART19細胞在經腫瘤細胞系MOLM14、JEKO-1及RL刺激後在依魯替尼存在下之增殖。MOLM14係AML細胞系，且JEKO-1及RL係外套細胞淋巴瘤細胞系。特定而言，RL細胞係自復發性MCL患者之胸膜滲出液獲得之源自贅瘤性B細胞之新穎MCL細胞系。將CART19細胞與腫瘤細胞以1：1比率混合且經5天評價增殖。增殖細胞之百分比表示於圖10A中之每一直方圖中。如圖10B中所展示之增殖之量化展示在與MCL細胞系共培養期間，高劑量之依魯替尼可抑制CART 19細胞增殖。
T細胞之脫粒指示細胞溶解T細胞之活化及起始抗原特異性細胞毒性之能力。CD107a係在T細胞刺激後在細胞表面上瞬時表現之T細胞脫粒之功能標記物。在經腫瘤細胞系MOLM14、JEKO-1及RL刺激後，使用流式細胞術分析來量化表現CD107a之CART19 T細胞。CD107a表現細胞存在於圖11A中所展示之細胞圖譜之Q2(第2象限) 中。自圖11A之圖譜獲得之結果之量化展示於圖11B中。該等結果指示，共培養CART19細胞與MCL-RL或JEKO-1使得大量CAR特異性CD107a脫粒。
亦在經不同腫瘤細胞系刺激後量化在依魯替尼存在下藉由CART19 T細胞之細胞介素產生。藉由流式細胞術評價IL-2、TNF-α及IFN-γ產生。產生細胞介素之細胞存在於圖12、圖13及圖14中所展示圖譜之第2象限中。經JEKO-1及RL刺激之CART19 T細胞展示細胞介素表現之增加。同樣，遞增濃度之依魯替尼治療並不影響產生細胞介素之CART19細胞之百分比。
藉由30重LUMINEX分析來分析在經腫瘤細胞刺激後且在不同濃度之依魯替尼存在下自CART19細胞分泌之細胞介素。分析由TH1細胞分泌之細胞介素，例如IL-2、IFN-γ及TNF-α。分析由TH2細胞分泌之細胞介素，包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-15、IL-17、MIP1a、GM-CSF、MIP-1b、CP-1、IL-1Ra、IL-7、IP-10、IL-1b、VEGF、G-CSF、EGF、HGF、IFNa、IL-12、RANTES、伊紅趨素、IL-2R、MIG及IL-8。如圖15中所展示，TH1及TH2細胞介素係由CART19 T細胞分泌。
同樣，利用兩種不同技術之實驗指示暴露於依魯替尼與未暴露於依魯替尼之CART19細胞之間的Th1/Th2極化不存在差異(圖54D)。
在依魯替尼存在下CART19細胞對MCL細胞之殺死加強，此表明來自組合之至少加和效應(圖54E)。然而，在依魯替尼存在下CART19細胞之固有細胞毒性功能並未加強。(圖54F)。
實施其他生物發光分析以評價腫瘤細胞之CART19細胞殺死。將CART19細胞與攜載螢光素酶報導基因之腫瘤細胞MOLM14、JEKO-1及RL以不同比率(例如1：1；1：0.5；1：0.25；及1：0)以一式兩份平鋪於96孔板中。24小時後，檢測並量化生物發光。結果指示在與CART19 細胞一起培育後，MOLM14樣品中之生物發光並未減少。然而，對於JEKO-1及RL細胞，在CART19細胞存在下之生物發光減少，此指示CART19細胞調介JEKO-1及RL細胞殺死(圖16A、16B、16C、16D、16E及16F)。在用依魯替尼治療時生物發光進一步減少，此指示依魯替尼及CART19之組合比使用單獨CART19治療可增加JEKO-1及RL細胞殺死。與該等結果一致，每一治療後之總細胞之計算展示JEKO-1及RL細胞之CART19治療可減小細胞數且在用CART19及依魯替尼治療時進一步減小(圖17B及17C)，此表明組合療法不僅有效地殺死MCL細胞，且亦有效地殺死MCL細胞系。
活體內依魯替尼/CART19治療之評價
在該等實驗中，使用小鼠外套細胞淋巴瘤模型來評價活體內CART19及依魯替尼組合療法。
諸如圖20、55及5A中所展示之彼等示意圖用於此實例中。圖20展示在活體內小鼠MCL模型中測試CART19/依魯替尼組合療法之示意圖。將來自RL(MCL-3)、JEKO-1(MCL-4)及NALM6(MCL-5)細胞系之1×106個細胞注射於NSG小鼠中(每一實驗使用20隻小鼠)。容許植入1週後，在第0天時起始治療，其中治療係：0.5-1×106個CART19細胞(經由注射)、25mg/kg/天依魯替尼(經口管飼)或CART19 +依魯替尼治療。在第7天、第14天、第21天及第28天時，使生物發光成像以監測腫瘤大小。繼續使用依魯替尼治療接受依魯替尼治療之小鼠。亦監測小鼠之存活率。圖55及56展示在活體內小鼠MCL模型中測試CART19/依魯替尼組合療法之其他示意圖。將2×106個MCL-RL細胞注射至NSG小鼠中。容許植入(藉由生物發光成像確認植入)1週後，在第7天(MCL-RL細胞注射後)時起始治療，其中治療係：媒劑對照、CART19細胞(2×106個細胞)及/或依魯替尼(125mg/kg/天)。在第14天、第21天、第28天及第35天(注射MCL-RL細胞後)時，使生物發光成像以監 測腫瘤大小。
檢查單獨依魯替尼治療對活體內小鼠MCL模型之效應。將經GFP/螢光素酶基因轉染之RL細胞靜脈內注射至免疫缺失NSG小鼠中，在肝及脾中產生100% MCL植入，且最終擴散至淋巴結及骨髓中。使用不同劑量之依魯替尼25mg/kg/天及250mg/kg/天治療小鼠。 在不同時間點下評價表示腫瘤生長之平均生物發光。如圖32中所展示，RL源性腫瘤展示劑量相關之敏感性。在含有RL細胞之小鼠中實施滴定依魯替尼劑量之其他實驗且展示於圖57中。較高劑量產生較佳抗腫瘤活性而不增加毒性，此與在MCL臨床中使用較高劑量之依魯替尼一致(Wang等人，NEJM 369.6(2013)：507-16)。
亦實施CART19劑量發現。在第0天時，將攜載GFP-螢光素酶報導基因之兩個MCL細胞系RL(MCL-1)及JEKO-1(MCL-2)注射至NSG小鼠中。在第7天時以不同劑量(例如以0.5×e6個細胞、1×e6個細胞或2×e6個細胞)注射CART19 T細胞。監測小鼠達例如100天。在不同時間點下，監測小鼠之腫瘤大小(例如，生物發光成像)(圖18A及18B及圖19A)及總存活期(例如，卡本-麥爾存活率曲線)(圖18C及圖19B)。不同劑量之CART19細胞展示劑量依賴性抗腫瘤效能，且2×106個CART19細胞/小鼠係最有效劑量(圖19A)。
該等研究提供實施面對面比較兩種MCL療法之機會。如圖58中所展示，僅在經CART-19細胞治療之小鼠中達成長期存活。在比較未經轉導之T細胞加依魯替尼與單獨依魯替尼時，抗腫瘤效應不存在差異。因此，在所有後續實驗中，對照組為媒劑及單獨依魯替尼(圖59)。
亦測試向依魯替尼中添加CART19，如圖56之示意圖中所詳述。 評估依魯替尼對腫瘤負荷之效應指示在較早時間點下適當延遲腫瘤生長。相比之下，CART19細胞療法使得腫瘤負荷明確減小達若干週。 在接受單獨CART19細胞之小鼠中，此後在第40天時開始惰性復發，而經CART19細胞以及依魯替尼治療之小鼠直至第80天仍未患可檢測之疾病(圖60)。在實驗結束時收穫之器官之組織病理學展示所有對照及經依魯替尼治療之小鼠中的疾病持久性，與經依魯替尼治療之小鼠中之腫瘤壞死病灶。大部分經單獨CART19治療之小鼠展示長期惰性復發伴隨有CART19細胞持久性，而經CART19-依魯替尼治療之小鼠展示來自所涉及器官之腫瘤清除及CART19消失(數據未展示)。
CART19及依魯替尼之組合效應之機制
本文之活體外實驗指示依魯替尼既不損害亦不明確加強短期CART19效應物功能。活體內研究展示依魯替尼單一療法具有適當抗腫瘤效應。結果指示依魯替尼可顯著增強CART19細胞之抗腫瘤功能(圖60)。因此，實施實驗以確定此效應之機制。
已展示抑制ITK會抑制Th2極化且向Th1表型偏移(Dubovsky等人，Blood 122.15(2013)：2539-49)。在經CART19細胞及依魯替尼治療之小鼠中，當與CART19細胞單一療法比較時，利用此分析未觀察到Th1細胞增加(圖61A、61B)。然而，使小鼠暴露於依魯替尼下可增加外周CART19細胞。治療組與對照組之間之增殖標記物Ki67不存在差異(圖61C)，因此此分析無法檢測增殖差異。類似地，抗細胞凋亡標記物Bcl2或細胞凋亡標記物磷脂醯絲胺酸不存在差異，此表明CART細胞數之差別與細胞凋亡受損不相關(圖61D)。由於在患者中依魯替尼與外周淋巴球增多症相關，故實施實驗以確定此是否亦發現於經單獨依魯替尼治療之小鼠中。開始依魯替尼後一週，在經依魯替尼治療之小鼠中存在更多循環MCL細胞及更少結節/器官MCL細胞。有趣的是，在依魯替尼敏感性及抗性活體內模型二者中皆觀察到此增加，如同在植入急性白血病細胞系NALM-6之NSG小鼠中亦觀察到者(數據未展示)。
為理解依魯替尼在活體內T細胞擴增中之作用，向NSG小鼠植入MCL-RL WT細胞且使用螢光素酶陽性T細對其進行治療。與UTD或UTD-依魯替尼相比，經CTL019及CTL019依魯替尼治療之小鼠皆展示較強T細胞擴增(數據未展示)。然後研究活體內不同T細胞亞組之頻率且在T細胞輸注後1週在PB T細胞中未見差別。(數據未展示)。由於CXCR4參與人類中之依魯替尼驅動之B細胞動員，檢查活體內CXCR4在經CTL019或CTL019-依魯替尼治療之小鼠之PB T細胞中的表現：CXCR4含量在2組中相似(數據未展示)。最後，分析經CART19及CART19-依魯替尼治療之小鼠之T細胞PB上的抑制/共刺激受體表現。TIM3、LAG3、CD137或CTLA4之表現不存在明顯差異，然而在經CTL019及UTD與依魯替尼組合治療之小鼠中注意到減少的PD-1表現之傾向。
結論
用於B細胞惡性病之療法包括基於BCR信號傳導及CD19定向T細胞療法之小分子抑制劑。在復發性MCL環境下，BTK抑制劑依魯替尼現經FDA批準且引起高初始反應率。不幸的是，該等反應往往為瞬時的且需要比用於CLL之藥物劑量高之藥物劑量。CART-19在患有高風險B-ALL之患者中產生耐久性反應，且其亦在其他B細胞惡性病中有效。初步數據表明成熟B細胞惡性病對CART-19之反應可低於B-ALL之彼等，但尚未確定此差別之機制。此實例研究向CART19中添加依魯替尼在治療MCL中之影響。
將對依魯替尼具有可變敏感性(IC50介於10nM至10μM範圍內)之不同MCL細胞系用於活體外實驗。使用該等不同細胞系來模型化依魯替尼敏感性及依魯替尼抗性MCL。在除了最高劑量以外之所有依魯替尼下，CART19細胞功能未受損，具有完整的T細胞擴增動力學、腫瘤識別及殺死以及細胞介素產生。此外，結果未揭露在依魯替尼暴 露時之T輔助物極化。此發現可歸因於要素(包括使用CD4及CD8細胞之混合培養物)之組合，此與由Dubovksy等人，Blood 122.15(2013)：2539-49實施之僅CD4實驗模型不同。依魯替尼敏感性及依魯替尼抗性細胞系二者皆強烈地活化CART19細胞且誘導殺死、細胞介素產生及增殖。活體外CART19及依魯替尼之組合產生至少加和的腫瘤殺死。此實例中之結果展示在使用CART19及依魯替尼各自作為單一療法時在臨床上相關之投與劑量及時間表(單次CART19劑量，持續投與依魯替尼)下CART19優於依魯替尼之優越性。
亦在此實例中利用實驗室中所產生之MCL-RL細胞系產生全身性異種移植物MCL模型。使用不同劑量之同種異體CAR19 T細胞治療該等小鼠會產生劑量依賴性抗腫瘤效應。亦在依魯替尼抗性JEKO-1細胞系中觀察到對CART-19之相似劑量反應。使用不同劑量(例如，0mg/kg/天、25mg/kg/天及125mg/kg/天)之依魯替尼活體內治療MCL-RL，分別產生70天、81天及100天之中值總存活期(p<0.001)。依魯替尼125mg/kg與CART19之直接活體內比較展示經CART19治療之小鼠之顯著改良之腫瘤控制。同樣，使用媒劑、依魯替尼、CART19或CART19及依魯替尼之組合(iCART19)治療MCL-RL植入小鼠。在臨床上相關之劑量下，使用CART19之單一MCL療法優於使用依魯替尼之單一療法，且依魯替尼與CART19之組合產生加強的抗腫瘤效應。具體而言，活體內iCART19組合產生初始較高循環量之CART19細胞，然後產生深腫瘤反應，且在將依魯替尼添加至CART19中時顯著延遲復發。iCART19組合可改良腫瘤控制，且80%之小鼠達到完全緩解及長期無疾病存活。機械上，經依魯替尼治療之小鼠具有較高的循環CART19細胞數而不改變Th1/Th2或記憶表型。因此，本文結果展示依魯替尼可以合理方式與CART19組合，且表明該等療法中每一者之性質可補償另一者之缺陷，因此產生增強的長期抗腫瘤效應。組合BCR 信號傳導抑制與抗-CD19定向T細胞療法之實驗及結果為B細胞惡性病之非交叉抗性療法之合理組合鋪平了道路。
腫瘤反應及復發之動力學表明依魯替尼用於加深藉由CTL019單獨達成之初始反應，或增強CTL019細胞之長期免疫監督能力。
實例9：用於慢性淋巴球性白血病之依魯替尼/CAR19 T細胞組合療法
依魯替尼亦用於治療慢性淋巴球性白血病(CLL)。依魯替尼尚未展示針對T細胞或NK細胞之細胞毒性效應。然而，在CLL細胞中，依魯替尼促進程式化細胞死亡且抑制腫瘤細胞遷移及黏附。在此實例中，實施實驗以檢查：1)依魯替尼對來自經歷依魯替尼療法之患者之CART19產生之效應；及2)使用依魯替尼與CART19之組合治療之最佳時機用於最佳活體內功能。
依魯替尼對CART19產生及功能之效應
利用如本文(例如實例6中)所述之血球分離獲得正常供體PBMC。將PBMC與5μM依魯替尼一起培育30分鐘或保持未經治療(用於對照)，且然後將細胞洗滌兩次。然後利用本文(例如實例4中)所述之方法用含有CAR19之慢病毒構築體轉導細胞以產生CART19 T細胞。測量自經依魯替尼治療之PBMC產生之CART19 T細胞數。實施FAC分析以測定與未經治療之PBMC相比自經依魯替尼治療之PBMC產生之CART19 T細胞數。如圖21中所展示，15%之經轉導依魯替尼治療之PBMC表現CAR19，且12%之經轉導未經治療之PBMC表現CAR19。 該等結果展示依魯替尼治療不會影響慢病毒轉導效率或CART19 T細胞產生。因此，可自經歷依魯替尼治療之CLL患者製造CART19 T細胞。
