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CN116334205A - 预测细胞因子释放综合征的生物标志物 - Google Patents

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CN116334205A
CN116334205A CN202210851486.4A CN202210851486A CN116334205A CN 116334205 A CN116334205 A CN 116334205A CN 202210851486 A CN202210851486 A CN 202210851486A CN 116334205 A CN116334205 A CN 116334205A
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crs
ifn
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Application number
CN202210851486.4A
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A·加法尔
A·加内茨基
S·吉尔
S·莱西
J·J·梅勒霍斯特
D·蒂奇
E·兰卡斯特
A·D·科恩
P·肖
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Novartis AG
University of Pennsylvania Penn
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Novartis AG
University of Pennsylvania Penn
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Abstract

本公开涉及与细胞因子释放综合征(CRS)临床相关的生物标志物(例如，分析物，分析物谱或标志物(例如，基因表达和/或蛋白质表达谱))的鉴定和用途。

Description

预测细胞因子释放综合征的生物标志物
本申请为2016年9月2日提交的、发明名称为“预测细胞因子释放综合征的生物标志物”的PCT申请PCT/US2016/050112的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2018年5月2日，申请号为201680063992.X。
相关申请
本申请要求于2015年9月3日提交的美国序列号62/214066，2015年12月4日提交的美国序列号62/263235以及2016年8月30日提交的美国序列号62/381,153的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明是在National Institutes of Health授予的资助号为R01CA165206，R01CA193776，R01CA102646，R01CA116660和K23GM110496的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且通过引用将其全部内容并入本文。所述ASCII副本于2016年9月2日创建，名为N2067-7096WO_SL.txt，大小为702,117字节。
技术领域
本发明涉及预测细胞因子释放综合征的生物标志物及其用途。
背景技术
具有抗CD19特异性的CAR T细胞已经表现出针对高度难治性血液恶性肿瘤的可观前景。报道了在用CTL019治疗的复发/难治性ALL儿童中具有完全缓解率高达90％的显著临床反应。体内标记CAR T细胞增殖(100至100,000x)导致改善的功效，但可能与不良事件(包括细胞因子释放综合征(CRS))相关联。CRS是基于免疫细胞的疗法(例如CAR T细胞治疗)的严重且常见的不良副作用。严重的CRS是潜在的危及生命的毒性。
因此，需要开发用于预测患者发展CRS的风险的方法和生物标志物。
发明内容
本文的公开内容至少部分基于以下发现：在基于免疫细胞的疗法(例如CAR T细胞治疗)期间，若干生物标志物可以早期准确预测CRS(例如，在受试者患CRS变得危重病之前，例如在CAR T细胞施用的第一个10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天或更少的范围内)。在一些实施方案中，两种细胞因子sgp130和IFNγ与严重CRS的发展密切相关。在成人和儿科受试者的实施方案中，可以使用IFN，sgp130和IL-1Ra进行严重CRS的准确早期预测。在儿科患者的实施方案中，可以使用IFNγ，IL13和MIP1α或使用sgp130，IFNγ和疾病负担评估进行严重CRS的准确早期预测。因此，本文提供了用于评估受试者，例如预测受试者发展CRS(例如，严重CRS)的风险的方法，系统和试剂盒，以及治疗患有癌症的受试者的方法，包括评估受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险。本文描述的方法有利地提供了用免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)疗法(例如CAR T细胞)治疗的受试者具有很高的可能性从严重CRS变为危重病的早期且准确识别(例如，预测)。由于可以在受试者生病之前进行预测，因此本文的方法允许可以降低发病率或死亡率的早期干预。因此，本文描述的使用少量细胞因子和细胞因子受体以高敏感性和特异性预测CRS严重性的方法，系统和试剂盒在临床上是有用的，并且优于目前的治疗方式。
因此，一方面，本发明的特征在于评估，例如预测受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险的方法。该方法包括例如响应基于免疫细胞的疗法(例如，CAR表达细胞疗法(例如CAR19表达细胞疗法)或CD19消耗疗法)获得受试者的CRS风险状态，其中CRS风险状态指示受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险。在一些实施方案中，CRS风险状态包括下述中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多(全部)量度：
(i)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，可溶性gp130(sgp130)或干扰素-γ(IFN-g)或其组合的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(ii)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，sgp130，IFN-γ或IL1Ra或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和IL1Ra中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(iii)在样品(例如血液样品)中sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，和受试者中骨髓疾病的水平，例如其中受试者是儿科受试者；
(iv)在样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或MIP1-α或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和MIP1-α中任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(v)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vi)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL-2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130或其组合(例如，IL-2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(viii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL10的水平或活性和在受试者中的疾病负担水平或其组合，例如其中受试者是儿科受试者；
(ix)在受试者中IFN-γ或IL-13或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(x)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ，IL-13或MIP1-α或其组合(例如IFN-γ，IL-13和MIP1-α中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；或
(xi)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ或MIP1-α或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者。
另一方面，本发明的特征在于在治疗过程(例如，基于免疫细胞的疗法(例如，CAR表达细胞疗法(例如，CAR19表达细胞疗法)或CD19消耗疗法)期间，监控受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险的方法。该方法包括例如响应于疗法(例如基于免疫细胞的疗法)获得受试者的CRS风险状态，其中CRS风险状态指示受试者在疗法期间发展CRS(例如严重CRS)的风险。在一些实施方案中，CRS风险状态包括下述中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多(全部)量度：
(i)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，可溶性gp130(sgp130)或干扰素-γ(IFN-g)或其组合的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(ii)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，sgp130，IFN-γ或IL1Ra或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和IL1Ra中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(iii)在样品(例如血液样品)中sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，和受试者中骨髓疾病的水平，例如其中受试者是儿科受试者；或
(iv)在样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或MIP1-α或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和MIP1-α中任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(v)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vi)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130或其组合(例如，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(viii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL10的水平或活性和在受试者中的疾病负担水平或其组合，例如其中受试者是儿科受试者；
(ix)在受试者中IFN-γ或IL-13或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(x)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ，IL-13或MIP1-α或其组合(例如IFN-γ，IL-13和MIP1-α中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；或
(xi)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ或MIP1-α或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者。
又一方面，本发明的特征在于用于治疗患有癌症例如血液癌症的受试者的方法。该方法包括：
向受试者施用治疗有效剂量的CAR表达细胞疗法，例如CAR19疗法；和
获取受试者的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态包括以下中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多(全部)量度：
(i)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(ii)在受试者，例如样品(例如血液样品)中，sgp130，IFN-γ或IL1Ra或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和IL1Ra中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(iii)在受试者中，例如在样品(例如血液样品)中sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，和受试者中骨髓疾病的水平，例如其中受试者是儿科受试者；
(iv)在受试者中，例如在样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或MIP1-α或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和MIP1-α中任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(v)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vi)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL-2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130或其组合(例如，IL-2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IFN-γ，IL-2或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，IFN-γ，IL-2或嗜酸细胞活化趋化因子中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(viii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL-10的水平或活性和在受试者中的疾病负担水平或其组合，例如其中受试者是儿科受试者；
(ix)在受试者中IFN-γ或IL-13或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；或
(x)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ，IL-13或MIP1-α或其组合(例如IFN-γ，IL-13和MIP1-α中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；或
(xi)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ或MIP1-α或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
其中CRS风险状态指示受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险。
在又一个方面，本发明的特征在于CAR表达细胞疗法，例如CAR19疗法，用于患有癌症例如血液癌症的受试者的用途，其中所述受试者被鉴定为具有指示所述受试者发展CRS如严重CRS的风险的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态包括以下中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多(全部)量度：
(i)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(ii)在受试者，例如样品(例如血液样品)中，sgp130，IFN-γ或IL1Ra或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和IL1Ra中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(iii)在受试者中，例如在样品(例如血液样品)中sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，和受试者中骨髓疾病的水平，例如其中受试者是儿科受试者；
(iv)在受试者中，例如在样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或MIP1-α或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和MIP1-α中任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(v)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vi)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130或其组合(例如，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(viii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL10的水平或活性和在受试者中的疾病负担水平或其组合，例如其中受试者是儿科受试者；
(ix)在受试者中IFN-γ或IL-13或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(x)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ，IL-13或MIP1-α或其组合(例如IFN-γ，IL-13和MIP1-α中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；或
(xi)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ或MIP1-α或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者。
在又一方面，本发明的特征在于用于评估(例如预测)受试者发展CRS(例如，严重CRS)的风险的系统或方法。该系统包括可操作地连接至内存(memory)的至少一个处理器，其中该至少一个处理器在执行时被配置为获取受试者的CRS风险状态，例如响应于基于免疫细胞的疗法(例如CAR表达细胞疗法(例如CAR19表达细胞疗法))，其中所述CRS风险状态包括以下(i)-(vii)。该方法包括：
例如响应基于免疫细胞的疗法(例如，CAR表达细胞疗法(例如，CAR19表达细胞疗法))获取受试者的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态由以下确定：
(i)获取sgp130水平或活性；
(ii)如果获取的sgp130水平或活性低于例如约218,000pg/ml的参照sgp130水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为低；
(iii)任选地(例如，如果获取的sgp130水平或活性高于参照sgp130水平或活性)，获取IFN-γ水平或活性；
(iv)任选地(例如，如果获取的sgp130水平或活性高于参照sgp130水平或活性)如果获取的IFN-γ水平或活性低于例如约10pg/ml的参照IFN-γ水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为低；
(v)任选地(例如，如果获取的IFN-γ水平或活性高于参照IFN-γ水平或活性)获取IL1Ra水平或活性；
(vi)任选地，(例如，如果获取的IFN-γ水平或活性高于参照IFN-γ水平或活性)如果获取的IL1Ra水平或活性低于例如约658pg/ml的参照IL1Ra水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为高；和
(vii)任选地，(例如，如果获取的IFN-γ水平或活性高于参照IFN-γ水平或活性)如果获取的IL1Ra水平或活性高于例如约658pg/ml的参照IL1Ra水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为低；
从而评估，例如预测受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险。
在又一方面，本发明的特征在于用于评估(例如预测)受试者发展CRS(例如，严重CRS)的风险的系统或方法。该系统包括可操作地连接至内存(memory)的至少一个处理器，其中该至少一个处理器在执行时被配置为获取受试者的CRS风险状态，例如响应于基于免疫细胞的疗法(例如CAR表达细胞疗法(例如CAR19表达细胞疗法))，其中所述CRS风险状态包括以下(i)-(vii)。该方法包括：
例如响应基于免疫细胞的疗法(例如，CAR表达细胞疗法(例如，CAR19表达细胞疗法))获取受试者的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态由以下确定：
(i)获取sgp130水平或活性；
(ii)如果获取的sgp130水平或活性低于例如约218,000pg/ml的参照sgp130水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为低；
(iii)任选地(例如，如果获取的sgp130水平或活性高于参照sgp130水平或活性)，获取MCP1水平或活性；
(iv)任选地(例如，如果获取的sgp130水平或活性高于参照sgp130水平或活性)如果获取的MCP1水平或活性高于例如约4600pg/ml的参照MCP1水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为高；
(v)任选地(例如，如果获取的MCP1水平或活性低于参照MCP1水平或活性)获取嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；
(vi)任选地，(例如，如果获取的MCP1水平或活性低于参照MCP1水平或活性)如果获取的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性低于例如约29pg/ml的参照嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为高；和
(vii)任选地，(例如，如果获取的MCP1水平或活性低于参照MCP1水平或活性)如果获取的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性高于例如约29pg/ml的参照嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为低；
从而评估，例如预测受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险。
在又一方面，本发明的特征在于用于评估(例如预测)受试者发展CRS(例如，严重CRS)的风险的系统或方法。该系统包括可操作地连接至内存(memory)的至少一个处理器，其中该至少一个处理器在执行时被配置为获取受试者的CRS风险状态，例如响应于基于免疫细胞的疗法(例如CAR表达细胞疗法(例如CAR19表达细胞疗法))，其中所述CRS风险状态包括以下(i)-(vii)。该方法包括：
例如响应基于免疫细胞的疗法(例如，CAR表达细胞疗法(例如，CAR19表达细胞疗法))获取受试者的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态由以下确定：
(i)获取第一IFN-γ水平或活性；
(ii)如果第一获取的IFN-γ水平或活性低于例如约28pg/ml的第一参照IFN-γ水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为低；
(iii)任选地(例如，如果第一获取的IFN-γ水平或活性高于第一参照IFN-γ水平或活性)获取MIP1a水平或活性；
(iv)任选地(例如，如果第一获取的IFN-γ水平或活性高于第一参照IFN-γ水平或活性)，如果获取的MIP1a水平或活性低于例如约30pg/ml的参照MIP1a水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为高；
(v)任选地(例如，如果获取的MIP1a水平或活性高于参照MIP1a水平或活性，或者如果步骤(i)在高值下不产生准确读数)获取第二IFN-γ水平或活性；
(vi)任选地(例如如果获取的MIP1a水平或活性高于参照MIP1a水平或活性)，如果第一获取的IFN-γ水平或活性低于参照IFN-γ水平或活性，或任选地如果第二获取的IFN-γ水平或活性低于例如约95pg/ml的参照IFN-γ水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为低；和
(vii)任选地(例如如果获取的MIP1a水平或活性高于参照MIP1a水平或活性)，如果第一获取的IFN-γ水平或活性高于参照IFN-γ水平或活性，或任选地，如果第二获取的IFN-γ水平或活性高于例如约95pg/ml的参照IFN-γ水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为高；
从而评估，例如预测受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险。
在又一方面，本发明的特征在于用于评估(例如预测)受试者发展CRS(例如，严重CRS)的风险的系统或方法。该系统包括可操作地连接至内存(memory)的至少一个处理器，其中该至少一个处理器在执行时被配置为获取受试者的CRS风险状态，例如响应于基于免疫细胞的疗法(例如CAR表达细胞疗法(例如CAR19表达细胞疗法))，其中所述CRS风险状态包括以下(i)-(vii)。该方法包括：
例如响应基于免疫细胞的疗法(例如，CAR表达细胞疗法(例如，CAR19表达细胞疗法))获取受试者的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态由以下确定：
(i)获取第一生物标志物(例如细胞因子或细胞因子受体，例如本文所述的细胞因子或细胞因子受体)水平或活性；
(ii)确定第一生物标志物水平或活性是高于还是低于第一参照水平或活性，
(iii)任选地获取第二生物标志物(例如细胞因子或细胞因子受体，例如本文所述的细胞因子或细胞因子受体)水平或活性；
(iv)任选地确定第二生物标志物水平或活性是高于还是低于第二参照水平或活性，
(v)任选地获取第三生物标志物(例如细胞因子或细胞因子受体，例如本文所述的细胞因子或细胞因子受体)水平或活性；和
(vi)任选地确定第三生物标志物水平或活性是高于还是低于第三参照水平或活性，
从而评估，例如预测受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险。
在又一方面，本发明的特征在于用于评估(例如预测)受试者发展CRS(例如，严重CRS)的风险的系统或方法。该系统包括可操作地连接至内存(memory)的至少一个处理器，其中该至少一个处理器在执行时被配置为获取受试者的CRS风险状态，例如响应于基于免疫细胞的疗法(例如CAR表达细胞疗法(例如CAR19表达细胞疗法))，其中所述CRS风险状态包括以下(i)-(vii)。该方法包括：
例如响应基于免疫细胞的疗法(例如，CAR表达细胞疗法(例如，CAR19表达细胞疗法))获取受试者的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态由以下确定：
(i)获取IL-10水平或活性；
(ii)如果获取的IL-10水平或活性低于例如约12pg/ml的参照IL-10水平或活性，则将CRS风险状态鉴定为低；
(iii)任选地(例如，如果获取的IL-10水平或活性高于参照IFN-IL-10水平或活性)获取肿瘤负担水平；
(iv)任选地(例如，如果获取的IL-10水平或活性高于参照IL-10水平或活性)如果获取的肿瘤负担水平低于例如约51％的参照肿瘤负担水平，则将CRS风险状态鉴定为低；
(v)任选地(例如，如果获取的IL-10水平或活性高于参照IL-10水平或活性)如果获取的肿瘤负担水平高于例如约51％的参照肿瘤负担水平，则将CRS风险状态鉴定为高；
从而评估，例如预测受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险。
任何上述方法可以进一步包括，响应于CRS风险状态的确定，执行以下中的一个，两个或更多个(全部)：
将受试者鉴定为处于发展严重CRS的高风险或处于发展严重CRS的低风险；
施用改变剂量的CAR表达细胞疗法；
改变CAR表达细胞疗法的方案或时程；或
施用疗法以治疗CRS，例如选自以下一种或多种的疗法：IL-6抑制剂(例如抗IL-6受体抑制剂，例如托珠单抗)，血管活性药物，免疫抑制剂，皮质类固醇或机械通气；或
例如，对于处于发展严重CRS的高风险的受试者，施用替代疗法，例如特定癌症类型的标准护理。
在用于本文的用途的组合物实施方案中，一、二或更多(例如全部)：
响应于CRS风险状态的确定，将受试者鉴定为处于发展严重CRS的高风险或处于发展严重CRS的低风险中；
响应于CRS风险状态的确定，向受试者施用改变剂量的CAR表达细胞疗法；
响应于CRS风险状态的确定，改变CAR表达细胞疗法的方案或时程；
响应于CRS风险状态的确定，向受试者施用疗法以治疗CRS，例如选自以下一种或多种的疗法：IL-6抑制剂(例如托珠单抗)，血管活性药物，免疫抑制剂，皮质类固醇或机械通气；或
响应于CRS风险状态的确定，向受试者施用替代疗法，例如，用于具有发展严重CRS的高风险的受试者，例如特定癌症类型的标准护理。
另一方面，本发明的特征在于用于评估(例如预测)受试者发展CRS(例如严重CRS)的风险的试剂盒。试剂盒包括一组试剂，其特异性检测本文所述的一种或多种基因或蛋白质的水平或活性，例如选自：sgp130和IFN-γ；sgp130，IFN-γ和IL1Ra；sgp130，IFN-γ和MIP1-α；sgp130，IFN-γ，MIP1-α，嗜酸细胞活化趋化因子，IL-2，IL-10或IL-13或其组合；和使用所述试剂盒的说明书；
其中所述使用说明书规定，如果所检测的水平或活性中的一个或多个大于参照值，则受试者比具有在参照值处检测的水平或活性的受试者更可能发展CRS(例如，严重CRS)。
在又一方面，本发明的特征在于用于评估(例如预测)受试者发展细胞因子释放综合征(CRS)，例如严重CRS的风险的系统。该系统包括可操作地连接至内存(memory)的至少一个处理器，其中该至少一个处理器在执行时被配置为获取受试者的CRS风险状态，例如响应于基于免疫细胞的疗法(例如CAR表达细胞疗法(例如，CAR19表达细胞疗法))。在一些实施方案中，所述CRS风险状态包括本文所述的一、二、三、四、五、六、七或更多种(全部)生物标志物的量度。
在一些实施例中，响应于CRS风险状态的确定，系统执行以下中的一、二、三、四或更多个：
鉴定受试者处于发展严重CRS的高风险或发展严重CRS的低风险；
推荐选择或改变CAR表达细胞疗法的剂量(dosing)；
推荐选择或改变CAR表达细胞疗法的方案或时程；
推荐施用疗法以治疗CRS，例如IL-6抑制剂，如托珠单抗，血管活性药物，免疫抑制剂，皮质类固醇或机械通气；
推荐选择替代疗法，例如，用于严重CRS受试者，例如特定癌症类型的标准护理。
本文公开的前述方法的附加特征或实施方案，用于用途的组合物，试剂盒和系统包括以下中的一个或多个。
在方法，组合物用途，试剂盒和系统的一些实施方案中，CRS风险状态包括在受试者中(例如在样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或IL-13或其组合(例如sgp130，IFN-γ和IL-13的任何两种或全部三种的组合)的水平或活性的量度，例如其中受试者是成人或儿科受试者。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，CRS风险状态指示受试者是处于发展严重CRS的高风险还是低风险。例如，CRS可以是临床1-3级的CRS，或者可以是临床4-5级的严重CRS。
在一些实施方案中，所述方法在没有CRS症状(例如临床症状)例如低血压或发热中的一项或多项；或严重CRS，例如一种或多种器官毒性(例如4级器官毒性)或需要机械通气，的受试者上进行。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，高的IFN-γ，sgp130，MCP1，IL-10的水平或活性，或疾病负担，或其任何组合指示高风险的严重CRS。在一些实施方案中，低的IL13，IL1Ra，MIP1a或嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性或其任何组合指示高风险的严重CRS。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，患有严重CRS高风险的受试者具有或被鉴定为(例如，在样品，例如血液样品中)具有例如相对于参照例如与处于严重CRS的低风险的受试者相比较或与对照水平或活性相比较具有更高水平或活性的sgp130或IFN-γ或其组合。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的其他实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者具有或被鉴定为具有(例如，在样品例如血液样品中)例如相对于参照，更高的sgp130水平或活性，更高的IFN-γ水平或活性，或更低的IL1Ra水平或活性或其组合。在一个实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为具有更高的sgp130水平或活性和更高的IFN-γ水平或活性；更高的sgp130水平或活性和更低的IL1Ra水平或活性；更高的IFN-γ水平或活性和更低的IL1Ra水平或活性；或更高的sgp130水平或活性，更高的IFN-γ水平或活性，以及更低的IL1Ra水平或活性，例如相比于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或对照水平或活性。在一些实施方案中，参照是处于严重CRS的低风险的受试者或对照水平或活性。受试者可以是人，例如成人或儿科受试者。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者具有或被鉴定为具有在受试者中(例如在样品，例如血液样品中)更高的sgp130或IFN-γ水平或活性或其组合，以及更高的骨髓疾病水平，例如相对于参照，例如与处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比。在一个实施方案中，处于严重CRS高风险的受试者被鉴定为具有更高水平的sgp130和IFN-γ；sgp130和骨髓疾病；IFN-γ和骨髓疾病；或sgp130，IFN-γ和骨髓疾病，例如与参照例如处于严重CRS的低风险的受试者或对照水平或活性相比较。受试者可以是人，例如儿科受试者。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者(例如儿科受试者)被鉴定为具有(例如在样品，例如血液样品中)更高的sgp130的水平或活性、更高的IFN-γ的水平或活性，或更低的MIP1-α的水平或活性，或其组合，与参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比。在一个实施方案中，具有严重CRS高风险的受试者被鉴定为具有更高的sgp130水平或活性和更高的IFN-γ水平或活性；更高的sgp130的水平或活性和更低的MIP1-α水平或活性；更高的IFN-γ水平或活性和更低的MIP1-α水平或活性；或更高的sgp130水平或活性，更高的IFN-γ水平或活性，以及更低的MIP1-α水平或活性，例如与参照例如处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者具有或被鉴定为与参照例如处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比，(例如在样品，例如血液样品中)具有更高的sgp130水平或活性，更高的MCP1水平或活性，或更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性或它们的组合。在一些实施方案中，处于严重CRS的高风险中的受试者被鉴定为具有：更高的sgp130水平或活性和更高的MCP1水平或活性；更高的sgp130水平或活性以及更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；更高的MCP1水平或活性以及更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；或更高的sgp130水平或活性，更高的MCP1水平或活性以及更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；与参照例如与严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比较。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为与参照例如处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比，(例如在样品，例如血液样品中)具有改变的(例如更高的)IL-2水平或活性，更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性，或更高的sgp130水平或活性或其组合。在一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为具有：改变的(例如，更高的)IL-2的水平或活性和更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；改变的(例如更高的)IL-2水平或活性和更高的sgp130水平或活性；更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性以及更高的sgp130水平或活性；或改变的(例如更高的)IL-2水平或活性，更低的嗜酸细胞活化趋化因子的水平或活性，以及更高的sgp130水平或活性；相比于参照例如严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为与参照例如处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比，(例如在样品，例如血液样品中)具有更高的IFN-γ水平或活性，改变(例如更高)的IL-2的水平或活性，或更低的嗜酸细胞活化趋化因子的水平或活性，或其组合。在一些实施方案中，受试者是儿科受试者。在一些实施方案中，处于严重CRS高风险的受试者被鉴定为具有：更高的IFN-γ水平或活性，和改变的(例如更高的)IL-2水平或活性；更高的IFN-γ水平或活性，以及更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；改变的(例如更高的)IL-2的水平或活性和更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；或更高的IFN-γ水平或活性，改变的(例如更高的)IL-2的水平或活性，以及更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；相比于参照例如严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为与参照例如处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比，(例如在样品，例如血液样品中)具有更高的IL-10水平或活性或更高水平的疾病负担或其组合。在一些实施方案中，受试者是儿科受试者。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为与参照例如处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比，(例如在样品，例如血液样品中)具有更高的IFN-γ水平或活性或更低的IL-13水平或活性或其组合。在一些实施方案中，受试者是儿科受试者。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为与参照例如处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比，(例如在样品，例如血液样品中)具有更高的IFN-γ水平或活性，更低的IL-13水平或活性，更低的MIP1-α水平或活性或其组合。在一些实施方案中，受试者是儿科受试者。在一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为具有：更高的IFN-γ水平或活性，或更低的IL-13水平或活性；更高的IFN-γ水平或活性，或更低的MIP1-α水平或活性；更低的IL-13水平或活性或更低的MIP1-α水平或活性；或更高的IFN-γ水平或活性，更低的IL-13水平或活性，和更低的MIP1-α水平或活性；相比于参照例如严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较。在一些实施方案中，处于严重CRS的高风险中的受试者被鉴定为具有：更高的IFN-γ水平或活性和更低的IL-13水平或活性；更高的IFN-γ水平或活性和更低的MIP1-α水平或活性；更低的IL-13水平或活性和更低的MIP1-α水平或活性；或更高的IFN-γ水平或活性，更低的IL-13水平或活性，和更低的MIP1-α水平或活性；相比于参照例如严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为与参照例如处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比，(例如在样品，例如血液样品中)具有更高的IFN-γ水平或活性或更低的MIP1-α水平或活性，或其组合。在一些实施方案中，受试者是儿科受试者。
在一些实施方案中，例如在含有IL2，嗜酸细胞活化趋化因子和sgp130的3-生物标志物组中，或在含有IFN-γ，IL2和嗜酸细胞活化趋化因子的3-生物标志物组中(例如，在儿科患者中)，更高的IL2水平或活性指示受试者处于严重CRS的高风险中。在其他实施方案中，例如在2-生物标志物组中，例如对于儿科患者，更高的IL2水平或活性指示受试者处于严重CRS的低风险中。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，本文所述的更高水平的标志物是大于或等于1,2,5,10,20,50,100,200,500,1000,2000,5000,10,000,20,000,50,000,100,000,200,000,或500,000pg/ml。在一些实施方案中，更高水平的sgp130是大于或等于150,000,200,000,210,000,215,000,218,000,218,179,220,000,225,000,230,000,或250,000pg/ml。在一些实施方案中，更高水平的IFN-γ是大于或等于6,7,8,9,10,10.4272,10.5,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,27.6732,28,29,30,31,32,33,34,35,40,50,60,70,75,80,85,90,91,92,93,94,94.8873,95,96,97,98,99,100,105,110,115,或120pg/ml。在一些实施方案中，更高水平的IL-10是大于或等于5,6,7,8,9,10,11,11.7457,12,13,14,15,16,17,18,19,或20pg/ml。在一些实施方案中，更大的肿瘤负荷大于或等于25，30，35，40，45，50，51.9，55，60，65，70或75％。在一些实施方案中，更低水平的sgp130，IFN-γ，IL-10或肿瘤负荷是小于或等于本段中任何值的水平。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，本文所述的标志物的更低水平是大于或等于1,2,5,10,20,50,100,200,500,1000,2000,5000,10,000,20,000,50,000,100,000,200,000,或500,000pg/ml。在一些实施方案中，更低水平的IL1Rα小于或等于550,575,600,625,650,657.987,675,700,720,或750pg/ml。在一些实施方案中，更低水平的MCP1小于或等于3500,4000,4100,4200,4300,4400,4500,4600,4636.52,4700,4800,4900,5000,或5500pg/ml。在一些实施方案中，更低水平的嗜酸细胞活化趋化因子小于或等于0,21,22,23,24,25,26,27,28,29,29.0902,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,或40pg/ml。在某些实施方案中，更低水平的MIP1a小于或等于20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,30.1591,31,32,33,34,35,36,37,38,39或40pg/ml。在一些实施方案中，更高水平的IL1Rα，MCP1，嗜酸细胞活化趋化因子或MIP1a是大于或等于本段中任何值的水平。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，灵敏度为至少.75,0.79,0.80,0.82,0.85,0.86,0.90,0.91,0.93,0.95,0.96,0.97,0.98,0.99,或1.0。在一些实施方案中，特异性为至少0.75,0.77,0.80,0.85,0.86,0.89,0.90,0.92,0.94,0.95,0.96,0.97,0.98,0.99或1.0。在一些实施方案中，PPV为至少0.62,0.65,0.70,0.71,0.75,0.80,0.82,0.83,0.85,0.90,0.91,0.92,0.95,0.96,0.97,0.98,0.99或1.0。在一些实施方案中，NPV为至少0.80,0.85,0.90,0.92,0.94,0.95,0.96,0.97,0.98,0.99或1.0。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，嗜酸细胞活化趋化因子的量度包括嗜酸细胞活化趋化因子-1，嗜酸细胞活化趋化因子-2和嗜酸细胞活化趋化因子-3中的一种或多种(例如，两种或全部)的量度。在一些实施方案中，嗜酸细胞活化趋化因子的量度包括嗜酸细胞活化趋化因子-1和嗜酸细胞活化趋化因子-2，嗜酸细胞活化趋化因子-1和嗜酸细胞活化趋化因子-3或嗜酸细胞活化趋化因子-2和嗜酸细胞活化趋化因子-3的量度。
在方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的一些实施方案中，生物标志物在输注CAR表达细胞疗法的3天内测量，例如在输注后1、2或3天。在一些实施方案中，生物标志物包含IFN-γ和/或sgp130。
本文公开的任何方法可以进一步包括获得受试者中例如在来自受试者的样品(例如，血液样品)中一、二、三、四、五、十、二十种或更多种选自sTNFR2,IP10,sIL1R2,sTNFR1,M1G,VEGF,sILR1,TNFα,IFNα,GCSF,sRAGE,IL4,IL10,IL1R1,IFN-γ,IL6,IL8,sIL2Rα,sgp130,sIL6R,MCP1,MIP1α,MIP1β,或GM-CSF或其组合的细胞因子或细胞因子受体的水平或活性的量度的步骤。在一些实施方案中，患有严重CRS或具有严重CRS的高风险的受试者具有或被鉴定为具有相比于参照例如严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，更高的水平或活性的一种或多种(例如二、三、四、五、十、十五、二十种或更多种)选自下述的细胞因子或细胞因子受体：sTNFR2,IP10,sIL1R2,sTNFR1,M1G,VEGF,sILR1,TNFα,IFNα,GCSF,sRAGE,IL4,IL10,IL1R1,IFN-γ,IL6,IL8,sIL2Rα,sgp130,sIL6R,MCP1,MIP1α,MIP1β,或GM-CSF或其组合。
本文公开的任何方法可进一步包括获取受试者中，例如在来自受试者的样品(例如血液样品)中选自以下的一种，两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种或全部细胞因子或细胞因子受体的水平或活性的量度的步骤：IFN-γ,IL10,IL6,IL8,IP10,MCP1,M1G,sIL2Rα,GM-CSF,或TNFα或其组合。在一些实施方案中，患有严重CRS或具有严重CRS的高风险的受试者具有或被鉴定为具有相比于参照例如严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，更高的水平或活性的一种或多种(例如两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种或全部)选自下述的细胞因子或细胞因子受体：IFN-γ，IL10，IL6，IL8，IP10，MCP1，M1G，sIL2Rα，GM-CSF或TNFα或其组合。
本文公开的任何方法可进一步包括获取受试者中，例如在来自受试者的样品(例如血液样品)中选自以下的一种，两种，三种，四种，五种，六种或全部细胞因子或细胞因子受体的水平或活性的量度的步骤：IFN-γ，IL10，IL6，IL8，IP10，MCP1，M1G或sIL2Rα或其组合。在一些实施方案中，具有严重CRS或具有严重CRS的高风险的受试者具有或被鉴定为具有相比于参照例如严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，更高的水平或活性的一种或多种(例如两种，三种，四种，五种，六种或全部)选自下述的细胞因子或细胞因子受体：IFN-γ，IL10，IL6，IL8，IP10，MCP1，M1G或sIL2Rα或其组合。
在一些实施方案中，本文公开的任何方法可以进一步包括确定来自受试者的样品(例如血液样品)中C-反应蛋白(CRP)水平的步骤。在一个实施方案中，处于严重CRS的低风险中的受试者具有或被鉴定为具有小于7mg/dL(例如7、6.8、6、5、4、3、2、1mg/dL或更少)的CRP水平。在一个实施方案中，处于严重CRS的高风险的受试者具有或被鉴定为具有与处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比更高水平的CRP。在一个实施方案中，与处于严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比，更高的水平或活性至少高2倍(例如至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，100，500，1000倍或更高)。
在其他实施方案中，本文公开的方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统进一步包括基于获取的CRS风险状态选择或改变用于受试者的疗法例如CAR表达细胞疗法的步骤。在获取的CRS风险状态是受试者处于严重CRS的高风险的实施方案中，治疗被改变以使其停止，或者疗法(例如，CAR表达细胞)的后续(例如，第二，第三或第四)剂量的剂量低于先前的剂量，或者比如果患者没有处于严重CRS的高风险中施用的剂量低的剂量。在其他实施方案中，后续的(例如，第二，第三或第四)剂量的CAR表达细胞包含与施用于受试者的先前的CAR表达细胞疗法不同的CAR或不同的细胞类型。
在本文公开的方法，用于用途的组合物，试剂盒或系统的实施方案中，所述疗法是单独或与其他疗法组合的CAR表达细胞疗法。在实施方案中，疗法包含多种CAR表达免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)。在一些实施方案中，CAR表达细胞疗法包含CAR19疗法(例如，如本文所述的CTL019疗法)或由其组成。
在其他实施方案中，疗法是CD19抑制性或消耗性治疗，例如包括CD19抑制剂的疗法。在实施方案中，CD19-抑制或消耗治疗与CRS相关。在一些实施方案中，CD19抑制剂是CD19抗体，例如CD19双特异性抗体(例如靶向CD19的双特异性T细胞衔接物，例如blinatumomab)。在一些实施方案中，双特异性T细胞衔接物抗体分子是Bargou等人，“Tumorregression in cancer patients by very low doses of a T cell-engagingantibody”2008年8月15日；321(5891)：974-7.doi：10.1126/science.11 58545中描述的抗体分子。
在一些实施方案中，疗法包括表达CD19 CAR的细胞，例如CD19 CART细胞或抗CD19抗体(例如抗CD19单或双特异性抗体)或其片段或缀合物。在一个实施方案中，抗CD19抗体是如WO2014/153270(例如WO2014/153270的表3)中所述的人源化抗原结合结构域，其通过引用并入本文，或其缀合物。其它示例性抗CD19抗体或其片段或缀合物包括但不限于blinatumomab、SAR3419(Sanofi)、MEDI-551(MedImmune LLC)、Combotox、DT2219ARL(Masonic Cancer Center)、MOR-208(也称为XmAb-5574；MorphoSys)、XmAb-5871(Xencor)、MDX-1342(Bristol-Myers Squibb)、SGN-CD19A(Seattle Genetics)和AFM11(AffimedTherapeutics)。参见，例如，Hammer.MAbs.4.5(2012):571–77。博纳吐单抗是双特异性抗体，其由两个scFv组成，一个scFv结合CD19和一个scFv结合CD3。博纳吐单抗指导T细胞攻击癌细胞。参见，例如，Hammer等人；Clinical Trial Identifier No.NCT00274742和NCT01209286。MEDI-551是人源化抗CD19抗体，其具有被改造的Fc以具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。参见，例如，Hammer等人；和Clinical Trial IdentifierNo.NCT01957579。Combotox是结合CD19和CD22的免疫毒素的混合物。免疫毒素由scFv抗体片段融合至去糖基化的蓖麻毒蛋白A链组成。参见，例如，Hammer等人；和Herrera等人J.Pediatr.Hematol.Oncol.31.12(2009):936-41；Schindler等人Br.J.Haematol.154.4(2011):471-6。DT2219ARL是靶向CD19和CD22的双特异性免疫毒素，其包含两个scFv和截短的白喉毒素。参见，例如，Hammer等人；和Clinical Trial Identifier No.NCT00889408。SGN-CD19A是抗体-药物缀合物(ADC)，其由抗CD19人源化单克隆抗体连接合成的细胞毒性细胞杀伤物质，单甲基auristatin F(MMAF)组成。参见，例如，Hammer等人；和ClinicalTrial Identifier Nos.NCT01786096和NCT01786135。SAR3419是抗CD19抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过可切割接头与美登素衍生物缀合的抗CD19人源化单克隆抗体。参见，例如，Younes等人J.Clin.Oncol.30.2(2012):2776-82；Hammer等人；Clinical TrialIdentifier No.NCT00549185；和Blanc等人Clin Cancer Res.2011；17:6448-58。XmAb-5871是Fc工程化的、人源化的抗CD19抗体。参见，例如，Hammer等人。MDX-1342是具有增强的ADCC的人Fc-工程化的抗CD19抗体。参见，例如，Hammer等人。在实施方案中，抗体分子是双特异性抗CD19和抗CD3分子。例如，AFM11是靶向CD19和CD3的双特异性抗体。参见，例如，Hammer等人；和Clinical Trial Identifier No.NCT02106091。在一些实施方案中，本文所述的抗CD19抗体与治疗剂缀合或以其它方式结合，所述治疗剂，例如化疗剂、肽疫苗(如在Izumoto等人2008J Neurosurg 108：963-971中所述的)、免疫抑制剂、或免疫消融剂，例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、FK506、CAMPATH、抗CD3抗体、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228或细胞因子。
在本文公开的方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的实施方案中，癌症例如血液学癌症与CD19表达相关。示例性癌症例如血液癌症包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，B细胞早幼粒细胞白血病，胚细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，GC(生发中心)-DLBCL，NGC(非生发中心)-DLBCL，转化FL，双重打击DLBCL(double hit DLBCL)，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆胚细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤和瓦尔登斯特隆巨球蛋白血症。在一个实施方案中，癌症选自CLL，ALL或B-ALL中的一种或多种。在一个实施例中，受试者具有CLL。在另一个实施方案中，受试者具有ALL。在另一个实施方案中，受试者具有B细胞ALL。
在本文公开的方法，用于用途的组合物，试剂盒和系统的其他实施方案中，从受试者的样品(例如血液样品)获取一种或多种生物标志物(例如(i)-(xi)的一种或多种生物标志物)的测量。在一些实施方案中，受试者，例如来自受试者的样品在接受CAR表达细胞疗法的同时评估。在其他实施方案中，受试者，例如来自受试者的样品，在接受CAR表达细胞疗法后进行评估。例如，受试者，例如来自受试者的样品，在用CAR表达细胞疗法输注后10天或更短时间(例如1-10天，1-9天，1-8天，1-7天，1-6天，1-5天，1-4天，1-3天，1-2天，5天或更少，4天或更少，3天或更少，2天或更少，1天或更少，例如1，3，5，10，12，15，20小时)后进行评估。在一些实施方案中，受试者在5天或更少，4天或更少，3天或更少，2天或更少，1天或更少(例如但不早于CAR表达疗法输注后1，3，5，10，12，15，20小时)评估。在其他实施方案中，一种或多种生物标志物的量度包括一种或多种核酸(例如mRNA)水平或蛋白水平的检测。
在本文所述的任何方法或用于用途的组合物中，在一些实施方案中，CAR表达细胞(例如CD19 CAR-表达细胞或BCMA CAR-表达细胞)的剂量包含约104至约109个细胞/kg，例如约104至约105细胞/kg，约105至约106细胞/kg，约106至约107细胞/kg，约107至约108细胞/kg或约108至约109细胞/kg；或者至少大约以下之一：1x107，1.5x107，2x107，2.5x107，3x107，3.5x107，4x107，5x107，1x108，1.5x108，2x108，2.5x108，3x108，3.5x108，4x108，5x108，1x109，2x109或5x109细胞。在一些实施方案中，CAR表达细胞(例如CD19 CAR-表达细胞)的剂量包含至少约1-5x107至1-5x108个CAR表达细胞。在一些实施方案中，向受试者施用大约1-5×107CAR-表达细胞(例如CD19 CAR-表达细胞)。在其他实施方案中，向受试者施用约1-5×108CAR表达细胞(例如CD19 CAR表达细胞)。
在实施方案中，根据给药方案将CAR表达细胞(例如CD19 CAR-表达细胞或BCMACAR-表达细胞)施用受试者，所述给药方案包含通过剂量分级施用受试者的总细胞剂量，例如一次，两次，三次或更多次分开施用部分剂量。在实施方案中，在治疗的第一天施用总剂量的第一百分比，在治疗的后续(例如第二，第三，第四，第五，第六或第七或更晚)日施用总剂量的第二百分比，并且任选地，在治疗的后续(例如，第三，第四，第五，第六，第七，第八，第九，第十，更晚)日施用总剂量的第三百分比(例如，剩余百分比)。例如，在治疗的第一天递送10％的细胞总剂量，第二天递送30％的细胞总剂量，并且第三天递送总剂量的剩余60％的细胞总剂量。例如，总细胞剂量包括1至5×107或1至5×108CAR表达细胞(例如CD19CAR表达细胞或BCMA CAR表达细胞)。
另一方面，本发明的特征在于确定受试者是否具有严重CRS的方法。该方法包括例如响应于基于免疫细胞的疗法(例如，CAR表达细胞疗法(例如CAR19表达细胞疗法))来获取受试者的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态包括测量以下的一个，两个或更多(全部)：
(i)样品(例如血液样品)中选自sTNFR2，IP10，sIL1R2，sTNFR1，M1G，VEGF，sILR1，TNFα，IFNα，GCSF，sRAGE，IL4，IL10，IL1R1，IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β或GM-CSF的一种或多种(例如，3，4，5，10，15，20种或更多种)细胞因子或细胞因子受体，或选自C反应蛋白(CRP)，铁蛋白，乳酸脱氢酶(LDH)，天冬氨酸转氨酶(AST)或血液尿素氮(BUN)，丙氨酸转氨酶(ALT)，肌酸酐(Cr)或纤维蛋白原或其组合的分析物的水平或活性；
(ii)样品(例如血液样品)中IL6，IL6R或sgp130或其组合(例如，IL6，IL6R和sgp130中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性；或
(iii)样品(例如血液样品)中的IL6，IFN-γ或IL2R或其组合(例如，IL6，IFN-γ和IL2R中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性；
其中该值指示受试者的严重CRS状态。
在实施方案中，细胞因子或细胞因子受体(i)-(iii)或除纤维蛋白原之外的所有分析物的升高水平指示严重的CRS。在实施方案中，低纤维蛋白原指示严重的CRS。
另一方面，本发明的特征在于用于评估(例如预测)受试者发展细胞因子释放综合征(CRS)例如严重CRS的风险的试剂盒。该试剂盒包括一组特异性检测选自以下的一种或多种基因或蛋白质的水平或活性的试剂：sgp130和IFN-γ；sgp130，IFN-γ和IL1Ra；或sgp130，IFN-γ和MIP1-α；sgp130，MCP1和嗜酸细胞活化趋化因子；IL2，嗜酸细胞活化趋化因子和sgp130；IFN-γ，IL2和嗜酸细胞活化趋化因子；IFN-γ和IL-13；或IFN-γ，IL-13和MIP1-α；或其组合；和使用所述试剂盒的说明书。在实施方案中，使用说明书提供，如果检测到的IFN-γ，sgp130或MCP1的水平或活性中的一种或多种大于参照值，和/或如果检测到的IL-13，IL1Rα，MIP1α或嗜酸细胞活化趋化因子的水平或活性中的一种或多种小于参照值时，受试者比具有在参照值处检测到的水平或活性的受试者更可能发展CRS(例如，严重CRS)。
在一些实施方案中，所述一种或多种基因还包含sTNFR2，IP10，sIL1R2，sTNFR1，M1G，VEGF，sILR1，TNFα，IFNα，GCSF，sRAGE，IL4，IL10，IL1R1，IL6，IL8，sIL2Rα，sIL6R，MCP1，MIP1β或GM-CSF中的一种或多种。试剂盒可以包括反应混合物，其包括提取缓冲液/试剂，扩增缓冲液/试剂，杂交缓冲液/试剂或标记缓冲液/试剂中的一种或多种。
在上述试剂盒的一些实施方案中，该组试剂检测来自所述基因组的基因产物(例如，表达的mRNA)的水平。例如，该组试剂包括与从所述基因组表达的mRNA互补的核酸探针(例如cDNA或寡核苷酸)。与mRNA互补的核酸探针可以固定在基底表面上。
在上述试剂盒的其他实施方案中，该组试剂检测由所述基因组编码的多肽的表达。在一些实施方案中，试剂包含抗体分子，例如非人抗体分子。非人抗体分子可以识别人蛋白质，例如sgp130和IFN-γ；sgp130，IFN-γ和IL1Ra；或sgp130，IFN-γ和MIP1-α；sgp130，MCP1和嗜酸细胞活化趋化因子；IL2，嗜酸细胞活化趋化因子和sgp130；IFN-γ，IL2和嗜酸细胞活化趋化因子；IFN-γ和IL-13；或IFN-γ，IL-13和MIP1-α中的一种或多种；或其任何组合。
在某些实施方案中，例如涉及决策树的系统和方法，例如具有生物标志物的决策树，该方法在CRS风险状态首先被识别为例如高或低CRS风险状态时结束。在实施方案中，该方法包括按以下顺序执行以下步骤：(i)和(ii)；(i)，(ii)和(iii)；(i)，(ii)，(iii)和(iv)；(i)，(ii)，(iii)，(iv)和(v)；(i)，(ii)，(iii)，(iv)，(v)和(vi)；(i)，(ii)，(iii)，(iv)，(v)和(vii)；或(i)，(ii)，(iii)，(iv)，(v)，(vi)和(vii)。在实施方案中，执行步骤(i)，(iii)和(v)。在一个实施方案中，同时执行步骤(i)，(iii)和(v)。在一个实施例中，基本上同时执行步骤(i)，(iii)和(v)。在一个实施方案中，步骤(i)，(iii)和(v)在同一天或彼此的1，2，3，4，6，12或24小时内执行。在实施方案中，该方法包括在执行步骤(i)，(iii)和(v)之后，按以下顺序执行以下步骤：(ii)；(ii)和(iv)；(ii)，(iv)和(vi)；(ii)，(iv)和(vii)；或(ii)，(iv)，(vi)和(vii)。
在某些实施方案中，例如涉及决策树(例如具有两个生物标志物的决策树)的系统和方法，该方法在CRS风险状态首先被识别为例如高或低CRS风险状态时结束。在实施方案中，该方法包括按以下顺序执行以下步骤：(i)和(ii)；(i)，(ii)和(iii)；(i)，(ii)，(iii)和(iv)；(i)，(ii)，(iii)和(v)；或(i)，(ii)，(iii)，(iv)和(v)。在实施方案中，执行步骤(i)和(iii)。在实施方案中，同时执行步骤(i)和(iii)。在一个实施方案中，基本上同时执行步骤(i)和(iii)。在一个实施方案中，步骤(i)和(iii)在同一天进行，或者在彼此的1，2，3，4，6，12或24小时内进行。在实施方案中，所述方法包括在执行步骤(i)和(iii)之后，按以下顺序执行以下步骤：(ii)；(ii)和(iv)；(ii)和(v)；或(ii)，(iv)和(vi)。
在一些实施方案中，本文的系统和方法包括执行回归分析。在一些实施方案中，本文的系统和方法包括执行决策树分析。在一些实施方案中，本文的系统和方法包括获得细胞因子或细胞因子受体水平(而不是活性)。
另一方面，本发明的特征在于用于评估(例如预测)受试者发展细胞因子释放综合征(CRS)，例如严重CRS的风险的系统。该系统包括可操作地连接至内存的至少一个处理器，其中该至少一个处理器在执行时被配置为获取受试者的CRS风险状态，例如响应于基于免疫细胞的疗法(例如CAR表达细胞疗法(例如CAR19表达细胞疗法))，其中所述CRS风险状态包括以下中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多(全部)量度：
(i)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，可溶性gp130(sgp130)或干扰素-γ(IFN-γ)或其组合的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(ii)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，sgp130，IFN-γ或IL1Ra或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和IL1Ra中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(iii)在样品(例如血液样品)中sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，和受试者中骨髓疾病的水平，例如其中受试者是儿科受试者；
(iv)在样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或MIP1-α或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和MIP1-α中任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(v)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vi)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL-2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130或其组合(例如，I-L2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(viii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL10的水平或活性和在受试者中的疾病负担水平或其组合，例如其中受试者是儿科受试者；
