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JP2023503161A - Ｃｄ１９及びｃｄ２２キメラ抗原受容体及びその使用 - Google Patents

Ｃｄ１９及びｃｄ２２キメラ抗原受容体及びその使用 Download PDF

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JP2023503161A JP2022530721A JP2022530721A JP2023503161A JP 2023503161 A JP2023503161 A JP 2023503161A JP 2022530721 A JP2022530721 A JP 2022530721A JP 2022530721 A JP2022530721 A JP 2022530721A JP 2023503161 A JP2023503161 A JP 2023503161A
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ノバルティス アーゲー
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Abstract

本開示は、例えば、本明細書に記載されるとおりのＣＤ２２ ＣＡＲ及びＣＤ１９ ＣＡＲを含む組換えＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することにより、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関連する疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。本開示は、ＣＤ２２及び／又はＣＤ１９に特異的なＣＡＲ分子、それを含む細胞を作製する方法及びそれをコードするベクターにも関する。

Description

関連出願の相互参照及び配列表の援用
本願は、２０１９年１１月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／９４０，６００号明細書に対する優先権を主張するものであり、この仮特許出願は、全体として参照により本願に援用される。２０２０年１１月２４日に作成された、１８２，８３７バイト（オペレーティングシステムＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）の「ＰＡＴ０５８６９１－ＷＯ－ＰＣＴ ＳＱＬ＿ＳＴ２５」という名称のファイルに含まれる配列表が本明細書と共に提出され、参照により本明細書に援用される。
本発明は、概して、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関連する疾患を治療するための、分化クラスター１９タンパク質（ＣＤ１９）結合ドメイン及び／又は分化クラスター２２タンパク質（ＣＤ２２）結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作されたＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の使用に関する。
多くのＢ細胞悪性腫瘍患者は、標準療法では不治である。加えて、従来の治療選択肢は、多くの場合に重篤な副作用を有する。癌免疫療法において試みがなされているものの、幾つかの障害により、これは、臨床効果の実現が極めて困難な目標となっている。何百ものいわゆる腫瘍抗原が同定されているが、それらは、概して自己由来であり、従って免疫原性が低い。更に、腫瘍は、幾つかの機構を用いて自らを免疫攻撃の惹起及び伝播に不適にする。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変自己Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）療法を用いた最近の展開は、Ｔ細胞をＢ細胞悪性腫瘍などの癌細胞上の好適な細胞表面分子に仕向け直すことに依存するものであり、免疫系の力を利用したＢ細胞悪性腫瘍及び他の癌の治療において有望な結果を示している（例えば、非特許文献１を参照されたい）。マウス由来ＣＡＲＴ１９（即ち「ＣＴＬ０１９」）の臨床結果は、ＣＬＬ並びに小児ＡＬＬに罹患している患者において完全寛解が得られる見込みを示している（例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４を参照されたい）。遺伝子改変Ｔ細胞上のキメラ抗原受容体が標的細胞を認識し破壊する能力に加えて、治療的Ｔ細胞療法の成功には、白血病再発について調査するために増殖して長期間持続する能力を有することが必要である。アネルギー、抑制又は枯渇に起因するＴ細胞品質のばらつきがＣＡＲ形質転換Ｔ細胞の性能に影響を及ぼし得るが、それに対し、現時点で当業者の制御は限られている。有効であるには、ＣＡＲ形質転換患者Ｔ細胞が、コグネイト抗原に応答して増殖する能力を持続及び維持する必要がある。
Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ３：３８８－３９８（２０１３） Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３：９５ｒａ７３（２０１１） Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３６５：７２５－７３３（２０１１） Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３６８：１５０９－１５１８（２０１３）
本開示は、とりわけ、ＣＤ２２ ＣＡＲを含む第１のＣＡＲと、ＣＤ１９ ＣＡＲを含む第２のＣＡＲとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子、例えば本明細書に記載されるとおりのデュアルＣＡＲをコードする新規核酸分子を特徴とする。一部の実施形態において、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２２抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ１９抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む。本明細書に開示されるＣＡＲ分子の一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、例えば、第１及び第２の膜貫通ドメイン；第１及び第２の共刺激ドメイン並びに／又は第１及び第２の一次シグナル伝達ドメインの２つの同一のポリペプチド配列であって、異なるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。また、本明細書には、前記ＣＡＲ分子の使用方法も開示される。更に、本明細書には、ＣＤ２２抗原結合ドメインとＣＤ１９抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲ、例えば本明細書に記載されるとおりのタンデムＣＡＲが開示される。本組成物をコードする核酸、宿主細胞、ベクター並びに作製及び使用方法も開示される。
デュアルＣＡＲ
ある態様において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子を提供し、前記ＣＡＲ分子は、
（ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ；及び
（ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲ
を含み、
（ｉ）第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；
（ｉｉ）第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のいずれか１つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；及び／又は
（ｉｉｉ）第１の一次シグナル伝達ドメイン及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる。
ある実施形態において、第１のＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。ある実施形態において、第１のＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと；第１の一次シグナル伝達ドメインとを含む。ある実施形態において、第１のＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１の共刺激シグナル伝達ドメインと、第１の一次シグナル伝達ドメインとを含む。
ある実施形態において、第２のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと；第２の膜貫通ドメインと；第２の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。ある実施形態において、第２のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと；第２の膜貫通ドメインと；第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む。ある実施形態において、第２のＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと；第２の膜貫通ドメインと；第２の共刺激シグナル伝達ドメインと；第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、（ｉ）それぞれ配列番号２０、２１、２２、２８、２９及び３０；（ｉｉ）それぞれ配列番号２３、２４、２２、３１、３２及び３３；又は（ｉｉｉ）それぞれ配列番号２５、２６、２７、３４、３２及び３０のアミノ酸配列を含むＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号５０、５３又は５５の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号５０、５３又は５５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号５０、５３又は５５のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４９、５１、５２、５４、５６又は５７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるｓｃＦｖを含む。
ある実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ、表３Ａ又は表５ＡにおけるＣＤ１９抗原結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ、表３Ａ又は表５ＡにおけるＣＤ１９抗原結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む。ある実施形態において、ＣＤ１９結合ドメインは、（ｉ）それぞれ配列番号３５、３６、３９、４０、４１及び４２；（ｉｉ）それぞれ配列番号３５、３７、３９、４０、４１及び４２；又は（ｉｉｉ）それぞれ配列番号３５、３８、３９、４０、４１及び４２のアミノ酸配列を含むＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４４又は４７の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４４又は４７と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４４又は４７のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４３、４５、４６又は４８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるｓｃＦｖを含む。
本明細書に開示されるＣＡＲ分子をコードする核酸のある実施形態において、第１の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％異なる。ある実施形態において、第１の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド又は全ヌクレオチドの違いを有する。
本明細書に開示されるＣＡＲ分子をコードする核酸のある実施形態において、第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％異なる。ある実施形態において、第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド又は全ヌクレオチドの違いを有する。
本明細書に開示されるＣＡＲ分子をコードする核酸のある実施形態において、第１の一次シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％異なる。ある実施形態において、第１の一次シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド又は全ヌクレオチドの違いを有する。
本明細書に開示されるＣＡＲ分子をコードする核酸配列のある態様において、ＣＡＲ分子は、配列番号１１、１５又は１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
ある態様において、本明細書に開示されるＣＡＲ分子は、配列番号１２又は１６のアミノ酸配列、それと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある態様において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸配列を含む細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）を提供し、前記ＣＡＲ分子は、
（ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインとを含む第１のＣＡＲ；及び
（ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む第２のＣＡＲ
を含み、
（ｉ）第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；
（ｉｉ）第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；及び／又は
（ｉｉｉ）第１の一次シグナル伝達ドメイン及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる。
一態様において、第１の一次シグナル伝達ドメイン及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号１０８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる。
別の態様において、本明細書には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）が提供され、前記ＣＡＲ分子は、
（ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインとを含む第１のＣＡＲ；及び
（ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む第２のＣＡＲ
を含み、
（ｉ）第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；
（ｉｉ）第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；及び／又は
（ｉｉｉ）第１の一次シグナル伝達ドメイン及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる。
ある実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）又はＮＫ細胞である。ある実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。
ある態様において、本明細書には、抗腫瘍免疫を提供する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の、本明細書に開示されるＣＡＲ分子、例えば本明細書に開示されるデュアルＣＡＲ分子を含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む方法が提供される。
別の態様において、本開示は、抗原（例えば、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２）に関連する疾患を有する対象を治療する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の、本明細書に開示されるＣＡＲ分子、例えば本明細書に開示されるデュアルＣＡＲ分子を含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む方法を提供する。
タンデムＣＡＲ
ある態様において、本開示は、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを提供する。
別の態様において、本明細書には、本明細書に記載される二重特異性抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。
更に別の態様において、本開示は、本明細書に記載される二重特異性抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を提供する。
本明細書に記載される二重特異性抗原結合ドメインの一部の実施形態、例えば二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲ又は二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸において、第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの上流に（例えば、Ｎ末端の向きに）あり得るか、又は第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの下流に（例えば、Ｃ末端の向きに）あり得る。
一部の実施形態において、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインの各々は、ｓｃＦｖ、例えば軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと重鎖可変（ＶＨ）ドメインとを含む。一部の実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、第１のＶＨ（ＶＨ１）と第１のＶＬ（ＶＬ１）とを含むｓｃＦｖを含む。一部の実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、第２のＶＨ（ＶＨ２）と第２のＶＬ（ＶＬ２）とを含むｓｃＦｖを含む。
一部の実施形態において、二重特異性抗原結合ドメインは、以下のＮ末端からＣ末端への構成：ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２；ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２；ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２；ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２、ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＬ１－ＶＨ１；ＶＬ２－ＶＨ２－ＶＬ１－ＶＨ１；ＶＨ２－ＶＬ２－ＶＨ１－ＶＬ１；又はＶＬ２－ＶＨ２－ＶＨ１－ＶＬ１のいずれか１つを有する。
ある態様において、二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、配列番号１の核酸配列によってコードされる。別の態様において、二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、配列番号３の核酸配列によってコードされる。
別の態様において、二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、配列番号５の核酸配列によってコードされる。
別の態様において、二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、配列番号８のアミノ酸配列を含み、配列番号７の核酸配列によってコードされる。
別の態様において、二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、配列番号９の核酸配列によってコードされる。
ある態様において、本開示は、本明細書に開示されるＣＡＲ分子をコードする核酸分子、本明細書に開示される二重特異性抗原結合ドメインをコードする核酸又は本明細書に開示される二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを提供する。
別の態様において、本明細書には、本明細書に開示されるＣＡＲ分子をコードする核酸を含む医薬組成物又は本明細書に開示されるＣＡＲ分子を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態において、この医薬組成物は、賦形剤、担体、希釈剤及び／又は安定剤を含む。
更に別の態様において、本開示は、本明細書に開示される二重特異性抗原結合ドメイン、本明細書に開示される二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲ又は本明細書に開示される二重特異性抗原結合ドメインをコードするＣＡＲ核酸を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、この医薬組成物は、賦形剤、担体、希釈剤及び／又は安定剤を含む。
ある態様において、本明細書には、抗腫瘍免疫を提供する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の、本明細書に開示されるＣＡＲ、例えば本明細書に開示されるタンデムＣＡＲを含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む方法が提供される。
別の態様において、本開示は、抗原（例えば、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２）に関連する疾患を有する対象を治療する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の、本明細書に開示されるＣＡＲ、例えば本明細書に開示されるタンデムＣＡＲを含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む方法を提供する。
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、又はルーチンに過ぎない実験を用いてそれを確かめることができるであろう。かかる均等物は、以下の実施形態の列挙に包含されることが意図される。
実施形態の列挙
１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子であって、前記ＣＡＲ分子は、
（ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ；及び
（ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲ
を含み、
（ｉ）第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；
（ｉｉ）第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；及び／又は
（ｉｉｉ）第１の一次シグナル伝達ドメイン及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる、核酸分子。
２．第１のＣＡＲは、
ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン及び第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；
ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン；及び第１の一次シグナル伝達ドメイン；又は
ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第１の一次シグナル伝達ドメイン
を含む、実施形態１の核酸分子。
３．第２のＣＡＲは、
ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；及び第２の共刺激シグナル伝達ドメイン；
ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；及び第２の一次シグナル伝達ドメイン；又は
ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び第２の一次シグナル伝達ドメイン
を含む、実施形態１又は２の核酸分子。
４．ＣＤ２２抗原結合ドメインは、
本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；及び／又は
本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）
を含む、前出の実施形態のいずれか１つの核酸分子。
５．ＣＤ２２抗原結合ドメインは、本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインのＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含む、実施形態４の核酸分子。
６．ＣＤ２２抗原結合ドメインは、配列番号２８、３１又は３４のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２９又は３２のＬＣ ＣＤＲ２；配列番号３０又は３３のＬＣ ＣＤＲ３；及び／又は配列番号２０、２３又は２５のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２又は配列番号２１、２４若しくは２６；配列番号２２又は２７のＨＣ ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態４又は５の核酸分子。
７．ＣＤ２２抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、本明細書に記載される、例えば表１Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインの軽鎖可変（ＶＬ）領域；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインの重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、実施形態４～６のいずれか１つの核酸分子。
８．ＣＤ２２抗原結合ドメインは、
表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＬ領域配列の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＬ領域配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；又は
表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＬ領域配列のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされるＶＬ領域
を含む、実施形態７の核酸分子。
９．ＣＤ２２抗原結合ドメインは、
表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＨ領域配列の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；
表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＨ領域配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；又は
表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＨ領域配列のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされるＶＨ領域
を含む、実施形態７又は８の核酸分子。
１０．ＣＤ２２抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬ領域は、リンカー、例えば本明細書に記載されるリンカー、例えば表４Ａに開示されるリンカーと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するリンカーによって結び付けられる、実施形態７～９のいずれか１つの核酸分子。
１１．ＣＤ２２抗原結合ドメインは、
表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号５０の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ；
表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号５０と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ；
表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号５０のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ；又は
表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４９又は５１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるｓｃＦｖ
を含む、前出の実施形態のいずれか１つの核酸分子。
１２．ＣＤ１９抗原結合ドメインは、
本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ、表３Ａ又は表５ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；及び／又は
本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ、表３Ａ又は表５ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）
を含む、前出の実施形態のいずれか１つの核酸分子。
１３．ＣＤ１９抗原結合ドメインは、本明細書に記載される、例えば表１Ａ又は表２ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインのＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含む、実施形態１２の核酸分子。
１４．ＣＤ１９抗原結合ドメインは、配列番号４０のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号４１のＬＣ ＣＤＲ２；及び配列番号４２のＬＣ ＣＤＲ３；及び／又は配列番号３５のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３６～３８のＨＣ ＣＤＲ２；及び配列番号３９のＨＣ ＣＤＲ３を含む、実施形態１２又は１３の核酸分子。
１５．ＣＤ１９抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表３Ａ又は表５ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインの軽鎖可変（ＶＬ）領域；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表３Ａ又は表５ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインの重鎖可変（ＶＨ）領域を含む、実施形態１２～１４のいずれか１つの核酸分子。
１６．ＣＤ１９抗原結合ドメインは、
表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＬ領域配列の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列；
表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＬ領域配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＬ領域配列のアミノ酸配列
を含むＶＬ領域を含む、実施形態１５の核酸分子。
１７．ＣＤ１９抗原結合ドメインは、
表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＨ領域配列の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列；
表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＨ領域配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＨ領域配列のアミノ酸配列
を含むＶＨ領域を含む、実施形態１５又は１６の核酸分子。
１８．ＣＤ１９抗原結合ドメインのＶＨ及びＶＬ領域は、リンカー、例えば本明細書に記載されるリンカー、例えば表４Ａに開示されるリンカーと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するリンカーで結び付けられる、実施形態１５～１７のいずれか１つの核酸分子。
１９．ＣＤ１９抗原結合ドメインは、
表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４４の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ；
表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ；
表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４４のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖ；又は
表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４３又は４８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるｓｃＦｖ
を含む、前出の実施形態のいずれか１つの核酸分子。
２０．第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
２１．第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列に対して１、２、３、４、５、６又は７個の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
２２．第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
２３．第１の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％異なる、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
２４．第１の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド又は全ヌクレオチドの違いを有する、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
２５．第１の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６４又は６６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列から選択される、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
２６．第２の膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６７又は６８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列から選択される、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
２７．第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
２８．第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して１、２、３、４又は５個の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
２９．第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
３０．第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％異なる、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
３１．第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド又は全ヌクレオチドの違いを有する、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
３２．第１の共刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６９又は７２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列から選択される、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
３３．第２の共刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７１又は７３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列から選択される、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
３４．第１の一次シグナル伝達ドメイン及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
３５．第１の一次シグナル伝達ドメイン及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
３６．第１の一次シグナル伝達ドメイン及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
３７．第１の一次シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％異なる、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
３８．第１の一次シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも１ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、３００ヌクレオチド又は全ヌクレオチドの違いを有する、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
３９．第１の一次シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７４又は７７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列から選択される、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
４０．第２の一次シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７６又は７８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列から選択される、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
４１．第１のＣＡＲ及び／又は第２のＣＡＲは、シグナルペプチド、例えば、一続き、例えば５～１６残基の疎水性アミノ酸を含むペプチドを含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
４２．シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチド、インターロイキン２シグナルペプチド、ヒトアルブミンシグナルペプチド、ヒトキモトリプシノーゲンシグナルペプチド、ヒトトリプシノーゲン－２シグナルペプチド又はＳｔｅｒｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ：Ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈａｓ ａ ｍａｊｏｒ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ”（２００７）に開示されている他の同様のシグナルペプチドから選択される、実施形態４１の核酸分子。
４３．シグナルペプチドは、
表４Ａに提供されるシグナルペプチドを含むか；
配列番号５９のアミノ酸を含むか、又は
配列番号５８、６０、６１、６２若しくは６３のいずれか１つの核酸又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する核酸によってコードされる、実施形態４１又は４２の核酸分子。
４４．５’から３’方向に第１のＣＡＲ、続いて第２のＣＡＲを含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
４５．５’から３’方向に第２のＣＡＲ、続いて第１のＣＡＲを含む、実施形態１～４３のいずれかの核酸分子。
４６．プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ切断部位）又は配列内リボソーム進入部位を更に含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
４７．プロテアーゼ切断部位は、Ｐ２Ａ部位である、実施形態４６の核酸分子。
４８．Ｐ２Ａ部位は、配列番号８６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；又は配列番号８５又は８７のヌクレオチド配列を含む、実施形態４６又は４７の核酸分子。
４９．プロテアーゼ切断部位又は配列内リボソーム進入部位は、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲとの間に位置している、実施形態４６～４８のいずれか１つの核酸分子。
５０．プロテアーゼ切断部位は、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲとを含む融合タンパク質を細胞が発現できるような位置にあり、任意選択で、融合タンパク質は、タンパク質分解切断によってプロセシングされて２つのペプチドになる、実施形態４６～４９のいずれか１つの核酸分子。
５１．ＣＡＲ分子は、配列番号１１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
５２．ＣＡＲ分子は、配列番号１３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む第１のＣＡＲと、配列番号１４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む第２のＣＡＲとを含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
５３．ＣＡＲ分子は、配列番号１２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
５４．ＣＡＲ分子は、配列番号１５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１～５０のいずれかの核酸分子。
５５．ＣＡＲ分子は、配列番号１７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む第１のＣＡＲと、配列番号１８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む第２のＣＡＲとを含む、実施形態１～５０又は５４のいずれか１つの核酸分子。
５６．ＣＡＲ分子は、配列番号１６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸をコードする核酸によってコードされる、実施形態１～５０又は５４又は５５のいずれか１つの核酸分子。
５７．ＣＡＲ分子は、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態１～５０のいずれかの核酸分子。
５８．ＣＡＲ分子は、配列番号１３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む第１のＣＡＲと、配列番号１４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む第２のＣＡＲとを含む、実施形態１～５０又は５７のいずれか１つの核酸分子。
５９．ＣＡＲ分子は、配列番号１２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む、実施形態１～５０又は５７又は５８のいずれか１つの核酸分子。
６０．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子であって、前記ＣＡＲ分子は、５’から３’の向きに、
（ａ）第１のシグナルペプチド；ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ；
（ｂ）Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位；
（ｃ）第２のシグナルペプチド；ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲ
を含み、
ＣＡＲ分子は、配列番号１１のヌクレオチド配列；又は配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされる、核酸分子。
６１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子であって、前記ＣＡＲ分子は、５’から３’の向きに、
（ａ）第２のシグナルペプチド；ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲ；
（ｂ）Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位；
（ｃ）第１のシグナルペプチド；ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ
を含み、
ＣＡＲ分子は、配列番号１５のヌクレオチド配列；又は配列番号１６のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされる、核酸分子。
６２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子であって、前記ＣＡＲ分子は、５’から３’の向きに、
（ａ）第１のシグナルペプチド；ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ；
（ｂ）Ｐ２Ａプロテアーゼ切断部位；
（ｃ）第２のシグナルペプチド；ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲ
を含み、
ＣＡＲ分子は、配列番号１９のヌクレオチド配列；又は配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされる、核酸分子。
６３．プロモーター配列、例えばＥＦ１プロモーターを更に含む、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
６４．第１のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と、第２のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とは、単一の核酸コンストラクトに置かれる、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
６５．第１のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と、第２のＣＡＲをコードする核酸とは、同じベクターに置かれる、実施形態６４の核酸分子。
６６．第１のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と、第２のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列とは、異なる核酸コンストラクトに置かれ、例えば、第１のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、第１の核酸コンストラクトに置かれ、且つ第２のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、第２の核酸コンストラクトに置かれる、前出の実施形態のいずれかの核酸分子。
６７．第１のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、第１のベクターに置かれる、実施形態６６の核酸分子。
６８．第２のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、第２のベクターに置かれる、実施形態６６の核酸分子。
６９．核酸分子は、ウイルスエレメント、例えば、ウイルスパッケージングエレメントを含む。
７０．実施形態１～６９のいずれかの核酸分子を含むベクター。
７１．ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択される、実施形態７０のベクター。
７２．実施形態７０又は７１のベクター又は実施形態１～６９のいずれかの核酸分子を含む細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）。
７３．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子を含む細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）であって、前記ＣＡＲ分子は、
（ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインとを含む第１のＣＡＲ；及び
（ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む第２のＣＡＲ
を含み、
（ｉ）第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；
（ｉｉ）第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；及び／又は
（ｉｉｉ）第１の一次シグナル伝達ドメイン及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のいずれか１つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる、細胞。
７４．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）であって、前記ＣＡＲ分子は、
（ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインとを含む第１のＣＡＲ；及び
（ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む第２のＣＡＲ
を含み、
（ｉ）第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；
（ｉｉ）第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；及び／又は
（ｉｉｉ）第１の一次シグナル伝達ドメイン及び第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる、細胞。
７５．ＣＡＲ分子をコードする核酸を含む、実施形態７４の細胞。
７６．実施形態１～６９のいずれかの核酸分子又は実施形態７０若しくは７１のベクターを含む、実施形態７３又は７５の細胞。
７７．（ａ）第１のシグナルペプチド；ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ；
（ｂ）第２のシグナルペプチド；ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲ
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む細胞であって、
ＣＡＲ分子は、配列番号１１のヌクレオチド配列によってコードされるか；又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、細胞。
７８．（ａ）第２のシグナルペプチド；ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲ；
（ｂ）第１のシグナルペプチド；ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む細胞であって、
ＣＡＲ分子は、配列番号１５のヌクレオチド配列によってコードされるか；又は配列番号１６のアミノ酸配列を含む、細胞。
７９．（ａ）第１のシグナルペプチド；ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ；
（ｂ）第２のシグナルペプチド；ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲ
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む細胞であって、
ＣＡＲ分子は、配列番号１９のヌクレオチド配列によってコードされるか；又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む、細胞。
８０．免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）又はＮＫ細胞である、実施形態７２～７９のいずれか１つの細胞。
８１．ヒト細胞である、実施形態７２～８０のいずれか１つの実施形態の細胞。
８２．細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）を作製する方法であって、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に、実施形態７０又は７１のベクターを形質導入することを含む方法。
８３．細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）を作製する方法であって、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に、実施形態１～６９のいずれか１つの核酸分子を導入することを含む方法。
８４．ＲＮＡが操作された細胞の集団を作成する方法であって、インビトロ転写されたＲＮＡ又は合成のＲＮＡを細胞に導入することを含み、ＲＮＡは、実施形態１～６９のいずれか１つの核酸分子を含む、方法。
８５．ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメイン。
８６．第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの上流に（例えば、Ｎ末端の向きに）あり得るか、又は第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの下流に（例えば、Ｃ末端の向きに）あり得る、実施形態８５の二重特異性抗原結合ドメイン。
８７．第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインの各々は、ｓｃＦｖ、例えば軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと重鎖可変（ＶＨ）ドメインとを含む、実施形態８５又は８６の二重特異性抗原結合ドメイン。
８８．ＶＨは、ＶＬの上流又は下流にあり得る、実施形態８７の二重特異性抗原結合ドメイン。
８９．第１の抗原結合ドメインは、第１のＶＨ（ＶＨ１）と第１のＶＬ（ＶＬ１）とを含むｓｃＦｖを含む、実施形態８７又は８８の二重特異性抗原結合ドメイン。
９０．第２の抗原結合ドメインは、第２のＶＨ（ＶＨ２）と第２のＶＬ（ＶＬ２）とを含むｓｃＦｖを含む、実施形態８７～８９のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
９１．第１の抗原結合ドメインは、ＶＨ１をＶＬ１の上流に含んで配列される、実施形態８７～９０のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
９２．第１の抗原結合ドメインは、ＶＬ１をＶＨ１の上流に含んで配列される、実施形態８７～９０のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
９３．第２の抗原結合ドメインは、ＶＨ２をＶＬ２の上流に含んで配列される、実施形態８７～９２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
９４．第２の抗原結合ドメインは、ＶＬ２をＶＨ２の上流に含んで配列される、実施形態８７～９２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
９５．抗原結合ドメインは、以下のＮ末端からＣ末端への構成：ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２を有する、実施形態８７～９０又は９２～９３のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
９６．抗原結合ドメインは、以下のＮ末端からＣ末端への構成：ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２を有する、実施形態８７～９０、９１又は９３のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
９７．抗原結合ドメインは、以下のＮ末端からＣ末端への構成：ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２を有する、実施形態８７～９０、９２又は９４のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