實施進一步活體外分析以確定依魯替尼對CART19 T細胞增殖、CART19細胞毒性及TH1：TH2細胞介素產生之比率的效應。
為量測細胞增殖，用CFSE對細胞染色以檢測增殖細胞且藉由 FACS分析，如實例4中所述。將CART19 T細胞與不同濃度之依魯替尼(0.1μM、0.5μM、1μM及5μM)一起培育，且用CD3/CD28珠粒刺激或保持未經刺激。在圖22中，將直方圖疊加以比較每一依魯替尼濃度下未經刺激與經CD3/CD28刺激之CART19 T細胞。對於每一依魯替尼濃度，觀察到經CD3/CD28刺激之T細胞增殖，由此展示依魯替尼治療不會影響CART19細胞增殖。
亦利用實例4中所述之方法評價依魯替尼對CART19 T細胞之細胞毒性之效應。用培養基、DMSO或1μM依魯替尼治療未經轉導及經CAR19轉導之T細胞。使用效應物CART19細胞(經培養基、DMSO或依魯替尼治療)利用滴定效應物對靶(E：T)比率實施基於流式之殺死分析，以確定針對CD19表現靶細胞之特異性細胞毒性活性。如圖23中所展示，經依魯替尼治療之CART19 T細胞展示與對照(經培養基或DMSO治療之CART19 T細胞)相同之針對CD19表現靶細胞之特異性細胞毒性活性百分比。因此，依魯替尼治療不會影響CART19細胞毒性。
在人類CLL患者中，依魯替尼治療可限制TH2活化，且因此可促進T細胞之TH1選擇壓力且使TH1/TH2細胞介素偏移。實施分析以量測在依魯替尼或DMSO(對照)存在或不存在下TH1及TH2細胞介素產生。 如圖24中所展示，依魯替尼並不促進CART 19細胞中之TH1及TH2細胞介素偏移。
活體內依魯替尼/CART19組合治療之效能
在活體內小鼠模型中評價CART19功能。將Nalm/6細胞(人類急性淋巴母細胞性白血病細胞系)植入NSG小鼠中，且每天監測小鼠持續至少50天。Nalm/6腫瘤模型產生對依魯替尼不敏感之腫瘤，且因此容許分析減小腫瘤體積/治療癌症之活體內CART19功能及效能。第7天開始，藉由經口管飼每天向小鼠投與DMSO(對照)或依魯替尼。在第 7天或第9天時投與CART19，或保持小鼠未經治療(對照)。在第4天、第11天、第18天、第25天及第32天時，例如藉由末梢血FACS分析量測在小鼠中循環之Nalm/6細胞數，以確定CART19在依魯替尼存在或不存在下清除Nalm/6細胞之效能。舉例而言，使用抗人類CD19抗體對細胞染色以確定帶有腫瘤之NSG小鼠之血液中人類CD19+(Nalm/6)細胞%。
如圖25A中所展示，未接受CART19注射之小鼠展現腫瘤Nalm/6細胞增加。然而，接受CART19注射與每天投與DMSO之組合之小鼠展示成功地清除(減少)Nalm/6細胞。接受CART19注射與每天投與依魯替尼之組合之小鼠亦展示成功地清除Nalm/6細胞，且具有與接受DMSO治療之小鼠相同之動力學及效能。因此，該等結果展示依魯替尼治療並不損害CART19在自此腫瘤模型清除Nalm/6細胞方面的功能。
在注射Nalm/6細胞後監測小鼠之健康狀態持續至少50天。圖25B之卡本-麥爾存活率曲線展示在注射Nalm/6細胞後，未經治療(未接受CART19 T細胞)及接受DMSO或依魯替尼之小鼠皆未存活超過30天。 然而，使用CART19 T細胞、DMSO或依魯替尼治療會增加小鼠之存活期。因此，綜合考慮該等結果與來自圖13A之腫瘤負荷結果展示依魯替尼治療並不損害CART19在自活體內NSG-Nalm/6腫瘤模型清除腫瘤細胞方面之功能。
CLL患者中依魯替尼/CART19組合治療之最佳時機
利用來自經歷依魯替尼治療達一年之CLL患者之樣品評價用於投與CART19之依魯替尼治療CLL期間之最佳時間。在不同依魯替尼治療週期下分離來自9個CLL患者(患者111330026、患者111330030、患者111330039、患者111330056、患者111330073、患者111330074、患者111330081、患者111330086及患者111330111)之PBMC樣品，且用 於製造CART19 T細胞。在依魯替尼治療前收集PBMC樣品以建立基線，且然後在第2週期第1天及第12週期第1天在依魯替尼治療期間收集。評價CART19製造之若干不同參數，例如轉導、增殖、細胞毒性及細胞介素產生。其他評估可包括離體免疫表型分型，例如評價記憶、抑制劑分子及耗竭。
圖26展示來自患者111330030之T細胞之CAR19轉導之流式細胞術分析的結果，此代表在CAR轉導後自其他8個患者獲得之結果。在所指示時間(基線，例如治療前；第2週期第1天；及第12週期第1天)下自患者收集PBMC且用含有CAR19之慢病毒載體利用例如實例4中所述之方法轉導。然後針對annexin、CD3、CD4及GAM對經轉導之PBMC染色(以檢測CAR)，且然後藉由FACS分析來分析。圖14圖中之帶框區域展示為GAM陽性且成功地轉導至CART19 T細胞之細胞之百分比。下部三個圖展示CAR19成功地轉導於在基線處約23%之細胞中、在第2週期第1天28%之細胞中及在第12週期第1天44%之細胞中。
隨後，在每一時間點(基線、第2週期第1天及第12週期第1天)下持續12天評價CART19細胞或未經轉導之細胞(對照)之增殖速率(或群倍增)。圖27展示三個患者患者111330039(編號39)、患者111330026(編號26)及患者111330030(編號30)之超過12天之群倍增之圖示。該等結果指示，關於增殖速率，或在第2週期第1天與第12週期第1天之間或在第2週期第1天及第12週期第1天時分離之PBMC較佳用於CAR轉導。
影響CART19功能之依魯替尼治療之可能機制
自CLL患者樣品評價可影響CART19功能之多種依魯替尼治療機制。
藉由FACS分析評價CD19表現(CD19+)細胞之分析。在基線處(依魯替尼治療前)、第2週期第1天及第12週期第1天分離來自經歷依魯替 尼治療之CLL患者之PBMC，且隨後針對CD19染色。FACS分析展示依魯替尼可減少CD19表現細胞(圖28A、圖28B及圖28C)。因此，該等結果指示，依魯替尼治療會誘導淋巴球增多症。
實施其他分析以檢查在依魯替尼治療期間腫瘤細胞上隨時間之CD200表現。免疫阻抑分子CD200在原代B細胞CLL腫瘤細胞上上調。CD200結合至其受體CD200R，其在單核球/巨噬細胞譜系之細胞及T淋巴球上表現。CD200與其受體之相互作用將抑制信號遞送至巨噬細胞譜系，從而使細胞介素圖譜自TH1變化至TH2且誘導調控T細胞。針對annexin、CD19及CD200對來自基線處(篩選)、第2週期第1天及第12週期第1天之患者111330030、111330026及111330039之樣品染色(以分選表現CD19之腫瘤細胞)，且藉由FACS來分析。將每一患者之檢測來自每一時間點之腫瘤細胞上之CD200表現之直方圖疊加(圖29A、29B及29C)。通常，在依魯替尼治療期間腫瘤細胞上之CD200表現隨時間減少。
亦評價在依魯替尼治療期間表現PD1之T細胞之頻率。在基線處、第2週期第1天及第12週期第1天獲得患者之樣品且用annexin、CD3、CD8及PD1染色。分析對annexin呈陰性且對CD3呈陽性細胞之CD8及PD1表現。表現CD8及PD1之細胞表示於圖30A、30B及30C中之框中。比較基線處(圖30A)、第2週期第1天(圖30B)及第12週期第1天(圖30C)之細胞之FACS圖譜指示依魯替尼治療會減小PD1表現細胞隨時間之頻率。
自上述實驗獲得之數據指示，向接受依魯替尼之CLL患者投與CART19療法之最佳時間介於第2週期與第12週期之間或在第12週期。
實例10：用於霍奇金氏淋巴瘤之CAR19 T細胞療法
CAR19 T細胞療法亦可用於治療霍奇金氏淋巴瘤(HL)。霍奇金氏淋巴瘤之特徵在於存在源自純系生髮中心B細胞之惡性霍奇金氏裡-斯 (Reed-Sternberg)(HRS)細胞。有若干因素指示CAR19 T細胞療法對HL之治療效能。HL腫瘤之CD19染色展示腫瘤及腫瘤微環境內之CD19表現(CD19+)細胞(圖33)。研究已展示，表現CD19之純系B細胞群(CD20+CD27+ALDH+)負責產生並維持霍奇金氏淋巴瘤細胞系，且亦在大多數HL患者之血液中循環(Jones等人，Blood,2009,113(23)：5920-5926)。亦已表明此純系B細胞群可導致或促進產生惡性HRS細胞。因此，CART19療法會清除此促進腫瘤形成或腫瘤細胞之維持之B細胞群。另一研究展示，在多種鼠類模型中，B細胞清除減緩實體腫瘤生長(Kim等人，J Immunotherapy,2008,31(5)：446-57)。在HL腫瘤微環境中清除B細胞引起某一抗腫瘤效應之觀念的支持下，正在臨床上測試當前療法(例如瑞圖宣)對HL中之腫瘤B細胞之靶向及清除(Younes等人，Blood,2012,119(18)：4123-8)。亦已展示，與慢性發炎相關之重新誘癌可具有B細胞依賴性(de Visser等人，Cancer Cell,2005,7(5)：411-23)。該等研究之結果指示，尤其在HL腫瘤微環境中靶向B細胞群將可用於藉由降低或抑制疾病進展或腫瘤生長來治療HL。
另外，正常CD19表現B細胞亦浸潤HL中之腫瘤微環境。在CLL及ALL中使用CART19療法之先前研究(例如，闡述於實例4及5中)展示，CART19於CD19+靶中之暴露引起細胞介素產生及巨噬細胞產生。因此，將HL腫瘤微環境自促腫瘤微環境調節至抗腫瘤微環境可藉由輸注CART19以與存於HL中之正常CD19+ B細胞相互作用來達成。舉例而言，CART19暴露於CD19表現靶中引起細胞介素產生(例如，發炎性細胞介素)，該等細胞介素經由使細胞毒性T細胞擴增、活化巨噬細胞及招募具有各種抑制腫瘤生長之功能之其他免疫效應細胞(例如白血球、巨噬細胞及抗原呈遞細胞)來促進抗腫瘤活性。由於靶CD19+ B細胞可並非惡性(例如，正常循環B細胞)，瞬時而非延長CART19效應對於調節腫瘤微環境可較佳。
檢查CART19療法在HL患者中之治療效能之研究可如下文所述來實施(圖34)。該研究亦將評價CART19在HL個體中之安全性及耐受性，並測定CART19細胞對HL腫瘤微環境之效應。
在此研究中治療8名患有經典HL之患者。患者處於所有年齡，但可建立用於小兒及成年患者之單獨藥物遞送方案。此研究中之患者無可用潛在治癒性治療選擇(例如自體(ASCT)或同種異體幹細胞移植)，或不適於該等治癒性治療選擇。舉例而言，患者可為以下中之任一種情形：在救援性化學療法後之PET+，在用布妥昔單抗治療後之PET+，或在先前經或未經布妥昔單抗暴露之ASCT後之PET+。使用當前可用療法，患者將具有有限預後(預期存活為數月至小於或等於2年)。且最後，患者將不會接受抗-CD20抗體療法。例如，若6次輸注CART19後患者之T細胞數不足，則由於缺少可行性而排除患者。
藉由活體外轉錄來產生mRNA CAR19。將CAR19 mRNA電穿孔至供體T細胞中，並藉由與CD3/CD28珠粒一起培育來擴增並刺激所得細胞。經兩週一週三次(例如，在第0天、第2天、第4天、第7天、第9天及第11天)將含有1×108-5×108 RNA-電穿孔CAR19 T細胞之劑量遞送至患者。將在治療後1個月時藉由臨床、CT及PET掃描評價總體反應率。將在最初6個月中每個月監測反應及存活，然後每3個月監測直至第一次CART19輸注(第0天)後2年。監測技術包括在CART19治療之前及之後的腫瘤或淋巴結之生檢(例如，用於免疫組織化學分析及/或用於基因表現剖析之RNA)及PET掃描。舉例而言，藉由在治療前及在治療後約一週(或在治療後之適當時間以容許細胞表型改變)比較對來自所選擇患者可及淋巴結生檢實施之基因表現剖析之結果來分析CART19細胞對HL腫瘤微環境之效應。為評價CART19治療之安全性及耐受性，報告不良事件之頻率及嚴重程度，包括細胞介素釋放症候群(CRS)及巨噬細胞活化症候群(MAS)之頻率。
化學療法可與CART19治療同時投與。可在CART19之第一劑量之前投與淋巴清除化學療法，例如，癌得星。
實例11：CLL患者之非反應者亞組展現增加之免疫檢查點抑制劑分子之表現
在此研究中，評價自34名CLL患者臨床製造之CART19細胞之免疫檢查點抑制劑分子(例如PD-1、LAG3及TIM3)之表現。已知此隊列對CART19之反應且因此可評價反應及生物標記物表現模式之間之關聯。
藉由流式細胞術分析自對CART療法具有不同反應之CLL患者製造之CART19細胞，以測定CAR及免疫檢查點抑制劑分子PD-1、LAG3及TIM3之表現。CART19細胞來自：健康供體(HD)(n=2)；對CART療法反應之CLL患者(CR)(n=5)；對CART療法部分反應之CLL患者(PR)(n=8)；對CART療法無反應之CLL患者(NR)(n=21)。根據業內已知之流式細胞術分析之標準方法，用特異性識別CD3、CD4、CD8、CD27、CD45RO、CAR19分子及免疫檢查點分子PD-1、LAG3及TIM3之螢光標記抗體對細胞進行染色。藉由流式細胞術分析軟體測定每一標記物(例如，CD4+、CD8+等)之表現，且進一步分析亞群(例如，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或CAR19表現T細胞)之免疫檢查點分子PD-1、LAG3及TIM3之表現。
用於測定表面標記物表現之流式細胞術圖譜分析之實例展示於圖35A及35B中。利用流式細胞術測定表現CD4之T細胞，並進一步分析CAR19及PD-1表現，使得圖譜之x軸指示CAR19表現(頂部左側(Q5)及底部左側(Q8)象限展示CAR19陰性CD4+細胞，而頂部右側(Q6)及底部右側(Q7)象限展示CAR19表現CD4+細胞)，且y軸展示PD-1表現(底部左側(Q8)及右側(Q7)象限展示PD-1陰性CD4+細胞，且頂部左側(Q5)及右側(Q6)象限展示PD-1表現CD4+細胞)。在來自CART反應者 之CD4+群中，總計44.7%之CD4+細胞表現PD-1，且約22.3%之CAR19表現細胞係PD-1陽性，同時27.2%之CAR19表現細胞係PD-1陰性(圖35A)。相比之下，在來自非反應者之CD4+群中，總CAR19表現細胞顯著減少(約15.3%，與之相比，CR中為49.5%)，且14.7%之CAR19表現細胞係PD-1陽性，同時僅0.64%係PD-1陰性(圖35B)。圖35A及圖35B中之圖譜之間之比較展示，與CART反應者(約44.7%)相比，顯著較高百分比之來自非反應者之CD4+細胞表現PD-1(約92.9%)。