(ix)在受试者中IFN-γ或IL-13或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(x)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ，IL-13或MIP1-α或其组合(例如IFN-γ，IL-13和MIP1-α中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；或(xi)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ或MIP1-α或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者。
在一些实施方案中，响应于CRS风险状态的确定，执行以下中的一个，两个，三个，四个或更多个：
将受试者鉴定为处于发展严重CRS的高风险或发展严重CRS的低风险；
推荐选择或改变CAR表达细胞疗法的剂量；
推荐选择或改变CAR表达细胞疗法的方案或时程；
推荐施用疗法以治疗CRS，例如IL-6抑制剂，如托珠单抗，血管活性药物，免疫抑制剂，皮质类固醇或机械通气；
推荐选择替代疗法，例如，用于严重CRS受试者，例如特定癌症类型的标准护理。
在一些实施方案中，该系统用于评估受试者中的癌症，例如本文所述的血液癌症。在一些实施方案中，癌症与CD19表达相关。例如，癌症可以选自CLL，ALL或B-ALL。
在本文所述系统的实施方案中，CAR表达细胞疗法包含多个CAR表达免疫效应细胞，例如如本文所述。例如，CAR表达细胞疗法包含CAR19疗法(例如，CTL019疗法)或由其组成。
在一些方面，本公开提供了一种用于评估受试者中的癌症例如血液癌症的系统，该系统包括可操作地连接至内存的至少一个处理器，所述至少一个处理器在执行时被配置为执行任何一个或多个例如上面列举的本文所述的步骤。
在一些方面，本公开内容提供了治疗GC(生发中心)-DLBCL，NGC(非生发中心)-DLBCL，转化的FL或双重打击DLBCL的方法，其包括向需要其的患者施用CD19 CAR-表达细胞从而治疗GC-DLBCL，NGC-DLBCL，转化的FL或双重打击DLBCL。
在一些实施方案中，CD19 CAR(或编码它的核酸)包含表3，表4，表5，表6或表7中任一个中提出的序列。在实施方案中，CD19 CAR是CTL019。在实施方案中，双重打击DLBCL是具有影响MYC/8q24基因座的染色体断点和第二癌基因基因座并由滤泡淋巴瘤的转化或从头发生的DLBCL。在实施方案中，DLBCL是CD19+DLBCL。在实施方案中，DLBCL是I，II，III或IV期。在实施方案中，DLBCL具有骨髓受累。在实施方案中，DLBCL是GC-DLBCL或NGC-DLBCL。在实施方案中，第二癌基因座是BCL2或BCL6。在实施方案中，患者在施用CD19 CAR-表达细胞之前接受淋巴消耗化疗。在实施方案中，施用单剂量的CD19 CAR表达细胞。在实施方案中，患者经历CRS。在实施方案中，患者经历应答，例如完全应答。在实施方案中，CD19 CAR表达细胞(例如CTL019细胞)以约5×108个细胞的剂量施用，例如约4-6×108个细胞。在实施方案中，CD19 CAR表达细胞(例如CTL019细胞)以约5-7x106个细胞/kg的剂量施用。在实施方案中，CD19 CAR表达细胞(例如CTL019细胞)以约2×108个细胞的剂量施用，例如约1-3×108个细胞。在实施方案中，CD19 CAR表达细胞(例如CTL019细胞)以约3x106个细胞/kg，例如约2-4x106个细胞/kg的剂量施用。
在一些方面，本公开内容提供了区分受试者中的CRS和脓毒症的方法，包括获取以下中的一个或多个的量度：
(i)GM-CSF，HGF，IFN-γ，IFN-α，IL-10，IL-15，IL-5，IL-6，IL-8，IP-10，MCP1，MIG，MIP-1β，sIL-2Rα，sTNFRI和sTNFRII中一种或多种(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或全部)的水平或活性，其中高于参照的水平或活性指示CRS；或
(ii)CD163，IL-1β，sCD30，sIL-4R，sRAGE，sVEGFR-1和sVEGFR-2的一种或多种(例如2，3，4，5，6种或全部)的水平或活性，其中高于参照的水平或活性指示脓毒症。
在实施方案中，该方法包括如果该量度指示CRS则施用治疗CRS的疗法。在实施方案中，所述方法包括如果量度指示脓毒症，则施用治疗脓毒症的疗法。
在一些方面，本公开还提供了用于区分患者中的CRS和脓毒症的试剂盒，所述试剂盒包含一组试剂，其特异性检测一种或多种(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22或全部)选自以下的基因或蛋白质的水平或活性：
GM-CSF，HGF，IFN-γ，IFN-α，IL-10，IL-15，IL-5，IL-6，IL-8，IP-10，MCP1，MIG，MIP-1β，sIL-2Rα，sTNFRI，sTNFRII，CD163，IL-1β，sCD30，sIL-4R，sRAGE，sVEGFR-1和sVEGFR-2；和
使用所述试剂盒的说明书；
其中所述使用说明书提供，如果检测到的GM-CSF，HGF，IFN-γ，IFN-α，IL-10，IL-15，IL-5，IL-6，IL-8，IP-10，MCP1，MIG，MIP-1β，sIL-2Rα，sTNFRI或sTNFRII的水平或活性中的一个或多个(例如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或全部)大于参照值时，受试者可能具有CRS，
和/或如果检测到的CD163，IL-1β，sCD30，sIL-4R，sRAGE，sVEGFR-1或sVEGFR-2的水平或活性中的一个或多个(例如2，3，4，5，6或全部)大于参照值时，受试者可能具有脓毒症。
在一些方面中，本公开还提供了一种反应混合物，包含：
一组试剂，其特异性检测一种或多种(例如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23或全部)选自以下的基因或蛋白质的水平或活性：GM-CSF，HGF，IFN-γ，IFN-α，IL-10，IL-15，IL-5，IL-6，IL-8，IP-10，MCP1，MIG，MIP-1β，sIL-2Rα，sTNFRI，sTNFRII，CD163，IL-1β，sCD30，sIL-4R，sRAGE，sVEGFR-1和sVEGFR-2，和
生物样品，例如血液样品。
在实施方案中，生物样品来自用CAR表达细胞疗法治疗和/或具有CRS和/或脓毒症症状的受试者。
在某些方面，本公开内容还提供了鉴定受试者脓毒症的方法，包括获取以下一种或多种的量度：
(i)一种或多种(例如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22或全部)ANG2，GCSF，IFNα，IL1RA，IL4，IL6，MIG，MIP1α，PTX3，TNFα，sCD163，sCD30，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-2Rα，sIL-4R，sRAGE，sTNFRI，sTNFRII，sVEGFR1，sVEGFR2，sVEGFR3和VEGF的水平或活性，其中相对于参照更大的水平或活性指示脓毒症；
(ii)一种或多种(例如，两种)IL13和RANTES的水平或活性，其中相对于参照更低的水平或活性指示脓毒症。
在一些方面，本公开提供治疗神经毒性，CRS或后可逆性脑病综合征(PRES)中的一种或多种的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的环磷酰胺。在相关方面，本公开内容提供了环磷酰胺用于治疗神经毒性，CRS或后部可逆性脑病综合征(PRES)。在实施方案中，环磷酰胺的施用在基于细胞的疗法之后进行，例如基于细胞的癌症疗法，CD19抑制疗法或CD19消耗疗法，或者受试者先前已经用基于细胞的疗法治疗，例如基于细胞的癌症疗法，CD19-抑制疗法或CD19-消耗疗法。在实施方案中，环磷酰胺的施用在基于细胞的疗法之前，同时或之后。
在实施方案中，患者具有或被鉴定为具有CRS，PRES或两者。在一些实施方案中，受试者已经用CD19抑制或消耗疗法治疗。在一些实施方案中，CD19抑制剂是CD19抗体，例如CD19双特异性抗体(例如靶向CD19的双特异性T细胞衔接物，例如blinatumomab)。在一些实施方案中，疗法包含CAR表达细胞，例如抗BCMA CAR或抗CD19 CAR。在实施方案中，患者患有神经毒性，例如局灶缺陷(例如，脑神经麻痹或轻偏瘫)或全身异常(例如全身性癫痫发作，混乱)或癫痫持续状态。在实施方案中，受试者不具有CRS的任何临床症状。在实施方案中，受试者具有CRS的一种或多种临床症状。在实施方案中，受试者具有或被鉴定为具有相对于参照，例如比用CAR表达细胞治疗之前受试者的IL-6水平升高的IL-6。在实施方案中，受试者具有或被鉴定为具有相对于参照与CRS(例如IL-6和/或IL-8)相关的细胞因子或细胞因子受体的升高的血清水平。在实施方案中，受试者具有或被鉴定为具有相对于参照与CRS相关的细胞因子或细胞因子受体(例如CSF IL-6和/或IL-8)的升高的水平。在实施方案中，受试者被治疗或已经用CRS的疗法如托珠单抗或皮质类固醇(例如(甲基泼尼松龙，氢化可的松或二者)治疗。在实施方案中，受试者具有或被鉴定为具有循环的，活化的CAR表达细胞的增加。在实施方案中，受试者具有或被鉴定为具有CSF中的CAR表达细胞。在实施方案中，与环磷酰胺治疗之前相比，在环磷酰胺治疗后，受试者具有在循环中减少数量的CAR表达细胞。在实施方案中，减少数量的CAR表达细胞是非零数字，例如可检测数量。
在一些方面，本公开提供评估(例如预测)受试者对IL6受体抑制剂(例如托珠单抗)的反应性的方法，包括评估受试者的IL-6R基因型，其中与低sIL-6R水平相关的基因型指示对IL6受体抑制剂(例如托珠单抗)的敏感性。在一些方面，本公开内容还提供评估(例如预测)受试者对IL6受体抑制剂(例如托珠单抗)的反应性的方法，包括评估受试者的sIL-6R水平，其中sIL-6R水平低于参照水平指示对IL6受体抑制剂(例如托珠单抗)的敏感性。
在一些实施方案中，受试者处于患有或预计发展CRS的风险中(例如，具有如本文所述的改变的生物标志物水平)。
在一些实施方案中，受试者已经用CD19抑制或消耗疗法进行治疗。
在一些实施方案中，该方法进一步包括用CD19抑制或消耗疗法来治疗受试者。在一些实施方案中，CD19抑制剂是CD19抗体，例如CD19双特异性抗体(例如靶向CD19的双特异性T细胞衔接物，例如blinatumomab)。在一些实施方案中，治疗剂包含CD19 CAR表达细胞，例如本文所述的CD19 CAR表达细胞。
在一些实施方案中，在施用CD19抑制剂或消耗疗法之前或之后测试受试者的IL-6R基因型或sIL-6R水平。在一些实施方案中，在受试者发展CRS之前或之后或在被鉴定为具有CRS之前或之后，测试IL-6R基因型或sIL-6R水平。
在一些实施方案中，评估受试者的IL-6R基因型包括确定受试者在rs2228145处的基因型。在实施方案中，在rs2228145处具有A/A单元型的受试者被鉴定为对IL6受体抑制剂(例如托珠单抗)敏感。
在实施方案中，受试者(例如，被鉴定为对IL6受体抑制剂如托珠单抗敏感的受试者)用IL6受体抑制剂如托珠单抗治疗。在实施方案中，受试者(例如被鉴定为具有降低的对IL6受体抑制剂如托珠单抗的敏感性的受试者)用除IL6受体抑制剂以外(例如除托珠单抗之外)的CRS疗法治疗。在实施方案中，除了IL6受体抑制剂以外的CRS疗法包含巴多昔芬，sgp130阻断剂，血管活性药物，皮质类固醇，免疫抑制剂或机械通气。在实施方案中，与对于被鉴定为对IL6受体抑制剂敏感的受试者的正常治疗过程相比，受试者(例如，被鉴定为对IL6受体抑制剂如托珠单抗具有降低的敏感性的受试者)用一种或多种另外的剂量或较高剂量的IL6受体抑制剂(例如托珠单抗)治疗。在一些实施方案中，被鉴定为对IL6受体抑制剂的敏感性降低的受试者用至少2，3或4个剂量的IL6受体抑制剂例如托珠单抗治疗。
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或检验本发明，然而现在描述合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，所述材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。标题、副标题或编号或字母编号的要素，例如，(a)、b)、(i)等，仅为了易于阅读而展示。使用本文件中的标题或编号或字母编号的要素不要求步骤或要素按字母顺序进行并且该步骤或要素必然地彼此独立。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从权利要求书中显而易见。
附图的简要说明
图1描绘了说明用于预测严重CRS的双基因组(sgp130和IFN-γ)灵敏度和特异性的接受者工作特征(ROC)曲线。灵敏度是指真正的阳性率；特异性是指假阳性率。PPV＝阳性预测值(精度)。Sens＝12/14表示有14个真正的阳性，测试正确地预测了它们中的12个。Spec＝30/35表示有35个真正的阴性，并且测试正确地预测了它们中的30个。
图2描绘了显示在组合群组中用于预测严重CRS的三基因组(sgp130，IFN-γ和IL1Ra)灵敏度和特异性的ROC曲线。灵敏度是指真正的阳性率；特异性是指假阳性率。PPV＝阳性预测值(精度)。Sens＝12/14表示有14个真正的阳性，测试正确地预测了他们中的12个。Spec＝31/35表示有35个真正的阴性，并且测试正确地预测了它们中的31个。数据的替代分析显示sens＝13/14和spec＝27/35。分析来自输注后的前3天的细胞因子，在患者发展严重CRS之前发送。使用Logistic和分类树模型来开发严重CRS的预测因子。利用通过正向选择发现的3变量回归模型，使用IFNγ，sgp130和IL1RA准确预测了哪些患者发展了严重的CRS。
图3描绘了在评估图2的3标记组时可以使用的决策树。指示了该决策树的灵敏度、特异性、PPV和NPV。
图4描绘了基于组合群组的分析在评估包含sgp130，MCP1和嗜酸细胞活化趋化因子的3标记组时可以使用的决策树。指示了该决策树的灵敏度、特异性、PPV和NPV。
图5描绘了显示儿科患者中一组IFN-γ和IL-13的灵敏度和特异性的ROC曲线。指示了该组的灵敏度、特异性、PPV和NPV。
图6描绘了显示儿科患者中一组IFN-γ，IL-13和MIP1a的灵敏度和特异性的ROC曲线。指示了该组的灵敏度、特异性、PPV和NPV。
图7描绘了显示用于预测严重CRS的一组sgp130，IFN-γ和疾病负担评估的灵敏度和特异性的ROC曲线。灵敏度是指真正的阳性率；特异性是指假阳性率。PPV＝阳性预测值(精度)。Sens＝10/11有11个真正的阳性，测试正确地预测了它们中的10个。Spec＝24/26表示有26个真正的阴性，并且测试正确地预测了它们中的24个。
图8描绘了当评估包含IFN-γ(在两步)和MIP1a的组(例如在儿科患者中)时可以使用的决策树。指示了该决策树的灵敏度、特异性、PPV和NPV。仅在儿科群组中，在输注前立即收集骨髓抽吸物。发现疾病负担与CRS严重性相关联，但并未改善模型相对于单独细胞因子的预测准确性。
图9描绘了当评估包含IL-10和肿瘤负担的组(例如在儿科患者中)时可以使用的决策树。指示了该决策树的灵敏度、特异性、PPV和NPV。使用决策树建模的单细胞因子IL10和疾病负担的组合对于CRS预测是非常准确的。在一些实施方案中，疾病负担阈值<51.9％，如图所示，并且在其他实施方案中，疾病负担阈值<50％。
图10描绘了可以在其上实践各个方面和实施方案的计算机系统的示例性框图。
图11A，11B，11C和11D描绘了CTL019输注后的第一个月期间相比于CRS0-3与CRS4-5高度相关的24种细胞因子的峰值水平，其通过Holm-Bonferroni调整的p值显著。在用CTL019治疗的51名患者中进行43种细胞因子的系列细胞因子评估。在发展严重CRS的患者与未发展CRS的患者中比较细胞因子概况。这些图描绘了第一个月的细胞因子峰值。与CRS0-3相比，24种细胞因子(包括IFNγ、IL6、IL8、sIL2Rα、sgp130、sIL6R、MCP1、MIP1α和GM-CSF)与CRS4-5高度相关，其对Holm调整的p值显著。
图12A，12B，12C和12D描绘了CTL019输注后第一个月期间19种细胞因子的峰值水平，与CRS0-3相比，CRS4-5没有差异性升高。
图13A和13B描绘了预期在HLH(图13A和13B各自的左侧)中升高的细胞因子，预期在一些HLH患者中升高且在其他患者中正常的细胞因子(图13A和13B中的每一个的中部)和预期在HLH中正常的细胞因子(图13A和13B各自的右侧)。先前已在儿童巨噬细胞活化综合征(MAS)/噬血细胞综合征(HLH)中研究了19种测试的细胞因子。与CRS0-3相比，几乎相同模式的HLH中差异性升高的细胞因子也在CRS4-5患者中升高。这些图描绘了被分簇为三组的细胞因子。预期包括IFNg，IL10，IL6，IL8，IP10，MCP1，MIP1B和IL2RA在内的左侧的那些会在HLH中升高，并且也发现在严重CRS患者中有不同的升高。发现包括TNF-α和GM-CSF在内的中间的那些在一些HLH患者中升高而在其他患者中正常。在右侧的那些是预期在HLH中正常的细胞因子。*＝通过霍尔姆调整具有统计学显著性(图13A)以线性标度呈现的数据。(图13B)以log10标度呈现的数据。
图14指示托珠单抗改善严重CRS患者的高细胞因子血症。51名患者中有14例发展了严重CRS，并全部接受托珠单抗治疗。细胞因子连续测量。该图描述了从输注当天开始第一个月的细胞因子水平。散列线描绘了托珠单抗给药的时间。托珠单抗治疗后，IL6(三角形)瞬间升高，随后迅速下降。大多数患者在托珠单抗给药后，INFγ(x's)也迅速下降。在托珠单抗后，所有患者的sIL6R升高，大多数患者的sgp130水平升高。
图15描绘了来自正常供体，由于脓毒症而入住ICU时的儿科患者以及由于CRS而入住ICU的72小时内的ALL患者的血清中的sCD163和IP10。CRS群组中的空心圆圈指示患有脓毒症的患者。
图16是描述经历CRS的患者中的血清IL-6水平，CSF IL-6水平，患者温度和CART-BCMA频率的时程。
详细说明
细胞因子释放综合征(CRS)是基于免疫细胞的疗法(例如CAR T细胞治疗)的严重且常见的不良副作用。严重的CRS是潜在的危及生命的毒性。响应于基于免疫细胞的疗法的CRS的诊断和管理常规是基于临床参数和症状，例如参见Lee，D等人(2014)Blood 124(2)：188-195所述的CRS分级量表。在本发明之前，CRS预测性细胞因子或细胞因子受体的鉴定在患有癌症的患者中特别具有挑战性，其中基线炎性细胞因子水平由于其潜在疾病而很高。因此，需要鉴定预测CRS的生物标志物(例如，基因产物(例如，多肽、基因表达和/或蛋白质表达谱)或其他分析物)。
本文的公开内容至少部分基于这样的发现，即在治疗过程期间，例如基于免疫细胞的疗法(例如CAR T细胞治疗)，若干生物标志物可以在早期准确地预测CRS。生物标志物的这种早期检测可以发生在受试者表现出CRS症状或生病之前，例如在CAR T细胞给药的第一个10、9、8、7、6、5、4、3、2、1天或更少)。如本文所述，相比于较不严重的CRS(CRS等级0-3)，24种细胞因子和细胞因子受体，包括sTNFR2、IP10、sIL1R2、sTNFR1、M1G、VEGF、sILR1、TNFα、IFNα、GCSF、sRAGE、IL4、IL10、IL1R1、IFN-γ、IL6、IL8、sIL2Rα、sgp130、sIL6R、MCP1、MIP1α、MIP1β和GM-CSF与严重CRS(CRS等级4-5)相关。在一些实施方案中，两种细胞因子sgp130和IFNγ与严重CRS的发展密切相关。在成人和儿科受试者的实施方案中，可以使用IFN、sgp130和IL1Ra进行严重CRS的准确早期预测。在儿科患者的实施方案中，可以使用IFNγ、IL13和MIP1α；或使用sgp130、IFNγ和疾病负担评估进行严重CRS的准确早期预测。本文还描述了其他组。
因此，本文提供了用于评估受试者，例如预测受试者发展CRS(例如，严重CRS)的风险的方法，系统和试剂盒，以及治疗患有癌症的受试者的方法，包括评估受试者发展CRS(例如严重的CRS)的风险。本文描述的方法有利地提供了用免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)疗法(例如CAR T细胞)治疗的受试者具有发展严重CRS的高可能性的早期和准确识别(例如，预测)。由于可以在受试者生病之前进行预测，因此本文的方法允许可以降低发病率或死亡率的早期干预。预测哪些受试者在其发展CRS之前可能发展成严重CRS的能力有助于减轻毒性。例如，细胞因子导向疗法可以在CRS发展之前或CRS发展后立即(但在受试者患上危重症之前)开始。被鉴定为可能发展为严重CRS的受试者也可以进行更密切的监测，以允许早期开始积极的支持治疗。另一方面，预测哪些受试者不可能发展严重CRS的能力可以防止不必要的早期住院和/或暴露于不需要的细胞因子导向疗法。因此，本文描述的使用少量细胞因子和细胞因子受体以高敏感性和特异性预测CRS严重性的方法，系统和试剂盒在临床上是有用的，并且提供了优于现有治疗方式的优点。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
术语“一个”是指物体的语法对象中的一个或多于一个(即至少一个)。作为示例，“元素”是指一个元素或多于一个元素。
当涉及诸如量，持续时间等的可测量值时，术语“约”意在包括±20％的变化或在某些情况下±10％，或在某些情况下±5％，或在某些情况下为±1％，或在某些情况下为指定值的±0.1％，因为这些变化适用于实施公开的方法。
本文使用的术语“获取”是指通过“直接获取”或“间接获得”物理实体或值，获得物理实体(例如，样品，多肽，核酸或序列)或值，例如数值的占有。“直接获取”是指执行方法(例如，执行合成或分析方法)以获得物理实体或值。“间接获取”是指从另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的第三方实验室)接收物理实体或值。直接获取物理实体包括执行包括物理物质(例如起始材料)的物理变化的方法。示例性变化包括从两种或更多种起始材料制造物理实体，剪切或分裂物质，分离或纯化物质，将两个或更多个分离的实体组合成混合物，进行包括断裂或形成共价或非共价键的化学反应。直接获取值包括执行包括样品或其他物质的物理变化的方法，例如，执行包括物质，例如样品，分析物或试剂的物理变化的分析过程(有时在本文中称为“物理分析”)，执行分析方法，例如包括以下一个或多个的方法:从另一物质中分离或纯化物质，例如分析物或其片段或其其他衍生物；将分析物或其片段或其他衍生物与另一物质例如缓冲液，溶剂或反应物组合；或通过在分析物的第一和第二个原子之间破坏或形成共价键或非共价键来改变分析物或其片段或其它衍生物的结构；或者通过改变试剂或其片段或其他衍生物的结构，例如通过在试剂的第一和第二原子之间破坏或形成共价或非共价键。
正如本文中使用的那样，术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。抗体可以为免疫球蛋白分子的四聚体。
本文所述的生物标志物的术语“改变的表达水平”指受试者，例如样品，例如来自患有癌症(例如，诸如ALL和CLL的血液癌症)的患者的样品中标志物的表达水平的增加(或减少)大于或小于参照，例如本文所述的参照。在实施方案中，大于或小于是与用于评估表达的测定法的标准误进行比较。在实施方案中，所述改变可以是对照样品(例如，来自不患有CRS的健康受试者的样品)中生物标志物的表达水平或几个对照样品中的平均表达水平的至少两倍，至少三倍，至少四倍，至少五倍，或至少十倍或以上更大或更小。可以在蛋白质或核酸(例如mRNA)水平上确定“改变的表达水平”。
术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括，但不限于Fab，Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体比如sdAb(VL或VH)、camelid VHH结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗原结合片段也可以被掺入单域抗体、最大抗体、微小抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也可以接枝到基于多肽的支架，比如III型纤连蛋白(Fn3)(参见美国专利号:6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微小抗体)。术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是经由短的柔性多肽接头邻接的，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
术语“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在的抗体分子中两种类型的多肽链中较大的一个，其通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中两种类型的多肽链中中较小的一个。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“抗癌作用”是指可以通过多种手段表现的生物效应，包括但不限于例如肿瘤体积减小、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活率降低或与癌性病症有关的各种生理学症状的改善。“抗癌作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体预防癌症首次出现的能力。术语“抗癌作用”是指可以通过各种手段表现的生物学效应，包括但不限于例如肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活率降低。
术语“同种异体的”是指来源于与将导入物质的个体相同物种的不同动物的任何物质。当一个或更多个基因座的基因不相同时，两个或多个个体被认为是彼此同种异体的。在某些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上是足够不同的而以在抗原性上相互作用。
本文所用的术语“单采血液成分术”是指体外方法，供体或患者的血液通过该方法从供体或患者中移出并通过分离出选择的特定成分的装置并将其余部分，例如通过再输血返回供体或患者的循环。因此，在“单采血液成分术样品”的上下文中，是指使用单采血液成分术获得的样品。
术语“自体”是指从同一个体获得的任何材料，该材料后来被重新引入该个体。
“生物标志物”或“标志物”是与病症或病状相关或预测病症或病状的分析物、基因或基因产物(例如，mRNA或蛋白质)。在一个实施方案中，生物标志物或标志物与CRS相关。在另一个实施方案中，生物标志物或标志物预测CRS。在实施方案中，生物标志物的水平或活性与CRS相关或预测CRS。在一些实施方案中，生物标志物相对于参照的水平或活性的改变(例如对照水平或活性)与CRS相关或预测CRS。在实施方案中，将从患有癌症的受试者获得的样品(例如血液、血浆或血清样品)中的生物标志物或标志物的水平或活性与对照水平或活性进行比较。
在实施方案中，对照水平或活性(也称为参照水平或活性)是受试者中生物标志物或标志物的量和/或活性，例如获自以下一项或多项的生物学样品：受试者的基线或早先值(例如，在用CAR表达细胞治疗之前)；在不同的时间间隔的受试者；癌症患者群体的平均值或中值；健康的对照；或健康的受试者群体(例如对照)，例如其不具有CRS(例如，严重的CRS)。在实施方案中，细胞因子或细胞因子受体的对照水平是正常、健康受试者(例如类似年龄(例如成人或儿科))中的细胞因子或细胞因子受体的水平。
术语“与......相关”或“与......关联”是指由于一种病状而发生的一种或多种生物标志物的变化(例如，一种或多种基因产物(例如mRNA、蛋白质(例如细胞因子或细胞因子受体)、分析物、或其改变(例如，突变或水平或量的差异(例如，大于或小于参照))的变化)，例如生物标志物与病状之间的相关性。关联可以在任何时间点进行(例如在疾病发展或发作之前、期间或之后)。生物标志物不必是症状的原因，仅在病状时程中的任何时刻出现。
术语“预测”指在病状发展或发作之前发生的一种或多种生物标志物的变化(例如一种或多种基因产物(例如，mRNA、蛋白质(例如细胞因子或细胞因子受体)、分析物、或其改变(例如，突变或水平或量的差异(例如，大于或小于参照))的变化)。在一个实施方案中，所述变化发生在CRS(例如严重CRS)的一种或多种症状发作之前。在一个实施方案中，一种或多种生物标志物与病状(例如疾病/病症)之间的相关性在CRS(例如严重CRS)的发展或发作之前存在。在实施方案中，与病状相关的生物标志物可以不预测病状；预测病状的生物标志物是一种关联的例子。在实施方案中，在CRS(例如严重CRS)发展或发作之前，预测病状例如CRS(例如严重CRS)的生物标志物(例如生物标志物水平和/或活性)与CRS(例如严重CRS)相关。例如，预测未经历CRS(例如，严重CRS)的一种或多种症状的受试者中的CRS(例如，严重CRS)风险状态的生物标志物(例如，生物标志物水平和/或活性)可以意味着，受试者将具有某种形式的CRS(例如，严重CRS)的概率多于50％(例如，多于50％，60％，70％，80％，90％或更大概率)。
术语“CRS风险状态”是指受试者发展CRS(例如，严重CRS)的风险水平或可能性。在实施方案中，CRS风险状态可以是高风险状态或低风险状态。在实施方案中，高风险状态可以意味着受试者将发展CRS(例如，严重CRS)的概率多于50％(例如，多于50％，60％，70％，80％，90％或更大的概率)。在实施方案中，低风险状态可以意味着受试者将不会发展CRS(例如，严重CRS)的概率多于50％(例如，多于50％，60％，70％，80％，90％或更大的概率)。
术语“癌症”是指特征为异常细胞的不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或穿过血流和淋巴系统至身体的其他部分。各种癌症的实例是本文描述的，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。癌症包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，B细胞早幼粒细胞白血病，胚细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆胚细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤和瓦尔登斯特隆巨球蛋白血症。在一个实施方案中，癌症与CD19表达相关。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前，以及恶性癌症和肿瘤。
术语“与癌症相关的抗原”或“肿瘤抗原”可互换地是指与正常细胞相比全部地或以片段形式(例如MHC/肽)优选在癌细胞表面上被表达的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其用于将药理学活性剂优先靶向癌细胞。在某些实施方案中，肿瘤抗原为由正常细胞和癌细胞表达的标志物，例如谱系标志物例如在B细胞上的CD19。在某些实施方案中，与癌症相关的抗原为在癌细胞中与正常细胞相比过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍或以上过表达。在某些实施方案中，与癌症相关的抗原为癌细胞中被不适当地合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上被表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。
如本文所用，术语“CD19”是指分化簇19蛋白，其是可在白血病前体细胞上检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD19的氨基酸序列可以作为UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，编码人CD19的核苷酸序列可以在登录号NM_001178098中找到。如本文所用，“CD19”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD19的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。CD19在大多数B系癌症上表达，包括例如急性成淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。表达CD19的其他细胞在“与CD19的表达相关的疾病”的定义中提供。它也是B细胞祖细胞的早期标志物。参见例如Nicholson等人，MOL.IMMUN.34(16-17):1157-1165(1997)。一方面，CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)的抗原结合部分识别并结合CD19蛋白的细胞外结构域内的抗原。一方面，CD19蛋白在癌细胞上表达。在一个实施方案中，CD19具有野生型序列，例如野生型人类序列。在另一个实施方案中，CD19具有突变序列，例如突变人序列
“嵌合抗原受体”或“CAR”是指重组多肽构建体，其包含至少一个细胞外抗原结合结构域，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自如下所定义的刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域在相同的多肽链中，例如，包含嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如在不同的多肽链中，例如如在本文所述的RCAR中提供。
一方面，CAR的刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域包含一级信号传导结构域(例如，CD3-ζ的一级信号传导结构域)。在一个方面，细胞质信号传导结构域还包含一个或多个衍生自如下定义的至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，共刺激分子选自4-1BB(即CD137)，CD27，ICOS和/或CD28。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和包含衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包括嵌合融合蛋白，其包含细胞外抗原识别结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含至少两个衍生自一个或多个共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)上任选的前导序列。在一个方面，CAR进一步包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工过程中从抗原识别结构域(例如scFv)切除，并将CAR定位于细胞膜。在一个实施方案中，CAR是CD19CAR，例如CTL019。
包含靶向特定肿瘤标志物X的抗原结合结构域(例如scFv，单结构域抗体或TCR(例如TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))的CAR(其中X可以是如本文所述的肿瘤标志物)也被称为XCAR。例如，包含靶向CD19的抗原结合结构域的CAR被称为CD19CAR。CAR可以在任一细胞中表达，例如，如本文所述的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
术语“信号传导结构域”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使起效应物作用经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。
包含抗体或其抗体片段的CAR组合物的部分可以多种形式存在，其中抗原结合结构域被表达为多肽链，例如连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)，单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow等人，1999,在:USING ANTIBODIES:A LABORATORYMANUAL,COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS,NY；Harlow等人，1989,在:ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人，1988,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 85:5879-5883；Bird等人，1988,Science 242:423-426)。一方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。另一方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任何一种来确定，包括由Kabat等人，(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案),Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的方案或其组合。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”包括抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个免疫球蛋白可变结构域序列的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有对第一表位的结合特异性和多个免疫球蛋白可变结构域序列的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有对第二表位的结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
短语“与CD19表达相关的疾病”包括但不限于与CD19(例如，野生型或突变型CD19)表达相关的疾病或与表达或在任何时间表达CD19的细胞相关的病症，包括，例如增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症例如骨髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD19的细胞相关的非癌症相关适应证。为了避免疑问，与CD19表达相关的疾病可以包括与目前不表达CD19的细胞相关的病症，例如因为CD19表达已被下调，例如由于用靶向CD19的分子例如，CD19 CAR治疗，但从前表达CD19。一方面，与CD19的表达相关的癌症是血液癌症。一方面，血液癌症是白血病或淋巴瘤。
一方面，与CD19的表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于例如一种或多种急性白血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞白血病(“B-ALL”)，T细胞急性淋巴细胞白血病(“T-ALL”)，急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。与CD19表达相关的额外癌症或血液病包括但不限于例如B细胞早幼粒细胞白血病，胚细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆胚细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，和“白血病前期”，它们是通过骨髓血液细胞的无效生产(或发育不良)联合在一起的血液病症的多样化集合，等。与CD19表达相关的其它疾病包括但不限于例如与CD19表达相关的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病症或增殖性疾病。与CD19表达相关的非癌症相关适应证包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)，炎症性病症(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时候表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变型)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞在一点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白质，随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。在其它实施方案中，该疾病是CD19阴性癌症，例如CD19阴性复发性癌症。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原(例如CD19)的细胞表达或在任何时候表达了编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原(例如CD19)的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变型)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原(例如CD19)的细胞在一点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白质，随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
术语“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合从而介导T细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖的T细胞上的同源结合配偶体。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于I类MHC分子，TNF受体蛋白，免疫球蛋白样蛋白，细胞因子受体，整联蛋白，信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)，激活NK细胞受体，BTLA，Toll配体受体，OX40，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40，CDS，ICAM-1，LFA-1(CD11a/CD18)，4-1BB(CD137)，B7-H3，CDS，ICAM-1，ICOS(CD278)，GITR，BAFFR，LIGHT，HVEM(LIGHTR)，KIRDS2，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，NKp44，NKp30，NKp46，CD19，CD4，CD8alpha，CD8beta，IL2R beta，IL2R gamma，IL7R alpha，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，NKG2D，NKG2C，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，CD19a，和与CD83特异性结合的配体。
共刺激胞内信号传导结构域是指共刺激分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域可以包括衍生其的分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段。共刺激分子可以在以下蛋白质家族中表示：TNF受体蛋白质，免疫球蛋白样蛋白质，细胞因子受体，整联蛋白，信号转导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白质)和激活NK细胞受体。这些分子的实例包括CD27，CD28，4-1BB(CD137)，OX40，GITR，CD30，CD40，ICOS，BAFFR，HVEM，ICAM-1，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CDS，CD7，CD287，LIGHT，NKG2C，SLAMF7，NKp80，CD160，B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。
术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
术语“编码”是指多核苷酸比如基因、cDNA、或mRNA中的核苷酸的特异性序列在生物学过程中作为合成其它聚合物和大分子的模板起作用的固有特性，所述聚合物以及大分子具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列及由其得到的生物学特性。因此，如果与所述基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常被提供在序列表中的编码链和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链这两者都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其达到编码蛋白质的核苷酸序列可以在一些形式中含有一个或多个内含子的程度。
术语“内源性”是指来自或产生于生物，细胞，组织或系统内的任何物质。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指有效实现特定生物学结果的本文所述的化合物，制剂，材料或组合物的量。
术语“外源性”是指从生物，细胞，组织或系统外面引入或产生的任何物质。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如在scFv的上下文中使用的那样，术语“柔性的多肽接头”或“接头”是指由比如单独或联合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基的氨基酸组成的肽接头，其将可变的重链和可变的轻链区域连接在一起。在一种实施方案中，柔性的多肽接头为Gly/Ser接头且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3.n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10(SEQ ID NO:28)。在一种实施方案中，柔性的多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。在另一种实施方案中，接头包括多个重复的(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:31)。在本发明的范围内也包括被描述在WO2012/138475中的接头，将其并入本文作为参考。
本文中可互换使用的术语“同源性”或“同一性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间的序列相似性，同一性是更严格的比较。短语“百分比同一性或同源性”和“％同一性或同源性”是指在两个或多个多核苷酸序列或两个或多个多肽序列的比较中发现的序列相似性的百分比。“序列相似性”是指在两个或更多个多核苷酸序列之间的碱基对序列(通过任何合适的方法测定)的百分比相似性。两个或更多个序列可以是从0-100％任一点相似的，或其间的任何整数值。同一性或相似性可以通过比较每个序列中的位置来确定，可以为了比较目的而比对所述序列。当比较的序列中的位置被相同的核苷酸碱基或氨基酸占据时，则该位置处的分子是相同的。多核苷酸序列之间的相似性或同一性程度是多核苷酸序列共有位置上相同或匹配核苷酸数量的函数。多肽序列的同一性程度是多肽序列共有位置上相同氨基酸数量的函数。多肽序列的同源性或相似性程度是多肽序列共有位置上的氨基酸数量的函数。本文所用的术语“基本同源性”是指至少50％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或以上的同源性。
非人(例如，鼠抗体)的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种例如小鼠，大鼠或兔(供体抗体)的具有所希望的特异性，亲和力和容量的CDR的残基所取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含在受体抗体中以及输入的CDR或构建序列中均不存在的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有的至少一个，通常为两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区域，FR区的全部或重要部分是人免疫球蛋白序列的部分。人源化抗体或抗体片段还可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人，NATURE,321:522-525,1986；Reichmann等人，NATURE,332:323-329,1988；Presta,CURR.OP.STRUCT.BIOL.,2:593-596,1992。
本文使用的术语“免疫效应细胞”是指涉及免疫应答，例如涉及促进免疫效应应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞，B细胞，自然杀伤(NK)细胞，自然杀伤T(NK-T)细胞，肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。
如本文所用的术语“免疫效应功能或免疫效应应答”是指例如增强或促进靶细胞免疫攻击的免疫效应细胞的功能或应答。例如，免疫效应功能或应答是指促进靶细胞杀死或生长或增殖的抑制的T或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，主要刺激和共刺激是免疫效应功能或应答的实例。
术语“4-1BB”是指具有作为GenBank Acc.No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人物种例如小鼠，啮齿动物，猴，猿等的等同残基；“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank Acc No.AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基。一方面，“4-1BB共刺激结构域”是以SEQ ID NO:16提供的序列或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可产生促进含有CAR的细胞例如表达CAR的细胞，例如T细胞或NK细胞的免疫效应功能的信号。例如在CAR表达细胞中，免疫效应功能的实例包括溶细胞活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在实施方案中，细胞内信号结构域是蛋白质中转导效应子功能信号并引导细胞执行专门的功能的部分。尽管可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不需要使用整个链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短部分代替完整链，只要其转导效应子功能信号。因此术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包含一级细胞内信号传导结构域。示例性一级细胞内信号传导结构域包括衍生自负责初次刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原独立刺激的分子的那些。例如，在CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)的情况下，一级细胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激的细胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
一级细胞内信号传导结构域可以包含已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有一级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(“ICOS”)，FcεRI，CD66d，CD32，DAP10和DAP12的那些。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已经在体外合成的RNA，例如mRNA。通常，体外转录的RNA是从体外转录载体产生的。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
术语“分离的”是指从自然状态改变或去除。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，因为能够感染非分裂细胞；它们可以将大量遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV，SIV和FIV都是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”是指衍生自慢病毒基因组的至少一部分的载体，特别包括Milone等人，MOL.THER.17(8):1453–1464(2009)提供的自身灭活的慢病毒载体。可以在临床中使用的慢病毒载体的其它实例包括但不限于例如来自Oxford BioMedica的
Figure BDA0003753655610000561
基因递送技术，来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的，并且是本领域技术人员已知的。
当与mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001或雷帕霉素或催化性mTOR抑制剂)一起使用时，术语“低的免疫增强剂量”是指部分但不是完全抑制mTOR活性(例如，通过抑制P70S6激酶活性测量)的mTOR抑制剂的剂量。该剂量不足以导致完全的免疫抑制，但足以增强免疫应答。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其DNA或RNA的组合及其聚合物。术语“核酸”包括基因，cDNA或mRNA。在一个实施方案中，核酸分子是合成的(例如化学合成的)或重组的。除非特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式进行代谢。除非另有说明，特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)，等位基因，直向同源物，SNP和互补序列以及明确指出的序列。特别地，简并密码子取代可以通过产生序列来实现，所述序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，NUCLEIC ACIDRES.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.BIOL.CHEM.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，MOL.CELL.Probes 8:91-98(1994))。在本发明的上下文中，使用通常存在的核酸碱基的以下缩写。“A”表示腺苷，“C”表示胞嘧啶，“G”表示鸟苷，“T”表示胸苷，“U”表示尿苷。
“核酸”“标志物”或“核酸生物标志物”是由如本文所述的标志物编码或与所述标志物对应的核酸(例如，DNA、mRNA、cDNA)。例如，这样的标志物核酸分子包括DNA(例如，基因组DNA和cDNA)，其包含任何所述核酸序列的全部或部分序列，或该序列的互补或杂交片段。标志物核酸分子还包括包含本文所述的任何核酸序列的全部或部分序列或这种序列的互补序列的RNA，其中所有胸苷残基被尿苷残基替代。“标志物蛋白”是由本发明的标志物编码或对应的蛋白质。标志物蛋白包含由本文所述的任何序列编码的蛋白质的全部或部分序列，或其片段。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。
术语“有效连接”或“转录控制”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子有效连接编码序列。有效连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如在结合两个蛋白编码区需要时，在同一读码框中。
基因产物的“过表达”或“显著更高水平的表达”是指测试样品中的表达水平或拷贝数大于用于评估表达水平的测定法的标准误。在实施方案中，过表达可以是对照样品中基因的表达水平或几个对照样品中基因产物的平均表达水平的至少两倍，至少三倍，至少四倍，至少五倍，至少十倍或更多倍。
术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且可以包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指两个短链，其也在本领域中通常被称为肽，寡肽和寡聚体，例如长链，其在本领域中通常称为蛋白质，其中存在很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，同二聚体，异二聚体，多肽的变体，修饰的多肽，衍生物，类似物，融合蛋白等。多肽包括天然肽，重组肽或其组合。
如本文所用，“多聚(A)”是通过聚腺苷酸化连接到mRNA的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一个实施方案中，多聚A在50和5000之间(SEQ ID NO:34)(例如，2000；SEQID NO:32)，例如64(SEQ ID NO:44)，例如大于100(SEQ ID NO:53)，例如大于400(SEQ IDNO:38)。多聚(A)序列可以被化学修饰或酶促修饰以调节mRNA功能，如定位，稳定性或翻译效率。
正如本文中使用的那样，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷部分或其修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'末端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾部为通过酶聚腺苷酸聚合酶的作用添加到前-mRNA的腺嘌呤核苷酸(通常几百)的长序列。在较高等的真核生物中，聚(A)尾部被添加到含有特异性序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。聚(A)尾及结合其的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核输出和翻译也很重要。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA之后立即出现在细胞核中，但是另外也可更迟地出现在细胞质中。在转录已经终止之后，通过与RNA聚合酶结合的核酸内切酶复合体的作用，mRNA链被切割下来。切割位点通常的特征在于在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA已经被切割下来之后，将腺苷残基添加到切割位点的游离3'末端。
术语“探针”是指能够选择性结合特定目标分子，例如本发明的标志物的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或衍生自适当的生物制剂。为了检测靶分子，可以将探针专门设计成如本文所述进行标记。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA，DNA，蛋白质，抗体和有机单体。
术语“启动子”是指由细胞的合成机器识别，或引入合成机器，启动多核苷酸序列的特异性转录所需的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”是指与启动子/调节序列有效连接的基因产物的表达所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列也可以包括基因产物表达所需的增强子序列和其他调控元件。启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。
本文所用的术语“预防”是指预防或保护性治疗疾病或疾病状态。
本文所用的“难治的”是指对治疗不应答的疾病，例如癌症。在实施方案中，难治性癌症可以在治疗开始之前或开始时耐受治疗。在其它实施方案中，难治性癌症在治疗期间可变得抗性。难治性癌症也被称为耐药性癌症。
本文所用的“复发的”是指在改善的时期之后(例如在疗法例如癌症疗法前治疗之后)疾病(例如癌症)或疾病(例如癌症)的体征和症状的返回。
范围:在本公开内容中，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发明的范围的僵化限制。因此，对范围的描述应被考虑为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，从1到6的范围的描述应被认为具体公开了诸如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及该范围内的个别数字，例如1，2，2.7，3，4，5，5.3和6。作为另一实例，诸如95-99％同一性的范围包括具有95％，96％，97％，98％或99％的同一性的某物，并且包括诸如96-99％，96-98％，96-97％，97-99％，97-98％和98-99％同一性。无论范围的广度如何，这都适用。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为通过合成编码抗体的DNA分子产生的抗体并且所述DNA分子表达抗体蛋白或指定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已经使用本领域可获得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
“样品”，“组织样品”，“患者样品”，“患者细胞或组织样品”或“样本”均指从受试者或患者的组织或体液获得的生物样品。组织样品的来源可以是来自新鲜的，冷冻和/或保存的器官，组织样品，活组织检查或抽吸物的固体组织；血液或任何血液成分(如血清，血浆)；体液如尿液，脑脊液，全血，血浆和血清。样品可以包括非细胞级分(例如尿，血浆，血清或其它非细胞体液)。在一个实施方案中，样品是尿样。在其他实施方案中，从个体获得样品的体液包含血液(例如全血)。在一个实施方案中，样品是从受试者获得的全血液样品。在某些实施方案中，可以进一步处理血液以获得血浆或血清。在一个实施方案中，样品是从受试者的血液中获得的单采血液成分术样品。在一个实施方案中，样品是制造的产品样品，例如从受试者的血液获得的经遗传工程化的T细胞，例如制备的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产物，例如制造的CD19 CAR表达细胞产物。在另一个实施方案中，样品含有组织，细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC))。例如，样品可以是细针活检样品，归档样品(例如，具有已知诊断和/或治疗史的归档样品)，组织学切片(例如，冷冻或福尔马林固定的切片，例如，长期存储后)等。术语样品包括从生物样品获得和/或衍生的任何材料，包括从样品纯化或加工的多肽和核酸(例如，基因组DNA、cDNA、RNA)。样品的纯化和/或加工可以包括提取，浓缩，抗体分离，分选，浓缩，固定，加入试剂等中的一种或多种。样品可以含有天然不与天然组织混合的化合物，如防腐剂，抗凝剂，缓冲剂，固定剂，营养物，抗生素等。
本文所用的术语“产品”或“制造的产品”是指包含遗传工程化细胞(例如，免疫效应细胞)的制造的组合物，所述细胞为例如细胞群，其中多个细胞被工程化以表达CAR,例如本文描述的CAR。制造的产品可以是任何基因工程化的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)，例如从受试者的血液获得的遗传工程化的免疫效应细胞，例如制造的CAR表达细胞产物，例如制造的CD19 CAR表达细胞产物。在一个实施方案中，可以从活化的冷冻保存的扩增的细胞群(例如扩增的免疫效应细胞群)获得工程化以表达CAR的细胞(例如，免疫效应细胞)。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能部分，其通过在细胞内传递信息来调节细胞活性起作用，经由确定的信号途径通过产生第二信使或通过应答这样的信使而作为效应子发挥功能实现所述调节细胞活性。
如果生物标志物的量比正常水平的量分别大于或小于用于评估该量的测定法的标准误的量，或所述量的至少两，三，四，五，十倍或更多倍，则受试者中的生物标志物，例如基因产物(例如，本文所述的一种或多种生物标志物)的表达量“显著”高于或低于该标志物的正常量。或者，如果该量比标志物正常量分别高或低至少约1.5，2，至少约3，至少约4，或至少约5倍或更高或更低，则受试者中的标志物的量可被认为“显著”高于或低于正常量。
术语“特异性结合”是指识别并结合存在于样品中的同源结合配偶体蛋白的抗体或配体，但所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
术语“刺激”是指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合诱导的主要应答，从而介导信号转导事件，例如但不限于通过TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
术语“刺激分子”是指由T细胞表达的分子，其提供一级细胞质信号传导序列，所述序列以刺激方式为T细胞信号通路的至少一些方面调节TCR复合物的主要活化。在一个方面，主要信号是通过例如TCR/CD3复合物与装载肽的MHC分子的结合引发的，并导致T细胞应答的介导，包括但不限于增殖，激活，分化等。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列(也称为“一级信号传导结构域”)可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号基序。在本发明中特别使用的包含细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ，共同FcRγ(FCER1G)，FcγRIIa，FcRβ(FcεR1bb)，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD79a，CD79b，DAP10和DAP12的那些。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的一级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的一级信号传导序列是作为SEQ ID NO:17提供的序列或来自非人物种，例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等同残基。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的一级信号传导序列是作为SEQ ID NO:30中提供的序列，或来自非人物种，例如小鼠、啮齿动物、猴、猿猴等的等同残基。
术语“受试者”旨在包括可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物，人)。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是患者。受试者的实例包括人、猴、黑猩猩、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。
本文所用的术语“治疗”是指治疗。通过减轻，抑制，缓解或消除疾病状态获得治疗效果。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是用外源核酸转染，转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其后代。
如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因表达数小时，数天或数周，其中表达时间段小于如果整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定的质粒复制子中时基因表达的时间段。在实施方案中，CAR分子在细胞(例如宿主细胞)中短暂表达有限时间段或细胞复制次数，例如小于50天(例如，小于40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或更少天)。在一个实施方案中，使用体外转录的RNA进行瞬时表达。
如本文所用，“稳定的”是指比瞬时表达更长时间的转基因的表达。在实施方案中，转基因整合到细胞的基因组中，例如宿主细胞中，或者包含在细胞中稳定的质粒复制子内。在一个实施方案中，使用基因递送载体，例如逆转录病毒载体如慢病毒载体，将转基因整合到细胞基因组中。
术语“跨膜结构域”是指跨越质膜的多肽。在一个实施方案中，其将细胞外序列(例如开关结构域，细胞外识别元件，例如抗原结合结构域，抑制性反配体结合结构域或共刺激ECD结构域)连接到细胞内序列，例如开关结构域或细胞内信号传导结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如与衍生跨膜的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个，多达15个氨基酸)和/或与衍生跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如，细胞内区域的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个，多达15个氨基酸)。本文公开了跨膜结构域的实例。
正如本文中使用的那样，术语“治疗(treat、treatment、treating)”是指由于施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂比如本发明的CAR)减慢或改善增生性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增生性病症的一种或多种症状(例如，一种或多种可辨别的症状)。在特定实施方案中，术语“治疗”是指改善增生性病症的至少一种可测量的物理参数比如肿瘤生长，不必是患者可辨别的。在其它实施方案中，术语“治疗”是指通过例如稳定可辨别的症状以物理方式、通过例如稳定物理参数以生理学方式或两者抑制增生性病症的进展。在其它实施方案中，术语“治疗”是指减小或稳定肿瘤尺寸或癌细胞计数。
产品(例如，本文所述的标志物)的“低表达”或“显著较低的表达水平”是指测试样品中的表达水平大于用于评估表达的测定的标准误，例如，比对照样品中基因的表达水平，或几种对照样品中基因产物的平均表达水平少至少1.5倍，2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，或至少10倍或更多倍。