９８．抗原結合ドメインは、以下のＮ末端からＣ末端への構成：ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２を有する、実施形態８７～９０、９１又は９４のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
９９．リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれる、実施形態８５～９８のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
１００．リンカーは、第１の抗原結合ドメインのｓｃＦｖと第２の抗原結合ドメインのｓｃＦｖとの間に置かれる、実施形態９９の二重特異性抗原結合ドメイン。
１０１．リンカーは、
コンストラクトがＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２の構成を有する場合、ＶＨ１とＶＨ２との間；
コンストラクトがＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２の構成を有する場合、ＶＬ１とＶＨ２との間；
コンストラクトがＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２の構成を有する場合、ＶＨ１とＶＬ２との間；又は
コンストラクトがＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２の構成を有する場合、ＶＬ１とＶＬ２との間
に置かれる、実施形態１００の二重特異性抗原結合ドメイン。
１０２．リンカーは、２つのｓｃＦｖのドメイン間での誤った対合を回避するのに十分に長い、実施形態９９～１０１のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
１０３．リンカーは、本明細書に記載されるリンカー、例えば表１Ａ又は表４Ａに提供されるリンカーである、実施形態９９～１０２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
１０４．リンカーは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５又は６である）である、実施形態９９～１０３のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
１０５．ｎ＝１であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４－Ｓｅｒを有する、実施形態１０４の二重特異性抗原結合ドメイン。
１０６．ｎ＝３であり、例えば配列番号８２である、実施形態１０４の二重特異性抗原結合ドメイン。
１０７．リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫ、例えば配列番号８０を含む、実施形態９９～１０３のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
１０８．リンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーは、第１の抗原結合ドメインのｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に置かれる、実施形態９９～１０７のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
１０９．リンカー、例えば本明細書に記載されるリンカーは、第２の抗原結合ドメインのｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に置かれる、実施形態９９～１０８のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
１１０．表１Ａ又は表４Ａに提供される抗原結合ドメインのアミノ酸配列、例えば配列番号２、４、６、８、１０、４４、４７、５３若しくは５５のいずれか１つ又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９９～１０９のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
１１２．表１Ａ又は表４ａに提供される抗原結合ドメインのヌクレオチド配列、例えば配列番号１、３、５、７、９、４３、４５、４６、５２、５４、５６若しくは５７のいずれか１つ又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態９９～１０９のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン。
１１３．実施形態８５～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメインを含む、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
１１４．二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸コンストラクトであって、実施形態８５～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメインをコードする核酸コンストラクト。
１１５．ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン及びＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む二重特異性抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲ。
１１６．実施形態８６～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメインを含む、実施形態１１５のＣＡＲ。
１１７．二重特異性抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；及び共刺激シグナル伝達ドメイン；
二重特異性抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；及び一次シグナル伝達ドメイン；又は
二重特異性抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；共刺激シグナル伝達ドメイン；及び第１の一次シグナル伝達ドメイン
を含む、実施形態１１５又は１１６のＣＡＲ。
１１８．ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４から選択される、実施形態１１５～１１７のいずれか１つのＣＡＲ。
１１９．二重特異性抗原結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば本明細書に記載されるヒンジ領域によって膜貫通ドメインに結び付けられる、実施形態１１８のＣＡＲ。
１２０．ＣＡＲは、共刺激ドメインを含み、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１１５～１１９のいずれか１つのＣＡＲ。
１２１．共刺激ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１１５～１２０のいずれか１つのＣＡＲ。
１２２．ＣＡＲは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含む一次シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１１５～１２１のいずれか１つのＣＡＲ。
１２３．ＣＡＲは、表４Ａに提供されるアミノ酸配列、例えば配列番号２、４、６、８、１０のいずれか１つ又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１１５～１２２のいずれか１つのＣＡＲ。
１２４．ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ｉ）第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖであり；
（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインの上流に向いており；及び
（ｉｉｉ）リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれ、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み、
ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＡＲ。
１２５．ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ｉ）第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖであり；
（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの上流に向いており；及び
（ｉｉｉ）リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれ、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み、
ＣＡＲは、配列番号４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＡＲ。
１２６．ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ｉ）第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖであり；
（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの上流に向いており；及び
（ｉｉｉ）リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれ、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み、
ＣＡＲは、配列番号６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＡＲ。
１２７．ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ｉ）第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖであり；
（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの上流に向いており；及び
（ｉｉｉ）リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれ、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み、
ＣＡＲは、配列番号８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＡＲ。
１２８．ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ｉ）第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖであり；
（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの上流に向いており；及び
（ｉｉｉ）リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれ、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み、
ＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＡＲ。
１２９．キメラ抗原受容体をコードする核酸（ＣＡＲ核酸）であって、ＣＡＲは、
ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン及びＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む二重特異性抗原結合ドメインを含み、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲ核酸。
１３０．実施形態８６～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメインをコードする核酸を含む、実施形態１２９のＣＡＲ核酸。
１３１．ＣＡＲは、
二重特異性抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；及び共刺激シグナル伝達ドメイン；
二重特異性抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；及び一次シグナル伝達ドメイン；又は
二重特異性抗原結合ドメイン；膜貫通ドメイン；共刺激シグナル伝達ドメイン；及び第１の一次シグナル伝達ドメイン
を含む、実施形態１２９又は１３０のＣＡＲ核酸。
１３２．ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα、β若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４から選択される、実施形態１２９～１３１のいずれか１つのＣＡＲ核酸。
１３３．二重特異性抗原結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば本明細書に記載されるヒンジ領域によって膜貫通ドメインに結び付けられる、実施形態１３２のＣＡＲ核酸。
１３４．ＣＡＲは、共刺激ドメインを含み、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１２９～１３３のいずれか１つのＣＡＲ核酸。
１３５．共刺激ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む、実施形態１３４のＣＡＲ核酸。
１３６．ＣＡＲは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含む一次シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１２９～１３５のいずれか１つのＣＡＲ核酸。
１３７．表４Ａに提供されるヌクレオチド配列、例えば配列番号１、３、５、７若しくは９のいずれか１つ又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１２９～１３６のいずれか１つのＣＡＲ核酸。
１３８．キメラ抗原受容体をコードする核酸（ＣＡＲ核酸）であって、ＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含み、
（ｉ）第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖであり；
（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインの上流に向いており；及び
（ｉｉｉ）リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれ、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み、
ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＡＲ核酸。
１３９．キメラ抗原受容体をコードする核酸（ＣＡＲ核酸）であって、ＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含み、
（ｉ）第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖであり；
（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの上流に向いており；及び
（ｉｉｉ）リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれ、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み、
ＣＡＲは、配列番号４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＡＲ核酸。
１４０．キメラ抗原受容体をコードする核酸（ＣＡＲ核酸）であって、ＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含み、
（ｉ）第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖであり；
（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの上流に向いており；及び
（ｉｉｉ）リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれ、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み、
ＣＡＲは、配列番号６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％。８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＡＲ核酸。
１４１．キメラ抗原受容体をコードする核酸（ＣＡＲ核酸）であって、ＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含み、
（ｉ）第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖであり；
（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの上流に向いており；及び
（ｉｉｉ）リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれ、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み、
ＣＡＲは、配列番号８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＡＲ核酸。
１４２．キメラ抗原受容体をコードする核酸（ＣＡＲ核酸）であって、ＣＡＲは、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含み、
（ｉ）第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれｓｃＦｖであり；
（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインの上流に向いており；及び
（ｉｉｉ）リンカーは、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に置かれ、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含み、
ＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、ＣＡＲ核酸。
１４３．実施形態８５～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン、実施形態１１３若しくは１１５～１２８のいずれか１つのＣＡＲ又は実施形態１１４若しくは１２９～１４２のいずれか１つのＣＡＲ核酸を含むベクター。
１４４．実施形態８５～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン、実施形態１１３若しくは１１５～１２８のいずれか１つのＣＡＲ、実施形態１１４若しくは１２９～１４２のいずれか１つのＣＡＲ核酸又は実施形態１４３のベクターを含む細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）。
１４５．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞であって、ＣＡＲは、
ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン及びＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む二重特異性抗原結合ドメインを含み、
ＣＡＲは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び／又は一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞。
１４６．実施形態１１６～１２３のいずれか１つのＣＡＲを含む、実施形態１４５の細胞。
１４７．細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）を作製する方法であって、
免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に実施形態１４３のベクターを形質導入すること；又は
免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に実施形態１２９～１４２のいずれか１つのＣＡＲ核酸分子を導入すること
を含む方法。
１４８．実施形態１～６９のいずれか１つのＣＡＲ分子、実施形態８５～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン、実施形態１１３若しくは１１５～１２８のいずれか１つのＣＡＲ又は実施形態１１４若しくは１２９～１４２のいずれか１つのＣＡＲ核酸をコードする核酸を含む医薬組成物であって、任意選択で、賦形剤、担体、希釈剤及び／又は安定剤を含む医薬組成物。
１４９．抗腫瘍免疫を提供する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の、実施形態１～６９のいずれか１つのＣＡＲ分子、実施形態８５～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン、実施形態１１３若しくは１１５～１２８のいずれか１つのＣＡＲ又は実施形態１１４若しくは１２９～１４２のいずれか１つのＣＡＲ核酸をコードする核酸を含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む方法。
１５０．対象に抗腫瘍免疫を提供する方法における使用のための、実施形態１～６９のいずれか１つのＣＡＲ分子、実施形態８５～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン、実施形態１１３若しくは１１５～１２８のいずれか１つのＣＡＲ又は実施形態１１４若しくは１２９～１４２のいずれか１つのＣＡＲ核酸をコードする核酸を含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団。
１５１．細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である、実施形態１４９の方法又は実施形態１５０の使用。
１５２．細胞は、自己細胞又は同種異系細胞である、実施形態１４９又は１５１の方法又は実施形態１５０又は１５１の使用。
１５３．対象は、ヒトである、実施形態１４９の方法又は実施形態１５０の使用。
１５４．抗原（例えば、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２）に関連する疾患を有する対象を治療する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の、実施形態１～６９のいずれか１つのＣＡＲ分子、実施形態８５～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン、実施形態１１３若しくは１１５～１２８のいずれか１つのＣＡＲ又は実施形態１１４若しくは１２９～１４２のいずれか１つのＣＡＲ核酸をコードする核酸を含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む方法。
１５５．抗原（例えば、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２）に関連する疾患を有する対象を治療する方法における使用のための、実施形態１～６９のいずれか１つのＣＡＲ分子、実施形態８５～１１２のいずれか１つの二重特異性抗原結合ドメイン、実施形態１１３若しくは１１５～１２８のいずれか１つのＣＡＲ又は実施形態１１４若しくは１２９～１４２のいずれか１つのＣＡＲ核酸をコードする核酸を含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団。
１５６．細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である、実施形態１５４の方法又は実施形態１５５の使用。
１５７．細胞は、自己細胞又は同種異系細胞である、実施形態１５４又は１５５の方法又は実施形態１５４又は１５５の使用。
１５８．対象は、ヒトである、実施形態１５４の方法又は実施形態１５５の使用。
１５９．ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２に関連する疾患は、増殖性疾患、例えば癌又は悪性腫瘍、前癌病態、例えば骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病又はＣＤ１９及び／若しくはＣＤ２２の発現に関連する非癌関連適応疾患から選択される、実施形態１５４若しくは１５５～１５８のいずれか１つの方法又は実施形態１５５～１５８のいずれか１つの使用。
１６０．疾患は、癌、例えば血液癌である、実施形態１５９の方法又は使用。
１６１．疾患は、Ｂ細胞悪性腫瘍である、実施形態１５４若しくは１５５～１６０のいずれか１つの方法又は実施形態１５５～１６０のいずれか１つの使用。
１６２．血液癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＢＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常若しくは骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病又はこれらの組み合わせから選択される、実施形態１６０又は１６１の方法又は使用。
１６３．対象に、
ＣＡＲ分子を発現する細胞の有効性を増加させる薬剤；
ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与に伴う１つ以上の副作用を改善する薬剤；又は
ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２に関連する疾患を治療する薬剤
を投与することを含む、実施形態１５４若しくは１５５～１６２のいずれか１つの方法又は実施形態１５５～１６２のいずれか１つの使用。
本明細書に開示されるデュアルＣＡＲコンストラクトの概略図である。これらのデュアルＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ２２ ＣＡＲとＣＤ１９ ＣＡＲとを含む。図１Ａは、Ｎ末端からＣ末端にＣＤ２２ ＣＡＲ、続いてＣＤ１９ ＣＡＲを含むデュアルＣＡＲコンストラクトを示す。図１Ｂは、Ｎ末端からＣ末端にＣＤ２２ ＣＡＲ、続いてＣＤ１９ ＣＡＲを含む異なるデュアルＣＡＲコンストラクトを示す。図１Ｃは、Ｎ末端からＣ末端にＣＤ１９ ＣＡＲ、続いてＣＤ２２ ＣＡＲを含むデュアルＣＡＲコンストラクトを示す。 本開示のタンデムＣＤ１９／ＣＤ２２ ＣＡＲコンストラクトの概略図である。各タンデムＣＡＲは、ＣＤ１９抗原結合ドメインとＣＤ２２抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含む。 ＣＤ１９及びＣＤ２２を標的化するタンデム及びデュアルＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ活性を示す。図３Ａは、ＣＤ２２陰性ＡＬＬ細胞株（ＣＤ２２ＫＯ Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃ）に対する様々なコンストラクトの細胞溶解活性（細胞死滅）を描くグラフである。図３Ｂは、ＣＤ１９陰性ＡＬＬ細胞株（ＣＤ１９ＫＯ Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃ）に対する様々なコンストラクトの細胞溶解活性（細胞死滅）を描くグラフである。図３Ｃ～図３Ｄは、ＣＤ２２及び／又はＣＤ１９を発現する標的細胞に応答した様々なＣＡＲコンストラクトによるＩＦＮｇサイトカイン産生を示すグラフである。 Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病異種移植片再発モデルにおけるＣＤ１９及びＣＤ２２を標的化するタンデム及びデュアルＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ活性を示す。図４Ａは、全ての治療群についての全フラックス（平均生物発光）を示すグラフである。図４Ｂは、様々なＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大動態を描くグラフである。 活性化プロセスによって製造したＣＤ１９及びＣＤ２２を標的化するＣＡＲ１９＋、ＣＡＲ２２＋及びダブルポジティブＣＡＲ Ｔ細胞の割合についてのフローサイトメトリー分析を示す。図５Ａ及び図５Ｂは、それぞれ回収後７２時間及び回収後１４４時間の小規模製造プロセスによる結果を描く。図５Ｃは、大規模製造プロセスによる結果を描く。 Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病異種移植モデルにおけるＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を標的化するモノ及びデュアルＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ活性を示す。図６Ａは、全ての治療群についての全フラックス（平均生物発光）を示すグラフである。図６Ｂは、０．３×１０６（０．３ｅ６）用量群の直接比較を示す。図６Ｃは、血液２０μｌ当たりのＣＡＲ＋細胞数（ＣＡＲ－Ｔ細胞数、ｎＣＡＲｔｏｔ）として示される、様々なＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大動態を描くグラフである。
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つ又は１つより多い（即ち少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
用語「約」は、量、時間的な継続期間などの計測可能な値を参照するとき、指定される値から±２０％又は一部の例では±１０％、又は一部の例では±５％、又は一部の例では±１％、又は一部の例では±０．１％の変動が、かかる変動が本開示の方法の実施に適切であるものとして包含されることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な塩」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応などを伴うことなく対象の組織と接触して使用するのに好適な、且つ合理的なリスク対効果比に見合った塩を指す。薬学的に許容可能な塩は、当技術分野において周知である。例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．が、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１－１９に薬学的に許容可能な塩について詳細に記載している。
用語「キメラ抗原受容体」、「ＣＡＲ」又は「ＣＡＲ分子」は、免疫エフェクター細胞中にあるとき、標的細胞、典型的には癌細胞への特異性、及び細胞内シグナル生成をその細胞に付与するポリペプチドの組、最も単純な実施形態では典型的に２つを指す。一部の実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下に定義するとおりの刺激分子及び／又は共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）とを含む。一部の態様において、ポリペプチドの組は互いに連続していて、例えば同じポリペプチド鎖内にあり、例えばキメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドの組は互いに連続しておらず、例えば異なるポリペプチド鎖にある。一部の実施形態において、ポリペプチドの組は、二量化分子が存在したときにそれらのポリペプチドを互いにカップリングすることのできる、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングすることのできる二量化スイッチを含む。一態様において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するζ鎖である。一態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義するとおりの少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能性シグナル伝達ドメインを更に含む。一態様において、共刺激分子は、本明細書に記載される共刺激分子、例えば４－１ＢＢ（即ちＣＤ１３７）、ＣＤ２７及び／又はＣＤ２８から選択される。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能性シグナル伝達ドメイン及び刺激分子に由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒ）に任意選択のリーダー配列を含む。一態様において、ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を更に含み、ここで、リーダー配列は、任意選択により、細胞プロセシング及びＣＡＲの細胞膜局在化の間に抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切断される。
用語「シグナル伝達ドメイン」は、二次メッセンジャーを生成するか、又はかかるメッセンジャーに応答してエフェクターとして機能することにより、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するよう細胞内で情報を伝えることにより機能するタンパク質の中の機能性の一部分を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ１９」は、白血病前駆細胞上に検出可能な抗原決定基である分化クラスター１９タンパク質を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５３９１として見付けることができ、ヒトＣＤ１９をコードする核酸配列は受託番号ＮＭ＿００１１７８０９８で見付けることができる。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病及び非ホジキンリンパ腫を含むほとんどのＢ細胞系列癌に発現する。ＣＤ１９を発現する他の細胞は、以下の「ＣＤ１９の発現に関連する疾患」の定義に提供する。これは、Ｂ細胞前駆細胞の初期マーカーでもある。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）を参照されたい。一態様において、ＣＡＲＴの抗原結合部分はＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ１９タンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ１９」には、完全長野生型ＣＤ１９の突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤ２２」は、白血病前駆細胞上に検出可能であることが公知の抗原決定基を指す。ヒト及びマウスアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公開データベースに見付けることができる。例えば、アイソフォーム１～５ヒトＣＤ２２のアミノ酸配列は、それぞれ受託番号ＮＰ ００１７６２．２、ＮＰ ００１１７２０２８．１、ＮＰ ００１１７２０２９．１、ＮＰ ００１１７２０３０．１、及びＮＰ ００１２６５３４６．１で見付けることができ、ヒトＣＤ２２の変異体１～５をコードする核酸配列は、それぞれ受託番号ＮＭ ００１７７１．３、ＮＭ ００１１８５０９９．１、ＮＭ ００１１８５１００．１、ＮＭ ００１１８５１０１．１、及びＮＭ ００１２７８４１７．１で見付けることができる。一態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ２２タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。一態様において、ＣＤ２２タンパク質は癌細胞上に発現する。本明細書で使用されるとき、「ＣＤ２２」には、完全長野生型ＣＤ２２の突然変異、例えば点突然変異、断片、挿入、欠失及びスプライス変異を含むタンパク質が含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「結合ドメイン」（例えば、「ＣＤ２０結合ドメイン」）は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えばその免疫グロブリン鎖又は断片を指す。用語「結合ドメイン」（本明細書では「抗体分子」とも称される）又は「抗体分子」は、抗体及び抗体断片を包含する。ある実施形態において、抗体分子は多重特異性抗体分子であり、例えば、これは、複数個の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、ここで、複数個のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数個のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態において、多重特異性抗体分子は二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は２つ以下の抗原に対して特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列及び第２のエピトープに対して結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。
用語「抗体断片」は、抗原のエピトープと（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持している抗体の少なくとも一部分を指す。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、ｓｄＡｂなどのシングルドメイン抗体（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片などの抗体断片で形成される多重特異性抗体、及び抗体の単離ＣＤＲ又は他のエピトープ結合断片が挙げられる。抗原結合断片は、シングルドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ及びビス－ｓｃＦｖにも取り込まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６，２００５を参照されたい）。抗原結合断片は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドをベースとする足場にもグラフトされ得る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディについて記載している米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質を指し、軽鎖及び重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば短い可動性ポリペプチドリンカーによって近接して連結されており、単鎖ポリペプチドとして発現することが可能であり、及びｓｃＦｖは、その由来であるインタクトな抗体の特異性を保持している。指定されない限り、本明細書で使用されるとき、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域を例えばポリペプチドのＮ端側及びＣ端側末端に対していずれの順序でも有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含み得るか又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。
用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、本明細書で使用されるとき、抗原特異性及び結合親和性を付与する抗体可変領域内にあるアミノ酸の配列を指す。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」付番スキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番スキーム）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）付番（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２－１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５－７７（２００３）（「ＩＭＧＴ」付番スキーム）に記載されるものを含め、幾つもの周知のスキームのいずれかを用いて決定することができる。例えば、古典的フォーマットについて、Ｋａｂａｔに基づき、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基は３１～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され；及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基は２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｃｈｏｔｈｉａに基づき、ＶＨのＣＤＲアミノ酸は２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５２～５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され；及びＶＬのアミノ酸残基は２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）並びにヒトＶＬのアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）からなる。ＩＭＧＴに基づき、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は約２６～３５（ＣＤＲ１）、５１～５７（ＣＤＲ２）及び９３～１０２（ＣＤＲ３）と付番され、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は約２７～３２（ＣＤＲ１）、５０～５２（ＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＣＤＲ３）と付番される（「ＩＭＧＴ」に係る付番）。ＩＭＧＴに基づき、抗体のＣＤＲ領域はプログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎを用いて決定することができる。
抗体又はその抗体断片を含む本発明のＣＡＲの一部分は、種々の形態で存在し得、抗原結合ドメインは、例えば、シングルドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体又は二重特異性抗体を含め、連続したポリペプチド鎖の一部として発現する（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。一態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。更なる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。
用語「抗体重鎖」は、その天然に存在するコンホメーションをとる抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の大きい方を指し、通常、これが抗体の属するクラスを決定する。
用語「抗体軽鎖」は、その天然に存在するコンホメーションをとる抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の小さい方を指す。カッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖が２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
用語「組換え抗体」は、例えば、バクテリオファージ又は酵母発現システムによって発現される抗体など、組換えＤＮＡ技術を用いて作成される抗体を指す。この用語は、抗体をコードするＤＮＡ分子であって、抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子、又はその抗体を指定するアミノ酸配列の合成によって作成された抗体を意味するとも解釈されるべきであり、ＤＮＡ又はアミノ酸配列は、当技術分野において利用可能な周知の組換えＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。
用語「抗原」又は「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答には、抗体産生、又は特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか又は両方が含まれ得る。当業者は、任意の巨大分子が、事実上あらゆるタンパク質又はペプチドを含め、抗原となり得ることを理解するであろう。更に、抗原は、組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、従って、免疫応答を生じさせるタンパク質をコードする核酸配列又は部分的核酸配列を含む任意のＤＮＡが、その用語が本明細書において使用されるとおりの「抗原」をコードすることを理解するであろう。更に、当業者は、抗原がある遺伝子の完全長核酸配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明には、限定されないが、２つ以上の遺伝子の部分的核酸配列の使用が含まれること、及びそれらの核酸配列が所望の免疫応答を生じさせるポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配列されることが容易に明らかである。更に、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は、合成して作成され得、又は生体試料から得られ得、又はポリペプチド以外の巨大分子である可能性もあることが容易に明らかである。かかる生体試料には、限定されないが、組織試料、腫瘍試料、細胞又は体液が他の生物学的成分と共に含まれ得る。
用語「抗癌効果」は、限定されないが、例えば腫瘍容積の減少、癌細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、癌細胞増殖の減少、癌細胞生存の減少、又は癌性病態に関連する様々な生理学的症状の改善を含め、様々な手段によって明らかになり得る生物学的効果を指す。「抗癌効果」は、そもそも癌の発生を防ぐことにおける本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体の能力によっても明らかになり得る。用語「抗腫瘍効果」は、限定されないが、例えば腫瘍容積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、又は腫瘍細胞生存の減少を含め、様々な手段によって明らかになり得る生物学的効果を指す。用語「自己」は、同じ個体に由来する任意の材料であって、後にその個体に再導入されることになる材料を指す。
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系であると言われる。一部の態様において、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。
用語「異種」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
用語「併用」は、１つの投薬量単位形態での固定的併用、又は本発明の化合物及び併用パートナー（例えば、以下に説明するとおりの別の薬物、「治療剤」又は「共薬剤」とも称される）が独立して同じ時点で又は時間間隔内に別々に投与され得る併用投与、特にこれらの時間間隔によって併用パートナーが協同効果、例えば相乗効果を示すことが可能になる併用投与のいずれかを指す。単一の成分がキットに又は別々に包装され得る。成分（例えば、粉末又は液体）の一方又は両方が投与前に所望の用量に再構成又は希釈され得る。用語「共投与」又は「併用投与」などは、本明細書で利用されるとき、それを必要としている単一の対象（例えば、患者）への選択の併用パートナーの投与を包含することが意味され、薬剤が必ずしも同じ投与経路によって又は同じ時点で投与されない治療レジメンを含むことが意図される。用語「医薬併用」は、本明細書で使用されるとき、２つ以上の治療剤を混合し又は組み合わせることにより得られる生成物を意味し、治療剤の固定的組み合わせ及び非固定的組み合わせの両方を含む。用語「固定的組み合わせ」は、治療剤、例えば本発明の化合物と併用パートナーとが両方とも単一の実体又は投薬量の形態で同時に患者に投与されることを意味する。用語「非固定的組み合わせ」は、治療剤、例えば本発明の化合物と併用パートナーとが両方とも別個の実体として特定の時間制限なしに同時に、並行して、又は代わりに逐次的に患者に投与されることを意味し、かかる投与は、患者の体内において２つの化合物の治療上有効なレベルを提供する。後者は、カクテル療法、例えば３つ以上の治療剤の投与にも適用される。
用語「癌」は、異常細胞の急激な無制御の成長によって特徴付けられる疾患を指す。癌細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を通じて体の他の部位に広がり得る。様々な癌の例が本明細書に記載され、限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられる。用語「腫瘍」及び「癌」は、本明細書では同義的に使用され、例えば両方の用語とも固形及び液性、例えば腫瘍を包含する。本明細書で使用されるとき、用語「癌」又は「腫瘍」は、前癌性並びに悪性の癌及び腫瘍を含む。
本明細書で使用されるとおりの語句「ＣＤ２２の発現に関連する疾患」には、限定はされないが、例えば、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態を含めた、ＣＤ２２（例えば、野生型又は突然変異体ＣＤ２２）の発現に関連する疾患又はＣＤ２２（例えば、野生型又は突然変異体ＣＤ２２）を発現する、又はいずれかの時点で発現した細胞に関連する病態；又はＣＤ２２（例えば、野生型又は突然変異体ＣＤ２２）を発現する細胞に関連する非癌関連徴候が含まれる。誤解を避けるため、ＣＤ２２の発現に関連する疾患には、例えば、ＣＤ２２を標的とする分子、例えばＣＤ２２ ＣＡＲによる治療によって例えばＣＤ２２発現が下方制御されているため現在はＣＤ２２を発現しないが、かつてはＣＤ２２を発現した細胞に関連する病態が含まれ得る。一態様において、ＣＤ２２の発現に関連する癌は血液癌である。一態様において、血液癌には、限定はされないが、ＡＭＬ、骨髄異形成症候群、ＡＬＬ、ヘアリー細胞白血病、前リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物などが含まれる。更に、ＣＤ２２発現の発現に関連する疾患には、限定はされないが、例えば、ＣＤ２２の発現に関連する非定型の及び／又は非古典的な癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患が含まれる。ＣＤ２２の発現に関連する非癌関連徴候も含まれ得る。一部の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ２２ Ｍｒｎａを発現するか又はいずれかの時点で発現した。ある実施形態において、ＣＤ２２発現細胞はＣＤ２２タンパク質（例えば、野生型又は突然変異体）を産生し、ＣＤ２２タンパク質は、正常レベル又は低いレベルで存在し得る。ある実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、一時点で検出可能なレベルのＣＤ２２タンパク質を産生したが、続いて実質的に検出可能なＣＤ２２タンパク質を産生しなくなった。
語句「ＣＤ１９の発現に関連する疾患」には、限定されないが、例えば癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態を含めた、ＣＤ１９（例えば、野生型又は変異体ＣＤ１９）の発現に関連する疾患又はＣＤ１９（例えば、野生型又は変異体ＣＤ１９）を発現するか若しくはいずれかの時点で発現した細胞に関連する病態又はＣＤ１９を発現する細胞に関連する非癌関連徴候が含まれる。誤解を避けるため、ＣＤ１９の発現に関連する疾患には、例えば、ＣＤ１９を標的とする分子、例えばＣＤ１９ ＣＡＲによる治療によって例えばＣＤ１９発現が下方制御されているため、現在ではＣＤ１９を発現しないが、かつてはＣＤ１９を発現した細胞に関連する病態が含まれ得る。一態様において、ＣＤ１９の発現に関連する癌は、血液癌である。一態様において、血液癌は、白血病又はリンパ腫である。一態様において、ＣＤ１９の発現に関連する癌には、限定されないが、例えばＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を例えば含むが、それに限定されない１つ以上の急性白血病、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を例えば含むが、それに限定されない１つ以上の慢性白血病を含めた癌及び悪性腫瘍が含まれる。ＣＤ１９の発現に関連する更なる癌又は血液学的病態は、限定されないが、例えばＢ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）によってまとめられる様々な血液学的病態の群である「前白血病」などを含む。更に、ＣＤ１９発現の発現に関連する疾患には、限定されないが、例えばＣＤ１９の発現に関連する非定型の及び／又は非古典的な癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患が含まれる。ＣＤ１９の発現に関連する非癌関連徴候には、限定されないが、例えば自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）及び移植が含まれる。一部の実施形態において、ＣＤ１９発現細胞は、ＣＤ１９ Ｍｒｎａを発現するか、又はいずれかの時点で発現した。ある実施形態において、ＣＤ１９発現細胞は、ＣＤ１９タンパク質（例えば、野生型又は突然変異体）を産生し、ＣＤ１９タンパク質は、正常レベル又は低下したレベルで存在し得る。ある実施形態において、ＣＤ１９発現細胞は、一時的に検出可能なレベルのＣＤ１９タンパク質を産生したが、続いて検出可能なＣＤ１９タンパク質を実質的に産生しなくなった。
本明細書で使用されるとき、特に指定されない限り、用語「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、対象が病態又は病態の再発を被り始める前に行われる行為を指す。予防は、病態の完全な予防が得られなくてもよく；この用語には、病態若しくは病態の症状の部分的予防若しくは低減又は病態の発症リスクの低減が包含される。
「併用して」投与されるとは、本明細書で使用されるとき、障害を伴う対象の病気の経過中に対象に２つの（又はそれより多い）異なる治療が送達され、例えば、対象が障害の診断を受けた後、且つ障害が治癒し若しくは消失する前又は他の理由で治療を中止する前に２つ以上の治療が送達されることを意味する。一部の実施形態では、一方の治療の送達が第２の送達の開始時になおも行われているため、投与の点で重複があることになる。これは時に、本明細書では「同時」又は「並行送達」と称される。他の実施形態では、一方の治療の送達が他方の治療の送達の開始前に終わっている。いずれの場合の一部の実施形態でも、併用投与が理由で治療は有効性が高くなる。例えば、第１の治療なしに第２の治療が投与されたならば見られたであろうものと比べて第２の治療の有効性が高くなり、例えば、第２の治療を減らしても均等な効果が見られるか若しくは第２の治療が症状を低減する程度が大きくなるか、又は第１の治療でも同様の状況が見られる。一部の実施形態において、送達は、症状又は障害に関連する他のパラメータの低減が、一方の治療を他方なしに送達したならば観察されたであろうものよりも大きくなるような送達である。２つの治療の効果は、部分的に相加的であることも、全面的に相加的であることも又は相加より大きいこともある。送達は、第１の治療が送達される効果が第２の送達時になおも検出可能であるような送達である。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞が、本明細書に記載される用量及び／又は投薬スケジュールで投与され、及びＢ細胞阻害薬又はＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤が、本明細書に記載される用量及び／又は投薬スケジュールで投与される。
「～に由来する」とは、本明細書においてこの用語が使用されるとき、第１の分子と第２の分子との間の関係を指示している。これは、概して、第１の分子と第２の分子との間の構造的類似性を指し、第２の分子に由来する第１の分子に関するプロセス又は供給源の限定を含意又は包含するものではない。例えば、ＣＤ３ζ分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインの場合、この細胞内シグナル伝達ドメインは、要求される機能、即ち適切な条件下でシグナルを生成する能力をそれが有するように、十分なＣＤ３ζ構造を保持している。これは、細胞内シグナル伝達ドメインを作製する特定のプロセスに限定することを含意又は包含するものではなく、例えばこれは、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ζ配列から出発して、望ましくない配列を欠失させるか、又は突然変異を課さなければ細胞内シグナル伝達ドメインに到達しないことを意味するものではない。
用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含む抗体又は抗体断片の結合特性が大きい影響又は変化を被ることのないアミノ酸改変を指す。かかる保存的改変には、アミノ酸置換、付加及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発など、当技術分野において公知の標準技法によって本発明の抗体又は抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、本発明のＣＡＲ内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換えることができ、及び変化したＣＡＲは、本明細書に記載される機能アッセイを用いて試験することができる。