利用上述方法及分析，測定每一反應組中每一患者之CD4+群及CD8+群中PD-1表現(PD-1+)細胞的百分比。展示與彼等對CAR療法反應者(CR)相比，非反應者在CD4+(圖35C)及CD8+(圖35D)群二者中具有較大PD-1+細胞百分比；對於CD4+及CD8+群二者，平均PD-1百分比之增加在統計學上顯著。在CD4+(圖35C)及CD8+(圖35D)群二者中，部分反應者(PR)展現之PD-1+細胞百分比高於反應者(CR)。
之後，測定每一反應組中每一患者之CAR19表現CD4+群及CAR19表現CD8+群中PD-1表現(PD-1+)細胞的百分比。實施與上文類似之分析，且實施以下額外步驟：分析CD4+及CD8+細胞之CAR19表現，且在鑑別CAR19表現細胞後測定CAR19表現細胞群中具有PD-1表現之細胞的百分比。對於CAR19表現CD4+及CD8+群，觀察到與在CD4+及CD8+總群中所觀察到者類似之傾向：展示與彼等對CAR療法反應者(CR)相比，非反應者在CD4+(圖36A)及CD8+(圖36B)群二者中具有較大百分比之PD-1+細胞；對於CD4+及CD8+群二者，平均PD-1百分比之增加在統計學上顯著。在CD4+(圖36A)及CD8+(圖36B)群二者中，部分反應者(PR)展現之PD-1+細胞百分比高於反應者(CR)。
實施進一步分析以測定來自對CAR療法具有不同反應之患者的表現PD-1、LAG3及TIM3之細胞之分佈。CD4+群中針對PD-1、LAG3及TIM3表現之代表性細胞譜分析展示於圖37中。首先分析該細胞群之 CD4+及CD8+表現。然後分析CD4+群(或CD8+群，未展示)之PD-1及CAR19表現(圖37，左側圖譜)。如先前所述，非反應者(NR)之總PD-1+細胞之百分比與CART反應者(CR)相比顯著增加(NR為約92.9% PD-1陽性，與之相比，CR為44.7% PD-1陽性)。此外，在非反應者中，CAR19表現細胞大多為PD-1陽性(14.7% PD-1陽性及CAR+，與之相比，0.64% PD-1陰性及CAR+)。然後分析該群之PD-1及LAG3共表現(圖37，中間圖譜)。表現PD-1及LAG3二者之細胞展示於頂部右側象限(Q2)中。非反應者之表現免疫檢查點抑制劑PD-1及LAG3二者之細胞的百分比與CART反應者相比顯著增加(67.3%與7.31%相比)。亦分析PD-1表現及TIM3表現。在圖37之右側圖譜中，方框指示表現PD-1及TIM3二者之細胞。與使用PD-1及LAG3獲得之結果類似，非反應者之表現免疫檢查點抑制劑PD-1及TIM3二者之細胞的百分比與CART反應者相比顯著較高(83.3%與28.5%相比)。如上文所述利用流式細胞術分析測定每一反應組中每一患者之PD-1表現細胞(PD1+)、PD-1及LAG3表現細胞(PD1+LAG3+)及PD-1及TIM3表現細胞(PD1+TIM3+)的百分比。展示非反應者具有與CART反應者相比增加之PD1+ LAG3+細胞(圖38A)及PD1+TIM3+細胞(圖38B)的百分比，該增加之百分比對於兩個細胞群在統計學上顯著。部分反應者亦展示與CART反應者相比增加之兩個細胞群之百分比，且平均值與非反應者相比有所減小。
該等結果指示，對CAR療法無反應之患者展現與對CAR療法反應或部分反應之患者相比增加之免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1、LAG3及TIM3)之表現。因此，該等結果展示，抑制或降低免疫檢查點抑制劑(例如，PD-1、LAG3或TIM3)之表現之試劑可用於投與接受CAR療法之患者以經由免疫檢查點路徑(例如，由PD-1、LAG3或TIM3介導)預防免疫阻抑，由此增加CAR表現細胞之效能。
實例12：mTOR抑制對老年人之免疫衰老之效應
最明確地與衰老相關之路徑之一係mTOR路徑。已展示mTOR抑制劑雷帕黴素可延長小鼠壽命並改良老年小鼠之多種衰老相關病況(Harrison,DE等人(2009)Nature 460：392-395；Wilkinson JE等人(2012)Aging Cell 11：675-682；及Flynn,JM等人(2013)Aging Cell 12：851-862)。因此，該等發現指示，mTOR抑制劑可對人類之衰老及衰老相關病況具有有益效應。
可在短臨床試驗時間範圍中研究之年齡相關表型係免疫衰老。 免疫衰老係在老年中發生之免疫功能下降，其導致對感染之敏感性增加及對疫苗接種(包括流行性感冒疫苗接種)之反應下降。免疫功能隨年齡下降係由於免疫缺陷之累積所致，包括造血幹細胞(HSC)產生純真淋巴球之能力下降，及對抗原刺激具有缺陷性反應之耗竭PD-1陽性淋巴球之數目增加(Boraschi,D等人(2013)Sci.Transl.Med.5：185ps8；Lages,CS等人(2010)Aging Cell 9：785-798；及Shimatani,K等人，(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106：15807-15812)。老年小鼠中之研究展示，使用mTOR抑制劑雷帕黴素之6週治療恢復HSC功能，導致增加純真淋巴球之產生，改良對流行性感冒疫苗接種之反應，並延長壽命(Chen,C等人(2009)Sci.Signal.2：ra75)。
為評價mTOR抑制對人類衰老相關表型之效應及mTOR抑制劑RAD001是否改善免疫衰老，評估接受RAD001或安慰劑之老年志願者對流行性感冒疫苗之反應。此處呈現之發現表明，在良好耐受之劑量下，RAD001增強老年志願者對流行性感冒疫苗之反應。RAD001亦減小隨年齡累積之程式化死亡配體(PD)-1陽性CD4及CD8 T淋巴球之百分比。該等結果展示，mTOR抑制對老年志願者之免疫衰老具有有益效應。
如本文所述，使用mTOR抑制劑RAD001(雷帕黴素類似物)之6週治療改良老年人類志願者對流行性感冒疫苗接種之反應。
方法 研究群
在新西蘭及澳大利亞之9個地點招收無不穩定潛在醫學疾病之年齡>=65歲之老年志願者。在篩選時之排除準則包括血紅素<9.0g/dL、白血球計數<3,500/mm3、嗜中性球計數<2,000/mm3或血小板計數<125,000/mm3、不受控糖尿病、不穩定缺血性心臟病、臨床上顯著之潛在肺部疾病、免疫缺失或接受免疫阻抑療法史、凝血病變或需要長期抗凝之醫學病況史、估計腎小球濾過率<30ml/min、嚴重不受控高膽固醇血症之存在(>350mg/dL,9.1mmol/L)或高膽固醇血症(>500mg/dL,5.6mmol/L)。
治療組之間之基線人口統計類似(表14)。所招收之218名個體中，211名完成研究。7名個體退出研究。5名個體因不良事件(AE)退出，1名個體撤回同意，且1名個體因違反方案而離開研究。
Figure 104111176-A0305-02-0327-1
研究設計及實施
自2011年12月至2012年4月，在隨機化、觀察者盲化、安慰劑對照試驗中招收218名老年志願者。利用經驗證自動化隨機化系統將個 體隨機化至治療組中，每一治療臂中RAD001對安慰劑之比率為5：2。治療組為：每天0.5mg RAD001或安慰劑
每週5mg RAD001或安慰劑
每週20mg RAD001或安慰劑
由於每天0.5mg RAD001及每週20mg隊列中之安慰劑與彼等隊列中之RAD001錠劑差異微小，故該試驗係觀察者盲化。評估個體之研究人員未見到研究藥劑，且因此完全盲化。所有隊列之治療持續時間皆為6週，在此期間，個體每2週經歷臨床安全性評估。在向個體投藥4週後，量測投藥前及投藥後1小時之RAD001穩態值。在完成研究藥物之6週過程後，給予個體2週無藥物中斷期以逆轉任何可能的RAD001誘導之免疫阻抑，然後給予含有株系H1N1 A/California/07/2009、H3N2 A/Victoria/210/2009、B/Brisbane/60/2008之2012季節性流行性感冒疫苗接種(Agrippal®,Novartis Vaccines and Diagnostics,Siena,Italy)。在流行性感冒疫苗接種後4週，收集個體血清以供流行性感冒效價量測。藉由標準血球凝集抑制分析量測抗體對3種流行性感冒疫苗株以及對2種異源株系(A/H1N1株A/New Jersy/8/76及A/H3N2株A/Victoria/361/11)之效價(Kendal,AP等人(1982)Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance.Atlanta：Centers for Disease Control and Prevention B17-B35)。如先前所述在流行性感冒疫苗接種之前及之後4週所取之血清樣品中量測對A/H1N1/California/07/2009具有特異性之IgG及IgM含量(Spensieri,F.等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110：14330-14335)。結果表述為螢光強度。
所有個體皆提供書面知情同意書。該研究係根據優良臨床試驗規範(Good Clinical Practice)實施且由適當倫理委員會及管理機構批 准。
安全性
在研究訪視期間實施不良事件評價及血液收集用於血液及生物化學安全性評價。亦在個體服用研究藥物之6週期間在個體在家填寫之日誌中收集不良事件資訊。自知情同意時起直至最後一次研究訪視後30天，收集關於所有不良事件之數據。研究者將事件歸類為輕度、中度或嚴重。
統計學分析
利用具有非資訊先驗之正態Bayesian回歸模型實施對幾何平均效價比率之初步分析。將此模型擬合至對數標度上之每一抗體效價。每一模型中之主要結果係第84天量測。結果向量中包括第63天量測。利用SAS 9.2程序擬合之模型與事先聲明混合。矩陣之協方差結構視為未結構化(選擇類型=UN)。使用平直(flat)先驗。對於血清轉化率之第二分析，使用邏輯式回歸。
治療意向群定義為接受至少一個完全劑量之研究藥物且不顯著偏離方案而影響效能數據之所有個體。研究中總計218名所招收個體中之199名個體在治療意向群中。
免疫表型分型
自於3個時間點收集之全血分離末梢血單核細胞：基線；在研究藥物治療6週後；及在研究結束時(個體已停用研究藥物6週且在流行性感冒疫苗接種後4週時)。在人類免疫監測中心史丹福大學(Stanford University)(CA,USA)，如先前所述藉由流式細胞術利用8色免疫表型分型面板分析76個PBMC亞組(Maecker,HT等人(2012)Nat Rev Immunol.12：191-200)。藉由流式細胞術利用8色凍乾免疫表型分型面板(BD Lyoplate,BD Biosciences,San Diego,CA)分析76個PBMC亞組。分析中包括活力>80%且產率為2×106個細胞或更大之PBMC樣 品。
計算每一RAD001投藥隊列之免疫表型自基線至研究藥物治療第6週及自基線至研究結束時(第12週)之相對變化。實施司徒登氏T測試以檢查在針對安慰劑效應加以調節後，在每一投藥組內，免疫表型自基線至兩個血液取樣時間點之相對變化是否分別顯著不等於零。在治療效應分析中未實施遺漏數據插補。因此，若患者在基線時具有遺漏表型數據，則在此表型之分析中不包括此患者。若患者在6或12週具有遺漏表型數據，則此患者對於此表型在受影響時間點之分析無貢獻。
對3個投藥組之76個表型實施608次測試，以比較治療效應對安慰劑效應。實踐分層錯誤發現率(FDR)控制方法以控制與多重測試相關之偽陽性之發生率，仍提供顯著較佳檢定力。以細胞類型組作為分層因子並分別在每一層內實施FDR(q值)計算。在0.05顯著水準及相應q值
Figure 104111176-A0202-12-0328-111
0.1下，淘汰所有虛無假設。在0.05顯著水準及相應q<0.1下淘汰之多重測試調節策略確保小於10%之發現係錯誤。
在第二分析中，免疫表型在彙集治療組與安慰劑組之間變化，其中合併所有三個RAD001投藥組。為確定何種免疫表型變化在治療組與安慰劑組之間不同，在基線與研究藥物治療第6週之間及在基線與研究結束時(第12週)之間計算所量測每一表型之患者本身(within-patient)之細胞計數比率。該等比率經對數轉化，且在每一時間點藉由協方差分析來分析，以檢測彙集治療組與安慰劑組之間之差異。在76個表型中實施152次測試，以比較彙集治療效應對安慰劑效應。實踐分層錯誤發現率(FDR)控制方法以控制與多重測試相關之偽陽性之發生率，仍提供顯著較佳之檢定力(Benjamini,Y.等人(1995)J.Roy.Statist.57：289-300；及Sun,L.等人(2006)Genet.Epidemiol.30：519-530)。以細胞類型組作為分層因子且分別在每一層內實施FDR(q值) 計算。在0.05顯著水準及小於20%之q值之下淘汰所有虛無假設。此可解釋為僅淘汰彼等P值小於0.05且所觀察到之每一顯著結果係由於多重測試所致之機率小於20%之假設。
結果
一般而言，RAD001具有良好耐受，尤其係每天0.5mg及每週5mg投藥方案。在研究期間未發生死亡。3名個體經歷4次評價為與RAD001無關之嚴重不良事件(SAE)。該4次SAE係具有正常血小板計數之個體之左眼視網膜出血且之後失明，該個體先前已完成6週中每週5mg RAD001之6週過程；經安慰劑治療之個體之嚴重背痛，及經安慰劑治療之個體之嚴重胃腸炎。任一治療組中發病率>2%之治療相關不良事件(AE)之列表提供於表8中。最常見RAD001相關AE係口腔潰瘍，其在大多數情形中具有輕度嚴重程度。總之，接受RAD001之個體具有與彼等經安慰劑治療者類似之嚴重AE發病率。在經每週20mg RAD001治療之個體中，僅一次嚴重AE評價為與RAD001口腔潰瘍相關。
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Figure 104111176-A0202-12-0330-433