术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
术语“ζ”或备选地“ζ链”，“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为作为GenBankAcc.No.BAG36664.1提供的蛋白质，或来自非人物种例如小鼠，啮齿动物，猴，猿等的等同残基，以及“ζ刺激结构域”或备选地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为足以在功能上传递T细胞活化所需的初始信号的ζ链的胞质结构域的氨基酸残基。在一个方面，ζ的胞质结构域包含GenBank Acc.No.BAG36664.1的残基52至164或作为其功能直向同源物的来自非人物种例如小鼠，啮齿动物，猴，猿等的等同残基。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ ID NO:18(突变CD3ζ)提供的序列。一方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ ID NO:20(野生型CD3ζ)所提供的序列。
以下进一步详细描述本发明的各个方面。在整个说明书中列出了其他定义。
细胞因子释放综合征(CRS)
细胞因子释放综合征(CRS)是可能由于癌症免疫疗法(例如癌症抗体疗法或T细胞免疫疗法(例如CAR T细胞))而发生的潜在威胁生命的细胞因子相关毒性。当大量淋巴细胞和/或髓样细胞在激活时释放炎性细胞因子时，从高水平免疫激活产生CRS。CRS的严重性和症状发作的时间可以根据免疫细胞活化的幅度、给药的疗法的类型和/或受试者的肿瘤负担的程度而变化。在用于癌症的T细胞疗法的情况下，症状发作通常在给药T细胞疗法后的几天至几周内，例如当存在体内T细胞扩增峰值时。参见例如Lee等人，Blood.124.2(2014)：188-95。
CRS的症状可以包括神经毒性，弥散性血管内凝血，心脏功能障碍，成人呼吸窘迫综合征，肾衰竭和/或肝衰竭。例如，CRS的症状包括伴有或不伴有寒颤，疲劳，乏力，肌痛，呕吐，头痛，恶心，厌食，关节痛，腹泻，皮疹，低氧血症，呼吸急促，低血压，脉压增宽，潜在的心输出量减少(晚期)，增加的心输出量(早期)，氮质血症，伴有或不伴有出血的低纤维蛋白原血症，D-二聚体升高，高胆红素血症，转氨酶升高，混乱，精神错乱，精神状态改变，幻觉，震颤，癫痫发作，步态改变，识字困难，坦率的失语症或dymetria。
IL-6被认为是CRS毒性的介质。参见例如同上，高IL-6水平可启动促炎性IL-6信号级联反应，导致一种或多种CRS症状。可以测量IL-6和sIL-6R水平，例如，如Chen等人所述，“Measuring IL-6and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumaband/or siltuximab following CAR T cell therapy”J Immunol Methods.2016Jul；434:1-8.doi:10.1016/j.jim.2016.03.005。
在一些情况下，C-反应蛋白(CRP)(由肝产生的生物分子，例如响应于IL-6)的水平可以是IL-6活性的量度。在一些情况下，在CRS期间CRP水平可增加几倍(例如，几个log)。可以使用本文所述的方法和/或本领域可用的标准方法来测量CRP水平。
CRS分级
在一些实施方案中，如下所述，CRS的严重程度可以从1-5分级。1-3级是低于严重CRS的。4-5级是严重CRS。对于1级CRS，仅需要对症状治疗(例如恶心，发热，疲劳，肌痛，乏力，头痛)并且症状不会危及生命。对于2级CRS，症状需要适度干预，并且通常对适度干预有反应。患有2级CRS的受试者发展对或是流体或是一种低剂量血管加压剂有反应的低血压；或者他们发展2级器官毒性或对低流量氧(<40％氧)有反应的轻度呼吸症状。在3级CRS患者中，低血压通常不能通过流体疗法或一种低剂量血管加压剂逆转。这些受试者通常需要比低流量氧更多的并且具有3级器官毒性(例如肾或心脏功能障碍或凝血病)和/或4级转氨酶升高。3级CRS受试者需要更积极的干预，例如40％或更高的氧气，高剂量血管加压剂和/或多种血管加压剂。4级CRS受试者患有立即危及生命的症状，包括4级器官毒性或需要机械通气。4级CRS受试者通常不会有转氨酶升高。在5级CRS受试者中，毒性导致死亡。用于分级CRS的标准集在本文中提供为表13、表15和表16。除非另有说明，否则本文所用的CRS是指根据表13的标准的CRS。
CRS疗法
用于CRS的疗法包括IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗(tocilizumab)或siltuximab)，巴多昔芬(bazedoxifene)，sgp130阻断剂，血管活性药物，皮质类固醇，免疫抑制剂和机械通气。国际申请WO2014011984中描述了用于CRS的示例性疗法，其通过引用并入本文。
托珠单抗是人源化的免疫球蛋白G1kappa抗人IL-6R单克隆抗体。参见例如同上。托珠单抗阻断IL-6与可溶性和膜结合IL-6受体(IL-6R)的结合，从而抑制经典和反式IL-6信号传导。在实施方案中，托珠单抗以约4-12mg/kg的剂量给药，例如成年人约4-8mg/kg，和儿科受试者约8-12mg/kg，例如在1小时的过程中给药。
在一些实施方案中，CRS治疗剂是IL-6信号传导的抑制剂，例如IL-6或IL-6受体的抑制剂。在一个实施方案中，抑制剂是抗IL-6抗体，例如抗IL-6嵌合单克隆抗体，例如siltuximab。在其他实施方案中，抑制剂包含能够阻断IL-6信号传导的可溶性gp130(sgp130)或其片段。在一些实施方案中，sgp130或其片段融合至异源结构域，例如Fc结构域，例如gp130-Fc融合蛋白例如FE301。在实施方案中，IL-6信号传导抑制剂包含抗体，例如针对IL-6受体的抗体，如沙鲁单抗(sarilumab)，奥洛单抗(olokizumab)(CDP6038)，elsilimomab，西鲁克单抗(sirukumab)(CNTO136)，ALD518/BMS-945429，ARGX-109或FM101。在一些实施方案中，IL-6信号传导抑制剂包含小分子如CPSI-2364。
示例性的血管活性药物包括但不限于血管紧张素-11，内皮素-1，α肾上腺素能激动剂，rostanoids，磷酸二酯酶抑制剂，内皮素拮抗剂，inotropes(例如肾上腺素，多巴酚丁胺，异丙肾上腺素，麻黄素)，血管加压剂(例如正肾上腺素，加压素、metaraminol，加压素，亚甲蓝)，inodilators(例如米力农，左西孟旦)和多巴胺。
示例性血管加压剂包括但不限于去甲肾上腺素，多巴胺，去氧肾上腺素，肾上腺素和加压素。在一些实施方案中，高剂量血管加压剂包括以下一种或多种：≥20μg/min的去甲肾上腺素单一疗法，≥10ug/kg/min的多巴胺单一疗法，≥200μg/min的去氧肾上腺素单一疗法和/或≥10μg/min的肾上腺素单一疗法。在一些实施方案中，如果受试者使用加压素，则高剂量血管加压剂包括血管加压素+≥10μg/min去甲肾上腺素当量，其中去甲肾上腺素当量剂量＝[去甲肾上腺素(μg/min)]+[多巴胺(μg/kg/分钟)/2]+[肾上腺素(μg/min)]+[去氧肾上腺素(μg/min)/10]。在一些实施方案中，如果受试者使用联合血管加压剂(不是加压素)，高剂量血管加压剂包括≥20μg/min的去甲肾上腺素当量，其中去甲肾上腺素当量剂量＝[去甲肾上腺素(μg/min)]+[多巴胺(ug/kg/min)/2]+[肾上腺素(μg/min)]+[去氧肾上腺素(μg/min)/10]。参见例如同上。
在一些实施方案中，低剂量血管加压剂是血管加压剂，其以低于上文针对高剂量血管加压剂列出的一种或多种剂量的剂量给药。
示例性的皮质类固醇包括但不限于地塞米松、氢化可的松和甲基泼尼松龙。在实施方案中，使用0.5mg/kg的地塞米松剂量。在实施方案中，使用10mg/剂量的地塞米松的最大剂量。在实施方案中，使用2mg/kg/天的甲基泼尼松龙剂量。
示例性免疫抑制剂包括但不限于TNFα抑制剂或IL-1抑制剂。在实施方案中，TNFα抑制剂包含抗-TNFα抗体，例如单克隆抗体，例如英夫利昔单抗。在实施方案中，TNFα抑制剂包含可溶性TNFα受体(例如依那西普)。在实施方案中，IL-1或IL-1R抑制剂包含阿那白滞素。
在一些实施方案中，向处于发展严重CRS风险的受试者给药抗IFN-γ或抗sIL2Rα疗法，例如针对IFN-γ或sIL2Rα的抗体分子。
在实施方案中，对于接受治疗性抗体分子如blinatumomab并且具有CRS或处于发展CRS风险中的受试者，以较低剂量和/或较低频率给药治疗性抗体分子，或停止治疗性抗体分子的给药。
在实施方案中，患有CRS或有发展CRS风险的受试者用退热药物如对乙酰氨基酚治疗。
在实施方案中，以任何组合，例如与本文描述的CAR表达细胞组合，向本文中的受试者给药或提供针对本文所述的CRS的一种或多种疗法，例如IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)，血管活性药物，皮质类固醇，免疫抑制剂或机械通气中的一种或多种。
在实施方案中，将有发展CRS(例如严重CRS)(例如鉴定为具有发展为严重CRS的高风险状态)风险的受试者给药本文所述的用于CRS的一种或多种疗法，例如一种或多种IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)，血管活性药物，皮质类固醇，免疫抑制剂或机械通气，其以任何组合，例如与本文描述的CAR-表达细胞组合。
在实施方案中，本文中的受试者(例如处于发展严重CRS风险的受试者或被鉴定为处于发展严重CRS风险的受试者)被转移至重症监护病房。在一些实施方案中，监测本文中的受试者(例如处于发展严重CRS风险的受试者或被鉴定为处于发展严重CRS风险的受试者)的与CRS相关的一种或多种症状或病状，例如发热，心率升高、凝血病、凝血病，MODS(多器官功能障碍综合征)，心血管功能障碍，分布性休克，心肌病，肝功能障碍，肾功能障碍，脑病，临床癫痫发作，呼吸衰竭或心动过速。在一些实施方案中，本文的方法包括施用用于与CRS相关的症状或病状之一的疗法。例如，在实施方案中，例如如果受试者发展凝血病，则该方法包括施用冷沉淀物。在一些实施方案中，例如如果受试者发展心血管功能障碍，则该方法包括施用血管活性输注支撑物。在一些实施方案中，例如如果受试者发展分布性休克，则该方法包括施用α激动剂疗法。在一些实施方案中，例如如果受试者发展心肌病，则该方法包括施用米力农疗法。在一些实施方案中，例如如果受试者发展呼吸衰竭，则该方法包括执行机械通气(例如，有创机械通气或无创机械通气)。在一些实施方案中，例如如果受试者发展休克，该方法包括施用类晶体和/或胶体液。
在实施方案中，表达CAR的细胞在施用本文所述的CRS的一种或多种疗法之前、同时或之后施用，所述疗法例如IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)，血管活性药物，皮质类固醇，免疫抑制剂或机械通气中的一种或多种。在实施方案中，表达CAR的细胞在施用一种或多种本文所述CRS的疗法2周内(例如2周或1周内，或14天内，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1天或更少内)施用，所述疗法例如IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)，血管活性药物，皮质类固醇，免疫抑制剂或机械通气中的一种或多种。在实施方案中，表达CAR的细胞在施用一种或多种本文所述CRS的疗法至少1天(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、3个月或更长时间)施用，所述疗法例如IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)，血管活性药物，皮质类固醇，免疫抑制剂或机械通气中的一种或多种。
在实施方案中，向本文中的受试者(例如处于发展严重CRS的风险中的受试者或被鉴定为处于发展严重CRS的风险中的受试者)施用单一剂量的IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)的抑制剂(例如，托珠单抗)。在实施方案中，向受试者施用多种剂量(例如2、3、4、5、6或更多剂量)的IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)。
在实施方案中，不对处于低风险或无风险发展为CRS(例如严重CRS)(例如，鉴定为具有发展为严重CRS的低风险状态)的受试者施用本文描述的CRS疗法，所述疗法例如IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)，血管活性药物，皮质类固醇，免疫抑制剂或机械通气中的一种或多种。
在实施方案中，通过使用本文描述的评估或预测方法，确定受试者处于发展严重CRS的高风险中。在实施方案中，通过使用本文描述的评估或预测方法，确定受试者处于发展严重CRS的低风险中。
生物标志物评估(例如预测)CRS严重性的用途
在实施方案中，使用一种或多种生物标志物来评估(例如预测)CRS严重性。用于评估(例如预测)CRS严重性的示例性生物标志物包括细胞因子和细胞因子受体，例如sTNFR2，IP10，sIL1R2，sTNFR1，M1G，VEGF，sILR1，TNFα，IFNα，GCSF，sRAGE，IL4，IL10，IL1R1，IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β和GM-CSF。在实施方案中，使用细胞因子和细胞因子受体，sTNFR2，IP10，sIL1R2，sTNFR1，M1G，VEGF，sILR1，TNFα，IFNα，GCSF，sRAGE，IL4，IL10，IL1R1，IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β和GM-CSF中的一种或多种(例如两种或更多种或三种或更多种)评估(例如预测)CRS严重性。在实施方案中，使用细胞因子和细胞因子受体IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β和GM-CSF中的一种或多种(例如两种或更多种或三种或更多)评估(例如，预测)CRS严重性。在实施方案中，使用细胞因子IFN-γ和sgp130中的一种或多种(例如两种)评估(例如预测)CRS严重性，例如在成人或儿科患者中。在实施方案中，使用细胞因子和细胞因子受体IFN-γ，sgp130和IL1Ra中的一种或多种(例如，两种或更多种或全部三种)评估(例如预测)CRS严重性，例如在成人或儿科患者中。在实施方案中，使用细胞因子IFN-γ，IL13和MIP1α中的一种或多种(例如，两种或更多种或全部三种)评估(例如预测)CRS严重性，例如在儿科患者中。在实施方案中，使用细胞因子sgp130，MCP1和嗜酸细胞活化趋化因子中的一种或多种(例如，两种或更多种或全部三种)评估(例如预测)CRS严重性，例如在儿科或成人受试者中。在实施方案中，使用细胞因子IL2，嗜酸细胞活化趋化因子和sgp130中的一种或多种(例如，两种或更多种或全部三种)评估(例如预测)CRS严重性，例如在儿科或成人受试者中。在实施方案中，使用细胞因子IFN-γ，IL2和嗜酸细胞活化趋化因子中的一种或多种(例如，两种或更多种或全部三种)评估(例如预测)CRS严重性，例如在儿科受试者中。在实施方案中，使用IL10和疾病负担中的一种或多种(例如两者)评估(例如预测)CRS严重性，例如在儿科患者中。在实施方案中，使用细胞因子IFN-γ和IL-13嗜酸细胞活化趋化因子中的一种或多种(例如，两者)评估(例如预测)CRS严重性，例如在儿科对象中。在实施方案中，使用细胞因子IFN-γ，IL-13和MIP1-α中的一种或多种(例如，两种或更多种或全部三种)评估(例如预测)CRS严重性，例如在儿科患者中。在实施方案中，使用细胞因子IFN-γ和MIP1-α中的一种或多种(例如，两者)评估(例如预测)CRS严重性，例如在儿科患者中。
用于评估(例如预测)CRS严重性的示例性生物标志物还可以包括疾病负担评估，例如受试者中疾病(例如癌症)的程度。例如，可以通过测定来自受试者的生物样品(例如受试者的骨髓)中的疾病水平(例如癌症)来进行疾病负担评估。例如，存在至少25％(例如至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，70％，80％，90％或更高)骨髓胚细胞(例如，通过抽吸或活组织检查的形态学，抽吸或活组织检查的流动分析和/或通过MRD确定)指示高疾病负担。在一些实施方案中，存在至少50％的骨髓胚细胞指示高疾病负担。例如，存在少于25％(例如，24％或更少，例如24％，23％，22％，21％，20％，15％，10％，5％或更少)骨髓胚细胞(例如，通过抽吸或活组织检查的形态学，抽吸或活组织检查中的流动测定和/或通过MRD确定)指示低疾病负担。在一些实施方案中，存在少于0.1％，1％，5％，25％或50％的骨髓胚细胞指示低疾病负担。在一些实施方案中，癌症是ALL。
在实施方案中，与疾病负担评估组合使用一种或多种细胞因子或细胞因子受体来评估(例如预测)CRS严重性，例如在儿科患者中。在实施方案中，使用与骨髓疾病(例如癌症)组合的一种或多种细胞因子，spg130和IFN-γ来评估(例如预测)CRS严重性，例如在儿科患者中。在实施方案中，可以使用本文所述的方法确定例如来自骨髓例如癌症的疾病负担评估，例如如Borowitz等人，Blood.2008；111(12)：5477-85；或Weir等人，Leukemia.1999；13(4)：558-67所述。
用于评估(例如预测)CRS严重性的另一示例性生物标志物包括C-反应蛋白(CRP)水平或活性。在实施方案中，处于低风险的严重CRS的受试者被鉴定为具有小于7mg/dL(例如7、6.8、6、5、4、3、2、1mg/dL或更小)的CRP水平。在实施方案中，与低风险的严重CRS的受试者相比或与对照水平或活性相比，处于严重CRS高风险的受试者被鉴定为在样品(例如血液样品)中具有更高水平的CRP。在实施方案中，更高的水平或活性是相比于处于低风险的严重CRS的受试者或比较于对照水平或活性，至少2倍高(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、100、500、1000倍或更高)。
在实施方案中，本文描述的生物标志物用于预测在用CAR T细胞(例如，本文描述的CAR T细胞，例如本文描述的CD19 CAR-表达细胞疗法例如，例如，CTL019)施用后受试者早期CRS严重性。在实施方案中，本文描述的生物标志物用于在2周内，例如在施用CAR T细胞后1周或更短时间内预测受试者的CRS严重性。在实施方案中，本文所述的生物标志物用于在10天内(例如，在施用CAR T细胞后10、9、8、7、6、5、4、3、2、1天或更短时间内预测受试者中的CRS严重性。在实施方案中，本文描述的生物标志物用于在1-10天内(例如，在施用CART细胞后1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天内)预测受试者的CRS严重性。在实施方案中，本文描述的生物标志物用于在受试者经历2、3、4或5级CRS的一种或多种症状之前(例如，在受试者经历3、4或5级CRS或4或5级CRS的一种或多种症状之前)预测受试者中的CRS严重性。
在实施方案中，细胞因子IFN-γ和sgp130中的一种或多种(例如，两种)被用于预测CRS严重性，例如在成人或儿科受试者中，例如在施用CAR T细胞后(例如，本文描述的CART细胞，例如本文描述的CD19CAR表达细胞疗法，例如CTL019)1-10天内(例如1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天后)。
在实施方案中，细胞因子和细胞因子受体IFN-γ，sgp130和IL1Ra中的一种或多种(例如，两种或更多种或全部三种)用于预测CRS严重性，例如在成人或儿科受试者中，例如在施用CAR T细胞后(例如，本文描述的CAR T细胞，例如本文描述的CD19CAR表达细胞疗法，例如CTL019)1-10天内(例如1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天后)。
在实施方案中，细胞因子IFN-γ，IL13和MIP1α中的一种或多种(例如两种或更多种或全部三种)用于预测CRS严重性，例如在儿科受试者中，例如在施用CAR T细胞后(例如，本文描述的CAR T细胞，例如本文描述的CD19CAR表达细胞疗法，例如CTL019)1-10天内(例如1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天后)。
在实施方案中，细胞因子spg130和IFN-γ中的一种或多种与骨髓疾病(例如癌症)组合用于预测CRS严重性，例如在儿科受试者中，例如在施用CAR T细胞后(例如，本文描述的CAR T细胞，例如本文描述的CD19CAR表达细胞疗法，例如CTL019)1-10天内(例如1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天后)。
在实施方案中，CRP水平或活性用于预测CRS严重性，例如在成人或儿科受试者中，例如在施用CAR T细胞后(例如，本文描述的CAR T细胞，例如本文描述的CD19CAR表达细胞疗法，例如CTL019)1-10天内(例如1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天后)。
在实施方案中，本文描述的一种或多种细胞因子和细胞因子受体(例如sTNFR2，IP10，sIL1R2，sTNFR1，M1G，VEGF，sILR1，TNFα，IFNα，GCSF，sRAGE，IL4，IL10，IL1R1，IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β和GM-CSF)相对于对照水平的升高或降低水平指示受试者处于发展严重CRS的高风险中。
在实施方案中，本文描述的一种或多种细胞因子或细胞因子受体(例如sTNFR2，IP10，sIL1R2，sTNFR1，M1G，VEGF，sILR1，TNFα，IFNα，GCSF，sRAGE，IL4，IL10，IL1R1，IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β和GM-CSF)的水平相对于参照水平升高或降低，指示受试者处于发展为严重CRS的高风险中。在实施方案中，将本文所述的一种或多种细胞因子或细胞因子受体的水平相对于对照水平(例如基线水平)提高至少2倍(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000倍或更多)，指示受试者处于发展严重CRS的高风险中。在实施方案中，本文描述的一种或多种细胞因子或细胞因子受体的水平相对于参照水平低至少10％(例如至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％90％，95％或99％)，指示受试者处于发展严重CRS的高风险中。在一些实施方案中，参照水平是不依赖于受试者中细胞因子或细胞因子受体的基线水平的值。在一些实施方案中，参照水平是在Teachey等人，Cancer Discov.2016Jun；6(6):664-79的补充表7中所述的水平，其全部内容通过引用并入本文，包括所有补充材料。(基线细胞因子或细胞因子受体值)或Teachey等人的补充表8(基线细胞因子或细胞因子受体的疾病负担值)。在一些实施方案中，细胞因子或细胞因子受体的升高或降低水平是Teachey等人的补充表9的Peak35值。(儿童和成人中按分级的Peak35细胞因子或细胞因子受体值)。在一些实施方案中，细胞因子或细胞因子受体的升高或降低值为Teachey等人补充表9中的Peak35值的±10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。在一些实施方案中，给定细胞因子或细胞因子受体的升高水平在Teachey等人的补充表7中的该细胞因子或细胞因子受体的中值水平(作为下限)以及Teachey等人补充表9中该细胞因子的最高峰值水平(例如总群组中CRS0-3或CRS4-5患者的最高峰值水平)(作为上限)之间。在一些实施方案中，给定的细胞因子或细胞因子受体的升高水平在Teachey等人的补充表8中的该细胞因子或细胞因子受体的中值水平(作为下限)以及Teachey等人补充表9中的该细胞因子或细胞因子受体的最高峰值水平(例如总群组中CRS0-3或CRS4-5患者的最高峰值水平)(作为上限)之间。在一些实施方案中，给定细胞因子或细胞因子受体的降低水平在Teachey等人的补充表9中该细胞因子或细胞因子受体的最低峰值水平(例如总群组中CRS0-3或CRS4-5患者的最低峰值水平)(作为下限)，以及Teachey等人补充表7中的该细胞因子或细胞因子受体的中值水平(作为上限)之间。在一些实施方案中，给定细胞因子或细胞因子受体的降低水平在Teachey等人的补充表9中该细胞因子或细胞因子受体的最低峰值水平(例如总群组中CRS0-3或CRS4-5患者的最低峰值水平)(作为下限)，以及Teachey等人的补充表8中的该细胞因子或细胞因子受体的中值水平(作为上限)之间。
在实施方案中，本文描述的一种或多种细胞因子或细胞因子受体(例如sTNFR2，IP10，sIL1R2，sTNFR1，M1G，VEGF，sILR1，TNFα，IFNα，GCSF，sRAGE，IL4，IL10，IL1R1，IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β和GM-CSF)的水平相对于参照水平升高或降低，指示受试者处于发展为严重CRS的高风险中。
在实施方案中，例如，在1-10天内(例如，在施用CAR T细胞(例如，本文描述的CART细胞，例如本文所述的CD19CAR-表达细胞疗法，例如CTL019)后1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天之内)测量时，细胞因子IFN-γ和sgp130中的一种或多种(例如两种)水平相对于对照水平升高例如至少2倍(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000倍或更高)，指示受试者处于发展严重CRS的高风险中，例如其中受试者是成人或儿科受试者。在实施方案中，对照水平是正常，健康成人或儿科受试者(例如，没有CRS)或者在施用CAR表达细胞之前的受试者的IFN-γ和/或sgp130水平。
在实施方案中，例如，在1-10天内(例如，在施用CAR T细胞(例如，本文描述的CART细胞，例如本文所述的CD19CAR-表达细胞疗法，例如CTL019)后1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天之内)测量时，细胞因子或细胞因子受体IFN-γ、sgp130和IL1Ra中的一种或多种(例如两种或更多种或所有三种)水平相对于对照水平改变例如至少2倍(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000倍或更高)，指示受试者处于发展严重CRS的高风险中，例如其中受试者是成人或儿科受试者。在实施方案中，改变的水平是更高水平的sgp130，更高水平的IFN-γ或更低水平的IL1Ra或其任何组合。在实施方案中，对照水平是正常，健康成人或儿科受试者(例如，没有CRS)或者在施用CAR表达细胞之前的受试者的IFN-γ和/或sgp130水平。
在实施方案中，例如，在1-10天内(例如，在施用CAR T细胞(例如，本文描述的CART细胞，例如本文所述的CD19CAR-表达细胞疗法，例如CTL019)后1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天之内)测量时，细胞因子IFN-γ、IL13和MIP1α中的一种或多种(例如两种或更多种或所有三种)水平相对于对照水平改变例如至少2倍(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、500、1000倍或更高)，指示受试者处于发展严重CRS的高风险中，例如其中受试者是儿科受试者。在实施方案中，改变的水平是更高水平的IFN-γ，更低水平的IL-13水平，更低水平的MIP1-α或其任何组合。在实施方案中，对照水平是正常，健康儿科受试者(例如，没有CRS)或者在施用CAR表达细胞之前的受试者的IFN-γ和/或sgp130水平。
在实施方案中，例如，在1-10天内(例如，在施用CAR T细胞(例如，本文描述的CART细胞，例如本文所述的CD19CAR-表达细胞疗法，例如CTL019)后1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天之内)测量时，细胞因子sgp130、IFN-γ中的一种或多种相对于对照的改变水平和高疾病负担(例如骨髓疾病)组合，指示受试者处于发展严重CRS的高风险中，例如受试者是儿科受试者。在实施方案中，改变的水平是更高水平的sgp130，更高水平的IFN-γ和更高水平的疾病负担。在实施方案中，对照水平是正常，健康儿科受试者(例如，没有CRS)或者在施用CAR表达细胞之前的受试者的IFN-γ和/或sgp130水平。
在实施方案中，在1-10天内(例如，在施用CAR T细胞(例如，本文描述的CAR T细胞，例如本文所述的CD19CAR-表达细胞疗法，例如CTL019)后1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天之内)测量时，CRP水平小于7mg/dL(例如，7、6.8、6、5、4、3、2、1mg/dL或更小)指示受试者处于发展严重CRS的低风险中。
在实施方案中，在1-10天内(例如，在施用CAR T细胞(例如，本文描述的CAR T细胞，例如本文所述的CD19CAR-表达细胞疗法，例如CTL019)后1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1天之内)测量时，CRP水平为6mg/dL或更高(例如，6、6.8、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40mg/dL或更大)指示受试者处于发展为严重CRS的高风险中。
在某些方面，本公开提供监测CRS(例如监测患有CRS0，CRS1、CSR2或CRS3的患者)或监测发展严重CRS的方法，包括评估本文的一种或多种CRS生物标志物。该方法可以包括在多个时间点，例如在2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个时间点测量一种或多种生物标志物。在某些方面，本公开提供了一种管理CRS的方法，包括评估处于发展CRS(例如，严重CRS)的风险中的受试者，以及任选地施用用于CRS的治疗，例如本文所述的治疗。
某些细胞因子或细胞因子受体可以指一种或多种同义词。例如，如本文所用，IL1R1和IL1RA都是IL1受体的同义词。sIL_1RI是sILR1的同义词。sIL_1RII是sIL1R2的同义词。
使用实验室测试来确定受试者是否有严重CRS
在一些方面，本发明的特征在于确定受试者是否具有严重CRS的方法。该方法包括例如响应于基于免疫细胞的疗法(例如，用于受试者的CAR表达细胞疗法(例如CAR19表达细胞疗法))来获取CRS风险状态，其中所述CRS风险状态包括测量以下的一个、两个或更多(全部)：
(i)在样品(例如，血液样品)中选自sTNFR2、IP10、sIL1R2、sTNFR1、M1G、VEGF、sILR1、TNFα、IFNα、GCSF、sRAGE、IL4、IL10、IL1R1、IFN-γ、IL6、IL8、sIL2Rα、sgp130、sIL6R、MCP1、MIP1α、MIP1β或GM-CSF的一种或多种(例如，3、4、5、10、15、20种或更多种)细胞因子或细胞因子受体的水平或活性，或选自C反应蛋白(CRP)，铁蛋白，乳酸脱氢酶(LDH)，天冬氨酸转氨酶(AST)或血尿素氮(BUN)，丙氨酸转氨酶(ALT)，肌酐(Cr)或纤维蛋白原的实验室检测(例如分析物)，凝血酶原时间(PT)，部分致凝血活酶时间(PTT)或其组合；
(ii)在样品(例如血液样品)中IL6，IL6R或sgp130或其组合(例如，IL6，IL6R和sgp130中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性；或
(iii)样品(例如血液样品)中IL6，IFN-γ或IL2R或其组合(例如，IL6，IFN-γ和IL2R中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性；
其中该值指示受试者的严重CRS状态。
在一些实施方案中，至少约23,500、25,000、30,000、40,000、50,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000、200,000或250,000ng/ml，并且任选地至多约299,000或412,000ng/ml的铁蛋白水平指示严重CRS。在一些实施方案中，小于约23,500、20,000、18,000、16,000、14,000、12,000、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000 5,000、4,000、3,000、2,000或1,000ng/ml，并且任选地大于约280ng/ml的铁蛋白水平指示受试者没有严重CRS。
在一些实施方案中，至少约1,700、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、15,000或20,000U/L，并且任选地至多约24,000U/L的LDH水平指示为严重CRS。在一些实施方案中，小于约1,700、1,500、1,400、1,300、1,200、1,100、1,000、900、800、700、600、500、400、300或200U/L，并且任选地大于约159U/L的LDH水平指示受试者没有严重CRS。
在一些实施方案中，至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35mg/dl，并且任选地多达约38mg/dl的CRP水平指示严重CRS。在一些实施方案中，小于约20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1mg/dl，并且任选地大于约0.7mg/dl的CRP水平指示受试者不具有严重CRS。
在一些实施方案中，至少约100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、980、900、950或1000U/L，并且任选地多达1300U/L的ALT水平指示严重CRS。在一些实施方案中，小于约100、90、80、70、60、50、40或30U/L且任选地大于约25U/L的ALT水平指示受试者不具有严重CRS。
在一些实施方案中，至少约150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、980、900、950、1000U/L，并且任选地多达约1500U/L的AST水平指示严重CRS。在一些实施方案中，小于约150、140、130、120、100、90、80、70、60、50、40或30U/L，并且任选地大于约15U/L的AST水平指示受试者没有严重CRS。
在一些实施方案中，至少约18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190mg/dl，以及任选多达约210mg/dl的BUN水平指示严重CRS。在一些实施方案中，小于约18、17、16、15、14、13、12、11或10mg/dl，和任选地大于约5mg/dl的BUN水平指示受试者不具有严重CRS。
在一些实施方案中，小于约150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40或30mg/dl，并且任选地大于约20mg/dl的纤维蛋白原水平指示严重CRS。在一些实施方案中，至少约150、160、170、180、190、200或210mg/dl，以及任选地多达约230mg/dl的纤维蛋白原水平指示受试者不具有严重CRS。
在一些实施方案中，至少约17、18、19、20、21或22秒，以及任选多达约24秒的PT水平指示严重CRS。在一些实施方案中，小于约17、16、15或14秒，并且任选地大于约12秒的PT水平指示受试者不具有严重CRS。
在一些实施方案中，至少约44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、75、80或85秒并且任选多达约95秒的PTT水平指示严重CRS。在一些实施方案中，小于约44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28或27秒且任选地大于约25秒的PTT水平指示受试者不具有严重CRS。
在一些实施方案中，患有严重CRS的患者具有>75pg/ml的IFN-α和>60pg/ml的IL-10。在一些实施方案中，患有严重CRS的患者具有大于或等于40、50、60、70或75pg/ml的IFN-α，大于或等于30、40、50或60pg/ml的IL-10水平，或其任何组合。
受试者
对于本文公开的任何方法和试剂盒，被治疗的受试者或评估的受试者是在任何治疗阶段的具有癌症或具有癌症风险的受试者。示例性的癌症包括但不限于B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)，T-细胞急性淋巴性白血病(T-ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，B细胞幼淋巴细胞白血病，胚细胞性浆细胞树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴增生性病症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆胚细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。在一个实施方案中，癌症是血液癌症。在一个实施方案中，癌症是ALL。在一个实施方案中，癌症是CLL。在一个实施方案中，癌症与CD19表达相关。
在其他实施方案中，对于本文公开的任何方法和试剂盒，所治疗的受试者或评估的受试者是待治疗的受试者或已经用CAR T细胞治疗的受试者，所述细胞例如CD19 CAR-表达细胞，例如，CTL-019。
在实施方案中，受试者是成年受试者，例如年龄大于18岁(例如18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30岁或更大、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95或95-100岁)。
在实施方案中，受试者是儿科受试者，例如年龄小于18岁(例如，17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1岁或更小)。
在实施方案中，受试者处于发展CRS(例如，严重CRS)的风险中(例如处于高风险)。在实施方案中，受试者处于发展CRS(例如严重CRS)的低风险中(例如，无风险)。
在实施例中，受试者具有CRS0、CRS1、CRS2或CRS3。
在实施方案中，使用本文描述的评估或预测方法确定受试者发展CRS(例如，严重CRS)的风险。
生物标志物评估
在一些实施方案中，将来自受试者的样品中确定的生物标志物的量定量为绝对测量(例如，ng/mL)。绝对测量可以很容易地与参照值或截断值进行比较。例如，可以确定代表疾病进展状态的截断值；高于截断值(即对于随着癌症例如血液癌症如ALL和CLL进展增加表达的生物标志物)或低于截断值(即对于随着癌症例如血液癌症如ALL和CLL进展减少表达的生物标志物)的任何绝对值可能是疾病进展。
或者，确定生物标志物的相对量。在一个实施方案中，通过将患有癌症的受试者中的一种或多种生物标志物的表达和/或活性与参照参数中的生物标志物的表达进行比较来确定相对量。在一些实施方案中，从以下中的一个或多个获得参照参数:受试者的基线或先前值，不同时间间隔的受试者，癌症受试者(例如，患者)群体的平均值或中值，健康对照或健康的受试者群体。
本公开还涉及预测医学领域，其中诊断测定法，药物基因组学和监测临床试验用于预测目的，从而预防性地治疗个体。因此，本公开的一个方面涉及用于确定对应于本文所述的一种或多种标志物的多肽或核酸的量，结构和/或活性的测定法，以便确定患有癌症(例如，血液癌症如CLL和ALL)的个体或患有癌症(例如，血液癌症如CLL和ALL)的风险的个体是否将更可能应答CAR表达细胞疗法(例如本文所述的CD19 CAR表达细胞疗法，例如，CTL019)。
基因表达检测方法
还可以测定生物标志物表达水平。本文描述的标志物的表达可以通过用于检测转录的分子或蛋白质的表达的多种已知方法中的任何一种进行评估。这些方法的非限制性实例包括用于检测分泌蛋白，细胞表面蛋白，细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法，蛋白质纯化方法，蛋白质功能或活性测定法，核酸杂交方法，核酸逆转录方法和核酸扩增方法。
在某些实施方案中，特定基因的活性的特征在于基因转录物(例如mRNA)的度量，翻译的蛋白质量的度量或基因产物活性的度量。可以通过多种方式监测标志物表达，包括检测mRNA水平，蛋白质水平或蛋白质活性，其中任何一种都可以使用标准技术进行测量。检测可以涉及基因表达水平的定量(例如，基因组DNA，cDNA，mRNA，蛋白质或酶活性)，或者可以是基因表达水平的定性评估，特别是与对照水平相比较。正在检测的水平的类型从上下文中将是清楚的。
使用核酸杂交技术检测和/或定量基因转录物(由其制备的mRNA或cDNA)的方法是本领域技术人员已知的(参见例如Sambrook等人，同上)。例如，用于评估cDNA的存在，不存在或数量的一种方法涉及如上所述的Southern转移。简言之，分离mRNA(例如，使用酸性胍盐-苯酚-氯仿提取方法，Sambrook等人，同上)，并逆转录以产生cDNA。然后任选地将cDNA消化并在缓冲液中的凝胶上运行并转移到膜中。然后使用对靶cDNA特异性的核酸探针进行杂交。
这种诊断和预后测定法的一般原理包括制备含有标志物和探针的样品或反应混合物,在适当条件下和足够使得所述标志物和探针相互作用并结合的时间内进行所述制备，从而形成复合物，其可以在反应混合物中除去和/或检测。这些测定法可以以各种方式进行。
例如，进行这种测定的一种方法将涉及将标志物或探针锚定在固相支持体(也称为基质)上，以及在反应结束时检测锚定在固相上的靶标志物/探针复合物。在这种方法的一个实施方案中，待测定标志物的存在和/或浓度的来自受试者的样品可以锚定在载体或固相支持体上。在另一个实施方案中，相反的情况是可能的，其中探针可以锚定到固相，并且来自受试者的样品可以作为测定的未锚定组分反应。
为了用上述方法进行测定，将非固定化组分加入其上锚定第二组分的固相中。反应完成后，可以在形成的任何复合物将固定在固相上的条件下除去(例如通过洗涤)未复合的组分。锚定到固相的标志物/探针复合物的检测可以用本文概述的许多方法完成。
在另一个实施方案中，当探针是未锚定的测定组分时，其可以被标记以便直接或间接地用本文讨论的并且本领域技术人员熟知的可检测标记检测和读出测定。
也可以直接检测标志物/探针复合物形成，而无需进一步操作或标记任一组分(标志物或探针)，例如通过利用荧光能量转移技术(参见例如Lakowicz等人，美国专利号5,631,169；Stavrianopoulos等人，美国专利号4,868,103)。选择第一个“供体”分子上的荧光标记，使得当用适当波长的入射光激发时，其发射的荧光能量将被第二个“受体”分子上的荧光标记吸收，“受体”分子由于吸收的能量能够发出荧光。或者，“供体”蛋白质分子可以简单地利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记，使得“受体”分子标记可以与“供体”的不同。由于标签之间能量转移的效率与分离分子的距离有关，因此可以评估分子之间的空间关系。在分子之间发生结合的情况下，测定中“受体”分子标记的荧光发射应该是最大的。可以通过本领域公知的标准荧光检测手段(例如，使用荧光计)方便地测量FET结合事件。
在另一个实施方案中，可以通过利用诸如实时生物分子相互作用分析(BIA)的技术完成测定探针识别标志物的能力而无需标记测定组分(探针或标志物)(参见例如Sjolander,S.and Urbaniczky,C.,1991,ANAL.CHEM.63:2338-2345以及Szabo等人，1995,CURR.OPIN.STRUCT.BIOL.5:699-705)。如本文所用，“BIA”或“表面等离振子共振”是用于实时研究生物特异性相互作用的技术，而不标记任何相互作用体(例如BIAcore)。结合表面上的质量变化(指示结合事件)导致表面附近的光的折射率的改变(表面等离振子共振(SPR)的光学现象))，导致可检测的信号，其可以用作生物分子之间的实时反应的指示。
或者，在另一个实施方案中，类似的诊断和预后测定可以用标志物和探针作为溶质在液相中进行。在这种测定中，通过许多标准技术中的任何一种将复合的标志物和探针与未复合的组分分离，所述技术包括但不限于:差速离心，层析，电泳和免疫沉淀。在差速离心中，可以通过一系列离心步骤将标志物/探针复合物与未复合的测定组分分离，这是由于基于不同大小和密度对复合物的不同沉降平衡(参见例如Rivas,G.,and Minton,A.P.,1993,Trends Biochem Sci.18(8):284-7)。也可以使用标准层析技术将复合分子与未复合的分子分离。例如，凝胶过滤层析基于大小分离分子，并且通过利用柱形式的合适的凝胶过滤树脂，例如，相对较大的复合物可以与相对较小的未复合的组分分离。类似地，与未复合的组分相比，标志物/探针复合物的相对不同的电荷性质可以被利用以区分复合物与未复合组分，例如通过利用离子交换层析树脂。这样的树脂和层析技术是本领域技术人员公知的(参见例如Heegaard,N.H.,1998,J.MOL.RECOGNIT.Winter 11(1-6):141-8；Hage,D.S.,and Tweed,S.A.J CHROMATOGR B BIOMED SCI APPL 1997 Oct 10，699(1-2):499-525)。还可以使用凝胶电泳来将复合的测定组分与未结合的组分分离(参见例如Ausubel等人编，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987-1999)。在这种技术中，蛋白质或核酸复合物例如根据大小或电荷分离。为了维持电泳过程中的结合相互作用，非变性凝胶基质材料和不存在还原剂的条件是典型的。对于特定测定及其组分的适当条件对于本领域技术人员来说是众所周知的。
在一个具体实施方案中，可以使用本领域已知的方法，通过原位和体外形式来确定生物样品中对应于标志物的mRNA的水平。术语“生物样品”旨在包括从受试者分离的组织，细胞，生物流体及其分离物，以及存在于受试者内的组织，细胞和流体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，不针对mRNA的分离而选择的任何RNA分离技术可以用于从细胞中纯化RNA(参见例如Ausubel等人编，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York 1987-1999)。此外，使用本领域技术人员熟知的技术，例如Chomczynski(1989，美国专利号4,843,155)的单步RNA分离方法可以容易地处理大量的组织样品。
分离的核酸可用于杂交或扩增测定，包括但不限于Southern或Northern分析，聚合酶链反应分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的一种诊断方法包括使分离的mRNA与可与被检测的基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是例如全长cDNA或其部分，例如长度至少为7、15、30、50、100、250或500个核苷酸，并且足以在严格条件下与编码本发明标志物的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。本文描述了用于诊断测定的其它合适的探针。mRNA与探针的杂交表明正在表达所讨论的标志物。
在一种形式中，将mRNA固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜(例如硝酸纤维素)上。在备选形式中，将探针固定在固体表面上，并且将mRNA与探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可以容易地调整已知的mRNA检测方法，以用于检测由本文所述的标志物编码的mRNA的水平。
探针可以是编码蛋白质的核酸序列的全长或小于全长。经验测试较短探针的特异性。示例性的核酸探针的长度为20个碱基或更长(对于选择用于核酸杂交的核酸探针序列的方法参见例如Sambrook等人)。杂交部分的显现允许定性测定cDNA的存在或不存在。
用于确定样品中相应于本发明的标志物的转录物水平的备选方法涉及核酸扩增方法，例如通过rtPCR(Mullis，1987，美国专利号4,683,202中所述的实验实施方案)，连接酶链反应(Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:189-193)，自持续序列复制(Guatelli等人，1990,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87:1874-1878)，转录扩增系统(Kwoh等人，1989,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 86:1173-1177)，Q-Beta复制酶(Lizardi等人，1988,BIO/TECHNOLOGY 6:1197)，滚环复制(Lizardi等人，美国专利号5,854,033)或任何其它核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。荧光rtPCR也可用于本发明的方法。在荧光rtPCR中，定量是基于荧光信号的量，例如TaqMan和sybr green。如果这样的分子以非常低的数量存在，则这些检测方案对于检测核酸分子是特别有用的。如本文所用，扩增引物被定义为可以退火到基因的5'或3'区域的一对核酸分子(分别为正负链，反之亦然)，并且其间包含短区域。通常，扩增引物长度为约10至30个核苷酸，并且侧翼是长度为约50至200个核苷酸的区域。在合适的条件下并且使用合适的试剂，这样的引物允许扩增包含侧翼为引物的核苷酸序列的核酸分子。
对于原位方法，mRNA在检测前不需要从细胞中分离出来。在这种方法中，使用组织学方法制备/加工细胞或组织样品。然后将样品固定在支持体(通常为载玻片)上，然后与可以与编码标志物的mRNA杂交的探针接触。
作为基于标志物的绝对表达水平进行测定的备选方案，可以基于标志物的归一化表达水平进行测定。通过将其表达与不是标志物的基因(例如组成型表达的持家基因)的表达进行比较来校正标志物的绝对表达水平，使表达水平归一化。合适的归一化基因包括持家基因，例如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性基因。该归一化允许将一个样品(例如，受试者样品)中的表达水平与另一个样品(例如健康受试者)或来自不同来源的样品之间进行比较。
或者，表达水平可以作为相对表达水平提供。为了确定标志物的相对表达水平，在测定所讨论的样品的表达水平之前，测定10个或更多个正常对癌症分离物或甚至50个或更多个样品的标志物的表达水平。确定在较大数量的样品中测定的每种基因的平均表达水平，并且这用作标志物的基线表达水平。然后将为测试样品(绝对表达水平)确定的标志物的表达水平除以为该标志物获得的平均表达值。这提供了相对表达水平。
在某些实施方案中，在基线测定中使用的样品将来自具有癌症(例如，血液癌症如ALL和CLL)的受试者的样品与来自相同组织类型的健康受试者的样品。细胞来源的选择取决于相对表达水平的使用。使用在正常组织中发现的表达作为平均表达得分有助于验证所测定的标志物是否对组织特异，所述细胞来源于所述组织(相对于正常细胞)。另外，随着更多的数据被累积，可以修改平均表达值，提供基于累积数据的改进的相对表达值。来自正常细胞的表达数据提供了分级癌症疾病状态的严重性的手段。
在另一个实施方案中，通过从受试样品中的细胞制备基因组DNA或mRNA/cDNA(即转录的多核苷酸)并通过将基因组DNA或mRNA/cDNA与参照多核苷酸杂交来评估标志物的表达，所述参照多核苷酸是包含标志物的多核苷酸的互补序列，及其片段。任选地，在与参考多核苷酸杂交之前，可以使用多种聚合酶链式反应方法中的任何一种来扩增cDNA。同样可以使用定量PCR(QPCR)检测一种或多种标志物的表达，以评估标志物的表达水平。或者，可以使用检测本发明标志物的突变或变体(例如单核苷酸多态性，缺失等)的许多已知方法中的任何一种来检测受试者中突变标志物的发生。
在相关实施方案中，将从样品获得的转录的多核苷酸的混合物与基质接触，所述基质固定有与至少部分(例如，至少7，至少10，至少15，至少15，至少20，至少25，至少30，至少40，至少50，至少100，至少500个或更多个核苷酸残基)本文所述的标志物互补或同源的多核苷酸。如果与本文所述的标志物互补或与同源的多核苷酸在底物上是可差别检测的(例如，使用不同的发色团或荧光团可检测或固定到不同的选定位置)，则可以使用单个基质(例如，固定在选定位置的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时评估多种标志物的表达水平。当使用涉及一个核酸与另一个核酸杂交的评估标志物表达的方法时，杂交可以在严格的杂交条件下进行。
在另一个实施方案中，利用评估标志物表达的方法的组合。
因为组合物，试剂盒和方法可以依赖于检测本文所述的一种或多种标志物的表达水平的差异，在某些实施方案中，标志物的表达水平显著大于用于评估在来自患有癌症(例如，诸如ALL和CLL的血液癌症)的受试者的生物样品的至少一种或参考物(例如，来自健康受试者，例如，无癌症的受试者的生物样品)中表达的方法的最小检测限。
核酸分子和探针
本公开的一个方面涉及对应于本文所述的一种或多种标志物的分离的核酸分子，包括编码对应于本文所述的一种或多种标志物的多肽或这种多肽的一部分的核酸。核酸分子包括存在于本文鉴定的基因组区域中的那些核酸分子。分离的核酸分子还包括足以用作杂交探针以鉴定对应于本文所述标志物的核酸分子的核酸分子，包括编码对应于本文所述标志物的多肽的核酸分子和此类核酸分子的片段，例如适合用作PCR引物用于扩增或突变核酸分子的那些。如本文所使用的，术语“核酸分子”旨在包括使用核苷酸类似物产生的DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的；在某些实施方案中，核酸分子是双链DNA。
“分离的”核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分离的。在某些实施方案中，“分离的”核酸分子不含天然侧翼于衍生所述核酸的生物的基因组DNA中核酸的序列(即位于核酸的5'和3'端的序列)(例如蛋白质编码序列)。
术语“基本上不含其它细胞材料或培养基”包括核酸分子的制剂，其中所述分子与从所述细胞分离的细胞组分分离或重组产生。因此，基本上不含细胞材料的核酸分子包括核酸分子的制剂，其具有小于约30％，小于约20％，小于约10％或小于约5％(以干重计)的其他细胞材料或培养基。
如果需要，可以使用标准分子生物学技术和本文所述的数据库记录中的序列信息分离核酸分子，例如本文鉴定的标志物基因产物。使用这些核酸序列的全部或部分，可以使用标准杂交和克隆技术分离核酸分子(例如，如Sambrook等人编，MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989中所述)。
可以使用cDNA，mRNA或基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术扩增核酸分子。如此扩增的核酸分子可以克隆到合适的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。此外，对应于本发明的核酸分子的全部或一部分的寡核苷酸可以通过标准合成技术制备，例如使用自动化DNA合成仪。
基于本发明的核酸分子的序列的探针可用于检测对应于本文所述的一种或多种标志物的转录物(例如mRNA)或基因组序列。探针包含与其连接的标记基团，例如放射性同位素，荧光化合物，酶或酶辅因子。这样的探针可以用作用于鉴定错误表达蛋白质的细胞或组织的诊断测试试剂盒的一部分，例如通过测量来自受试者的细胞样品中编码所述蛋白质的核酸分子的水平，例如检测mRNA水平或确定编码所述蛋白质的基因是否已突变或缺失。
多肽检测
测量本文描述的生物标志物的方法包括但不限于:蛋白质印迹，免疫印迹，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，免疫沉淀，表面等离振子共振，化学发光，荧光偏振，磷光，免疫组织化学分析，液相色谱质谱(LC-MS)，基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱，微细胞计数，微阵列，显微术，荧光激活细胞分选(FACS)，流式细胞术，激光扫描细胞计数，血液学分析仪和基于蛋白质性质的测定，包括但不限于DNA结合，配体结合或与其它蛋白质配偶体的相互作用。
也可以通过检测或定量表达的多肽来检测和/或定量标志物蛋白的活性或水平。可以通过本领域技术人员公知的多种方法中的任何一种来检测和定量多肽。这些可以包括分析生物化学方法，如电泳，毛细管电泳，高效液相层析(HPLC)，薄层层析(TLC)，超扩散层析等，或各种免疫学方法，如液体或凝胶沉淀素反应，免疫扩散(单或双倍)，免疫电泳，放射免疫测定(RIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，免疫荧光测定，Western印迹，免疫组织化学等。技术人员可以容易地调整用于确定血清样品中一种或多种生物标志物的表达水平的已知蛋白质/抗体检测方法。
用于检测多肽的另一种试剂是能够结合对应于本文所述标志物的多肽的抗体，例如具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆或单克隆抗体。可以使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab')2)。关于探针或抗体，术语“标记的”旨在包括通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即，物理连接)来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂的反应性间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体，并用生物素终止标记DNA探针，以便其可用荧光标记的链霉亲和素检测。
在另一个实施方案中，抗体是被标记的，例如放射性标记的，生色团标记的，荧光团标记的或酶标记的抗体。在另一个实施方案中，使用抗体衍生物(例如，与底物缀合或与蛋白质-配体对{例如生物素-链霉亲和素}的蛋白质或配体缀合的抗体)或抗体片段(例如，单链抗体，分离的抗体高变区等)，其与对应于标志物的蛋白质(例如由对应于标志物的可读框编码的蛋白质或经历其正常翻译后修饰的全部或部分的蛋白质)特异性结合。
可以使用本领域技术人员熟知的技术来分离来自细胞的蛋白质。所使用的蛋白质分离方法可以是例如在Harlow和Lane(Harlow and Lane,1988,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)中描述的那些。
在一种形式中，抗体或抗体片段可用于诸如Western印迹或免疫荧光技术的方法中以检测所表达的蛋白质。在这种用途中，可以将抗体或蛋白质固定在固相支持体上。合适的固相支持体或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持体。合适的支持体或载体包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龙，淀粉酶，天然和改性纤维素，聚丙烯酰胺，辉长岩和磁石。
在另一个实施方案中，使用免疫测定法检测多肽。如本文所用，免疫测定法是利用抗体特异性结合分析物的测定法。因此，免疫测定法通过检测多肽与抗体的特异性结合来表征，而不是使用其他物理或化学性质来分离，靶向和定量分析物。
使用许多公知的免疫结合测定法中的任一种来检测和/或定量多肽(参见例如美国专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168)。关于一般免疫测定法的综述，另见Asai(1993)Methods in Cell Biology Volume 37:Antibodies in Cell Biology,Academic Press,Inc.New York；Stites&Terr(1991)Basic and Clinical Immunology，第7版。
在另一个实施方案中，使用
Figure BDA0003753655610000911
测定技术检测和/或定量多肽。
Figure BDA0003753655610000912
测定将微小的颜色编码的珠粒分离成例如不同的组，每组都用用于特定生物测定的试剂包被，从而以多路方式捕获和检测来自样品的特定分析物。可以使用基于珠的荧光细胞计数法将
Figure BDA0003753655610000913
测定技术与多路ELISA测定进行比较，以检测分析物，如生物标志物。
本公开还包括用于检测生物样品，例如含有组织，全血，血清，血浆，颊刮，唾液，脑脊液，尿液，粪便和骨髓的样品中对应于本文所述标志物的多肽或核酸的存在的试剂盒。这样的试剂盒可用于确定受试者发展严重CRS的风险。例如，试剂盒可以包含能够检测生物样品中对应于本文所述标志物的多肽的多肽或编码所述多肽的mRNA的标记化合物或试剂，以及用于测定样品中多肽或mRNA的量的工具(例如，结合多肽的抗体或与编码多肽的DNA或mRNA结合的寡核苷酸探针)。试剂盒还可以包括解释使用试剂盒获得的结果的说明书。
因此，本公开内容包括用于评估受试者发展严重CRS的风险的试剂盒。
用于与对应于本文所述标志物的多肽结合的合适试剂包括抗体，抗体衍生物，抗体片段等。用于与核酸(例如基因组DNA、mRNA、剪接的mRNA、cDNA等)结合的合适的试剂包括互补核酸。例如，核酸试剂可包括固定于基质的寡核苷酸(标记或未标记的)，未与基质结合的标记寡核苷酸，PCR引物对，分子信标探针等。
试剂盒可以任选地包含用于执行本文所述方法的其它组分。作为示例，试剂盒可以包含适于退火互补核酸或将抗体与其特异性结合的蛋白质结合的液体(例如，SSC缓冲液)，一个或多个样品室，描述本发明的方法的性能的指导材料，用于比较本文所述的生物标志物的表达水平的参照样品等。
本发明的试剂盒可以包含可用于测定标志物的蛋白质水平或蛋白质活性的试剂。
治疗剂，组合物和施用
本文描述的方法可用于评估受试者中发展严重CRS的风险状态，例如，受试者将被施用或已经被施用表达CAR的细胞。
在一个实施方案中，细胞表达CAR分子，所述CAR分子包含抗原结合结构域(例如，特异性结合肿瘤抗原的抗体或抗体片段)，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，细胞内信号传导结构域，其包含共刺激结构域和/或一级信号传导结构域)。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含本领域已知的靶向或特异性结合本文所述的任何肿瘤抗原的任何抗体或其片段，例如scFv。例如，肿瘤抗原是CD19。抗体或其片段可以是鼠，人源化或完全人的抗体或其片段，例如scFv。
在一个实施方案中，CAR包含抗体或抗体片段，其包含本文所述的抗-CD19结合结构域(例如，本文所述特异性结合CD19的鼠或人源化抗体或抗体片段)，本文所述的跨膜结构域，以及本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，包含本文所述的共刺激结构域和/或一级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域)。
抗原结合结构域
在一个方面，CAR包含靶特异性的结合元件，另外称为抗原结合结构域。部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别在特定疾病状态有关的靶细胞上起细胞表面标志物作用的配体。因此，可以作为本发明的CAR中抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物的实例包括那些与病毒，细菌和寄生虫感染，自身免疫性疾病和癌症细胞相关的细胞表面标志物。
在一个方面中，可通过将特异性结合所需抗原的抗原结合结构域工程化为CAR的方式，将CAR介导的T细胞应答导向目的抗原。
在一个方面中，包含抗原结合结构域的CAR的部分包含靶向肿瘤抗原，例如，本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域。
抗原结合结构域可以是结合如下抗原的任何结构域:包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体，比如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科来源的纳米抗体的可变结构域(VHH)，且结合本领域已知的备选的支架以抗原结合结构域形式(比如重组纤连蛋白结构域、T细胞受体(TCR)或其片段，例如单链TCR等)起作用。在某些情况下，抗原结合结构域来源于与CAR的最终用处相同的物种是有利的。例如，为了用于人类，CAR的抗原结合结构域包含人类或人源化的用于抗体或抗体片段的抗原结合结构域的残基可能是有利的。
在PCT公开WO2012/079000中描述了鼠CD19 CAR构建体，其通过引用并入本文，并且鼠CD19 CAR和scFv构建体的氨基酸序列示于下表1中。
表1：鼠CD19 CAR构建体
Figure BDA0003753655610000941
Figure BDA0003753655610000951
Figure BDA0003753655610000961
包含人源化抗CD19 scFv结构域的CD19 CAR构建体描述于PCT公开WO 2014/153270中，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗CD19抗体或其片段，例如scFv。例如，抗原结合结构域包含表2中列出的可变重链和可变轻链。连接可变重链和可变轻链的接头序列可以是例如本文所述的任何接头序列，或者备选地，可以为GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQID NO:45)。
表2:抗CD19抗体结合结构域
Figure BDA0003753655610000962
Figure BDA0003753655610000971
Figure BDA0003753655610000981
任何已知的CD19 CAR，例如本领域中任何已知CD19 CAR的CD19抗原结合结构域可以根据本公开使用。例如，CD19 CAR可以是LG-740，或在下面任一中描述的任何CAR：USPat.No.8,399,645；US Pat.No.7,446,190；Xu等人，Leuk Lymphoma.2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人，Blood 122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人，Blood,118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人，Blood 116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人，Blood 122(25):4129-39(2013)；Kochenderfer,J.N.等人，J.Immunother.32(7),689-702(2009)；Genbank登录号HM852952；16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)(May 15-18,Salt Lake City)2013,Abst 10；WO2012/129514；和WO2014/031687,其各通过引用引入本文。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自本文(例如上述)列举的抗体的一、二、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3，和/或来自本文(例如上述)列举的抗体的一、二、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含本文(例如上述)列举或描述的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施方案中，完整CAR构建体是表3中列出的CAR。表3提供了使用表2中列出的各种CAR结构域(例如跨膜和胞内信号传导结构域)产生的示例性全CD19 CAR构建体，以及表2中列出的抗CD19抗原结合结构域。氨基酸序列被命名为(aa)并且核酸序列被命名为(nt)。
表3.CD19 CAR构建体
Figure BDA0003753655610000991
Figure BDA0003753655610001001
Figure BDA0003753655610001011
Figure BDA0003753655610001021
Figure BDA0003753655610001031
Figure BDA0003753655610001041
Figure BDA0003753655610001051
Figure BDA0003753655610001061
Figure BDA0003753655610001071
Figure BDA0003753655610001081
Figure BDA0003753655610001091
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗CD19抗体或其片段，例如scFv。例如，抗原结合结构域包含表4中列出的可变重链和可变轻链。连接可变重链和可变轻链的接头序列可以是本文所述的任何接头序列，或者可以是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：NO：84)。
表4：抗CD19抗体结合结构域
Figure BDA0003753655610001092
表5：另外的抗CD19抗体结合结构域
Figure BDA0003753655610001093
Figure BDA0003753655610001101
Figure BDA0003753655610001111
scFv结构域的人源化CDR序列的重链可变结构域序列在表6中示出并且轻链可变结构域序列在表7中示出。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。
表6：重链可变结构域CDR(Kabat)
Figure BDA0003753655610001112
表7：轻链可变结构域CDR(Kabat)
Figure BDA0003753655610001121