用語「刺激」は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体又はＣＡＲ）がそのコグネイトリガンド（又はＣＡＲの場合には腫瘍抗原）と結合して、それにより、限定はされないがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達又は適切なＮＫ受容体若しくはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達など、シグナル伝達イベントを媒介することによって生じる一次応答を指す。刺激は、ある種の分子の発現の変化を媒介することができる。
用語「刺激分子」は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の側面について刺激的方法で免疫細胞の活性化を調節する１つ又は複数の細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＢ細胞によって発現される分子を指す。一態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが負荷されたＭＨＣ分子との結合によって惹起される一次シグナルであり、これが、限定はされないが増殖、活性化、分化などを含めたＴ細胞応答の媒介につながる。刺激的方法で機能する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用なＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例には、限定はされないが、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（Ｆｃ ε Ｒ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれる。本発明の具体的なＣＡＲにおいて、本発明の任意の１つ以上のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えばＣＤ３－ζの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の具体的なＣＡＲにおいて、ＣＤ３－ζの一次シグナル伝達配列は、配列番号９６として提供される配列、又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基である。
用語「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」は、その表面上に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞などの免疫系細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）を指す。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこうした複合体を認識し得る。ＡＰＣは、抗原をプロセシングしてそれをＴ細胞に提示する。
「免疫エフェクター細胞」は、この用語が本明細書で使用されるとき、免疫応答、例えば免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えばα／β Ｔ細胞及びγ／δ Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ－Ｔ）細胞、肥満細胞、及び骨髄系由来食細胞が挙げられる。
「免疫エフェクター機能又は免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書で使用されるとき、標的細胞の免疫攻撃を増強又は促進する例えば免疫エフェクター細胞の機能又は応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能又は応答は、標的細胞の死滅又は成長若しくは増殖阻害を促進するＴ細胞又はＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激及び共刺激が、免疫エフェクター機能又は応答の例である。
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性及びサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性が挙げられる。
ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的一次細胞内シグナル伝達ドメインには、一次刺激、又は抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的共刺激細胞内シグナル伝達ドメインには、共刺激シグナル、又は抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが含まれる。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインがＴ細胞受容体の細胞質配列を含むことができ、及び共刺激細胞内シグナル伝達ドメインが共受容体又は共刺激分子からの細胞質配列を含むことができる。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例には、限定されないが、ＣＤ３ζ、共通ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが含まれる。
用語「ζ」若しくは代わりに「ζ鎖」、「ＣＤ３－ζ」又は「ＴＣＲ－ζ」は、ＧｅｎＢａｎ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基として定義され、「ζ刺激ドメイン」若しくは代わりに「ＣＤ３－ζ刺激ドメイン」又は「ＴＣＲ－ζ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分なζ鎖又はその機能性誘導体の細胞質ドメインからのアミノ酸残基として定義される。一態様において、ζの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２～１６４又はその機能性オルソログである非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基を含む。一態様において、「ζ刺激ドメイン」又は「ＣＤ３－ζ刺激ドメイン」は、配列番号９６として提供される配列である。
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドに特異的に結合して、それにより、限定されないが増殖など、Ｔ細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上のコグネイト結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子には、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ５（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが含まれる。
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ＮＫ細胞受容体に代表され得る。かかる分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＳＤ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
細胞内シグナル伝達ドメインは、その由来である分子の細胞内部分全体、又は天然の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、又はその機能性断片若しくは誘導体を含み得る。
用語「４－１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、及び「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４～２５５、又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基として定義される。一態様において、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号７０として提供される配列又は非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの均等な残基である。
用語「コードする」は、定義付けられたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は定義付けられたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的過程における他のポリマー及び巨大分子の合成の鋳型としての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチド内の特異的ヌクレオチド配列の固有の特性及びそれによってもたらされる生物学的特性を指す。従って、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞又は他の生体系のタンパク質が産生される場合にタンパク質をコードする。その核酸配列がｍＲＮＡ配列と同一の且つ通常配列表に提供されるものであるコード鎖、及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写鋳型として使用される非コード鎖の両方は、その遺伝子のｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると称することができる。
特記されない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする核酸配列の全てを含む。タンパク質又はＲＮＡをコードする核酸配列という語句には、そのタンパク質をコードする核酸配列が何らかのバージョンで１つ又は複数のイントロンを含み得る限りにおいて、イントロンも含まれ得る。
用語「有効量」又は「治療有効量」は、本明細書では同義的に使用され、本明細書に記載されるとおりの化合物、製剤、材料、又は組成物が特定の生物学的結果を達成するのに有効な量を指す。
用語「内因性」は、生物、細胞、組織又は系由来の、又はその内部で産生される任意の材料を指す。
用語「外因性」は、生物、細胞、組織又は系の外側から導入されるか又はその外側で産生される任意の材料を指す。
用語「発現」は、プロモーターによってドライブされる特定の核酸配列の転写及び／又は翻訳を指す。
用語「トランスファーベクター」は、単離核酸を含む組成物であって、細胞内部への単離核酸の送達に使用し得る組成物を指す。当技術分野では、限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含め、多くのベクターが公知である。従って、用語「トランスファーベクター」には自己複製プラスミド又はウイルスが含まれる。この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸のトランスファーを促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物も更に含むものと解釈されなければならない。ウイルストランスファーベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
用語「発現ベクター」は、発現させる核酸配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、他の発現用エレメントは、宿主細胞によって供給されるか、又はインビトロ発現系に供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッド又はリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含め、当技術分野において公知のもの全てが含まれる。
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させることができる点でレトロウイルスの中でユニークであり、レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡに多量の遺伝情報を送達することができ、そのため、遺伝子デリバリーベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
用語「レンチウイルスベクター」は、特に、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）に提供されるとおりの自己不活性化レンチウイルスベクターを含め、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指す。臨床で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例としては、限定されないが、例えばＯｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子デリバリー技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが挙げられる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に公知であろう。
用語「相同」又は「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子間又は２つのポリペプチド分子間におけるサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占有されるとき、例えば２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占有される場合、それらは、その位置で相同又は同一である。２つの配列間の相同性は、一致する位置又は相同な位置の数の直接の関数である。例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５個の位置）が相同である場合、それらの２つの配列は、５０％相同である。位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致するか又は相同である場合、それらの２つの配列は、９０％相同である。
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗原結合部分配列など）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体及びその抗体断片は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体又は抗体断片）においてレシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置き換えられているものである。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。更に、ヒト化抗体／抗体断片は、レシピエント抗体にも、移入されるＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含むことができる。これらの改変は抗体又は抗体断片の性能を更に精緻化及び最適化し得る。一般に、ヒト化抗体又はその抗体断片は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、及びＦＲ領域の全て又は大部分がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体又は抗体断片は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含むことができる。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６，１９９２を参照されたい。
「完全にヒト」は、分子全体がヒト起源であるか、又はヒト形態の抗体又は免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなる抗体又は抗体断片などの免疫グロブリンを指す。
「ネズミ科動物」は、マウス又はラットを指す。例えば、ネズミ科動物抗体又はその断片は、ネズミ科動物、例えばマウス又はラットから単離される抗体又はその断片の配列を含む。
用語「単離されている」は、自然状態から改変されているか又は取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸又はペプチドは、「単離されている」のではないが、その自然状態の共存する材料から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは、「単離されている」。単離核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、又は例えば宿主細胞など、非天然環境中に存在することができる。
本発明との関連において、一般的に存在する核酸塩基に関して以下の略称が使用される。「Ａ」は、アデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、及び「Ｕ」は、ウリジンを指す。
用語「作動可能に連結された」又は「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列との間における後者の発現をもたらす機能的な連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係した状態に置かれているとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、互いに連続し得、例えば２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、又は胸骨内注射、腫瘍内、又は輸注技法を含む。
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びこれらのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、且つ天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸が包含される。特に指示されない限り、ある詳細な核酸配列は、黙示的に、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列並びに明示的に指示される配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択の（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合によってつなぎ合わされた２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、この用語は、当技術分野では一般に例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短鎖と、当技術分野では概してタンパク質と称される、多数の種類があるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、又はこれらの組み合わせが含まれる。
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要である、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
用語「プロモーター／調節配列」は、そのプロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の例では、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の例では、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであり得る。
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんど又は全ての生理条件下で細胞において遺伝子産物の産生を生じさせる核酸配列を指す。
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか又はそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘発物質が細胞に存在する場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせる核酸配列を指す。
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせる核酸配列を指す。
用語「可動性ポリペプチドリンカー」又は「リンカー」は、ｓｃＦｖとの関連で使用されるとき、可変重鎖領域と可変軽鎖領域とを共に連結するために単独又は組み合わせで使用されるグリシン及び／又はセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、ｎ回繰り返されたアミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）（配列番号８９）（式中、ｎは、１以上の正の整数、例えばｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、Ｎ＝４、ｎ＝５及びｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０である）を含む。一実施形態において、可動性ポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号８２）である。別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）及び（ＧｌｙＳｅｒ）の複数の繰り返しを含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、リンカーを含まず、例えば（ｎ＝０）である。また、国際公開第２０１２／１３８４７５号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるリンカーも本発明の範囲内に含まれる。
本明細書で使用されるとき、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７－メチルグアノシンキャップ又はＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも称される）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「前」又は５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、１番目の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びＲＮアーゼからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結び付いており、それぞれが他方に影響を与えるようにして同時転写的に起こる。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端に、ＲＮＡポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡのその安定性又は翻訳効率などの機能を調整するために改変することができる。
本明細書で使用されるとき、「インビトロ転写ＲＮＡ」は、インビトロ合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから作成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの作成に使用される鋳型を含む。
本明細書で使用されるとき、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付加される一連のアデノシンである。一過性発現のためのコンストラクトの好ましい実施形態において、ポリＡは、５０～５０００、好ましくは６４より多く、より好ましくは１００より多く、最も好ましくは３００又は４００より多い。ポリ（Ａ）配列は、局在性、安定性又は翻訳効率などのｍＲＮＡ機能を調整するために化学的又は酵素的に改変することができる。
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニリル部分、又はその改変変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってｍＲＮＡ前駆体に付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列（多くの場合に数百個）である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ（Ａ）テール及びそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、ｍＲＮＡの核外移行、及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写直後に核内で起こるが、更に後に細胞質でも起こり得る。転写が終結した後、ＲＮＡポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によってｍＲＮＡ鎖が切断される。切断部位は、通常、切断部位近傍の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位の遊離３’末端にアデノシン残基が付加される。
本明細書で使用されるとき、「一過性」は、数時間、数日間又は数週間の期間にわたる組み込まれないトランス遺伝子の発現を指し、この発現期間は、宿主細胞においてゲノムに組み込まれた場合又は安定プラスミドレプリコン中に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、１つ以上の療法（例えば、本発明のＣＡＲなどの１つ以上の療法剤）の投与によってもたらされる増殖性障害の進行、重症度及び／又は持続期間の低減又は改善、又は増殖性障害の１つ以上の症状（好ましくは１つ以上の認識し得る症状）の改善を指す。具体的な実施形態において、用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、患者には必ずしも認識できない、腫瘍の成長などの増殖性障害の少なくとも１つの計測可能な理学的パラメータの改善を指す。一部の実施形態において用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、増殖性障害の進行の物理的な、例えば認識し得る症状の安定化による阻害、生理学的な、例えば理学的パラメータの安定化による阻害のいずれか又は両方を指す。一部の実施形態において用語「治療する」、「治療」及び「治療している」は、腫瘍サイズ又は癌性細胞数の低減又は安定化を指す。
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。語句「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、且つ細胞の膜を越えてシグナルを伝える能力を有する分子及び分子複合体を含む。
用語「対象」は、免疫応答を生じさせることのできる生きている生物（例えば、哺乳類、ヒト）を含むことが意図される。
用語の「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞とは、その天然に存在する状態でそれが通常結び付いている他の細胞型と分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞の集団とは、均質な細胞の集団を指す。他の例では、この用語は、単に、その自然状態でそれが天然に結び付いている細胞から分離されている細胞を指す。一部の態様において、これらの細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、これら細胞は、インビトロで培養されない。
用語「療法的」とは、本明細書で使用されるとき、治療を意味する。療法的効果は疾患状態の低減、抑制、寛解、又は根絶によって達成される。
用語「予防」は、本明細書で使用されるとき、疾患又は疾患状態の予防又はそれに対する予防的治療を意味する。
本発明との関連において、「腫瘍抗原」、又は「過剰増殖性障害抗原」、又は「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、特異的な過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。特定の態様において、本発明の過剰増殖性障害抗原は、限定されないが、原発性又は転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌及び腺癌、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌などを含めた癌に由来する。
用語「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」は、外因性核酸を宿主細胞に移入させるか又は導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、又は「形質転換された」、又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換又は形質導入されたものである。細胞には初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在する結合パートナー（例えば、刺激性腫瘍抗原）タンパク質を認識し、結合する抗体、又はリガンドであって、しかし、試料中の他の分子は、実質的に認識又は結合しない、抗体又はリガンドを指す。
「不応性」は、本明細書で使用されるとき、治療に応答しない疾患、例えば癌を指す。実施形態において、不応性癌は、治療の開始前又は開始時点で治療に抵抗性であり得る。一部の実施形態において、不応性癌は、治療中に抵抗性になり得る。不応性癌は、抵抗性癌とも称される。
対象は、対象における癌のパラメータ（例えば、血液癌、例えば癌細胞成長、増殖及び／又は生存）が、任意の適切な尺度、例えば質量、細胞数又は容積によって決定したとき検出可能な量だけ、例えば約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えて遅延又は減少する場合に治療に「応答する」。一例において、対象の平均余命が治療を投与しない場合に予想される平均余命を超えて約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれを超えて延びる場合、対象は、治療に応答する。別の例において、対象が無病生存、全生存の増加又は無増悪期間の増加を有する場合、対象は、治療に応答する。患者が治療に応答するかどうかは、例えば、ＮＣＣＮ腫瘍学臨床実践ガイドライン（ＮＣＣＮ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）（ＮＣＣＮ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（登録商標））によって提供される基準を含め、幾つかの方法を用いて決定することができる。例えば、Ｂ－ＡＬＬのコンテクストでは、完全奏効又は完全奏効者は、＜５％ＢＭ芽球、＞１０００好中球／ＡＮＣ（／μＬ）、循環芽球又は髄外疾患を伴わない（リンパ節症、脾腫、皮膚／歯肉浸潤／精巣腫瘤／ＣＮＳ病変を伴わない）＞１００，０００血小板（／μＬ）、三血球系造血、及び４週間無再発の１つ以上を伴い得る。部分奏効者は、ＢＭ芽球の≧５０％減少、＞１０００好中球／ＡＮＣ（／μＬ）、＞１００，０００血小板（／μＬ）の１つ以上を伴い得る。非奏効者は疾患の進行、例えば＞２５％のＢＭ芽球を示し得る。ある実施形態において、完全奏効者は、ＣＤ８＋集団に７％以上のＣＤ２７＋ ＣＤ４５ＲＯ－細胞を有するものとして定義される。ある実施形態において、採取前レベルのＣＡＲ＋細胞のパーセントにより、奏効者（例えば、完全奏効者及び部分奏効者）が非奏効者（ＮＲ）と区別される。
用語「再発」は、本明細書で使用されるとき、初期の奏効期間（例えば、完全奏効又は部分奏効）後に癌が再び出現することを指す。初期応答期間は、特定の閾値を下回る、例えば２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％を下回るレベルの癌細胞を伴い得る。再出現は、特定の閾値を上回る、例えば２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％を上回るレベルの癌細胞を含み得る。例えば、例としてＢ－ＡＬＬのコンテクストにおいて、再出現は、例えば、完全奏効後の血液、骨髄（＞５％）、又は任意の髄外部位における芽球の再出現を含み得る。これに関連して、完全奏効は、＜５％ＢＭ芽球を含み得る。より一般的には、ある実施形態において、応答（例えば、完全奏効又は部分奏効）は、検出可能なＭＲＤ（微小残存病変）が存在しないことを含み得る。ある実施形態において、初期応答期間は、少なくとも１、２、３、４、５、又は６日、少なくとも１、２、３、又は４週間、少なくとも１、２、３、４、６、８、１０、又は１２ヵ月、又は少なくとも１、２、３、４、又は５年続く。
その用語が本明細書で使用されるとおりの「調節可能なキメラ抗原受容体（ＲＣＡＲ）」は、ＲＣＡＲＸ細胞内にあるとき、標的細胞、典型的には癌細胞に対する特異性、及び調節可能な細胞内シグナル生成又は増殖をＲＣＡＲＸ細胞に付与し、それによりＲＣＡＲＸ細胞の免疫エフェクター特性を最適化することができるポリペプチドの組、最も単純な実施形態では典型的に２つのポリペプチドを指す。ＲＣＡＲＸ細胞は、抗原結合ドメインが結合する抗原を含む標的細胞に対する特異性を付与するために、少なくとも一部には抗原結合ドメインに頼る。ある実施形態において、ＲＣＡＲは、二量化分子が存在したとき細胞内シグナル伝達ドメインを抗原結合ドメインにカップリングすることができる二量化スイッチを含む。
「膜アンカー」又は「膜繋留ドメイン」は、この用語が本明細書で使用されるとき、細胞外又は細胞内ドメインを細胞膜にアンカリングするのに十分なポリペプチド又は部分、例えばミリストイル基を指す。
「スイッチドメイン」は、この用語が本明細書で例えばＲＣＡＲに言及する場合に使用されるとき、二量化分子の存在下で別のスイッチドメインと会合する実体、典型的にはポリペプチドベースの実体を指す。この会合の結果、第１のスイッチドメインに連結、例えば融合した第１の実体と、第２のスイッチドメインに連結、例えば融合した第２の実体との機能的カップリングが生じる。第１及び第２のスイッチドメインは、まとめて二量化スイッチと称される。実施形態において、第１及び第２のスイッチドメインは互いに同じであり、例えばこれらは同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、まとめてホモ二量化スイッチと称される。実施形態において、第１及び第２のスイッチドメインは互いに異なり、例えばこれらは異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、まとめてヘテロ二量化スイッチと称される。実施形態において、スイッチは細胞内である。実施形態において、スイッチは細胞外である。実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばＦＫＢＰ又はＦＲＢベースであり、二量化分子は小分子、例えばラパログである。実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばｍｙｃペプチドに結合するｓｃＦｖであり、二量化分子はポリペプチド、その断片、又はポリペプチドの多量体、例えば１つ以上のｍｙｃ ｓｃＦｖに結合するｍｙｃリガンド又はｍｙｃリガンドの多量体である。実施形態において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの実体、例えばｍｙｃ受容体であり、二量化分子は抗体又はその断片、例えばｍｙｃ抗体である。
「二量化分子」は、この用語が本明細書で例えばＲＣＡＲに言及する場合に使用されるとき、第１のスイッチドメインと第２のスイッチドメインとの会合を促進する分子を指す。実施形態において、二量化分子は対象に天然に存在しないか、又は有意な二量化をもたらし得る濃度で存在しない。実施形態において、二量化分子は小分子、例えばラパマイシン又はラパログ、例えばＲＡＤ００１である。
用語「生物学的に同等」は、参照用量又は参照量の参照化合物（例えば、ＲＡＤ００１）によって生じる効果と等価な効果を生じさせるために必要な参照化合物（例えば、ＲＡＤ００１）以外の薬剤の量を指す。ある実施形態において、効果は、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害によって測定したときの、例えばインビボ又はインビトロアッセイで評価したときの、例えば本明細書に記載されるアッセイ、例えばＢｏｕｌａｙアッセイ、又はウエスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定によって測定したときの、ｍＴＯＲ阻害レベルである。ある実施形態において、効果は、細胞選別によって測定したときの、ＰＤ－１陽性／ＰＤ－１陰性Ｔ細胞の比の変化である。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の生物学的に同等な量又は用量は、参照用量又は参照量の参照化合物と同じレベルのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量又は用量である。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の生物学的に同等な量又は用量は、参照用量又は参照量の参照化合物と同じレベルのＰＤ－１陽性／ＰＤ－１陰性Ｔ細胞の比の変化を達成する量又は用量である。
用語「免疫増強低用量」は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害薬、例えばＲＡＤ００１又はラパマイシン、又は触媒ｍＴＯＲ阻害薬と併せて使用されるとき、例えばＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性の阻害によって測定したときのｍＴＯＲ活性を、完全ではないが、部分的に阻害するＭｔｏｒ阻害薬の用量を指す。ｍＴＯＲ活性の、例えばＰ７０ Ｓ６キナーゼの阻害による評価方法は、本明細書で考察される。用量は、完全な免疫抑制をもたらすには不十分であるが、免疫応答を増強するには十分である。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の免疫増強低用量は、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の数減少、及び／又はＰＤ－１陰性Ｔ細胞数の増加、又はＰＤ－１陰性Ｔ細胞／ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の比の増加をもたらす。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の免疫増強低用量は、ナイーブＴ細胞数の増加をもたらす。ある実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の免疫増強低用量は、以下の１つ以上：
例えばメモリーＴ細胞上、例えばメモリーＴ細胞前駆体上の、以下のマーカー：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋、及びＢＣＬ２の１つ以上の発現の増加；
例えばメモリーＴ細胞上、例えばメモリーＴ細胞前駆体上の、ＫＬＲＧ１の発現の減少；及び
メモリーＴ細胞前駆体、例えば以下の特性：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増加、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増加、ＣＤ２７＋の増加、ＫＬＲＧ１の減少、及びＢＣＬ２の増加のいずれか１つ又は組み合わせを有する細胞の数の増加
をもたらし、ここで、上記に記載される変化のいずれも、例えば未治療対象と比較したとき、例えば少なくとも一過性に起こる。
範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な態様が範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での記載は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解釈されてはならないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値を有すると考えられなければならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示される部分範囲並びにその範囲内にある個々の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を有すると考えられなければならない。別の例として、９５～９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するものを含み、及び９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％及び９８～９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関わらず適用される。
デュアルＣＡＲ
本開示は、少なくとも一部には、ＣＤ２２ ＣＡＲを含む第１のＣＡＲと、ＣＤ１９ ＣＡＲを含む第２のＣＡＲとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子、例えば本明細書に記載されるとおりのデュアルＣＡＲをコードする新規核酸分子を特徴とする。一部の実施形態において、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２２抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ１９抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む。本明細書に開示されるＣＡＲ分子の一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、例えば、第１及び第２の膜貫通ドメイン；第１及び第２の共刺激ドメイン；及び／又は第１及び第２の一次シグナル伝達ドメインの、２つの同一のポリペプチド配列を含み、これらのポリペプチド配列は、異なるヌクレオチド配列によってコードされる。また、本明細書には、前記ＣＡＲ分子の使用方法も開示される。
理論によって拘束されることを望むものではないが、一部の実施形態では、ＣＡＲ分子、例えば、デュアルＣＡＲ分子をコードする核酸分子が、組換え、例えば、相同組換えを防ぐために最適化、例えば、コドン最適化されることが考えられる。一部の実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、デュアルＣＡＲ分子は、２つのドメイン、例えば、第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインを含み、これらは各々が同様のアミノ酸配列を含むが、異なるヌクレオチド配列によってコードされる。
ある態様において、本明細書に開示されるＣＡＲ分子は、ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲを含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインのＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号２８のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣ ＣＤＲ３を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号３１のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３２のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号３３のＬＣ ＣＤＲ３を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号３４のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３２のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号２０のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２１のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号２２のＨＣ ＣＤＲ３を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号２３のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２４のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号２２のＨＣ ＣＤＲ３を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号２５のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号２８のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣ ＣＤＲ３；及び配列番号２０のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２１のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号２２のＨＣ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号３１のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３２のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号３３のＬＣ ＣＤＲ３；及び配列番号２３のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２４のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号２２のＨＣ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号３４のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号３２のＬＣ ＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣ ＣＤＲ３；及び配列番号２５のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣ ＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣ ＣＤＲ３を含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、本明細書に記載される、例えば表１Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインの軽鎖可変（ＶＬ）領域；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ２２結合ドメインの重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＬ領域配列の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＬ領域配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＬ領域配列のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＨ領域配列の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＨ領域配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合ドメインは、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ＶＨ領域配列のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。
ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合は、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号５０の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合は、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号５０と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合は、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号５０のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ２２抗原結合は、表１Ａ又は表３Ａに提供されるＣＤ２２ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４９又は５１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるｓｃＦｖを含む。
ある態様において、本明細書に開示されるＣＡＲ分子は、ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む第２のＣＡＲを含む。
一部の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ、表３Ａ又は表５ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ、表３Ａ又は表５ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、本明細書に記載される、例えば表１Ａ又は表２ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表２Ａ又は表３ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインのＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、配列番号４０のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号４１のＬＣ ＣＤＲ２；及び配列番号４２のＬＣ ＣＤＲ３；及び／又は配列番号３５のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号３６～３８のＨＣ ＣＤＲ２；及び配列番号３９のＨＣ ＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表３Ａ又は表５ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインの軽鎖可変（ＶＬ）領域；及び／又は本明細書に記載される、例えば表１Ａ、表３Ａ又は表５ＡにおけるＣＤ１９結合ドメインの重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＬ領域配列の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＬ領域配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＬ領域配列のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＨ領域配列の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＨ領域配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ＶＨ領域配列のアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。
他の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４４の１、２又は３個以上の改変（例えば、置換）であって、但し３０、２０又は１０個以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４４のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。他の実施形態において、ＣＤ１９抗原結合ドメインは、表１Ａ、表３Ａ又は表５Ａに提供されるＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列、例えば配列番号４３又は４８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるｓｃＦｖを含む。
ある態様において、本明細書に開示されるＣＡＲ分子は、第１の膜貫通ドメインを含む第１のＣＡＲと第２の膜貫通ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む。ある実施形態において、第１の膜貫通ドメインと第２の膜貫通ドメインとは、例えば本明細書に開示されるとおりの、同じアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、それぞれ第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列とは、少なくとも１ヌクレオチドの違いを有する。
一部の実施形態において、第１の膜貫通ドメインと第２の膜貫通ドメインとは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４から選択される、同じ膜貫通ドメインである。
一部の実施形態において、第１の膜貫通ドメインと第２の膜貫通ドメインとは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４から選択される、異なる膜貫通ドメインである。
ある態様において、本明細書に記載されるＣＡＲ分子をコードする核酸分子は、第１の膜貫通ドメインを含む第１のＣＡＲと第２の膜貫通ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む。一部の実施形態において、第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態において、第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、第１の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる。
ある態様において、本明細書に開示されるＣＡＲ分子は、第１の共刺激ドメインを含む第１のＣＡＲと第２の共刺激ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む。ある実施形態において、第１の共刺激ドメインと第２の共刺激ドメインとは、例えば本明細書に開示されるとおりの、同じアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、第１の共刺激ドメイン及び第２の共刺激ドメインは、それぞれ第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列とは、少なくとも１ヌクレオチドの違いを有する。
一部の実施形態において、第１の共刺激ドメインと第２の共刺激ドメインとは、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のシグナル伝達ドメインから選択される、同じ共刺激ドメインである。
一部の実施形態において、第１の共刺激ドメインと第２の共刺激ドメインとは、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）又は４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のシグナル伝達ドメインから選択される、異なる共刺激ドメインである。
ある態様において、本明細書に記載されるＣＡＲ分子をコードする核酸分子は、第１の共刺激ドメインを含む第１のＣＡＲと第２の共刺激ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む。一部の実施形態において、第１の共刺激ドメイン及び第２の共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。一部の実施形態において、第１の共刺激ドメイン及び第２の共刺激ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、第１の共刺激ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、第２の共刺激ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる。
一部の態様において、本開示は、例えば、（ｉ）ＣＤ２２抗原結合ドメインを含む第１のＣＡＲと（ｉｉ）ＣＤ１９抗原結合ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む、ＣＡＲ分子をコードする核酸分子を提供する。実施形態において、この核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む。実施形態において、（ｉ）及び（ｉｉ）をコードする核酸配列は同じ向きに位置しており、例えば、（ｉ）及び（ｉｉ）をコードする核酸配列の転写は同じ方向に進む。実施形態において、（ｉ）及び（ｉｉ）をコードする核酸配列は異なる向きに位置している。実施形態において、（ｉ）及び（ｉｉ）をコードする核酸配列の発現は、単一のプロモーターが制御する。実施形態において、（ｉ）及び（ｉｉ）をコードする核酸配列の間に、プロテアーゼ切断部位（Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ切断部位など）をコードする核酸が位置している。実施形態において、プロテアーゼ切断部位は、（ｉ）及び（ｉｉ）を含む融合タンパク質を細胞が発現できるように置かれ、このタンパク質が、続いてタンパク質分解切断によってプロセシングされて、２つのペプチドになる。一部の実施形態では、（ｉ）をコードする核酸配列が、（ｉｉ）をコードする核酸配列の上流にあるか、又は（ｉｉ）をコードする核酸配列が、（ｉ）をコードする核酸配列の上流にある。実施形態において、第１のプロモーターが、（ｉ）をコードする核酸配列の発現を制御し、第２のプロモーターが、（ｉｉ）をコードする核酸配列の発現を制御する。実施形態において、核酸は、プラスミドである。実施形態において、核酸は、ウイルスパッケージングエレメントを含む。一部の態様において、本開示は、本明細書に記載される核酸、例えば上記に記載されるとおりの（ｉ）及び（ｉｉ）を含む核酸を含む細胞、例えば免疫エフェクター細胞を提供する。この細胞は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａ切断部位を切断するプロテアーゼ（例えば、内因性又は外因性）を含み得る。