藉由量測對2012季節性流行性感冒疫苗之血清學反應來評估RAD001改良老年志願者之免疫功能之能力。在基線時及流行性感冒疫苗接種後4週時對3種流行性感冒疫苗株中之每一者之血球凝集抑制(HI)幾何平均效價(GMT)提供於表9中。初步分析變量為HI GMT比率(疫苗接種後4週/基線)。將研究加權以能夠展示，在3種流行性感冒疫苗株之至少2者中存在：1)相對於安慰劑
Figure 104111176-A0202-12-0330-112
1.2倍之GMT增加；及2)經安慰劑校正之GMT比率超過1之事後機率不低於80%。選擇此終點係因為，藉由MF-59疫苗佐劑誘導之流行性感冒GMT比率之1.2倍增加與流行性感冒疾病減少相關(Iob,A等人(2005)Epidemiol Infect 133：687-693)。
表9. 每一流行性感冒疫苗株在基線時及在流行性感冒疫苗接種後4週時之HI GMT
Figure 104111176-A0202-12-0331-434
基線指示流行性感冒疫苗接種前2週
第4週指示流行性感冒疫苗接種後4週
N係每個隊列之個體數
GMT係幾何平均效價
GMT比率係在疫苗接種後第4週之GMT/在基線時之GMT
CV%指示變化係數
在治療意向(ITT)群中，低免疫增強劑量RAD001(每天0.5mg或 每週5mg)隊列而非較高劑量(每週20mg)隊列滿足研究之主要終點(圖40A)。此展示，RAD001在較低劑量下有獨特免疫調節機制，且在較高劑量下，mTOR抑制之已知免疫阻抑效應可發揮作用。此外，結果表明在低免疫增強劑量RAD001治療後偏向改良老年人免疫功能之傾向。
在亞組分析中，具有低基線流行性感冒效價(
Figure 104111176-A0202-12-0332-113
1：40)之個體亞組所經歷之效價的RAD001相關增加大於ITT群(圖40B)。該等數據展示，RAD001尤其有效於增強在基線時不具有保護性(>1：40)效價，且因此具有最高流行性感冒疾病風險之個體之流行性感冒疫苗反應。
RAD001濃度對針對每一流行性感冒疫苗株之效價增加之散佈圖展示反相關暴露/反應關係(圖41)。基於mTOR介導之S6激酶(S6K)磷酸化之建模及模擬預測，在投藥間隔期間，每週20mg投藥方案幾乎完全抑制mTOR介導之S6K活性，每週5mg投藥方案將S6K活性抑制超過50%，且每天0.5mg投藥方案將S6K磷酸化抑制約38%(Tanaka,C等人(2008)J.Clin.Oncol 26：1596-1602)。因此，用低免疫增強劑量RAD001部分抑制mTOR(例如，mTOR介導之S6K磷酸化)可與用高劑量RAD001幾乎完全抑制mTOR同樣有效(若並非更有效)於增強老年人之免疫反應。
亦在流行性感冒疫苗接種後4週評估血清轉化率。血清轉化定義為變化自陰性疫苗接種前效價(即，HI效價<1：10)至疫苗接種後HI效價(
Figure 104111176-A0202-12-0332-114
1：40)之變化，或自非陰性(
Figure 104111176-A0202-12-0332-115
1：10)疫苗接種前HI效價增加至少4倍。在意向治療群中，RAD001隊列中之H3N2及B株之血清轉化率與安慰劑隊列相比有所增加，但該增加不滿足統計顯著性(表10)。在基線流行性感冒效價<=1：40之個體亞群中，RAD001治療亦增加血清轉化至H3N2及B株之比率，且在每天0.5mg投藥隊列中，對於B株，該等結果達到統計顯著性。該等數據進一步展示，RAD001增強老年人 對流行性感冒疫苗接種之血清學反應。
Figure 104111176-A0202-12-0333-435
* RAD001與安慰劑之間之血清轉化的勝算比顯著不等於1(藉由邏輯式回歸以治療作為固定效應獲得之雙側p值<0.05)
當前季節性流行性感冒疫苗針對不斷新出現之作為先前循環病毒之變體存在之流行性感冒株系提供之保護通常不足。然而，與安慰劑相比，在mTOR抑制劑雷帕黴素存在下接種針對流行性感冒之疫苗之小鼠產生較寬之針對流行性感冒之血清學反應。較寬血清學反應包括針對多種流行性感冒亞型表現之保守表位之抗體，其提供針對疫苗中未包含之異源流行性感冒株系之感染之保護(Keating,R等人(2013)Nat Immunology 14：2166-2178)。為確定RAD001是否加寬老年志願者針對流行性感冒之血清學反應，量測針對流行性感冒疫苗中未包含之2種異源流行性感冒株系(A/H1N1株A/New Jersey/8/76及A/H3N2株A/Victoria/361/11)之HI效價。與安慰劑隊列相比，在RAD001隊列中針對異源株系之HI GMT比率之增加較高(圖42)。另外，與安慰劑隊列相比，在RAD001隊列中針對異源株系之血清轉化率較高。在每週5 mg及20mg RAD001投藥隊列中，針對H3N2異源株系之血清轉化率之增加在統計學上顯著(表11)。彙集RAD001隊列之H3N2血清轉化率為39%，與之相比，安慰劑隊列為20%(p=0.007)。本文中呈現之結果表明，mTOR抑制加寬老年志願者對流行性感冒疫苗接種之血清學反應，並增加針對季節性流行性感冒疫苗中未包含之異源流行性感冒株系之抗體效價。
在經雷帕黴素治療之小鼠中，加寬之針對異源流行性感冒株系之血清學反應與抑制B細胞中之類別轉換及增加抗流行性感冒IgM含量相關(Keating,R.等人(2013)Nat Immunol 14：2166-2178)。然而，抑制類別轉換可不參與經RAD001治療之人類中加寬之血清學反應，此乃因疫苗接種後抗流行性感冒IgM及IgG含量在RAD001治療隊列與安慰劑治療隊列之間無差異(圖43)。
Figure 104111176-A0202-12-0334-102
* RAD001與安慰劑之間之血清轉化之勝算比顯著不等於1(藉由邏輯式回歸以治療作為固定效應獲得之雙側p值<0.05)
為闡明RAD001增強老年志願者之免疫功能之機制，對在基線時、在研究藥物治療6週後及在流行性感冒疫苗接種後4週時(研究藥物中斷後6週時)自個體獲得之PBMC樣品實施免疫表型分型。儘管大多數PBMC亞組之百分比在RAD001隊列與安慰劑隊列之間並無不 同，但與安慰劑隊列相比，PD-1陽性CD4及CD8細胞之百分比在RAD001隊列中較低(圖44)。PD-1陽性CD4及CD8細胞隨年齡累積且對抗原刺激具有缺陷性反應，此乃因PD-1抑制T細胞受體誘導之T細胞增殖、細胞介素產生及細胞溶解功能(Lages,CS等人(2010)Aging Cell 9：785-798)。在安慰劑隊列中，PD-1陽性T細胞之百分比隨時間而增加。在第12週時(疫苗接種後4週時)，此增加可係由於流行性感冒疫苗接種所致，此乃因已展示流行性感冒病毒可增加PD-1陽性T細胞(Erikson,JJ等人(2012)JCI 122：2967-2982)。然而，在所有RAD001隊列中CD4 PD-1陽性T細胞之百分比在第6週及第12週時自基線減小(圖44A)。在兩個較低劑量RAD001隊列中，CD8 PD-1陽性細胞之百分比亦在第6週及第12週皆自基線減小(圖44B)。評估PD-1陰性CD4 T細胞之百分比，且與安慰劑隊列相比，在RAD001隊列中有所增加(圖44C)。
在更嚴格之統計學分析下，其中彙集來自RAD001隊列之結果並針對基線PD-1表現之差異加以調節，與安慰劑隊列(n=25)相比，在彙集RAD隊列(n=84)中，在第6週時PD-1陽性CD4 T細胞在統計學上顯著地減少30.2%，且p=0.03(q=0.13)(圖45A)。與安慰劑隊列相比，在彙集RAD隊列中在第12週時PD-1陽性CD4 T細胞減少32.7%，且p=0.05(q=0.19)。圖45B展示，與安慰劑隊列(n=25)相比，在所彙集RAD001隊列(n=84)中，在第6週時PD-1陽性CD8 T細胞在統計學上顯著地減少37.4%，且p=0.008(q=0.07)。與安慰劑隊列相比，在彙集RAD001隊列中在第12週時PD-1陽性CD8 T細胞減少41.4%，且p=0.066(q=0.21)。因此，圖44及45之結果一起表明，PD-1陽性CD4及CD8 T細胞之百分比的RAD001相關降低可有助於增強免疫功能。
結論
總之，本文呈現之數據展示，mTOR抑制劑RAD001改善人類老 年之免疫功能之年齡相關下降，如藉由針對流行性感冒疫苗接種之反應所評價，且所獲得之此改善具有可接受之風險/益處平衡。在老年小鼠之研究中，用mTOR抑制劑雷帕黴素治療6週不僅增強針對流行性感冒疫苗接種之反應，且亦延長壽命，表明免疫衰老的改善可係對衰老相關表型之更寬效應之標記物。
由於RAD001投藥在疫苗接種前2週中斷，故RAD001之免疫增強效應可藉由在中斷藥物治療後持續之相關細胞群中之變化來介導。本文中呈現之結果展示，與安慰劑相比，RAD001減小耗竭PD-1陽性CD4及CD8 T細胞之百分比。PD-1表現係由TCR信號傳導來誘導且在持久抗原刺激(包括慢性病毒感染)環境中保持較高。儘管不希望受限於理論，但RAD001可能降低老年志願者之慢性免疫活化且由此導致減少PD-1表現。RAD001亦可直接抑制PD-1表現，如針對免疫親和素環孢素A所報導(Oestreich,KJ等人(2008)J Immunol.181：4832-4839)。RAD001誘導之PD-1陽性T細胞之百分比減小有可能改良T細胞反應之品質。此與先前研究一致，該等先前研究展示，在小鼠及靈長類動物中，mTOR抑制改良針對疫苗接種之記憶CD8 T細胞反應之品質(Araki,K等人(2009)Nature 460：108-112)。在老年小鼠中，亦展示mTOR抑制可增加造血幹細胞數，從而增加純真淋巴球之產生(Chen,C等人(2009)Sci Signal 2：ra75)。儘管在此實例中未檢測到純真淋巴球百分比在RAD001隊列與安慰劑隊列之間之顯著差異，但可進一步研究此可能機制。
可進一步研究RAD001加寬針對異源流行性感冒株系之血清學反應之機制。亦已展示雷帕黴素可在流行性感冒疫苗接種後抑制B細胞中之類別轉換。因此，產生抗流行性感冒抗體之獨特譜，其促進針對流行性感冒疫苗中未包含之流行性感冒病毒亞型之致死感染之株系交叉保護(Keating,R等人(2013)Nat Immunol.14：2166-2178)。本文所 述之結果展示，RAD001不改變在流行性感冒疫苗接種前2週時中斷RAD001之老年個體之B細胞類別轉換。儘管潛在機制需要進一步闡明，但在季節性疫苗與社區中之循環流行性感冒株系之間之匹配較差之年份，增加之針對本文所述之異源流行性感冒病毒株之血清學反應可賦予增強之針對流行性感冒疾病之保護。
RAD001對流行性感冒抗體效價之效應與經批准用於增強老年人對流行性感冒疫苗接種之反應之MF59疫苗佐劑之效應相當(Podda,A(2001)Vaccine 19：2673-2680)。因此，RAD001驅動之針對流行性感冒疫苗接種之抗體反應之增強可轉換為臨床益處，如使用MF59輔助之流行性感冒疫苗在老年人中所展示(Iob,A等人(2005)Epidemiol Infect.133：687-693)。然而，RAD001亦用於阻抑器官移植患者之免疫反應。 該等看似矛盾之發現增加了mTOR抑制劑之免疫調節效應可能具有劑量依賴性及/或抗原依賴性之可能性(Ferrer,IR等人(2010)J Immunol.185：2004-2008)。在本文中觀察到偏向反相關RAD001暴露/疫苗接種反應關係之傾向。完全mTOR抑制可能經由正常親環素-雷帕黴素機制阻抑免疫功能，而至少在老年人中，部分mTOR抑制由於獨特衰老相關表型抑制而增強免疫功能。令人關注的是，mTOR活性在多種組織中增加，包括衰老動物模型中之造血幹細胞(Chen C.等人(2009)Sci Signal 2：ra75及Barns,M.等人(2014)Int J Biochem Cell Biol.53：174-185)。因此，與更完全地阻抑mTOR活性相反，將mTOR活性降低至在幼嫩組織中所見之程度可在衰老適應症中具有臨床益處。
mTOR抑制劑(例如RAD001)在衰老相關適應症之治療中之安全性概況令人關注。RAD001在用於腫瘤或器官移植適應症中之劑量下之毒性包括對於許多衰老相關適應症不可接受之口炎、腹瀉、惡心、血球減少症、高脂血症及高血糖症之比率。然而，該等AE與RAD001在血液中之穀值相關。因此，用於此研究中之RAD001投藥方案經選擇 以使穀值降至最低。每天0.5mg、每週5mg及每週20mg投藥隊列之平均RAD001穀值分別為0.9ng/ml、低於0.3ng/ml(量化下限)及0.7ng/ml。該等穀值顯著低於與用於器官移植及癌症患者中之投藥方案相關之穀值。另外，有限6週療程降低不良事件之風險。該等發現表明，用於此研究中之投藥方案可對於老年人之一些病況具有可接受之風險/益處。然而，本文所述實驗中之大量個體即使在低至每天0.5mg之投藥時亦發生口腔潰瘍。因此，低免疫增強劑量RAD001之安全性概況需要進一步研究。研發安全性概況優於當前可用雷帕黴素類似物之mTOR抑制劑可在未來提供用於衰老相關病況之更佳治療選擇。
實例13：老年個體中針對疫苗之免疫反應之增強
老年人之免疫功能下降導致感染發病率增加及針對疫苗接種之反應降低。作為確定mTOR抑制在人類中是否具有抗衰老效應之第一步驟，實施隨機化安慰劑對照試驗以確定mTOR抑制劑RAD001是否逆轉衰老相關之免疫功能下降，如藉由老年志願者針對疫苗接種之反應所評價。在所有情形中，獲得適當專利許可且該研究由國家衛生局批准。
在研究中使用以下3種RAD001投藥方案：每週20mg(穀值：0.7ng/ml)
每週5mg(穀值低於檢測限值)
每天0.5mg(穀值：0.9ng/ml)
選擇該等投藥方案係因為其穀值低於經批准用於移植及腫瘤適應症之RAD001劑量。穀值係藥物在體內之最低含量。與每天10mg腫瘤投藥方案相關之RAD001穀值係約20ng/ml。與0.75-1.5mg bid移植投藥方案相關之穀值係約3ng/ml。相比之下，與用於本發明免疫研究中之投藥方案相關之穀值低3-20倍。
由於RAD001相關AE與穀值相關，預測3種投藥方案對於正常志 願者具有足夠安全性。另外，預測3種劑量可產生一定範圍之mTOR抑制。P70 S6激酶(P70 S6K)係由mTOR磷酸化之下游靶。P70 S6K磷酸化程度用作mTOR活性之量度。基於在RAD001之臨床前及臨床研究中獲得之P70 S6K磷酸化數據之建模及模擬，預測每週20mg可幾乎完全抑制mTOR活性一整週，而預測每週5mg及每天0.5mg可部分抑制mTOR活性。