在一些实施方案中，CD19 CAR包含衍生自(例如，包含其氨基酸序列)抗CD19抗体(例如抗CD19单或双特异性抗体)或其片段或缀合物的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抗CD19抗体是如WO2014/153270(例如，WO2014/153270的表3)中所述的人源化抗原结合结构域(其通过引用并入本文)或其缀合物。其他示例性的抗CD19抗体或其片段或缀合物包括但不限于靶向CD19的双特异性T细胞衔接器(engager)(例如blinatumomab)，SAR3419(Sanofi)，MEDI-551(MedImmune LLC)，Combotox，DT2219ARL(Masonic Cancer Center)，MOR-208(也称为XmAb-5574；MorphoSys)，XmAb-5871(Xencor)，MDX-1342(Bristol-MyersSquibb)，SGN-CD19A(Seattle Genetics)和AFM11(Affimed Therapeutics)。参见例如Hammer.MAbs.4.5(2012)：571-77。Blinatomomab是一种双特异性抗体，由两种scFv组成，一种结合CD19，另一种结合CD3。Blinatomomab指导T细胞攻击癌细胞。参见例如Hammer等人；临床试验标识号NCT00274742和NCT01209286。MEDI-551是一种人源化抗CD19抗体，其Fc被改造为具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT01957579。Combotox是与CD19和CD22结合的免疫毒素的混合物。免疫毒素由与脱糖基化的蓖麻毒蛋白A链融合的scFv抗体片段组成。参见例如Hammer等人；和Herrera等人，J.Pediatr.Hematol.ONCOL.31.12(2009)：936-41；Schindler等人，Br.J.Haematol.154.4(2011)：471-6。DT2219ARL是靶向CD19和CD22的双特异性免疫毒素，由两种scFv和截短的白喉毒素组成。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT00889408。SGN-CD19A是抗体-药物缀合物(ADC)，由与合成的细胞毒性细胞杀伤剂单甲基auristatin F(MMAF)连接的抗CD19人源化单克隆抗体组成。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT01786096和NCT01786135。SAR3419是抗CD19抗体-药物缀合物(ADC)，其包含经由可切割接头缀合至美登素衍生物的抗CD19人源化单克隆抗体。参见例如Younes等人,J.Clin.ONCOL.30.2(2012)：2776-82；Hammer等人，临床试验标识号NCT00549185；和Blanc等人，Clin Cancer Res.2011；17：6448-58。XmAb-5871是Fc工程化的人源化抗CD19抗体。参见例如Hammer等人。MDX-1342是具有增强的ADCC的人Fc工程化抗CD19抗体。参见例如Hammer等人。在实施方案中，抗体分子是双特异性抗CD19和抗CD3分子。例如，AFM11是靶向CD19和CD3的双特异性抗体。参见例如Hammer等人；和临床试验标识号NCT02106091。在一些实施方案中，本文所述的抗CD19抗体缀合或另外结合治疗剂例如化疗剂，肽疫苗(例如在Izumoto等人，2008 J Neurosurg 108：963-971中描述的)，免疫抑制剂，或免疫(性)烧蚀剂例如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨喋呤，霉酚酸酯，FK506，CAMPATH，抗CD3抗体，细胞毒素，氟达拉滨，雷帕霉素，麦考酚酸，类固醇，FR901228或细胞因子。
在一个实施方案中，针对CD19的抗原结合结构域是本文表中所述的抗原结合结构域的抗原结合部分，例如CDR。
在实施方案中，BCMA CAR包含抗BCMA结合结构域(例如人或人源化抗BCMA结合结构域)，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，并且其中所述抗BCMA结合结构域包含表8或9中列出的任何抗BMCA重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在一个实施方案中，抗BCMA结合结构域包含本文(例如表8或9中)描述的轻链可变区和/或本文(例如表8或9中)描述的重链可变区。
在一个实施方案中，编码的抗BCMA结合结构域是包含表8或9的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。
在一个实施方案中，人或人源化抗BCMA结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含具有表8或9中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代，例如保守取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列或与表8或9中提供的轻链可变区的氨基酸序列具有至少95％(例如95％-99％)的同一性的序列；和/或重链可变区，其包含具有表8或9中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代，例如保守取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列或与表8或9中提供的重链可变区的氨基酸序列具有至少95％(例如95％-99％)的同一性的序列。
表8.示例性抗BCMA scFv结构域和BCMA CAR分子的氨基酸和核酸序列
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表9.额外的示例性BCMA CAR序列
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可以使用CAR表达细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19，CD123，EGFRvIII，间皮素等，如例如WO 2014/130635，WO 2014/130657，和WO 2015/090230中所述，其各自的全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，特异性结合CD19的CAR T细胞具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。CTL019通过T细胞的基因修饰来制备，其经由用自失活的复制缺陷型慢病毒(LV)载体转导通过稳定插入介导，所述载体含有EF-1α启动子控制下的CTL019转基因。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞的百分比递送给受试者。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合人CD19，例如，可以包括根据WO2014/153270(通过引用并入本文)的表3的CAR分子或抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。
在实施方案中，CAR分子包含本文所述的CD19 CAR分子，例如US-2015-0283178-A1中描述的CD19 CAR分子，例如CTL019。在实施方案中，CD19 CAR包含氨基酸，或具有US-2015-0283178-A1(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合CD123，例如，可以包括根据WO2014/130635(通过引用并入本文)的表1-2的CAR分子(例如CAR1-CAR8任一个)或抗原结合结构域。
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的CD123 CAR，例如US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中描述的CD123 CAR，二者均通过引用并入本文。在实施方案中，CD123CAR包含氨基酸，或具有US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中所示的核苷酸序列，二者均通过引用并入本文。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合EGFRvIII，例如可以包括根据WO2014/130657(其通过引用并入本文)的表2或SEQ ID NO:11的CAR分子或抗原结合结构域。
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的EGFRvIII CAR分子，例如US2014/0322275A1(其通过引用并入本文)中描述的EGFRvIII CAR。在实施方案中，EGFRvIII CAR包含氨基酸，或具有US2014/0322275A1(其通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列。
在其它实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合间皮素，例如可以包括根据WO2015/090230(其通过引用并入本文)的表2-3的CAR分子或抗原结合结构域。
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的间皮素CAR，例如WO 2015/090230(其通过引用并入本文)中描述的间皮素CAR。在实施方案中，间皮素CAR包含氨基酸，或具有WO2015/090230(其通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的BCMA CAR分子，例如US-2016-0046724-A1中所述的BCMA CAR。在实施方案中，BCMA CAR包含氨基酸，或具有US-2016-0046724-A1(其通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的CLL1 CAR，例如US2016/0051651A1(其通过引用并入本文)中描述的CLL1 CAR。在实施方案中，CLL1 CAR包含氨基酸，或具有US2016/0051651A1(其通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，CAR分子包含本文描述的CD33 CAR，例如US2016/0096892A1(其通过引用并入本文)中描述的CD33 CAR。在实施方案中，CD33CAR包含氨基酸，或具有US2016/0096892A1(其通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自上文所列抗体的一个，两个或三个(例如全部三个)重链CDR:HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3，和/或一个，二个，三个(例如，全部三个)轻链CDR:LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含上文列出或描述的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施方案中，肿瘤抗原是在国际申请WO2015/142675中描述的肿瘤抗原，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，肿瘤抗原选自以下一种或多种:CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也被称为CD2子集1，CRACC，SLAMF7，CD319，和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)和Alelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(AB1)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾胚细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1A)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；FOS相关抗原1；肿瘤蛋白质p53(p53)；p53突变体；prostein；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)，由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经胚细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点的调节物的兄弟)，由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物受体(RAGE-1)；肾uibiguitous 1(RU1)；肾uibiguitous 2(RU2)；legumain；人类乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人类乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hosp 70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；与免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
根据本文所述的任何方法或组合物，在实施方案中，CAR分子包含本文描述的CD123 CAR，例如US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中描述的CD123 CAR，二者均通过引用并入本文。在实施方案中，CD123CAR包含氨基酸，或具有US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中所示的核苷酸序列，二者均通过引用并入本文。在其他实施方案中，CAR分子包含本文所述的CD19 CAR分子，例如US-2015-0283178-A1中描述的CD19 CAR分子，例如CTL019。在实施方案中，CD19 CAR包含氨基酸，或具有US-2015-0283178-A1中所示的核苷酸序列，通过引用并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的BCMA CAR分子，例如US-2016-0046724-A1中所述的BCMA CAR。在实施方案中，BCMA CAR包含氨基酸，或具有US-2016-0046724-A1中所示的核苷酸序列，通过引用并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的CLL1 CAR，例如US2016/0051651A1中描述的CLL1 CAR，其通过引用并入本文。在实施方案中，CLL1 CAR包含氨基酸，或具有US2016/0051651A1中所示的核苷酸序列，通过引用并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的CD33 CAR，例如US2016/0096892A1中所述的CD33 CAR，其通过引用并入本文。在实施方案中，CD33 CAR包含氨基酸，或具有US2016/0096892A1中所示的核苷酸序列，通过引用并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的EGFRvIII CAR分子，例如描述为US2014/0322275A1的EGFRvIIICAR，通过引用并入本文。在实施方案中，EGFRvIII CAR包含氨基酸，或具有US2014/0322275A1中所示的核苷酸序列，通过引用并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的间皮素CAR，例如WO 2015/090230中描述的间皮素CAR，其通过引用并入本文。在实施方案中，间皮素CAR包含氨基酸，或具有WO 2015/090230中所示的核苷酸序列，通过引用并入本文。
示例性的CD19 CAR包括本文所述的CD19 CAR，例如本文所述的一个或多个表中，或在下文中描述的抗CD19 CAR：Xu等人，Blood 123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人，Blood 122.25(2013):4129-39，Cruz等人，Blood 122.17(2013):2965-73，NCT00586391，NCT01087294，NCT02456350，NCT00840853，NCT02659943，NCT02650999，NCT02640209，NCT01747486，NCT02546739，NCT02656147，NCT02772198，NCT00709033，NCT02081937，NCT00924326，NCT02735083，NCT02794246，NCT02746952，NCT01593696，NCT02134262，NCT01853631，NCT02443831，NCT02277522，NCT02348216，NCT02614066，NCT02030834，NCT02624258，NCT02625480，NCT02030847，NCT02644655，NCT02349698，NCT02813837，NCT02050347，NCT01683279，NCT02529813，NCT02537977，NCT02799550，NCT02672501，NCT02819583，NCT02028455，NCT01840566，NCT01318317，NCT01864889，NCT02706405，NCT01475058，NCT01430390，NCT02146924，NCT02051257，NCT02431988，NCT01815749，NCT02153580，NCT01865617，NCT02208362，NCT02685670，NCT02535364，NCT02631044，NCT02728882，NCT02735291，NCT01860937，NCT02822326，NCT02737085，NCT02465983，NCT02132624，NCT02782351，NCT01493453，NCT02652910，NCT02247609，NCT01029366，NCT01626495，NCT02721407，NCT01044069，NCT00422383，NCT01680991，NCT02794961或NCT02456207，其全部内容各自通过引用引入本文。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自本文所述抗体的一、二或三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3(例如WO2015/142675，US-2015-0283178-A1，US-2016-0046724-A1，US2014/0322212A1，US2016/0068601A1，US2016/0051651A1，US2016/0096892A1，US2014/0322275A1或WO2015/090230中描述的抗体)，和/或来自本文所述抗体的一、二或三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3(例如WO2015/142675，US-2015-0283178-A1，US-2016-0046724-A1，US2014/0322212A1，US2016/0068601A1，US2016/0051651A1，US2016/0096892A1，US2014/0322275A1或WO2015/090230中描述的抗体，通过引用并入本文)。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含上文列出的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在实施方案中，抗原结合结构域是WO2015/142675，US-2015-0283178-A1，US-2016-0046724-A1，US2014/0322212A1，US2016/0068601A1，US2016/0051651A1，US2016/0096892A1，US2014/0322275A1或WO2015/090230中描述的抗原结合结构域，其通过引用并入本文。
在实施方案中，抗原结合结构域靶向BCMA并描述于US-2016-0046724-A1中。
在实施方案中，抗原结合结构域靶向CD19并描述于US-2015-0283178-A1中。
在实施方案中，抗原结合结构域靶向CD123，并描述于US2014/0322212A1，US2016/0068601A1中。
在实施方案中，抗原结合结构域靶向CLL并描述于US2016/0051651A1中。
在实施方案中，抗原结合结构域靶向CD33并描述于US2016/0096892A1中。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19，CD123，EGFRvIII，CD33，间皮素，BCMA和GFR ALPHA-4等，如描述于，例如，WO2014/153270，WO 2014/130635，WO2016/028896，WO 2014/130657，WO2016/014576，WO 2015/090230，WO2016/014565，WO2016/014535和WO2016/025880，其各自通过引用整体并入本文。
在其他实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合人源化CD19，例如可以包括根据WO2014/153270的表3的CAR分子或抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)，其通过引用并入本文。编码CD19 CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一、二、三个VH CDR；和一、二、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2014/153270中具体说明。
在其他实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据WO2014/130635的表1-2的CAR分子(例如CAR1至CAR8的任何一种)或抗原结合结构域，通过引用并入本文。编码CD123CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一、二、三个VH CDR；和一、二、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2014/130635中具体说明。
在其他实施方案中，CAR-表达细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据WO2016/028896的表2、6和9的CAR分子(例如CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任何)或抗原结合结构域，通过引用并入本文。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一、二、三个VH CDR；和一、二、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/028896中具体说明。
在其他实施方案中，表达CAR的细胞可特异性结合EGFRvIII，例如可包括根据WO2014/130657的表2或SEQ ID NO：11的CAR分子或抗原结合结构域，其通过引用并入本文。编码EGFRvIII CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一、二、三个VHCDR和一、二、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2014/130657中具体说明。
在其他实施方案中，CAR-表达细胞可以特异性结合CD33，例如可以包括根据WO2016/014576的表2或9的CAR分子(例如，CAR33-1至CAR-33-9中的任何)或抗原结合结构域，通过引用并入本文。编码CD33CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一、二、三个VH CDR；和一、二、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014576中具体说明。
在其他实施方案中，表达CAR的细胞可特异性结合间皮素，例如可包括根据WO2015/090230的表2-3的CAR分子或抗原结合结构域，其通过引用并入本文。编码间皮素CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一、二、三个VH CDR；和一、二、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2015/090230中具体说明。
在其他实施方案中，CAR表达细胞可以特异性结合BCMA，例如可以包括根据WO2016/014565的表1或16，SEQ ID NO：271或SEQ ID NO：273的CAR分子或抗原结合结构域，通过引用并如本文。编码BCMA CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一、二、三个VH CDR和一、二、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014565中具体说明。
在其他实施方案中，CAR表达细胞可特异性结合CLL-1，例如可包括根据WO2016/014535的表2的CAR分子或抗原结合结构域，其通过引用并入本文。编码CLL-1 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一、二、三个VH CDR和一、二、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014535中具体说明。
在其他实施方案中，CAR表达细胞可特异性结合GFR ALPHA-4，例如可包括根据WO2016/025880的表2的CAR分子或抗原结合结构域，其通过引用并入本文。编码GFR ALPHA-4CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一、二、三个VH CDR；和一、二、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/025880中具体说明。
在一个实施方案中，本文所述的任何CAR分子(例如，CD19，CD123，EGFRvIII，CD33，间皮素，BCMA和GFR ALPHA-4中的任何)的抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一、二、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上文列出的抗原结合结构域的一、二、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含上文列出或描述的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
非抗体支架
在实施方案中，抗原结合结构域包含非抗体支架，例如纤连蛋白，锚蛋白，结构域抗体，脂质运载蛋白，小模块免疫药物，maxybody，蛋白A或affilin。非抗体支架具有结合细胞上的靶抗原的能力。在实施方案中，抗原结合结构域是在细胞上表达的天然存在的蛋白质的多肽或其片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含非抗体支架。可以使用多种非抗体支架，只要所得到的多肽包含至少一个特异性结合靶细胞上的靶抗原的结合区即可。
非抗体支架包括:纤连蛋白(Novartis，MA)，锚蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)，结构域抗体(Domantis，Ltd.，Cambridge，MA和Ablynx nv，Zwijnaarde，Belgium)，脂质运载蛋白(Pieris Proteolab AG，Freising，Germany)，小型模块化免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)，maxybodies(Avidia，Inc.，Mountain View，CA)，蛋白A(Affibody AG，Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(ScilProteins GmbH，Halle，Germany)。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含结合靶细胞表面上的反配对的分子的胞外结构域或其反配体结合片段。
跨膜结构域
在实施方案中，本文所述的CAR包含与细胞外序列(例如细胞外识别元件)融合的跨膜结构域，其可以包含抗原结合结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域是与CAR中的一个结构域天然结合的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域是不与CAR中的一个结构域天然结合的跨膜结构域。
跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如与衍生跨膜的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个至多达15个氨基酸)和/或一个或多个与衍生跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区域相关的另外的氨基酸(例如，细胞内区域的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个至多达15个氨基酸)。
在实施方案中，跨膜结构域是使与其它元件例如其他跨膜结构域的相互作用最小化的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域使得这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域的结合最小化，例如以最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。可以通过选择或修饰已知跨膜结构域的氨基酸取代来获得合适的实例。在一个实施方案中，跨膜结构域能够促进与细胞表面上的另一种CAR的同二聚化。
跨膜结构域可以包含天然存在的或非天然存在的合成序列。当天然存在时，跨膜结构域可以衍生自任何膜结合的或跨膜蛋白。
适用于本文所述分子的跨膜区域可衍生自以下的任何一种或多种:例如T细胞受体的α，β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。在一些实施方案中，跨膜结构域可以至少包括例如KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD11a，CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，NKp44，NKp30，NKp46，CD160，CD19，IL2R beta，IL2Rgamma，IL7Rα，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM(例如，CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKG2D，NKG2C的跨膜区。在一个实施方案中，跨膜结构域衍生自CD8。在一个实施方案中，跨膜结构域衍生自CD28。一方面，跨膜结构域是来自作为SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:42提供的序列的跨膜结构域。
在一个实施方案中，序列，例如铰链或间隔区序列可以设置在跨膜结构域和与其融合的另一个序列或结构域之间。在实施方案中，也可以使用多种人铰链(也称为“间隔区”)，例如包括但不限于人Ig(免疫球蛋白)铰链。任选地，长度为2至10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头可以形成CAR的跨膜结构域与另一结构域(例如细胞内信号传导结构域或共刺激结构域)之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。在一个方面，铰链或间隔区是作为SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8提供的氨基酸序列。在一个方面，铰链或间隔区包含KIR2DS2铰链。
在一个实施方案中，跨膜结构域可以是非天然存在的序列，在这种情况下可以主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个实施方案中，将在跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸，色氨酸和缬氨酸三联体。
任选地，长度为2至10个氨基酸的短的寡肽或多肽接头可以形成CAR的跨膜结构域和细胞质区域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。例如，一方面，接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:11)的核苷酸序列编码。
细胞质结构域
CAR的细胞质结构域或区域包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责其中已经引入CAR的免疫细胞的正常效应子功能中至少一个的活化。
用于本发明的CAR的胞内信号传导结构域的实例包括共同作用以在抗原受体衔接之后引发信号转导的T细胞受体(TCR)和共同受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。
众所周知通过单独的TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要二级和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以被称为是由两个不同种类的细胞质信号传导序列介导的:通过TCR引发抗原依赖性一级活化的那些(一级胞内信号传导结构域)以及以抗原独立方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些(二级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。
一级信号传导结构域
一级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合体的一级活化。以刺激方式起作用的一级胞内信号传导结构域可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
在本发明中特别使用的含有一级细胞内信号传导结构域的ITAM的实例包括TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(也称为“ICOS”)，FcεRI，DAP10，DAP12和CD66d。在一个实施方案中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ的一级信号传导结构域，例如本文所述的CD3-ζ序列。
在一种实施方案中，一级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增强或降低的)活性的突变ITAM结构域。在一种实施方案中，一级信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的一级胞内信号传导结构域，例如含有优化的和/或截短的ITAM的一级胞内信号传导结构域。在一种实施方案中，一级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。在本发明中特别使用的含有一级细胞内信号传导结构域的分子的其它实例包括DAP10，DAP12和CD32的那些。
一级细胞内信号传导结构域包含主要刺激分子(例如CD3zeta-GenBankAcc.No.BAG36664.1)的功能片段或类似物。一级细胞内信号传导结构域可以包含整个细胞内区域或细胞内区域的片段，当与其融合的抗原结合结构域结合同源抗原时，其足以产生细胞内信号。在实施方案中，一级细胞内信号传导结构域与天然存在的主要刺激分子，例如人(GenBank Acc No.BAG36664.1)或其他哺乳动物，例如非人类物种，例如啮齿动物，猴，猿或鼠细胞内主要刺激分子的整个细胞内区域或细胞内区域的片段具有至少70，75，80，85，90，95，98或99％的序列同一性，所述片段足以产生细胞内信号。在实施方案中，一级细胞内信号传导结构域与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20具有至少70，75，80，85，90，95，98或99％的序列同一性。
在实施方案中，一级细胞内信号传导结构域与天然存在的人类主要刺激分子(例如本文公开的天然存在的人类主要刺激分子)的整个细胞内区域或细胞内区域的足以产生细胞内信号的片段的相应残基具有至少70，75，80，85，90，95，96，97，98,或99％同一性，或者相差不超过30，25，20，15，10，5，4，3，2或1个氨基酸残基。
共刺激信号传导结构域
CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者其可以与用于本发明的CAR的上下文中的任何其它期望的胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指包括共刺激性分子的胞内结构域的CAR的部分。在一个实施方案中，细胞内结构域被设计为包含CD3-zeta的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，细胞内结构域被设计成包含CD3-zeta的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。
共刺激性分子可以是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。这些分子的实例包括CD27，CD28，4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。例如，CD27共刺激已经被证明在体外增强人类CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)的扩增，效应子功能和存活，并在体内增强人T细胞的持久性和抗肿瘤活性(Song等人，BLOOD.2012；119(3):696-706)。此类共刺激分子的其它实例包括CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，NKp44，NKp30，NKp46，CD160，CD19，CD4，CD8alpha，CD8beta，IL2R beta，IL2R gamma，IL7R alpha，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKG2D，NKG2C和PAG/Cbp。
在一些实施方案中，免疫效应细胞群(例如T细胞)包含含有具有两个或更多个细胞内信号传导结构域的CAR分子的细胞混合物。在实施方案中，免疫效应细胞群体包含一个或多个包含CD28信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域的CAR。例如，第一免疫效应细胞包含含有CD28信号传导结构域的CAR分子，第二免疫效应细胞含有包含4-1BB信号传导结构域的CAR分子。包含CD28信号传导结构域和/或4-1BB信号传导结构域的CAR分子的表达可以是瞬时的或稳定的。
可以使本发明的CAR的细胞质部分之内的胞内信号传导序列以随机或指定顺序彼此连接。任选地，例如长度在2和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短的寡肽或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成连接。在一种实施方案中，甘氨酸-丝氨酸二联体可用作合适的接头。在一种实施方案中，单个氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸可用作合适的接头。
在一个方面，胞内信号传导结构域被设计成包含两个或多个，例如2、3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域。在一种实施方案中，两个或多个，例如2、3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域被接头(例如本文所述的接头)分子分开。在一种实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在某些实施方案中，接头分子为甘氨酸残基。在某些实施方案中，接头为丙氨酸残基。
共刺激结构域包括共刺激分子(例如，ICOS，CD28或4-1BB)的功能片段或类似物。其可以包含整个细胞内区域或细胞内区域的足以产生细胞内信号的片段，例如当其融合的抗原结合结构域结合同源抗原时。在实施方案中，共刺激结构域与如本文所述的天然存在的共刺激分子，例如人或其它哺乳动物，例如非人类物种，例如啮齿动物，猴，猿或鼠的细胞内共刺激分子的整个细胞内区域或细胞内区域的足够产生细胞内信号的片段具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性。在实施方案中，共刺激结构域与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，或99％的序列同一性。
在实施方案中，共刺激信号传导结构域与天然存在的人共刺激分子，例如本文公开的天然存在的人共刺激分子的整个细胞内区域的相应残基或细胞内区域的足以产生细胞内信号的片段具有至少70，75，80，85，90，95，96，97，98或99％的同一性，或者相差不超过30，25，20，15，10，5，4，3，2或1个氨基酸残基。
本文描述的任何CAR可以包括表10中列出的一种或多种组分。
表10.CAR的多种组分的序列(aa-氨基酸，na-编码相应蛋白质的核酸)
Figure BDA0003753655610001921
Figure BDA0003753655610001931
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CAR与其他分子或活性剂的共表达
第二CAR的共表达
在一个方面，本文所述表达CAR的细胞可以进一步包括第二CAR，例如，第二CAR，其包括例如对相同靶标(例如CD19)或不同靶标(例如除CD19以外的靶标，例如本文描述的靶标)不同的抗原结合结构域在一个实施方案中，表达CAR的细胞包括靶向第一抗原且包括具有共刺激信号传导结构域而不是一级信号传导结构域的胞内信号传导结构域的第一CAR，和靶向第二、不同的抗原且包括具有一级信号传导结构域而不是共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域的第二CAR。将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB、CD28、CD27、OX-40或ICOS)置于第一CAR上，并且将一级信号传导结构域例如CD3ζ置于第二CAR上可以将CAR活性限制为表达两个靶的细胞。在一种实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR，其包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，和第二CAR，其靶向另一抗原并且包括抗原结合结构域，跨膜结构域和一级信号传导结构域。在另一个实施方案中，CAR表达细胞包含第一CAR和第二CAR，所述第一CAR包括抗原结合结构域，跨膜结构域和一级信号传导结构域，所述第二CAR靶向另一抗原并且包括抗原的抗原结合结构域，跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一种实施方案中，表达CAR的细胞包含本文所述XCAR和抑制性CAR。在一种实施方案中，抑制性CAR包含结合正常细胞(例如也表达X的正常细胞)而不是癌细胞上发现的抗原的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以是PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(，CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，CD80，CD86，B7-H3(CD276)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGF(例如TGFRβ)的胞内结构域。
在一种实施方案中，当表达CAR的细胞包括两个或多个不同的CAR时，不同的CAR的抗原结合结构域可以是这样的，使得所述抗原结合结构域彼此不相互作用。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域，例如呈片段形式，例如scFv，其不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合，例如第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子。SDAB分子包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域，天然缺乏轻链的结合分子，衍生自常规4-链抗体的单结构域，工程化结构域和除了衍生自抗体的那些之外的单结构域支架。SDAB分子可以是任何现有技术或任何未来的单结构域分子。SDAB分子可以来源于任何物种，包括但不限于小鼠，人，骆驼，美洲驼，七鳃鳗，鱼，鲨鱼，山羊，兔和牛。该术语还包括来自除骆驼科和鲨鱼以外的物种的天然存在的单域抗体分子。
在一个方面，SDAB分子可以源自在鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如源自在鲨鱼血清中发现的称为新抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型。产生源自NAR可变区的单结构域分子(“IgNAR”)的方法描述于WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909。
根据另一方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，已知为不含轻链的重链。这种单结构域分子公开于例如WO 9404678和Hamers-Casterman，C等人(1993)Nature 363：446-448。为了清楚起见，源自天然缺乏轻链的重链分子的该可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开来。这种VHH分子可以衍生自骆驼科物种，例如骆驼，美洲驼，单峰驼，羊驼和大羊驼。除骆驼科外，其他物种可产生天然缺乏轻链的重链分子；这样的VHH在本发明的范围内。
SDAB分子可以是重组的、CDR移植的、人源化的、骆驼化的、去免疫的和/或体外产生的(例如通过噬菌体展示选择的)。
还发现具有多个嵌合膜嵌入受体的细胞包含抗原结合结构域，所述受体的抗原结合结构域之间的相互作用可能是不期望的，例如，因为它抑制一种或多种抗原结合结构域来结合其同源抗原的能力。因此，本文公开了具有第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的细胞，所述受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域。本文还公开了编码第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的核酸，所述受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域，以及制备和使用此类细胞和核酸的方法。在一个实施方案中，第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体之一的抗原结合结构域包含scFv，而另一个包含单个VH结构域，例如骆驼科动物，鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域，或衍生自人或小鼠序列的单个VH结构域。
在一些实施方案中，本文的组合物包含第一和第二CAR，其中第一CAR和第二CAR中之一的抗原结合结构域不包含可变轻链结构域和可变重链结构域。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域是scFv，而另一不是scFv。在一些实施方案中，第一和第二CAR之一的抗原结合结构域包含单个VH结构域，例如骆驼科动物，鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域，或来自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，而另一包含单个VH结构域，例如骆驼科动物，鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域，或来自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，另一包含纳米抗体。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，另一包含骆驼科VHH结构域。
在某些实施方案中，当存在于细胞表面上时，所述第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合不会受所述第二CAR的存在而实质性降低。在某些实施方案中，在所述第二CAR的存在下，所述第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合是在不存在所述第二CAR下所述第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施方案中，当存在于细胞表面上时，所述第一CAR和第二CAR的抗原结合结构域彼此缔合少于如果两者都为scFv抗原结合结构域时。在某些实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR的抗原结合结构域彼此缔合少于如果两者都为scFv抗原结合结构域时的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
增强CAR活性的活性剂的共同表达
另一方面，本文所述的CAR表达细胞可以进一步表达另一种活性剂，例如增强CAR表达细胞的活性或适合性的活性剂。
例如，在一个实施方案中，所述活性剂可以是抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的活性剂。在一些实施方案中，调控或调节T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施方案中，抑制分子(例如PD1)可以降低CAR表达细胞产生免疫效应物应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1，PD-L1，CTLA4，TIM3，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，CD80，CD86，B7-H3(CD276)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，MHC I类，MHC II类，GAL9，腺苷或TGFβ。
在实施方案中，活性剂，例如，抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA；或例如，抑制性蛋白或系统，例如聚簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)，转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或锌指内切核酸酶(ZFN)，例如如本文所述，可以用于抑制调控或调节，例如抑制CAR表达细胞中的T细胞功能的分子的表达。在一个实施方案中，活性剂是shRNA，例如本文所述的shRNA。在一个实施方案中，调控或调节，例如抑制T细胞功能的活性剂在CAR表达细胞内被抑制。例如，抑制调控或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的表达的dsRNA分子与编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸连接。
在一个实施方案中，抑制抑制性分子的活性剂包含与向细胞提供阳性信号的第二多肽相结合的第一多肽，例如抑制性分子，所述第二多肽例如本文所述的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，所述活性剂包含第一多肽，例如抑制性分子如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷或TGFβ的第一多肽，或任何这些的片段(例如至少这些中任何的一部分细胞外结构域)，和第二多肽，其是本文所述的细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域(例如，41BB，CD27或CD28，例如如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，活性剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，本文描述的CD28信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是受体CD28家族的抑制成员，其还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞，T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人，1996Int.Immunol 8：765-75)。已经显示PD1、PD-L1和PD-L2的两种配体在与PD1结合后下调T细胞活化(Freeman等人，2000 J Exp Med 192：1027-34；Latchman等人，2001 Nat Immunol2：261-8；Carter等人，2002 Eur J Immunol 32：634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人，2003 J Mol Med 81：281-7；Blank等人，2005 Cancer Immunol.Immunother54：307-314；Konishi等人，2004Clin Cancer Res 10：5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。
在一个实施方案中，包含抑制性分子(例如程序性死亡1(PD1))的细胞外结构域(ECD)的活性剂可以与跨膜结构域和细胞内信号传导结构域例如41BB和CD3ζ(在本文中也称为PD1 CAR)融合。在一个实施方案中，当与本文所述的XCAR组合使用时，PD1 CAR改善了T细胞的持久性。在一个实施方案中，CAR是包含如SEQ ID NO：40中下划线所示的PD1的胞外域的PD1 CAR。在一个实施方案中，PD1 CAR包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
在一个实施方案中，活性剂包含编码PD1 CAR(例如本文所述的PD1CAR)的核酸序列。在一个实施方案中，PD1 CAR的核酸序列在SEQ ID NO：42中示出，PD1ECD在SEQ ID NO：42中下划线。
在另一个实例中，在一个实施方案中，增强CAR表达细胞活性的活性剂可以是共刺激分子或共刺激分子配体。共刺激分子的实例包括MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体，以及OX40，CD27，CD28，CDS，ICAM-1，LFA-1(CD11a/CD18)，ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的进一步实例包括CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，NKp44，NKp30，NKp46，CD160，CD19，CD4，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，NKG2D，NKG2C，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，CD19a以及特异性结合CD83的配体，例如如本文所述。共刺激分子配体的例子包括CD80，CD86，CD40L，ICOSL，CD70，OX40L，4-1BBL，GITRL和LIGHT。在实施方案中，共刺激分子配体是不同于CAR的共刺激分子结构域的共刺激分子的配体。在实施方案中，共刺激分子配体是与CAR的共刺激分子结构域相同的共刺激分子的配体。在一个实施方案中，共刺激分子配体是4-1BBL。在一个实施方案中，共刺激配体是CD80或CD86。在一个实施方案中，共刺激分子配体是CD70。在实施方案中，本文所述的CAR-表达免疫效应细胞可进一步工程化以表达一种或多种另外的共刺激分子或共刺激分子配体。
CAR与趋化因子受体的共同表达
在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞，例如CD19 CAR表达细胞进一步包含趋化因子受体分子。趋化因子受体CCR2b或CXCR2在T细胞中的转基因表达增强了对分泌CCL2-或CXCL1的实体瘤(包括黑素瘤和神经胚细胞瘤)的运输(Craddock等人，J Immunother.2010Oct；33(8):780-8和Kershaw等人，Hum Gene Ther.2002 Nov 1；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论束缚，认为在CAR表达细胞中表达的识别由肿瘤例如实体瘤分泌的趋化因子的趋化因子受体，可以改善CAR表达细胞归巢到肿瘤中，促进CAR表达细胞浸润到肿瘤，并增强CAR表达细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包含天然存在的或重组的趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适于在本文所述的CAR表达细胞(例如CAR-Tx)中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因子受体(例如CXCR1，CXCR2，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CXCR6,或CXCR7)，CC趋化因子受体(例如CCR1，CCR2，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，CCR9，CCR10或CCR11)，CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1)，XC趋化因子受体(例如XCR1)或其趋化因子结合片段。在一个实施方案中，基于肿瘤分泌的趋化因子选择要用本文所述的CAR表达的趋化因子受体分子。在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞进一步包含，例如表达CCR2b受体或CXCR2受体。在一个实施方案中，本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同的载体上或在两个不同的载体上。在本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同载体上的实施方案中，CAR和趋化因子受体分子各自由两种不同的启动子控制，或者在同一启动子的控制下。
CAR表达细胞
本文描述的CAR在细胞，例如免疫效应细胞，例如T细胞上表达。例如，将本文所述的CAR的核酸构建体转导至T细胞。在实施方案中，表达本文所述的CAR的细胞是体外转录的RNA CAR T细胞。
细胞的来源
在实施方案中，在扩增和遗传修饰或其它修饰之前，可以从受试者获得细胞来源，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，来自感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾组织和肿瘤。
在实施方案中，免疫效应细胞(例如免疫效应细胞群)例如T细胞源自(例如，分化自)干细胞，例如胚胎干细胞或多能干细胞，例如诱导多能干细胞(iPSC)。在实施方案中，细胞是自体的或同种异体的。在细胞是同种异体的实施方案中，例如来自干细胞(例如iPSC)的细胞被修饰以降低其同种异体反应性。例如，细胞可以被修饰以降低同种异体反应性，例如通过修饰(例如破坏)它们的T细胞受体。在实施方案中，可以使用位点特异性核酸酶来破坏T细胞受体，例如在T细胞分化后。在其他实例中，细胞(例如源自iPSC的T细胞)可以由病毒特异性T细胞产生，由于它们识别病原体衍生抗原，所述病毒特异性T细胞不太可能引起移植物抗宿主疾病。在其他实例中，可通过从常见HLA单元型产生iPSC来减少(例如最小化)同种异体反应性，使得它们与匹配的、不相关的受体受试者组织相容。在其他实例中，通过遗传修饰抑制HLA表达，可减少(例如最小化)同种异体反应性。例如，来源于iPSC的T细胞可以如例如Themeli等人，Nat.Biotechnol.31.10(2013)：928-35处理，通过引用引入本文。在一些实例中，可以使用WO2014/165707中描述的方法来处理/生成免疫效应细胞，例如来自干细胞的T细胞，其通过引用并入本文。关于同种异体细胞的另外的实施方案在本文中描述，例如在本文的“同种异体CAR免疫效应细胞”部分中。
在实施方案中，所述方法(例如制造方法)还包括将细胞群与IL-15和/或IL-7接触。例如，细胞群在IL-15和/或IL-7存在下扩增。在一些实施方案中，细胞群体如在国际申请WO2016/109410的第145页所述进行处理，其在此通过引用整体并入。
T细胞
在实施方案中，细胞是T细胞。可使用本领域可用的T细胞系。在实施方案中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的多种技术的任一种(比如FicollTM分离)从受试者收集的血液单位获得。在一个是实施方案中，通过单采血液成分术成分术，从个体的正在循环的血液获得细胞。单采血液成分术成分术的产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术成分术收集的细胞以除去血浆级分，并将细胞置于适合的缓冲液或培养基中用于后续加工步骤。在一个实施方案中，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个备选的实施方案中，洗涤溶液不含钙，且可以不含镁或可以不含许多(即使不是全部)二价阳离子。在一个实施方案中，在不存在钙下的初始活化步骤导致放大的信号活化。洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，比如通过根据制造商的说明使用半自动化的“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)。在洗涤之后，可以将细胞再悬浮在多种生物相容性缓冲液中，比如例如不含Ca、不含Mg PBS、PlasmaLyte A、或含或不含缓冲剂的其它盐溶液。备选地，可以除去单采血液成分术成分术样品的不期望组分，并将细胞直接再悬浮在培养基中。
在一个实施方案中，通过溶解红细胞和例如通过离心穿过PERCOLLTM梯度或逆流离心机淘析耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。T细胞的特定亚群，如CD3+，CD28+，CD4+，CD8+，CD45RA+和CD45RO+ T细胞可通过阳性或阴性选择技术进一步分离。例如，在一个实施方案中，通过用抗-CD3/抗-CD28(即3×28)-缀合的珠(比如
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M-450 CD3/CD28 T)培养足以正选择期望的T细胞的时期来分离T细胞。在一个实施方案中，所述时期为约30分钟。在一个进一步的实施方案中，所述时期范围为30分钟至36小时或更长及其中所有整数值。在一个进一步的实施方案中，所述时期为至少1、2、3、4、5或6小时。在仍然另一个实施方案中，所述时期为10至24小时。在一个实施方案中，培养时期是24小时。为了从患有白血病的患者中分离T细胞，使用更长的培养时间(如24小时)可以增加细胞产量。在与其它细胞类型相比存在很少T细胞的任何情形中，比如从肿瘤组织或免疫功能受损的个体分离浸润肿瘤的淋巴细胞(TIL)，可以使用较长的培养时间以分离T细胞。进一步，使用较长的培养时间可以提高俘获CD8+ T细胞的效率。因此，通过仅缩短或延长时间使T细胞结合CD3/CD28珠和/或通过增加或降低珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，在培养开始或在该过程的其它时间点可以优选地选择T细胞的亚群。另外，通过增加或降低珠或其它表面上抗-CD3和/或抗-CD28抗体的比率，可以在培养开始或在其它期望时间点优选地选择T细胞的亚群。本领域技术人员将认识到也可以使用多轮选择。在某些实施方案中，可能需要执行选择过程并在激活和扩展过程中使用“未选择”的细胞。“未选择”的细胞也可以进行更多轮选择。
使用针对负选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合，通过负选择可以实现对T细胞群体的富集。一种方法是通过负磁免疫粘附或流式细胞术，使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14，CD20，CD11b，CD16，HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或正向选择通常表达CD4+，CD25+，CD62Lhi，GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方案中，T调节细胞被抗CD25缀合的珠子或其他类似的选择方法耗尽。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25-耗尽，mTOR抑制剂及其组合。在实施方案中，例如如2015年12月28日提交的国际申请WO2016/109410(例如，其中的第1-6页和第152-153页)中所述，TREG细胞被耗尽，该申请通过引用整体并入本文。
在实施方案中，例如T细胞的细胞异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT，例如，如2015年12月28日提交的国际申请WO2016/109410的第62-66页中所述，该申请在此通过引用整体并入本文。
对于通过正选择或负选择分离期望的细胞群，细胞的浓度和表面(例如，粒子，比如珠)可以变化。在某些实施方案中，可能期望显著地降低其中珠和细胞混合在一起的体积(即，提高细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在又一个实施方案中，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在一个实施方案中，使用来自7.5、8、8.5、9、9.5或10千万个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.50亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以引起细胞产率提高、细胞活化和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度能够更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，比如CD28-阴性T细胞，或者从其中存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)更有效地捕获细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且将是期望得到的。例如，使用高浓度的细胞能够更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+ T细胞。
在一个相关的实施方案中，可能期望使用较低的细胞浓度。通过显著地稀释T细胞和表面(例如，粒子比如珠)的混合物，使粒子和细胞之间的相互作用最小化。这选择表达大量的期望结合粒子的抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀浓度中比CD8+ T细胞更有效地被捕获。在一个实施方案中，使用的细胞浓度为5×106/ml。在其它实施方案中，使用的浓度可以为约1×105/ml至1×106/ml及其中任何整数值。
在其它实施方案中，可以在2-10℃或在室温下在旋转器中以可变速率培养细胞可变的时间长度。
也可以在洗涤步骤之后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受到理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群中除去粒细胞及在一定程度上除去单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，将细胞悬浮在冷冻液中。虽然许多冷冻液和参数是本领域已知的且将适用于该情形，但是一种方法包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并贮存在液氮贮槽的汽相中。可以使用控制冷冻的其它方法以及在-20℃下或在液氮中立即不受控制的冷冻。
在某些实施方案中，将冷藏保存的细胞解冻并如本文所述洗涤，并且允许在室温下静置1小时，之后使用本文描述的方法活化。