本明細書に開示されるＣＡＲ分子、例えば、デュアルＣＡＲ分子の例示的ヌクレオチド及びアミノ酸配列を表１Ａに提供する。
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本開示のデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲのＣＤ２２及びＣＤ１９ ＣＤＲを表２Ａに提供する。
Figure 2023503161000016
Figure 2023503161000017
表３Ａは、本明細書に開示されるデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲのＣＤ１９及びＣＤ２２結合ドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。
Figure 2023503161000018
Figure 2023503161000019
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Figure 2023503161000021
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表４Ａは、追加のＣＡＲ成分、例えば、シグナルペプチド、リンカー及びＰ２Ａ部位のヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。
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タンデムＣＡＲ
ある態様において、本明細書には、二重特異性抗原結合ドメインを含むＣＡＲ、例えば、タンデムＣＡＲが開示される。一部の実施形態において、二重特異性抗原結合ドメインは、２つの抗原結合ドメイン、例えば、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとを含む。一部の実施形態において、タンデムＣＡＲは、ＣＤ２２抗原結合ドメインとＣＤ１９抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗原結合ドメインを含む。
二重特異性抗原結合ドメインの一部の実施形態において、第１の抗原結合ドメインは、抗体分子、例えば、抗体結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）である。二重特異性抗原結合ドメインの一部の実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、抗体分子、例えば、抗体結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）である。二重特異性抗原結合ドメインの各抗体分子、例えばｓｃＦｖ内において、ＶＨがＶＬの上流又は下流にあり得る。
一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２を有する。
一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２を有する。
一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ１）がそのＶＨ（ＶＨ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）がそのＶＨ（ＶＨ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２を有する。
更に一部の実施形態において、上流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ１）がそのＶＬ（ＶＬ１）の上流にあるように配置され、下流抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）がそのＶＬ（ＶＬ２）の上流にあるように配置され、従って、二重特異性抗体分子は、全体でＮ末端からＣ末端の向きに配置ＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２を有する。
前記構成のいずれにおいても、任意選択により、２つの抗体又は抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）の間、例えばコンストラクトがＶＨ１－ＶＬ１－ＶＬ２－ＶＨ２として配置される場合にＶＬ１とＶＬ２との間；コンストラクトがＶＬ１－ＶＨ１－ＶＨ２－ＶＬ２として配置される場合にＶＨ１とＶＨ２との間；コンストラクトがＶＬ１－ＶＨ１－ＶＬ２－ＶＨ２として配置される場合にＶＨ１とＶＬ２との間；又はコンストラクトがＶＨ１－ＶＬ１－ＶＨ２－ＶＬ２として配置される場合にＶＬ１とＶＨ２との間にリンカーが置かれる。一般に、２つのｓｃＦｖの間のリンカーは、２つのｓｃＦｖのドメイン間での誤対合を回避するのに十分な長さでなければならない。リンカーは、本明細書に記載されるとおりのリンカーであり得る。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４－Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号８２）である。一部の実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列：ＬＡＥＡＡＡＫ（例えば、配列番号８０）を含み、例えばそれからなる。
前記構成のいずれにおいても、任意選択により、リンカーは第１のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に置かれる。任意選択により、リンカーは第２のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に置かれる。複数のリンカーを有するコンストラクトにおいて、リンカーの任意の２つ以上は同じであるか又は異なり得る。従って、一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、ＶＬ、ＶＨ、及び任意選択により１つ以上のリンカーを本明細書に記載されるとおりの配置で含む。
一部の実施形態において、各抗体分子、例えば各抗原結合ドメイン（例えば、各ｓｃＦｖ）は、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にリンカーを含む。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域との間のリンカーは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、又は６である）である。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝１である）であり、例えば、リンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ４－Ｓｅｒを有する。一部の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎ＝４である）（配列番号８２）である。一部の実施形態において、ＶＨ領域とＶＬ領域とは、リンカーなしに結合される。
スプリットＣＡＲ
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞はスプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲ手法については、国際公開第２０１４／０５５４４２号パンフレット及び同第２０１４／０５５６５７号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に更に詳細に記載される。簡潔に言えば、スプリットＣＡＲシステムは、第１の抗原結合ドメイン及び共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ）を有する第１のＣＡＲを発現する細胞を含み、この細胞は、第２の抗原結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を有する第２のＣＡＲも発現する。細胞が第１の抗原に遭遇すると、共刺激ドメインが活性化され、細胞が増殖する。細胞が第２の抗原に遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、細胞殺傷活性が始まる。従って、このＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下に限り完全に活性化される。
ＲＮＡトランスフェクション
インビトロで転写されたＲＮＡ ＣＡＲを産生する方法が本明細書に開示される。本発明は、細胞に直接遺伝子導入できるＲＮＡ構築物をコードするＣＡＲも含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、特異的に設計したプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）、続くポリＡ付加を含み、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ及び／又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現させる核酸及びポリＡテールを含む構築物、典型的には５０～２０００塩基長を産生し得る。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞において効率的に翻訳され得る。一態様において、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。
一態様において、ＣＡＲ、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる。一態様において、ＣＡＲ、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ ＮＫ細胞の作製のため、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に導入される。
一実施形態において、ＣＡＲのインビトロ転写ＲＮＡは、一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成鋳型を使用したインビトロ転写によって産生される。適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用して、任意の供給源からの目的のＤＮＡをＰＣＲによってインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接変換することができる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列又は任意の他の適切なＤＮＡ供給源であり得る。望ましいインビトロ転写用鋳型は本発明のＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ ＣＡＲの鋳型は、抗腫瘍抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外領域と；ヒンジ領域、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメイン）と；ＣＤ３－ζのシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを例えば含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含む。
一実施形態において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡはオープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列からのものであり得る。一実施形態において、核酸は５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部又は全てを含み得る。核酸はエクソン及びイントロンを含み得る。一実施形態において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡはヒト核酸配列である。別の実施形態において、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、代わりに、天然に存在する生物では通常発現しない人工ＤＮＡ配列であり得る。例示的人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように共にライゲートされる遺伝子の部分を含むものである。共にライゲートされるＤＮＡの部分は、単一の生物又は２つ以上の生物からのものであり得る。
トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型はＰＣＲを用いて作成される。ＰＣＲの実施方法は、当技術分野において周知である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＰＣＲの鋳型として使用されるＤＮＡの領域と実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用されるとき、プライマー配列中の塩基の大部分又は全てが相補的であるか、又は１つ以上の塩基が非相補的若しくはミスマッチであるヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに用いられるアニーリング条件下で意図されるＤＮＡ標的とアニール又はハイブリダイズすることが可能である。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分と実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲを含めた、細胞で通常転写される核酸の一部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計することができる。プライマーは、特定の目的ドメインをコードする核酸の一部分を増幅するように設計することもできる。一実施形態において、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲの全て又は一部分を含めた、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当技術分野において周知の合成方法によって作成することができる。「フォワードプライマー」は、増幅しようとするＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドと実質的に相補的なヌクレオチド領域を含むプライマーである。「上流」は、本明細書では、コード鎖に対して増幅しようとするＤＮＡ配列の５，側の位置を指して使用される。「リバースプライマー」は、増幅しようとするＤＮＡ配列の下流にある二本鎖ＤＮＡ鋳型と実質的に相補的なヌクレオチド領域を含むプライマーである。「下流」は、本明細書では、コード鎖に対して増幅しようとするＤＮＡ配列の３’側の位置を指して使用される。
本明細書に開示される方法では、ＰＣＲに有用な任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。試薬及びポリメラーゼは幾つもの供給元から市販されている。
安定性及び／又は翻訳効率を促進する能力を備えた化学構造も用いられ得る。ＲＮＡは、好ましくは５’及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態において、５’ＵＴＲは１～３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは種々の方法によって変えることができ、限定はされないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのためのプライマーを設計することが挙げられる。この手法を用いると、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を実現するために必要な５’及び３’ＵＴＲ長さを改変することができる。
５’及び３’ＵＴＲは、目的の核酸に関する天然に存在する内因性５’及び３’ＵＴＲであり得る。代わりに、目的の核酸にとって内因性でないＵＴＲ配列が、フォワード及びリバースプライマーへのそのＵＴＲ配列の導入によるか、又は鋳型の任意の他の改変により付加され得る。目的の核酸にとって内因性でないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を改変するのに有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列におけるＡＵリッチエレメントはｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。従って、３’ＵＴＲは、当技術分野において周知のＵＴＲの特性に基づいて転写ＲＮＡの安定性が増加するように選択又は設計することができる。
一実施形態において、５’ＵＴＲは内因性核酸のコザック配列を含み得る。代わりに、目的の核酸にとって内因性でない５’ＵＴＲが上記に記載したとおりＰＣＲによって付加される場合、５’ＵＴＲ配列を付加することによりコンセンサスコザック配列を設計し直し得る。コザック配列は一部のＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させることができるが、効率的な翻訳を可能にするため全てのＲＮＡに必要というようには思われない。多くのｍＲＮＡについてのコザック配列の要件は、当技術分野において公知である。一部の実施形態において、５’ＵＴＲは、細胞において安定しているＲＮＡゲノムのＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。一部の実施形態において、３’又は５’ＵＴＲに様々なヌクレオチド類似体を使用してｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げることができる。
遺伝子クローニングの必要なしにＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成可能にするには、転写する配列の上流でＤＮＡ鋳型に転写プロモーターが付加されなければならない。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加されると、ＰＣＲ産物において転写しようとするオープンリーディングフレームの上流にＲＮＡポリメラーゼプロモーターが取り込まれることになる。好ましい一実施形態において、プロモーターは、本明細書の他の部分に記載されるとおり、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、限定はされないが、Ｔ３及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６プロモーターのコンセンサス核酸配列は、当技術分野において公知である。
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは５’末端のキャップ及び３’ポリ（Ａ）テールの両方を有し、これらがリボソーム結合、翻訳開始及び細胞における安定性ｍＲＮＡを決定する。環状ＤＮＡ鋳型上、例えばプラスミドＤＮＡ上では、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞における発現に好適でない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で線状化されたプラスミドＤＮＡの転写は、転写後にポリアデニル化されたとしても、真核生物トランスフェクションにおいて有効でない通常のサイズのｍＲＮＡをもたらす。
線状ＤＮＡ鋳型では、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写物の３’末端を鋳型の最後の塩基を超えて伸長させることができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ ａｎｄ Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：６２２３－３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ ａｎｄ Ｂｅｒｚａｌ－Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５－６５（２００３）。
ＤＮＡ鋳型へのポリＡ／Ｔストレッチの従来の組込み方法は分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列はプラスミド不安定性を引き起こすこともあり、細菌細胞から得られたプラスミドＤＮＡ鋳型が欠失及び他の異常に高度に汚染されていることが多いのは、このためである。これによりクローニング手順が労力及び時間を要するようになるばかりでなく、信頼性が失われる。そのため、クローニングのないポリＡ／Ｔ ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築を可能にする方法が極めて望ましい。
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００Ｔテール（サイズは５０～５０００Ｔであり得る）など、ポリＴテールを含むリバースプライマーを使用してＰＣＲの間に作製するか、又は限定はされないが、ＤＮＡライゲーション又はインビトロ組換えを含め、任意の他の方法によってＰＣＲ後に作製することができる。ポリ（Ａ）テールもＲＮＡに安定性をもたらし、その分解を低減する。概して、ポリ（Ａ）テールの長さは転写されるＲＮＡの安定性と正に相関する。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールは１００～５０００アデノシンである。
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、インビトロ転写後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して更に伸長させることができる。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さが１００ヌクレオチドから３００～４００ヌクレオチドに増加すると、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍になる。加えて、３’末端に異なる化学基を付加すると、ｍＲＮＡ安定性が高まり得る。かかる付加は、改変／人工ヌクレオチド、アプタマー及び他の化合物を含み得る。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールにＡＴＰ類似体を取り込むことができる。ＡＴＰ類似体はＲＮＡの安定性を更に高めることができる。
５’キャップもＲＮＡ分子に安定性をもたらす。好ましい実施形態において、本明細書に開示される方法によって作製されるＲＮＡは５’キャップを含む。５’キャップは、当技術分野において公知の及び本明細書に記載される技法を用いて提供される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６－４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８－９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８－９６６（２００５））。
本明細書に開示される方法によって作製されるＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始して翻訳開始を促進する任意のウイルス配列、染色体配列又は人工的に設計された配列であり得る。糖類、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、及び界面活性剤など、細胞透過及び生存能力を促進する因子を含有し得る、細胞電気穿孔に好適な任意の溶質を含めることができる。
ＲＮＡは、幾つもの異なる方法、例えば、限定はされないが、電気穿孔（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－ＩＩ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、独国））、（ＥＣＭ ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）又はＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、Ｈａｍｂｕｒｇ 独国）、リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリマー封入、ペプチド媒介性トランスフェクション、又は「遺伝子銃」などのバイオリスティック粒子デリバリーシステムを含む市販の方法のいずれかを用いて標的細胞に導入することができる（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１－７０（２００１）を参照されたい。
非ウイルス送達方法
幾つかの態様において、非ウイルス方法を使用して、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を細胞、又は組織、又は対象に送達できる。
一実施形態において、非ウイルス方法は、トランスポゾン（転位因子とも呼ばれる）の使用を含む。一実施形態において、トランスポゾンは、ゲノムの位置にそれ自体挿入できるＤＮＡの断片、例えば自己複製性であり、そのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡの断片又は長い核酸の外にスプライシングされ、ゲノムの別の場所に挿入され得るＤＮＡの断片である。例えば、トランスポゾンは、転移遺伝子に隣接する逆方向反復で構成されたＤＮＡ配列を含む。
トランスポゾンを使用した核酸送達の例示的方法には、スリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾン系（ＳＢＴＳ）及びピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ）（ＰＢ）トランスポゾン系が含まれる。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０．Ｒ１（２０１１）：Ｒ１４－２０；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５（２００８）：２９６１－２９７１；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（２００８）：５８０－５８９；Ｇｒａｂｕｎｄｚｉｊａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８（２０１０）：１２００－１２０９；Ｋｅｂｒｉａｅｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．１２２．２１（２０１３）：１６６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １６．９（２００８）：１５１５－１６；Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２．１２（２００７）：３１５３－６５；及びＤｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．１２２．３（２００５）：４７３－８３（これらは、全て参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
ＳＢＴＳは、２つの成分：１）トランス遺伝子を含むトランスポゾン、及び２）トランスポザーゼ酵素源を含む。トランスポザーゼは、トランスポゾンを担体プラスミド（又は他のドナーＤＮＡ）から宿主細胞染色体／ゲノムなどの標的ＤＮＡに転移させることができる。例えば、トランスポザーゼは担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、プラスミドからトランスポゾン（トランス遺伝子を含む）を切り出し、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。
例示的トランスポゾンには、ｐＴ２ベースのトランスポゾンが含まれる。例えば、Ｇｒａｂｕｎｄｚｉｊａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１．３（２０１３）：１８２９－４７；及びＳｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８．８（２００８）：２９６１－２９７１（これらは、全て参照により本明細書に援用される）を参照されたい。例示的トランスポザーゼには、Ｔｃ１／マリナー型トランスポザーゼ、例えばＳＢ１０トランスポザーゼ又はＳＢ１１トランスポザーゼ（例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現させることのできる高活性トランスポザーゼ）が含まれる。例えば、Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．；Ｋｅｂｒｉａｅｉ ｅｔ ａｌ．；及びＧｒａｂｕｎｄｚｉｊａ ｅｔ ａｌ．（これらは、全て参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
ＳＢＴＳを使用することにより、トランス遺伝子、例えば本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸の効率的な組込み及び発現が可能になる。本明細書には、例えば、ＳＢＴＳなどのトランスポゾン系を使用した、本明細書に記載されるＣＡＲを安定に発現する細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の作成方法が提供される。
本明細書に記載される方法によれば、一部の実施形態において、ＳＢＴＳ成分を含む１つ以上の核酸、例えばプラスミドが細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に送達される。例えば、核酸は、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）送達の標準方法、例えば本明細書に記載される方法、例えば電気穿孔、トランスフェクション、又はリポフェクションによって送達される。一部の実施形態において、核酸は、トランス遺伝子、例えば本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。一部の実施形態において、核酸は、トランス遺伝子（例えば、本明細書に記載されるＣＡＲをコードする核酸）を含むトランスポゾン並びにトランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、２つの核酸を含むシステム、例えばデュアルプラスミドシステムが提供され、例えば、ここで、第１のプラスミドが、トランス遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第２のプラスミドが、トランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。例えば、第１及び第２の核酸は宿主細胞に共送達される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、ＳＢＴＳを使用した遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、又は操作されたメガヌクレアーゼが再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ）を使用した遺伝子編集との組み合わせを用いることによって作成される。
一部の実施形態において、非ウイルス送達方法を用いると、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の再プログラム化、及び対象への細胞の直接注入が可能となる。非ウイルスベクターの利点としては、限定はされないが、患者集団を満たすために必要な十分な量の作製が容易で比較的低コストであること、保存時に安定していること、及び免疫原性がないことが挙げられる。
ＣＡＲをコードする核酸コンストラクト
本発明は、本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲコンストラクトをコードする核酸分子も提供する。一態様において、核酸分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一態様において、核酸分子はＤＮＡコンストラクトとして提供される。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用して、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニングにより、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子を誘導化することにより又はそれを含むことが知られる細胞及び組織から直接単離することによるような、組み換え当技術分野で知られる方法を使用して得ることができる。代わりに、目的の遺伝子をクローン化ではなく合成により産生できる。
本発明は、本発明のＤＮＡが挿入されているベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組込み及び娘細胞への伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できる点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコ－レトロウイルス由来のベクターを超える更なる利点を有する。更に低免疫原性であるという付加的利点も有する。
別の実施形態において、所望の本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成できる。参照により本明細書に包含される下記のＪｕｎｅ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９．１０：７０４－７１６を参照されたい。
概説すると、ＣＡＲをコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸又はその一部をプロモーターに操作可能に連結させ、その構築物を発現ベクターに取り込むことにより達成される。ベクターは、真核生物での複製及び組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列及びプロモーターを含む。
本発明の構築物の発現は、標準遺伝子送達プロトコルを使用する核酸免疫化及び遺伝子治療にも使用し得る。遺伝子送達のための方法が当技術分野で知られている。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許第５，３９９，３４６号明細書、同第５，５８０，８５９号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書を参照されたい。別の実施形態において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
核酸は、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクター及びシークエンシングベクターを含む。
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ １ －４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ及び他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ以上の選択可能マーカーを含む（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット；国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；及び米国特許第６，３２６，１９３号明細書）。
多数のウイルスベースの系が哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当技術分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に包装できる。次いで、組み換えウイルスが単離され、対象の細胞にインビボ又はエクスビボで送達され得る。多数のレトロウイルス系が当技術分野で知られている。一実施形態において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当技術分野で知られている。一実施形態において、レンチウイルスベクターを使用する。
更なるプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは、開始部位の上流３０～１１０ｂｐの領域に位置するが、多数のプロモーターが同様に開始部位の下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の空間は、多くの場合、可動性であり、そのため、要素が互いに逆になったとき又は移動したときにプロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間の空間は、活性が落ち始める前、５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモーターにより、個々の要素は、転写を活性化するために協調的又は独立的に機能できるように見える。例示的プロモーターとしては、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ－１α、ユビキチンＣ、又はホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲ導入遺伝子の発現ができるプロモーターの例は、ＥＦ－１α（ＥＦ１ａ）プロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う伸長因子－１複合体のαサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された導入遺伝子からＣＡＲ発現を駆動するのに有効であることが示されている。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。一態様において、ＥＦ１ａプロモーターは、当技術分野で知られている配列を含む。
プロモーターの別の例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列並びにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターなど、しかし、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターも使用し得る。更に、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定すべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部であるとして意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、発現が望まれるときに活性化し、発現が望まれないときに遮断することができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
ＣＡＲポリペプチド又はその一部の発現を評価するために、細胞に導入する発現ベクター遺伝子導入又はウイルスベクターによる感染が探求される細胞の集団から発現細胞から発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又は両方を含み得る。他の態様において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの別の断面に担持され、共トランスフェクション法において使用される。選択可能マーカー及びレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞における発現が可能であるように適切な制御配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。
レポーター遺伝子は、恐らく遺伝子導入されている細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織に存在又は発現されず、発現がある容易に検出可能な特性、例えば酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現を、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてから適当な時間後にアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。適当な発現系は、周知であり、既知技術により製造できるか又は商業的に入手できる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を有する構築物をプロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するのに使用され得る。
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は、当技術分野で知られている。発現ベクターに関連して、ベクターは、当技術分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫細胞に容易に導入できる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段により、宿主細胞に移入され得る。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクター及び／又は外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照されたい）。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入に好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書及び同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散体系を含む。インビトロ及びインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的化ナノ粒子又は他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達など、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体は、リポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される（インビトロ、エクスビボ又はインビボ）。別の態様において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含又は複合体化又は他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとして又は「崩壊」構造を有して存在し得る。それらは、単に溶液に分散され、恐らくサイズ又は形状が均一ではない凝集体も形成し得る。脂質は、天然に存在する又は合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴並びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群及びその誘導体を含む。
使用に適する脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得ることができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から得ることができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ．）から得ることができる。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質の原液を約－２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために唯一の溶媒として使用する。「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集体の産生により形成される多様な単及び多層状脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を伴う小胞構造を有することにより特徴付けられ得る。多層状リポソームは、水性媒体により分離された、複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに自然に形成される。脂質要素は、閉構造形成前に自己凝集し、水及び溶解した溶質を脂質二重層の間に封入する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であるか又は単に脂質分子の不均一凝集体として存在すると考えられ得る。リポフェクタミン－核酸複合体も考慮される。
外来性核酸を宿主細胞に導入するか又はそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、薬剤の同定に使用するための、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）により、特定のペプチドの存在又は不在を検出するような「生化学的」アッセイ又は本発明の範囲内に入る本明細書に記載のアッセイを含む。
本発明は、ＣＡＲコード化核酸分子を含むベクターを更に提供する。一態様において、ＣＡＲベクターを細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に直接形質導入し得る。一態様において、ベクターは、クローニング又は発現ベクター、例えば１つ以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター構築物を含むが、これらに限定されないベクターである。一態様において、ベクターは、哺乳動物Ｔ細胞又はＮＫ細胞においてＣＡＲ構築物の発現ができる。一態様において、哺乳動物Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。
製造／生産方法
本発明は、本明細書に開示される細胞を作製する方法、例えば本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲコンストラクトをコードする核酸分子を発現するようにＴ細胞又はＮＫ細胞を操作する方法も提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示される製造方法は、本明細書に開示される２つのＣＡＲ（例えば、本明細書に開示されるＣＤ１９／ＣＤ２２タンデム及び／又はデュアルＣＡＲ）をコードする核酸分子を含む細胞の製造に用いられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される製造方法は、本明細書に開示されるダイアボディＣＡＲ、例えば本明細書に開示される抗ＣＤ２２／抗ＣＤ１９ダイアボディＣＡＲをコードする核酸分子を含む細胞の製造に用いられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される製造方法は、本明細書に開示されるＣＡＲを各々がコードする２つの核酸分子（例えば、抗ＣＤ２２ ＣＡＲをコードする１つの核酸分子及び抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする１つの核酸分子）を含む細胞の製造に用いられる。一部の実施形態において、本明細書には、本明細書に記載される製造プロセスのいずれかによって作製される細胞（例えば、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞）の集団が提供される。
活性化プロセス
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、１つ以上のＣＡＲを発現するように操作された免疫エフェクター細胞を２４時間未満で製造し得る。理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書に提供される方法は、製造プロセス中、ナイーブＴ細胞などの未分化表現型のＴ細胞を維持する。未分化表現型を持つこうしたＣＡＲ発現細胞は、注入後にインビボでより長く残存し、且つ／又はより良好に拡大する。一部の実施形態において、本明細書に提供される製造方法によって作製されたＣＡＲＴ細胞は、例えば、シングルセル又はバルクＲＮＡ－ｓｅｑ又は当技術分野において公知のマーカーを使用したフローサイトメトリーを用いて測定したとき、従来の製造プロセスによって作製されたＣＡＲＴ細胞と比較して、より高い割合の幹細胞メモリーＴ細胞を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される製造方法によって作製されたＣＡＲＴ細胞は、例えば、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑを用いて測定したとき、従来の製造プロセスによって作製されたＣＡＲＴ細胞と比較して、より低い割合のエフェクターＴ細胞を含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される製造方法によって作製されたＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて測定したとき、従来の製造プロセスによって作製されたＣＡＲＴ細胞と比較して、Ｔ細胞の幹細胞性をより良好に維持している。一部の実施形態において、本明細書に提供される製造方法によって作製されたＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて測定したとき、従来の製造プロセスによって作製されたＣＡＲＴ細胞と比較して、より低いレベルの低酸素を示す。一部の実施形態において、本明細書に提供される製造方法によって作製されたＣＡＲＴ細胞は、例えば、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを用いて測定したとき、従来の製造プロセスによって作製されたＣＡＲＴ細胞と比較して、より低いレベルのオートファジーを示す。一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、本明細書に開示されるタンデム又はデュアルＣＡＲ（例えば、本明細書に開示されるＣＤ１９／ＣＤ２２タンデム又はデュアルＣＡＲ）をコードする核酸分子を含むように操作される。一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、本明細書に開示されるタンデム又はデュアルＣＡＲ、例えば本明細書に開示される抗ＣＤ２２／抗ＣＤ１９タンデム又はデュアルＣＡＲをコードする核酸分子を含むように操作される。一部の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、本明細書に開示されるＣＡＲを各々がコードする２つの核酸分子（例えば、抗ＣＤ２２ ＣＡＲをコードする１つの核酸分子及び抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする１つの核酸分子）を含むように操作される。他の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、本明細書に開示される１つ又は２つのＣＡＲをコードする１つの核酸分子（例えば、抗ＣＤ２２／抗ＣＤ１９タンデム又は抗ＣＤ２２／抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする１つの核酸分子）を含むように操作される。
一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））などのビーズの使用を含まず、且つ脱ビーズ化ステップを含まない。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法によって製造されたＣＡＲＴ細胞は、エキソビボ拡大培養を最小限、例えば、２日未満、１日未満、１２時間未満、８時間未満、６時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満として又はエキソビボ拡大培養なしに対象に投与され得る。従って、本明細書に記載される方法は、対象の疾患の治療における使用のための改良されたＣＡＲ発現細胞産物を作製する高速製造プロセスを提供する。
一部の実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えば、１つ以上のＣＡＲ、例えば、２つのＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、（ｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば凍結又は新鮮白血球アフェレーシス産物から単離されたＴ細胞）の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させること；（ｉｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）と接触させることであって、それにより核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を提供すること、及び（ｉｉｉ）保管のため（例えば、凍結保存培地中に細胞の集団を再製剤化する）又は投与のため、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を回収することを含む方法を提供し、（ａ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に実施されるか、又はステップ（ｉ）の開始後２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１８時間以内に実施され、及びステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後２６時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後２２、２３又は２４時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後２４時間以内に実施され；（ｂ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に実施されるか、又はステップ（ｉ）の開始後２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１８時間以内に実施され、及びステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）の開始後３０時間以内、例えばステップ（ｉｉ）の開始後２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内に実施され；及び／又は（ｃ）ステップ（ｉ）の開始時における細胞の集団と比較した生細胞数によって評価されるとき、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団は拡大されないか、又は５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％又は４０％以下、例えば、１０％以下だけ拡大され；又はｄ）例えば、ステップ（ｉ）の開始時における細胞の集団と比較した生細胞数によって評価されるとき、ステップ（ｉｉｉ）からの細胞の集団が、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％又は７０％減るか又は少なくなる。一部の実施形態において、ステップ（ｉｉ）の核酸分子はＤＮＡ分子である。一部の実施形態において、ステップ（ｉｉ）の核酸分子はＲＮＡ分子である。一部の実施形態において、ステップ（ｉｉ）の核酸分子は、ウイルスベクター上、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態において、ステップ（ｉｉ）の核酸分子は非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態において、ステップ（ｉｉ）の核酸分子はプラスミド上にある。一部の実施形態において、ステップ（ｉｉ）の核酸分子は、いかなるベクター上にもない。一部の実施形態において、ステップ（ｉｉ）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団に、１つ又は複数のＣＡＲをコードする核酸分子を含む１つ又は複数のウイルスベクターを形質導入することを含む。
前述の方法の一部の実施形態において、本方法は、細胞培養培地に補助剤又は形質導入増強試薬を添加して形質導入効率を増強することを更に含む。一部の実施形態において、補助剤又は形質導入増強試薬は、カチオン性ポリマーを含む。一部の実施形態において、補助剤又は形質導入増強試薬は、ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）（Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１、Ｆ１０８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ ３３８又はＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－３８）、臭化ヘキサジメトリン（ポリブレン）、ＰＥＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７、硫酸プロタミン、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ又はＬｅｎｔｉＴｒａｎｓ（商標）から選択される。一部の実施形態において、補助剤は、ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）（Ｓｉｒｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。他の実施形態において、補助剤は、Ｆ１０８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ ３３８又はＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－３８）である。
一部の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団は、対象からのアフェレーシス試料（例えば、白血球アフェレーシス試料）から採取される。