將年齡>=65歲之老年志願者隨機化至3個RAD001治療組(每組50名個體)或安慰劑組(每組20名個體)中之一組中。用研究藥物將個體治療6週，給予2週之中斷，且然後接受流行性感冒(Aggrippal,Novartis)及肺炎球菌(Pneumovax 23,Merck)疫苗接種。藉由以下方式評價針對流行性感冒疫苗接種之反應：在疫苗接種後4週藉由血球凝集抑制分析量測流行性感冒疫苗中針對3種流行性感冒病毒株(H1N1、H3N2及B流行性感冒亞型)之幾何平均效價(GMT)。研究之主要終點係(1)安全性及耐受性及(2)與安慰劑相比，在疫苗接種後4週，在2/3之流行性感冒疫苗株中流行性感冒效價增加1.2倍。選擇此終點係因為流行性感冒效價之1.2倍增加與疫苗接種後流行性感冒疾病降低相關，且因此在臨床上相關。每週5mg及每天0.5mg劑量具有良好耐受，且與每週20mg劑量不同，滿足GMT主要終點(圖40A)。與安慰劑相比，RAD001不僅改良老年志願者針對流行性感冒疫苗接種之反應，其亦改良針對肺炎球菌疫苗接種之反應。肺炎球菌疫苗含有來自23種肺炎球菌血清型之抗原。在本發明個體中量測針對7種血清型之抗體效價。在所有3個RAD隊列中，與安慰劑相比，針對6/7之血清型之抗體效價有所增加。
組合流行性感冒及肺炎球菌效價數據表明，部分(小於80-100%)mTOR抑制較更完全mTOR抑制更有效於逆轉衰老相關之免疫功能下降。
實例14：低劑量mTOR抑制增加活力及運動
在臨床前模型中，雷帕黴素類似物雷帕黴素之mTOR抑制增加老年小鼠之自發身體活動(Wilkinson等人，Rapamycin slows aging in mice.(2012)Aging Cell；11：675-82)。令人關注的是，闡述於實例13中之每天0.5mg投藥隊列中之個體亦在投藥後1年執行之問卷中報告活力及運動能力與安慰劑相比有所增加(圖46)。該等數據表明，雷帕黴素類似物之部分mTOR抑制可對免疫功能以外之衰老相關罹病率具有有益效應。
實例15：RAD001之P70 S6激酶抑制
實施建模及模擬以預測RAD001之經預測可部分抑制mTOR活性之每天及每週劑量範圍。如上所述，P70 S6K經mTOR磷酸化且係mTOR之與衰老最密切相關之下游靶，此乃因P70 S6K之基因敲除延長壽命。因此，對部分抑制P70 S6K活性之RAD001劑量實施建模。預測在>=0.1mg且<20mg範圍內之每週投藥可達成對P70 S6K活性之部分抑制(圖47)。
對於每天投藥，30pM至4nM之RAD001濃度在細胞系中部分抑制P70 S6K活性(表12)。預測該等血清濃度可以每天>=0.005mg至<1.5mg之RAD001劑量達成。
Figure 104111176-A0202-12-0340-103
結論
用僅部分抑制P70 S6K之mTOR抑制劑劑量治療衰老相關罹病率或通常增強免疫反應之方法。低劑量RAD001在衰老適應症中之部分mTOR抑制之效能係意外發現。介於每週>=0.1mg至<20mg及每天>=0.005mg至<1.5mg之間之RAD001劑量範圍將達成部分mTOR抑 制，且因此預期可在衰老相關罹病率中或在增強免疫反應中具有效能。
實例16：外源IL-7增強CAR T細胞之功能
在授受性轉移CAR T細胞後，一些患者經歷CAR T細胞之有限持久性，此可產生次最佳程度之抗腫瘤活性。在此實例中，在小鼠異種移植物模型中評價投與外源人類IL-7之效應，其中已觀察到針對CAR T細胞之初始次最佳反應。
首先在不同癌細胞系及CAR表現細胞中評價IL-7受體CD127之表現。藉由流式細胞術分析兩個外套細胞淋巴瘤細胞系(RL及Jeko-1)及一個B-ALL細胞系(Nalm-6)之CD127表現。如圖48A中所展示，在所測試之三種癌細胞系中，展示RL具有最高CD127表現，其次係Jeko-1及Nalm-6。將CART19細胞輸注至NSG小鼠中並藉由流式細胞術在循環CART19細胞上評價CD127表現。如圖48B中所展示，CD127在所有循環CART19細胞上表現一致。
之後，在淋巴瘤動物模型中評價外源IL-7治療對CART19細胞之抗腫瘤活性之效應。在第0天時(D0)向NSG小鼠植入螢光素酶表現外套細胞系(RL luc)，之後在第6天時進行CART19細胞治療。將NSG小鼠分成數組，其中一組不接受CART19細胞，第二組接受0.5×106個CART19細胞，第三組接受1×106個CART19細胞，且第四組接受2×106個CART19細胞。在超過80天期間藉由量測植入腫瘤之平均生物發光來監測腫瘤大小。僅接受2×106個CART19細胞之小鼠展示排斥腫瘤及抑制腫瘤生長(圖49A)。接受0.5×106個CART19細胞或1×106個CART19細胞之兩個組之小鼠展示次最佳抗腫瘤反應。然後將該兩個組之小鼠隨機化，其中3只小鼠(接受0.5×106個CART19細胞之小鼠編號3827及編號3829，及接受1×106個CART19細胞之小鼠編號3815)在第85天時起始每週三次藉由腹膜內注射以200ng/小鼠之劑量接受外源 重組人類IL-7，且2只小鼠不接受該外源重組人類IL-7。如藉由平均生物發光所檢測，自第85天至第125天接受外源IL-7之小鼠之腫瘤負荷展示於圖49B中。所有接受IL-7之小鼠皆展示腫瘤負荷降低1-3 log之顯著反應。最初接受較高劑量之CART19細胞之小鼠(接受1×106個CART19細胞之小鼠編號3815)展示更顯著反應。在IL-7治療之前及之後比較接受IL-7治療之小鼠與對照之腫瘤負荷時，僅在已接受IL-7治療之小鼠中見到腫瘤負荷之腫瘤減小(圖49C)。
在淋巴瘤動物模型中，亦檢查IL-7治療之後的T細胞動力學。在IL-7治療之前，在血液中檢測不到人類CART19細胞。在IL-7治療後，在經治療小鼠中，T細胞數出現快速但可變的增加(圖50A)。在接受IL-7之小鼠中觀察到之T細胞擴增程度亦與腫瘤反應相關聯。在IL-7治療期間在峰值擴增下於血液中檢測到最高T細胞數之小鼠(小鼠編號3815)具有腫瘤負荷之最穩健降低(參見圖49B)。此外，峰值擴增時間與作為基線注射之T細胞劑量相關聯。亦在IL-7治療之前及之後量測血液中之CD3表現細胞數目/含量。在對照小鼠中，檢測到極少CD3表現細胞，同時經IL-7-治療之小鼠展示CD3+細胞在IL-7治療後顯著增加(圖50B)。
總而言之，此實例中之結果展示，外源IL-7治療增加活體內T細胞增殖及抗腫瘤活性，指示於在CAR療法後具有次最佳結果之患者中使用IL-7可改良該等患者之抗腫瘤反應。
等效內容
本文引用之每一及所有專利、專利申請案及公開案之揭示內容係全文以引用方式併入本文中。儘管已參照特定態樣揭示本發明，但顯然，在不背離本發明之真實精神及範圍之情況下，熟習此項技術者可想到本發明之其他態樣及變化形式。意欲將隨附申請專利範圍視為包括所有該等態樣及等效變化形式。
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 39
Figure 104111176-A0202-12-0386-178
Figure 104111176-A0202-12-0387-179
Figure 104111176-A0202-12-0388-182
<210> 40
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 40
Figure 104111176-A0202-12-0389-183
Figure 104111176-A0202-12-0390-184
Figure 104111176-A0202-12-0391-185
<210> 41
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 41
Figure 104111176-A0202-12-0391-186
Figure 104111176-A0202-12-0392-187
Figure 104111176-A0202-12-0393-188
<210> 42
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 42
Figure 104111176-A0202-12-0393-189
Figure 104111176-A0202-12-0394-190
Figure 104111176-A0202-12-0395-191
Figure 104111176-A0202-12-0396-192
<210> 43
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Figure 104111176-A0202-12-0396-193
<210> 44
<211> 336
<212> DNA
<213> 智人
<400> 44
Figure 104111176-A0202-12-0396-194
Figure 104111176-A0202-12-0397-195
<210> 45
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 45
Figure 104111176-A0202-12-0397-196
Figure 104111176-A0202-12-0398-197
<210> 46
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 46
Figure 104111176-A0202-12-0398-198
Figure 104111176-A0202-12-0399-199
<210> 47
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 47
Figure 104111176-A0202-12-0399-200
Figure 104111176-A0202-12-0400-201
<210> 48
<211> 847
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 48
Figure 104111176-A0202-12-0400-202
Figure 104111176-A0202-12-0401-203
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 49
Figure 104111176-A0202-12-0401-204
<210> 50
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 50
Figure 104111176-A0202-12-0401-205
<210> 51
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 51
Figure 104111176-A0202-12-0402-206
<210> 52
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 52
Figure 104111176-A0202-12-0402-207
<210> 53
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
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<400> 53
Figure 104111176-A0202-12-0403-208
<210> 54
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 54
Figure 104111176-A0202-12-0403-371
<210> 55
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 55
Figure 104111176-A0202-12-0403-372
<210> 56
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 56
Figure 104111176-A0202-12-0404-373
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 57
Figure 104111176-A0202-12-0404-377
<210> 58
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 58
Figure 104111176-A0202-12-0404-209
Figure 104111176-A0202-12-0405-210
Figure 104111176-A0202-12-0406-211
<210> 59
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 59
Figure 104111176-A0202-12-0407-212
Figure 104111176-A0202-12-0408-213
<210> 60
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 60
Figure 104111176-A0202-12-0408-375
<210> 61
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 61
Figure 104111176-A0202-12-0408-214
Figure 104111176-A0202-12-0409-215
<210> 62
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 62
Figure 104111176-A0202-12-0409-216
<210> 63