在一个实施方案中，在可能需要扩增细胞之前的时间进行从受试者收集血液样品或单采血液成分术成分术产物。因而，要扩增的细胞来源可以在任何必须的时间点收集，并且分离和冷冻期望的细胞比如T细胞用于随后例如T细胞疗法中的用途，所述T细胞疗法用于许多将受益于这种T细胞疗法的疾病或病症。在一个实施方案中，血液样品或单采血液成分术成分术是从一般健康受试者采集的。在某些实施方案中，血液样品或单采血液成分术成分术是从处于发展为疾病的风险中但还没有发展为疾病的一般健康受试者采集的，并且分离和冷冻目的细胞用于随后使用。在某些实施方案中，T细胞可以扩增、冷冻和在随后时间使用。在某些实施方案中，可以在诊断特定疾病之后不久但在任何治疗之前，从患者采集样品。在一个进一步的实施方案中，在许多相关的治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分术成分术分离细胞，所述治疗模式包括但不限于用如下活性剂治疗:比如那他珠单抗(natalizumab)、艾法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化疗、放射、免疫抑制剂比如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体、或其它免疫烧蚀剂(immunoablative agents)比如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu等人，Cell 66：807-815，1991；Henderson等人，Immun.73：316-321，1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.5：763-773，1993)。在进一步的实施方案中，分离患者的细胞并且冷冻用于后续用途，所述用途与骨髓或干细胞移植(例如，在其之前，同时或之后)，使用化疗剂例如氟达拉滨的T细胞消融疗法，外部束放射疗法(XRT)，环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH一起使用。在一个实施方案中，在B细胞消融疗法例如与CD20反应的试剂，例如Rituxan之前细胞被分离，并且可以被冷冻以用于在所述疗法之后的后续治疗用途。
在进一步的实施方案中，在给受试者留下功能性T细胞的治疗之后直接从患者获得T细胞。在这点上，已经观察到在一些癌症治疗之后，特别地用损害免疫系统的药物治疗之后，在患者通常从治疗恢复期间的治疗后不久，获得的T细胞的质量可能是最佳的或对其在离体扩增的能力有所改善。同样地，在使用本文所述方法离体处理之后，这些细胞可以对于增强移植和体内扩增处于优选的状态。因此，在本发明的上下文之内预期在该恢复期收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。进一步，在某些实施方案中，可以使用转移(例如，用GM-CSF转移)和调节方案产生受试者中的条件，其中特别地在治疗之后的定义时间窗期间，特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增是有利的。同种异体的CAR
在本文所述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如功能性T细胞受体(TCR)和/或人类白细胞抗原(HLA)(例如I类HLA和/或II类HLA)表达不足的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如工程化以使得其在其表面上不表达任何功能性TCR，工程化以使其不表达包括功能性TCR的一个或更多个亚基(例如，被工程化使得它不表达(或表现出降低的表达)TCRα，TCRβ，TCRγ，TCRδ，TCRε和/或TCRζ)，或工程化以使得其在其表面产生非常少的功能性TCR。备选地，T细胞可以表达基本上受损的TCR，例如通过表达突变或截短的形式的一个或更多个TCR的亚基。术语“基本上受损的TCR”是指该TCR不会在宿主中引发不利的免疫反应。
本文所述的T细胞可以例如工程化以使得其在表面上不表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以工程化以使得细胞表面表达HLA(例如1类HLA和/或II类HLA)下调。在一些实施方案中，HLA的下调可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)的表达来实现。
在某些实施方案中，T细胞可以缺乏功能性TCR和功能性HLA(例如I类HLA和/或II类HLA)。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何合适的方法获得，包括一个或更多个TCR或HLA的亚基的基因敲除或基因敲减。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)的TCR和/或HLA的基因敲减。
在某些实施方案中，同种异体细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如通过本文所述任何方法。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如可以降低表达CAR的细胞建立免疫效应物应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1，PD-L1，CTLA4，TIM3，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，CD80，CD86，B7-H3(CD276)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGF(例如TGFRβ)。抑制性分子的抑制，例如通过在DNA、RNA或蛋白水平的抑制，可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，可以使用如本文所述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA例如siRNA或shRNA，簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)。
siRNA和shRNA抑制TCR或HLA
在一些实施方案中，可以使用靶向编码TCR和/或HLA和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，CD80，CD86，B7-H3(CD276)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFβ)的核酸的siRNA或shRNA来抑制细胞例如T细胞中TCR表达和/或HLA表达。
用于siRNA和shRNA以及示例性shRNA的表达系统描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第649和650段，其全部内容通过引用并入本文。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文中使用的“CRISPR”或“TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指簇状的规则间隔的短回文重复序列组或包括该重复序列组的系统。正如本文中使用的那样，“Cas”是指CRISPR-相关的蛋白。“CRISPR/Cas”系统指来源于CRISPR和Cas的系统，其可用于沉默或突变在细胞，例如T细胞中TCR和/或HLA基因,和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，CD80，CD86，B7-H3(CD276)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷和TGFβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第651-658段中，其全部内容通过引用并入本文。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录激活子样效应子核酸酶，其是一种在细胞中，例如T细胞中可用于编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶，和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，CD80，CD86，B7-H3(CD276)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷，和TGFβ)。
TALEN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第659-665段，其全部内容通过引用并入本文。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指细胞，例如T细胞中中的锌指核酸酶，一种可用于编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，CD80，CD86，B7-H3(CD276)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，I类MHC，II类MHC，GAL9，腺苷，和TGFβ)的人工核酸酶。
ZFN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第666-671段，其全部内容通过引用并入本文。
NK细胞
在一个实施方案中，细胞是天然杀伤细胞。这些细胞可以分离自患者。在一个实施方案中，细胞是天然杀伤细胞的稳定细胞系，例如来自Conkwest的稳定同种异体NK-92细胞系。这些稳定的NK-92细胞系来自NK-92细胞，其使用Gong等人(1994年4月)，LeukemiaMacmillan Press，Ltd，8：652-658所述的方法获得、转染并培养，并公开于EP1007630，在此引入作为参考。也可以使用具有与NK-92细胞系相似性质的NK细胞系。在一个实施方案中，来自个体的循环血液的NK细胞通过血浆分离置换法(apheresis)获得。在一个实施方案中，NK细胞被工程化以表达CAR，并且这些工程化的CARN细胞可以用于治疗从其分离NK细胞的患者以外的患者。因此，这些CARN细胞是“通用的”细胞，因为它可以给予多个患者而没有副作用。也就是说，NK细胞可以分离自一名患者，并被改造为表达CAR，由此产生CARN细胞，并且可以将这些CARN细胞给予相同或不同的患者。NK细胞，例如NK-92细胞不表达杀伤抑制性受体，因此不能通过逃避癌细胞而失活。已经描述了分离和使用NK细胞的方法(例如，衍生自来自非霍奇金淋巴瘤患者的外周血单核细胞的NK-92细胞系或相似的NK细胞系)(参见Zhang等人(2013)Retargeting NK-92for anti-melanoma activity by a TCR-likesingle结构域antibody；Immunol Cell Biol.91:615-624；Tonn等人，(2013)Treatment ofpatients with advanced cancer with the natural killer cell-line NK-92,Cytotherapy,15:1563-1570。
发现NK-92细胞系表现出CD56高，CD2，CD7，CD11a，CD28，CD45和CD54表面标志物。此外，它不显示CD1，CD3，CD4，CD5，CD8，CD10，CD14，CD16，CD19，CD20，CD23和CD34标志物。培养物中NK-92细胞的生长取决于重组白细胞介素2(rIL-2)的存在，其中低至10IU/mL的剂量足以维持增殖。也可以使用具有相似性质的NK细胞系。
NK-92细胞容易维持在培养基中，例如补充有胎牛血清(例如，12.5％，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)和马血清(例如12.5％，Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)的富含α最低必需培养基(MEM，Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)。最初需要10M氢化可的松，但在随后的传代中发现可以省去氢化可的松。此外，IL-2如重组人IL-2(500U/mL，Chiron，Emeryville，CA)是长期生长所必需的。当悬浮培养物以这种方式以半周改变培养基来维持时，细胞表现出约24h的加倍时间。
NK-92细胞体外证明了针对广泛恶性靶细胞的裂解活性。这些包括源自循环靶细胞的细胞系，所述靶细胞例如急性和慢性淋巴细胞和骨髓性白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，黑素瘤以及来自实体瘤如前列腺癌，成神经细胞瘤和乳腺癌细胞系的细胞。
其他免疫效应细胞
在另一个实施方案中，可以分离并工程化任意数量的免疫效应细胞以表达CAR，例如B细胞，肥大细胞。骨髓来源的吞噬细胞，NKT细胞或γδT细胞。示例性的免疫效应细胞在国际申请WO2015/090229的图8中列出，该申请通过引用整体并入本文。
T细胞的活化和扩增
在一个实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。通常使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利公开号20060121005中所述的方法进行T细胞的活化和扩增。
在一些实施方案中，T细胞通过与连接有刺激CD3/TCR复合体相关的信号的活性剂和刺激T细胞表面上的共刺激性分子的配体的表面接触进行扩增。在T细胞中，共刺激分子是T细胞上的结合配偶体，其与共刺激配体结合，介导T细胞(即MHC I类分子，例如CD28)中的共刺激反应。特别地，可以如本文所述的刺激T细胞群，比如通过与抗-CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗-CD2抗体接触，或通过与钙离子载体协同与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)接触。为了刺激T细胞表面上的辅助分子(例如CD3)，使用结合辅助分子的配体。可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，用抗-CD3抗体和抗CD28抗体扩增T细胞群。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，可以使用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。抗-CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,
Figure BDA0003753655610002131
France)(Berg等人，TransplantProc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些实施方案中，可以通过不同的方案提供用于T细胞的初次激活信号和共刺激信号。例如，提供每种信号的活性剂可以在溶液中或被偶联至表面。当与表面偶联时，可以把所述活性剂偶联到相同的表面(即，“顺式”形式)或单独的表面(即，“反式”形式)。备选地，可以把一种活性剂偶联到表面，且另一种活性剂可以在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的活性剂与细胞表面结合，且提供一级活化信号的活性剂在溶液中或被偶联至表面。在某些实施方案中面，两种活性剂都可以在溶液中。在一个实施方案中，活性剂可以呈可溶性形式，然后被交联至表面，比如表达将会与该活性剂结合的Fc受体或抗体或其它结合剂的细胞。在这点上，关于人工抗原呈递细胞(aAPCs)，参见例如美国专利申请公开号:20040101519和20060034810，考虑其用于活化和扩增T细胞。
在一个实施方案中，把两种活性剂都固定在珠上，在相同的珠上，即“顺式”，或在不同的珠上，即“反式”。例如，提供一级活化信号的活性剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的活性剂是抗-CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种活性剂以等同的分子数量被共同固定在相同珠上。在一个实施方案中，使用与所述珠结合的每种抗体的1:1的比率，用于CD4+ T细胞扩增和T细胞生长。在某些实施方案中，使用与所述珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个实施方案中，与使用1:1的比率观察的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个实施方案中，与所述珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100及其中所有整数值。在一个实施方案中，与粒子结合的抗-CD28抗体比抗CD3抗体多，即CD3:CD28的比率小于1。在某些实施方案中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个实施方案中，使用1:100的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个实施方案中，使用1:75的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个进一步的实施方案中，使用1:50的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。在一个实施方案中，使用1:30的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个实施方案中，使用1:10的与珠结合的抗体的CD3:CD28比率。在一个实施方案中，使用的与珠结合的抗体的1:3 CD3:CD28比率。在还有一个实施方案中，使用3:1的与珠结合的抗体CD3:CD28比率。
可以使用1:500至500:1及其间任何整数值的粒子与细胞的比率来刺激T细胞或其它靶细胞。正如本领域普通技术人员可以容易地理解的那样，粒子与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒子尺寸。例如，小尺寸珠可能仅结合少数细胞，而较大珠可结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与粒子的比率范围为1:100至100:1及其中任何整数值，并且在进一步的实施方案中，也可以使用包括1:9至9:1的及其中任何整数值的比率来刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗-CD3-和抗-CD28偶联的粒子与T细胞的比率可以如上所述变化，然而某些合适值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个合适的比率为至少1:1的粒子/T细胞。在一个实施方案中，使用1:1或更小的粒子与细胞的比率。在一个特别的实施方案中，合适的粒子:细胞比率为1:5。在进一步的实施方案中，粒子与细胞的比率可以根据刺激的天数变化。例如，在一个实施方案中，在第一天，粒子与细胞的比率为1:1至10:1，并且此后每天或每隔一天向细胞中加入另外的粒子，直到10天，最终比率为1:1至1:10(基于加入当天的细胞计数)。在一个特别的实施方案中，在刺激的第一天，粒子与细胞的比率为1:1，并在刺激的第三天和第五天调节为1:5。在一个实施方案中，以每日或每隔一天为基准加入粒子至刺激的第一天最终比为1:1，且在刺激的第三天和第五天为1:5。在一个实施方案中，在刺激的第一天，粒子与细胞的比率为2:1，并在刺激的第三天和第五天调节为1:10。在一个实施方案中，以每日或每隔一天为基准加入粒子至刺激的第一天最终比为1:1，且在刺激的第三天和第五天为1:10。本领域技术人员应当理解多种其它比率都可以适合使用。特别地，比率将根据粒径及细胞尺寸和类型而变化。在一个实施方案中，在第一天，最典型的使用比率为约1:1、2:1和3:1左右。
在进一步的实施方案中，将细胞比如T细胞与活性剂包被的珠混合，接着分离珠和细胞，然后培养细胞。在备选的实施方案中，在培养之前，活性剂-包被的珠和细胞没有分离，而是一起培养。在一个进一步的实施方案中，首先通过施加力(比如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，可以通过允许附着了抗-CD3和抗-CD28的顺磁性的珠(3x28珠)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如104至109个T细胞)和珠(例如，比率1:1的
Figure BDA0003753655610002161
M-CD3/CD28 T顺磁性的珠)在缓冲液中混合，缓冲液例如为PBS(不含二价阳离子，比如钙和镁)。此外，本领域普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。例如，样品中靶细胞可能非常少，且仅占样品的0.01％，或全部样品(即，100％)可以包含目的靶细胞。在某些实施方案中，可能期望显著减少其中粒子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和粒子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml的浓度。在又一个实施方案中，使用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0千万个细胞/ml的浓度。在又一个实施方案中，使用从7.5、8、8.5、9、9.5或10千万个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.50亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以引起细胞产率提高、细胞活化和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，比如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且在某些实施方案中将是期望得到的。例如，使用高浓度的细胞能够更有效地选择通常具有弱CD28表达的CD8+ T细胞。
在一个实施方案中，可以将混合物培养几个小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在一个实施方案中，混合物可以培养21天。在一个实施方案中，珠和T细胞一起培养约八天。在一个实施方案中，珠和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以为60天或以上。适于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如,极限必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15,(Lonza))，其可以含有增殖和生存所必需的因子，包括血清(例如胎牛血清或人血清)、白介素-1(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括，但不限于表面活性剂、plasmanate和还原剂比如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、OptimizeR,具有加入的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充有适合量的血清(或血浆)或定义的激素组、和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不在输注到受试者中的细胞培养物中。靶细胞保持在载体生长必需的条件下，例如适合的温度(例如37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。例如，典型的血液或单采血液成分术成分术外周血单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制T细胞群(TC,CD8+)的辅助T细胞群(TH,CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体的离体T细胞扩增产生T细胞群，该细胞群在约第8-9天前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，T细胞群包括越来越大的TC细胞群。因此，根据治疗的目的，向受试者输注主要包括TH细胞的T细胞群可能是有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原特异性亚组，则使该亚组在更大程度上扩增可能是有益的。
进一步，除了CD4和CD8标志物之外，其它表型标志物显著变化，但大部分在细胞扩增过程中可再重现。因此，这样的可重现性使能够针对特定目的裁剪活化的T细胞产物。
可以使用多种测定法来评价CAR分子的活性，比如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力、在不存在再刺激下维持T细胞扩增和在适合的动物模型中的抗癌活性。用于评价CAR的效应的试验在下文进一步详细描述。
可以使用公开的用于CAR的方法，使用原代T细胞中CAR表达的Western印迹分析来检测它们的存在，参见，例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。非常简单地，表达CAR的T细胞(CD4+和CD8+ T细胞的1:1混合物)体外扩增超过10天，接着在还原条件下裂解和SDS-PAGE。包含全长TCR-ζ细胞质结构域和内源性TCR-ζ链的CAR通过Western印迹使用TCR-ζ链的抗体进行检测。相同的T细胞亚群用于非还原条件下的SDS-PAGE分析以允许评估共价二聚体的形成。
可以通过流式细胞测量术测量抗原刺激后CAR+ T细胞(即CART细胞)的体外扩增。例如，用αCD3/αCD28 aAPC刺激CD4+和CD8+ T细胞的混合物，接着在要被分析的启动子的控制下用表达GFP的慢病毒载体转导。示例性的启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在第6天，通过流式细胞测量术测量CD4+和/或CD8+T细胞亚组中培养物的GFP荧光。参见，例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。备选地，在第0天，用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激CD4+和CD8+ T细胞的混合物，并在第1天使用表达CAR的双顺反子慢病毒载体用CAR转导以及使用2A核醣体跳跃序列用eGFP转导。在抗-CD3和抗-CD28抗体(K562-BBL-3/28)的存在下，用CAR构建体再刺激培养物，之后洗涤。每隔一天，向培养物中加入100IU/ml的外源性IL-2。通过流式细胞术，使用基于珠的计数对GFP+ T细胞计数。参见，例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。
也可以测量在不存在再刺激下保持的CAR+ T细胞扩增。参见，例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，并在第1天用指定的RCAR转导，在培养的第8天，使用Coulter Multisizer III粒子计数器测量平均T细胞体积(fl)。
先前已经描述了对细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如在Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)中。简言之，通过将洗涤的T细胞与表达肿瘤抗原例如EGFRvIII或EGFR野生型(wt)或CD32和CD137(KT32)的靶细胞例如U87MG，BHK或CHO细胞混合至最终T细胞：靶细胞比例为1：1，在微量滴定板中进行CAR介导的增殖的评估。将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体加入具有KT32-BBL细胞的培养物中以用作刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期CD8+ T细胞的离体扩增。使用CountBrightTM荧光珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)和流式细胞术按制造商描述在培养物中计数T细胞。CAR+ T细胞通过使用用eGFP-2A连接的CAR表达慢病毒载体工程化的T细胞通过GFP表达鉴定。对于不表达GFP的CAR+ T细胞，用生物素化重组蛋白例如EGFRvIII和次级抗生物素蛋白-PE缀合物检测CAR+ T细胞。还用特定的单克隆抗体(BD Biosciences)同时检测T细胞上的CD4+和CD8+表达。根据制造商的说明，使用人TH1/TH2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(BD Biosciences，San Diego，CA)在再刺激24小时后收集上清液，进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评估荧光，并根据制造商的说明分析数据。
细胞毒性可以通过标准的51Cr释放测定来评估。参见例如Milone等人，MolecularTherapy 17(8)：1453-1464(2009)。简而言之，在37℃下，在频繁搅拌下将靶细胞(例如表达RCAR的U87MG，BHK或CHO细胞，例如EGFRvIII或EGFR野生型(wt))装载51Cr(作为NaCrO4，NewEngland Nuclear，Boston，MA)持续2小时，在完全RPMI中洗涤2次并铺板到微滴定板中。将效应T细胞与完全RPMI的孔中的靶细胞以不同比例的效应细胞：靶细胞(E：T)混合。还制备仅含培养基(自发释放，SR)或1％triton-X 100洗涤剂溶液(总释放量，TR)的额外的孔。在37℃孵育4小时后，从每孔收集上清液。然后使用γ粒子计数器(Packard Instrument Co.,Waltham,MA)测量释放的51Cr。每个条件进行至少3个重复，并使用公式％裂解＝(ER-SR)/(TR–SR)计算裂解的百分比，其中ER表示每个实验条件下释放的平均51Cr。也可以使用可选的细胞毒性测定，例如基于流动的细胞毒性分析。其他测定法，包括本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那些测定法也可用于评估RCAR构建体。
编码CAR的核酸构建体
编码一种或多种CAR构建体的核酸分子可以引入如本文所述免疫效应细胞(例如，T细胞)中。一方面，提供核酸分子作为信使RNA转录物。一方面，提供核酸分子作为DNA构建体。
本文所述的核酸分子可以是DNA分子，RNA分子或其组合。在一个实施方案中，核酸分子是编码如本文所述的CAR多肽的mRNA。在其它实施方案中，核酸分子是包含任何上述核酸分子的载体。
核酸分子可以编码例如本文所述的CAR分子，并且可以包含例如本文所述，例如表1，表2或表3中的核酸序列。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞筛选文库，通过从已知包含该基因的载体衍生基因，或使用标准技术通过从含有该基因的细胞和组织直接分离。或者，可以合成产生，而不是克隆目的基因。
还描述了其中插入本公开的核酸的载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体相对于衍生自癌逆转录病毒例如鼠白血病病毒的载体具有增加的优点，因为它们可以转导非增殖细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。
在另一个实施方案中，包含编码本发明所需CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，编码CAR的核酸的表达可以使用转座子如睡美人，CRISPR，CAS9和锌指核酸酶来实现。参见下面的June等人，2009NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY 9.10:704-716，通过引用将其并入本文。
总之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸有效连接至启动子，并将构建体掺入表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子，起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。
表达构建体也可以使用标准的基因递送方案用于核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,399,346，5,580,859，5,589,466，其全部内容通过引用并入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了一种基因治疗载体。
核酸可以克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，包括但不限于质粒，噬菌粒，噬菌体衍生物，动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体，复制载体，探针产生载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是众所周知的，并且描述于例如Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)和其他病毒学和分子生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一个生物体中起作用的复制起点，启动子序列，方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个可选择标志物(例如WO01/96584；WO 01/29058和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将所选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以将重组病毒分离并在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒体系是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子调节转录起始的频率。通常，它们位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管已经显示了许多启动子在起始位点的下游含有功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能被保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加到50bp。取决于启动子，似乎单独的元件可以协同或独立地起作用以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因，EF-1α，泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基的表达，其负责将氨酰基tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已被广泛用于哺乳动物表达质粒，已被证明能有效驱动克隆到慢病毒载体中的转基因的CAR表达。参见，例如，Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。一方面，EF1a启动子包含SEQ ID NO:11提供的序列。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子，MoMuLV启动子，禽白血病病毒启动子，EB病毒立即早期启动子，劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子，肌球蛋白启动子，延伸因子-1α启动子，血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。也可以考虑诱导型启动子作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够启动当期望这种表达时有效连接的多核苷酸序列的表达，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子，糖皮质激素启动子，孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个例子是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施方案中，当与野生型PGK启动子序列比较时，截短的PGK启动子(例如，具有一个或多个，例如1，25，10，100，200，300或400个核苷酸缺失的PGK启动子)可能是需要的。在实施方案中，截短的PGK启动子是2016年1月15日提交的国际申请WO2016/115482(例如，其中的第43-44页)中描述的启动子，该申请通过引用整体并入本文。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可以含有选择性标记基因或报道基因或两者，以便于从细胞群体中鉴定和选择试图通过病毒载体转染或感染的表达细胞。在其他方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染过程。选择性标记和报告基因都可以侧翼为适当的调控序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评估调节序列的功能。通常，报道基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达，并且编码其表达通过某些容易检测到的性质(例如酶活性)表现的多肽的基因。在将DNA导入受体细胞后，在合适的时间测定报道基因的表达。合适的报道基因可以包括编码萤光素酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等人，2000FEBS LETTERS479：79-82)的基因。合适的表达系统是众所周知的并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，具有显示最高水平的报道基因表达的最小5'侧翼区域的构建体被鉴定为启动子。这种启动子区域可以与报道基因连接并用于评估活性剂调节启动子驱动的转录的能力。
在实施方案中，载体可以包含编码CAR，例如本文所述的CAR，例如CD19 CAR和第二种CAR，例如抑制性CAR或特异性结合除了CD19外的抗原的CAR的两种或更多种核酸序列。在这样的实施方案中，编码CAR的两种或更多种核酸序列由相同框架中的单个核酸分子和作为单个多肽链编码。在这方面，两种或更多种CAR可以例如被一个或多个肽切割位点分开。(例如，自切割位点或细胞内蛋白酶的底物)。肽切割位点的实例包括T2A，P2A，E2A或F2A位点。
将基因引入细胞并表达的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物，细菌，酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理，化学或生物手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域熟知的，参见例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY)。一种用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的方法是磷酸钙转染。
将目的多核苷酸引入到宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经变成将基因插入哺乳动物例如人类细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的化学方法包括胶体分散系统，比如大分子复合体、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。一种用作体外和体内递送载体的示例性的胶体系统为脂质体(例如，人工膜囊)。可利用靶向递送核酸的其它方法，比如用靶向纳米颗粒或其它合适的亚微米尺寸递送系统来递送多核苷酸。
在其中使用非病毒递送系统的情况下，示例性的递送载体是脂质体。预期使用脂质制剂将核酸引入到宿主细胞(体外，离体或体内)。在另一个方面，核酸可能与脂质结合。与脂质结合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子附着在脂质体上、俘获在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、呈悬浮液含在脂质中、含有胶束或与胶束复合、或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或与脂质/表达载体缔合的组合物不限于在溶液中的任一特定结构。例如，它们可以以双层结构、呈胶束存在或具有“塌陷(collapsed)”的结构。它们也可以仅简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质为脂肪物质，其可以天然存在或是合成脂质。例如，脂质包括细胞质中天然存在的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物的化合物种类，比如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适于使用的脂质可以从商业来源得到。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以得自Sigma,St.Louis,MO；磷酸三十二烷基酯(“DCP”)可以得自K&K Laboratories(Plainview,NY)；胆固醇(“Choi”)可以得自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)及其它脂质可以得自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的贮存液可以储存在约-20℃。氯仿可以用作溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是包括通过产生封闭脂质双层或聚集体形成的多种单层或多层脂质载体的通称。脂质体可以表征为具有磷脂双层膜和内部水介质的囊状结构。多层脂质体具有多个被水性介质分开的脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发地形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排且在脂质双层之间俘获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，也包括在溶液中具有与正常囊状结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以采用胶束结构或仅仅作为脂质分子的非均匀聚集体存在。还预期lipofectamine-核酸复合体。
与用于将外源性核酸引入到宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法无关，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种试验。这样的试验包括，例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”试验，比如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生化”试验，比如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的试验，以鉴定落入本发明范围之内的活性剂。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹，RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹)检测特定肽的存在或不存在，或通过本文所述的测定来鉴定属于本发明范围内的活性剂。
治疗方法
一方面，本公开提供了治疗与本文所述的肿瘤抗原表达相关的疾病的方法。
在一个方面，本公开提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表达CAR(例如CD19 CAR，其中癌细胞表达CD19)的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)来治疗癌症(例如，血液癌症，例如ALL和CLL)的方法。在一个实施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，待治疗的癌症是ALL(急性淋巴细胞白血病)，CLL(慢性淋巴细胞白血病)，DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)，MCL(套细胞淋巴瘤)或MM(多发性骨髓瘤)。在一个实施方案中，待治疗的癌症是ALL，例如难治或复发性ALL。
在实施方案中，本文描述的治疗癌症的方法包括如本文所述评估受试者的步骤(例如，评估，例如预测受试者发展严重CRS的风险)。
本公开内容包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)被遗传修饰(例如，通过慢病毒载体的转导)以表达CAR,并且将CAR表达细胞输注到需要其的受体中。输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)能够在体内复制，导致长期持续性，其可导致持续的肿瘤控制。使用慢病毒载体产生的CAR表达细胞(例如，T细胞或NK细胞)将具有稳定的CAR表达。在各个方面，施用于患者或其后代的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)在T细胞或NK细胞施用于患者后在患者中持续至少四个月，五个月，六个月，七个月，八个月，九个月，十个月，十一个月，十二个月，十三个月，十四个月，十五个月，十六个月，十七个月，十八个月，十九个月，二十个月，二十一个月，二十二个月，二十三个月，二年，三年，四年，或五年。
本发明还包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)被修饰，例如通过体外转录的RNA修饰，以瞬时表达CAR,并且将表达CAR的细胞输注到需要其的受体中。通过CAR RNA转导产生的表达CAR的细胞(例如，T细胞，NK细胞)(例如通过转染或电穿孔)在转导后瞬时表达RNA CAR 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15天。输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，施用于患者的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)在T细胞施用于患者后持续至少一个月，例如三周，两周，一周。
在一个实施方案中，将免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)工程化以表达CD19CAR,用于治疗患有癌症(例如血液癌症，例如ALL和CLL)的受试者，其中癌细胞表达CD19。在一个实施方案中，待治疗的癌症是ALL或CLL。要在免疫效应细胞中表达的CD19 CAR分子可以包含本领域任何抗CD19抗原结合结构域(例如表2中提供的那些)与本文所述的任何CAR结构域组合以产生完整的CAR构建体。
CD19相关疾病和/或病症
一方面，本公开提供了用CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)疗法来治疗癌症例如与CD19表达相关的癌症的方法。示例性的癌症包括但不限于例如，一种或多种急性白血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞白血病(“B-ALL”)，T细胞急性淋巴细胞白血病(“T-ALL”)，急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。与CD19表达相关的额外癌症或血液病症包括但不限于例如B细胞早幼粒细胞白血病，胚细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆胚细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤，瓦尔登斯特隆巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是通过骨髓血细胞的无效生产(或发育不良)联合起来的血液病症的多样化集合等。此外，与CD19表达相关的疾病包括但不限于例如与CD19表达相关的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病症或增殖性疾病。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗CLL的方法。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗ALL的方法。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗B细胞ALL的方法。
一方面，本公开提供了治疗难治或复发性ALL的方法。
在一个实施方案中，CLL的护理标准包括但不限于本文所述的示例性疗法，例如表11中所述，以及其组合。
表11:CLL的示例性疗法
Figure BDA0003753655610002281
Figure BDA0003753655610002291
Figure BDA0003753655610002301
在一个实施方案中，CLL的护理标准包括(1)放射疗法，(2)化学疗法，(3)手术(例如，去除脾脏)，(4)靶向疗法，(5)干细胞移植及其组合。在一个实施方案中，护理标准包括外部放射疗法。在一个实施方案中，护理标准包括内部放射疗法(例如，密封在例如直接放置在癌症中或癌症附近的针头，导线或导管中的放射性物质)。
在一个实施方案中，ALL的护理标准包括但不限于本文所述的示例性疗法，例如表12所述，以及其组合。
表12:ALL的示例性疗法
Figure BDA0003753655610002302
Figure BDA0003753655610002311
在一个实施方案中，ALL的护理标准包括(1)化疗，(2)放疗，(3)干细胞移植，(4)生物治疗，(5)靶向治疗及其组合。
在一个实施方案中，护理标准包括但不限于氟达拉滨与环磷酰胺(FC)；氟达拉滨与利妥昔单抗(FR)；氟达拉滨，环磷酰胺和利妥昔单抗(FCR)；环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和泼尼松(CHOP)；及其组合。考虑使用的一般化学治疗剂包括但不限于阿那曲唑
Figure BDA0003753655610002321
比卡鲁胺(bicalutamide)
Figure BDA0003753655610002322
、硫酸博来霉素盐(bleomycinsulfate)
Figure BDA0003753655610002323
白消安(busulfan)
Figure BDA0003753655610002324
白消安注射剂
Figure BDA0003753655610002325
卡培他滨
Figure BDA0003753655610002326
N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡铂
Figure BDA0003753655610002327
卡莫司汀
Figure BDA0003753655610002328
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003753655610002329
顺铂
Figure BDA00037536556100023210
克拉屈滨
Figure BDA00037536556100023211
环磷酰胺(
Figure BDA00037536556100023212
或
Figure BDA00037536556100023213
)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷
Figure BDA00037536556100023214
阿糖胞苷脂质体注射剂
Figure BDA00037536556100023215
达卡巴嗪
Figure BDA00037536556100023216
更生霉素(Actinomycin D，Cosmegan)、柔红霉素盐酸盐
Figure BDA00037536556100023217
柔红霉素柠檬酸盐脂质体注射剂
Figure BDA00037536556100023218
地塞米松、多西他赛
Figure BDA00037536556100023219
多柔比星盐酸盐
Figure BDA00037536556100023220
依托泊苷
Figure BDA00037536556100023221
氟达拉滨磷酸盐
Figure BDA00037536556100023222
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00037536556100023223
氟他胺
Figure BDA00037536556100023224
tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞嘧啶核苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲
Figure BDA00037536556100023225
伊达比星
Figure BDA00037536556100023226
异环磷酰胺
Figure BDA00037536556100023227
依立替康
Figure BDA00037536556100023228
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00037536556100023229
甲酰四氢叶酸钙、美法仑
Figure BDA00037536556100023230
6-巯基嘌呤
Figure BDA00037536556100023231
甲氨蝶呤
Figure BDA00037536556100023232
米托蒽醌
Figure BDA00037536556100023233
麦罗塔(mylotarg)、紫杉醇
Figure BDA00037536556100023234
、phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀植入物
Figure BDA00037536556100023235
枸橼酸它莫西芬
Figure BDA00037536556100023236
替尼泊苷
Figure BDA00037536556100023237
6-硫代鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)
Figure BDA00037536556100023238
用于注射的托泊替康盐酸盐
Figure BDA00037536556100023239
长春碱
Figure BDA00037536556100023240
长春新碱
Figure BDA00037536556100023241
长春瑞滨
Figure BDA00037536556100023242
和其组合。
在一个实施方案中，化学疗法包括抗代谢物，包括但不限于叶酸拮抗剂(本文中也称为抗叶酸剂)，嘧啶类似物，嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤
Figure BDA0003753655610002331
5-氟尿嘧啶
Figure BDA0003753655610002332
Figure BDA0003753655610002333
氟尿苷
Figure BDA0003753655610002334
阿糖胞苷(
Figure BDA0003753655610002335
Tarabine PFS)，6-巯嘌呤
Figure BDA0003753655610002336
)，6-硫鸟嘌呤(Thioguanine
Figure BDA0003753655610002337
)，磷酸氟达拉滨
Figure BDA0003753655610002338
喷司他丁
Figure BDA0003753655610002339
培美曲塞
Figure BDA00037536556100023310
雷替曲塞
Figure BDA00037536556100023311
克拉屈滨
Figure BDA00037536556100023312
氯法拉滨
Figure BDA00037536556100023313
阿糖胞苷脂质体(也称为Liposomal Ara-C，DepoCytTM)；地西他滨
Figure BDA00037536556100023314
羟基脲(
Figure BDA00037536556100023315
DroxiaTM和MylocelTM)；巯嘌呤
Figure BDA00037536556100023316
普拉曲坦(FolotynTM)，卡培他滨
Figure BDA00037536556100023317
奈拉滨
Figure BDA00037536556100023318
阿扎胞苷
Figure BDA00037536556100023319
和吉西他滨
Figure BDA00037536556100023320
合适的抗代谢物包括，例如5-氟尿嘧啶
Figure BDA00037536556100023321
氟尿苷
Figure BDA00037536556100023322
卡培他滨
Figure BDA00037536556100023323
培美曲塞
Figure BDA00037536556100023324
雷替曲塞
Figure BDA00037536556100023325
和吉西他滨
Figure BDA00037536556100023326
及其组合。在一个实施方案中，嘌呤类似物是氟达拉滨。
在一个实施方案中，化疗包括烷化剂，包括但不限于氮芥(nitrogen mustards)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)∶尿嘧啶氮芥(Aminouracil
Figure BDA00037536556100023327
Figure BDA00037536556100023328
Uracil nitrogen
Figure BDA00037536556100023329
)、氮芥(chlormethine)
Figure BDA00037536556100023330
环磷酰胺(
Figure BDA00037536556100023331
Figure BDA00037536556100023332
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure BDA00037536556100023333
美法仑
Figure BDA00037536556100023334
苯丁酸氮芥
Figure BDA00037536556100023335
哌泊溴烷(pipobroman)
Figure BDA00037536556100023336
三乙撑三聚氰胺(triethylenemelamine)
Figure BDA00037536556100023337
三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺
Figure BDA00037536556100023338
塞替派
Figure BDA00037536556100023339
白消安
Figure BDA00037536556100023340
卡莫司汀
Figure BDA00037536556100023341
洛莫司汀
Figure BDA00037536556100023342
、链佐星(streptozocin)
Figure BDA00037536556100023343
和达卡巴嗪
Figure BDA00037536556100023344
和其组合。另外的示例性的烷化剂包括，不限于奥沙利铂
Figure BDA0003753655610002341
替莫唑胺(
Figure BDA0003753655610002342
和
Figure BDA0003753655610002343
)；更生霉素(也称为放线菌素-D，
Figure BDA0003753655610002344
)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素和苯基丙氨酸氮芥，
Figure BDA0003753655610002345
)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM)，
Figure BDA0003753655610002346
)；卡莫司汀
Figure BDA0003753655610002347
苯达莫司汀(Bendamustine)
Figure BDA0003753655610002348
白消安(
Figure BDA0003753655610002349
和
Figure BDA00037536556100023410
)；卡铂
Figure BDA00037536556100023411
洛莫司汀(也称为CCNU，
Figure BDA00037536556100023412
)；顺铂(也称为CDDP、
Figure BDA00037536556100023413
和
Figure BDA00037536556100023414
)；苯丁酸氮芥
Figure BDA00037536556100023415
环磷酰胺(
Figure BDA00037536556100023416
and
Figure BDA00037536556100023417
)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、
Figure BDA00037536556100023418
)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM)，
Figure BDA00037536556100023419
)；异环磷酰胺
Figure BDA00037536556100023420
Prednumustine；丙卡巴肼
Figure BDA00037536556100023421
氮芥(Mechlorethamine)(也称为氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和甲氯乙胺(mechloroethamine)盐酸盐、
Figure BDA00037536556100023422
)；链佐星
Figure BDA00037536556100023423
塞替派(也称为硫代磷酰胺(thiophosphoamide)、TESPA和TSPA，
Figure BDA00037536556100023424
)；环磷酰胺
Figure BDA00037536556100023425
Figure BDA00037536556100023426
和苯达莫司汀HCl
Figure BDA00037536556100023427
和其组合。在一个实施方案中，烷化剂是苯达莫司汀。在一个实施方案中，烷化剂是环磷酰胺。
在一个实施方案中，化学治疗剂是激酶抑制剂，例如酪氨酸激酶抑制剂，包括但不限于盐酸埃罗替尼
Figure BDA00037536556100023428
N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲(也称为ABT 869，可从Genentech得到)；苹果酸舒尼替尼
Figure BDA00037536556100023429
波舒替尼(4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-腈，也称为SKI-606，并在美国专利号6,780,996中描述)；达沙替尼
Figure BDA00037536556100023430
帕唑帕尼
Figure BDA00037536556100023431
索拉非尼
Figure BDA00037536556100023432
zactima(ZD6474)；和伊马替尼或甲磺酸伊马替尼(
Figure BDA00037536556100023433
和
Figure BDA00037536556100023434
)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自ibrutinib(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A113的BTK抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂:aloisine A；flavopiridol或HMR-1275，2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-[(3S，4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-chromenone；crizotinib(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-[(2R，3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃–4-酮盐酸盐(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；吲地磺胺(E7070)；roscovitine(CYC202)；palbociclib(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基
Figure BDA0003753655610002351
唑-2-基)甲基]硫基]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2，6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5，4-d][2]苯并氮杂
Figure BDA0003753655610002352
-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4，6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自CGP052088；4-氨基-3-(对氟苯基氨基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶(CGP57380)；cercosporamide；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3，4-d]嘧啶的MNK抑制剂。
在一个实施方案中，靶向疗法包括但不限于抗CD20抗体或其功能性片段，例如利妥昔单抗(
Figure BDA0003753655610002353
和
Figure BDA0003753655610002354
)；托西莫单抗
Figure BDA0003753655610002355
和ofatumumab
Figure BDA0003753655610002356
及其组合。在一个实施方案中，靶向疗法包括但不限于抗CD52抗体或其功能性片段，例如阿仑珠单抗
Figure BDA0003753655610002357
在一个实施方案中，生物疗法包括免疫疗法。示例性的蒽环类药物包括但不限于多柔比星(
Figure BDA0003753655610002358
和
Figure BDA0003753655610002359
)；博来霉素
Figure BDA00037536556100023510
柔红霉素(盐酸多柔比星，道诺霉素和盐酸红比霉素，
Figure BDA00037536556100023511
)；柔红霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸脂质体，
Figure BDA00037536556100023512
)；米托蒽醌(DHAD，
Figure BDA00037536556100023513
)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(
Figure BDA00037536556100023514
Idamycin
Figure BDA00037536556100023515
)；丝裂霉素C
Figure BDA00037536556100023516
格尔德霉素；除莠霉素；ravidomycin；去乙酰拉维霉素(desacetylravidomycin)及其组合。
在一个实施方案中，干细胞移植包括自体干细胞移植。在一个实施方案中，干细胞移植包括同种异体干细胞移植。在一个实施方案中，干细胞移植包括同种异体骨髓移植。在一个实施方案中，干细胞移植包括造血干细胞移植(HSCT)。在一个实施方案中，造血干细胞衍生自各种组织，包括但不限于骨髓，外周血，脐带血及其组合。
一方面，本公开提供了治疗与CD19表达相关的疾病的方法。一方面，本发明提供了治疗疾病的方法，其中部分肿瘤对于CD19是阴性的，并且部分肿瘤对于CD19是阳性的。例如，所提供的方法可用于治疗已经经历与CD19升高的表达相关的疾病治疗的受试者，其中经历了升高水平的CD19的治疗的受试者表现出与升高水平的CD19相关的疾病。
在一个方面，提供的方法包括含有有效连接到启动子以在哺乳动物细胞(例如，T细胞或NK细胞)中表达的CD19 CAR的载体。一方面，所提供的方法包括表达CD19 CAR的重组细胞(例如，T细胞或NK细胞)用于治疗CD19表达肿瘤的方法，其中表达CD19 CAR的重组T细胞称为CD19 CAR表达细胞。在一个方面，根据提供的方法施用的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)能够使肿瘤细胞与其表面上表达的至少一种CD19 CAR接触，使得CAR表达细胞靶向肿瘤细胞并且肿瘤的生长被抑制。
一方面，本公开的特征在于抑制表达CD19的肿瘤细胞生长的方法，其包括使肿瘤细胞与本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)接触，使得表达CAR细胞响应于抗原而被激活并靶向癌细胞，其中肿瘤的生长被抑制。
一方面，本公开内容包括一种细胞疗法，其中T细胞被遗传修饰以表达CAR，并且将CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)输注到需要其的受体。输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR修饰的细胞(例如，T细胞或NK细胞)能够在体内复制，导致长期持续性，其可导致持续的肿瘤控制。在各方面，在将细胞施用于患者后，施用于患者的细胞或其后代在患者中持续至少四个月，五个月，六个月，七个月，八个月，九个月，十个月，十一个月，十二个月，十三个月，十四个月，十五个月，十六个月，十七个月，十八个月，十九个月，二十个月，二十一个月，二十二个月，二十三个月，两年，三年，四年，或五年。