一部の実施形態において、対象からアフェレーシス試料（例えば、白血球アフェレーシス試料）が採取され、凍結試料（例えば、凍結保存されている試料）として細胞製造施設に発送される。次に凍結アフェレーシス試料が解凍され、例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用して、アフェレーシス試料からＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が選択される。次に、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が播種され、本明細書に記載される活性化プロセスを用いたＣＡＲＴ製造にかけられる。一部の実施形態において、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ製造のための播種前に、１ラウンド以上の凍結融解を受ける。
一部の実施形態において、対象からアフェレーシス試料（例えば、白血球アフェレーシス試料）が採取され、新鮮製剤（例えば、凍結されていない製剤）として細胞製造施設に発送される。例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用して、アフェレーシス試料からＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が選択される。次に、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が播種され、本明細書に記載される活性化プロセスを用いたＣＡＲＴ製造にかけられる。一部の実施形態において、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ製造のための播種前に、１ラウンド以上の凍結融解を受ける。
一部の実施形態において、対象からアフェレーシス試料（例えば、白血球アフェレーシス試料）が採取される。例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用して、アフェレーシス試料からＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が選択される。次に、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が凍結試料（例えば、凍結保存されている試料）として細胞製造施設に発送される。選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）は、後に解凍され、播種され、本明細書に記載される活性化プロセスを用いたＣＡＲＴ製造にかけられる。
一部の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体と接触させて、例えばその直後に、ＣＡＲ（例えば１つ以上のＣＡＲ）をコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）（例えば１つ以上のベクター）が形質導入される。培養開始から２４時間後、細胞が洗浄され、保管又は投与のため製剤化される。
理論によって拘束されることを望むものではないが、ＣＤ３及びＣＤ２８を短時間刺激すると、自己複製Ｔ細胞の効率的な形質導入が促進され得る。従来のＣＡＲＴ製造手法と比較すると、本明細書に提供される活性化プロセスは、長時間にわたるエキソビボ拡大培養を伴わない。サイトカインプロセスと同様に、本明細書に提供される活性化プロセスでも、ＣＡＲＴ製造中、未分化Ｔ細胞が維持されている。
一部の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体と例えば１２時間接触させた後、続いてＣＡＲ（例えば１つ以上のＣＡＲ）をコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）（例えば１つ以上のベクター）が形質導入される。培養開始から２４時間後、細胞が洗浄され、保管又は投与のため製剤化される。
理論によって拘束されることを望むものではないが、ＣＤ３及びＣＤ２８を短時間刺激すると、自己複製Ｔ細胞の効率的な形質導入が促進され得る。従来のＣＡＲＴ製造手法と比較すると、本明細書に提供される活性化プロセスは、長時間にわたるエキソビボ拡大培養を伴わない。サイトカインプロセスと同様に、本明細書に提供される活性化プロセスでも、ＣＡＲＴ製造中、未分化Ｔ細胞が維持されている。
一部の実施形態において、細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させる。
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８ビーズを用いて、例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用したポジティブ選択により選択される。
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ４５ＲＡ及び抗ＣＣＲ７ビーズを用いて、例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用したポジティブ選択により選択される。
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ４５ＲＡ及び抗ＣＤ２７ビーズを用いて、例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用したポジティブ選択により選択される。
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズを用いて、例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用したポジティブ選択により選択される。
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、抗系統ビーズ（Ｔ細胞を除く）を用いて、例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用したネガティブ選択により選択される。
一部の実施形態において、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、ＣＤ３を刺激する薬剤である。一部の実施形態において、共刺激分子を刺激する薬剤は、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＣＤ２、ＣＤ２２６又はこれらの任意の組み合わせを刺激する薬剤である。一部の実施形態において、共刺激分子を刺激する薬剤は、ＣＤ２８を刺激する薬剤である。一部の実施形態において、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗体（例えば、シングルドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディー、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド又はキメラリガンド）から選択される。一部の実施形態において、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗体である。一部の実施形態において、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、抗ＣＤ３抗体である。一部の実施形態において、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗体（例えば、シングルドメイン抗体（例えば、重鎖可変ドメイン抗体）、ペプチボディー、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ）、小分子又はリガンド（例えば、天然に存在するリガンド、組換えリガンド又はキメラリガンド）から選択される。一部の実施形態において、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗体である。一部の実施形態において、共刺激分子を刺激する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体である。一部の実施形態において、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤又は共刺激分子を刺激する薬剤は、ビーズを含まない。一部の実施形態において、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤は、コロイド状ポリマーナノマトリックスに共有結合的に取り付けられた抗ＣＤ３抗体を含む。一部の実施形態において、共刺激分子を刺激する薬剤は、コロイド状ポリマーナノマトリックスに共有結合的に取り付けられた抗ＣＤ２８抗体を含む。一部の実施形態において、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び共刺激分子を刺激する薬剤は、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を含む。
一部の実施形態において、マトリックスは、例えば、細胞にとって非毒性の、ポリマー性、例えば生分解性又は生体適合性の不活性材料を含むか又はそれからなる。一部の実施形態において、マトリックスは親水性ポリマー鎖で構成され、これは、鎖の水和に起因して、水溶液中で最大限の移動度を達成する。一部の実施形態において、移動性のあるマトリックスは、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖、グリコサミノグリカン又は細胞外マトリックス組成物のものであり得る。多糖には、例えば、セルロースエーテル類、デンプン、アラビアゴム、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、キサンタン、グアーガム又はアルギン酸が含まれ得る。他のポリマーには、ポリエステル類、ポリエーテル類、ポリアクリレート類、ポリアクリルアミド類、ポリアミン類、ポリエチレンイミン類、ポリクオタニウムポリマー類、ポリホスファゼン類、ポリビニルアルコール類、ポリ酢酸ビニル類、ポリビニルピロリドン類、ブロック共重合体又はポリウレタン類が含まれ得る。一部の実施形態において、移動性のあるマトリックスは、デキストランのポリマーである。
一部の実施形態において、細胞の集団は、ＣＡＲ（例えば１つ以上のＣＡＲ）をコードする核酸分子（例えば１つ以上の核酸分子）と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団には、ＣＡＲ（例えば１つ以上のＣＡＲ）をコードするＤＮＡ分子（例えば１つ以上のＤＮＡ分子）が形質導入される。
一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることと同時に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０．５時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後２０時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１９時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１８時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１７時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１６時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１５時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１４時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１４時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１３時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１２時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１１時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１０時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後９時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後８時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後７時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後６時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後５時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後４時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後３時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後２時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後１時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後３０分以内に行われる。
一部の実施形態において、細胞の集団は、保管又は投与のため回収される。
一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後７２、６０、４８、３６、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９又は１８時間以内に、保管又は投与のため回収される。一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後２６時間以内に、保管又は投与のため回収される。一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後２５時間以内に、保管又は投与のため回収される。一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後２４時間以内に、保管又は投与のため回収される。一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後２３時間以内に、保管又は投与のため回収される。一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を細胞の集団と接触させることの開始後２２時間以内に、保管又は投与のため回収される。
一部の実施形態において、細胞の集団はエキソビボで拡大されない。
一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を接触させる前の細胞の集団と比較して、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を接触させる前の細胞の集団と比較して、５％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を接触させる前の細胞の集団と比較して、１０％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を接触させる前の細胞の集団と比較して、１５％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を接触させる前の細胞の集団と比較して、２０％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を接触させる前の細胞の集団と比較して、２５％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を接触させる前の細胞の集団と比較して、３０％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を接触させる前の細胞の集団と比較して、３５％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載されるＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤を接触させる前の細胞の集団と比較して、４０％以下だけ拡大される。
一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、２４、３６又は４８時間以下だけ拡大される。
一部の実施形態において、活性化プロセスは、無血清細胞培地で行われる。一部の実施形態において、活性化プロセスは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５（例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ－１５Ｒａ））又はＩＬ－６（例えば、ＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒａ）から選択される１つ以上のサイトカインを含む細胞培地で行われる。一部の実施形態において、ｈｅｔＩＬ－１５は、
Figure 2023503161000031
 のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ｈｅｔＩＬ－１５は、配列番号１０９と少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、活性化プロセスは、ＬＳＤ１阻害薬を含む細胞培地で行われる。一部の実施形態において、活性化プロセスは、ＭＡＬＴ１阻害薬を含む細胞培地で行われる。一部の実施形態において、無血清細胞培地は、血清代替物を含む。一部の実施形態において、血清代替物は、ＣＴＳ（商標）免疫細胞血清代替物（ＩＣＳＲ）である。一部の実施形態において、ＩＣＳＲのレベルは、例えば、最高５％、例えば、約１％、２％、３％、４％又は５％であり得る。理論によって拘束されることを望むものではないが、ＩＣＳＲ、例えば、２％ＩＣＳＲを含む細胞培地、例えばラピッドメディア（Ｒａｐｉｄ Ｍｅｄｉａ）を使用すると、本明細書に記載される製造プロセスの間の細胞生存能が向上し得る。
一部の実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、（ａ）対象から採取したアフェレーシス試料（例えば、新鮮な又は凍結保存された白血球アフェレーシス試料）を提供すること；（ｂ）アフェレーシス試料から（例えば、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はビーズなしの選択を用いて）Ｔ細胞を選択すること；（ｃ）単離したＴ細胞を、例えば１×１０６～１×１０７細胞／ｍＬで播種すること；（ｄ）Ｔ細胞を刺激する薬剤、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤をＴ細胞と接触させること（例えば、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体をＴ細胞と接触させること、例えば、ＴｒａｎｓＡｃｔをＴ細胞と接触させること）；（ｅ）例えば、６～４８時間、例えば、２０～２８時間にわたり、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）をＴ細胞と接触させること（例えば、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を含むウイルスをＴ細胞と接触させること）；及び（ｆ）保管（例えば、Ｔ細胞を凍結保存培地に再製剤化する）又は投与のため、Ｔ細胞を洗浄及び回収することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ステップ（ｆ）は、ステップ（ｄ）又は（ｅ）の開始後３０時間以内、例えばステップ（ｄ）又は（ｅ）の開始後２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内に実施される。
一部の実施形態において、本明細書には、本明細書に記載される製造プロセスのいずれか（例えば、本明細書に記載される活性化プロセス）によって作製される細胞（例えば、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞）の集団が提供される。
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ４５ＲＯ－ ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞の割合は、製造プロセスの開始時（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時）における細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ４５ＲＯ－ ＣＣＲ７＋細胞の割合と比較したとき、（１）同じであるか、（２）例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％以下の差があるか、又は（３）例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５％増加している。一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団は、他の点では同様でありながら、例えば、２６時間より長く続く（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日より長く続く）方法、又は細胞の集団を、例えば３日より長くインビトロで拡大すること（例えば、細胞の集団を、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５日間にわたってインビトロで拡大すること）を伴う方法によって作製された細胞と比較して、より高い割合のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ４５ＲＯ－ ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０％高い）を示す。
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のナイーブ細胞、例えばナイーブＴ細胞、例えばＣＤ４５ＲＡ＋ ＣＤ４５ＲＯ－ ＣＣＲ７＋ Ｔ細胞の割合は、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０％以上である。
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋セントラルメモリーＴ細胞及び／又はＣＣＲ７＋セントラルメモリーＴ細胞の割合は、製造プロセスの開始時（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時）における細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞の割合と比較したとき、（１）同じであるか、（２）例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５％以下の差があるか、又は（３）例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５％減少している。一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団は、他の点では同様でありながら、例えば、２６時間より長く続く（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日より長く続く）方法、又は細胞の集団を、例えば３日より長くインビトロで拡大すること（例えば、細胞の集団を、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５日間にわたってインビトロで拡大すること）を伴う方法によって作製された細胞と比較して、より低い割合のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０％低い）を示す。
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）における細胞の集団中のセントラルメモリー細胞、例えばセントラルメモリーＴ細胞、例えばＣＤ９５＋セントラルメモリーＴ細胞の割合は、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％以下である。
一部の実施形態において、製造プロセスの終了時（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの終了時）の細胞の集団は、インビボ投与後に、他の点では同様でありながら、例えば、２６時間より長く続く（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２日より長く続く）方法、又は細胞の集団を、例えば３日より長くインビトロで拡大すること（例えば、細胞の集団を、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５日間にわたってインビトロで拡大すること）を伴う方法によって作製された細胞と比較して、より長く残存するか又はより高いレベルで拡大する（例えば、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５又は９０％高い）。
一部の実施形態において、細胞の集団は、製造プロセスの開始前に（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始前に）ＩＬ６Ｒ発現細胞（例えば、ＩＬ６Ｒα及び／又はＩＬ６Ｒβ陽性の細胞）が濃縮される。一部の実施形態において、細胞の集団は、製造プロセスの開始時（例えば、本明細書に記載されるサイトカインプロセス又は活性化プロセスの開始時）に、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％以上をＩＬ６Ｒ発現細胞（例えば、ＩＬ６Ｒα及び／又はＩＬ６Ｒβ陽性の細胞）が占める。
サイトカインプロセス
一部の実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えば、１つ以上のＣＡＲ、例えば、２つのＣＡＲ）を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、（１）細胞の集団を、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－６又はこれらの組み合わせから選択されるサイトカインと接触させること、（２）細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）と接触させることであって、それにより核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を提供すること、及び（３）保管のため（例えば、凍結保存培地中に細胞の集団を再製剤化する）又は投与のため、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を回収することを含む方法を提供し、（ａ）ステップ（２）は、ステップ（１）と一緒に実施されるか、又はステップ（１）の開始後５時間以内、例えばステップ（１）の開始後１、２、３、４又は５時間以内に実施され、及びステップ（３）は、ステップ（１）の開始後２６時間以内、例えばステップ（１）の開始後２２、２３又は２４時間以内、例えばステップ（１）の開始後２４時間以内に実施されるか、又は（ｂ）例えば、生細胞数によって評価されるとき、ステップ（１）の開始時における細胞の集団と比較して、ステップ（３）からの細胞の集団は、拡大されないか、又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、ステップ（２）の核酸分子はＤＮＡ分子である。一部の実施形態において、ステップ（２）の核酸分子はＲＮＡ分子である。一部の実施形態において、ステップ（２）の核酸分子は、ウイルスベクター上、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクター上にある。一部の実施形態において、ステップ（２）の核酸分子は非ウイルスベクター上にある。一部の実施形態において、ステップ（２）の核酸分子はプラスミド上にある。一部の実施形態において、ステップ（２）の核酸分子は、いかなるベクター上にもない。一部の実施形態において、ステップ（２）は、１つ又は複数のＣＡＲをコードする１つ又は複数の核酸分子を含むウイルスベクターを細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団に形質導入することを含む。一部の実施形態において、細胞は、本明細書に開示されるタンデム又はデュアルＣＡＲ（例えば、本明細書に開示されるＣＤ１９／ＣＤ２２タンデム又はデュアルＣＡＲ）をコードする核酸分子を含むように操作される。一部の実施形態において、細胞は、本明細書に開示されるダイアボディＣＡＲ、例えば本明細書に開示される抗ＣＤ２２／抗ＣＤ１９ダイアボディＣＡＲをコードする核酸分子を含むように操作される。一部の実施形態において、細胞は、本明細書に開示されるＣＡＲを各々がコードする２つの核酸分子（例えば、抗ＣＤ２２ ＣＡＲをコードする１つの核酸分子及び抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする１つの核酸分子）を含むように操作される。
一部の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団は、対象からのアフェレーシス試料（例えば、白血球アフェレーシス試料）から採取される。
一部の実施形態において、対象からアフェレーシス試料（例えば、白血球アフェレーシス試料）が採取され、凍結試料（例えば、凍結保存されている試料）として細胞製造施設に発送される。次に、凍結アフェレーシス試料が解凍され、例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用して、アフェレーシス試料からＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が選択される。次に、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が播種され、本明細書に記載されるサイトカインプロセスを用いたＣＡＲＴ製造にかけられる。一部の実施形態において、サイトカインプロセスの終了時、ＣＡＲ Ｔ細胞は凍結保存され、後に解凍されて、対象に投与される。一部の実施形態において、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ製造のための播種前に、１ラウンド以上の凍結融解を受ける。
一部の実施形態において、対象からアフェレーシス試料（例えば、白血球アフェレーシス試料）が採取され、新鮮製剤（例えば、凍結されていない製剤）として細胞製造施設に発送される。例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用して、アフェレーシス試料からＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が選択される。次に、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が播種され、本明細書に記載されるサイトカインプロセスを用いたＣＡＲＴ製造にかけられる。一部の実施形態において、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ製造のための播種前に、１ラウンド以上の凍結融解を受ける。
一部の実施形態において、対象からアフェレーシス試料（例えば、白血球アフェレーシス試料）が採取される。例えば、細胞選別機械（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）装置）を使用して、アフェレーシス試料からＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が選択される。次に、選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）が凍結試料（例えば、凍結保存されている試料）として細胞製造施設に発送される。選択されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）は、後に解凍され、播種され、本明細書に記載されるサイトカインプロセスを用いたＣＡＲＴ製造にかけられる。
一部の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞）が播種された後、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５（例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ－１５Ｒａ）から選択される１つ以上のサイトカイン）、ＩＬ－２１又はＩＬ－６（例えば、ＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒ））並びにＣＡＲ（例えば、１つ以上のＣＡＲ）をコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）（例えば１つ以上のベクター）が、細胞に加えられる。２０～２４時間インキュベートした後、細胞が洗浄され、保管又は投与のため製剤化される。
従来のＣＡＲＴ製造手法と異なり、本明細書に提供されるサイトカインプロセスは、ＣＤ３及び／又はＣＤ２８刺激又はエキソビボＴ細胞拡大を伴わない。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体と接触してエキソビボで広範に拡大するＴ細胞は、セントラルメモリー表現型に向かう分化を示す傾向がある。理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書に提供されるサイトカインプロセスでは、ＣＡＲＴ製造中に未分化表現型のＴ細胞が維持されるか又は増加するため、対象への注入後、より長く残存し得るＣＡＲＴ製剤が生じる。
一部の実施形態において、細胞の集団には、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５（例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ－１５Ｒａ）から選択される１つ以上のサイトカイン）、ＩＬ－２１又はＩＬ－６（例えば、ＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒａ）を接触させる。
一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－２と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－７と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－１５（例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ－１５Ｒａ））と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－２１と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－６（例えば、ＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒａ）と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－２及びＩＬ－７と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－２及びＩＬ－１５（例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ－１５Ｒａ））と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－２及びＩＬ－２１と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－２及びＩＬ－６（例えば、ＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒａ）と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－７及びＩＬ－１５（例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ－１５Ｒａ））と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－７及びＩＬ－２１と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－７及びＩＬ－６（例えば、ＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒａ）と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－１５（例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ－１５Ｒａ））及びＩＬ－２１と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－１５（例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ－１５Ｒａ））及びＩＬ－６（例えば、ＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒａ）と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－２１及びＩＬ－６（例えば、ＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒａ）と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団はＩＬ－７、ＩＬ－１５（例えば、ｈｅｔＩＬ－１５（ＩＬ１５／ｓＩＬ－１５Ｒａ））及びＩＬ－２１と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団は、ＬＳＤ１阻害薬と更に接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団は、ＭＡＬＴ１阻害薬と更に接触させる。
一部の実施形態において、細胞の集団は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０又は３００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５と接触させる。
一部の実施形態において、細胞の集団は、ＣＡＲ（例えば、１つ以上のＣＡＲ）をコードする核酸分子（例えば１つ以上の核酸分子）と接触させる。一部の実施形態において、細胞の集団には、ＣＡＲ（例えば１つ以上のＣＡＲ）をコードするＤＮＡ分子（例えば１つ以上のＤＮＡ分子）が形質導入される。
一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることと同時に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後５時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後４時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後３時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後２時間以内に行われる。一部の実施形態において、１つ又は複数のＣＡＲをコードする核酸分子を細胞の集団と接触させることは、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後１時間以内に行われる。
一部の実施形態において、細胞の集団は、保管又は投与のため回収される。
一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後７２、６０、４８、３６、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９又は１８時間以内に、保管又は投与のため回収される。一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後２６時間以内に、保管又は投与のため回収される。一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後２５時間以内に、保管又は投与のため回収される。一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後２４時間以内に、保管又は投与のため回収される。一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後２３時間以内に、保管又は投与のため回収される。一部の実施形態において、細胞の集団は、上記に記載される１つ以上のサイトカインを細胞の集団と接触させることの開始後２２時間以内に、保管又は投与のため回収される。
一部の実施形態において、細胞の集団はエキソビボで拡大されない。
一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、５％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、１０％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、１５％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、２０％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、２５％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、３０％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、３５％以下だけ拡大される。一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、４０％以下だけ拡大される。
一部の実施形態において、細胞の集団は、例えば、生細胞数によって評価されるとき、上記に記載される１つ以上のサイトカインを接触させる前の細胞の集団と比較して、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１６、２０、２４、３６又は４８時間以下だけ拡大される。
一部の実施形態において、細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤（例えば、抗ＣＤ３抗体）及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤（例えば、抗ＣＤ２８抗体）とインビトロでは接触させないか、又は接触させる場合、接触させるステップは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５又は５時間未満である。
一部の実施形態において、細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤（例えば、抗ＣＤ３抗体）及び／又は細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤（例えば、抗ＣＤ２８抗体）と、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８時間にわたってインビトロで接触させる。
一部の実施形態において、本明細書に提供されるサイトカインプロセスを用いて製造される細胞の集団は、他の点では同様でありながら、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体に結合する薬剤（例えば、抗ＣＤ３抗体）及び／又は細胞の表面上の共刺激分子に結合する薬剤（例えば、抗ＣＤ２８抗体）を細胞の集団と接触させることを更に含む方法によって作製された細胞と比較したとき、ＣＡＲ発現細胞中においてより高い割合のナイーブ細胞を示す（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０％高い）。
一部の実施形態において、本明細書に提供されるサイトカインプロセスは、０、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５又は８％以下の血清を含む細胞培地で行われる。一部の実施形態において、本明細書に提供されるサイトカインプロセスは、ＬＳＤ１阻害薬、ＭＡＬＴ１阻害薬又はこれらの組み合わせを含む細胞培地で行われる。
追加の例示的製造方法
一部の実施形態において、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体をコートしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用して活性化され、ＣＡＲ（例えば１つ以上のＣＡＲ）をコードする１つ以上の核酸分子と接触させて、次に、例えば、７、８、９、１０又は１１日間にわたってインビトロで拡大される。一部の実施形態において、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、新鮮な又は凍結保存された白血球アフェレーシス試料から、例えばポジティブ又はネガティブ選択を用いて選択される。一部の実施形態において、細胞は、ＣＡＲ（例えば１つ以上のＣＡＲ）をコードする核酸分子（例えば１つ以上の核酸分子）と接触させる。一部の実施形態において、細胞は、本明細書に開示されるタンデム又はデュアルＣＡＲ（例えば、ＣＤ１９／ＣＤ２２タンデム又はデュアルＣＡＲ）をコードする核酸分子と接触させる。一部の実施形態において、細胞は、一方が第１のＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ２２ ＣＡＲ）を発現し、他方が第２のＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ）を発現する２つの核酸分子と接触させる。一部の実施形態において、細胞は、ダイアボディＣＡＲ（例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ２２／抗ＣＤ１９ダイアボディＣＡＲ）をコードする核酸分子と接触させる。
エルトリエーション
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法は、望ましくない細胞、例えば単球及び芽球を除去し、それによってＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮の向上を得るエルトリエーション方法を特徴とする。一部の実施形態において、本明細書に記載されるエルトリエーション方法は、以前に凍結されていた試料、例えば、解凍した試料からのＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮に最適化される。一部の実施形態において、本明細書に記載されるエルトリエーション方法は、当技術分野において公知のエルトリエーションプロトコルから収集した細胞の調製物と比較したとき純度が向上した細胞の調製物を提供する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるエルトリエーション方法は、ある種の等張液（例えば、ＰＢＳ）を用いた希釈により、最適化された粘度の出発試料、例えば、細胞試料、例えば、解凍した細胞試料を使用すること、及びエルトリエーション装置によって収集される各画分についての流速及び収集容積の最適化された組み合わせを使用することを含む。本発明において適用される可能性のある例示的エルトリエーション方法については、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレット（本明細書において全体として参照により援用される）の４８～５１頁に記載されている。
密度勾配遠心法
養子細胞療法製剤の製造には、末梢血アフェレーシス出発材料中に存在する血液細胞及び血液成分の複合混合物から所望の細胞、例えば免疫エフェクター細胞を離れさせる処理が必要である。末梢血に由来するリンパ球試料の分離が、Ｆｉｃｏｌｌ溶液による密度勾配遠心法を用いて成功している。しかしながら、Ｆｉｃｏｌｌは臨床使用に適格ではないため、Ｆｉｃｏｌｌは、治療用途の細胞の分離に好ましい試薬ではない。加えて、Ｆｉｃｏｌｌはグリコールを含有し、これは細胞にとって有毒である可能性がある。更に、凍結保存後の解凍したアフェレーシス産物のＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法では、例えば、本明細書の実施例に記載するとおり、準最適なＴ細胞産物が生じる。例えば、Ｆｉｃｏｌｌ溶液による密度勾配遠心法によって分離された細胞調製物では、最終産物中のＴ細胞が失われ、それに伴い相対的に非Ｔ細胞、特に望ましくないＢ細胞、芽球及び単球が増加することが観察された。
理論によって拘束されることを望むものではないが、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、凍結保存中に脱水して、新鮮な細胞よりも密度が高くなると考えられる。理論によって拘束されることを望むものではないが、また、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、他の血液細胞よりも長時間にわたって密度が高いままであり、そのため、他の細胞と比較したときＦｉｃｏｌｌ密度勾配分離中に失われ易いとも考えられる。従って、理論によって拘束されることを望むものではないが、Ｆｉｃｏｌｌよりも密度の高い媒体が、Ｆｉｃｏｌｌ又はＦｉｃｏｌｌと同じ密度、例えば、１．０７７ｇ／ｍＬの他の媒体と比較して、所望の免疫エフェクター細胞の分離の向上をもたらすと考えられる。
一部の実施形態において、本明細書に記載される密度勾配遠心方法は、イオジキサノールを含む密度勾配媒体の使用を含む。一部の実施形態において、密度勾配媒体は、水中約６０％のイオジキサノールを含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載される密度勾配遠心方法は、Ｆｉｃｏｌｌよりも高い密度の密度勾配媒体の使用を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載される密度勾配遠心方法は、１．０７７ｇ／ｍＬよりも高い、例えば、１．０７７ｇ／ｍＬよりも高い、１．１ｇ／ｍＬよりも高い、１．１５ｇ／ｍＬよりも高い、１．２ｇ／ｍＬよりも高い、１．２５ｇ／ｍＬよりも高い、１．３ｇ／ｍＬよりも高い、１．３１ｇ／ｍＬよりも高い密度の密度勾配媒体の使用を含む。一部の実施形態において、密度勾配媒体は、約１．３２ｇ／ｍＬの密度を有する。
密度勾配遠心法の更なる実施形態については、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレット（本明細書において全体として参照により援用される）の５１～５３頁に記載されている。
選択による濃縮
本明細書には、ＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮を向上させるための、特定の細胞の選択方法が提供される。一部の実施形態において、選択は、ポジティブ選択、例えば、所望の免疫エフェクター細胞に関する選択を含む。一部の実施形態において、選択は、ネガティブ選択、例えば、望ましくない細胞に関する選択、例えば、望ましくない細胞の除去を含む。実施形態において、本明細書に記載されるポジティブ又はネガティブ選択方法は、例えば、フロースルー装置、例えば本明細書に記載されるフロースルー装置を使用することにより、流動条件下で実施される。例示的ポジティブ及びネガティブ選択については、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレット（本明細書において全体として参照により援用される）の５３～５７頁に記載されている。選択方法は、ＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に関して細胞調製物を更に濃縮するため、例えば、細胞処理システムとも称されるフロースルー装置を使用することにより、流動条件下で実施され得る。例示的フロースルー装置については、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレット（本明細書において全体として参照により援用される）の５７～７０頁に記載されている。例示的細胞分離及び脱ビーズ化方法については、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレット（本明細書において全体として参照により援用される）の７０～７８頁に記載されている。
選択手順は、国際公開第２０１７／１１７１１２号パンフレットの５７～７０頁に記載されているものに限定されない。カラム技術（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｌｕｓ又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標））と組み合わせた、ＣＤ１９、ＣＤ１４及びＣＤ２６ Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズによる望ましくない細胞の除去を介したネガティブＴ細胞選択又はＣＤ４及びＣＤ８ Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズとカラム技術（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｌｕｓ又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標））との組み合わせによるポジティブＴ細胞選択を用いることができる。代わりに、遊離可能なＣＤ３ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるカラムフリー技術を用いることもできる。
加えて、ＴｈｅｒｍｏＧｅｎｅｓｉｓ Ｘシリーズ装置などのビーズフリー技術も同様に利用することができる。
本明細書に開示される細胞を作製する方法には、例えば、中国特許第１０８１０３１０５号明細書、中国特許第１０８０８５３４２号明細書、中国特許第１０８０１８３１２号明細書、中国特許第１０７２８７１６４号明細書、国際公開第１８０５２９４７号パンフレット、国際公開第１７１２３９５６号パンフレット、国際公開第１７１１４４９７号パンフレット、国際公開第１７１０３５９６号パンフレット、国際公開第１７０６８４２１号パンフレット、国際公開第１７０２３８０３号パンフレット、国際公開第１７０１５４２７号パンフレット、国際公開第１６１９６３８８号パンフレット、国際公開第１６１６８５９５号パンフレット、国際公開第１４１８６４６９号パンフレット、国際公開第１７１６５２４５号パンフレット、国際公開第１８１０６７３２号パンフレット、国際公開第１７０１５４９０号パンフレット、国際公開第１８０７５８１３号パンフレット、国際公開第１８１０２７６１号パンフレット、国際公開第１７１２７７５５号パンフレット、国際公開第１７２１４３３３号パンフレット、国際公開第１８０５９５４９号パンフレット、国際公開第１７１９０１００号パンフレット、国際公開第１６１８０７７８号パンフレット、国際公開第１８０５７８２３号パンフレット及び／又は中国特許第１０６９５７８２２号明細書（この一つ一つが本明細書によって全体として参照により援用される）に記載されるとおりの、当技術分野において公知のものが含まれる。
細胞の供給源
拡大及び遺伝子改変又は他の改変前に、細胞、例えばＴ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の供給源を対象から入手することができる。用語「対象」は、免疫応答が誘発され得る生きている生物（例えば、哺乳類）を含むことが意図される。対象の例としては、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びこれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。本発明の開示の一態様において、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離など、当業者に知られるあらゆる技術を使用して、対象から採取した血液の単位から得ることができる。ある好ましい態様において、個体の循環血液からの細胞をアフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は、典型的にはＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球及び血小板を含む。一態様において、アフェレーシスにより採取した細胞は、血漿画分を除去するために洗浄し、任意選択により細胞を続くプロセシング過程のために適切な緩衝液又は媒体に入れる。本発明の一態様において、細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。別の態様において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、又は全てではないにしても多くの二価カチオンを欠き得る。カルシウム非存在下の初期活性化過程は、活性化の増強に至り得る。当業者に容易に認識されるように、洗浄工程は、製造業者の指示に従う半自動化「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）により達成され得る。洗浄後、細胞を、例えば無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ又は他の緩衝剤を含む又は含まない食塩水溶液など、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。代わりに、アフェレーシス試料の望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁し得る。
一態様において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解させて、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）グラジエントでの遠心によるか、又は向流遠心エルトリエーションによって単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離される。
本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の、例えば陰性選択技術を使用する、例えばＴ制御性細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞の特異的亜集団、例えばＴ細胞の選択を含み得る。好ましくは、Ｔ制御性枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋ Ｔ細胞は、抗Ｃ２５抗体、又はその断片、又はＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ－２を使用して集団から除去される。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体、又はその断片、又はＣＤ２５結合リガンドは、基材、例えばビーズにコンジュゲートされるか、又は他の方法で基材、例えばビーズにコーティングされる。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体、又はその断片は、本明細書に記載されるとおり基材にコンジュゲートされる。