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 63
Figure 104111176-A0202-12-0410-218
<210> 64
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 64
Figure 104111176-A0202-12-0410-219
Figure 104111176-A0202-12-0411-220
<210> 65
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 65
Figure 104111176-A0202-12-0411-221
Figure 104111176-A0202-12-0412-222
<210> 66
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 66
Figure 104111176-A0202-12-0412-225
<210> 67
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 67
Figure 104111176-A0202-12-0413-226
<210> 68
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 68
Figure 104111176-A0202-12-0413-227
Figure 104111176-A0202-12-0414-228
<210> 69
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 69
Figure 104111176-A0202-12-0414-230
Figure 104111176-A0202-12-0415-231
<210> 70
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 70
Figure 104111176-A0202-12-0415-232
<210> 71
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 71
Figure 104111176-A0202-12-0416-234
<210> 72
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 72
Figure 104111176-A0202-12-0416-235
Figure 104111176-A0202-12-0417-236
<210> 73
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 73
Figure 104111176-A0202-12-0417-237
Figure 104111176-A0202-12-0418-239
<210> 74
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 74
Figure 104111176-A0202-12-0418-240
Figure 104111176-A0202-12-0419-241
Figure 104111176-A0202-12-0420-242
<210> 75
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 75
Figure 104111176-A0202-12-0420-243
Figure 104111176-A0202-12-0421-244
<210> 76
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 76
Figure 104111176-A0202-12-0421-245
Figure 104111176-A0202-12-0422-246
<210> 77
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 77
Figure 104111176-A0202-12-0423-247
Figure 104111176-A0202-12-0424-248
<210> 78
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 78
Figure 104111176-A0202-12-0424-249
Figure 104111176-A0202-12-0425-250
Figure 104111176-A0202-12-0426-251
<210> 79
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 79
Figure 104111176-A0202-12-0426-252
Figure 104111176-A0202-12-0427-253
<210> 80
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 80
Figure 104111176-A0202-12-0427-254
Figure 104111176-A0202-12-0428-255
Figure 104111176-A0202-12-0429-256
<210> 81
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 81
Figure 104111176-A0202-12-0429-257
Figure 104111176-A0202-12-0430-258
<210> 82
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 82
Figure 104111176-A0202-12-0430-259
Figure 104111176-A0202-12-0431-260
Figure 104111176-A0202-12-0432-261
<210> 83
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 83
Figure 104111176-A0202-12-0432-262
Figure 104111176-A0202-12-0433-263
<210> 84
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 84
Figure 104111176-A0202-12-0433-264
Figure 104111176-A0202-12-0434-265
<210> 85
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 85
Figure 104111176-A0202-12-0435-266
Figure 104111176-A0202-12-0436-267
<210> 86
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 86
Figure 104111176-A0202-12-0436-268
Figure 104111176-A0202-12-0437-269
<210> 87
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 87
Figure 104111176-A0202-12-0437-270
Figure 104111176-A0202-12-0438-271
<210> 88
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 88
Figure 104111176-A0202-12-0438-272
Figure 104111176-A0202-12-0439-273
<210> 89
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 89
Figure 104111176-A0202-12-0439-275
Figure 104111176-A0202-12-0440-276
<210> 90
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 90
Figure 104111176-A0202-12-0440-277
Figure 104111176-A0202-12-0441-278
<210> 91
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 91
Figure 104111176-A0202-12-0441-279
Figure 104111176-A0202-12-0442-281
<210> 92
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 92
Figure 104111176-A0202-12-0443-282
<210> 93
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 93
Figure 104111176-A0202-12-0444-283
Figure 104111176-A0202-12-0445-284
<210> 94
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 94
Figure 104111176-A0202-12-0445-285
Figure 104111176-A0202-12-0446-286
<210> 95
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 95
Figure 104111176-A0202-12-0446-287
Figure 104111176-A0202-12-0447-288
<210> 96
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 96
Figure 104111176-A0202-12-0447-289
Figure 104111176-A0202-12-0448-290
<210> 97
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 97
Figure 104111176-A0202-12-0448-291
Figure 104111176-A0202-12-0449-292
<210> 98
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 98
Figure 104111176-A0202-12-0449-293
Figure 104111176-A0202-12-0450-294
<210> 99
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 99
Figure 104111176-A0202-12-0450-295
Figure 104111176-A0202-12-0451-296
<210> 100
<211> 1184
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 100
Figure 104111176-A0202-12-0451-297
Figure 104111176-A0202-12-0452-298
<210> 101
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 101
Figure 104111176-A0202-12-0452-299
Figure 104111176-A0202-12-0453-300
<210> 102
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 102
Figure 104111176-A0202-12-0453-301
Figure 104111176-A0202-12-0454-302
<210> 103
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 103
Figure 104111176-A0202-12-0454-303
Figure 104111176-A0202-12-0455-304
<210> 104
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 104
Figure 104111176-A0202-12-0455-305
<210> 105
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
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<400> 105
Figure 104111176-A0202-12-0455-306
<210> 106
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 106
Figure 104111176-A0202-12-0456-307
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 107
Figure 104111176-A0202-12-0456-308
<210> 108
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 108
Figure 104111176-A0202-12-0456-309
<210> 109