本公开还包括一种细胞疗法，其中细胞(例如，T细胞，NK细胞)被修饰(例如通过体外转录的RNA)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)并且CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)被输注到需要其的受体。输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，在向患者施用细胞(例如，T细胞，NK细胞)之后，施用于患者的细胞存在少于一个月，例如三周，两周，一周。
不希望受任何特定理论的约束，由CAR修饰的细胞(例如，T细胞，NK细胞)引起的抗肿瘤免疫应答可能是主动或被动免疫应答，或者可能是由于直接对间接免疫应答。一方面，CAR转导的T细胞应答表达CD19的人类癌细胞而表现出特异性促炎细胞因子分泌和有效的溶细胞活性，抵抗可溶性CD19抑制，介导旁观者杀死并介导已建立的人肿瘤的消退。例如，CD19表达肿瘤的异质区域内的少抗原肿瘤细胞可能会对CD19重定向的T细胞的间接破坏敏感，所述CD19重定向的T细胞先前已经针对相邻的抗原阳性癌细胞反应。
一方面，本文所述的完全人CAR修饰的细胞(例如，T细胞，NK细胞)可以是用于哺乳动物中离体免疫和/或体内疗法的一种疫苗。一方面，哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞施用于受试者之前，以下至少一种在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是众所周知的，并且在下面更全面地讨论。简而言之，用表达本文公开的CAR的载体从受试者(例如人)分离细胞并进行遗传修饰(即，在体外转导或转染)。CAR修饰的细胞可以施用于哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人，并且CAR修饰的细胞可以相对于受体是自体的。或者，相对于受体，细胞可以是同种异体的，同基因的或异种的。
血液癌症
血液癌症状况是影响血液，骨髓和淋巴系统的癌症类型，如白血病和恶性淋巴组织增生症。
白血病可分为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可进一步分为急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性骨髓性白血病(CML)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。其他相关病症包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称为“白血病前期”)，这是通过骨髓细胞无效产生(或发育异常)和转化为AML的风险联合起来的血液病症的多样化集合。
本公开提供了治疗癌症的组合物和方法。一方面，癌症是血液癌症，包括但不限于白血病或淋巴瘤。一方面，本发明的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)可用于治疗癌症和恶性肿瘤，例如但不限于例如急性白血病，包括但不限于例如急性骨髓性白血病(AML)，B细胞急性淋巴细胞白血病(“B-ALL”)，T细胞急性淋巴细胞白血病(“T-ALL”)，急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)；额外的血液癌症或血液病症，包括但不限于例如B细胞早幼粒细胞白血病，胚细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞-滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆胚细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，骨髓增生性肿瘤；组织稀薄啊病症(例如肥大细胞病症或胚细胞类浆细胞样树突状细胞肿瘤)；肥大细胞病症，例如系统性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病；B细胞幼淋巴细胞白血病，浆细胞骨髓瘤和“白血病前期”，其是通过骨髓细胞无效产生(或发育异常)等联合起来的血液病症的多样化集合。与CD19表达相关的其他疾病包括但不限于例如表达CD19的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病症或增殖性疾病。
本公开还提供了抑制增殖或减少表达CD19的细胞群体的方法，所述方法包括使包含表达CD19的细胞的细胞群与本文所描述的结合CD19表达细胞的CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)接触。在具体方面，本公开提供了抑制表达CD19的癌细胞的群体增殖或减少所述群体的方法，所述方法包括使表达CD19的癌细胞群体与结合CD19表达细胞的本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)接触。一方面，本公开提供了抑制表达CD19的癌细胞群体的增殖或减少该群体的方法，所述方法包括使表达CD19的癌细胞群体与本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)接触，所述CD19 CAR表达细胞结合CD19表达细胞。在某些方面，相对于阴性对照，抗CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)将在有骨髓性白血病或与CD19表达细胞相关的另一种癌症的受试者或动物模型中细胞和/或癌细胞的数量，数目，量或百分比减少至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少65％，至少75％，至少85％，至少95％或至少99％。在一个方面，受试者是人。
本公开还提供了用于预防，治疗和/或控制与CD19表达细胞相关的疾病(例如，表达CD19的血液癌症或非典型癌症)的方法，所述方法包括向需要的受试者施用本文所述的CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)，其结合CD19表达细胞。在一个方面，受试者是人。与CD19表达细胞相关的病症的非限制性实例包括自身免疫性病症(例如狼疮)，炎症性病症(例如变态反应和哮喘)和癌症(例如表达CD19的血液癌症或非典型癌症)。
本公开还提供了用于预防，治疗和/或控制与CD19表达细胞相关的疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)，其结合CD19表达细胞。在一个实施方案中，受试者是人。
本公开提供了用于预防与CD19表达细胞相关的癌症(例如，血液癌症例如ALL和CLL)复发的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)，其结合CD19表达细胞。在一个方面，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的与表达CD19的细胞结合的本文所述的CD19 CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)与有效量的另一种疗法的组合。
在一些实施方案中，本文所述的CAR表达细胞(例如CD19 CAR-表达细胞)用于消耗B细胞(例如B细胞群，例如调节性B细胞)。不希望受理论束缚，据信B细胞(例如调节性B细胞)的消耗可以改善肿瘤微环境，使得抗癌疗法(例如，本文所述的治疗)可以(例如，比没有B细胞耗尽)更有效。因此，本文提供了用于减少(例如，消耗)调节性细胞(例如调节性B细胞)的方法。该方法包括以足以减少调节细胞的量施用本文所述CAR表达细胞(例如CD19CAR-表达细胞)。在一些实施方案中，所述方法可用于调节肿瘤微环境，例如增强本文所述疗法的有效性。
在一些实施方案中，CAR表达细胞(例如本文所述的CAR表达细胞，例如本文所述的CD19 CAR表达细胞)的剂量包含约104至约109细胞/kg，例如约104至约105细胞/kg，约105至约106细胞/kg，约106至约107细胞/kg，约107至约108细胞/kg，或约108至约109细胞/kg。在实施方案中，CAR表达细胞的剂量包含约0.6×106个细胞/kg至约2×107个细胞/kg。在一些实施方案中，本文所述的CAR表达细胞(例如CD19 CAR-表达细胞)的剂量包含约2x105，1x106，1.1x106，2x106，3x106，3.6x106，5x106，1x107，1.8x107，2x107，5x107，1x108，2x108，3x108，或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD19 CAR-表达细胞)的剂量包含至少约1x106，1.1x106，2x106，3.6x106，5x106，1x107，1.8x107，2x107，5x107，1x108，2x108，3x108或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD19 CAR-表达细胞)的剂量包含高达约1x106，1.1x106，2x106，3.6x106，5x106，1x107，1.8x107，2x107，5x107，1x108，2x108，3x108或5x108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD19 CAR-表达细胞)的剂量包含约1.1×106至1.8×107个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD19 CAR-表达细胞)的剂量包含约1x107，2x107，5x107，1x108，2x108，3x108，5x108，1x109，2x109或5x109个细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，例如CD19 CAR-表达细胞)的剂量包含至少约1x107，2x107，5x107，1x108，2x108，3x108，5x108，1x109，2x109或5x109个细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，例如CD19 CAR-表达细胞)的剂量包含高达约1x107，2x107，5x107，1x108，2x108，3x108，5x108，1x109，2x109或5x109个细胞。
在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD19 CAR-表达细胞)的剂量包含高达约1x107，1.5x107，2x107，2.5x107，3x107，3.5x107，4x107，5x107，1x108，1.5x108，2x108，2.5x108，3x108，3.5x108，4x108，5x108，1x109，2x109或5x109个细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如CD19 CAR表达细胞)的剂量包含高达约1-3x107至1-3x108个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1-3x107个CD19 CAR表达细胞。在其他实施方案中，向受试者施用约1-3x108个CD19CAR表达细胞。
在一些实施方案中，CAR表达细胞(例如，本文描述的CAR-表达细胞，例如本文描述的CD19 CAR-表达细胞)的剂量包含约1x106细胞/m2至约1x109细胞/m2，例如约1x107细胞/m2至约5x108细胞/m2，例如约1.5x107细胞/m2，约2x107细胞/m2，约4.5x107细胞/m2，约108细胞/m2，约1.2x108细胞/m2，或约2x108细胞/m2。
在实施方案中，表达CD19 CAR的细胞以多个剂量施用，例如第一剂量，第二剂量和任选的第三剂量。在实施方案中，所述方法包括治疗患有癌症(例如急性淋巴性白血病(ALL))的受试者(例如成人受试者)，所述方法包括向所述受试者施用第一剂量，第二剂量和任选地一种或多种额外剂量，每个剂量包含表达CAR分子的免疫效应细胞，例如CD19 CAR分子，例如本文表1中列出的CTL019全长氨基酸序列。
在实施方案中，所述方法包括施用剂量为2-5x106个存活CAR表达细胞/kg，其中所述受试者具有小于50kg的体重；或
施用剂量为1.0-2.5x108个存活CAR表达细胞，其中所述受试者具有至少50kg的体重。
在实施方案中，将单一剂量施用于受试者，例如儿科受试者。
在实施方案中，所述剂量在连续的日期施用，例如第一剂量在第一日施用，第二剂量在第二日施用，并且任选的第三剂量(如果施用)在第三日施用。
在实施方案中，施用第四、第五或第六剂量或更多剂量。
在实施方案中，第一剂量包含总剂量的约10％，第二剂量包含总剂量的约30％，并且第三剂量包含总剂量的约60％，其中上述百分比具有总计100％。在实施方案中，第一剂量包括约9-11％，8-12％，7-13％或5-15％的总剂量。在实施方案中，第二剂量包含约29-31％，28-32％，27-33％，26-34％，25-35％，24-36％，23-37％，22-38％，21-39％，或20-40％的总剂量。在实施方案中，第三剂量包括约55-65％，50-70％，45-75％或40-80％的总剂量。在实施方案中，总剂量是指在1周，2周，3周或4周的过程中施用的存活CAR表达细胞的总数。在其中施用两个剂量的一些实施方案中，总剂量是指以第一和第二剂量向受试者施用的存活CAR表达细胞的数目的总和。在其中施用三个剂量的一些实施方案中，总剂量是指以第一、第二和第三剂量向受试者施用的存活的CAR-表达细胞的数目的总和。
在实施方案中，剂量根据其中存活的CAR表达细胞的数量来测量。可以例如通过使用结合CAR分子的抗体分子和可检测标记的流式细胞术来测量CAR表达。活力可以通过例如Cellometer来测量。
在实施方案中，存活CAR表达细胞以递增剂量施用。在实施方案中，第二剂量大于第一剂量，例如大于10％，20％，30％或50％。在实施方案中，第二剂量是第一剂量大小的两倍、三倍、四倍或五倍。在实施方案中，第三剂量大于第二剂量，例如大于10％，20％，30％或50％。在实施方案中，第三剂量是第二剂量大小的两倍、三倍、四倍或五倍。
在某些实施方案中，该方法包括以下的a)-h)中的一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个或全部：
a)以第一剂量施用的表达CAR的活细胞的数量不超过以第二剂量施用的表达CAR的活细胞的数量的1/3；
b)以第一剂量施用的表达CAR的活细胞的数量不超过施用的表达CAR的活细胞总数的1/X，其中X是2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30，40或50；
c)以第一剂量施用的表达CAR的活细胞的数目不超过1x107，2x107，3x107，4x107，5x107，6x107，7x107，8x107，9x107，1x108，2x108，3x108，4x108或5x108个CAR表达活细胞，并且第二剂量大于第一剂量；
d)以第二剂量中施用的表达CAR的活细胞的数量不超过以第三剂量施用的表达CAR的活细胞的数量的1/2；
e)以第二剂量施用的表达CAR的活细胞的数量不超过施用的表达CAR的活细胞总数的1/Y，其中Y是2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，30，40或50；
f)以第二剂量施用的表达CAR的活细胞的数目不超过1x107，2x107，3x107，4x107，5x107，6x107，7x107，8x107，9x107，1x108，2x108，3x108，4x108或5x108个CAR表达活细胞，并且第三剂量大于第二剂量；
h)选择第一剂量，第二剂量和任选的第三剂量的施用剂量和时间段，使得受试者经历不大于4、3、2或1的CRS水平。
在实施方案中，总剂量是约5x108个表达CAR的活细胞。在实施方案中，总剂量为约5x107-5x108个表达CAR的活细胞。在实施方案中，第一剂量为约5×107个(例如±10％，20％或30％)表达CAR的活细胞，第二剂量为约1.5×108个(例如±10％，20％或30％)表达CAR的活细胞，并且第三剂量是约3×108个(例如±10％，20％或30％)表达CAR的活细胞。
在实施方案中，在接受剂量后，例如在接受第一剂量，第二剂量和/或第三剂量后，评估受试者的CRS。
在实施方案中，受试者接受CRS治疗，例如托珠单抗，皮质类固醇，依那西普或siltuximab。在实施方案中，CRS治疗在包含CAR分子的细胞的第一剂量之前或之后施用。在实施方案中，CRS治疗在包含CAR分子的细胞的第二剂量之前或之后施用。在实施方案中，CRS治疗在包含CAR分子的细胞的第三剂量之前或之后施用。在实施方案中，CRS治疗在包含CAR分子的细胞的第一和第二剂量之间施用，和/或在包含CAR分子的细胞的第二和第三剂量之间施用。
在实施方案中，在第一剂量后具有CRS(例如CRS等级1、2、3或4)的受试者中，第二剂量在第一剂量后至少2、3、4或5天施用。在实施方案中，在第二剂量后具有CRS(例如CRS等级1、2、3或4)的受试者中，第三剂量在第二剂量后至少2、3、4或5天施用。在实施方案中，在第一剂量后具有CRS的受试者中，相对于第二剂量已经施用而受试者没有CRS时，第二剂量的CAR表达细胞被延迟。在实施方案中，在第二剂量后具有CRS的受试者中，相对于第三剂量已经施用而受试者没有CRS时，第三剂量的CAR表达细胞延迟。
在实施方案中，受试者在施用第一剂量之前患有高疾病负担的癌症。在实施方案中，受试者具有至少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％或50％的骨髓胚细胞(blast)水平，例如至少5％。在实施方案中，受试者具有I，II，III或IV期癌症。在实施方案中，受试者例如在单个肿瘤或多个肿瘤中具有至少1，2，5，10，20，50，100，200，500或1000g的肿瘤块。
在一些实施方案中，受试者患有癌症(例如，如本文所述的实体癌症或血液癌症)。在一个实施方案中，受试者具有CLL。在实施方案中，受试者具有ALL。在其他实施方案中，受试者具有多发性骨髓瘤。
在一个实施方案中，癌症是与CD19表达相关的疾病，例如如本文所述。在其他实施方案中，癌症是与肿瘤抗原相关的疾病，例如如本文所述。在实施方案中，CAR分子是如本文所述的CAR分子。
在一些实施方案中，用本文所述CAR表达细胞治疗的受试者在治疗后通过分子成像方法例如FDG-PET/CT进行评估。在实施方案中，受试者在治疗后1、2或3个月经历分子成像。在实施方案中，当受试者没有CRS症状时，受试者经历分子成像。在实施方案中，受试者具有DLBCL或FL。
组合疗法
应当理解，如本文所述的任何癌症疗法可以与一种或多种另外的疗法组合施用以治疗和/或减轻本文所述的癌症的症状。药物组合物可以与一种或多种其它疗法或治疗剂同时施用，在其他疗法之前或之后施用。在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞可以与其它已知的活性剂和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用是指在受试者患有病症的过程中将两种(或更多种)不同的治疗递送给受试者，例如，在受试者被诊断所述病症之后和在病症已经治愈或消除或者由于其他原因治疗已经停止之前，递送两种或多种治疗。在一些实施方案中，当第二种治疗递送开始时，一种治疗的递送仍然发生，从而在给药方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“同时递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中，由于组合施用，治疗更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，用较少的第二种治疗看到等同效果，或者与没有第一种治疗的情况下施用第二种治疗所看到的或者用第一种治疗所看到的类似情况相比，第二种治疗可以更大程度地减轻症状。在一些实施方案中，递送使得症状或与该病症相关的其他参数的减少大于在不存在另一种的情况下递送的一种治疗所观察到的减少。两种治疗的效果可以是部分相加的，全部相加的或大于相加的。递送可以使得当递送第二种治疗时仍然可以检测到递送的第一种治疗的效果。
本文所述的CAR表达细胞和至少一种另外的治疗剂可以同时或在相同或分开的组合物中或顺序施用。为了顺序施用，可以首先施用本文所述的CAR表达细胞，并且可以其次施用另外的活性剂，或者可以颠倒施用顺序。
在另外的方面，本文所述的CAR表达细胞可以与手术，化学疗法，放射，免疫抑制剂如环孢菌素，硫唑嘌呤，甲氨蝶呤，霉酚酸酯和FK506，抗体或其它免疫烧蚀剂如CAMPATH，抗CD3抗体或其他抗体疗法，细胞毒素，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228，细胞因子和放射肽疫苗组合用于治疗方案，如Izumoto等人，2008JNEUROSURG 108:963-971所述。
在一种实施方式中，本文所述表达CAR的细胞可以与化疗剂联合使用。示例性的化疗剂包括蒽环类(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如，苯达莫司汀、环磷酰胺、达可巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，alemtuzamab、吉姆单抗、利妥昔单抗(rituximab)、托西莫单抗(tositumomab))、抗代谢药(包括，例如叶酸拮抗药、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调节剂比如沙立度胺或沙立度胺衍生物(例如来那度胺(lenalidomide))，以及其组合。
考虑用于组合疗法的一般化疗剂包括阿那曲唑
Figure BDA0003753655610002461
比卡鲁胺(bicalutamide)
Figure BDA0003753655610002462
硫酸博来霉素盐(bleomycin sulfate)
Figure BDA0003753655610002471
白消安(busulfan)
Figure BDA0003753655610002472
白消安注射剂
Figure BDA0003753655610002473
卡培他滨
Figure BDA0003753655610002474
N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡铂
Figure BDA0003753655610002475
卡莫司汀
Figure BDA0003753655610002476
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003753655610002477
顺铂
Figure BDA0003753655610002478
克拉屈滨
Figure BDA0003753655610002479
环磷酰胺(
Figure BDA00037536556100024710
或
Figure BDA00037536556100024711
)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷
Figure BDA00037536556100024712
阿糖胞苷脂质体注射剂
Figure BDA00037536556100024713
达卡巴嗪
Figure BDA00037536556100024714
更生霉素(Actinomycin D,Cosmegan)、柔红霉素盐酸盐
Figure BDA00037536556100024715
柔红霉素柠檬酸盐脂质体注射剂
Figure BDA00037536556100024716
地塞米松、多西他赛
Figure BDA00037536556100024717
多柔比星盐酸盐
Figure BDA00037536556100024718
依托泊苷
Figure BDA00037536556100024719
氟达拉滨磷酸盐
Figure BDA00037536556100024720
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00037536556100024721
氟他胺
Figure BDA00037536556100024722
tezacitibine、吉西他滨(二氟脱氧胞嘧啶核苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲
Figure BDA00037536556100024723
伊达比星
Figure BDA00037536556100024724
异环磷酰胺
Figure BDA00037536556100024725
依立替康
Figure BDA00037536556100024726
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00037536556100024727
甲酰四氢叶酸钙、美法仑
Figure BDA00037536556100024728
6-巯基嘌呤
Figure BDA00037536556100024729
甲氨蝶呤
Figure BDA00037536556100024730
米托蒽醌
Figure BDA00037536556100024731
麦罗塔(mylotarg)、紫杉醇
Figure BDA00037536556100024732
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生(polifeprosan)20与卡莫司汀植入物
Figure BDA00037536556100024733
枸橼酸它莫西芬
Figure BDA00037536556100024734
替尼泊苷
Figure BDA00037536556100024735
6-硫代鸟嘌呤、塞替派(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)
Figure BDA00037536556100024736
用于注射的托泊替康盐酸盐
Figure BDA00037536556100024737
长春碱
Figure BDA00037536556100024738
长春新碱
Figure BDA00037536556100024739
和长春瑞滨
Figure BDA00037536556100024740
示例性的烷化剂包括，不限于:氮芥(nitrogen mustards)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)∶尿嘧啶氮芥(Aminouracil
Figure BDA00037536556100024741
Figure BDA00037536556100024742
Uracil nitrogen
Figure BDA00037536556100024743
Figure BDA00037536556100024744
)、氮芥(chlormethine)
Figure BDA00037536556100024745
环磷酰胺(
Figure BDA00037536556100024746
Figure BDA00037536556100024747
RevimmuneTM)、异环磷酰胺
Figure BDA00037536556100024748
美法仑
Figure BDA00037536556100024749
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003753655610002481
哌泊溴烷(pipobroman)
Figure BDA0003753655610002482
三乙撑三聚氰胺(triethylenemelamine)
Figure BDA0003753655610002483
三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺
Figure BDA0003753655610002484
塞替派
Figure BDA0003753655610002485
白消安
Figure BDA0003753655610002486
卡莫司汀
Figure BDA0003753655610002487
洛莫司汀
Figure BDA0003753655610002488
链佐星(streptozocin)
Figure BDA0003753655610002489
和达卡巴嗪
Figure BDA00037536556100024810
另外的示例性的烷化剂包括，不限于奥沙利铂
Figure BDA00037536556100024811
替莫唑胺(
Figure BDA00037536556100024812
和
Figure BDA00037536556100024813
)；更生霉素(也称为放线菌素-D，
Figure BDA00037536556100024814
)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素和苯基丙氨酸氮芥，
Figure BDA00037536556100024815
)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM),
Figure BDA00037536556100024837
)；卡莫司汀
Figure BDA00037536556100024816
苯达莫司汀(Bendamustine)
Figure BDA00037536556100024817
白消安(
Figure BDA00037536556100024818
和
Figure BDA00037536556100024819
)；卡铂
Figure BDA00037536556100024820
洛莫司汀(也称为CCNU,
Figure BDA00037536556100024821
)；顺铂(也称为CDDP、
Figure BDA00037536556100024822
和
Figure BDA00037536556100024823
)；苯丁酸氮芥
Figure BDA00037536556100024824
环磷酰胺(
Figure BDA00037536556100024825
and
Figure BDA00037536556100024826
)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、
Figure BDA00037536556100024827
)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM),
Figure BDA00037536556100024828
)；异环磷酰胺
Figure BDA00037536556100024829
Prednumustine；丙卡巴肼
Figure BDA00037536556100024830
氮芥(Mechlorethamine)(也称为氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和甲氯乙胺(mechloroethamine)盐酸盐、
Figure BDA00037536556100024831
)；链佐星
Figure BDA00037536556100024832
塞替派(也称为硫代磷酰胺(thiophosphoamide)、TESPA和TSPA,
Figure BDA00037536556100024833
)；环磷酰胺
Figure BDA00037536556100024834
和苯达莫司汀HCl
Figure BDA00037536556100024835
示例性的mTOR抑制剂包括但不限于RAD001，坦罗莫司；雷达罗莫司(ridaforolimus)(正式称为deferolimus、(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]六(三十烷)-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，且描述在PCT公开号WO 03/064383中)；依维莫司(
Figure BDA00037536556100024836
或RAD001)；雷帕霉素(AY22989,
Figure BDA0003753655610002491
)；simapimod(CAS 164301-51-3)；emsirolimus，(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502,CAS1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基L-丝氨酸，内盐(SF1126,CAS 936487-67-1)-(SEQ ID NO:337)，XL765及其组合。
示例性免疫调节剂包括，但是不限于，afutuzumab(可获自
Figure BDA0003753655610002492
)；培非司亭
Figure BDA0003753655610002493
来那度胺(CC-5013，
Figure BDA0003753655610002494
)；沙立度胺
Figure BDA0003753655610002495
actimid(CC4047)；IRX-2(人细胞因子的混合物，包括白介素1，白细胞介素2和干扰素γ，CAS951209-71-5，可从IRX Therapeutics获得)，以及其组合。
示例性的蒽环类抗生素包括但是不限于多柔比星(
Figure BDA0003753655610002496
和
Figure BDA0003753655610002497
)；博来霉素
Figure BDA0003753655610002498
柔红霉素(盐酸多柔比星，道诺霉素和盐酸红霉素，
Figure BDA0003753655610002499
)；柔红霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸盐脂质体，
Figure BDA00037536556100024910
)；米托蒽醌(DHAD，
Figure BDA00037536556100024911
)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星
Figure BDA00037536556100024912
丝裂霉素C
Figure BDA00037536556100024913
格尔德霉素；除莠霉素；ravidomycin；去乙酰曲霉素，以及其组合。
示例性的长春花生物碱包括但是不限于酒石酸长春瑞滨
Figure BDA00037536556100024914
和长春新碱
Figure BDA00037536556100024915
长春地辛
Figure BDA00037536556100024916
)；长春花碱(也称为硫酸长春花碱，长春碱和VLB，
Figure BDA00037536556100024917
和
Figure BDA00037536556100024918
)；长春烯碱
Figure BDA00037536556100024919
以及其组合。
示例性蛋白酶体抑制剂但是不限于硼替佐米
Figure BDA0003753655610002501
Carfilzomib(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺；marizomib(NPI-0052)；柠檬酸伊佐珠单抗(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)，以及其组合。
示例性的GITR激动剂包括但不限于GITR融合蛋白和抗-GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，比如例如美国专利号∶6,111,090、欧洲专利号:090505B1、美国专利号:8,586,023、PCT公开号∶WO 2010/003118和2011/090754中描述的GITR融合蛋白，或例如在美国专利号∶7,025,962、欧洲专利号∶1947183B1、美国专利号：7,812,135、美国专利号:8,388,967、美国专利号:8,591,886、欧洲专利号:EP 1866339、PCT公开号:WO 2011/028683、PCT公开号:WO 2013/039954、PCT公开号:WO2005/007190、PCT公开号:WO 2007/133822、PCT公开号:WO2005/055808、PCT公开号:WO 99/40196、PCT公开号:WO 2001/03720、PCT公开号:WO99/20758、PCT公开号:WO2006/083289、PCT公开号:WO 2005/115451、美国专利号∶7,618,632和PCT公开号:WO 2011/051726中所述的抗GITR抗体。
在一个实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞，例如CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)(例如CTL019)与mTOR抑制剂(例如本文所述的mTOR抑制剂)，例如雷帕霉素信号传导途径的靶标，例如RAD001组合施用于受试者，例如被鉴定为使用本文公开的方法的受试者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞之前施用mTOR抑制剂。例如，在一个实施方案中，mTOR抑制剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有癌症(例如，血液癌症例如ALL和CLL)。在一个实施方案中，受试者患有ALL。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
在一个实施方案中，将本文所述的CAR表达细胞，例如CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)(例如CTL019)与GITR激动剂，例如本文所述的GITR激动剂组合施用于受试者，例如被鉴定为使用本文公开的方法的受试者。在一个实施方案中，在CAR表达细胞之前施用GITR激动剂。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有癌症(例如，血液癌症例如ALL和CLL)。在一个实施方案中，受试者患有ALL。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
在实施方案中，向受试者施用另外的活性剂(与CAR-表达细胞和任选的治疗CRS的疗法的进一步组合)，其中所述另外的活性剂是抑制性分子的抑制剂，例如检查点分子，例如PD-1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，CD80，CD86，B7-H3(CD276)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD270)，KIR，A2aR，MHC I类，MHC II类，GAL9，腺苷或TGF(例如TGFβ)。在实施方案中，另外的活性剂是PD-L1抑制剂，例如FAZ053(hIgG4人源化抗PD-L1单克隆抗体)，MPDL3280A，durvalumab(DEMI-4736)，avelumab(MSB-0010718C)或BMS-936559。在实施方案中，另外的活性剂是PD-1的另外的抑制剂，例如派姆单抗(pembrolizumab)，nivolumab，PDR001，MEDI-0680(AMP-514)，AMP-224，REGN-2810或BGB-A317。在实施方案中，另外的活性剂是CTLA-4抑制剂，例如ipililimumab。在实施方案中，另外的活性剂是LAG-3的抑制剂，例如LAG525(hIgG4人源化抗-LAG-3单克隆抗体)。在实施方案中，另外的活性剂是TIM-3抑制剂，例如MBG453(hIgG4人源化抗TIM-3单克隆抗体)。在实施方案中，另外的活性剂是酶B-Raf的抑制剂，例如达拉菲尼(GSK2118436；N-{3-[5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-叔丁基-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺)。在实施方案中，另外的活性剂是MEK1和/或MEK2的抑制剂，例如，trametinib(N-(3-{3-环丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-1(2H)-基}苯基)乙酰胺)。在实施方案中，另外的活性剂包含dabrafenib和trametinib。在实施方案中，另外的活性剂是GITR抑制剂，例如GWN323。在实施方案中，另外的活性剂是STING的激动剂(干扰素基因的刺激剂)，例如MIW815。在实施方案中，另外的活性剂是IL-15激动剂，例如NIZ985。在实施方案中，另外的活性剂是腺苷受体抑制剂，例如NIR178。在实施方案中，另外的活性剂是巨噬细胞集落刺激因子(CSF-1)的抑制剂，例如MCS110。在实施方案中，另外的活性剂是cMet的抑制剂，例如INC280。在实施方案中，另外的活性剂是豪猪(PORCN)的抑制剂，例如WNT974。在一些实施方案中，另外的活性剂是组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如帕比司他(panobinostat)。在实施方案中，另外的活性剂是mTOR抑制剂，例如依维莫司(everolimus)。在实施方案中，另外的活性剂是半胱天冬酶模拟物的第二种线粒体衍生的活化剂(SMAC)和/或IAP蛋白质家族抑制剂(凋亡蛋白抑制剂)，例如LCL161。在实施方案中，另外的活性剂是抑制剂表皮生长因子受体(EGFR)，例如EGF816。在实施方案中，另外的活性剂是IL-17的抑制剂，例如CJM112。在实施方案中，另外的活性剂是IL-1β的抑制剂，例如ILARIS。
激酶抑制剂
在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞可以与激酶抑制剂例如CDK4抑制剂，BTK抑制剂，MNK抑制剂，mTOR抑制剂，ITK抑制剂等组合用于治疗方案中。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如本文所述的CDK4抑制剂，例如CDK4/6抑制剂，比如例如6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称为palbociclib或PD0332991)。在一种实施方案中，激酶抑制剂为BTK抑制剂，例如本文所述BTK抑制剂，比如例如ibrutinib。在一种实施方案中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，例如本文所述mTOR抑制剂，比如例如雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以为例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如本文所述mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一种实施方案中，激酶抑制剂为MNK抑制剂，例如本文所述MNK抑制剂，比如例如4-氨基-5-(4-氟苯氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以为例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。
在一种实施方案中，激酶抑制剂为CDK4抑制剂，选自阿洛新A(aloisine A)；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275,2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基4-哌啶基]-4-色酮(chromenone)；crizotinib(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟基甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine(CYC202)；palbociclib(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基
Figure BDA0003753655610002531
唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂
Figure BDA0003753655610002532
-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。
在一种实施方案中，激酶抑制剂为CDK4抑制剂，例如palbociclib(PD0332991)，并且palbociclib以每日约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量施用一段时间，例如28天周期的第14-21天每日施用，或21天周期的第7-12天每日施用。在一种实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个周期的palbociclib。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自ibrutinib(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13的BTK抑制剂。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如ibrutinib(PCI-32765),ibrutinib以每天约250mg，300mg，350mg，400mg，420mg，440mg，460mg，480mg，500mg，520mg，540mg，560mg，580mg，600mg(例如，250mg，420mg或560mg)的剂量施用一段时间，例如21天周期每日施用，或例如28天周期每日施用。在一个实施方案中，施用1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多个周期的ibrutinib。
在一种实施方案中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，选自坦罗莫司；雷达罗莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸酯，也称为AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；simapimod(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基L-丝氨酸，内盐(SF1126)(SEQ ID NO:337)；和XL765。
在一种实施方案中，激酶抑制剂为mTOR抑制剂，例如雷帕霉素，并且雷帕霉素每日以约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如6mg)的剂量施用一段时间，例如21天周期每日施用，或28天周期每日施用。在一个实施方案中，施用了1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如依维莫司，并且依维莫司以每天约2mg，2.5mg，3mg，4mg，5mg，6mg，7mg，8mg，9mg，10mg，11mg，12mg，13mg，14mg，15mg(例如10mg)的剂量施用一段时间，例如28天周期每日施用。在一个实施方案中，施用依维莫司，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多个周期。
在一种实施方案中，激酶抑制剂为MNK抑制剂，选自CGP052088；4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；cercosporamide；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
与低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂的组合
本文描述的方法使用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂，例如变构mTOR抑制剂，包括诸如RAD001的rapalog。施用低的免疫增强剂量的mTOR抑制剂(例如，不足以完全抑制免疫系统但足以改善免疫功能的剂量)可以优化受试者中免疫效应细胞(例如T细胞或CAR表达细胞)的性能。用于测量mTOR抑制，剂量，治疗方案和合适的药物组合物的方法描述于美国专利申请号2005/0140036中，其通过引用并入本文。
抑制分子抑制剂/检查点抑制剂
在一个实施方案中，可以对受试者施用增强CAR表达细胞活性的活性剂。例如，在一个实施方案中，活性剂可以是抑制检查点分子的活性剂。在一些实施方案中，检查点分子，例如程序性死亡1(PD1)可以降低CAR表达细胞装载免疫效应应答的能力。检查点分子的实例包括PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如，CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，TGF(例如，TGFβ)。
本文描述的方法可以包括CAR表达细胞与检查点抑制剂组合施用。在一些实施方案中，检查点抑制剂在CAR表达细胞之前施用，例如在施用CAR表达细胞前两周，12天，10天，8天，一周，6天，5天，4天，3天，2天或1天前施用。在一些实施方案中，检查点抑制剂与CAR表达细胞同时施用。
检查点分子的抑制，例如通过在DNA，RNA或蛋白质水平的抑制，可以优化CAR表达细胞性能。在实施方案中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA可以用来抑制CAR表达细胞中检查点分子的表达。在一个实施方案中，抑制剂是shRNA。在一个实施方案中，检查点分子在CAR表达细胞内被抑制。在这些实施方案中，抑制检查点分子表达的dsRNA分子与编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸连接。
在一个实施方案中，抑制信号的抑制剂可以是例如结合检查点分子的抗体或抗体片段。例如，该活性剂可以是结合PD1，PD-L1，PD-L2或CTLA4的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也称为MDX-010和MDX-101)，并以
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上市；Bristol-Myers Squibb)；Tremelimumab(可得自Pfizer的IgG2单克隆抗体，以前称为ticilimumab，CP-675,206)。在一个实施方案中，该活性剂是与TIM3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，该活性剂是结合LAG3的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，该活性剂是与CEACAM结合的抗体或抗体片段。
PD1是CD28受体家族的抑制成员，该家族还包括CD28，CTLA-4，ICOS和BTLA。PD1在活化的B细胞，T细胞和髓系细胞上表达(Agata等人，1996 INT.IMMUNOL 8:765-75)。已经显示PD1，PD-L1和PD-L2的两个配体在与PD1结合时下调T细胞活化(Freeman等人，2000 J ExpMed 192:1027-34；Latchman等人，2001 NAT IMMUNOL 2:261-8；Carter等人，2002 EUR JIMMUNOL 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人，2003 J MOL MED 81:281-7；Blank等人，2005 CANCER IMMUNOL.IMMUNOTHER.54:307-314；Konishi等人，2004 CLINCANCER RES 10:5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。
PD1，PD-L1和PD-L2的抗体，抗体片段和其他抑制剂在本领域是可获得的，并且可以与本文所述的CAR,例如本文所述的CD19 CAR组合使用。例如，nivolumab(也称为BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)是完全人IgG4单克隆抗体，其特异性阻断PD1。在US 8,008,449和WO2006/121168中公开了Nivolumab(克隆5C4)和与PD1特异性结合的其它人单克隆抗体。Pidilizumab(CT-011；Cure Tech)是结合PD1的人源化IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab和其他人源化抗PD1单克隆抗体公开在WO2009/101611中。兰布鲁珠单抗(Lambrolizumab)(也称为MK03475；默克)是与PD1结合的人源化IgG4单克隆抗体。兰布鲁珠单抗和其他人源化抗PD1抗体公开在US 8,354,509和WO2009/114335中。MDPL3280A(Genentech/Roche)是与PD-L1结合的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和PD-L1的其它人单克隆抗体公开在美国专利号7,943,743和美国公开号20120039906中。其它抗PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(重链和轻链可变区显示在WO2010/077634中的SEQ ID NO20和21)和MDX-1105(也称为BMS-936559，以及例如WO2007/005874中公开的抗PD-L1结合剂)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如WO2010/027827和WO2011/066342中公开的)是阻断PD1和B7-H1之间的相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体。其它抗PD1抗体包括AMP 514(Amplimmune)等，例如US8,609,089,US 2010028330和/或US 20120114649中公开的抗PD1抗体。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其片段是标题为“Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof”的US 2015/0210769(其全部内容通过引用并入本文)中所述的抗PD-1抗体分子。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含来自选自以下任何一种的抗体的重链和轻链可变区的至少一个，二个，三个，四个，五个或六个CDR(或统称为所有CDR):BAP049-hum01，BAP049-hum02，BAP049-hum03，BAP049-hum04，BAP049-hum05，BAP049-hum06，BAP049-hum07，BAP049-hum08，BAP049-hum09，BAP049-hum10，BAP049-hum11，BAP049-hum12，BAP049-hum13，BAP049-hum14，BAP049-hum15，BAP049-hum16，BAP049-Clone-A，BAP049-Clone-B，BAP049-Clone-C，BAP049-Clone-D或BAP049-Clone-E；或如US2015/0210769的表1所述；或由表1中的核苷酸序列编码，或与任一前述序列基本相同的序列(例如，至少80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％，99％或以上的同一性)；或密切相关的CDR例如相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
在另一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含来自本文所述抗体的至少一个，两个，三个或四个可变区，例如选自BAP049-hum01，BAP049-hum02，BAP049-hum03，BAP049-hum04，BAP049-hum05，BAP049-hum06，BAP049-hum07，BAP049-hum08，BAP049-hum09，BAP049-hum10，BAP049-hum11，BAP049-hum12，BAP049-hum13，BAP049-hum14，BAP049-hum15，BAP049-hum16，BAP049-Clone-A，BAP049-Clone-B，BAP049-Clone-C，BAP049-Clone-D，或BAP049-Clone-E任一个的抗体；或如表1所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或如US 2015/0210769的表1所述；或由表1中的核苷酸序列编码；或与任一前述序列基本相同(例如，至少80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％，99％或更高同一性)的序列。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含：
(a)包含SEQ ID NO：4的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)；和包含SEQ ID NO：13的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：33的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，其各自公开于US 2015/0210769的表1中；
(b)包含选自SEQ ID NO：1的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：2的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列的VH；以及包含SEQ ID NO：10的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：32的VLCDR3氨基酸序列的VL，其各自公开在US2015/0210769的表1中；
(c)包含SEQ ID NO：224的VH CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列的VH；以及包含SEQ ID NO：13的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：33的VLCDR3氨基酸序列的VL，其各自公开在US2015/0210769的表1中；或
(d)包含SEQ ID NO：224的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：2的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列的VH；以及包含SEQ ID NO：10的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：32的VLCDR3氨基酸序列的VL，其各自公开在US2015/0210769的表1中。
在下文的组合中，在另一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含(i)包含选自SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：224的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)；和(ii)包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：13的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，其各自公开在US 2015/0210769的表1中。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体分子通过注射(例如皮下或静脉内)以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg，约10至20mg/kg，约1至5mg/kg或约3mg/kg的剂量施用。给药方案可以从例如每周一次到每2、3或4周一次变化。在一个实施方案中，每隔一周以约1至20mg/kg的剂量施用抗PD-1抗体分子。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体分子)的剂量是平剂量。在一些实施方案中，通过注射(例如，皮下或静脉内)以约200mg至500mg，例如约250mg至450mg，约300mg至400mg，约250mg至350mg，约350mg至450mg，或约300mg或约400mg的剂量(例如平剂量)施用抗PD-1抗体分子。给药方案(例如平剂量给药方案)可以从例如每周一次到每2、3、4、5或6周一次变化。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子以每三周一次或每四周一次约300mg至400mg的剂量施用。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子以每三周一次约300mg的剂量施用。在一个实施方案中，抗-PD-1抗体分子以每四周一次约400mg的剂量给药，例如通过静脉内输液给药。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子以每四周一次约300mg的剂量给药，例如通过静脉内输液给药。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子以每三周一次约400mg的剂量给药，例如通过静脉内输液给药。
在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括来自BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N、或BAP058-Clone-O中任何的重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，或如表1中所述，或由US-2016/0108123的表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，一个或多个CDR(或者共同地全部CDR)相对于表1所示或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。
在又一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)，至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包含恒定区)或两者，包含BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N、或BAP058-Clone-O中的任何的氨基酸序列，或如US-2016/0108123的表1所述或由表1中的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％，99％或更高同一性)的序列。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含：
(i)包含选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：2的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)，其各自在US-2016/0108123的表1中公开；和
(ii)包含SEQ ID NO：9的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：10的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：11的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，其各自在US-2016/0108123的表1中公开。
在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含：
(i)包含选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)，其各自在US-2016/0108123的表1中公开；和
(ii)包含SEQ ID NO：12的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：14的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，其各自在US-2016/0108123的表1中公开。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO：1的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO：4的VHCDR1氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO：195的VHCDR1氨基酸序列，其各自在US-2016/0108123的表1中公开。
TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)也负调节T细胞功能，特别是在分泌IFN-g的CD4+T辅助1细胞和CD8+T细胞毒性1细胞中，并在T细胞消耗中发挥关键作用。抑制TIM3与其配体如galectin-9(Gal9)，磷脂酰丝氨酸(PS)和HMGB1之间的相互作用可增加免疫应答。TIM3及其配体的抗体，抗体片段和其他抑制剂在本领域是可获得的，并且可以与本文所述的CD19CAR组合使用。例如，靶向TIM3的抗体，抗体片段，小分子或肽抑制剂结合TIM3的IgV结构域以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM3的抗体和肽公开在WO2013/006490和US20100247521中。其他抗TIM3抗体包括RMT3-23的人源化形式(公开于Ngiow等人，2011,Cancer Res,71:3540-3551)和克隆8B.2C12(公开于Monney等人，2002,Nature,415:536-541)。在US20130156774中公开了抑制TIM3和PD-1的双特异性抗体。
在一个实施方案中，抗TIM3抗体或其片段是标题为“Antibody Molecules toTIM3and Uses Thereof”的美国专利2015/0218274(其全部内容通过引用并入本文)中所述的抗TIM3抗体分子。在一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包括来自抗体的重链和轻链可变区的至少一个，二个，三个，四个，五个或六个CDR(或统称为所有CDR)，所述抗体选自ABTIM3，ABTIM3-hum01，ABTIM3-hum02，ABTIM3-hum03，ABTIM3-hum04，ABTIM3-hum05，ABTIM3-hum06，ABTIM3-hum07，ABTIM3-hum08，ABTIM3-hum09，ABTIM3-hum10，ABTIM3-hum11，ABTIM3-hum12，ABTIM3-hum13，ABTIM3-hum14，ABTIM3-hum15，ABTIM3-hum16，ABTIM3-hum17，ABTIM3-hum18，ABTIM3-hum19，ABTIM3-hum20，ABTIM3-hum21，ABTIM3-hum22，ABTIM3-hum23的任一个；或如US2015/0218274的表1-4所述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与任何前述序列基本相同(例如至少80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％，99％或更高同一性)的序列或密切相关的CDR，例如，相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
在另一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包含来自本文所述抗体的至少一个，两个，三个或四个可变区，所述抗体例如选自ABTIM3，ABTIM3-hum01，ABTIM3-hum02，ABTIM3-hum03，ABTIM3-hum04，ABTIM3-hum05，ABTIM3-hum06，ABTIM3-hum07，ABTIM3-hum08，ABTIM3-hum09，ABTIM3-hum10，ABTIM3-hum11，ABTIM3-hum12，ABTIM3-hum13，ABTIM3-hum14，ABTIM3-hum15，ABTIM3-hum16，ABTIM3-hum17，ABTIM3-hum18，ABTIM3-hum19，ABTIM3-hum20，ABTIM3-hum21，ABTIM3-hum22，ABTIM3-hum23的任一个；；或如US 2015/0218274的表1-4所述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与前述任何序列基本相同(例如，至少80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％，99％或更高同一性)的序列。
在其它实施方案中，增强CAR表达细胞活性的活性剂是CEACAM抑制剂(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5抑制剂)。在一个实施方案中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性的抗CEACAM-1抗体描述于WO 2010/125571，WO 2013/082366，WO2014/059251和WO 2014/022332中，例如单克隆抗体34B1,26H7和5F4；或其重组形式，如例如US 2004/0047858，US 7,132,255和WO 99/052552中所述。在其它实施方案中，抗CEACAM抗体结合CEACAM-5，如例如Zheng等人，PLoS One.2010 Sep 2；5(9).pii:e12529(DOI:10:1371/journal.pone.0021146)所述，或与例如WO 2013/054331和US 2014/0271618中所述的CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应。