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋ Ｔ細胞は、Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇試薬を使用して集団から除去される。一実施形態において、細胞に対するＣＤ２５枯渇試薬の比は、１ｅ７細胞に対して２０ｕＬ、又は１ｅ７細胞に対して１５ｕＬ、又は１ｅ７細胞に対して１０ｕＬ、又は１ｅ７細胞に対して５ｕＬ、又は１ｅ７細胞に対して２．５ｕＬ、又は１ｅ７細胞に対して１．２５ｕＬである。
一実施形態において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。他の態様において、枯渇すべき免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９～１×１０１０（及びその間の任意の整数値）ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含む。一実施形態において、得られたＴ制御性枯渇細胞の集団は、２×１０９Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞又はそれ未満（例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７又はそれ未満のＣＤ２５＋細胞）を含む。
一実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞を、例えばチュービング１６２－０１など、枯渇チュービングセットと共にＣｌｉｎｉＭＡＣ系を使用して集団から除去する。一実施形態において、ＣｌｉｎｉＭＡＣ系を例えばＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１などの枯渇設定において動かす。
本明細書に記載の方法は、２つ以上の選択工程、例えば２つ以上の枯渇工程を含み得る。陰性選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、陰性に選択される細胞に独特な表面マーカーを指向する抗体の組み合わせにより達成できる。１つの方法は、陰性に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫粘着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／又は選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ８に対する抗体を含み得る。
チェックポイント阻害剤、例えば本明細書に記載のチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えばＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞及びＴＩＭ３＋細胞の１つ以上の集団からの除去を含み、それによりＴ制御性枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇細胞及びチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えばＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋及び／又はＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤は、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ＆－１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ及びＬＡＩＲ１を含む。一実施形態において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御性、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗Ｃ２５抗体又はその断片及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はその断片を同じビーズに結合でき、それを細胞の除去に使用でき、又は抗ＣＤ２５抗体又はその断片及び抗チェックポイント阻害剤抗体又はその断片を別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。一部の実施形態において、Ｔ制御性細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去及びチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は、逐次的であり、例えばいずれ順序の順番でも生じ得る。
本明細書に記載される方法は、ポジティブ選択ステップを含み得る。例えば、Ｔ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３ｘ２８）コンジュゲートビーズと共に所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間にわたってインキュベートすることにより単離し得る。一態様において、この時間は約３０分である。更なる態様において、時間は３０分～３６時間又はそれより長い範囲及びその間にあるあらゆる整数値である。更なる態様において、時間は少なくとも１、２、３、４、５、又は６時間である。更に別の好ましい態様において、時間は１０～２４時間である。一態様において、インキュベーション時間は２４時間である。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を腫瘍組織から又は免疫無防備状態の個体から単離するなど、他の細胞型と比較したときＴ細胞がわずかにのみある任意の状況では、Ｔ細胞の単離により長いインキュベーション時間が用いられ得る。更に、より長いインキュベーション時間を用いると、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕捉効率が増加し得る。従って、単純に時間を増減させることにより、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることが可能であり、及び／又はビーズに対するＴ細胞の比を増減させることにより（本明細書に更に記載されるとおり）、培養開始時又はプロセス中の他の時点でＴ細胞の一部の集団を優先的に選択又は除外選択することができる。加えて、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体の比率を増減させることにより、培養開始時又は他の所望の時点でＴ細胞の一部の集団を優先的に選択又は除外選択することができる。
一実施形態において、Ｔ細胞ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ及びパーフォリン又は他の適切な分子、例えば他のサイトカインの１つ以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現についてスクリーニングする方法は、例えば、国際公開第２０１３／１２６７１２号パンフレットに記載する方法により決定できる。
陽性又は陰性選択により所望の細胞の集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は、変わり得る。一態様において、細胞とビーズとの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞とを一緒に混合する体積を有意に低下させる（例えば、細胞濃度を増加させる）ことが望まれ得る。例えば、一態様において、約１００億細胞／ｍｌ、９０億細胞／ｍｌ、８０億細胞／ｍｌ、７０億細胞／ｍｌ、６０億細胞／ｍｌ、又は５０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。一態様において、１０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。一態様において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度を使用する。更なる態様において、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。
高濃度を使用して細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。更に、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞の、又は多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病性血液、腫瘍組織など）からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得、取得することが望ましい。例えば、高濃度細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
関連する態様において、低濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用が最小化される。これは、粒子に結合する所望の抗原を高量で発現する細胞で選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕獲される。一態様において、使用する細胞の濃度は５×１０６／ｍｌである。他の態様において、使用する濃度は約１×１０５／ｍｌ～１×１０６／ｍｌ及びその間の任意の整数値であり得る。
他の態様において、細胞を、種々の長さの時間、種々の速度で２～１０℃又は室温においてローテータでインキュベートし得る。
刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄工程後凍結させ得る。理論に拘束されることを望まないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団から顆粒球及びある程度単球を除去することにより、より均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液及びパラメータが当技術分野で知られ、これに関連して有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ又は１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯ又は３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％Ｄｅｘｔｒａｎ ４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ＤＭＳＯを含む培養培地、又は例えばＨｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む他の適当な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１°／分の速度で－８０℃に凍結し、気相の液体窒素貯蔵タンクに保存する。制御凍結の他の方法並びに直接－２０℃又は液体窒素の非制御凍結も使用できる。
一態様において、凍結保存細胞を本明細書に記載のように解凍し、洗浄し、本発明の方法を使用する活性化前に室温で１時間休息させる。
本発明に関連して、本明細書に記載の増殖細胞が必要となり得る時点の前の期間における対象からの血液試料又はアフェレーシス産物の収集も企図されている。従って、増殖する細胞の供給源を必要な任意の時点で採取でき、Ｔ細胞などの所望の細胞を、本明細書に記載のものなどの免疫エフェクター細胞療法からの利益があるであろう任意の数の疾患及び状態について、免疫エフェクター細胞治療におけるその後の使用のために単離及び凍結できる。一態様において、血液試料又はアフェレーシスを一般に健常対象から採取する。一態様において、血液試料又はアフェレーシスを、一般に、疾患を発症するリスクにあるが、依然として疾患を発症していない健常対象から採取し、目的の細胞をその後の使用のために単離及び凍結する。一態様において、Ｔ細胞をその後の時点で増殖、凍結及び使用し得る。一態様において、試料を、本明細書に記載の特定の疾患の診断の直後に、しかし、何らかの処置前に患者から採取する。更なる態様において、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び照射などの抗体又は他の免疫除去剤による処置を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連する処置モダリティの前に対象からの血液試料又はアフェレーシスから細胞を単離する。
本発明の更なる態様において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、患者から直接得る。ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、処置の直後、患者が、通常、その処置から回復するまでの間、得られるＴ細胞の品質がエクスビボで増殖する能力について最適であり得るか又は改善され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載の方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、生着及びインビボ増殖増強について好ましい状態であり得る。そのため、本発明に関連して、Ｔ細胞、樹状細胞又は造血細胞系統の他の細胞を含む血液細胞をこの回復期に採取することが企図される。更に、一態様において、可動化（例えば、ＧＭ－ＣＳＦでの可動化）及びコンディショニングレジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び／又は増殖に好都合である条件を、特に治療後の定められた時間枠中に対象に形成できる。細胞型の例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び免疫系の他の細胞を含む。
一実施形態において、免疫エフェクターＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば本明細書に記載のＣＡＲ分子は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得る。一実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作される免疫エフェクター細胞の集団、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を、対象又は対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞のレベル又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の比が少なくとも一過性に増加するように、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投薬から十分な時間後又は十分な用量の後に採取する。
一部の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作されているか又は操作する免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増やすか又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の比を増やす量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処理できる。
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ ＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか、又はＤＧＫ活性が低下した又は阻害された細胞である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ発現を低減又は阻止するための遺伝的方法、例えばＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。代わりに、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書に記載のＤＧＫ阻害剤での処置により産生できる。
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスＲＮＡ又はタンパク質を発現しないか、又はイカロス活性が低下した又は阻害された細胞を含み、イカロス欠損細胞は、イカロス発現を低減又は阻止するための遺伝的方法、例えばＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。代わりに、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えばレナリドマイドでの処置により産生できる。
実施形態において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損及びイカロス欠損であり、例えばＤＧＫ及びイカロスを発現せず、又はＤＧＫ及びイカロス活性が低下又は阻害されている。このようなＤＧＫ及びイカロス欠損細胞は、本明細書に記載の方法のいずれかにより産生できる。
一実施形態において、ＮＫ細胞を対象から得る。別の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えばＮＫ－９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
同種ＣＡＲＴ
本明細書に記載の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、同種免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩの発現を欠く同種Ｔ細胞である。
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に何ら機能的ＴＣＲを発現しないように操作され、機能的ＴＣＲを含む１つ以上のサブユニットを発現しないように操作され、又はその表面に微少の機能的ＴＣＲを産生するように操作され得る。代わりに、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１つ以上の変異した又は切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現し得る。用語「実質的に障害されたＴＣＲ」は、このＴＣＲが宿主で有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。かかる細胞は、本明細書に記載されるとおりの１つ以上の遺伝子編集システムを用いて作成することができる。実施形態において、遺伝子編集システムは、ＴＣＲの成分をコードする配列、例えばＴＣＲα定常鎖遺伝子（ＴＲＡＣ）における配列又はその調節エレメントを標的にする。実施形態において、遺伝子編集システムは、ＴＣＲの成分をコードする配列、例えばＴＣＲβ定常鎖遺伝子（ＴＲＢＣ）における配列又はその調節エレメントを標的にする。
本明細書に記載されるＴ細胞は、例えば、その表面上に機能性ＨＬＡを発現しないように操作することができる。例えば、本明細書に記載されるＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラス１及び／又はＨＬＡクラスＩＩが下方制御されるように操作することができる。かかる細胞は、本明細書に記載されるとおり１つ以上の遺伝子編集システムを用いて作成することができる。実施形態において、遺伝子編集システムは、１つ以上のＨＬＡ分子の成分をコードする配列を標的にする。実施形態において、遺伝子編集システムは、１つ以上のＨＬＡ分子の発現に影響を及ぼす因子をコードする配列を標的にする。実施形態において、遺伝子編集システムは、ＭＨＣクラスＩ発現の調節因子、例えばβ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする配列を標的にする。実施形態において、遺伝子編集システムは、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現の調節因子、例えばＣＩＩＴＡをコードする配列を標的にする。実施形態において、ＭＨＣクラスＩ発現の調節因子（例えば、Ｂ２Ｍ）とＭＨＣクラスＩＩ分子発現の調節因子（例えば、ＣＩＩＴＡ）との両方を標的にする遺伝子編集システムが、少なくともＭＨＣクラスＩ分子及び少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子の発現が下方制御されるように細胞に導入される。
一実施形態において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲ及び機能的ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩを欠き得る。
機能的ＴＣＲ及び／又はＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲ又はＨＬＡの１つ以上のサブユニットのノックアウト又はノックダウンを含む任意の適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用したＴＣＲ及び／又はＨＬＡのノックダウンを含み得る。
一実施形態において、同種細胞は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかにより、阻害性分子を発現しないか又は低レベルで発現する細胞であり得る。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下できる、阻害分子を発現しないか又は阻害分子を低レベルで発現する細胞であり得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦβを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。実施形態において、例えば本明細書に記載の阻害性核酸、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）、転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用できる。
例えばＴＣＲ又はＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ
一実施形態において、ＴＣＲ発現及び／又はＨＬＡ発現を、Ｔ細胞におけるＴＣＲ及び／又はＨＬＡをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して阻害できる。
Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系などの任意の慣用の発現系を使用して達成できる。
ＴＣＲの要素の発現を下方制御する代表的ｓｈＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２１６６７号明細書に記載されている。ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現を下方制御する代表的ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７７３号明細書に開示されている。
例えばＴＣＲ又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
本明細書で使用する「ＣＲＩＳＰＲ」、又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ」、又は「ＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ」は、一連の群生性等間隔短回文反復配列又はこのような一連の反復を含む系を指す。本明細書で使用する「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系は、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子の発現抑制又は変異に使用できる、ＣＲＩＳＰＲ及びＣａｓ由来の系を指す。
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％及び配列決定された古細菌の９０％に見られる。Ｇｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．（２００７）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８：１７２。この系は、プラスミド及びファージなどの外来遺伝的要素に対する抵抗性を付与する１種の原核生物免疫系であり、後天性免疫の形態を提供する。Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１５：１７０９－１７１２；Ｍａｒｒａｇｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１８４３－１８４５。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウス又は霊長類などの真核生物における遺伝子エディティング（特定の遺伝子のサイレンシング、増強又は変更）に使用するために改変されている。Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４８２：３３１－８。これは、真核細胞に、特別に設計したＣＲＩＳＰＲ及び１つ以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを導入することにより達成される。
ＣＲＩＳＰＲ座位と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列は、交互の反復及びスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常細菌に対して外来であるプラスミド又はファージ配列などの配列を含み、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーは、ＴＣＲ又はＨＬＡ遺伝子配列に由来する。
ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは、構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質により小ＲＮＡに加工される。これらは、反復配列が隣接したスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質をＲＮＡ又はＤＮＡレベルで外来性遺伝的要素に対して発現抑制するように導く。Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７－１７０；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｉｒｅｃｔ １：７。スペーサーは、そのため、ｓｉＲＮＡに類似して、ＲＮＡ分子の鋳型としての役割を果たす。Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：８３３－８３６。
多くの異なるタイプの細菌で自然に生じるように、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置及び構造、Ｃａｓ遺伝子の機能及び数及びそれらの産物は、種毎にいくぶん異なる。Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０；Ｋｕｎｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．８：Ｒ６１；Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．６０：１７４－１８２；Ｂｏｌｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１：２５５１－２５６１；Ｐｏｕｒｃｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１：６５３－６６３；及びＳｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．２８：３３５－３４０。例えば、Ｃｓｅ（Ｃａｓサブタイプ、大腸菌）タンパク質（例えば、ＣａｓＡ）は、機能的複合体、Ｃａｓｃａｄｅを形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ転写物を、Ｃａｓｃａｄｅが保持するスペーサー－反復単位に加工する。Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－９６４。他の原核生物において、Ｃａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲ転写物を加工する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化は、Ｃａｓｃａｄｅ及びＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１又はＣａｓ２を必要としない。パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）及び他の原核生物におけるＣｍｒ（Ｃａｓ ＲＡＭＰモジュール）タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと機能的複合体を形成し、これは相補的標的ＲＮＡを認識し、開裂する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系は、二重らせんの各鎖のための２活性切断部位を有するヌクレアーゼであるタンパク質Ｃａｓ９に依存する。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせを遺伝子エディティングのための系に使用できる。Ｐｅｎｎｉｓｉ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：８３３－８３６。
従ってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いると、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子を編集し（１つ以上の塩基対を付加する又は欠失させる）、又は中途終止を導入して、ひいてはＴＣＲ及び／又はＨＬＡなどの標的遺伝子又は染色体配列の発現を低下させることができる。代わりに、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをＲＮＡ干渉のように用いて、ＴＣＲ及び／又はＨＬＡ遺伝子を可逆的な方式でオフにすることができる。例えば、哺乳類細胞では、ＲＮＡはＣａｓタンパク質、例えばヌクレアーゼ活性が欠損したＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）をＴＣＲ及び／又はＨＬＡプロモーターにガイドし、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断することができる。
当技術分野において公知の、例えば米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号明細書に記載される技法を用いて、例えばＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを作成することができる。本明細書に記載される発明において有用となり得るＣＲＩＳＰＲシステムとしては、例えば、国際公開第２０１７／０９３９６９号パンフレット（この内容は全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。
例えばＴＣＲ及び／又はＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ」は、ＨＬＡ及び／又はＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである転写アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ開裂ドメインを融合することにより人工的に産生される。転写アクティベータ様効果（ＴＡＬＥ）は、ＨＬＡ又はＴＣＲ遺伝子の部分を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作できる。操作されたＴＡＬＥとＤＮＡ開裂ドメインを合わせることにより、ＨＬＡ又はＴＣＲ配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素を産生できる。次いで、これらを細胞に導入でき、そこで、それらは、ゲノムエディティングのために使用され得る。Ｂｏｃｈ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１３５－６；及びＢｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１２；Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：３５０１。
ＴＡＬＥは、ザントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目及び１３番目のアミノ酸以外、反復した高度に保存的な３３～３４アミノ酸配列を含む。これらの２箇所は、高度に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。それらは、従って、所望のＤＮＡ配列と結合するように操作され得る。
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型又は変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ（Ｎ）と融合する。ＴＡＬＥＮにおいて使用するために、ＦｏｋＩについて幾つかの変異が行われており、これらは、例えば、開裂特異性又は活性の改善を含む。Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：ｅ８２；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３－８；Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：７３１－７３４；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３：３０７；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：７４－７９；Ｓｚｃｚｅｐｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：７８６－７９３；及びＧｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００：９６。
ＦｏｋＩドメインは、二量体として機能し、適切な配向及び間隔を有する標的ゲノムにおける部位のための独特なＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ開裂ドメインとの間のアミノ酸残基数及び２の個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両方が高レベルの活性を達成するために重要なパラメータであると考えられる。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３－８。
ＨＬＡ又はＴＣＲ ＴＡＬＥＮを細胞内で使用して二重鎖切断（ＤＳＢ）を産生できる。変異は、修復機構が切断を非相同末端結合により不適切に修復する場合、切断部位に導入できる。例えば、不適切な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。代わりに、外来ＤＮＡをＴＡＬＥＮと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡの配列及び染色体配列により、この方法は、ＨＬＡ又はＴＣＲ遺伝子における欠損の補正、又はｗｔ ＨＬＡ、又はＴＣＲ遺伝子におけるこのような欠損の導入に使用でき、そうしてＨＬＡ又はＴＣＲの発現を減少させる。
ＨＬＡ又はＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮは、モジュラー要素を使用する多様なスキームを含む、当技術分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４９－５３；Ｇｅｉｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ１９５０９。
例えばＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
「ＺＦＮ」、又は「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲに対するＺＦＮ」、又は「ＨＬＡ及び／又はＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ」は、ＨＬＡ及び／又はＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼを指す。
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（又はその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上の亜鉛フィンガーを含む。Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １８８：７７３－７８２；及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１５６－１１６０。
亜鉛フィンガーは、１つ以上の亜鉛イオンにより安定化される小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことができ、約３ｂｐ配列を認識できる。既知特異性の多様な亜鉛フィンガーを合わせて、約６ｂｐ、９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ又は１８ｂｐ配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生できる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッド系及び哺乳動物細胞を含む、特異的配列を認識する亜鉛フィンガー（及びそれらの組み合わせ）を産生するための多様な選択及びモジュラーアセンブリー技術が利用可能である。
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡを開裂するために二量体化しなければならない。そのため、ＺＦＮの対が非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とすることが必要である。２の各々のＺＦＮは、そのヌクレアーゼが適切に離れて、ＤＮＡの逆の鎖に結合しなければならない。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０５７０－５。
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡに二重鎖切断を創製でき、これは、不適切に修復された場合にフレームシフト変異を創製でき、細胞におけるＨＬＡ及び／又はＴＣＲの発現及び量の減少に至る。ＺＦＮは、ＨＬＡ又はＴＣＲ遺伝子における変異のために相同組換えとも使用できる。
ＨＬＡ及び／又はＴＣＲにおける配列に特異的なＺＦＮは、当技術分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Ｃａｔｈｏｍｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１２００－７；及びＧｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００：９６を参照されたい。
免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化及び増殖
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載する方法を使用して、一般的に活性化及び増殖できる。
一般に、本発明の免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体結合シグナルを刺激する薬剤が結合したその表面とＴ細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドを接触させることにより増殖できる。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片又は抗ＣＤ２抗体との接触又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣアクティベータ（例えば、ブリオスタチン）との接触により、本明細書に記載のように刺激し得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖刺激に適する条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体がある。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８を含み（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、当技術分野で一般に知られる他の方法のように使用できる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）。
一態様において、Ｔ細胞のための一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中でも表面と結合し得る。表面に結合しているとき、薬剤は、同じ表面（即ち「シス」形態）又は別の表面（即ち「トランス」形態）に結合し得る。代わりに、一方の薬剤が表面に結合し、他方が溶液にあり得る。一態様において、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中であるか又は表面と結合する。一態様において、両剤は、溶液中にあり得る。一態様において、薬剤は、不溶性形態であり、Ｆｃ受容体又は抗体又は薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面に架橋され得る。この点に関して、例えば本発明におけるＴ細胞の活性化及び増殖のために意図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書及び同第２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
一態様において、２剤は、ビーズに、同じビーズ、即ち「シス」又は別のビーズ、即ち「トランス」で固定化される。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合断片であり、両剤は、均等な分子量で同じビーズに共固定化される。一態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及びＴ細胞増殖のためのビーズに結合した１：１比の各抗体を使用する。本発明の一態様において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して、Ｔ細胞増殖の増殖が観察されるように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を使用する。特定の一態様において、１：１比を使用して観察された増殖と比較して約１～約３倍増加が観察される。一態様において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体比は、１００：１～１：１００及びその間の全ての整数値の範囲である。本発明の一態様において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合しており、即ちＣＤ３：ＣＤ２８比が１未満である。本発明の一態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体対抗ＣＤ３抗体比は、２：１より大きい。特定の一態様において、ビーズに結合した１：１００ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：７５ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。更なる態様において、ビーズに結合した１：５０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：３０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。ある好ましい態様において、ビーズに結合した１：１０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。一態様において、ビーズに結合した１：３ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。更なる態様において、ビーズに結合した３：１ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体を使用する。
１：５００～５００：１及びその間の任意の整数値の粒子対細胞比をＴ細胞又は他の標的細胞の刺激のために使用し得る。当業者に容易に認識され得るように、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは、少ない細胞にのみ結合でき、大きいビーズは、多く結合できる。一態様において、細胞対粒子比は、１：１００～１００：１及びその間の任意の整数値の範囲であり、更なる態様において１：９～９：１及びその間の任意の整数値からなる比をＴ細胞刺激に使用し得る。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞の比は、上記のように変わり得るが、しかしながら、ある好ましい値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１及び１５：１を含み、１つの好ましい比は少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。一態様において、１：１以下の粒子対細胞比を使用する。特定の一態様において、好ましい粒子：細胞比は、１：５である。更なる態様において、粒子対細胞比は、刺激の日により変わり得る。例えば、一態様において、粒子対細胞比は、１日目は１：１～１０：１であり、更なる粒子をその後１０日目まで連日又は隔日で細胞に添加し、最終比１：１～１：１０である（添加の比の細胞数に基づく）。特定の一態様において、粒子対細胞比は、刺激１日目に１：１であり、刺激３日目及び５日目に１：５に調節する。一態様において、粒子を、１日目の１：１及び刺激３日目及び５日目の１：５の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。一態様において、粒子対細胞比は、刺激１日目は２：１であり、刺激３日目及び５日目に１：１０に調節する。一態様において、粒子を、１日目の１：１及び３日目及び５日目の１：１０の最終比に基づき、連日又は隔日で添加する。当業者は、多様な他の比が本発明における使用に適し得ることを認識する。特に、比は、粒子径並びに細胞サイズ及びタイプによる。一態様において、使用するための最も典型的な比は、１日目の１：１、２：１及び３：１付近である。
本発明の更なる態様において、Ｔ細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズ及び細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。異なる態様において、培養前に薬剤被覆ビーズ及び細胞を分離するが、一緒に培養する。更なる態様において、ビーズ及び細胞を磁気力などの力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ（３ｘ２８ビーズ）とＴ細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。一態様において、細胞（例えば、１０４～１０９Ｔ細胞）及びビーズ（例えば、ＤＹＮＡビーズＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズを１：１比）を緩衝液、例えばＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価カチオンなし）中で合わせる。再び、任意の細胞濃度を使用し得ることが当業者に容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、試料中で極めて稀であり、試料の０．０１％のみが含まれるか又は試料全体（即ち１００％）が目的の標的細胞で構成され得る。従って、あらゆる細胞数が本発明に関連して一体となる。一態様において、細胞と粒子との最大接触を確実にするために、粒子及び細胞を混合する体積を有意に減少させる（即ち細胞の濃度を高める）ことが望ましいことがある。例えば、一態様において、約１００億細胞／ｍｌ、９０億／ｍｌ、８０億／ｍｌ、７０億／ｍｌ、６０億／ｍｌ、又は５０億／ｍｌの濃度を使用する。一態様において、１億細胞／ｍｌ超を使用する。更なる態様において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万又は５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。更なる態様において、細胞の７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万又は１億細胞／ｍｌの濃度を使用する。更なる態様において、１億２５００万又は１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化及び細胞増殖を増加できる。更に、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得、及び特定の態様では得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度細胞の使用は、通常、ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
一実施形態において、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸が形質導入された細胞を例えば本明細書に記載の方法により増殖する。一実施形態において、細胞を数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間）～約１４日（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又は１４日）の期間の培養により増殖する。一実施形態において、細胞は、４～９日の期間増殖される。一実施形態において、細胞は、８日以下、例えば７日、６日又は５日の期間増殖される。一実施形態において、細胞、例えば本明細書に記載のデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲを含む、例えば発現する細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件において９日間培養で増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死、サイトカイン産生、活性化、遊走又はそれらの組み合わせにより規定され得る。一実施形態において、５日増殖された細胞、例えば本明細書に記載のＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍又は４倍増加を示す。一実施形態において、細胞、例えば本明細書に記載のデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲを含む、例えば発現する細胞は、５日の培養により増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えばＩＦＮ－γ及び／又はＧＭ－ＣＳＦレベルを示す。一実施形態において、例えば、本明細書に記載のデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲを含む、例えば発現する細胞は、５日増殖され、同じ培養条件下において９日間培養で増殖された同じ細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生、例えばＩＦＮ－γ及び／又はＧＭ－ＣＳＦレベルのｐｇ／ｍｌで少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれを超えて増加する。
本発明の一態様において、混合物を数時間（約３時間）～約１４日又はその間の任意の時間的整数値だけ培養し得る。一態様において、混合物を２１日培養し得る。本発明の一態様において、ビーズ及びＴ細胞を一緒に約８日培養する。一態様において、ビーズ及びＴ細胞を一緒に２～３日培養する。Ｔ細胞の培養期間が６０日以上となり得るような数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養に適する条件は、血清（例えば、胎児ウシ又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ及びＴＮＦ－α又は当業者に知られる細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存能に必要な因子を含み得る、適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又はＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート、及びＮ－アセチル－システイン、及び２－メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、無血清又は適切な量の血清（又は血漿）が添加されたか、又は規定されたセットのホルモン及び／又はＴ細胞の増殖及び拡大に十分な量のサイトカインが添加されたＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５及びＸ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンは、実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養に含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。
一実施形態において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーなどの本明細書に記載の方法により測定して、１４日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）増加をもたらす１つ以上のインターロイキンを含む適切な培地（例えば、本明細書に記載の培地）で増殖させる。一実施形態において、細胞は、ＩＬ－１５及び／又はＩＬ－７（例えば、ＩＬ－１５及びＩＬ－７）の存在下で増殖させる。
種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液又はアフェレーシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性又はサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８～９日目前まで主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８～９日目後、Ｔ細胞の集団は、徐々に大きくなるＴＣ細胞の集団を含む。従って、処置の目的により、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットを大きい程度まで増殖させることが有利であり得る。
更に、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中、有意に、しかし、主に再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物をもたらす能力を可能とする。
ＣＡＲ、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲが構築されると、適切なインビトロ及び動物モデルにおける抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのＴ細胞増殖の持続及び抗癌活性など、しかし、これらに限定されない分子の活性を評価するために種々のアッセイが使用され得る。ＣＡＲ、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、以下に更に詳細に記載する。
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウエスタンブロット分析を、単量体及び二量体の存在を検出するために使用できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。極めて簡潔には、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）をインビトロで１０日超増殖させ、続いて溶解及び還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥを行う。全長ＴＣＲ－ζ細胞質ドメイン及び内因性ＴＣＲ－ζ鎖を含むＣＡＲを、ＴＣＲ－ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合性二量体形成の評価を可能とするために非還元条件下のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に使用する。
抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞のインビトロ増殖をフローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８ ａＡＰＣで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下において、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。代表的プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ－１α、ユビキチンＣ又はホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの培養６日目にフローサイトメトリーにより評価する。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。代わりに、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用するＣＡＲとｅＧＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を、洗浄後、ＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２－ＣＤ１９）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体存在下ｈＣＤ３２及び４－１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＢＢＬ－３／２８）で再刺激する。外来性ＩＬ－２を１００ＩＵ／ｍｌにおいて隔日で培養物に添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。抗ＣＤ２０ Ｔ細胞（例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ ２０１４；１２３：２３４３を参照されたい）を用いて、又は抗ＣＤ２０ ＣＡＲ Ｔ細胞と共に類似のアッセイを実施することができる。
再刺激非存在下の持続するＣＡＲ＋Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。簡潔には、平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激及び１日目の記載するＣＡＲの形質導入後、培養８日目にＣｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩＩ粒子カウンター、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｃｅｐｔｅｒを使用して測定する。
動物モデルもＣＡＲＴ活性の測定に使用できる。例えば、免疫欠損マウスにおける初代ヒトプレＢ ＡＬＬを処置するための、ヒトＣＤ１９特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用する異種移植モデルを使用できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。極めて簡潔には、ＡＬＬ確立後、マウスを処置群に無作為化する。異なる数のαＣＤ１９－ζ及びαＣＤ１９－ＢＢ－ζ操作Ｔ細胞を、Ｂ－ＡＬＬを担持するＮＯＤ－ＳＣＩＤ－γ－／－マウスに１：１の比で共注射する。マウスからの脾臓ＤＮＡにおけるαＣＤ１９－ζ及びαＣＤ１９－ＢＢ－ζベクターのコピー数をＴ細胞注射後種々の時点で評価する。動物を１週間間隔で白血病について評価する。末梢血ＣＤ１９＋Ｂ－ＡＬＬ芽細胞数を、αＣＤ１９－ζ ＣＡＲ＋Ｔ細胞又は偽形質導入Ｔ細胞を注射したマウスで測定する。ログ・ランク検定を使用して、群の生存曲線を比較する。更に、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－γ－／－マウスへのＴ細胞注射４週間後の絶対的末梢血ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞数も分析し得る。マウスに白血病性細胞を注射し、３週間後、ｅＧＦＰに連結したＣＡＲをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによりＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞を注射する。Ｔ細胞を、注入ＧＦＰ＋Ｔ細胞の４５～５０％に、注射前に偽形質導入細胞と混合することにより標準化し、フローサイトメトリーにより確認する。動物を１週間間隔で白血病について評価する。ＣＡＲ＋Ｔ細胞群の生存曲線を、ログ・ランク検定を使用して比較する。類似の実験をデュアルＣＡＲＴ又はタンデムＣＡＲＴで実施できる。
用量依存的ＣＡＲ処置応答を評価できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。例えば、２１日目にＣＡＲ Ｔ細胞、等しい数の偽形質導入Ｔ細胞で処置した又はＴ細胞処置なしの、マウスにおいて白血病が確立した後３５～７０日後に末梢血を得る。各群からのマウスを末梢血ＣＤ１９＋ＡＬＬ芽細胞数の決定のために無作為に採血し、３５日目及び４９日目に屠殺する。残りの動物を５７日目及び７０日目に評価する。類似の実験をデュアルＣＡＲＴ又はタンデムＣＡＲＴで実施できる。
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価は、例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）に以前に記載されている。簡潔には、ＣＡＲ介在増殖の評価を、洗浄したＴ細胞と、ＣＤ１９（Ｋ１９）又はＣＤ３２及びＣＤ１３７（ＫＴ３２－ＢＢＬ）を発現するＫ５６２細胞とを最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比２：１で混合することによりマイクロタイタープレートにおいて実施する。Ｋ５６２細胞を使用前にガンマ線で照射する。抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体を、これらのシグナルがエクスビボでの長期ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を支持するため、刺激Ｔ細胞増殖について陽性対照として役立つＫＴ３２－ＢＢＬ細胞の培養物に添加する。Ｔ細胞を、製造者により記載のとおりＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びフローサイトメトリーを使用して培養において数える。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ－２Ａ連結ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで操作されたＴ細胞を使用するＧＦＰ発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋Ｔ細胞について、ＣＡＲ＋Ｔ細胞をビオチニル化組み換えＣＤ１９タンパク質及び二次アビジン－ＰＥコンジュゲートにより検出する。Ｔ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋発現も、特異的モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して同時に検出する。サイトカイン測定を、製造業者の指示に従ってヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して再刺激２４時間後に回収した上清で又はＬｕｍｉｎｅｘ ３０－ｐｌｅｘキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施する。ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して蛍光を評価し、データを製造業者の指示に従って分析する。類似の実験をデュアルＣＡＲＴ又はタンデムＣＡＲＴで実施できる。
細胞毒性を標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい。簡潔には、標的細胞（Ｋ５６２株及び初代プロＢ－ＡＬＬ細胞）に５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４として、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞をウェル中で完全ＲＰＭＩ中に標的細胞と種々のエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で混合する。更なる培地のみ（自発的放出、ＳＲ）又はｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００洗剤１％溶液（全放出、ＴＲ）を含むウェルも調製する。３７℃で４時間のインキュベーション後、各ウェルから上清を回収する。放出された５１Ｃｒを、次いでガンマ粒子カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して測定する。各条件を少なくとも３回行い、溶解のパーセントを式：溶解％＝（ＥＲ－ＳＲ）／（ＴＲ－ＳＲ）（式中、ＥＲは、各実験条件で放出された平均５１Ｃｒを示す）を使用して計算する。
造影技術を使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送及び増殖を評価できる。このようなアッセイは、例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１５７５－１５８６（２０１１）に記載されている。簡潔には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ－／－（ＮＳＧ）マウスにＮａｌｍ－６細胞をＩＶ注射し、７日後、ＣＡＲ構築物でエレクトロポレーションから４時間後にＴ細胞を注射する。Ｔ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定にトランスフェクトされ、マウスをバイオルミネセンスについて造影する。代わりに、Ｎａｌｍ－６異種移植モデルにおけるＣＡＲ＋Ｔ細胞の単回注射の治療有効性及び特異性を次のように測定できる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように形質導入したＮａｌｍ－６を注射し、続いて７日後にＣＡＲで電気穿孔したＴ細胞を１回尾静脈注射する。動物を注射後の種々の時点で造影する。例えば、５日目（処置２日前）及び８日目（ＣＡＲ＋ＰＢＬ後２４時間）に代表的マウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを作成できる。
本明細書の実施例のセクションに記載されるもの並びに当技術分野において公知のものを含め、他のアッセイも、本明細書に開示されるデュアルＣＡＲＴ又はタンデムＣＡＲＴコンストラクトの評価に用いることができる。
治療上の適用
本発明は、特に、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関連する癌若しくは疾患又はＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を発現する細胞に関連する病態を治療するための組成物及び方法を提供する。一部の実施形態において、癌又は疾患には、例えば、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態；又はＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を発現する細胞に関連する非癌関連徴候が含まれる。一態様において、ＣＤ２２の発現に関連する癌又は疾患は血液癌である。一態様において、血液癌としては、限定はされないが、Ｂ細胞悪性腫瘍が挙げられる。一態様において、血液癌は白血病又はリンパ腫である。一態様において、癌、例えばＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関連する癌としては、限定はされないが、例えばＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＢＡＬＬ）、例えば小児ＢＡＬＬ及び／又は成人ＢＡＬＬ、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含むが、それに限定されない１つ以上の急性白血病；慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むが、それに限定されない１つ以上の慢性白血病；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁層リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び「前白血病」（これは骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）によってまとめられる多様な血液学的病態の群である）を含むが、それに限定されない更なる血液癌又は血液学的病態を含めた癌及び悪性腫瘍が挙げられる。一部の実施形態において、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２発現に関連する疾患としては、限定はされないが、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を発現する非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
ＣＤ２２の発現に関連する非癌関連徴候も含まれ得る。ＣＤ２２の発現に関連する非癌関連徴候としては、限定はされないが、例えば自己免疫疾患（例えば、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、脈管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎及びデビック病、グレーブス眼症、及び自己免疫性膵炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）及び移植が挙げられる。
一態様において、本発明は、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２発現に関連する疾患を治療する方法を提供する。一態様において、本発明は、腫瘍の一部がＣＤ１９及び／又はＣＤ２２陰性であり、且つ腫瘍の一部がＣＤ１９及び／又はＣＤ２２陽性である疾患を治療する方法を提供する。例えば、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関連する疾患の治療を受けたことがある対象の治療に有用であり、ここで、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関して治療を受けたことがある対象は、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２の発現に関連する疾患を呈する。
一態様において、本発明は、哺乳類Ｔ細胞又はＮＫ細胞で発現させるためのプロモーターに作動可能に連結された本明細書に記載されるとおりのＣＡＲを含むベクターに関する。一態様において、本発明は、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２発現腫瘍の治療における使用のためのＣＡＲを発現する組換えＴ細胞を提供し、ＣＤ１９ ＣＡＲ及びＣＤ２２ ＣＡＲを発現する組換えＴ細胞は、デュアルＣＡＲＴと称される。一態様において、本発明は、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２発現腫瘍の治療における使用のためのＣＡＲを発現する組換えＴ細胞を提供し、ＣＤ１９抗原結合ドメイン及びＣＤ２２抗原結合ドメインを発現する組換えＴ細胞は、タンデムＣＡＲＴと称される。一態様において、本発明のデュアルＣＡＲＴ又はタンデムＣＡＲＴは、ＣＡＲＴが腫瘍細胞を標的化し、腫瘍の成長が阻害されるように、ＣＡＲＴの表面上に発現した本発明の少なくとも１つのＣＤ１９ ＣＡＲ又はＣＤ２２ ＣＡＲを腫瘍細胞に接触させる能力を有する。
一態様において、本発明は、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、ＣＡＲ発現細胞が抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的化するように、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現ＮＫ細胞を腫瘍細胞と接触させることを含み、腫瘍の成長が阻害される、方法に関する。
一態様において、本発明は、対象の癌を治療する方法に関する。この方法は、対象において癌が治療されるように、対象に、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞によって治療可能な癌の例は、ＣＤ２２の発現に関連する癌である。本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞によって治療可能な癌の例としては、限定はされないが、本明細書に記載される血液癌が挙げられる。本発明は、細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変され、及びＣＡＲ発現細胞がそれを必要としているレシピエントに注入される一種の細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体療法と異なり、ＣＡＲ改変細胞はインビボで複製可能であるため長期間持続し、これが持続的な腫瘍制御につながり得る。様々な態様において、患者に投与されるＴ細胞、又はその子孫は、患者において、患者への細胞の投与後少なくとも４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、１３ヵ月、１４ヵ月、１５ヵ月、１６ヵ月、１７ヵ月、１８ヵ月、１９ヵ月、２０ヵ月、２１ヵ月、２２ヵ月、２３ヵ月、２年、３年、４年、又は５年持続する。
本発明は、免疫エフェクター細胞、例えばＮＫ細胞又はＴ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一過性に発現するように例えばインビトロ転写ＲＮＡによって改変され、及びＣＡＲ発現（例えば、ＣＡＲＴ又はＣＡＲ発現ＮＫ）細胞がそれを必要としているレシピエントに注入される一種の細胞療法も含む。注入された細胞は、レシピエントの癌細胞を死滅させることが可能である。従って、様々な態様において、患者に投与されるＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、患者へのＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の投与後１ヵ月未満、例えば３週間、２週間、１週間存在する。
一態様において、本発明のＣＡＲ修飾細胞、例えば完全ヒトＣＡＲ発現細胞は、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化及び／又はインビボ治療のための１種のワクチンである。一態様において、哺乳動物は、ヒトである。
エクスビボ免疫化に関して、次の少なくとも１つは、哺乳動物に細胞を投与する前にインビトロで起こる。ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）細胞へのＣＡＲをコードする核酸の導入又はｉｉｉ）細胞の凍結保存。
エクスビボ過程は、当技術分野で周知であり、下により詳細に記載する。簡潔には、細胞を哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、本明細書に記載するＣＡＲを発現するベクターで遺伝的に改変（即ちインビトロで形質導入又はトランスフェクト）される。ＣＡＲ修飾細胞を哺乳動物レシピエントに投与して、治療効果を提供できる。哺乳動物レシピエントは、ヒトであり得、ＣＡＲ修飾細胞は、レシピエントに対して自己であり得る。代わりに、細胞は、レシピエントに対して同種、同系又は異種であり得る。
参照により本明細書に援用される米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載する造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ増殖のための方法を本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法は、当技術分野で知られ、従って、本発明は、細胞のエクスビボ増殖の特定の方法に限定されない。簡潔には、Ｔ細胞のエクスビボ培養及び増殖は、（１）哺乳動物からの採取した末梢血又は髄外植体からのＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞回収、及び（２）エクスビボでのこのような細胞の増殖を含む。米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載される細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３及びｃ－ｋｉｔリガンドなどの他の因子を細胞の培養及び増殖に使用できる。
エクスビボ免疫化の点で細胞ベースのワクチンを使用するのに加えて、本発明は、患者における抗原に対する免疫応答を惹起するための、インビボ免疫化のための組成物及び方法も提供する。
概して、本明細書に記載されるとおり活性化され、拡大される細胞は、免疫無防備状態の個体に生じる疾患の治療及び予防に利用され得る。詳細には、本発明のＣＡＲ改変細胞は、ＣＤ２２及び／又はＣＤ１９の発現に関連する疾患、障害及び病態の治療に使用される。特定の態様において、本発明の細胞は、ＣＤ２２及び／又はＣＤ１９の発現に関連する疾患、障害及び病態を発症するリスクがある患者の治療に使用される。従って、本発明は、本発明のＣＡＲ改変細胞の治療有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む、ＣＤ２２及び／又はＣＤ１９の発現に関連する疾患、障害及び病態の治療又は予防方法を提供する。
一態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病などの前癌病態の治療に使用され得る。一態様において、ＣＤ２２及び／又はＣＤ１９の発現に関連する癌は、細胞の異常な成長によって特徴付けられる血液癌、前白血病、過剰増殖性障害、過形成又は異形成である。
一態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞は癌の治療に使用され、ここで、癌は血液癌である。血液癌病態は、白血病及び悪性リンパ球増殖性病態など、血液、骨髄及びリンパ系に発症する種類の癌である。
白血病は、急性白血病と慢性白血病とに分類することができる。急性白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）とに細分することができる。慢性白血病には慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が含まれる。他の関連する病態には骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、旧称「前白血病」）が含まれ、これは、骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）及びＡＭＬへの形質転換リスクによってまとめられる多様な血液学的病態の群である。
リンパ腫は、リンパ球から発達する血球細胞腫瘍の群である。例示的リンパ腫には、非ホジキンリンパ腫及びホジキンリンパ腫が含まれる。
一態様において、本発明の組成物及びＣＡＲ発現細胞は、非ホジキンリンパ腫、例えばＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、又はＣＬＬなどのＢ細胞悪性腫瘍の治療に特に有用である。
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、Ｂ細胞又はＴ細胞のいずれかから形成されるリンパ球の癌の群である。ＮＨＬはいずれの年齢でも起こり、多くの場合、正常よりも大きいリンパ節、体重減少、及び発熱によって特徴付けられる。ＮＨＬの異なる種類は、侵攻型（急激に成長する）及び無痛型（成長が遅い）に分類される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫には、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫が含まれる。Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫の例としては、菌状息肉症、未分化大細胞型リンパ腫、及び前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫が挙げられる。骨髄移植後又は幹細胞移植後に起こるリンパ腫は、典型的にはＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。例えば、Ｍａｌｏｎｅｙ．ＮＥＪＭ．３６６．２１（２０１２）：２００８－１６を参照されたい。
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、Ｂ細胞から発達するＮＨＬの一形態である。ＤＬＢＣＬは、リンパ節内又はリンパ系外、例えば胃腸管、精巣、甲状腺、皮膚、乳房、骨、又は脳に生じ得る侵攻性リンパ腫である。ＤＬＢＣＬでは一般に３つの細胞形態変種：中心芽球型、免疫芽球型、及び未分化型が観察される。中心芽球形態は最も一般的であり、細胞質が最小限の中型～大型リンパ球の出現を有する。ＤＬＢＣＬにはサブタイプが幾つかある。例えば、原発性中枢神経系リンパ腫は、脳にのみ発症するＤＬＢＣＬの一種であり、脳以外の範囲に発症するＤＬＢＣＬと異なって呼ばれ且つ治療される。別の種類のＤＬＢＣＬは原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫であり、これは多くの場合に若年患者に起こり、胸部で急激に成長する。ＤＬＢＣＬの症状には、肥大したリンパ節によって引き起こされる頸部、腋窩、又は鼡径部の無痛性の急激な腫脹が含まれる。一部の対象については、腫脹は有痛性のこともある。ＤＬＢＣＬの他の症状には、寝汗、原因不明発熱、及び体重減少が含まれる。ほとんどのＤＬＢＣＬ患者は成人であるが、この疾患は時に小児に起こる。ＤＬＢＣＬの治療には、化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、エトポシド）、抗体（例えば、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ））、放射線照射、又は幹細胞移植が含まれる。
濾胞性リンパ腫は、一種の非ホジキンリンパ腫であり、濾胞中心Ｂ細胞（中心細胞及び中心芽球）のリンパ腫であり、少なくとも部分的に濾胞状のパターンを有する。濾胞性リンパ腫細胞はＢ細胞マーカーのＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２を発現する。濾胞性リンパ腫細胞は、一般にＣＤ５陰性である。形態学的には、濾胞性リンパ腫腫瘍は、中心細胞の混合物を含む濾胞（切断型濾胞中心細胞又は小細胞とも称される）及び中心芽球（大型非切断型濾胞中心細胞又は大細胞とも称される）で構成される。濾胞は非悪性細胞、大部分はＴ細胞に取り囲まれている。濾胞は主に中心細胞を含み、少数の中心芽球を伴う。世界保健機関（ＷＨＯ）は、この疾患を以下のとおり形態学的にグレード分けしている：グレード１（強拡大視野（ｈｐｆ）当たり＜５個の中心芽球；グレード２（６～１５個の中心芽球／ｈｐｆ）；グレード３（＞１５個の中心芽球／ｈｐｆ）。グレード３は以下のグレードに更に細分される：グレード３Ａ（中心細胞がなおも存在する）；グレード３Ｂ（濾胞がほぼ完全に中心芽球からなる）。濾胞性リンパ腫の治療には、化学療法、例えばアルキル化剤、ヌクレオシド類似体、アントラサイクリン含有レジメン、例えばＣＨＯＰ－シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン／プレドニゾロンと呼ばれる併用療法、抗体（例えば、リツキシマブ）、放射免疫療法、及び造血幹細胞移植が含まれる。
ＣＬＬは、骨髄、血液、リンパ節、及び脾臓における新生細胞の増殖及び蓄積によって特徴付けられるＢ細胞悪性腫瘍である。ＣＬＬの診断時の年齢中央値は約６５歳である。現行の治療には、化学療法、放射線療法、生物学的療法、又は骨髄移植が含まれる。時に症状は外科的に（例えば、脾摘出術による肥大化した脾臓の除去）又は放射線療法によって（例えば、腫大リンパ節の減量）治療される。ＣＬＬを治療する化学療法剤としては、例えば、フルダラビン、２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、クロラムブシル、ビンクリスチン、ペントスタチン、シクロホスファミド、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ）、ドキソルビシン、及びプレドニゾンが挙げられる。ＣＬＬのための生物学的療法としては、抗体、例えばアレムツズマブ、リツキシマブ、及びオファツムマブ；並びにチロシンキナーゼ阻害薬療法が挙げられる。幾つもの基準、例えばライ（Ｒａｉ）又はビネー（Ｂｉｎｅｔ）方式を用いてＣＬＬのステージを分類することができる。ライ方式は、ＣＬＬが５つのステージを有するものとして記載する：ステージ０、リンパ球増加症のみが存在する；ステージＩ、リンパ節症が存在する；ステージＩＩ、脾腫、リンパ節症、又は両方が存在する；ステージＩＩＩ、貧血症、臓器肥大、又は両方が存在する（進行は、体重減少、疲労、発熱、重度の臓器肥大、及びリンパ球数の急激な増加によって定義付けられる）；及びステージＩＶ、貧血症、血小板減少症、臓器肥大、又はこれらの組み合わせが存在する。ビネーのステージ分類方式に基づき、３つのカテゴリがある：ステージＡ、リンパ球増加症が存在し、３つ未満のリンパ節が腫大している（このステージには、ライのステージ０患者の全て、ライのステージＩ患者の半分、及びライのステージＩＩ患者の３分の１が含まれる）；ステージＢ、３つ以上のリンパ節に病変がある；及びステージＣ、貧血症又は血小板減少症、又は両方が存在する。これらの分類方式を免疫グロブリン遺伝子の突然変異の測定値と組み合わせて、疾患の状態のより正確な特徴付けを提供することができる。突然変異免疫グロブリン遺伝子の存在は予後判定の改善と相関する。
別の実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、癌又は白血病、例えば白血病幹細胞を伴うものの治療に使用される。例えば、白血病幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－白血病細胞である。
本発明は、とりわけ、癌を治療するための組成物及び方法を提供する。一態様において、癌は、限定はされないが、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＢＡＬＬ）、例えば、小児ＢＡＬＬ及び／又は成人ＢＡＬＬ、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含むが、これらに限定されない１つ以上の急性白血病；慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むが、これらに限定されない１つ以上の慢性白血病；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症及び「前白血病」（これは、骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）によってまとめられる一群の多様な血液学的病態である）を含むが、これらに限定されない更なる血液癌又は血液学的病態を含めた血液癌並びに限定はされないが、ＣＤ２２を発現する非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患を含めたＣＤ２２発現に関連する疾患；及びこれらの任意の組み合わせである。
本発明のＣＡＲ改変細胞は、単独で投与されるか、或いは希釈剤及び／又はＩＬ－２若しくは他のサイトカイン又は細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与されるかのいずれかであり得る。
別の態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞は、以前にＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞で治療された対象の治療に用いられ得る。一部の実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞は、以前にＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞で治療された癌又は他の病態の再発後に投与される。
一部の実施形態において、癌又は他の病態は、ＣＤ１９を発現するものである。一部の実施形態において、癌又は他の病態は、ＣＤ２２を発現するものである。一部の実施形態において、癌又は他の病態は、ＣＤ１９及びＣＤ２２を発現するものである。
一部の実施形態において、癌又は他の病態は、これまでＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞に応答性があったことがない。一部の実施形態において、対象の癌又は他の病態は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性である。一部の実施形態において、癌又は他の病態は、現在よりもＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性が高かった。一部の実施形態において、癌又は他の病態は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった。一部の実施形態において、癌又は他の病態は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であったとともに、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞にもはや応答性がない。
一部の実施形態において、ＣＡＲ、例えば、デュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ（例えば、本明細書に記載されるとおりの）は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞に対する応答性の低下又は喪失が原因で投与される。一部の実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞療法は中止されている。一部の実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞に対する応答性の低下又は喪失が原因で中止されている。
一部の実施形態において、ＣＡＲ、例えば、デュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ（例えば、本明細書に記載されるとおりの）は、ＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞に対する応答性の低下又は喪失が原因で投与される。一部の実施形態において、ＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞療法は中止されている。一部の実施形態において、ＣＤ２２ ＣＡＲ療法は、ＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞に対する応答性の低下又は喪失が原因で中止されている。
本発明は、ＣＤ２２発現細胞に関連する疾患（例えば、ＣＤ２２を発現する血液癌又は非定型癌）を予防、治療及び／又は管理する方法であって、必要としている対象に、ＣＤ２２発現細胞に結合する本発明のＣＤ２２ ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む方法も提供する。一態様において、対象はヒトである。ＣＤ２２発現細胞に関連する障害の非限定的な例としては、自己免疫疾患（例えば、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、脈管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎及びデビック病、グレーブス眼症及び自己免疫性膵炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、移植及び癌（ＣＤ２２を発現する血液癌又は非定型癌など）が挙げられる。
本発明は、ＣＤ２２発現細胞に関連する疾患を予防、治療及び／又は管理する方法であって、必要としている対象に、ＣＤ２２発現細胞に結合する本発明のデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞を投与することを含む方法も提供する。一態様において、対象は、ヒトである。
一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する非奏効例である。一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する部分奏効例である。一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する完全奏効例である。一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する非再発例である。一部の実施形態において、対象は、ＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する再発例である。
一部の実施形態において、以前にＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態は、ＣＤ１９を発現しない。一部の実施形態において、以前にＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態は、癌又は他の病態がＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であったときと比べてＣＤ１９発現レベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれを超える低下を示す。一部の実施形態において、以前にＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態は、ＣＤ２２を発現する。
一部の実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞は、以前にＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞で治療された癌又は他の病態の再発後に投与される。
骨髄アブレーション
一態様において、本発明は、骨髄アブレーションのための組成物及び方法を提供する。例えば、一態様において、本発明は、対象の既存の骨髄の少なくとも一部分を根絶するための組成物及び方法を提供する。本明細書には、特定の例において、本発明のＣＤ２２ ＣＡＲ及びＣＤ１９ ＣＡＲを含むＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞がＣＤ１９及び／又はＣＤ２２陽性骨髄ミエロイド前駆細胞を根絶させることが記載される。
一態様において、本発明は、骨髄アブレーション方法であって、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞を、骨髄アブレーションを必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本方法を用いて、骨髄移植又は骨髄リコンディショニングが有益な治療戦略となる疾患又は障害を有する対象の既存の骨髄の一部又は全てを根絶し得る。一態様において、本明細書の他の部分に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞の投与を含む本発明の骨髄アブレーション方法は、対象において、骨髄移植前に実施される。従って、一態様において、本発明の方法は、骨髄移植又は幹細胞移植前の細胞コンディショニングレジメンを提供する。一態様において、骨髄移植は、幹細胞の移植を含む。骨髄移植は、自己細胞又は同種異系細胞の移植を含み得る。
本発明は、疾患又は障害を治療する方法であって、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞を投与して既存の骨髄の少なくとも一部分を根絶することを含む方法を提供する。本方法は、骨髄移植が有益な任意の疾患又は障害を治療する治療レジメンの少なくとも一部として用いられ得る。即ち、本方法は、骨髄移植を必要としている任意の対象で用いられ得る。一態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞の投与を含む骨髄アブレーションは、ＡＭＬの治療において有用である。特定の態様において、本方法を用いた骨髄アブレーションは、血液癌、固形腫瘍、血液疾患、代謝障害、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、リソソーム蓄積障害及び免疫不全症の治療において有用である。
本明細書に開示される組成物及び方法は、限定はされないが、本明細書に記載される癌、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＣＭＬ、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、ＤＬＢＣＬ又は濾胞性リンパ腫）及び多発性骨髄腫を含めた血液癌を治療するための既存の骨髄の少なくとも一部分の根絶に用いられ得る。
本明細書に開示される組成物及び方法は、限定はされないが、とりわけ、骨髄形成異常、貧血症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、再生不良性貧血、後天性赤芽球貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ファンコニー貧血、血球減少症、無巨核球性血小板減少症、骨髄増殖性疾患、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、骨髄線維症、異常ヘモグロビン症、鎌状赤血球症、重症型βサラセミアを含めた血液疾患の治療に用いられ得る。
一態様において、本発明は、骨髄コンディショニングを含む癌を治療する方法を提供し、ここで、対象の骨髄の少なくとも一部分は、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞によって根絶される。例えば、特定の例では、対象の骨髄は、ＣＡＲ発現細胞、例えばデュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲ発現細胞の活性によって標的化し、且つ消失させることのできる悪性前駆細胞を含む。一態様において、骨髄コンディショニング療法は、在来の骨髄を根絶した後に対象に骨髄移植又は幹細胞移植を投与することを含む。一態様において、骨髄リコンディショニング療法は、限定はされないが、抗腫瘍ＣＡＲ療法、化学療法、放射線照射などを含めた、１つ以上の他の抗癌療法と組み合わされる。
一態様において、骨髄の注入又は幹細胞移植の前に、投与されたＣＡＲ発現細胞の根絶が必要となり得る。ＣＡＲ発現細胞の根絶は、限定はされないが、自殺遺伝子の使用、ＲＮＡにコードされたＣＡＲを使用したＣＡＲの残存性の制限又は抗体若しくは化学療法を含めた抗Ｔ細胞モダリティを含め、任意の好適な戦略又は治療を用いて達成され得る。
ＣＤ２２関連疾患及び／又は障害
本開示は、とりわけ、例えば、ＣＤ２２を発現する細胞に関連する癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は前癌病態；又は非癌関連適応疾患を含めた、ＣＤ２２の発現に関連する疾患又はＣＤ２２を発現する細胞に関連する病態の治療のための組成物及び方法を提供する。一態様において、ＣＤ２２の発現に関連する癌は、血液癌である。一態様において、血液癌には、限定はされないが、Ｂ細胞悪性腫瘍が含まれる。一態様において、血液癌は、白血病又はリンパ腫である。一態様において、ＣＤ２２の発現に関連する癌には、限定はされないが、例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＢＡＬＬ）、例えば、小児ＢＡＬＬ及び／又は成人ＢＡＬＬ、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含むが、これらに限定されない１つ以上の急性白血病；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むが、これに限定されない１つ以上の慢性白血病；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含むが、これらに限定されない更なる血液癌又は血液学的病態を含めた、癌及び悪性腫瘍が含まれる。別の実施形態において、ＣＤ２２発現に関連する疾患には、限定はされないが、ＣＤ２２を発現する非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患；及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。
ＣＤ２２の発現に関連する非癌関連適応疾患も含まれ得る。ＣＤ２２の発現に関連する非癌関連適応疾患には、限定はされないが、例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、脈管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎及びデビック病、グレーブス眼症及び自己免疫性膵炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）及び固形臓器移植又は造血細胞移植が含まれる。
一態様において、本開示は、ＣＤ２２発現に関連する疾患の治療方法を提供する。一態様において、本開示は、腫瘍の一部がＣＤ２２陰性であり、且つ腫瘍の一部がＣＤ２２陽性である疾患の治療方法を提供する。例えば、本開示のＣＡＲは、ＣＤ２２の発現に関連する疾患の治療を受けたことがある対象の治療に有用であり、ＣＤ２２の発現に関する治療を受けたことがある対象は、ＣＤ２２の発現に関連する疾患を呈する。
一態様において、本開示は、哺乳類細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）における発現のためのプロモーターに作動可能に連結されたＣＡＲ、例えば、デュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲを含むベクターに関する。一態様において、本開示は、ＣＤ２２発現腫瘍の治療における使用のための、ＣＡＲ、例えば、デュアルＣＡＲ又はタンデムＣＡＲを発現する組換えＴ細胞を提供する。一態様において、本開示のＴ細胞又はＮＫ細胞を発現するＣＡＲは、ＣＡＲを発現するＴ細胞又はＮＫ細胞が腫瘍細胞を標的化し、腫瘍の成長が阻害されるように、その表面上に発現した本開示の少なくとも１つのＣＡＲを腫瘍細胞に接触させる能力を有する。
一態様において、本開示は、ＣＤ２２発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、ＣＡＲＴが抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的化するように、本開示のＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を腫瘍細胞と接触させることを含み、腫瘍の成長が阻害される、方法に関する。
一態様において、本開示は、対象の癌を治療する方法に関する。この方法は、対象において癌が治療されるように、対象に本開示のＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を投与することを含む。本開示のＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）によって治療可能な癌の例は、ＣＤ２２の発現に関連する癌である。本開示のＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）によって治療可能な癌の例には、限定はされないが、本明細書に記載される血液癌が含まれる。
本開示は、細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変され、及びＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）が、それを必要としているレシピエントに注入される、ある種の細胞療法を含む。注入される細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させる能力がある。抗体療法と異なり、ＣＡＲ改変細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、インビボでの複製能があるため、長期間残存し、持続性のある腫瘍管理につながり得る。様々な態様において、患者に投与された細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）又はその子孫は、患者へのＴ細胞の投与後少なくとも４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、７ヵ月間、８ヵ月間、９ヵ月間、１０ヵ月間、１１ヵ月間、１２ヵ月間、１３ヵ月間、１４ヵ月間、１５ヵ月間、１６ヵ月間、１７ヵ月間、１８ヵ月間、１９ヵ月間、２０ヵ月間、２１ヵ月間、２２ヵ月間、２３ヵ月間、２年間、３年間、４年間又は５年間にわたって患者体内に残存する。
本開示は、免疫エフェクター細胞、例えばＮＫ細胞又はＴ細胞が、例えば、インビトロ転写されたＲＮＡにより、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一過性に発現するように改変され、ＣＡＲ発現（例えば、ＣＡＲＴ又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞）細胞が、それを必要としているレシピエントに注入される、ある種の細胞療法も含む。注入される細胞は、レシピエントの癌細胞を死滅させる能力がある。従って、様々な態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、患者に投与され、患者へのＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の投与後１ヵ月未満、例えば、３週間、２週間、１週間にわたって存在する。
いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、ＣＡＲ改変細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）によって引き出される抗腫瘍免疫応答は、能動又は受動免疫応答であり得るか、又は代わりに直接的であるか、対照的に間接的である免疫応答に起因し得る。一態様において、ＣＡＲ形質導入細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、ＣＤ２２を発現するヒト癌細胞に応答して特異的な炎症誘発性サイトカイン分泌及び強力な細胞溶解活性を呈し、可溶性ＣＤ２２阻害に抵抗し、バイスタンダー殺傷を媒介し、且つ樹立されたヒト腫瘍の退縮を媒介する。例えば、ＣＤ２２発現腫瘍の異種領域内にある無抗原の腫瘍細胞は、以前に隣接する抗原陽性癌細胞に対して応答した、ＣＤ２２にリダイレクトされたＴ細胞による間接的な破壊を受け易い可能性がある。
一態様において、本開示のＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）、例えば、完全ヒトＣＡＲ発現細胞は、哺乳類におけるエキソビボ免疫用及び／又はインビボ療法のためのある種のワクチンであり得る。一態様において、哺乳類はヒトである。
エキソビボ免疫に関しては、哺乳類に細胞を投与する前に、以下の少なくとも１つがインビトロで行われる：ｉ）細胞の拡大、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入又はｉｉｉ）細胞の凍結保存。
エキソビボ手順は、当技術分野において周知であり、以下で更に詳しく考察する。簡潔に言えば、哺乳類（例えば、ヒト）から細胞が単離され、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するベクターによって遺伝子改変される（即ちインビトロで形質導入又はトランスフェクトされる）。ＣＡＲ細胞は、哺乳類レシピエントに投与すると、治療利益を提供することができる。哺乳類レシピエントは、ヒトであり得、ＣＡＲ細胞は、レシピエントにとって自己であり得る。代わりに、細胞は、レシピエントにとって同種異系、同系又は異種であり得る。
造血幹細胞・前駆細胞のエキソビボ拡大手順が米国特許第５，１９９，９４２号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されており、本開示の細胞に適用することができる。他の好適な方法は、当技術分野において公知であり、従って本開示は、細胞をエキソビボで拡大するいかなる特定の方法にも限定されない。簡潔に言えば、Ｔ細胞のエキソビボ培養及び拡大は、（１）哺乳類から末梢血採取又は骨髄外植によりＣＤ３４＋造血幹細胞・前駆細胞を収集すること；及び（２）かかる細胞をエキソビボで拡大することを含む。細胞の培養及び拡大には、米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載される細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３及びｃ－ｋｉｔリガンドなどの他の因子を使用することができる。
エキソビボ免疫の点で細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本開示は、患者において抗原に対する免疫応答を引き出すためのインビボ免疫のための組成物及び方法も提供する。
概して、本明細書に記載されるとおり活性化され、拡大された細胞は、免疫無防備状態の個体に発生する疾患の治療及び予防において利用され得る。詳細には、本開示のＣＡＲ改変細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）は、ＣＤ２２の発現に関連する疾患、障害及び病態の治療において使用される。特定の態様において、本開示の細胞は、ＣＤ２２の発現に関連する疾患、障害及び病態を発症するリスクがある患者の治療において使用される。従って、本開示は、ＣＤ２２の発現に関連する疾患、障害及び病態の治療又は予防方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量の本開示のＣＡＲ細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）を投与することを含む方法を提供する。
一態様において、本開示のＣＡＲ発現細胞は、癌若しくは悪性腫瘍などの増殖性疾患又は前癌病態の治療に使用され得る。一態様において、ＣＤ２２の発現に関連する癌は、異常な細胞成長を特徴とする血液癌、前白血病、過剰増殖性障害、過形成又は異形成である。
一態様において、本開示のＣＡＲ発現細胞は癌の治療に使用され、癌は、血液癌である。血液癌病態とは、白血病及び悪性リンパ球増殖性病態など、血液、骨髄及びリンパ系に発症する癌の種類である。
白血病は、急性白血病と慢性白血病とに分類することができる。急性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）とに細分することができる。慢性白血病には、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が含まれる。他の関連する病態には、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、旧称「前白血病」）が含まれ、これは、骨髄性血球細胞の無効な産生（又は異形成）及びＡＭＬへの形質転換リスクによってまとめられる一群の多様な血液学的病態である。
リンパ腫は、リンパ球から発生する一群の血液細胞腫瘍である。例示的リンパ腫には、非ホジキンリンパ腫及びホジキンリンパ腫が含まれる。
一態様において、本開示の組成物及びＣＡＲＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍、例えば、ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫又はＣＬＬの治療に特に有用である。
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、Ｂ細胞又はＴ細胞のいずれかから形成される、リンパ球の癌の一群である。ＮＨＬは、いずれの年齢でも起こり、多くの場合に正常よりも大きいリンパ節、体重減少及び発熱を特徴とする。種々のタイプのＮＨＬが、アグレッシブ（急激に成長する）タイプとインドレント（成長が遅い）タイプとに分類される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫には、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫が含まれる。Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫の例には、菌状息肉症、未分化大細胞型リンパ腫及び前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫が含まれる。骨髄移植又は幹細胞移植後に起こるリンパ腫は、典型的にはＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。例えば、Ｍａｌｏｎｅｙ．ＮＥＪＭ．３６６．２１（２０１２）：２００８－１６を参照されたい。
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、Ｂ細胞から発達するＮＨＬの一形態である。ＤＬＢＣＬは、リンパ節内又はリンパ系外、例えば、胃腸管、精巣、甲状腺、皮膚、乳房、骨又は脳に生じ得るアグレッシブリンパ腫である。ＤＬＢＣＬでは、一般に３つの細胞形態変種：中心芽球型、免疫芽球型及び未分化型が観察される。中心芽球形態が最も一般的であり、これは、細胞質が最小限の中型～大型リンパ球の出現を伴う。ＤＬＢＣＬにはサブタイプが幾つかある。例えば、原発性中枢神経系リンパ腫は、脳にのみ発症するＤＬＢＣＬの一種で、脳外の範囲に発症するＤＬＢＣＬとは呼称及び治療が異なる。別の種類のＤＬＢＣＬは原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫であり、これは多くの場合に若年患者に起こり、胸部で急激に成長する。ＤＬＢＣＬの症状には、肥大したリンパ節によって引き起こされる頸部、腋窩又は鼡径部の無痛性の急激な腫脹が含まれる。一部の対象では、腫脹は有痛性のこともある。ＤＬＢＣＬの他の症状には、寝汗、原因不明発熱及び体重減少が含まれる。ほとんどのＤＬＢＣＬ患者は成人であるが、この疾患は時に小児にも起こる。ＤＬＢＣＬの治療には、化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、エトポシド）、抗体（例えば、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ））、放射線照射又は幹細胞移植が含まれる。