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> /注意=「此序列可涵蓋50至5000個核苷酸」
<400> 109
Figure 104111176-A0202-12-0457-310
Figure 104111176-A0202-12-0458-313
Figure 104111176-A0202-12-0459-314
Figure 104111176-A0202-12-0460-315
<210> 110
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 110
Figure 104111176-A0202-12-0460-316
<210> 111
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
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<400> 111
Figure 104111176-A0202-12-0460-317
Figure 104111176-A0202-12-0461-318
Figure 104111176-A0202-12-0462-319
Figure 104111176-A0202-12-0463-320
<210> 112
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> misc_feature
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<400> 112
Figure 104111176-A0202-12-0464-322
Figure 104111176-A0202-12-0465-323
Figure 104111176-A0202-12-0466-324
Figure 104111176-A0202-12-0467-325
<210> 113
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(400)
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<400> 113
Figure 104111176-A0202-12-0467-326
<210> 114
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 114
Figure 104111176-A0202-12-0468-327
<210> 115
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 115
Figure 104111176-A0202-12-0468-328
Figure 104111176-A0202-12-0469-329
<210> 116
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 116
Figure 104111176-A0202-12-0469-330
Figure 104111176-A0202-12-0470-331
<210> 117
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 117
Figure 104111176-A0202-12-0470-332
<210> 118
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2000)
<223> /注意=「此序列可涵蓋50至2000個核苷酸」
<400> 118
Figure 104111176-A0202-12-0471-333
Figure 104111176-A0202-12-0472-334
<210> 119
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 119
Figure 104111176-A0202-12-0472-335
Figure 104111176-A0202-12-0473-336
Figure 104111176-A0202-12-0474-337
<210> 120
<211> 1182
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 120
Figure 104111176-A0202-12-0474-338
Figure 104111176-A0202-12-0475-339
<210> 121
<211> 394
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 121
Figure 104111176-A0202-12-0475-340
Figure 104111176-A0202-12-0476-341
Figure 104111176-A0202-12-0477-342
<210> 122
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 122
Figure 104111176-A0202-12-0477-343
Figure 104111176-A0202-12-0478-344
<210> 123
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 123
Figure 104111176-A0202-12-0478-345
<210> 124
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 124
Figure 104111176-A0202-12-0479-346
<210> 125
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 125
Figure 104111176-A0202-12-0479-347
Figure 104111176-A0202-12-0480-348
<210> 126
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 126
Figure 104111176-A0202-12-0480-349
<210> 127
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 127
Figure 104111176-A0202-12-0481-350
<210> 128
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任一胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(78)
<223> 任一胺基酸
<400> 128
Figure 104111176-A0202-12-0481-352
Figure 104111176-A0202-12-0482-353
<210> 129
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 129
Figure 104111176-A0202-12-0482-354
<210> 130
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注意=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 130
Figure 104111176-A0202-12-0483-355
<210> 131
<211> 1132
<212> PRT
<213> 智人
<400> 131
Figure 104111176-A0202-12-0483-356
Figure 104111176-A0202-12-0484-357
Figure 104111176-A0202-12-0485-358
Figure 104111176-A0202-12-0486-359
Figure 104111176-A0202-12-0487-360
Figure 104111176-A0202-12-0488-361
<210> 132
<211> 4027
<212> DNA
<213> 智人
<400> 132
Figure 104111176-A0202-12-0489-362
Figure 104111176-A0202-12-0490-364
Figure 104111176-A0202-12-0491-365

Claims (45)

  1. 一種表現結合CD19之CAR分子之免疫效應細胞群(「CAR19表現細胞」)之用途，其係用於製備治療患有血液癌症的哺乳動物的藥物，其中該CAR19表現細胞表現CAR分子，其包含抗-CD19結合結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，且其中該藥物進一步包含布魯頓氏酪胺酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase，BTK)抑制劑或與BTK抑制劑組合使用。
  2. 一種表現結合CD19之CAR分子之免疫效應細胞群(「CAR19表現細胞」)之用途，其係用於製備治療患有B細胞惡性病的哺乳動物的藥物，其中該CAR19表現細胞表現CAR分子，其包含抗-CD19結合結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，且其中該藥物進一步包含依魯替尼(ibrutinib)或與依魯替尼組合使用。
  3. 如請求項1之用途，其中：(a)該BTK抑制劑及該CAR19表現細胞係投與至該哺乳動物作為第一線療法；或(b)該CAR19表現細胞係在投與該BTK抑制劑後投與該哺乳動物。
  4. 如請求項1或3之用途，其中：(i)該CAR19表現細胞係在停止投與該BTK抑制劑後投與；或(ii)該BTK抑制劑係在投與該CAR19表現細胞之前開始投與，且該CAR19表現細胞係與該BTK抑制劑之持續投與組合投與。
  5. 如請求項1或3之用途，其中該哺乳動物為或經鑑別為該BTK抑制劑之完全或部分反應者，或該CAR19表現細胞之完全或部分反應者。
  6. 如請求項1或3之用途，其中該BTK抑制劑為依魯替尼(ibrutinib)。
  7. 如請求項1或3之用途，其中：(a)該BTK抑制劑係選自依魯替尼(ibrutinib)、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13；或(b)該BTK抑制劑係依魯替尼，且該依魯替尼之日劑量為約250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg或600mg。
  8. 如請求項1或2之用途，其中該藥物進一步包含以下各者或與以下各者併用：(i)CDK4抑制劑，其係選自：帕博西林(palbociclib)、阿羅辛A(aloisine A)、夫拉平度(flavopiridol)、2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(3S,4R)-3-羥基-1-甲基-4-六氫吡啶基]-4-
    Figure 104111176-A0305-02-0495-2
    烯酮；克唑替尼(crizotinib，PF-02341066)、P276-00、RAF265、因地蘇蘭(indisulam)、羅可韋汀(roscovitine)、地那西布(dinaciclib)、BMS 387032、MLN8054、AG-024322、AT7519、AZD5438、BMS908662；或瑞博司可裡布(ribociclib)；(ii)mTOR抑制劑，其係選自：雷帕黴素(rapamycin)或雷帕黴素類似物，其中該雷帕黴素類似物係選自依維莫司(everolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)、瑞達福羅莫司(ridaforolimus)、塞馬莫德(semapimod)、AZD8055、PF04691502、SF1126、XL765或OSI-027；或(iii)MNK抑制劑，其係選自：CGP052088、CGP57380、尾孢醯胺、ETC-1780445-2或4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
  9. 如請求項1或2之用途，其中：(i)該細胞內信號傳導結構域包含共刺激結構域及初級信號傳導結構域；(ii)該CAR分子包含抗-CD19結合結構域，該抗-CD19結合結構域包含抗-CD19結合結構域之輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)、輕鏈互補決定區3(LC CDR3)、重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)；(iii)該抗-CD19結合結構域包含SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59之鼠類輕鏈可變區、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：59之鼠類重鏈可變區或二者；(iv)該抗-CD19結合結構域包含SEQ ID NO：25之LC CDR1、SEQ ID NO：26之LC CDR2及SEQ ID NO：27之LC CDR3；(v)該抗-CD19結合結構域包含SEQ ID NO：19之HC CDR1、SEQ ID NO：20-23中任一者之HC CDR2及SEQ ID NO：24之HC CDR3；(vi)該抗-CD19結合結構域包含該SEQ ID NO：59之序列或與其具有95%至99%一致性之序列；及/或(vii)該抗-CD19結合結構域藉由鉸鏈區聯結至該跨膜結構域。