不希望被理论束缚，认为癌胚抗原细胞粘附分子(CEACAM)如CEACAM-1和CEACAM-5至少部分地介导抗肿瘤免疫应答的抑制(参见例如，Markel等人，J Immunol.2002 Mar 15；168(6):2803-10；Markel等人，J Immunol.2006 Nov 1；177(9):6062-71；Markel等人，Immunology.2009Feb；126(2):186-200；Markel等人，Cancer Immunol Immunother.2010Feb；59(2):215-30；Ortenberg等人，Mol Cancer Ther.2012 Jun；11(6):1300-10；Stern等人，J Immunol.2005Jun 1；174(11):6692-701；Zheng等人，PLoS One.2010 Sep 2；5(9).pii:e12529)。例如，CEACAM-1已经被描述为TIM-3的异嗜性配体，并且在TIM-3介导的T细胞耐受和消耗中起作用(参见例如WO 2014/022332；Huang等人，(2014)Nature doi:10.1038/nature13848)。在实施方案中，已经显示了CEACAM-1和TIM-3的共阻断增强异种移植结肠直肠癌模型中的抗肿瘤免疫应答(参见例如WO 2014/022332；Huang等人，(2014)，上文)。在其它实施方案中，CEACAM-1和PD-1的共同阻断降低了T细胞耐受性，例如在WO 2014/059251中所述。因此，CEACAM抑制剂可以与本文所述的其它免疫调节剂(例如抗PD-1和/或抗TIM-3抑制剂)一起使用以增强针对癌症(例如黑素瘤，肺癌(例如，NSCLC)，膀胱癌，结肠癌，卵巢癌和本文所述的其它癌症)的免疫应答。
LAG3(淋巴细胞激活基因-3或CD223)是在活化的T细胞和B细胞上表达的细胞表面分子，其已被证明在CD8+T细胞耗尽中起作用。LAG3及其配体的抗体，抗体片段和其他抑制剂在本领域是可获得的，并且可以与本文所述的CD19 CAR组合使用。例如，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)是靶向LAG3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是拮抗剂LAG3抗体，IMP731(Immutep和GlaxoSmithKline)是耗竭性LAG3抗体。其他LAG3抑制剂包括IMP321(Immutep)，其是LAG3的可溶性部分和与II类MHC分子结合并激活抗原呈递细胞(APC)的Ig的重组融合蛋白。例如在WO2010/019570中公开了其它抗体。
在一个实施方案中，抗LAG3抗体或其片段是标题为“Antibody Molecules toLAG3 and Uses Thereof”的美国专利2015/0259420(其全部内容通过引用并入本文)中所述的抗LAG3抗体分子。在一个实施方案中，抗LAG3抗体分子包括来自抗体的重链和轻链可变区的至少一个，二个，三个，四个，五个或六个CDR(或总和为所有CDR)，所述抗体选自BAP050-hum01，BAP050-hum02，BAP050-hum03，BAP050-hum04，BAP050-hum05，BAP050-hum06，BAP050-hum07，BAP050-hum08，BAP050-hum09，BAP050-hum10，BAP050-hum11，BAP050-hum12，BAP050-hum13，BAP050-hum14，BAP050-hum15，BAP050-hum16，BAP050-hum17，BAP050-hum18，BAP050-hum19，BAP050-hum20，huBAP050(Ser)(例如BAP050-hum01-Ser，BAP050-hum02-Ser，BAP050-hum03-Ser，BAP050-hum04-Ser，BAP050-hum05-Ser，BAP050-hum06-Ser，BAP050-hum07-Ser，BAP050-hum08-Ser，BAP050-hum09-Ser，BAP050-hum10-Ser，BAP050-hum11-Ser，BAP050-hum12-Ser，BAP050-hum13-Ser，BAP050-hum14-Ser，BAP050-hum15-Ser，BAP050-hum18-Ser，BAP050-hum19-Ser，或BAP050-hum20-Ser)，BAP050-Clone-F，BAP050-Clone-G，BAP050-Clone-H，BAP050-Clone-I，或BAP050-Clone-J的任何；或如US 2015/0259420的表1所述；或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何前述序列基本相同(例如至少80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％，99％或更高同一性)的序列或密切相关的CDR，例如，相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个，三个或四个改变(例如，取代，缺失或插入，例如保守取代)的CDR。
在另一个实施方案中，抗LAG3抗体分子包含来自本文所述抗体的至少一个，两个，三个或四个可变区，所述抗体例如选自BAP050-hum01，BAP050-hum02，BAP050-hum03，BAP050-hum04，BAP050-hum05，BAP050-hum06，BAP050-hum07，BAP050-hum08，BAP050-hum09，BAP050-hum10，BAP050-hum11，BAP050-hum12，BAP050-hum13，BAP050-hum14，BAP050-hum15，BAP050-hum16，BAP050-hum17，BAP050-hum18，BAP050-hum19，BAP050-hum20，huBAP050(Ser)(例如BAP050-hum01-Ser，BAP050-hum02-Ser，BAP050-hum03-Ser，BAP050-hum04-Ser，BAP050-hum05-Ser，BAP050-hum06-Ser，BAP050-hum07-Ser，BAP050-hum08-Ser，BAP050-hum09-Ser，BAP050-hum10-Ser，BAP050-hum11-Ser，BAP050-hum12-Ser，BAP050-hum13-Ser，BAP050-hum14-Ser，BAP050-hum15-Ser，BAP050-hum18-Ser，BAP050-hum19-Ser，或BAP050-hum20-Ser)，BAP050-Clone-F，BAP050-Clone-G，BAP050-Clone-H，BAP050-Clone-I，或BAP050-Clone-J的任一个；或如US 2015/0259420的表1所述；或由表1中的核苷酸序列编码；或与前述任何序列基本相同(例如，至少80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％，99％或更高同一性)的序列。
在一些实施方案中，增强CAR表达细胞活性的活性剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是检查点分子或其片段，第二结构域是与阳性信号相关的多肽，例如包含如本文所述的细胞内信号传导结构域的多肽(本文也称为抑制性CAR或iCAR)。在一些实施方案中，与阳性信号相关的多肽可以包括CD28，CD27，ICOS的共刺激结构域，例如CD28，CD27和/或ICOS的细胞内信号传导结构域和/或例如，本文所述CD3ζ的一级信号传导结构域。在一个实施方案中，融合蛋白由表达CAR的相同细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由不表达CAR，例如CD19 CAR的细胞，例如T细胞表达。
在一个实施方案中，检查点分子，例如本文所述的检查点分子的细胞外结构域(ECD)，例如编程性死亡1(PD1)，可以融合到本文所述的跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，例如，包含共刺激信号传导结构域，例如41BB，OX40，Cd28，CD27和/或例如CD3ζ的一级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，抑制性CAR,例如PD1 CAR可以与另一CAR,例如CD19CAR(例如，CD19RCAR)组合使用。在一个实施方案中，PD1RCAR(或PD1CAR)改善了T细胞的持续性。抑制分子的实例包括PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如，CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4和TGF(例如TGFβ)。。在一个实施方案中，抑制性分子CAR包含第一多肽(例如抑制性分子如PD1，PD-L1，PD-L2，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，和TGF(例如，TGFβ)或这些任何一种的片段(例如，这些任何一种的至少一部分细胞外结构域)，以及第二多肽(其是本文所述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB，CD27或CD28，例如本文所述)和/或一级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域))。
在一个实施方案中，抑制性分子CAR包含融合到跨膜结构域的PD1的细胞外结构域(ECD)和细胞内信号传导结构域如41BB和CD3ζ(本文也称为PD1 CAR)。在一个实施方案中，PD1 CAR改善了细胞CAR表达细胞的持久性。在一个实施方案中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:40中下划线所示的PD1的细胞外结构域。在一个实施方案中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
Figure BDA0003753655610002681
在一个实施方案中，PD1 CAR包含下面提供的氨基酸序列。
Figure BDA0003753655610002682
在一个实施方案中，PD1 CAR,例如本文所述的PD1 CAR由下面示出的核酸序列，或至少包含编码PD1细胞外结构域的核酸序列(在下面下划线中示出)。
Figure BDA0003753655610002691
在实施方案中，抑制性细胞外结构域与天然存在的人抑制分子，例如本文公开的天然存在的人类主要刺激分子具有至少70，75，80，85，90，95，96，97，98，或99％的同一性，或与所述天然存在的人抑制分子的相应残基相差不超过30，25，20，15，10，5，4，3，2，或1个氨基酸残基。
调节嵌合抗原受体的策略
有多种方式可以调节CAR活性。在实施方案中，本文的CRS疗法与在这部分中描述的用于调节嵌合抗原受体的策略组合使用。例如，使用例如融合到二聚化结构域的胱天蛋白酶的可诱导性凋亡(见例如，Di Stasa等人，N Engl.J.Med.2011Nov.3；365(18):1673-1683)，可以在本发明的CAR疗法中用作安全开关。在一个实施方案中，表达本发明的CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)还包含可诱导的凋亡开关，其中人胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶9)或修饰形式融合到人类FKB蛋白的修饰形式，其允许条件二聚化。在小分子如rapalog(例如AP 1903，AP20187)的存在下，可诱导的胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶9)被激活并导致表达本发明的CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的快速凋亡和死亡。基于胱天蛋白酶的可诱导凋亡开关(或这种开关的一个或多个方面)的实例已经在例如US2004040047；US20110286980；US20140255360；WO1997031899；WO2014151960；WO2014164348；WO2014197638；WO2014197638中进行了描述；所有这些文献都通过引用并入本文。
在另一个实例中，CAR表达细胞还可以表达诱导型胱天蛋白酶-9(iCaspase-9)分子，其在施用二聚体药物(例如，rimiducid(也称为AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))时导致胱天蛋白酶-9的激活和细胞凋亡。iCaspase-9分子含有在CID存在下介导二聚化的二聚化(CID)结合结构域的化学诱导剂。这导致CAR表达细胞的可诱导和选择性消耗。在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体分开的核酸分子编码，在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体相同的核酸分子编码。iCaspase-9可以提供安全开关，以避免CAR表达细胞的任何毒性。参见例如Song等人，Cancer Gene Ther.2008；15(10):667-75；Clinical Trial Id.No.NCT02107963；和Di Stasi等人，N.Engl.J.Med.2011；365:1673-83。
用于调节CAR疗法的备选策略包括利用失活或关闭CAR活性的小分子或抗体，例如，通过缺失CAR表达细胞，例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在一个实施方案中，CAR疗法包括施用T细胞消耗剂。在一个实施方案中，T细胞消耗剂是例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体诱导的细胞死亡而消耗CAR表达细胞的活性剂。例如，本文所述的CAR表达细胞也可以表达由能够诱导细胞死亡(例如ADCC或补体诱导的细胞死亡)的分子识别的抗原(例如，靶抗原)。例如，本文所述的CAR表达细胞还可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的靶蛋白(例如受体)。这些靶蛋白的实例包括但不限于EpCAM，VEGFR，整联蛋白(例如整联蛋白ανβ3，α4，αΙ3/4β3，α4β7，α5β1，ανβ3，αν)，TNF受体超家族的成员(例如TRAIL-R1，TRAIL-R2)，PDGF受体，干扰素受体，叶酸受体，GPNMB，ICAM-1，HLA-DR，CEA，CA-125，MUC1，TAG-72，IL-6receptor，5T4，GD2，GD3，CD2，CD3，CD4，CD5，CD11，CD11a/LFA-1，CD15，CD18/ITGB2，CD19，CD20，CD22，CD23/lgE受体，CD25，CD28，CD30，CD33，CD38，CD40，CD41，CD44，CD51，CD52，CD62L，CD74，CD80，CD125，CD147/basigin，CD152/CTLA-4，CD154/CD40L，CD195/CCR5，CD319/SLAMF7和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个胞外表位但是缺乏细胞质结构域内的一个或多个区域的形式)。
在其他实施方案中，本文所述的CAR表达细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，其缺少信号传导能力，但保留由能够诱导ADCC的分子(例如西妥昔单抗
Figure BDA0003753655610002711
)识别的表位，使得施用西妥昔单抗诱导ADCC并随后消耗CAR表达细胞(参见例如WO2011/056894和Jonnalagadda等人，Gene Ther.2013；20(8)853-860)。另一个策略包括表达高度紧密的标记/自杀基因，该基因将结合利妥昔单抗的本文描述的CAR表达细胞中的CD32和CD20抗原的靶表位组合，导致CAR表达细胞的选择性消耗，例如通过ADCC(参见例如Philip等人，Blood.2014；124(8)1277-1287)。用于消耗本文所述的CAR表达细胞的其它方法包括施用CAMPATH，其是单克隆抗CD52抗体，该抗体选择性结合并靶向成熟淋巴细胞例如CAR表达细胞，例如通过诱导ADCC进行破坏。在其它实施方案中，可以使用CAR配体例如抗独特型抗体选择性靶向CAR表达细胞。在一些实施方案中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性，从而减少CAR表达细胞的数量。在其它实施方案中，CAR配体，例如抗独特型抗体可以偶联至诱导细胞杀伤的试剂，例如毒素，从而减少CAR表达细胞的数量。或者，CAR分子本身可以被配置为使得可以调节活性，例如开启和关闭活性，如下所述。
在其它实施方案中，本文所述的CAR表达细胞还可以表达由T细胞消耗剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是CD20，T细胞消耗剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。在这样的实施方案中，一旦需要减少或消除CAR表达细胞，例如减轻CAR诱导的毒性，则施用T细胞消耗剂。在其它实施方案中，T细胞消耗剂是如本文实施例中所述的抗CD52抗体，例如阿仑珠单抗。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括在用细胞(例如本文所述的免疫效应细胞)处理后施用T细胞消耗剂，从而减少(例如，消耗)CAR表达细胞(例如，CD19 CAR表达细胞)。这样的T细胞消耗剂可用于有效地消耗CAR表达细胞(例如CD19 CAR表达细胞)以减轻毒性。在一些实施方案中，根据本文的方法制备CAR表达细胞，例如根据本文方法测定(例如，在转染或转导之前或之后)。
在一些实施方案中，在施用细胞，例如本文所述的免疫效应细胞群后1，2，3，4或5周施用T细胞消耗剂。
在一些实施方案中，CAR表达细胞共表达CAR和靶蛋白，例如天然表达靶蛋白或被工程化以表达靶蛋白。例如，细胞，例如免疫效应细胞群体可以包括包含CAR核酸(例如本文所述的CAR核酸)和编码靶蛋白的核酸的核酸(例如载体)。
在一个实施方案中，T细胞消耗剂是CD52抑制剂，例如抗CD52抗体分子，例如阿仑珠单抗。
在其他实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞群，表达如本文所述的CAR分子(例如CD19CAR)和由T细胞消耗剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是CD20。在靶蛋白是CD20的实施方案中，T细胞消耗剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。
在任何上述方法的进一步实施方案中，所述方法还包括将细胞例如造血干细胞或骨髓移植到受试者中。
另一方面，本发明的特征在于在细胞移植之前对受试者进行调理的方法。该方法包括向受试者施用有效量的包含CAR核酸或多肽例如CD19CAR核酸或多肽的细胞。在一些实施方案中，细胞移植是干细胞移植，例如造血干细胞移植或骨髓移植。在其它实施方案中，在细胞移植之前对受试者进行调理包括减少受试者中靶表达细胞，例如表达CD19的正常细胞或表达CD19的癌细胞的数量。
RCARs
在其他实施方案中，需要可以控制CAR活性的可调节CAR(RCAR)以优化CAR疗法的安全性和有效性。
在一个方面，RCAR包含一组多肽，在最简单的实施方案中通常是两个，其中本文所述标准CAR的组分(例如抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域)分配在分开的多肽或成员上。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子存在时可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR利用二聚化开关，如在WO2014127261或WO2015090229中所述的那些，其通过引用引入本文。这种可调节CAR的附加描述和示例性配置在本文和例如2015年3月13日提交的国际公开WO 2015/090229的第527-551的段落中提供，其全部内容通过引用并入本文。
自然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一个实施方案中，本文所述的CAR分子包含自然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自以下任何自然杀伤细胞受体的跨膜结构域，铰链结构域或细胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1，KIR2DL2/L3，KIR2DL4，KIR2DL5A，KIR2DL5B，KIR2DS1，KIR2DS2，KIR2DS3，KIR2DS4，DIR2DS5，KIR3DL1/S1，KIR3DL2，KIR3DL3，KIR2DP1，和KIR3DP1；自然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30，NKp44，NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48，CD229，2B4，CD84，NTB-A，CRACC，BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A，LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可与衔接子分子或细胞内信号传导结构域，例如DAP12相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述在国际公开号WO2014/145252中，其内容通过引用并入本文。
分裂CAR
在一些实施方案中，CAR表达细胞包括分裂CAR。分裂CAR方法在出版物WO2014/055442和WO2014/055657中有更详细的描述，其通过引用并入本文。简而言之，分裂CAR系统包括表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具有第二抗原结合结构域和胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活，并且细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，胞内信号传导结构域被激活，细胞杀伤活性开始。因此，CAR表达细胞仅在两种抗原存在下完全活化。
子集优化CAR
在一些方面和实施方案中，本文的组合物和方法针对T细胞的特定子集进行了优化，例如，如2015年7月31日提交的美国序列号PCT/US2015/043219中所述，其内容通过引用全部并入本文。在一些实施方案中，与对照T细胞(例如表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如，CD8+或CD4+))相比，T细胞的优化子集显示增强的持续性。在一些实施方案中，CD4+T细胞包含本文所述的CAR，所述CAR包含适于CD4+T细胞(例如，优化，例如导致增强的持久性)的细胞内信号传导结构域，例如ICOS结构域。在一些实施方案中，CD8+T细胞包含本文所述的CAR，所述CAR包含适于CD8+T细胞(例如，优化，例如导致增强的持久性)的细胞内信号传导结构域，例如4-1BB结构域，CD28结构域或ICOS结构域以外的另一共刺激结构域。在一些实施方案中，本文所述的CAR包含本文所述的抗原结合结构域，例如包含抗原结合结构域的CAR。
药物组合物和治疗
药物组合物可以包含与一种或多种药学上可接受的或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的表达CAR的细胞，例如，许多表达CAR的细胞(正如本文中描述的那样)，或CRS疗法。这样的组合物可以包含缓冲液例如中性的缓冲盐水、磷酸缓冲盐水以及诸如此类；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。例如，可以把组合物配制成用于静脉内施用。
可以以合适的方式把本公开的药物组合物施用到将要被治疗(或预防)的疾病。施用的数量和频度将由这样的因素决定，如患者的状况以及患者的疾病类型和严重程度，然而合适的剂量可以由临床试验来确定。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含，例如没有可检测水平的污染物，例如该污染物选自由下列组成的组：内毒素、支原体、有复制潜力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、汇合的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、包装载体的细胞或质粒组件、细菌和真菌。在一种实施方案中，所述的细菌是选自由下列组成的组的至少一种：粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，白念珠菌(Candida albicans)，大肠杆菌(Escherichia coli)，流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)，绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)，和酿脓链球菌A群(Streptococcus pyogenes group A)。
当指示“免疫学上有效量”，“抗肿瘤有效量”，“抑制肿瘤有效量”或“治疗有效量”时，将要被施用的本发明的组合物的精确数量可以由医师在考虑个体在年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的情况下确定。一般地可以声明:可以以104至109个细胞/kg体重(在一些实例中105至106个细胞/kg体重，包括这些范围内所有的整数值)的剂量，施用包含本文中描述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物。也可以以这些剂量多次施用所述的T细胞组合物。可以通过免疫疗法中通常已知的输注技术来施用所述的细胞(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)。
在实施方案中，取决于受试者发展为严重CRS的风险状态(例如，使用本文所述的方法确定风险状态)，改变施用于受试者的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的剂量。在实施方案中，在被鉴定为处于发展严重CRS的高风险的受试者中，施用于受试者的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的剂量低于被鉴定为处于发展严重CRS的低风险的受试者。在实施方案中，施用于被鉴定为处于发展严重CRS的高风险的受试者的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的剂量为104至108个细胞kg体重，在一些情况下为104至107，104至106，105至107或105至106个细胞/kg体重，包括在这些范围内的所有整数值。在实施方案中，施用于被鉴定为处于发展严重CRS的低风险的受试者的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的剂量为104至109个细胞/kg体重，在一些情况下为105至106个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。
在某些方面中，可能希望的是:给受试者施用活化的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，然后随后再次抽血(或者进行单采血液成分术成分术)，按照本公开活化从中得到的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并且再给所述的患者输注这些活化的并且扩增的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。每隔几个星期可以进行这种方法多次。在某些方面中，可以从10cc至400cc的抽血中活化所述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在某些方面中，从20cc，30cc，40cc，50cc，60cc，70cc，80cc，90cc，或100cc的抽血中活化所述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。
所述主题组合物的施用可以以常规方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。可以以下列方式给患者施用本文中描述的组合物:经动脉方式，皮下方式，皮内方式，肿瘤内方式，节内方式，髓内，肌肉内方式，通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内方式。在一个方面中，通过皮内或皮下注射给患者施用本文所述的T细胞组合物。在一个方面中，通过静脉内注射施用本文所述的T细胞组合物。可以把所述的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染位点。
在一种特定的示例性的方面中，受试者可以经受白细胞去除术，其中将白细胞收集，富集或离体耗尽以选择和/或分离目的细胞,例如，T细胞。可以通过本领域中已知的方法把这些T细胞分离物扩增和处理，使得可以引入本文所述的一种或更多种CAR构建体，从而产生本公开的CAR T细胞。需要其的受试者随后可以经受采用高剂量化疗然后外周血干细胞移植的标准治疗。在某些方面中，在所述的移植之后或与所述的移植同时，受试者接受本文所述的扩增的CAR细胞的输注。在另外一个方面中，在外科手术之前和之后，施用所述的扩增的细胞。
上述将要给患者施用的治疗的剂量将会随被治疗的状况的精确性质和所述治疗的接受者而变化。可以根据本领域公认的实践进行用于人施用的剂量的定标。例如，对于成年患者，CAMPATH剂量一般将会在1至大约100mg的范围，通常每日施用，持续1至30天的一段时间。合适的每日剂量是1至10mg/天，然而在一些实例中，可以使用最多40mg/天的更大剂量(在美国专利号6,120,766中描述的)。
在一种实施方案中，把所述的CAR引入到免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)中,例如利用体外转录，并且所述的受试者(例如人)接受本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的初次施用，以及本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的一次或更多次随后的施用，其中所述的一次或更多次随后的施用是在先前的施用之后15天以内,例如14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，或2天内被施用的。在一种实施方案中，每个星期给所述的受试者(例如人)超过一次施用本文所述的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞),例如每个星期施用2，3或4次本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一种实施方案中,每个星期所述的受试者(例如人受试者)接受超过一次CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的施用(例如每个星期2，3或4次施用)(在本文中也被称为循环)，随后一个星期不施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，然后给所述的受试者施用一次或更多次CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的额外施用(例如每个星期超过一次的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的施用)。在另一种实施方案中,所述的受试者(例如人受试者)接受超过一个循环的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，并且每个循环之间的时间少于10，9，8，7，6，5，4，或3天。在一种实施方案中，每隔一天施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，每个星期持续3次施用。在一种实施方案中，施用本文所述的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)持续至少2，3，4，5，6，7，8或更多个星期。
在实施方案中，如果受试者被鉴定为(例如使用本文所述的方法)处于发展严重CRS的高风险中，则以改变的方案或时间过程向受试者施用改变的CAR表达细胞疗法。例如，向被鉴定为处于发展严重CRS的高风险中的受试者施用具有低频率(例如，比被鉴定为具有发展严重CRS的低风险的受试者的频率低的频率)的CAR表达细胞疗法。例如，向被鉴定为处于发展严重CRS的高风险中的受试者施用CAR表达细胞疗法，其中在前次施用后至少1周(例如至少1、2、3、4、5或6周，或至少1个月，2个月，3个月或3个月或更长时间)施用一次或多次后续施用。例如，被鉴定为处于发展严重CRS的高风险中的受试者被施用CAR表达细胞疗法，其中在前次施用后至少7天(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或更长时间)施用一次或多次后续施用。
一方面，使用慢病毒病毒载体如慢病毒产生如本文所述的CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)，例如CD19 CAR表达细胞，例如CTL019。以这种方式产生的CAR表达细胞可以具有稳定的CAR表达。
一方面，CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞)在转导后瞬时表达CAR载体4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15天。CAR的瞬时表达可以通过RNA CAR载体递送来实现。一方面，通过电穿孔将CAR RNA转导入细胞。
使用瞬时表达CAR细胞例如T细胞(特别是携带鼠scFv的CAR表达细胞(例如T细胞，NK细胞))治疗的患者中可能出现的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。不受这个理论的限制，相信这样的过敏反应可能是由正在发展体液抗CAR应答，即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体的患者引起的。认为当在暴露于抗原中有10到14天的间断时，患者的产生抗体的细胞发生从IgG同种型(它不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。
如果在短暂的CAR治疗的过程期间，患者处于产生抗CAR抗体应答(例如通过RNA转导产生的那些)的高风险下，CAR表达细胞(例如，T细胞、NK细胞)输注间断不应该持续超过10至14天。
生物聚合物递送方法
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种CAR表达细胞可经由生物聚合物支架(例如生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的CAR表达细胞的递送，扩增和/或分散。生物聚合物支架包含生物相容性(例如，基本上不诱导炎性或免疫应答)和/或可天然存在或合成的可生物降解的聚合物。示例性生物聚合物描述于例如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675(其全部内容通过引用并入本文)的段落1004-1006中。
示例性计算机系统
多种计算机系统可以被特别配置以利用在CRS严重性风险状态(例如，如本文所述的CRS严重性风险，例如高风险或低风险)上返回的杠杆信息。在一些实施方案中，计算机系统可以确定和呈现关于与CRS严重性例如本文所述的生物标志物相关的置信水平的信息。例如，计算机系统可以评估对受试者进行的测试是否指示高或低的CRS严重性风险以及与分类相关联的置信度。在进一步的实例中，该系统可以提供关于增加与预测的分类相关联的置信度的指示和/或建议。在一个实施方案中，该系统可以被配置为评估任何测试和测试的生物标志物，已经为受试者针对被鉴定为独立于现有数据和/或现有数据添加物的另一特征进行了所述测试或测试的生物标志物。该系统可以确定额外的生物标志物何时将增加与例如CRS严重性风险的变化相关联的置信度。该系统可以相应地建议测试任何鉴定的特征。
在一些实施方案中，可以提供用于鉴定，评估和/或治疗患有癌症(例如，血液癌症如ALL和CLL)的受试者的交互式系统。根据一个实施方案，系统可以被配置为接受关于受试者评估的置信度的用户输入。响应用户输入的置信度，系统可以将测试特征确定为包括在评估模型中。在一个实例中，系统包括用于受试者(例如，患者)群体中疾病活动的独立指标的说明。该系统可以被配置为基于使用什么独立生物标志物/指标来估计确定疾病活动(例如CRS严重性)或预测未来疾病活动(例如CRS严重性)的置信度。该系统可以被进一步配置为确定和/或建议所确定的独立生物标志物/指标的各种组合，以提高评估的置信度。
根据另一方面，计算机系统可以被特别地配置为评估CRS严重性风险状态的生物标志物/指标。该系统可以被配置为生成多变量模型，其中多变量模型排除相关的生物标志物/指标。在一些实例中，系统可以被配置为响应于评估具有一个或多个生物标志物/指标的受试者(例如，患者)群体内的返回的测试结果来鉴定相关的生物标志物/指标。例如，系统可以执行回归模型分析来控制多种参数，包括例如受试者年龄，种族，性别以及其他生物标志物/指标的存在。响应消除相关的生物标志物/指标，系统可以生成一个或多个独立生物标志物/指标的模型。在一些实施方案中，系统可以被配置为选择一个或多个独立生物标志物/指标的各种组合，并且可以进一步访问评估(包括例如直接评估组合)以呈现关于与各自选择相关联的置信水平的信息。系统选择的模型可用于通过确定的置信水平来产生疾病活动(例如CRS严重性风险状态)的预期变化。
在一个实施方案中，本公开提供了用于评价受试者CRS(例如严重CRS)风险的系统，其包括:
有效连接到存储器的至少一个处理器，所述至少一个处理器在执行时被配置为:
针对受试者响应于基于免疫细胞的疗法(例如CAR表达细胞疗法(例CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)获得的严重CRS风险状态的值。
在实施方案中，严重CRS风险状态的值包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或更多(例如，全部)的量度：(i)sgp130或IFN-γ或其组合在受试者中，例如在样品(例如血液样品)中的水平或活性，例如，其中受试者是成人或儿科受试者；
(ii)样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或IL1Ra或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和IL1Ra中任何两个或所有三个的组合)的水平或活性，例如，其中受试者是成人或儿科受试者；
(iii)样品(例如血液样品)中sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，和受试者中骨髓疾病的水平，例如其中受试者是儿科受试者；
(iv)样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或MIP1-α或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和MIP1-α中任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如，其中受试者是儿科受试者；
(v)受试者，例如样品(例如血液样品)中sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如，其中受试者是成人或儿科受试者；
(vi)受试者，例如样品(例如血液样品)中IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130或其组合(例如，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如，其中受试者是成人或儿科受试者；
(vii)受试者，例如样品(例如血液样品)中IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如，其中受试者是儿科受试者；
(viii)受试者，例如样品(例如血液样品)中IL10的水平或活性和受试者中的疾病负担水平或其组合，例如其中受试者是儿科受试者；
(ix)受试者中IFN-γ或IL-13或其组合的水平或活性，例如，其中受试者是儿科受试者；
(x)在样品(例如血液样品)中，IFN-γ，IL-13或MIP1-α或其组合(例如IFN-γ，IL-13和MIP1-α中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如，其中受试者是儿科受试者；
(xi)样品(例如血液样品)中IFN-γ或MIP1-α或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科或成人受试者；或
(xii)样品(例如血液样品)中选自sTNFR2，IP10，sIL1R2，sTNFR1，M1G，VEGF，sILR1，TNFα，IFNα，GCSF，sRAGE，IL4，IL10，IL1R1，IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β和GM-CSF或其组合中的一种或多种的细胞因子或细胞因子受体的水平或活性，
其中该值表示受试者的严重CRS风险状态。
在一个实施方案中，响应于受试者的严重CRS风险状态的值的确定，本文描述的方法包括执行以下步骤中的一个，两个，三个，四个或更多个：将受试者鉴定为具有发展严重CRS的高风险或低风险；推荐选择或改变CAR表达细胞疗法(例如，如本文所述的CD19CAR表达细胞疗法，例如CTL019)的剂量；推荐选择或改变CAR表达细胞疗法的方案或时程；推荐施用疗法以治疗CRS(例如IL-6抑制剂，诸如托珠单抗，血管活性药物，皮质类固醇，免疫抑制剂和/或机械通气；或推荐选择替代疗法(例如，用于严重CRS受试者，例如特定癌症类型，例如ALL或CLL的标准护理)。
图10是分布式计算机系统200的框图，其中可以实施根据本公开的各个方面和功能。分布式计算机系统200可以包括一个或多个计算机系统。例如，如所示，分布式计算机系统200包括三个计算机系统202，204和206。如所示，计算机系统202，204和206通过通信网络208互连并且可以通过通信网络208交换数据。网络208可以包括任何通信网络，计算机系统可以通过其交换数据。为了通过网络208交换数据，计算机系统202，204和206以及网络208可以使用多种方法，协议和标准，包括令牌环，以太网，无线以太网，蓝牙，无线电信令，红外线信令，TCP/IP，UDP，HTTP，FTP，SNMP，SMS，MMS，SS2，JSON，XML，REST，SOAP，CORBA IIOP，RMI，DCOM和Web服务。
根据一些实施方案，可以单独和/或组合在计算机系统202,204和206上执行用于评估受试者中(例如预测)严重CRS的风险状态所讨论的功能和操作。例如，计算机系统202，204和206支持例如参与协作操作，其可以包括分析在患者群体上捕获的治疗数据。在一个备选方案中，单个计算机系统(例如，202)可以分析在受试者(例如，患者)群体上捕获的治疗数据，以开发表征模型和/或鉴定疾病活动的独立指标。计算机系统202，204和206可以包括个人计算设备诸如蜂窝电话，智能电话，平板电脑等的，并且还可以包括台式计算机，膝上型计算机等。
根据本公开的多个方面和功能可以被实现为在包括图10所示的计算机系统202的一个或多个计算机系统中执行的专用硬件或软件。在一个实施方案中，计算机系统202是专门配置为执行上面讨论的过程和/或操作的计算设备。例如，该系统可以向终端用户呈现用户界面，其呈现与生物标志物相关的治疗信息，诊断信息和置信水平以及其他选项。如所示，计算机系统202包括至少一个处理器210(例如，单核或多核处理器)，存储器212，总线214，输入/输出接口(例如，216)和存储装置(storage)218。处理器210可以包括一个或多个微处理器或其他类型的控制器，并且可以执行操作数据(例如，处理数据，测试数据等)的一系列指令。如所示，处理器210由互连元件(例如，总线214)连接到包括存储器212的其它系统组件。
存储器212和/或存储装置218可以用于在计算机系统202的运行期间存储程序和数据。例如，存储器212可以是相对高性能的易失性随机存取存储器，例如动态随机存取存储器(DRAM)或静态存储器(SRAM)。此外，存储器212可以包括用于存储数据的任何设备，诸如磁盘驱动器或其他非易失性存储设备，诸如闪速存储器，固态或相变存储器(PCM)。在另外的实施方案中，关于在受试者中评估(例如预测)严重CRS的风险状态所讨论的功能和操作可以体现在应用程序中，该应用程序在计算机系统202上从存储器212和/或存储装置218执行。
计算机系统202还包括一个或多个接口216，例如输入设备，输出设备和组合输入/输出设备。接口216可以接收输入，提供输出或两者。存储装置218可以包括计算机可读和可计算机可写的非易失性存储介质，在所述存储介质中存储定义要由处理器执行的程序的指令。存储系统218还可以包括记录在介质上或介质中的信息，并且该信息可以由应用程序处理。可以与多种实施方案一起使用的介质可以包括例如光盘，磁盘或闪存，SSD等。
此外，本发明不限于特定的存储系统或存储器系统。虽然计算机系统202作为示例被示为一种类型的计算机系统，其上可以实施用于在受试者中评估(例如预测)严重CRS的风险状态的各种功能，但是本发明不限于在图10所示的计算机系统上实现。可以在具有不同于图10所示的结构或组件的一个或多个计算机上实施根据本发明的多个方面和功能。
在一些实施方案中，计算机系统202可以包括操作系统,其管理包括在计算机系统202中的硬件组件(例如，输入/输出设备，触摸屏，照相机等)的至少一部分。一个或多个处理器或控制器诸如处理器210可以执行操作系统，其可以是可从Microsoft Corporation获得的基于Windows的操作系统(例如，Windows NT，ME，XP，Vista，2,8或者RT)，来自AppleComputer的操作系统(例如，MAC OS，包括System X)，许多基于Linux的操作系统发行版之一(例如，可从Red Hat Inc.获得的Enterprise Linux操作系统)，可从Sun Microsystems获取的Solaris操作系统或可从多种来源获取的UNIX操作系统。可以使用许多其他操作系统，包括为个人计算设备(例如，iOS，Android等)设计的操作系统，并且实施方案不限于任何特定的操作系统。
根据一个实施方案，处理器和操作系统一起定义可以在其上执行应用程序的计算平台。此外，可以在非编程环境(例如，以HTML，XML或其他格式创建的文档，其当在浏览器程序的窗口中查看时，呈现图形用户界面的方面或执行其他功能)中实现用于在受试者中评估(例如预测)严重CRS的风险状态的多种功能。此外，根据本公开的方面的多种实施方案可以被实现为已编程或非编程组件，或其任何组合。因此，本公开不限于特定的编程语言，并且也可以使用任何合适的编程语言。
实施例
通过参考下列实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了举例说明的目的,并不意图是限定性的，除非另有说明。因此,无论如何不应把本发明解释为限定到下列实施例,而是应该把本发明解释成包括任何以及所有的变化，这些变化作为本文中所提供的教导的结果而变成显而易见的。
没有进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前面描述和以下说明性实施例来制备和利用本发明的化合物并实施所要求保护的方法。以下工作实施例具体指出了本发明的各个方面，而不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：生物标志物准确预测嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)后的细胞因子释放综合征(CRS)
具有抗CD19特异性的CAR T细胞已经表现出针对高度难治性血液恶性肿瘤的可观前景。已报道用CTL019治疗复发/难治性ALL的患者(Maude等人，NEJM 2014)完全缓解率高达90％的显著反应。体内标记CAR T细胞增殖(100-100,000x)导致改善的功效，但可能与不良事件相关，包括细胞因子释放综合征(CRS)。为了更好地理解CRS的表现，研究了用抗CD19CAR T细胞治疗的患有复发/难治性ALL的39名儿童和12名成人的临床、实验室和生物标志物数据。
T细胞用由抗CD19单链可变片段/4-1BB/CD3组成的CAR慢病毒转导(Porter，NEJM2011)。使用Luminex珠阵列连续测量43种细胞因子、趋化因子和可溶性受体(在该实施例中统称为细胞因子)。其他生物标志物在CLIA/CAP认证实验室进行测试。
51名患者中有48名患者发展了1-5级CRS(CRS1-5)(见下表13)。大多数患者出现轻度(1-2级)至中度(3级)CRS(34/51)。14名发展严重(4-5级)CRS(12名4级，2名成年人5级)。21名患者用IL-6抑制剂托珠单抗治疗，大多数患者通过迅速发热消退和断处血管活性药物具有CRS的快速显著临床症状改善。
表13：CRS分级。
Figure BDA0003753655610002871
分析发现与CRS0-3相比，CTL019输注后第一个月的24种细胞因子，包括IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Ra，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1a和GM-CSF的峰值水平与严重CRS(CRS4-5)高度相关，Holm-Bonferroni调节的p值显著(图11A，11B，11C和11D)。没有差异化提高的细胞因子显示在图12A，12B，12C和12D中。
分析输注后第3天，在患者发展严重CRS之前发送的细胞因子，仅有2种细胞因子sgp130和IFN-γ与后期发展严重CRS密切相关(p<0.001)并且由Holm-Bonferroni显著(图1)。通过正向选择发现的3变量回归模型，使用IFN-γ，sgp130和IL1Ra(PPV 75％，NPV94％，灵敏度86％，特异性89％，AUC＝0.93)准确预测哪些患者发生严重CRS(图2)。对于儿科群组，建模甚至更加准确；IFN-γ，IL13和MIP1a的组合具有PPV92％，NPV100％，灵敏度100％和特异性96％(AUC＝0.98)(图6)。仅在儿科群组中，在输注前立即收集骨髓抽吸物。发现疾病负担与CRS严重程度相关，但并未改善模型相对于单独细胞因子的预测准确性。sgp130，IFN-γ和疾病负担的组合产生PPV 77％，NPV 96％，灵敏度91％和特异性88％(AUC0.95)(图7)。这些模型的准确性在另外12名患者群组中进行了验证。
几项临床实验室检测的1个月高峰，包括CRP，铁蛋白，LDH，AST和BUN与严重CRS密切相关；然而，它们并不能预测严重CRS(表14)。纤维蛋白原也与严重CRS有关。包括CRP在内的一些临床实验室测试对于早期预测具有良好的NPV，但没有一个具有良好的PPV。
表14.严重CRS与临床实验室检测的关联。
Figure BDA0003753655610002881
据推测，证明严重CRS儿童发生类似于巨噬细胞活化综合征(MAS)/噬血细胞综合征(HLH)的临床和实验室表现，包括高铁蛋白血症(>10,000ng/ml)，脾肿大和低纤维蛋白原血症。在测试的细胞因子中，先前已经在HLH儿童中研究了18种。与CRS0-3相比，发现CRS4-5患者中HLH差异性升高的细胞因子几乎相同的模式也升高。细胞因子聚集成三组(图13A和13B)。那些在每组左边的是预期在HLH中升高的细胞因子。在每组中间的那些是在一些HLH患者中升高而在另一些中正常的那些。在每组右边的是预期在HLH中正常的细胞因子。
IL6，sIL6R和sgp130在CRS4-5患者中显著升高；这种IL6细胞因子模式以及对托珠单抗的显著反应证实IL6跨信号传导在临床上是相关的。
这些数据代表了CAR T细胞相关CRS的临床和实验室表现的最大和最全面的分析，并提供了对CRS生物学的新见解。它们代表了能够准确预测哪些用CAR T细胞治疗的患者具有变得病情危重的高概率的第一手数据。这些数据具有直接的治疗相关性，并可指导未来的细胞因子定向疗法。
实施例2：鉴定嵌合抗原受体T细胞治疗急性淋巴细胞白血病后细胞因子释放综合征的预测性生物标志物
介绍
具有抗CD19特异性的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞是用于复发/难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)的高效免疫疗法。细胞因子释放综合征(CRS)是最重要且危及生命的毒性。为了提高对CRS的理解，在51名CTL019治疗的患者中测量细胞因子和临床。输注后第一个月24种细胞因子(包括IFNγ，IL6，sgp130和sIL6R)的峰值水平与严重CRS高度相关。使用回归建模，可以利用由三种细胞因子组成的标签准确预测哪些患者会发展严重CRS。结果在独立群组中得到验证。血清生化标志物(包括C反应蛋白和铁蛋白)的变化与CRS相关，但未能预测严重CRS的发展。这些综合谱数据为CRS生物学提供了新的见解，并且重要地代表了可以准确预测哪些患者很有可能变得病情危重的第一手数据。
具有针对CD19的特异性的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞已经证明对抗高度难治性血液恶性肿瘤具有相当大的希望。在儿童和成人复发/难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)中报道了显著的临床反应，完全缓解率高达90％。已经用CTL019，由抗CD19单链可变片段(scFv)，CD3ζ活化结构域和4-1BB共刺激结构域组成的工程化的T细胞，治疗患者。体内标记CAR T细胞增殖(100-100,000x)产生功效，但可导致毒性，包括细胞因子释放综合征(CRS)。CRS是与CAR T细胞相关的最常见的潜在严重毒性。CRS不是CAR T细胞特有的，而是与其他涵盖T细胞杀死癌细胞的疗法(包括双特异性T细胞参与(BiTETM)抗体如blinatumomab)一起发生的。
尽管有CAR T细胞输注后的CRS频率，但对该综合征的潜在生物学知之甚少。提高对CRS的理解可能会导致更好的认识，改善的治疗，并可能预防或消除CRS最严重的并发症的能力。预测哪些患者将患上严重CRS的能力对CAR T细胞疗法的发展非常重要，但尚未发布严重CRS的准确预测因子。可以用IL6R抑制剂托珠单抗成功改善CRS，并且还可以在T细胞参与疗法后使用。尽管有效，但托珠单抗缓解CRS的机制仍不明确。目前，托珠单抗用于治疗症状变严重后的CRS。目前还不清楚是否托珠单抗可以预防CRS，或者如果使用得太早，可能会降低CAR T细胞的功效。
为了更好地表征和潜在地预测CRS，本实施例描述了来自用CTL019治疗的难治性/复发性ALL的39名儿童和12名成人的数据的评估。获得了临床和全面的生物标志物数据，测量了43种不同的细胞因子，趋化因子和可溶性受体(以下统称为“细胞因子”)以及许多其他实验室标志物。来自这些患者的系列测量结果提供了许多新的观察结果，这些观察结果可以提高对CRS生物学的理解并直接影响临床实践。
本文要讨论的结果包括：(1)严重CRS的预测模型；(2)CART细胞治疗后细胞因子上升和下降的时间和模式的总体描述；(3)全面比较发展严重CRS与非CRS患者之间的细胞因子谱，其揭示了严重CRS的潜在生物学的重要细节；(4)分析，其显示发展严重CRS的患者发展出反映了嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)/巨噬细胞活化综合征(MAS)的临床，实验室和细胞因子谱；(5)托珠单抗对CRS的作用的特征，建立CRS的毒性由大多数患者托珠单抗治疗后迅速消除的反式-IL6信号介导。
方法
临床和实验室数据对于39名ALL患者收集，所述患者在1/2a期临床试验(NCT01626495)上连续接受CTL019治疗。在两项试验(NCT02030847和NCT01029366)上收集12名接受CTL019治疗的成人的临床和实验室数据。根据赫尔辛基宣言从所有受试者或其法定监护人处获得书面知情同意书，所有协议均由机构审查委员会(IRB)批准。还在NCT01626495上用CTL019治疗的另外12名连续患者收集了有限的临床和实验室数据集。该数据集为预测模型提供了验证群组。如先前所述并且如Teachey等人，Cancer Discovery(其全部内容通过引用并入本文)的补充表1A和1B中所定义的，将CRS分级。这个评分等级是在事先和任何数据分析之前开发的。在来自10名健康志愿者的血清样品上测量细胞因子标志物(细节见实施例3)。
所有数据都被解码并保存在安全的数据库中。连续监测43种独特的细胞因子和一组临床实验室检测，包括化学物质，铁蛋白和C-反应蛋白(CRP)。通过定量PCR在外周血中连续测量CTL019细胞。分析限于输注CTL019后的第一个月。在儿科群组中收集基线骨髓抽吸和活组织检查。MRD在华盛顿大学(Seattle，WA)的CLIA和CAP批准的Children’s OncologyGroup Western Flow Cytometry Reference Laboratory进行。
统计方法
与CRS相关的临床、实验室和细胞因子标志物在总体上以及通过儿童、成人和合并群组中严重CRS(4-5级)的发生进行总结。对于连续测量的标志物，将数值总结为输注后前3天和一个月的峰值，以便在患者经历CRS期间捕获这些生物标志物的早期和总体峰值。另外，在输注后的前3天评估从基线的相对变化(倍数变化)。该月定义为前35天，允许超出预期28天评估的1周窗口。使用Fisher精确检验对连续因子的离散和精确Wilcoxon秩和检验进行组间比较。由于少数记录为超过其他观察值范围内的检测限的值，所以使用针对右删失数据的广义Wilcoxon检验分析纤维蛋白原和CRP。低于检测下限的值被记录为下限的一半。所有的统计测试都是双面的，通常在0.05水平上完成。如下所述，当考察43种细胞因子生物标志物的假设时，考虑进行多重比较。使用R(版本3.2.1；R Development Core Team，Vienna，Austria)和SAS(版本9.4；SAS Institute Inc，Cary，NC)软件进行统计分析。
细胞因子分析
调查关于细胞因子水平的几个假设，并且只有在对43种多重比较进行Holm调整之后它们在0.05水平上仍然显著，统计学关联性才被认为是显著的。所有被测试的假设都是事先开发的。以这种方式分析的细胞因子水平的比较包括：具有vs没有严重CRS的患者之间的1个月峰值和3天峰值，具有高vs低疾病负担的患者之间基线以及基线患者vs健康成人受试者；分别对合并的、成人和儿科群组进行1个月和3天的峰值分析。多项已发表的研究表明，虽然细胞因子可以在患有疾病或抗原刺激后的儿童和成人之间变化，但正常健康儿童和成人的基线值相似。因此，不包括单独的健康儿科群组。为了排除患者之间细胞因子水平取样频率的任何变化可能偏向于这些比较，重复1个月的分析，包括来自几乎所有受试者共有的减少的常见取样方案的测量结果。假设用T细胞参与疗法治疗的患者(包括CTL019)经历严重CRS，会发展异常巨噬细胞活化并伴有继发性噬血细胞淋巴组织细胞增生症(HLH)。这个假设是基于临床症状学和显著的高铁蛋白血症做出的。许多研究表明铁蛋白>10,000ng/ml对儿童HLH高度敏感和特异。为了确定严重CRS患者是否表现出HLH，将发展严重CRS的患者的细胞因子谱与遗传素质相关联的原发性HLH患者的细胞因子谱的已发表报告进行比较。在所测试的43种细胞因子中，有19种以前曾在HLH儿童中进行过研究。重新考虑这一细胞因子亚组与严重CRS的关联以比较HLH模式，并针对19种多重比较进行Holm校正。
为了了解哪些因素可能与CRS综合征和免疫系统的初始反应最内在地相关，针对严重CRS开发了预测模型，该模型考虑了在输注后的前3天内测量的临床和实验室因子。模型和10％的全部：ALT，AST，BUN，CR，铁蛋白，qPCR，LDH的10％，43种细胞因子标志物，同样由于严重CRS病例数量有限(总共14例，儿科群组11例)保持较小。候选变量包括那些在输注后前2天内(是/否)在不超过2/14病例CRS定义症状中3天峰值丢失的因子和输注时的年龄。对于43种细胞因子也考虑3天峰值倍数变化，并且基线疾病负担是儿科群组的额外的候选变量。两名患者(均在儿科群组中)在第3天发展严重CRS；然而，模型中包含的所有数据至少在发展严重CRS前12小时收集。使Logistic回归和分类树模型适用于合并和儿科群组，以下简称发现群组。成人群组太小而无法单独建模。对于逻辑回归模型，使用Akaike信息标准(AIC)的前向选择来选择最终模型。偏差统计被用来选择树模型。模型在12名儿科患者的独立群组中进行验证，被称为验证群组。
结果
患者的临床描述
治疗总共51名ALL患者，39名年龄5-23岁的患者在儿科群组，12名年龄25-72岁在成人群组。这两个群组是根据临床试验和治疗机构确定的。47名患者(37名儿科；10名成人)在第一至第四次复发中有B ALL，1名儿童具有复发T-ALL，并有异常CD19表达，3名患者(1名儿科；2名成人)患有原发难治性B-ALL。先前的异基因造血干细胞移植(SCT)后，31名患者(27名儿科患者；4名成人)(61％)复发。4名患者(所有儿科)曾接受blinatumomab(CD19BITE抗体)的治疗。在CTL019之前没有患者接受任何其他CD19定向疗法。最近公布了前30名患者(25名儿童和5名成人)对CTL019反应的数据，表明90％的完全缓解(CR)率，并且6个月无事件生存率(EFS)为67％。
细胞因子释放综合征(CRS)的临床描述
51名患者中有48名(94％)发展CRS；另三个不是儿童。CRS患者通常表现出流感样疾病。大多数患者发展轻度(1-2级)(18/51；35％)至中度(3级)CRS(16/51；31％)，14名患者(27％)发展严重(4-5级)CRS(4级12名和5级2名)(参见Teachey等人，Cancer Discov.2016年6月；6(6)：664-79的表1，该文章通过引用整体并入本文，包括补充材料)。对于出现发热的患者，CRS开始被定义为相对于输注CTL019首次发热≥38.0℃(100.5°F)的日子。CRS停止被定义为24小时没有发热或血管活性药物，表明从休克恢复。4名患者在没有发热的情况下发展CRS：CRS的开始和停止分别基于第一天出现流感样症状和第一次24小时没有症状的时期。
9名患者需要机械通气并且20名患者需要分配性(19/20)或心源性休克(1/20)的血管活性药物。十四名患者需要高剂量的血管活性药物。只有6名患者发生了记载的符合病变感染，而且这两种感染在成人中仅有2例与脓毒症在临床上一致。Teachey等人的表1总结了与CRS有关的临床因子。在CTL019治疗后的第一个30天内有三名成人死亡。一些患有严重CRS的儿童发展为器官巨大，包括肝脾肿大并且一些患者发展为脑病。
CRS的实验室描述
在用CTL019治疗的患者中对炎症和器官衰竭的实验室标志物进行连续评估。作为全身炎症和/或铁超载的结果，大多数患者的基线铁蛋白(N＝48)升高(中位数：1580mg/dl，范围232-14,673)。37名测量者中仅有6名儿童并且无成人具有基线铁蛋白<500mg/dl。峰值铁蛋白(定义为CTL109输注后第一个月内的最高值)在所有患者中都非常高，不论等级如何，但是4-5级CRS患者的中位数显著更高(p<0.001)：0-3级CRS(中位数8,290mg/dl，范围280-411,936)和4-5级CRS(中位数130,000mg/dl，范围11,200-299,000)。在成年人和儿童中也看到类似的趋势。所有4-5级CRS患者具有峰值铁蛋白>10,000mg/dl，该值被认为对儿童巨噬细胞活化/HLH综合征敏感且特异。30名患者，包括39名儿童中的20名(51％)和12名0-3级CRS成人中的10名(83％)具有峰值铁蛋白>10,000mg/dl。
大多数患者的基线CRP升高(中位数1.20mg/dl，范围0.12-29.4)。三名儿童和两名成人没有在基线检测的CRP。36名儿童中的24名(67％)和10名成人中的1名具有基线CRP>1mg/dl。与铁蛋白相似，大多数4-5级CRS患者(中位数22.9，范围16.0-37.1)和0-3级CRS(中位数16.2，范围0.7-56.5)的1个月峰值CRP非常高，具有4-5级对0-3级CRS的统计学显著中值差异(p＝0.010)。在成年人和儿童中看到类似的趋势。与一般性炎症和低血压一致，大多数CRS患者的ALT，AST，BUN，LDH和Cr明显升高，4-5级对0-3 CRS的统计学显著增加。虽然这些临床实验室的峰值与CRS的严重性相关，但这些实验室在前3天内都对预测CRS没有帮助。早期CRP升高与4-5级CRS相关(p＝0.02)，但与另一份发表的报告相反，在CTL019输注后的前三天对CRP的早期评估在预测CRS严重性方面未被发现有用(AUC＝0.73)。例如，考虑CRP作为高风险病例的筛查，CRP>6.8mg/dl仅能识别72％的病例，并且具有阳性预测值(PPV)为43％。同样，早期铁蛋白升高与4-5级CRS相关，但对预测CRS无效。
纤维蛋白原<150mg/dl用于HLH的诊断标准，因为它是该综合征的敏感标志物。在儿科群组中发现低纤维蛋白原和4级CRS的强关联，但成人中没有。儿童变得轻度凝血，伴有更严重的凝血病和严重CRS。成人也发展了低纤维蛋白原血症和轻度凝血病；然而，这在整个CRS等级中都是可见的。尽管出血很少，但了解凝血病有直接的临床意义，因为许多患者除了新鲜冷冻血浆外还需要冷冻沉淀物来维持止血。
细胞因子谱
为了解CAR T细胞疗法后CRS的生物学特征，对51名患者进行了系列细胞因子评估。将来自50名ALL患者(一名受试者没有基线值)的中位基线值与10名患者正常供体群组进行比较。值得注意的是，发现包括sIL2Rα和MCP1在内的许多细胞因子在大多数ALL患者中与正常供体相比一直升高，并且是Holm的调整p值显著。确定某些细胞因子是否与儿童的基线疾病负担相关(许多成年人在输注时未收集骨髓)。通过Holm's p值，只有EPG、IL12和IL13与更高的基线疾病负担相关。
将患有严重CRS的患者的细胞因子谱与没有严重CRS的患者的细胞因子谱相比较。发现在CTL019后第一个月发送的24种细胞因子(包括IFNγ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β和GM-CSF)的峰值水平相比于等级0-3 CRS与4-5级CRS相关，并且Holm调整的p值显著(图11A，11B，11C，11D，12A，12B，12C和12D)。作为灵敏度分析，使用减少的一组细胞因子量度重复该分析，保持在该方案中指定的每个目标评估窗口仅一个量度，以均衡受试者之间的测量数量。结果相似；23种细胞因子显著-都在以前发现的24种中。只有IL1RA(原始24种最弱的显著性结果)没有保持显著性。
某些细胞因子在严重CRS患者中比其他细胞因子更早出现峰值。了解上升和下降的时间不仅提高了对潜在生物学的理解，而且还具有潜在的治疗相关性。例如，IFNγ和sgp130很早就上升。这两种细胞因子是在输注后的前3天以及患者在调整多重比较(Holm's)后出现危重症之前唯一对严重与非严重CRS有不同程度升高的。相比之下，虽然IL6是与第一个月的严重CRS最强烈相关的细胞因子，但在调整多重比较后，CRS的早期IL6水平(第0-3天)没有不同。
发现CRS的严重性在一个月内与峰值CAR T细胞扩增在拷贝数/微克qPCR方面弱相关(p＝0.058)；然而输注后前3天的峰值与CRS严重性无关。
预测建模
基于来自主要(发现)群组的51名患者的数据，开发和分析了16个预测模型(8个来自合并群组和8个来自仅儿科群组)。Teachey等人的表3列出了用于合并和仅儿科群组的最佳的整体回归模型和决策树模型。正向选择的逻辑回归模型使用IFNγ，sgp130和sIL1RA准确预测哪些患者发展了4-5级CRS，灵敏度为86％(95％CI：57，98)，特异性为89％(95％CI：73，97)，并且AUC＝0.93(95％CI：0.86，1.0)(图2)。使用决策树，sgp130，MCP1和嗜酸细胞活化趋化因子的组合具有86％的灵敏度(95％CI：57，98)和97％的特异性(95％CI：85，100)。参见图4。对于儿科群组，建模甚至更加准确；包括IFNγ，IL13和MIP1α的正向选择的逻辑回归模型具有100％的灵敏度(95％CI：72，100)，96％的特异性(95％CI：81，100)(AUC＝0.98；95％CI：0.93，1.0)参见图6。输注前的疾病负担可以预测严重CRS。在仅儿科群组中，在输注前立即收集骨髓抽吸物。发现使用回归建模，疾病负担并没有提高模型对单独细胞因子的预测准确性；然而，它被鉴定为使用决策树建模的儿科群组中的重要预测变量。IL10和疾病负担的组合具有91％的灵敏度(95％CI：59，100)和96％的特异性(95％CI：81，100)(图9)。由于许多试验未测量疾病负担，应注意的是，建立在来自最高候选逻辑模型的预测因子基础上的分类器包括IFNγ和MIP1α的组合，并且具有82％(95％CI：48，98)的灵敏度和93％的特异性(95％CI：76，99)。参见图8。
然后使用另外12名儿科患者的验证群组测试模型的准确性。发现所有模型在验证群组中表现极好。因此，验证群组没有改变模型的等级顺序。由CTL019引起的噬血细胞综合征/巨噬细胞活化综合征
在我们的患者中研究的19种细胞因子已经在HLH儿童中进行了研究。发现在HLH患者中具有差异性升高的1个月峰值的那些细胞因子的几乎相同的模式也在有vs没有严重CRS的患者中升高(图13A和13B)。CRS 4-5级vsCRS 0-3级的IFNγ，IL10，sIL2Rα，IL6，IL8，IP10，MCP1，MIG和MIP1β有统计学显著差异。预计所有这些细胞因子在HLH患者中都会升高。根据已发表的工作，在HL1H中预计正常的细胞因子IL1β，IL2，IL5，IL7，IL12，IL13和IL17中看到通过Holm调整的p值没有显著差异。在我们的研究中，GM-CSF和TNFα在严重CRS患者中差异性升高。在一些研究中已证明GM-CSF和TNFα在HLH中升高，而在另一些研究中正常。IL4在HLH患者中通常是正常的。这项研究中在严重CRS患者中差异性升高，尽管两组的水平都很低。
IL6信号传导和IL6导向治疗
用托珠单抗治疗21名患者的CRS。15名3级CRS受试者中的7名和全部14名4-5级CRS受试者接受托珠单抗。21名受试者中的10名(4名儿科；6名成年人)接受多于一次剂量。12名患者也接受皮质类固醇激素治疗，并且2名患者接受依那西普。没有患者接受siltuximab。在用CTL019输注后托珠单抗的中位数为5天(2到12天的范围)。Teachey等人的补充表15详细介绍托珠单抗相对于输注，首次发热，使用血管活性药物和插管(如果适用)的时间。对托珠单抗的反应迅速。第一次剂量后，许多患者立即变得无发热。大多数患者在接受托珠单抗后24-36小时内能够断除血管活性物质，并且在给予托珠单抗后4.5天的中位时间停止。尽管所有CRS儿童均存活并对托珠单抗有反应，但3名接受CTL019治疗的成年人死亡。
图14描述了用托珠单抗治疗的14名4-5级受试者中4种细胞因子(IFNγ，IL6，sIL6R和sgp130)随时间的水平。在首剂量托珠单抗后，IL6水平一般呈短暂升高，随后迅速下降。托珠单抗后sIL6R一般增加并持续维持升高至少2-3周，而sgp130在托珠单抗后似乎在一些患者中增加，而在另一些患者中没有。
讨论
这个例子描述了一些观察。首先，开发了能够预测哪些用CAR T细胞治疗的患者在患病前可能发病严重的模型，可能允许可降低发病率或死亡率的早期干预。其次，确定sIL6R和sgp130的浓度可能在临床和生物学上相关，因为这是在CAR T细胞后系统评估sIL6R和sgp130的首次工作。第三，鉴定了24种不同的细胞因子，这些细胞因子在有vs没有严重CRS的患者中差异表达，增加了对严重CRS的生物学基础的新见解。最后，证实了发展严重CRS的患者发展了与继发性HLH一致的临床、实验室和生物标志物谱。
在使用CAR修饰的T细胞疗法的试验中观察到的最常见和潜在的严重毒性是CRS。数据表明CRS发展与对CAR T细胞反应之间的相关性。尽管如此，CRS的程度和结果似乎并没有很强的关联。与其他T细胞参与疗法(包括blinatumomab)的数据类似，已经发现CRS的严重性可能与治疗时的疾病负担相关。正如本文已经证明的那样，虽然存在这种关联，但单独疾病负担并不足以预测哪些患者会发展严重CRS。23名M3骨髓(>25％的胚细胞)患者中仅有10名发生严重CRS，仅高疾病负担的PPV较差。然而，低疾病负担确实具有强烈的阴性预测值(NPV)。在我们的儿科群组中，15名在CTL019输注时具有出现<5％胚细胞的骨髓的患者中仅有一例发展严重CRS。大多数成年人没有获得基线疾病负担，并且我们正在向前推进的儿科临床试验不再评估输注时的疾病负担。这些数据表明，可以准确预测CRS的风险，而无需评估输注时的疾病负担。
严重CRS是潜在的危及生命的毒性。事实上，本系列的2名成人因CRS而死亡。预测哪些患者在其发展CRS之前可能发展严重CRS的能力可能有助于减轻毒性，因为可以在患者变得危重症之前建立细胞因子导向疗法。预计会发展严重CRS的患者可能会受到更严密的监测，以便及早开始积极的支持治疗。相反，预测哪些患者不可能发展严重CRS的能力可以防止不必要的早期住院和/或暴露于不需要的细胞因子导向疗法。因此，我们开发的模型使用少量细胞因子来以高度灵敏度和特异性预测CRS具有直接的临床和治疗相关性。不清楚早期干预或预防CRS是否会限制疗效。根据细胞因子谱模型启动早期干预的预期试验需要小心进行。
由于许多(铁蛋白，CRP，LDH，AST，ALT，BUN和CR)在患者发病后达到高峰，因此没有发现标准的临床实验室检测有助于预测CRS严重性。与其他组先前的报告不同，这项工作并未显示CRP的早期评估可准确预测CRS的严重性。尽管不希望受理论束缚，但在一些实施方案中，此处鉴定的早期预测性细胞因子谱也与其他T细胞参与疗法如BiTE以及靶向病毒的细胞毒性T淋巴细胞后有关。
除了开发准确的预测模型外，本研究还对CRS的生物学理解提供了一些重要见解。分析患者发展严重CRS前发送的细胞因子，证明sgp130和IFNγ与严重CRS的后期发展密切相关。早期观察到IFNγ，IL6和sIL2Rα在严重CRS患者中与未患有严重CRS的患者相比显示出显著的差异性增加。在CAR T细胞疗法后在以前未研究的许多其他细胞因子中发现了明显的差异。通常，基于CRS等级差异性升高的细胞因子包括从活化的T细胞(sIL2Rα，IFNγ，IL6，sIL6R，GM-CSF)或活化的单核细胞/巨噬细胞(IL1RA，IL10，IL6，IP10，MIG，INFα，MIP1α，MIP1β，sIL6R)释放的的细胞因子，以及对单核细胞/巨噬细胞具有趋化性的趋化因子(MCP1，MIP1β)，以及在组织损伤和炎症后通常升高的细胞因子(IL8，GCSF，GMCSF，VEGF，IL6，sRAGE)。
发现发展严重CRS的患者发展出类似于MAS/HLH的临床表型，以及异常巨噬细胞活化的实验室证据，包括升高的铁蛋白，低纤维蛋白原和反映出与在HLH的遗传形式中看到的那些的细胞因子图谱。当测量患有脓毒症或HLH的危重症儿童(患有和不患有恶性肿瘤)中的细胞因子水平时，IFNγ水平为75pg/ml且IL10水平>60pg/ml对HLH具有98.9％的特异性和93％的灵敏度。预计脓毒症患者的IFNγ水平不会升高。在该系列中所有CRS 4-5患者具有IFNγ>75pg/ml和IL10>60pg/ml。IL4是唯一被测试的细胞因子，它是先验假设的异常值；然而，所有患者的绝对值都非常小。因此，假设IL4在该群组中可能不具有临床或生物学相关性。未来的工作将决定CAR T细胞后MAS/HLH的发展与诱发HLH发生的基因突变(包括PRF1)之间是否存在任何基因型-表型关联。
IL6定向疗法是CAR T细胞治疗后基于细胞因子疗法的基石。它已被证明是有效的，并且重要的是，似乎并未降低CAR T细胞的功效。也就是说，由于IL6在CRS发展之前没有明显升高，所以在输注后的前几天对IL6进行临床评估不会有助于确定哪些患者会发展严重CRS或需要IL6定向疗法。尚不清楚在发展CRS之前使用托珠单抗的早期治疗是否有益。托珠单抗具有非常长的半衰期(11-14天)。因此，如果早期给药，药物将在IL6峰值时存在，理论上可以预防严重CRS。
这项研究证明了CRS中跨IL6信号传导的重要性。IL6通过两种机制(通过膜结合或可溶性IL6受体(sIL6R))发出信号。在经典的IL6信号传导中，IL6与其膜结合受体结合。大多数细胞不表达IL6R，并且对传统的IL6信号传导没有反应。在跨-IL6信号传导中，sIL6R结合IL6并且复合物与膜结合的gp130缔合。膜结合的gp130与JAK1，JAK2和TYK2相关。因此，IL6-跨信号传导激活Jak/Stat途径。IL6跨信号传导发生在不表达IL6R的细胞中。通常，血液中高水平的可溶性gp130(sgp130)和sIL6R充当缓冲液，阻断IL6-跨信号传导。在健康人中，IL6水平通常约为pg/ml量级，但sIL6R和sgp130水平在ng/ml水平时通常高1000倍。因此，IL6跨信号传导仅在IL6水平从pg/ml上升至ng/ml水平时发生。可通过降低IL6水平，阻断IL6与IL6R的相互作用，提高sIL6R水平，提高sgp130水平，或阻断IL6-IL6R与sgp130的相互作用来阻断IL6跨信号传导。托珠单抗是一种抗IL6R单克隆抗体。在其他IL6介导的疾病中，由于IL6R和IL6之间的相互作用被阻断，IL6水平通常升高并且治疗后sIL6R水平增加或减少。用托珠单抗治疗后，CRS群组中IL6似乎有短暂升高，随后迅速下降。托珠单抗后sIL6R水平看起来也显著增加，因为sIL6R和托珠单抗的复合物由于其大小而不能被肾脏清除。这些数据表明托珠单抗通过多种机制阻断IL6-跨信号传导：阻断IL6R与IL6的相互作用，提高sIL6R以增加IL6缓冲液，并最终降低IL6水平。值得注意的是，用托珠单抗治疗前后的患者样品的采集不均匀，因为托珠单抗是在相对输注时间的不同日期给予的，并且一些患者接受不止一剂量。Uno及其同事最近发表的数据表明，sgp130水平升高的类风湿性关节炎患者更可能对托珠单抗产生反应，因为更高的sgp130水平会中和更多的IL-6/sIL-6R复合物，从而使需要被托珠单抗中和的复合物减少。因此，相信在用托珠单抗治疗之前观察到的高水平sgp130在临床和生物学上是相关的；然而，今后需要研究跨-IL6信号传导的重要性和功能的工作。
靶向IL6信号传导的其他活性剂或可商购获得或临床开发，包括直接IL6抑制剂，例如siltuximab和IL6跨信号传导阻断剂sgp130Fc。这些活性剂有可能对CRS有效，但需要进一步的研究。我们广泛的细胞因子谱不支持TNFα阻断在CAR T细胞后的使用。虽然一些可溶性TNF受体在严重CRS患者中显著升高，但TNFα的峰值水平相当低。有趣的是，最近已经表明诱导TNF受体脱落导致TNFα靶细胞完全无应答。发表的研究表明TNFα阻断用的抑制剂在血清或组织TNFα水平升高的疾病中的功效。尽管一些TNFα阻断剂如依那西普也靶向TNF-受体，但在TNFα水平低的患者中靶向TNF受体是否有效尚不清楚。对于在CAR T细胞后发生危重症且对IL6阻断无应答的患者，Jak/Stat，IFNγ或sIL2Rα抑制剂可能有效改善CRS症状。遗憾的是，这些可能会影响CAR T细胞的功能。
解释细胞因子模式以理解疾病生物学或开发预测模型时，应始终考虑可以影响细胞因子产生的混淆变量。基线细胞因子值在基于年龄、性别和种族背景的健康正常受试者中可能会出现轻微差异。疾病相关因素，包括恶性肿瘤的类型或疾病负担也会影响细胞因子的产生。评估细胞因子产生的相对和绝对变化也很重要。人群之间的差异有时被报告为倍数变化而没有考虑绝对值，但这可能是误导性的，因为统计学上显著的差异可能不具有生物学或临床意义。数值在健康人群中观察到的变异程度和在患有炎性疾病和/或感染的患者中报道的水平的情境中考虑。考虑了两组之间的绝对差异和相对差异。
尽管有几个重要的观察，但这项研究有几个局限。虽然它描述了迄今为止最大的患者群组中CAR T细胞后的CRS，但4-5级CRS患者的总数相对较小。尽管如此，结果对多重比较进行了调整，并且预测模型在独立验证群组中保持准确。数据反映了在两个中心接受治疗使用同一制造过程产生的CAR T细胞产物的患者，并且这些模型是否可归纳是未知的。对CRS预测稳健的仅有的实验室生物标志物是细胞因子，许多临床实验室对细胞因子的检测不能迅速周转可用。数据允许设计一个可用于预测和追踪CRS的分析物集中小组。不良事件常用术语标准(CTCAE)分级量表不能充分或准确地定义T细胞参与疗法后的CRS。因此，不同的网站和不同的出版物使用不同的分级量表，这可以使研究之间的比较具有挑战性。Lee及其同事和Davila及其同事还发表了用CAR T细胞治疗的患者的CRS分级量表(参见Teachey等人的补充表16和17)。Teachey等人的补充讨论中描述了CRS分级量表与其他公布的分级量表的比较。分级系统足够相似，使得预测模型与其他分级系统相关。无论“数字等级”如何，本文的模型都会识别出发展CRS的危及生命的并发症(机械通气和/或失代偿性休克)的患者。
对预测模型的需求是将因CRS而变得危重症的患者与不如此的患者区分开。划分是基于发展CRS危及生命的并发症的患者，包括失代偿性休克或呼吸衰竭(4-5级)。0-2级CRS患者仅发展轻度疾病。相比之下，3级CRS代表异质临床谱，因为一些患者仅需静脉输液或最小补充氧气，而其他患者需要低剂量血管活性药物或发生更显著的低氧血症。在某些试验继续进行时，放宽对“严重CRS”的定义并包括变得非常重症但未发展危及生命的CRS患者可能很重要。根据需要，针对任何血管活性药物或显著氧需求(>＝40％FI02)，进行附加分析将3级CRS患者亚分为两组(3a和3b)，并将群组重新分割为严重和非严重，定义为CRS0-3a与CRS 3b-5。逻辑回归和决策树建模来开发具有这种替代分类的新模型，并使用替代分类测试来“原始”模型的准确性。这些附加模型和附加分析包含在Teachey等人的补充结果和补充表18和19以及补充图5a-e中。
对CRS的生物学进行了研究，并且调查了早期测定的某些细胞因子是否可以预测CRS严重性。本文未研究的其他变量可能预测严重CRS，并且这些将在未来的工作中进行调查。这些包括产物的T细胞表型，产物的T细胞功能，可差异性激活CTL019的CD19多态性，CD19或PD-L1的肿瘤表达以及免疫基因多态性。之前已经公开了大多数患者产生的产物表现出高细胞溶解活性并且产生与大多数细胞因子非常相似的体外水平。由于CTL019产物的离体组合物和细胞因子产生几乎没有变化，但患者的CRS具有相当大的异质性，因此假设该研究可能不会发现与CRS严重性相关的CTL019产物的差异。
总之，这些数据代表了CAR T细胞疗法后CRS的临床和生物学表现的最大和最全面的分析。这项研究鉴定和表征了与严重CRS相关的细胞因子和可以在其发生前预测哪些患者可能发展严重CRS的细胞因子。早期预测将允许试验确定早期干预是否会在不影响疗效的情况下减轻毒性。基于CAR T细胞在早期阶段试验中所见的令人兴奋的疗效，它们的使用正迅速从选择数量的三级医疗机构扩大到更大数量的中心。因此，理解并减少毒性是至关重要的，并且这些数据提供了可能有助于实现该目标的重要新颖信息。
实施例3：补充方法和结果
试验设计
从来自3个临床试验治疗的患者收集实验室和临床数据，这些试验被设计用来评估CTL019T细胞疗法在复发/难治性CD19+恶性肿瘤中的安全性和可行性。Clinicaltrials.gov：NCT01626495，NCT 02030847和NCT01029366。根据三项试验的资格标准，从所有受试者或其法定监护人获得书面知情同意书，其已包含在Clinicaltrials.gov网站上，并且之前也已公布。值得注意的是，排除了活性移植物抗宿主病，活性CNS累及白血病(CNS3)，不受控制的感染，活性乙型肝炎或丙型肝炎或HIV的患者。先前进行过异基因造血干细胞移植的患者只要是移植后至少6个月，且入选时患者不需要免疫抑制，那么就符合条件。包括白细胞分离术的细节和淋巴消耗化疗的类型的研究程序先前已公布(Maude，NEJM Oct 162014；371(16)：1507-1517)。如前所述，在1-3天内向患者输注1-10×107T细胞/kg(对于50kg以上的患者为5-50×108个T细胞)。本报告中前30名受试者对治疗的反应详情也在之前发表。
通用实验室声明
CTL019T细胞按照现行良好生产规范的原则生产。临床实验室研究包括铁蛋白，C-反应蛋白(CRP)，丙氨酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，血尿素氮(BUN)，肌酐(Cr)，全血计数(CBC)和差异的凝血酶原时间(PT)，部分致凝血活酶时间(PTT)和纤维蛋白原在临床实验室改进修正案(CLIA)认证的和美国病理学家学院(CAP)认可的临床实验室中进行。
CTL019T细胞的生产
通过白细胞分离术收集外周血单核细胞(PBMC)。通过添加抗CD3/CD28包被的顺磁珠以激活T细胞来富集、洗涤和扩增T细胞。含有前述抗CD19-BB-ζ转基因的慢病毒载体在细胞活化时加入，并在培养开始后第3天洗出。将细胞在摇摆平台装置(WAVE BioreactorSystem)上扩增8至12天。在培养的最后一天，使珠通过磁场来移除并收集CTL019细胞并在不溶性低温培养基中冷冻保存。IND中的最终产物释放标准包括以下：细胞活力≥70％，CD3+细胞≥80％，残留的顺磁性抗CD3/CD28包被的顺磁珠≤100每3x106细胞，内毒素≤3.5EU/mL，支原体阴性，细菌和真菌培养物阴性，残留牛血清白蛋白≤1μg/mL，VSV-G DNA作为复制组分慢病毒的替代标志物，每μgDNA≤50拷贝，流式细胞仪转导效率≥2％，载体DNA序列转导效率每个细胞0.02至4个拷贝。
用于非临床实验室研究的样品处理
在薰衣草帽(K2EDTA)或红帽(不添加)真空采血管(Becton Dickinson)中收集外周血和骨髓样品。薰衣草帽管在样品抽取后2小时内被递送到实验室，或者如上所述在室温下在绝缘容器中过夜运输。根据确定的SOP，样品在抽取16小时内进行处理。将外周血(PBMC)和骨髓(BMMC)单核细胞纯化，加工并储存在-140℃。在抽取2小时(包括凝血时间)内处理红帽管；通过离心分离血清，等分，一次性使用130μL等分试样并储存在-80℃。
Luminex 14 plex和30plex测定方法
人类细胞因子磁性30-plex板货号LHC6003M购自Life Technologies(Carlsbad，CA)。以下分析物在板中(IL-1RA，FGF-Basic，MCP-1，G-CSF，IFN-γ，IL-12，IL-13，IL-7，GM-CSF，TNF-α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IFN-α，IL-15，IL-10，MIP-1α，IL-17，IL-8，EGF，HGF，VEGF，MIG，RANTES，嗜酸细胞活化趋化因子，MIP-1β，IP-10，IL-2R)。人可溶性细胞因子受体磁珠14-plex板货号HSCRMA32KPX14购自EMD Millipore(Darmstadt，德国)。下列分析物(sCD30，sEGFR，sgp130，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-2Rα，sIL-4R，sIL-6R，sRAGE，sTNFRI，sTNFRII，sVEGFR1，sVEGFR2，sVEGFR3)在板中。根据制造商的方案解冻并分析从第-4天到第28天在-80℃下冷冻保存的血清样品。使用FlexMAP 3D仪器(Luminex，Austin，TX)测量测定板，并使用xPONENT软件(Luminex)完成数据采集和分析。数据质量基于以下标准进行检查。每种分析物的标准曲线的R2值>0.95，使用xPONENT软件进行或不进行微小拟合。标记也具有CV(变异系数)>20％的来自低珠计数的非外推数据。对于14-plex试剂盒，试剂盒中包含的对两个对照样品的结果>90％要求在制造商提供的预期范围内。对于结果超出范围低(<OOR)且用标准曲线的下半部分取代以进行数据分析的样品，没有进一步测试。结果超出范围高(>OOR)或大于标准曲线最大值(SC max)两倍的样品在较高稀释度下重新测试。通过上述质量控制或重新测试的结果用于翻译相关性研究。
收集时间点。
基于研究在随后几天收集细胞因子，CBC，ALT，AST，BUN，Cr，铁蛋白，CRP和LDH。当患者生病时，方案还允许额外收集样品。值得注意的是，研究首次开放时，铁蛋白和CRP不包括在内。2名儿童未获得基线铁蛋白。3名儿童和2名成人未获得基线CRP。在CHP959上收集铁蛋白，第一个受试者入组，但是直到第11天未收集，该受试者仅在前35天收集3个时间点。在了解了铁蛋白的重要性之后，第二，第三和第四名CHP959受试者在前35天分别更频繁地检测8次，24次和9次铁蛋白。到受试者5，铁蛋白按照与其他临床实验室和细胞因子相同的方案常规收集。在任何时间点，前两个受试者都没有发送CRP。根据受试者3，CRP按照与其他临床实验室相同的方案进行测试。以下提供凝血研究的细节。
基线疾病负担
这项研究中的儿童进行了骨髓抽吸和活组织检查，以及输注前立即发送的微小残留疾病检测。血液病理学家针对疾病负担量队抽吸和活检进行量化。如先前所述进行MRD(Borowitz MJ等人，Clinical significance of minimal residual disease inchildhood acutelycleoblastic leukemia and its relationship to otherprognostic factors：a Children's Oncology Group study，Blood.Jun 15 2008；111(12)：5477-5485,Weir EG等人，A limited antibody panel can distinguish B-precursor acute lymphoblastic leukemia from normal B precursors with fourcolor flow cytometry:implications for residual disease detection.Leukemia.Apr1999；13(4):558-567)。一名儿童没有进行骨髓活组织检查，并且4名儿童进行骨髓活组织检查，发现疾病无法准确定量。所有儿童都有骨髓抽取物进行形态学检查，5名儿童没有中心MRD。疾病负担被认为是连续和二分变量。基线疾病负担通过MRD或形态学抽吸或活检获得最高值(胚细胞百分比)定义。
CRS预测模型的应用：一个例子
本部分示出如何应用本文描述的预测模型来获得儿童方案中受试者136的严重CRS状态的预测。这个受试者有严重的(4级)CRS。
模型A：合并群组的最高回归模型
对于sgp130，IFNγ和IL1RA，受试者136的第1-3天峰值(Pk3)分别为272,292.6，59.9067和57.0324。在采用常用对数(底数10)并使用Teachey等人表3第一行中的相应估计值后，x＝(13.8712*5.4350)+(2.4626*1.7775)+(-1.6559*1.7561)-75.3502＝1.5095，exp(x)＝4.5245，和exp(x)/(1+exp(x))＝预测概率＝0.8190。由于这大于表3中的0.3623的截止值，所以该模型(正确地)预测了严重CRS。
模型B：合并群组的最高树模型
sgp130Pk3＝272,292.6大于截止值218,179，而MCP1Pk3＝1,053.2294小于截止值4,636.52，而嗜酸细胞活化趋化因子Pk3＝18.0830小于截止值29.0902，所以该模型(正确地)预测了严重CRS。
模型C：儿科群组的回归模型
如上所述的IFNγPk3；IL13Pk3为1.556，MIP1αPk3为25.886。在采用常用对数并使用表3第3行的估计值后，x＝(8.483*1.777)+(-5.599*0.192)+(-16.343*1.413)+15.742＝6.652。exp(6.652)＝774.38，且exp(x)/(1+exp(x))＝预测概率＝0.999。由于这大于0.3288的截止值，所以该模型(正确地)预测了严重CRS。
模型D：儿科群组的最高树模型
受试者136具有IL10Pk3＝37.4598，其大于11.747的截止值；98.5的疾病负担大于51％的截止值，所以该模型(正确地)预测了严重CRS。
模型E：使用来自最高儿科逻辑回归模型的因素的分类器
IFNγPk3＝59.9067大于27.6732的截止值，MIP1αPk3＝25.8859小于30.1591的截止值，所以该模型(正确地)预测了严重CRS。
补充结果
发热的定义、时间和持续时间
CRS的开始被定义为相对于输注CTL019，发热患者的第一次发热的日子。按照方案，对于儿科群组，发热定义为38.6℃(101.5°F)或更高。按照方案，对于成人群组，发热定义为38.0℃(100.5°F)或更高。为了一致性，为了分析的目的，CRS的开始被定义为所有受试者首次发热>＝38.0℃的日子。值得注意的是，对于任何儿科患者，使用>＝38.0℃或>＝38.5℃的定义，CRS的第一天不会改变。CRS停止定义为不发热>38.0℃的第一天。
与1-3级CRS相比，4-5级CRS患者首次发热的中位时间较早。这种差异在整个群组或成人中无统计学意义，但在儿童中有显著差异(中位数4天vs 1天；p<0.05)。虽然首次发热的中位时间在儿童中具有统计学意义，但首次发热的时间并不是CRS严重性的临床意义标志物，因为存在太多的异常值。基于CRS的等级，儿童或成人的发热总天数没有差异。患有严重CRS的患者用IL6R抑制剂托珠单抗治疗，这通常导致快速退热。
共病感染详情
CTL019输注后第一个月共有6名患者出现共病新感染。在儿科群组中，这些似乎并未影响CRS的严重性。在成人群组中，感染可能导致死亡。
在CRS预测中的CRP效用的附加细节
早期CRP升高与4-5级CRS相关(p＝0.02)，但与其他已发表的报道相反，未发现在CTL019输注后前三天早期CRP评估对于预测CRS严重性有用(AUC＝0.73)。例如，考虑CRP作为高风险病例的筛查，CRP>6.8mg/dl仅能鉴定72％的病例，并且具有阳性预测值(PPV)为43％。较高的截止值产生较低的PPV。输注后前3天的中位CRP在0-3级为4.8mg/dl(范围：<0.50-36.3)，4-5级CRS为13.6mg/dl(2.9-33.2)(p＝0.022)。有早期明显CRP升高的0-3级CRS患者，包括10/34名0-3级CRS患者，其在输注前3天内峰值CRP是>10mg/dl，而6/11名4-5级CRS患者的峰值CRP>10mg/dl(PPV＝0.375)。当研究第一次开放时，CRP的早期测量并不是常规进行，并且第1至3天之间的CRP对于3名4-5CRS患者和3名0-3级CRS患者不可用。
正常供体群组的细节
从10名正常健康志愿者收集血清。5人是男性，5人是女性。年龄中位数(范围)：40(25-65)。
有关凝血病的更多详情
PT，PTT和纤维蛋白原仅在临床指征时获得。因此，对于生病的儿童和成年人有有限的选择偏好。儿科群组以及CRS 4-5级的成人群组中的患者的子集中的11名患者中的10位，以及儿科群组以及CRS 0-3级的成人群组的子集中的28名患者中的15位发送了纤维蛋白原。在一个患者子集中检查纤维蛋白原一次，在一个患者子集中检查两次，在一个患者子集中检查3次，在一个患者子集中检查4次或更多次。在CRS4-5的儿童子集和成人子集以及CRS 0-3的儿童子集和成人子集中发送PT和PTT。在一个患者子集中检查PT和PTT一次，在一个患者子集中检查两次，在一个患者自己中检查3次，在一个患者子集中检查4次或更多次。与发展DIC或肝衰竭的患者不同，HLH患者常常发展凝血病，其对于与PT/INR或PTT适度升高相比该低纤维蛋白原血症的显著程度而言是明显的。这种模式也见于4级CRS的儿科群组中。成人也发展；然而，当比较CRS 4-5vs CRS 0-3时没有差异。
额外的统计分析
值得注意的是，对于患者子集，CRS非常短，并且细胞因子采集的时间顺序不包括患者发热的短窗口。为了确保这些患者不错误地歪曲结果，还完成了排除这些患者的统计分析，并发现它没有改变任何结果。临床方案要求在计划好的时间点收集细胞因子(参见补充方法)。发展严重CRS的患者通常发送额外的实验室值。为了确保结果不因附加测量而偏差，进行了每个方案的分析，并发现基于CRS等级而差异性升高的相同细胞因子(数据未示出)。
实施例4：在嵌合抗原受体T细胞治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)中区分脓毒症与细胞因子释放综合征的生物标志物谱
具有CD19特异性的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CTL019)是用于复发/难治性ALL的高效新颖免疫疗法。细胞因子释放综合征(CRS)是最重要的且在某些情况下危及生命的毒性。这些患者通常中性粒细胞减少和免疫抑制，并且具有脓毒症的高风险。此外，有一些病例，其中并发感染并发症可能激起潜在的CRS导致抗细胞因子定向治疗难以治愈的低血压和缺氧(Frey等人，摘要2296，ASH 2014)。在启动有效治疗所需的关键时间窗中，鉴别脓毒症和CRS可能是重大的临床挑战，特别是因为包括抗细胞因子疗法和皮质类固醇在内的CRS治疗可能会使严重感染恶化。对63个CTL019治疗的ALL患者的群组中的43个细胞因子和可溶性细胞因子受体以及临床生物标志物的广泛研究显示输注后第一个月的24个细胞因子的峰值水平与严重CRS高度相关，并且描述了CRS预测模型(Teachey等人，CancerDiscovery，2016 6；664，其全部内容通过引用并入本文)。
本实施例比较CRS和脓毒症中的生物标志物谱，并鉴定区分两种临床综合征的特征谱，特别是在ICU入住时。实施例评估了用CTL019治疗的66名成人和儿科患者(ALL-CRS群组)，15名未用CTL019治疗但发生导致ICU入住的脓毒症(脓毒症群组)的患者，以及10名正常健康的儿童(对照组)中的50种细胞因子、可溶性受体和其他血清生物标志物。66名用CTL019治疗并发展CRS的患者中，30例(45％)需要入住ICU。所测试的生物标志物包括本文所述的，加上一组七种额外的脓毒症相关生物标志物(血管生成素2，[ANG2]sCD163，Pentraxin 3[PTX3]，sCD14，PAI-1，P-选择素，ICAM-1)。
针对多重比较调整后，与正常受试者相比，脓毒症中的以下生物标志物显著升高：ANG2，GCSF，IFNα，IL1RA，IL4，IL6，MIG，MIP1α，PTX3，TNFα，sCD163，sCD30，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-2Rα，sIL-4R，sRAGE，sTNFRI，sTNFRII，sVEGFR1，sVEGFR2，sVEGFR3和VEGF，而IL13和RANTES在脓毒症中显著较低。在CTL019疗法后入住ICU 72小时内的ALL-CRS受试者(N＝29)中，与针对多重比较调整后的脓毒症相比，23种生物标志物显著不同；16种在CRS中升高：GM-CSF，HGF，IFN-γ，IFN-α，IL-10，IL-15，IL-5，IL-6，IL-8，IP-10，MCP1，MIG，MIP-1β，sIL-2Rα，sTNFRI和sTNFRII；而7种在脓毒症受试者中升高：CD163，IL-1β，sCD30，sIL-4R，sRAGE，sVEGFR-1和sVEGFR-2。图15示出了sCD163(脓毒症中升高)和IP-10(CRS中升高)的代表性绘图。这些综合谱数据为CRS生物学提供了新的见解，重要的是帮助区分接受CAR T细胞治疗后变得危重患者的CRS和败血症。这些数据具有直接的翻译治疗相关性。
实施例5：输注用于多发性骨髓瘤的抗BCMA CAR T细胞(CART-BCMA)后的后部可逆性脑病综合征(PRES)：用环磷酰胺成功治疗
在用抗CD19嵌合抗原受体(CAR)T细胞和抗CD19/抗CD3双特异性T细胞衔接子blinatumomab治疗的患者中观察到神经毒性。报道的神经毒性包括通常与系统性细胞因子释放综合征(CRS)有关，但是也可以在从CRS恢复或不存在CRS后观察到的局灶性缺陷(例如，脑神经麻痹或轻偏瘫)和全身异常(例如全身性发作，混乱)。CART-BCMA涉及通过慢病毒载体转导以表达对B细胞成熟抗原具有特异性的基于4-1BB/CD3-zeta的CAR的体外扩增的自体T细胞。本实施例报告了在多发性骨髓瘤(MM)中CART-BCMA的1期研究期间观察到的严重神经毒性的临床特征和管理(NCT02546167)。
受试者是55岁女性，具有在之前4线治疗后的高风险IgA lambda MM进展。治疗前的疾病表现包括胸膜和椎旁肌组织的血细胞减少和髓外浆细胞瘤。骨髓(BM)被BCMA+浆细胞占据>95％。治疗前的脑MRI显示，在左脑的凸面上有厚膜增厚和增强，可能是由于颅骨MM病灶的直接延伸。神经科医师和CSF细胞学的处理前检查显示没有CNS MM的证据。
受试者在连续两天内接受2x108CART-BCMA细胞，计划剂量的40％，没有先前的淋巴耗尽化疗；由于发热而举行第三次计划的输注。在接下来的4天内，发热持续存在，并且发展缺氧、全血细胞减少和谵妄。第4天脑MRI和腰穿未见新的异常。感染评估为阴性。这些症状与血清IL-6和其他CRS相关生物标志物的升高相对应。在CART-BCMA输注后的第6天，对CRS施用两种托珠单抗剂量，其导致血清IL-6下降和发热和缺氧的消退(图16，圆圈和三角形)。
在第8天，受试者变得迟钝，促使插管并开始皮质类固醇(甲泼尼龙1000mg×1，然后氢化可的松每8小时100mg)。她的精神状态在随后的两天中有所改善，到第11天，拔管、警觉、并且停止类固醇。在第12天，她发展为全身性癫痫发作，并再次插管用于气道保护并用抗癫痫剂(AED)治疗。她再次改善并拔管，但在第15天发展出癫痫持续状态，需要5种AED来控制。重复脑MRI显示涉及双侧额叶，顶骨，枕骨，后颞颥和小脑半球的新弥漫性通路，皮层和皮层下T2/FLAIR信号异常，具有涉及脑水肿的沟消除。这种恶化与发热的复发、其他全身性CRS体征/症状或高血压无关，但它与循环活化的(HLA-DR+)CART-BCMA细胞的频率显著上升相一致(图16，倒三角形)。CRS相关细胞因子的血清水平继续降低，但与第16天血清和第4天CSF二者相比，在第16天获得的CSF显示IL-6，IL-8和其他CRS相关细胞因子显著升高(图16，正方形)。在CSF中检测到CART-BCMA细胞。大剂量甲泼尼龙在第15天重新开始，没有临床改善。在第17天，施用环磷酰胺1.5g/m2以减少CART-BCMA细胞。从第18天开始，警觉性和反应性显著改善，并且对她在第20天拔管。皮质类固醇逐渐减少。第23天的MRI显示大脑和小脑信号异常的近分辨率，这在4周后重复MRI完全消失。除了归因于AEDs效应的疲劳和轻度集中困难以外，认知功能恢复无长期神经病后遗症。要恢复的最后神经病症状是加工视觉信息的轻度困难。尽管给予环磷酰胺和延长的皮质类固醇过程，但在最后的评估中，在输注后164天，CART-BCMA细胞在血液和骨髓中均保持可检测，并且患者实现了持续5个月的VGPR。
鉴于快速可逆性和MRI表现，这种神经综合征被认为与后部可逆性脑白质病综合征(PRES)最为一致，可能是由于CSF中CRS相关细胞因子水平高，这与针对神经元组织的直接CART-BCMA细胞毒性的脑炎相反。PRES在全身CRS改善中发展，表明了CNS定位的CRS，这可能是由于CART-BCMA频率上升和/或托珠单抗阻断CNS中的IL-6受体失败而遇到的隐匿CNSMM。尽管类固醇仅获得暂时的临床改善，但是症状在用环磷酰胺缩减细胞后迅速消退，而不用完全消除输注的CART-BCMA细胞，表明这种策略可以考虑用于危及生命的CAR T细胞神经毒性的情况。
实施例6：用抗CD19的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CTL019)治疗造成具有生发中心和非生发中心起源的复发或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤，“双重打击”弥漫性大B细胞淋巴瘤和转化的滤泡到弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的持久缓解
背景：生发中心(GC)或非生发中心(NGC)的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的起源细胞(COO)可能对一线和复发环境的治疗结果具有预后意义(Lenz等人，NEJM 2008；Thieblemont等人，JCO 2011)。通过影响MYC/8q24基因座和第二癌基因基因座并由滤泡淋巴瘤(FL)转化或从头发生的染色体断点定义的“双重打击”DLBCL(DHL)在复发设定中没有有效治疗。由于复发的DLBCL患者(pts)的不良预后组需要新的疗法，作为正在进行的IIa期临床试验(NCT02030834)的一部分，我们检查了用基因修饰以表达由具有CD3ζ的外部抗CD19单链鼠抗体结构域和4-1BB信号传导结构域(CTL019细胞)组成的嵌合抗原受体的自体T细胞在具有复发性或难治性GC-和NGC-DLBCL，DHL和转化FL的患者中治疗的功效。
方法：符合条件的患者在初期和挽救性疗法后具有CD19+DLBCL(有可测量的残留疾病)，不符合自体干细胞移植(ASCT)或在ASCT后具有复发/残留疾病，具有有限的预后(<2年的预期存活期)，以及具有反应性或稳定的具有最近的治疗疾病。使用Hans的算法通过免疫组织化学测定DLBCL的COO(Hans等人Blood 2004)。使用Vysis MYC(8q24)，BCL2(18q21)和BCL6(3q27)分开探针在诊断组织上进行荧光原位杂交以确定DHL。DHL由MYC基因座染色体易位定义，第二易位涉及BCL2或BCL6。在稳态分离血浆以收集外周血白细胞后，根据临床特征和既往的疗法，患者接受淋巴消耗化疗。化疗后1至4天，患者接受单次静脉内剂量的CTL019细胞。在CTL019细胞之后，患者没有接受进一步的疗法。使用国际工作组反应标准，在T细胞输注后3个月进行初始肿瘤反应评估。2014年2月开始招募；数据报告截至2016年7月24日。
结果：13名DLBCL患者入组并评估反应(7名患者GC，5名患者NGC，1名未确定)。中位年龄为59岁(范围：25-77)，男女比例为10：3，先前治疗的中位数为5(范围：2-8)，以及先前移植的患者人数为7(54％)。入组时，Ann Arbor分期为：第四期8名患者(61％)，第三期1名患者(8％)和第二期3名患者(23％)IE期1名患者(8％)；3名患者(23％)有骨髓受累。8名患者LDH升高(62％)。ECOG PS在4名患者中为0(31％)和在9名患者中为1(69％)。淋巴消耗化疗方案为苯达莫司汀(90mg/m2×2；1患者)，环磷酰胺(1gm/m2；2患者)，放射性环磷酰胺(4,000cGy-750mg/m2；1患者)，改良EPOCH(3患者)和高度分级的环磷酰胺(300mg/m2q12小时×6；6患者)。12名患者接受5.00E+08(5.10-6.75E+06细胞/kg)CTL019细胞；1名患者接受1.93E+08(3.10E+06个细胞/kg)。输注后7天(范围：2-28天)出现血液中的中值峰CTL019细胞扩增；应答者与非应答者或GC-或NGC-DLBCL患者之间的峰值扩展没有差异。细胞因子释放综合征发生在9名患者中(8名2级；1名3级)并且不预测应答。暂时性神经毒性包括在2/13患者(1名2级；1名3级)的谵妄和在1/13患者(1名1级)的认知障碍。在CTL019输注后3个月，总反应率(ORR)为52％(7/13患者)；对GC的ORR为71％(5/7患者)和对NGC的ORR为40％(2/5患者)。3个月的完全反应率(CR)为38％(5/13患者)；对于GC的CR为43％(3/7患者)，对于NGC的CR为40％(2/5患者)。所有患者的最佳反应是13名患者中6名为CR(46％)；对于GC的CR为57％(4/7患者)，对于NGC的CR为40％(2/5患者)。具有GC-DLBCL的7名患者中的3名具有转化FL，并且所有3名患者均获得CR；7名GC-DLBCL患者中的2名患有DHL，且均获得CR。迄今为止，没有获得CR的患者已经复发。5名NGC-DLBCL患者中有2名具有富含T细胞的DLBCL；患者都没有应答CTL019。所有患者的中位无进展生存期(PFS)为5.8个月(mo)，NGC患者为3.0个月，而对于GC患者未达到(PFS 57.1％[95％CI：17.2％-83.7％]在中位数随访21.9个月)。
结论：这些结果表明CTL019细胞单次治疗在复发或难治性GC-和NGC-DLBCL，DHL和转化FL中是安全且有效的。
实施例7：IL-6受体多态性预测CART19疗法后治疗难治性细胞因子释放综合征的发展
使用来自用CART19治疗的成人ALL患者的数据集，鉴定IL-6R中的单核苷酸多态性，其预测细胞因子释放综合征(CRS)是否是用IL-6受体拮抗剂托珠单抗治疗难治的。测试的SNP是：rs2228145(主要遗传变体)，rs4329505(导致用C/T对T/T具有较高sIL-6水平的转换取代SNP)，rs12083537，rs4129267和rs7529229(Galicia JC等人，Genes andImmunity2004；5：513-16；Ferreira RC等人，PLOS One 2013；9：e1003444)。表17列出了主要和次要等位基因、频率和对IL6的影响。
SNP rs2228145(位于染色体1q21上的IL-6r基因的外显子9)代表IL-6R胞外结构域内的Asp358Ala取代。确定患者的托珠单抗敏感性并与其在此基因座处的基因型进行比较(表18)。该实验表明在rs2228145处具有A/A单倍型是对托珠单抗应答的预测。这种效应可能是由于较高的非A/A单倍型的sIL-6R水平所致。
确定患者的托珠单抗敏感性，并与其在IL-6R中的另外四个SNP基因座处的基因型进行比较(表19)。
附加表格
表15.CTCAE v 4.0 CRS分级标度。
Figure BDA0003753655610003161
Figure BDA0003753655610003171
表16.NCI CRS分级标准。
Figure BDA0003753655610003172
表17.IL-6R SNP总结
Figure BDA0003753655610003173
Figure BDA0003753655610003181
表18.基于rs2228145基因型的患者的托珠单抗敏感性。
Figure BDA0003753655610003182
表19.基于rs4329505，rs12083537，rs4129267或rs7529229处的基因型的患者的托珠单抗敏感性。
Figure BDA0003753655610003183
Figure BDA0003753655610003191
等同方案
通过考虑本文公开的本发明的说明书或实践，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经参考具体方面公开了本发明，但是显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域技术人员可以设计出本发明的其它方面和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这些方面和等同变型。

Claims (61)

1.一种评估(例如预测)受试者发展细胞因子释放综合征(CRS)，例如严重CRS的风险的方法，包括：
例如响应于CAR表达细胞疗法(例如，CAR19表达细胞疗法)，获得受试者的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态包括下述中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多(全部)量度：
(i)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，可溶性gp130(sgp130)或干扰素-γ(IFN-g)或其组合的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(ii)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，sgp130，IFN-γ或IL1Ra或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和IL1Ra中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(iii)在样品(例如血液样品)中sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，和受试者中骨髓疾病的水平，例如其中受试者是儿科受试者；
(iv)在样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或MIP1-α或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和MIP1-α中任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(v)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vi)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130或其组合(例如，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(viii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL10的水平或活性和在受试者中的疾病负担水平或其组合，例如其中受试者是儿科受试者；
(ix)在受试者中IFN-γ或IL-13或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(x)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ，IL-13或MIP1-α或其组合(例如IFN-γ，IL-13和MIP1-α中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；或
(xi)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ或MIP1-α或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者，
其中CRS风险状态指示受试者发展CRS如严重CRS的风险。
2.一种治疗患有癌症例如血液癌症的受试者的方法，包括：
向受试者施用治疗有效剂量的CAR表达细胞疗法，例如CAR19疗法；和
获取受试者的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态包括以下中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多(全部)量度：
(i)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(ii)在受试者，例如样品(例如血液样品)中，sgp130，IFN-γ或IL1Ra或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和IL1Ra中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(iii)在受试者中，例如在样品(例如血液样品)中sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，和受试者中骨髓疾病的水平，例如其中受试者是儿科受试者；
(iv)在受试者中，例如在样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或MIP1-α或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和MIP1-α中任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(v)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vi)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130或其组合(例如，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(viii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL10的水平或活性和在受试者中的疾病负担水平或其组合，例如其中受试者是儿科受试者；
(ix)在受试者中IFN-γ或IL-13或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(x)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ，IL-13或MIP1-α或其组合(例如IFN-γ，IL-13和MIP1-α中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；或
(xi)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ或MIP1-α或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者，
其中CRS风险状态指示受试者发展CRS如严重CRS的风险。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括：响应于CRS风险状态的确定，执行以下中的一个，两个或更多个(全部)：
将受试者鉴定为处于发展严重CRS的高风险或处于发展严重CRS的低风险；
施用改变剂量的CAR表达细胞疗法；
改变CAR表达细胞疗法的方案或时程；
施用疗法以治疗CRS，例如选自以下一种或多种的疗法：IL-6抑制剂(例如托珠单抗)，血管活性药物，免疫抑制剂，皮质类固醇或机械通气；或
例如，对于处于发展严重CRS的高风险的受试者，施用替代疗法，例如特定癌症类型的标准护理。
4.一种CAR表达细胞疗法，例如CAR19疗法，用于患有癌症例如血液癌症的受试者中的用途，其中所述受试者被鉴定为具有指示所述受试者发展CRS如严重CRS的风险的CRS风险状态，其中所述CRS风险状态包括以下中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多(全部)量度：
(i)在受试者，例如在样品(例如血液样品)中，sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(ii)在受试者，例如样品(例如血液样品)中，sgp130，IFN-γ或IL1Ra或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和IL1Ra中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(iii)在受试者中，例如在样品(例如血液样品)中sgp130或IFN-γ或其组合的水平或活性，和受试者中骨髓疾病的水平，例如其中受试者是儿科受试者；
(iv)在受试者中，例如在样品(例如血液样品)中sgp130，IFN-γ或MIP1-α或其组合(例如，sgp130，IFN-γ和MIP1-α中任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(v)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，sgp130，MCP1或嗜酸细胞活化趋化因子中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vi)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130或其组合(例如，IL2，嗜酸细胞活化趋化因子或sgp130中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是成人或儿科受试者；
(vii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子或其组合(例如，IFN-γ，IL2或嗜酸细胞活化趋化因子中的任意两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(viii)在受试者中，例如在样品(例如，血液样品)中，IL10的水平或活性和在受试者中的疾病负担水平或其组合，例如其中受试者是儿科受试者；
(ix)在受试者中IFN-γ或IL-13或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；
(x)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ，IL-13或MIP1-α或其组合(例如IFN-γ，IL-13和MIP1-α中任何两种或全部三种的组合)的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者；或
(xi)在样品(例如，血液样品)中IFN-γ或MIP1-α或其组合的水平或活性，例如其中受试者是儿科受试者。
5.用于如权利要求4所述的用途的组合物，其中一种、两种或更多种(全部)：
响应于CRS风险状态的确定，将受试者鉴定为处于发展严重CRS的高风险或处于发展严重CRS的低风险中；
响应于CRS风险状态的确定，向受试者施用改变剂量的CAR表达细胞疗法；
响应于CRS风险状态的确定，改变CAR表达细胞疗法的方案或时程；
响应于CRS风险状态的确定，向受试者施用疗法以治疗CRS，例如选自以下一种或多种的疗法：IL-6抑制剂(例如托珠单抗)，血管活性药物，免疫抑制剂，皮质类固醇或机械通气；或
响应于CRS风险状态的确定，向受试者施用替代疗法，例如，用于具有发展严重CRS的高风险的受试者，例如特定癌症类型的标准护理。
6.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中所述CRS风险状态指示所述受试者是处于发展严重CRS的高风险还是低风险。
7.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中所述CRS是临床1-3级CRS，或所述严重CRS是临床4-5级CRS。
8.如权利要求1-3、6或7中任一项所述的方法，所述方法在没有CRS的症状(例如，临床症状)，例如低血压或发热中的一种或多种的受试者上进行。
9.如权利要求1-3、6或7中任一项所述的方法，所述方法在不具有严重CRS的症状(例如临床症状)，例如4级器官毒性或需要机械通气的一种或多种的受试者上进行。
10.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中，处于严重CRS的高风险中的受试者被鉴定为(例如，在样品，例如血液样品中)相对于参照，例如与处于严重CRS的低风险的受试者相比较或与对照水平或活性相比较，具有更高水平或活性的sgp130或IFN-γ或其组合。
11.用于如权利要求10所述的用途的方法或组合物，其中所述受试者是成人或儿科受试者。
12.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS高风险的受试者被鉴定为相对于参照，例如与处于严重CRS的低风险的受试者相比较或与对照水平或活性相比较，(例如在样品中，例如血液样品中)具有更高的sgp130水平或活性，更高的IFN-γ水平或活性或更低的IL1Ra水平或活性或其组合。
13.用于如权利要求12所述的用途的方法或组合物，其中所述受试者是成人或儿科受试者。
14.用于如权利要求12或13所述的用途的方法或组合物，其中所述处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为具有：
相比于参照，例如处于严重CRS的低风险或对照水平或活性的受试者，
更高的sgp130水平或活性和更高的IFN-γ水平或活性；
更高的sgp130水平或活性和更低的IL1Ra水平或活性；
更高的IFN-γ水平或活性和更低的IL1Ra水平或活性；或
更高的sgp130水平或活性，更高的IFN-γ水平或活性，以及更低的IL1Ra水平或活性。
15.用于如权利要求1-10中任一项所述用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为相对于参照，例如与处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，在受试者(例如，在样品中，例如血液样品中)具有更高的sgp130水平或活性或更高的IFN-γ水平或活性或其组合以及更高的骨髓疾病水平。
16.用于如权利要求15所述的用途的方法或组合物，其中所述受试者是儿科受试者。
17.用于如权利要求15或16所述的用途的方法或组合物，其中所述受试者被鉴定为相比于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或对照水平或活性
具有更高水平的：
sgp130和IFN-γ；
sgp130和骨髓疾病；
IFN-γ和骨髓疾病；或
sgp130，IFN-γ骨和骨髓疾病。
18.用于如权利要求1-10中任一项所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为相对于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，(例如，在样品中，例如血液样品中)具有更高的sgp130水平或活性，更高的IFN-γ水平或活性或更低的MIP1-α水平或活性或其组合。
19.用于如权利要求18所述的用途的方法或组合物，其中所述受试者是儿科受试者。
20.用于如权利要求18或19所述的用途的方法或组合物，其中具有严重CRS高风险的受试者被鉴定为具有：
相比于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，
更高的sgp130水平或活性和更高的IFN-γ水平或活性；
更高的sgp130水平或活性和更低的MIP1-α水平或活性；
更高的IFN-γ水平或活性和更低的MIP1-α水平或活性；或
更高的sgp130水平或活性，更高的IFN-γ水平或活性，以及更低的MIP1-α水平或活性。
21.用于如权利要求1至10中任一项所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为相对于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，(例如在样品例如血液样品中)具有更高的sgp130水平或活性，更高的MCP1水平或活性或更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性或其组合。
22.用于如权利要求21所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险中的受试者被鉴定为具有：
相比于参照，例如严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性进行比较，
更高的sgp130水平或活性和更高的MCP1水平或活性；
更高的sgp130水平或活性和更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；
更高的MCP1水平或活性和更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；或
更高的sgp130水平或活性，更高的MCP1水平或活性，以及更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性。
23.用于如权利要求1-10中任一项所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为相比于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，(例如，在样品例如血液样品中)具有更高的IL-2水平或活性，更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性，或更高的sgp130水平或活性，或其组合。
24.用于如权利要求23所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS高风险的受试者被鉴定为具有：
相比于参照，例如严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，
更高的IL-2水平或活性和更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；
更高的IL-2水平或活性和更高的sgp130水平或活性；
更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性和更高的sgp130水平或活性；或
更高的IL-2水平或活性，更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性，以及更高的sgp130水平或活性。
25.用于如权利要求1-10中任一项所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为相比于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，(例如在样品例如血液样品中)具有更高的IFN-γ水平或活性，更高的IL-2水平或活性，或更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性或其组合。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述受试者是儿科受试者。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中处于严重CRS的高风险中的受试者被鉴定为具有：
相比于参照，例如严重CRS的低风险的受试者与对照水平或活性相比较，
更高的IFN-γ水平或活性，和更高的IL-2水平或活性；
更高的IFN-γ水平或活性和更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；
更高的IL-2水平或活性和更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性；或
更高的IFN-γ水平或活性，更高的IL-2水平或活性，和更低的嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性。
28.用于如权利要求1-10中任一项所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为相比于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，(例如，在样品例如血液样品中)具有更高的IL10水平或活性或更高水平的疾病负担或其组合。
29.用于如权利要求28所述的用途的方法或组合物，其中所述受试者是儿科受试者。
30.用于如权利要求1-10中任一项所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为相比于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，(例如，在样品中，例如血液样品中)具有更高的IFN-γ水平或活性或更低的IL-13水平或活性或其组合。
31.用于如权利要求30所述的用途的方法或组合物，其中所述受试者是儿科受试者。
32.用于如权利要求1-10中任一项所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为相比于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，(例如，在样品，例如血液样品中)具有更高的IFN-γ水平或活性，更低的IL-13水平或活性，更低的MIP1-α水平或活性或其组合。
33.用于如权利要求32所述的用途的方法或组合物，其中所述受试者是儿科受试者。
34.如权利要求32或33所述的方法或组合物的用途，其中处于严重CRS的高风险中的受试者被鉴定为具有：
相比于参照，例如严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，
更高的IFN-γ水平或活性和更低的IL-13水平或活性；
更高的IFN-γ水平或活性和更低的MIP1-α水平或活性；
更低的IL-13水平或活性和更低的MIP1-α水平或活性；
更高的IFN-γ水平或活性，更低的IL-13的水平或活性，以及更低的MIP1-α水平或活性；或。
35.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中所述(i)-(xi)中的一种或多种的量度评估mRNA水平或蛋白质水平中的一种或多种。
36.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，进一步包括获得受试者中，例如在来自受试者的样品(例如血液样品)中选自以下的一、二、三、四、五、十、二十或更多种细胞因子或细胞因子受体的水平或活性的量度：sTNFR2，IP10，sIL1R2，sTNFR1，M1G，VEGF，sILR1，TNFα，IFNα，GCSF，sRAGE，IL4，IL10，IL1R1，IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β或GM-CSF或其组合。
37.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险中的受试者被鉴定为相比于参照，例如处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，具有选自以下的一种或多种(例如二、三、四、五、十、二十或全部)细胞因子或细胞因子受体的更高水平或活性：sTNFR2，IP10，sIL1R2，sTNFR1，M1G，VEGF，sILR1，TNFα，IFNα，GCSF，sRAGE，IL4，IL10，IL1R1，IFN-γ，IL6，IL8，sIL2Rα，sgp130，sIL6R，MCP1，MIP1α，MIP1β或GM-CSF或其组合。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括确定来自所述受试者的样品(例如血液样品)中C-反应蛋白(CRP)的水平。
39.如权利要求38所述的方法，其中处于严重CRS的低风险中的受试者被鉴定为具有小于7mg/dL(例如7、6.8、6、5、4、3、2、1mg/dL或更低)的CRP水平。
40.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中处于严重CRS的高风险的受试者被鉴定为相比于处于严重CRS的低风险的受试者或与对照水平或活性相比较，在样品(例如，血液样品)中具有更高水平的CRP。
41.用于如权利要求37-40中任一项所述的用途的方法或组合物，其中更高的水平或活性是与严重CRS的低风险的受试者相比或与对照水平或活性相比较至少大2倍(例如至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，100，500，1000倍或更高)。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法，还包括基于获得的CRS风险状态选择用于受试者的CAR表达细胞疗法的步骤。
43.如权利要求42所述的方法，其中获得的CRS风险状态是所述受试者处于严重CRS的高风险中，并且所建议的疗法是比施用于受试者的CAR表达细胞疗法的先前剂量低的剂量的随后的(例如，第二、第三或第四)剂量的CAR表达细胞。
44.如权利要求42所述的方法，其中所获得的CRS风险状态是受试者处于严重CRS的高风险中，并且所建议的治疗是随后的(例如，第二、第三或第四)剂量的CAR表达细胞，其包含不同于先前施用于受试者的CAR表达细胞疗法的不同CAR或不同细胞类型。
45.用于如前述权利要求中任一项的用途的方法或组合物，其中所述CAR表达细胞疗法包含多种CAR表达免疫效应细胞，例如CAR19疗法(例如CTL019疗法)。
46.用于如前述权利要求中任一项的用途的方法或组合物，其中所述癌症或血液学癌症与CD19表达相关。
47.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中所述癌症或血液癌症选自B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，B细胞早幼粒细胞白血病，胚细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴细胞增生症，MALT淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤(MCL)，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆胚细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞肿瘤和瓦尔登斯特隆巨球蛋白血症。
48.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中在接受所述CAR-表达细胞疗法的同时评估受试者，例如来自受试者的样品，或其中在接受CAR表达细胞治疗后评估受试者，例如来自受试者的样品。
49.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中在输注CAR表达细胞疗法后10天或更短时间(例如1-10天，1-9天，1-8天，1-7天，1-6天，1-5天，1-4天，1-3天，或1-2天，5天，3天，2天，1天或更少)评估所述受试者例如来自受试者的样品。
50.用于如前述权利要求中任一项的用途的方法或组合物，其中所述受试者是人。
51.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物，其中所述受试者是成人受试者或儿科受试者。
52.一种评估(例如预测)受试者发展细胞因子释放综合征(CRS)，例如严重CRS的风险的试剂盒，包含：
一组特异性检测选自以下的一种或多种基因或蛋白质的水平或活性的试剂：
sgp130和IFN-γ；
sgp130，IFN-γ和IL1Ra；
sgp130，IFN-γ和MIP1-α；
sgp130，MCP1和嗜酸细胞活化趋化因子；
IL2，嗜酸细胞活化趋化因子和sgp130；
IFN-γ，IL2和嗜酸细胞活化趋化因子；
IFN-γ和IL-13；或
IFN-γ，IL-13和MIP1-α；
或其组合；和
使用所述试剂盒的说明书；
其中所述使用说明书规定，如果检测到的IFN-γ，sgp130或MCP1的水平或活性中的一种或多种大于参照值，和/或如果检测到的IL-13，IL1Rα，MIP1α或嗜酸细胞活化趋化因子水平或活性中的一种或多种小于参照值，所述受试者比具有在参照值处检测到的水平或活性的受试者更可能发展CRS(例如，严重CRS)。
53.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物或试剂盒，其中所述CAR表达细胞是T细胞或NK细胞。
54.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物或试剂盒，其中如果所述受试者被鉴定为处于严重CRS风险中并且被鉴定为对IL6受体抑制剂敏感，则所述受试者用IL6受体抑制剂如托珠单抗治疗。
55.用于如前述权利要求中任一项所述的用途的方法或组合物或试剂盒，其中如果所述受试者被鉴定为处于严重CRS风险中且被鉴定为具有降低的对IL6受体抑制剂的敏感性，则用除IL6受体抑制剂例如除托珠单抗以外的CRS疗法。
56.一种区分受试者中的CRS和脓毒症的方法，包括获取以下一种或多种的量度：
(i)GM-CSF，HGF，IFN-γ，IFN-α，IL-10，IL-15，IL-5，IL-6，IL-8，IP-10，MCP1，MIG，MIP-1β，sIL-2Rα，sTNFRI和sTNFRII中一种或多种(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15种或全部)的水平或活性，其中高于参照的水平或活性指示CRS；或
(ii)CD163，IL-1β，sCD30，sIL-4R，sRAGE，sVEGFR-1和sVEGFR-2的一种或多种(例如2、3、4、5、6种或全部)的水平或活性，其中高于参照的水平或活性指示脓毒症。
57.一种治疗神经毒性，CRS或后可逆性脑病综合征(PRES)中的一种或多种的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的环磷酰胺，
其中环磷酰胺的施用在基于细胞的癌症疗法，CD19抑制疗法或CD19消耗疗法之后进行，或
其中所述受试者先前已经用基于细胞的癌症疗法，CD19抑制疗法或CD19消耗疗法进行了治疗。
58.一种评估(例如预测)受试者对IL6受体抑制剂(例如托珠单抗)的反应性的方法，包括评估受试者的IL-6R基因型，其中与低sIL-6R水平相关的基因型指示对IL6受体抑制剂(例如托珠单抗)的敏感性。
59.一种评估(例如预测)受试者对IL6受体抑制剂(例如托珠单抗)的反应性的方法，包括评估受试者的sIL-6R水平，其中低于参照水平的sIL-6R水平指示对IL6受体抑制剂(例如托珠单抗)的敏感性。
60.如权利要求59所述的方法，其中评估所述受试者的IL-6R基因型包括确定所述受试者在rs2228145处的基因型。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中所述受试者(例如，被鉴定为对IL6受体抑制剂如托珠单抗敏感的受试者)用IL6受体抑制剂例如托珠单抗治疗或所述受试者(例如被鉴定为对IL6受体抑制剂如托珠单抗具有降低的敏感性的受试者)用除IL6受体抑制剂(例如除托珠单抗)之外的CRS疗法治疗。
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