  10. 如請求項1或2之用途，其中該抗-CD19結合結構域係人類化抗-CD19結合結構域。
  11. 如請求項10之用途，其中：(a)該人類化抗-CD19結合結構域包含選自以下各項之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、 SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12或與其具有95%至99%一致性之序列；及/或(b)該人類化抗-CD19結合結構域係包含經由連接體附接至重鏈可變區之輕鏈可變區的scFv，其中該連接體包含SEQ ID NO：53之序列。
  12. 如請求項1或2之用途，其中：(i)該CAR分子包含選自以下各項之蛋白質之跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154；(ii)該CAR分子包含共刺激結構域；(iii)該CAR分子包含細胞內信號傳導結構域，；(iv)該CAR分子進一步包含前導序列；或(v)該CAR分子包含SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42之胺基酸序列。
  13. 如請求項11之用途，其中(i)該CAR分子包含蛋白質之跨膜結構域，其中該跨膜結構域包含SEQ ID NO：15之序列；(ii)該CAR分子包含共刺激結構域，其中該共刺激結構域包含選自以下各者之蛋白質之功能性信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)或4-1BB(CD137)，其中該共刺激結構域包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：51之序列；(iii)該CAR分子包含細胞內信號傳導結構域，其中： (a)該細胞內信號傳導結構域包含4-1BB之功能性信號傳導結構域、CD3 ζ之功能性信號傳導結構域或二者，或(b)該細胞內信號傳導結構域包含CD27之序列、CD3 ζ之功能性信號傳導結構域或二者；或(iv)該CAR分子進一步包含前導序列，其中該前導序列包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
  14. 如請求項11之用途，其中該細胞內信號傳導結構域包含：(a)該SEQ ID NO：16之序列、該SEQ ID NO：17之序列或二者；(b)該SEQ ID NO：16之序列、該SEQ ID NO：43之序列或二者；(c)該SEQ ID NO：51之序列、該SEQ ID NO：17之序列或二者；或(d)該SEQ ID NO：51之序列、該SEQ ID NO：43之序列或二者。
  15. 如請求項1或2之用途，其中該藥物係與抑制選自以下各項之免疫抑制分子之藥劑組合使用：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR β。
  16. 如請求項1或2之用途，其中該藥物包含1×108個至5×108個CAR19表現細胞。
  17. 如請求項1或2之用途，其中該血液癌症或B細胞惡性病選自白血病或淋巴瘤。
  18. 如請求項17之用途，其中該白血病或淋巴瘤係選自：(i)慢性淋巴球性白血病(CLL)、外套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤、急性淋巴樣白血病(ALL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、B細胞急性淋巴樣白血病(BALL)、T細胞急性淋巴樣白血病(TALL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、伯基特氏淋巴瘤 (Burkitt's lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、與慢性發炎相關之DLBCL、濾泡性淋巴瘤、小兒濾泡性淋巴瘤、多毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生性病況、MALT淋巴瘤(黏膜相關淋巴樣組織之結外邊緣帶淋巴瘤)、邊緣帶淋巴瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、脾邊緣帶淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾紅髓瀰漫性小B細胞淋巴瘤、多毛細胞白血病變體、淋巴漿細胞性淋巴瘤、重鏈疾病、漿細胞骨髓瘤、孤立性骨骼漿細胞瘤、骨外漿細胞瘤、結節邊緣帶淋巴瘤、小兒結節邊緣帶淋巴瘤、原發性皮膚濾泡中心淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病、原發性縱膈(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK+大B細胞淋巴瘤、在HHV8相關之多中心卡斯特雷曼氏病(multicentric Castleman disease)中出現之大B細胞淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤、B細胞淋巴瘤或無法歸類之淋巴瘤；或(ii)MCL、CLL、ALL、霍奇金氏淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
  19. 如請求項2之用途，其中該B細胞惡性病係選自：(i)慢性淋巴球性白血病(CLL)、外套細胞淋巴瘤(MCL)、多發性骨髓瘤、急性淋巴樣白血病(ALL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、B細胞急性淋巴樣白血病(BALL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、B細胞前淋巴球性白血病、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、與慢性發炎相關之DLBCL、濾泡性淋巴瘤、小兒濾泡性淋巴瘤、多毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增生性病況、MALT淋巴瘤(黏膜相關淋巴樣組織之結外邊緣帶淋巴瘤)、 邊緣帶淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、脾邊緣帶淋巴瘤、脾淋巴瘤/白血病、脾紅髓瀰漫性小B細胞淋巴瘤、多毛細胞白血病變體、淋巴漿細胞性淋巴瘤、重鏈疾病、漿細胞骨髓瘤、孤立性骨骼漿細胞瘤、骨外漿細胞瘤、結節邊緣帶淋巴瘤、小兒結節邊緣帶淋巴瘤、原發性皮膚濾泡中心淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病、原發性縱膈(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK+大B細胞淋巴瘤、在HHV8相關之多中心卡斯特雷曼氏病(multicentric Castleman disease)中出現之大B細胞淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤、B細胞淋巴瘤或無法歸類之淋巴瘤；或(ii)MCL、CLL、ALL、霍奇金氏淋巴瘤或多發性骨髓瘤。
  20. 如請求項1或2之用途，其中該藥物係與細胞介素組合使用。
  21. 如請求項20之用途，其中該細胞介素係IL-7、IL-15或IL-21。
  22. 如請求項1或2之用途，其中該CAR係可調控CAR(RCAR)，其中該RCAR包含：(a)細胞內信號傳導構件，其包含細胞內信號傳導結構域及第一開關結構域，(b)抗原結合構件，其包含結合CD19之抗原結合結構域及第二開關結構域；及(c)跨膜結構域。
  23. 如請求項1或2之用途，其中：(i)該哺乳動物具有或經鑑別具有BTK突變；(ii)該哺乳動物為或經鑑別為血液癌症之一或多種療法之部分反應者、非反應者或復發者；(iii)該哺乳動物為(或經鑑別為)該BTK抑制劑之部分反應者， 且在部分反應時段期間，向該哺乳動物投與單獨或與該BTK抑制劑組合之該CAR19表現細胞；(iv)該哺乳動物為(或經鑑別為)在使用依魯替尼治療後具有進行性或穩定疾病之非反應者，且在進行性或穩定疾病時段期間，向該哺乳動物投與單獨或與第二BTK抑制劑組合之該CAR19表現細胞，其中該第二BTK抑制劑並非依魯替尼；(v)該哺乳動物已經歷淋巴清除，其中該淋巴清除包含投與美法侖(melphalan)、癌得星(cytoxan)、環磷醯胺及氟達拉濱(fludarabine)中之一或多者；或(vi)該哺乳動物在投與該BTK抑制劑後經歷表現PD1之T細胞減少。
  24. 如請求項17之用途，其中：(i)對該BTK抑制劑、該CAR19表現細胞或二者之抗性延遲或減小；或(ii)該血液癌症之緩解經延長或該血液癌症之復發經延遲。
  25. 如請求項1或2之用途，其中該CAR19表現細胞係與第二BTK抑制劑組合投與，其中當該哺乳動物為或經鑑別為依魯替尼之非反應者或復發者時，該第二BTK抑制劑並非依魯替尼，其中第二BTK抑制劑係選自以下各項中之一或多者：GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13或其組合。
  26. 如請求項1或2之用途，其中該BTK抑制劑係依魯替尼，且該依魯替尼經調配用於投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個週期，其中週期長度為21天或28天。
  27. 如請求項1或2之用途，其中： (i)該CAR19表現細胞係在該BTK抑制劑開始投與後至少1、2、3或4週或1、2、3、4、6、9、12、15、18或24個月開始投與；(ii)該CAR19表現細胞與該BTK激酶抑制劑經調配用於同時投與；或(iii)該CAR19表現細胞與該BTK激酶抑制劑經調配用於依序遞送。
  28. 如請求項1或2之用途，其中：(i)該用途包含實施使用至少一種CD19 CAR表現細胞之淋巴球輸注；或(ii)該用途進一步包含向該哺乳動物投與低的免疫增強劑量之mTOR抑制劑，其中該mTOR抑制劑係依維莫司或雷帕黴素。
  29. 如請求項1或2之用途，其中該CAR19表現細胞係人類免疫效應細胞，其中該人類免疫效應細胞包含人類T細胞或人類NK細胞。
  30. 一種製備CAR19表現免疫效應細胞群之方法，其包含：(a)使免疫效應細胞或免疫效應細胞群與BTK抑制劑接觸；及(b)在使得CAR19分子表現之條件下，將編碼CAR19分子之核酸引入至該免疫效應細胞群中。
  31. 如請求項30之方法，其中該免疫效應細胞群包括T細胞、NK細胞或二者。
  32. 如請求項30或31之方法，其中：(i)該方法包含使該免疫效應細胞群與該BTK抑制劑接觸10分鐘至20分鐘、20分鐘至30分鐘、30分鐘至40分鐘、40分鐘至60分鐘或60分鐘至120分鐘，及隨後自該細胞群移除大部分或全部該BTK抑制劑；(ii)該BTK抑制劑係在收穫該免疫效應細胞群之後或在刺激該 免疫效應細胞群之前添加；或(iii)該BTK抑制劑係選自：依魯替尼、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13。
  33. 如請求項30或31之方法，其中該BTK抑制劑為依魯替尼(ibrutinib)。
  34. 如請求項30或31之方法，其中該免疫效應細胞群亦包含癌細胞。
  35. 如請求項30或31之方法，其中該方法進一步包含自該免疫效應細胞群清除T調控細胞。
  36. 如請求項30或31之方法，其中該CAR19表現細胞係人類免疫效應細胞，其中該人類免疫效應細胞包含人類T細胞或人類NK細胞。
  37. 一種反應混合物，其包含免疫效應細胞群、BTK抑制劑及CAR19分子或編碼CAR19分子之核酸。
  38. 如請求項37之反應混合物，其中：(i)該等免疫效應細胞中之一或多者表現該CAR19分子或包含編碼該CAR19分子之該核酸；(ii)該BTK抑制劑係選自依魯替尼、GDC-0834、RN-486、CGI-560、CGI-1764、HM-71224、CC-292、ONO-4059、CNX-774或LFM-A13；或(iii)該反應混合物進一步包含癌細胞。
  39. 如請求項37或38之反應混合物，其中該BTK抑制劑為依魯替尼(ibrutinib)。
  40. 一種組合物，其包含表現結合CD19之CAR分子之細胞(「CAR19表現細胞」)及布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑，其中該CAR19表現細胞及該BTK抑制劑係以單一劑型或以兩個或更多個劑型存 在。
  41. 如請求項40之組合物，其用作藥劑。
  42. 如請求項40或41之組合物，其中該CAR19表現細胞包含人類T細胞或人類NK細胞。
  43. 一種表現結合CD19之CAR分子之免疫效應細胞群(「CAR19表現細胞」)之用途，其係用於製備藥物，其中該CAR19表現細胞包含人類免疫效應細胞群，其中該人類免疫效應細胞群包含人類T細胞、人類NK細胞或人類T細胞及人類NK細胞之組合，其中該CAR19表現細胞表現CAR分子，其包含抗-CD19結合結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，且其中該藥物進一步包含布魯頓氏酪胺酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase，BTK)抑制劑或與BTK抑制劑組合使用。
  44. 如請求項43之用途，其中該BTK抑制劑為依魯替尼(ibrutinib)。
  45. 如請求項43或44之用途，其中該藥物係用於在個體中提供抗腫瘤免疫性的方法中。
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