濾胞性リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫の一種で、濾胞中心Ｂ細胞（中心細胞及び中心芽球）のリンパ腫であり、少なくとも部分的に濾胞状のパターンを有する。濾胞性リンパ腫細胞はＢ細胞マーカーＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ２２を発現する。濾胞性リンパ腫細胞は、一般的にはＣＤ５陰性である。形態学的には、濾胞性リンパ腫腫瘍は、中心細胞（切断型濾胞中心細胞又は小細胞とも称される）と中心芽球（大型非切断型濾胞中心細胞又は大細胞とも称される）との混合物を含む濾胞で構成される。濾胞は、大部分がＴ細胞である非悪性細胞に取り囲まれている。濾胞は主に中心細胞を含み、中心芽球は少数である。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＨＯ）は、この疾患を以下のとおり形態学的にグレード分けしている：グレード１（強拡大視野（ｈｐｆ）当たり５個未満の中心芽球；グレード２（６～１５個の中心芽球／ｈｐｆ）；グレード３（１５個を超える中心芽球／ｈｐｆ）。グレード３は以下のグレードに更に細分される：グレード３Ａ（中心細胞がなおも存在する）；グレード３Ｂ（濾胞がほぼ完全に中心芽球からなる）。濾胞性リンパ腫の治療には、化学療法、例えば、アルキル化剤、ヌクレオシド類似体、アントラサイクリン含有レジメン、例えば、ＣＨＯＰ－シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン／プレドニゾロンと呼ばれる併用療法、抗体（例えばリツキシマブ）、放射免疫療法及び造血幹細胞移植が含まれる。
ＣＬＬは、骨髄、血液、リンパ節及び脾臓における新生細胞の増殖及び蓄積を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍である。ＣＬＬの診断時の年齢中央値は約６５歳である。現行の治療には、化学療法、放射線療法、生物学的療法又は骨髄移植が含まれる。時に症状は外科的に（例えば、脾摘出術による肥大化した脾臓の除去）又は放射線療法によって（例えば腫大リンパ節の減量）治療される。ＣＬＬを治療する化学療法剤としては、例えば、フルダラビン、２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、クロラムブシル、ビンクリスチン、ペントスタチン、シクロホスファミド、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ）、ドキソルビシン及びプレドニゾンが挙げられる。ＣＬＬのための生物学的療法としては、抗体、例えば、アレムツズマブ、リツキシマブ及びオファツムマブ；並びにチロシンキナーゼ阻害薬療法が挙げられる。ＣＬＬのステージ分類には、幾つもの基準、例えばライ（Ｒａｉ）又はビネー（Ｂｉｎｅｔ）方式を用いることができる。ライ方式は、ＣＬＬが５つのステージを有するものとして記載する：ステージ０、リンパ球増加症のみが存在する；ステージＩ、リンパ節症が存在する；ステージＩＩ、脾腫、リンパ節症又は両方が存在する；ステージＩＩＩ、貧血症、臓器肥大又は両方が存在する（進行は、体重減少、疲労、発熱、重度の臓器肥大及びリンパ球数の急激な増加によって定義付けられる）；及びステージＩＶ、貧血症、血小板減少症、臓器肥大又はこれらの組み合わせが存在する。ビネーのステージ分類方式に基づけば、３つのカテゴリがある：ステージＡ、リンパ球増加症が存在し、３つ未満のリンパ節が腫大している（このステージには、ライのステージ０患者の全て、ライのステージＩ患者の半分及びライのステージＩＩ患者の３分の１が含まれる）；ステージＢ、３つ以上のリンパ節に病変がある；及びステージＣ、貧血症又は血小板減少症又は両方が存在する。これらの分類方式を免疫グロブリン遺伝子の突然変異の測定値と組み合わせると、疾患の状態のより正確な特徴付けを提供することができる。突然変異免疫グロブリン遺伝子の存在は予後判定の改善と相関する。
別の実施形態において、本開示のＣＡＲ発現細胞は、癌又は白血病、例えば白血病幹細胞を伴うものの治療に使用される。例えば、白血病幹細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８－白血病細胞である。
本開示は、とりわけ、癌を治療するための組成物及び方法を提供する。一態様において、癌は、限定はされないが、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＢＡＬＬ）、例えば、小児ＢＡＬＬ及び／又は成人ＢＡＬＬ、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含むが、これらに限定されない１つ以上の急性白血病；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むが、これに限定されない１つ以上の慢性白血病；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型又は大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含むが、これらに限定されない更なる血液癌又は血液学的病態を含めた血液癌並びに限定はされないが、ＣＤ２２を発現する非定型及び／又は非古典的癌、悪性腫瘍、前癌病態又は増殖性疾患を含めたＣＤ２２発現に関連する疾患；及びこれらの任意の組み合わせである。
本開示のＣＡＲ細胞は、単独で投与されても、又は希釈剤と、及び／又はＩＬ－２若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。
本開示は、ＣＤ２２発現細胞集団の増殖を阻害する又はそれを減少させる方法であって、ＣＤ２２発現細胞を含む細胞の集団と、ＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＡＲ発現細胞とを接触させることを含む方法も提供する。ある態様において、本開示は、ＣＤ２２を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害する又はそれを減少させる方法を提供し、本方法は、ＣＤ２２発現癌細胞集団と、ＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＡＲ発現細胞とを接触させることを含む。一態様において、本開示は、ＣＤ２２を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害する又はそれを減少させる方法を提供し、本方法は、ＣＤ２２発現癌細胞集団と、ＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＡＲＴとを接触させることを含む。特定の態様において、本開示のＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ２２発現細胞に関連するＢ細胞悪性腫瘍又は別の癌を有する対象又はそれの動物モデルにおいて、細胞及び／又は癌細胞の分量、数、量又は割合を陰性対照と比べて少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％減少させる。一態様において、対象はヒトである。
本開示は、ＣＤ２２発現細胞（例えば、ＣＤ２２を発現する血液癌又は非定型癌）に関連する疾患を予防、治療及び／又は管理する方法も提供し、本方法は、必要としている対象にＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。一態様において、対象はヒトである。ＣＤ２２発現細胞に関連する障害の非限定的な例としては、自己免疫疾患（例えば、ループス、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、脈管炎、水疱性皮膚障害、１型真性糖尿病、シェーグレン症候群、抗ＮＭＤＡ受容体脳炎及びデビック病、グレーブス眼症、及び自己免疫性膵炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、移植、及び癌（ＣＤ２２を発現する血液癌又は非定型癌など）が挙げられる。
本開示は、ＣＤ２２発現細胞に関連する疾患を予防、治療及び／又は管理する方法も提供し、本方法は、必要としている対象にＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＡＲ発現細胞を投与することを含む。一態様において、対象はヒトである。
本開示は、ＣＤ２２発現細胞に関連する癌の再発を予防する方法を提供し、本方法は、ＣＤ２２発現細胞に結合する本開示のＣＡＲ発現細胞を、それを必要としている対象に投与することを含む。一態様において、本方法は、ＣＤ２２発現細胞に結合する本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の有効量を別の療法の有効量と併用してそれを必要としている対象に投与することを含む。
一部の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＦＬＴ－３、ＲＯＲ－１、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ１０、ＣＤ３４、及び／又はＣＤ２０を発現する。特定の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ１９を発現する。一部の実施形態において、ＣＤ２２発現細胞は、ＣＤ１９を発現しない。
一部の実施形態において、対象はＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対して非奏効者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対して部分奏効者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対して完全奏効者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対して非再発者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対して部分再発者である。一部の実施形態において、対象はＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対して完全再発者である。
一部の実施形態において、以前ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態はＣＤ１９を発現しない。一部の実施形態において、以前ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態は、癌又は他の病態がＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であったときと比べてＣＤ１９発現レベルが１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれを超えて低下している。一部の実施形態において、以前ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞による治療に応答性であった癌又は他の病態はＣＤ２２を発現する。
一部の実施形態において、本開示のＣＡＲ発現細胞は、以前ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞で治療された癌又は他の病態の再発後に投与される。
多発性骨髄腫の治療における使用のためのＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞
化学療法、ターゲット療法、及び自己幹細胞移植の現行のレジメンであっても、骨髄腫は不治の疾患と考えられる。ある研究（非開示）では、キメラ抗原受容体を含むＣＤ１９に対する自己Ｔ細胞（レンチウイルス／ＣＤ１９：４－１ＢＢ：ＣＤ３ζ；「ＣＡＲＴ１９」又はＣＴＬ０１９としても知られる）による多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療が記載されている。この例では、ＣＤ１９に対するＣＡＲ療法が、ＣＤ１９の発現レベルが極めて低い（ほとんどの方法によって検出不能な）骨髄腫幹細胞及び／又は腫瘍細胞のターゲティングに基づいて、深い、長期持続性のある寛解を確立できる可能性があることが実証される。
ホジキンリンパ腫に対するＣＡＲ１９ Ｔ細胞療法
ＣＡＲ１９ Ｔ細胞療法は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）の治療にも使用することができる。ホジキンリンパ腫は、クローナル胚中心Ｂ細胞に由来する悪性ホジキンリード・スタンバーグ（ＨＲＳ）細胞の存在によって特徴付けられる。ＨＬに対するＣＡＲ１９ Ｔ細胞療法の治療有効性を示す幾つかの要因がある。ＨＬ腫瘍をＣＤ１９染色すると、腫瘍及び腫瘍微小環境内のＣＤ１９発現（ＣＤ１９＋）細胞が明らかになる。ある研究によれば、ＣＤ１９を発現するクローナルＢ細胞集団（ＣＤ２０＋ＣＤ２７＋ＡＬＤＨ＋）がホジキンリンパ腫細胞株の生成及び維持に関与し、またほとんどのＨＬ患者の血中に循環することが示されている（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００９，１１３（２３）：５９２０－５９２６）。このクローナルＢ細胞集団は、悪性ＨＲＳ細胞を生成し、又はその生成に寄与することも示唆されている。従って、ＣＡＲＴ１９療法は、腫瘍発生又は腫瘍細胞の維持に寄与するこのＢ細胞集団を枯渇させるであろう。別の研究では、複数のマウスモデルでＢ細胞枯渇が固形腫瘍成長を遅らせることが示された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２００８，３１（５）：４４６－５７）。ＨＬ腫瘍微小環境におけるＢ細胞の枯渇が何らかの抗腫瘍効果をもたらすという考えの裏付けとして、リツキサンなどの現行の療法が、ＨＬにおける腫瘍性Ｂ細胞のターゲティング及び枯渇に関して臨床的に試験されているところである（Ｙｏｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１２，１１９（１８）：４１２３－８）。慢性炎症に関連するデノボ発癌もＢ細胞依存性であることが示されている（ｄｅ Ｖｉｓｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００５，７（５）：４１１－２３）。これらの研究の結果から、Ｂ細胞集団のターゲティングが、特にＨＬ腫瘍微小環境において、疾患進行又は腫瘍成長の低減又は阻害によるＨＬの治療に有用となり得ることが指摘される。
ＣＬＬ患者の非奏効者サブセットは免疫チェックポイント抑制分子の発現増加を呈する
ある研究において（データ未発表）、３４人のＣＬＬ患者由来の臨床製品からのＣＡＲＴ１９細胞が、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、及びＴＩＭ３などの免疫チェックポイント抑制分子の発現に関して評価された。このコホートのＣＡＲＴ１９に対する応答は分かっており、従って応答とバイオマーカー発現パターンとの間の相関を評価することができた。
高齢者における免疫老化に対するｍＴＯＲ阻害効果
免疫老化に対するｍＴＯＲ阻害の有効性については、例えば、国際公開第２０１５／０７３６４４号パンフレットの実施例１に記載されており、この出願全体が本明細書において参照により援用される。
高齢対象におけるワクチンに対する免疫応答の増強
免疫応答の増強に対するｍＴＯＲ阻害の有効性については、例えば、国際公開第２０１５／０７３６４４号パンフレットの実施例２に記載されており、この出願全体が本明細書において参照により援用される。
低用量ｍＴＯＲ阻害はエネルギー及び運動を増加させる；
エネルギー及び運動に対するｍＴＯＲ阻害の効果については、例えば、２０国際公開第２０１５／０７３６４４号パンフレットの実施例３に記載されており、この出願全体が本明細書において参照により援用される。
ＲＡＤ００１によるＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害
Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害に対するｍＴＯＲ阻害の効果については、例えば、国際公開第２０１５／０７３６４４号パンフレットの実施例４に記載されており、この出願全体が本明細書において参照により援用される。
外因性ＩＬ－７はＣＡＲ Ｔ細胞の機能を増強する
ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入後、一部の患者ではＣＡＲ Ｔ細胞の持続性が限られ、その結果、抗腫瘍活性レベルが最適以下となり得る。この例では、外因性ヒトＩＬ－７の投与の効果が、ＣＡＲ Ｔ細胞に対する初期の最適以下の応答が観察されているマウス異種移植モデルで評価される。
併用療法
本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞は、他の既知の薬剤及び療法と組み合わせて使用され得る。本明細書で使用する「組み合わせて」投与するとは、２つ（又はそれを超える）の異なる処置を、対象が障害を患っている過程中に対象に送達することを意味し、例えば、２つ以上の処置を、対象が障害と診断された後に且つ障害が治癒又は撲滅される前に、又は処置が他の理由で中止される前に送達される。一実施形態において、投与期間の重複があるように、一方の処置の送達は、第２の処置の送達開始時に依然として行われている。これは、本明細書では「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」又は「同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）送達」ということがある。一部の実施形態において、一方の処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。いずれかの場合の一実施形態において、処置は、組み合わせ投与のためにより有効である。例えば、第２の処置剤は、より有効である、例えば等しい効果が少ない第２の処置剤で見られるか、又は第２の処置剤は、第２の処置剤を第１の処置剤の非存在下で投与したときに見られるよりも大きい程度で症状を軽減するか又は第１の処置剤で同様の状況が見られる。一実施形態において、送達、障害と関係する症状又は他のパラメータの減少は、他方の処置剤の非存在下において一方の処置剤の送達で観察されるより大きい。２つの処置の効果は、一部相加的、完全相加的又は相加的より大きいものであり得る。送達は、送達した第１の処置の効果が第２剤の送達時になお検出可能であるようなものであり得る。
本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞及び少なくとも１つの更なる治療剤を同時に、同じ又は別の組成物で又は逐次的に投与できる。逐次投与について、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞をまず投与し得、更なる薬剤を次に投与し得、又は投与の順番が逆であり得る。
ＣＡＲ治療及び／又は他の治療剤、方法又はモダリティを活動性障害の期間又は寛解又は低活動性疾患の期間に投与できる。ＣＡＲ治療を他の処置の処置前、処置と同時に、処置後に、又は障害の寛解中に投与できる。
組み合わせて投与するとき、ＣＡＲ治療及び更なる薬剤（例えば、第２又は第三の薬剤）又は全てを、個々に、例えば単剤療法として使用する各薬剤の量又は投与より高い、低い又は同じ量又は用量で投与できる。一実施形態において、ＣＡＲ治療、更なる薬剤（例えば、第２又は第三薬剤）又は全ての投与される量又は用量は、個々に、例えば単剤療法として使用する各薬剤の量又は用量より低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％）。一部の実施形態において、所望の効果（例えば、癌の処置）を生じるＣＡＲ治療、更なる薬剤（例えば、第２又は第三薬剤）又は全ての投与される量又は用量は、同じ治療効果を達成するのに必要である、個々に、例えば単剤療法として使用する各薬剤の量又は用量より低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％低い）。
更なる態様において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を、手術、サイトカイン、放射線若しくはシトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、デメチル化剤、又はＩｚｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ １０８：９６３－９７１に記載ものなどのペプチドワクチンなどの化学療法剤と組み合わせて治療レジメンにおいて使用し得る。
ある例において、本発明の化合物を他の抗癌剤、抗アレルギー剤、制吐剤（又は制吐剤）、鎮痛剤、細胞保護剤及びこれらの組み合わせなどの他の治療剤と組み合わせる。
併用療法における使用が企図される一般的化学療法剤は、アナストロゾール（アリミデックス（登録商標））、ビカルタミド（カソデックス（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（マイレラン（登録商標））、ブスルファン注（ブスルフェクス（登録商標））、カペシタビン（ゼローダ（登録商標））、Ｎ４－ペントキシカルボニル－５－デオキシ－５－フルオロシチジン、カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（リューケラン（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（ロイスタチン（登録商標））、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）又はＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメサゾン、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（ベプシド（登録商標））、リン酸フルダラビン（フルダラ（登録商標））、５－フルオロウラシル（アドルシル（登録商標）、エフデックス（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素（ハイドレア（登録商標））、イダルビシン（イダマイシン（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ－アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（アルケラン（登録商標））、６－メルカプトプリン（ピュリネソール（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（ノバントロン（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ｎａｂ－パクリタキセル（アブラキサン（登録商標））、ｐｈｏｅｎｉｘ（イットリウム９０／ＭＸ－ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、ポリフェプロザン２０とカルムスチンインプラント（グリアデル（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（ノルバデックス（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６－チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（ハイカムチン（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））及びビノレルビン（ナベルビン（登録商標））を含む。
本発明の化合物との併用に特に有益な抗癌剤としては、抗腫瘍性抗生物質；チロシンキナーゼ阻害薬；アルキル化剤；抗微小管剤又は抗有糸分裂剤；又は腫瘍崩壊ウイルスが挙げられる。
例示的チロシンキナーゼ阻害薬としては、限定はされないが、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｎ－［４－（３－アミノ－１Ｈ－インダゾル－４－イル）フェニル］－Ｎ’－（２－フルオロ－５－メチルフェニル）尿素、別名ＡＢＴ ８６９、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能）；リンゴ酸スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ボスチニブ（４－［（２，４－ジクロロ－５－メトキシフェニル）アミノ］－６－メトキシ－７－［３－（４－メチルピペラジン－１－イル）プロポキシ］キノリン－３－カルボニトリル、別名ＳＫＩ－６０６、及び米国特許第６，７８０，９９６号明細書に記載される）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；Ｚａｃｔｉｍａ（ＺＤ６４７４）；及びイマチニブ又はメシル酸イマチニブ（Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）及びＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））が挙げられる。
例示的アルキル化剤としては、限定はされないが、オキサリプラチン（エロキサチン（登録商標））；テモゾロミド（テモダール（登録商標）及びテモダール（登録商標））；ダクチノマイシン（別名アクチノマイシン－Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））；メルファラン（別名Ｌ－ＰＡＭ、Ｌ－サルコリシン及びフェニルアラニンマスタード、アルケラン（登録商標））；アルトレタミン（別名ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（ブスルフェクス（登録商標）及びマイレラン（登録商標））；カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））；ロムスチン（別名ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ（登録商標））；シスプラチン（別名ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）及びＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）－ＡＱ）；クロラムブシル（リューケラン（登録商標））；シクロホスファミド（シトキサン（登録商標）及びＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（別名ＤＴＩＣ、ＤＩＣ及びイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（登録商標））；アルトレタミン（別名ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（別名窒素マスタード、ムスチン及び塩酸メクロロエタミン、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（別名チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡ及びＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））；シクロホスファミド（エンドキサン（登録商標）、シトキサン（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；及びベンダムスチンＨＣｌ（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））が挙げられる。
例示的抗腫瘍性抗生物質としては、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）及びＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、及びルビドマイシン塩酸塩、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；及びデスアセチルラビドマイシンが挙げられる。
例示的抗微小管剤又は抗有糸分裂剤としては、限定なしに、ビンカアルカロイド（酒石酸ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標））など）；タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセルなど）；及びエストラムスチン（Ｅｍｃｙｌ（登録商標）又はＥｓｔｒａｃｙｔ（登録商標））が挙げられる。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるＣＡＲ発現細胞は、腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与される。実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞内で選択的に複製し、その死を誘発するか又は増殖を遅延することができる。ある場合、腫瘍溶解性ウイルスは、非癌細胞に効果を有しないか又は効果が最小である。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルス、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス、腫瘍溶解性レトロウイルス、腫瘍溶解性パルボウイルス、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、腫瘍溶解性シンドビスウイルス、腫瘍溶解性インフルエンザウイルス又は腫瘍溶解性ＲＮＡウイルス（例えば、腫瘍溶解性レオウイルス、腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、腫瘍溶解性麻疹ウイルス又は腫瘍溶解性水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ））を含むが、これらに限定されない。
一実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０／０１７８６８４Ａ１号明細書に記載のウイルス、例えば組み換え腫瘍溶解性ウイルスである。一実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０／０１７８６８４Ａ１号明細書に記載のような、免疫又は炎症性応答の阻害剤をコードする核酸配列（例えば、異種核酸配列）を含む。実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、例えば腫瘍溶解性ＮＤＶは、アポトーシス促進性タンパク質（例えば、アポプチン）、サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロン－γ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、腫瘍壊死因子－α）、免疫グロブリン（例えば、ＥＤ－Ｂフィブロネクチンに対する抗体）、腫瘍関連抗原、二特異性アダプタータンパク質（例えば、ＮＤＶ ＨＮタンパク質及びＣＤ３又はＣＤ２８などのＴ細胞共刺激性受容体に対する二特異性抗体又は抗体断片；又はヒトＩＬ－２及びＮＤＶ ＨＮタンパク質に対する一本鎖抗体の融合タンパク質）を含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるＺａｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７．３（２０１２）：３４７－６７を参照されたい。一実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、参照によりそれぞれその全体が本明細書に援用される米国特許第８５９１８８１Ｂ２号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１２２１８５Ａ１号明細書又は米国特許出願公開第２０１４／０２７１６７７Ａ１号明細書に記載のキメラ腫瘍溶解性ＮＤＶである。
一実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、排他的に癌細胞において複製するよう設計された条件的複製アデノウイルス（ＣＲＡｄ）である。例えば、Ａｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（２０００）：７２３－２７を参照されたい。一実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、その全体が参照により本明細書に援用されるＡｌｅｍａｎｙ ｅｔ ａｌ．の７２５ページの表１に記載のものを含む。
例示的な腫瘍溶解性ウイルスは、次のものを含むが、これらに限定されない。
Ｂ群腫瘍溶解性アデノウイルス（ＣｏｌｏＡｄ１）（ＰｓｉＯｘｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２０５３２２０を参照されたい）；
顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含むアデノウイルスであるＯＮＣＯＳ－１０２（以前はＣＧＴＧ－１０２と呼ばれた）（Ｏｎｃｏｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１５９８１２９を参照されたい）；
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼをコードする遺伝的に改変された腫瘍溶解性ヒトアデノウイルスであるＶＣＮ－０１（ＶＣＮ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓ．Ｌ．）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ：ＮＣＴ０２０４５６０２及びＮＣＴ０２０４５５８９を参照されたい）；
網膜芽細胞腫／Ｅ２Ｆ経路の脱制御を伴い癌細胞で選択的に複製するように改変されている野生型ヒトアデノウイルス血清型５（Ｈａｄ５）由来のウイルスである条件的複製アデノウイルスＩＣＯＶＩＲ－５（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｃａｔａｌａ ｄ’Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１８６４７５９を参照されたい）；
ＩＣＯＶＩＲ５、腫瘍溶解性アデノウイルスで感染させた骨髄由来自己間葉性幹細胞（ＭＳＣ）を含むＣｅｌｙｖｉｒ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｆａｎｔｉｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ Ｎｉｎｏ Ｊｅｓｕｓ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ／Ｒａｍｏｎ Ａｌｅｍａｎｙ）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１８４４６６１を参照されたい）；
ヒトＥ２Ｆ－１プロモーターが必須Ｅ１ａウイルス遺伝子の発現を駆動し、それによりＲｂ経路欠損腫瘍細胞に対するウイルス複製及び細胞毒性を制限する、条件複製腫瘍溶解性血清型５アデノウイルス（Ａｄ５）であるＣＧ００７０（Ｃｏｌｄ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２１４３８０４を参照されたい）；又は
網膜芽細胞腫（Ｒｂ）経路欠損細胞で選択的に複製し、ある種のＲＧＤ結合インテグリンをより効率的に発現する細胞に感染するように操作されているアデノウイルスであるＤＮＸ－２４０１（以前はデルタ－２４－ＲＧＤと称された）（Ｃｌｉｎｉｃａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｎａｖａｒｒａ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｎａｖａｒｒａ／ＤＮＡｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１９５６７３４を参照されたい）。
一実施形態において、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを注射、例えば皮下、動脈内、静脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射により投与する。実施形態において、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍内、経皮、経粘膜、経口、鼻腔内又は肺投与により投与する。
一実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、ＧＩＴＲアゴニスト及び／又は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるＧＩＴＲ抗体など、ＧＩＴＲを標的にする及び／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子と併用して対象に投与される。一実施形態において、ＧＩＴＲ結合分子及び／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子（例えば、ＧＩＴＲアゴニスト及び／又はＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体）は、ＣＡＲ発現細胞の前に投与される。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストは細胞のアフェレーシス前に投与され得る。一実施形態において、対象はＣＬＬを有する。例示的ＧＩＴＲアゴニストは、例えば、米国特許第６，１１１，０９０号明細書、欧州特許第０９０５０５Ｂ１号明細書、米国特許第８，５８６，０２３号明細書、国際公開第２０１０／００３１１８号パンフレット及び同２０１１／０９０７５４号パンフレットに記載のＧＩＴＲ融合タンパク質又は例えば米国特許第７，０２５，９６２号明細書、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号明細書、米国特許第７，８１２，１３５号明細書、米国特許第８，３８８，９６７号明細書、米国特許第８，５９１，８８６号明細書、欧州特許第１８６６３３９号明細書、国際公開第２０１１／０２８６８３号パンフレット、国際公開第２０１３／０３９９５４号パンフレット、国際公開第２００５／００７１９０号パンフレット、国際公開第２００７／１３３８２２号パンフレット、国際公開第２００５／０５５８０８号パンフレット、国際公開第９９／４０１９６号パンフレット、国際公開第２００１／０３７２０号パンフレット、国際公開第９９／２０７５８号パンフレット、国際公開第２００６／０８３２８９号パンフレット、国際公開第２００５／１１５４５１号パンフレット、米国特許第７，６１８，６３２号明細書及び国際公開第２０１１／０５１７２６号パンフレットに記載のような抗ＧＩＴＲ抗体など、例えばＧＩＴＲ融合タンパク質及び抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）を含む。
一実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、ｍＴＯＲ阻害薬、例えば本明細書に記載されるｍＴＯＲ阻害薬、例えばエベロリムスなどのラパログと併用して対象に投与される。一実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬はＣＡＲ発現細胞の前に投与される。例えば、一実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬は細胞のアフェレーシス前に投与され得る。
一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞をＧＩＴＲアゴニスト、例えば本明細書に記載のＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて対象に投与する。一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストをＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストを細胞のアフェレーシス前に投与できる。
一実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬、例えば本明細書に記載されるタンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬と併用して対象に投与される。一実施形態において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬はＳＨＰ－１阻害薬、例えば本明細書に記載されるＳＨＰ－１阻害薬、例えばスチボグルコン酸ナトリウムなどである。一実施形態において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬はＳＨＰ－２阻害薬である。
一実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞はキナーゼ阻害薬と併用して使用することができる。
ある実施形態では、この手法を用いて、対象における本明細書に記載されるＣＡＲ細胞のパフォーマンスを最適化することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、ある実施形態では、内因性の非改変免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞のパフォーマンスが向上すると考えられる。理論によって拘束されることを望むものではないが、ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞のパフォーマンスが向上すると考えられる。一部の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作されている、又は操作されることになる細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞の数を増加させる、又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の比を増加させる量のｍＴＯＲ阻害薬との接触により、エキソビボで処理することができる。
ある実施形態において、免疫増強低用量のｍＴＯＲ阻害薬、例えばアロステリック阻害薬、例えばＲＡＤ００１、又は触媒阻害薬の投与が、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の投与前に開始される。ある実施形態において、ＣＡＲ細胞は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞のレベル、又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の比が少なくとも一過性に増加しているように、ｍＴＯＲ阻害薬の十分な時間後、又は十分な用量投与後に投与される。
ある実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作されることになる細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、対象における又は対象から採取されたＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞のレベル、又はＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＮＫ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の比が少なくとも一過性に増加しているように、免疫増強低用量のｍＴＯＲ阻害薬の十分な時間後、又は十分な用量投与後に採取される。
一部の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬は、対象の末梢血中において、又は対象から単離されたＴ細胞の調製物においてＰＤ－１陽性Ｔ細胞の集団が減少し、ＰＤ－１陰性Ｔ細胞の集団が増加し、又はＰＤ－１陰性Ｔ細胞／ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の比が増加するのに十分な長さの時間にわたって投与される。
一部の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、例えば、ｐ７０ Ｓ６Ｋ阻害によって測定したとき、５％以上９０％以下のｍＴＯＲ阻害薬に関連する。一部の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害薬の用量は、例えば、ｐ７０ Ｓ６Ｋ阻害によって測定したとき、１０％以上４０％以下のｍＴＯＲ阻害に関連する。
一実施形態において、キナーゼ阻害薬は、ＣＤＫ４阻害薬、例えば本明細書に記載されるＣＤＫ４阻害薬、例えばＣＤ４／６阻害薬、例えば６－アセチル－８－シクロペンチル－５－メチル－２－（５－ピペラジン－１－イル－ピリジン－２－イルアミノ）－８Ｈ－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－オンヒドロクロリド（パルボシクリブ又はＰＤ０３３２９９１とも称される）などである。一実施形態において、キナーゼ阻害薬はＢＴＫ阻害薬、例えば本明細書に記載されるＢＴＫ阻害薬、例えばイブルチニブなどである。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、ラパマイシン類似体、ＯＳＩ－０２７など、例えば本明細書に記載のｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤及び／又はｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば本明細書に記載のｍＴＯＲＣ１阻害剤及び／又はｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば４－アミノ－５－（４－フルオロアニリノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジンなど、例えば本明細書に記載のＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａ及び／又はＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＤＧＫ阻害剤、例えばＤＧＫｉｎｈ１（Ｄ５９１９）又はＤＧＫｉｎｈ２（Ｄ５７９４）など、例えば本明細書に記載のＤＧＫ阻害剤である。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドール又はＨＭＲ－１２７５、２－（２－クロロフェニル）－５，７－ジヒドロキシ－８－［（３Ｓ，４Ｒ）－３－ヒドロキシ－１－メチル－４－ピペリジニル］－４－クロメノン；クリゾチニブ（ＰＦ－０２３４１０６６；２－（２－クロロフェニル）－５，７－ジヒドロキシ－８－［（２Ｒ，３Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）－１－メチル－３－ピロリジニル］－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン、ヒドロクロライド（Ｐ２７６－００）；１－メチル－５－［［２－［５－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－４－ピリジニル］オキシ］－Ｎ－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－アミン（ＲＡＦ２６５）；インジスラム（Ｅ７０７０）；ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）；パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）；ジナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）；Ｎ－［５－［［（５－ｔｅｒｔ－ブチルオキサゾール－２－イル）メチル］チオ］チアゾール－２－イル］ピペリジン－４－カルボキサミド（ＢＭＳ ３８７０３２）；４－［［９－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５Ｈ－ピリミド［５，４－ｄ］［２］ベンズアゼピン－２－イル］アミノ］－安息香酸（ＭＬＮ８０５４）；５－［３－（４，６－ジフルオロ－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イル）－１Ｈ－インダゾール－５－イル］－Ｎ－エチル－４－メチル－３－ピリジンメタンアミン（ＡＧ－０２４３２２）；４－（２，６－ジクロロベンゾイルアミノ）－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボン酸Ｎ－（ピペリジン－４－イル）アミド（ＡＴ７５１９）；４－［２－メチル－１－（１－メチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－Ｎ－［４－（メチルスルホニル）フェニル］－２－ピリミジンアミン（ＡＺＤ５４３８）；及びＸＬ２８１（ＢＭＳ９０８６６２）から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えばパルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）であり、パルボシクリブを一定期間にわたり１日約５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ（例えば、７５ｍｇ、１００ｍｇ又は１２５ｍｇ）の用量で例えば２８日サイクルの１４～２１日間連日又は２１日サイクルの７～１２日間連日投与する。一実施形態において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクル又はそれを超えるパルボシクリブを投与する。
一実施形態において、キナーゼ阻害薬は、イブルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５）；ＧＤＣ－０８３４；ＲＮ－４８６；ＣＧＩ－５６０；ＣＧＩ－１７６４；ＨＭ－７１２２４；ＣＣ－２９２；ＯＮＯ－４０５９；ＣＮＸ－７７４；及びＬＦＭ－Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害薬である。
一実施形態において、キナーゼ阻害薬は、ＢＴＫ阻害薬、例えばイブルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５）であり、イブルチニブは、約２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６００ｍｇ（例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇ又は５６０ｍｇ）の用量で、ある期間毎日、例えば２１日サイクルの間毎日、又は２８日サイクルの間毎日投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２サイクル又はそれを超えるイブルチニブが投与される。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；リダフォロリムス（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）－４－［（２Ｒ）－２－［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ、２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）－１，１８－ジヒドロキシ－１９，３０－ジメトキシ－１５，１７，２１，２３、２９，３５－ヘキサメチル－２，３，１０，１４，２０－ペンタオキソ－１１，３６－ジオキサ－４－アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ－１６，２４，２６，２８－テトラエン－１２－イル］プロピル］－２－メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、ＡＰ２３５７３及びＭＫ８６６９としても知られる；エベロリムス（ＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９）；セマピモド；（５－｛２，４－ビス［（３Ｓ）－３－メチルモルホリン－４－イル］ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル｝－２－メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２－アミノ－８－［トランス－４－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］－６－（６－メトキシ－３－ピリジニル）－４－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン（ＰＦ０４６９１５０２）；及びＮ２－［１，４－ジオキソ－４－［［４－（４－オキソ－８－フェニル－４Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）モルホリニウム－４－イル］メトキシ］ブチル］－Ｌ－アルギニルグリシル－Ｌ－α－アスパルチルＬ－セリン－、分子内塩（ＳＦ１１２６）；及びＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンであり、ラパマイシンを約３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ（例えば、６ｍｇ）の用量で連日、一定期間、例えば２１日サイクルで連日又は２８日サイクルで連日投与する。一実施形態において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクル又はそれを超えるラパマイシンを投与する。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばエベロリムスであり、エベロリムスを一定期間にわたり１日約２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ（例えば、１０ｍｇ）の用量において例えば２８日サイクルで連日投与する。一実施形態において、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクル、１１サイクル、１２サイクル又はそれを超えるエベロリムスを投与する。
一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８；４－アミノ－３－（ｐ－フルオロフェニルアミノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン（ＣＧＰ５７３８０）；セルコスポラミド；ＥＴＣ－１７８０４４５～２；及び４－アミノ－５－（４－フルオロアニリノ）－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
カルシウム依存的ホスファターゼカルシニューリンを阻害する（シクロスポリン及びＦＫ５０６）又は増殖因子誘発シグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物（ラパマイシン）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ．７３：３１６－３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３－７７３，１９９３）も使用できる。更なる態様において、本発明の細胞組成物を、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド及び／又はＯＫＴ３又はＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて（例えば、その前に、それと同時に、又はその後に）患者に投与し得る。一態様において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞除去療法後に投与する。例えば、一実施形態において、対象を高用量化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付す。一実施形態において、移植後、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。更なる実施形態において、増殖細胞を手術前又は後に投与する。
投与中又は後に本発明の化合物及び／又は他の抗癌剤に対するアレルギー反応を経験する患者がいる場合があり、そのため、多くの場合、アレルギー反応のリスクを最小化するために抗アレルギー剤を投与する。適当な抗アレルギー剤は、デキサメサゾン（例えば、デカドロン（登録商標））、ベクロメタゾン（例えば、Ｂｅｃｌｏｖｅｎｔ（登録商標））、ヒドロコルチゾン（コルチゾン、ヒドロコルチゾンナトリウムスクシネート、ヒドロコルチゾンナトリウムホスフェートとしても知られ、商品名Ａｌａ－Ｃｏｒｔ（登録商標）、ヒドロコルチゾンホスフェート、Ｓｏｌｕ－Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ Ａｃｅｔａｔｅ（登録商標）及びＬａｎａｃｏｒｔ（登録商標）として販売）、プレドニゾロン（商品名Ｄｅｌｔａ－Ｃｏｒｔｅｌ（登録商標）、Ｏｒａｐｒｅｄ（登録商標）、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ（登録商標）及びＰｒｅｌｏｎｅ（登録商標）として販売）、プレドニゾン（商品名Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕｉｄ Ｒｅｄ（登録商標）、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ（登録商標）及びＯｒａｓｏｎｅ（登録商標）として販売）、メチルプレドニゾロン（６－メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンアセテート、メチルプレドニゾロンナトリウムスクシネートとしても知られ、商品名Ｄｕｒ単独（登録商標）、Ｍｅｄｒ単独（登録商標）、Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）、Ｍ－Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（登録商標）及びＳｏｌｕ－Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）として販売）などのコルチコステロイド；ジフェンヒドラミン（例えば、Ｂｅｎａｄｒｙｌ（登録商標））、ヒドロキシジン及びシプロヘプタジンなどの抗ヒスタミン剤；及びβ－アドレナリン受容体アゴニスト、アルブテロール（例えば、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ（登録商標））及びテルブタリン（Ｂｒｅｔｈｉｎｅ（登録商標））などの気管支拡張剤を含む。
本発明の化合物及び／又は他の抗癌剤の投与中及び後に悪心を経験する患者がいる場合があり、そのため、悪心（胃上部）及び嘔吐の予防に制吐剤を使用する。適当な制吐剤は、アプレピタント（Ｅｍｅｎｄ（登録商標））、オンダンセトロン（Ｚｏｆｒａｎ（登録商標））、グラニセトロンＨＣｌ（Ｋｙｔｒｉｌ（登録商標））、ロラゼパム（Ａｔｉｖａｎ（登録商標）、デキサメサゾン（デカドロン（登録商標））、プロクロルペラジン（Ｃｏｍｐａｚｉｎｅ（登録商標））、カソピタント（Ｒｅｚｏｎｉｃ（登録商標）及びＺｕｎｒｉｓａ（登録商標））及びこれらの組み合わせを含む。
処置中に経験する疼痛を軽減する投薬も、多くの場合、患者がより快適になるように処方される。タイレノール（登録商標）のような一般的非処方鎮痛剤が多くの場合に使用される。しかしながら、ヒドロコドン／パラセタモール又はヒドロコドン／アセトアミノフェン（例えば、Ｖｉｃｏｄｉｎ（登録商標））、モルヒネ（例えば、Ａｓｔｒａｍｏｒｐｈ（登録商標）又はＡｖｉｎｚａ（登録商標））、オキシコドン（例えば、ＯｘｙＣｏｎｔｉｎ（登録商標）又はＰｅｒｃｏｃｅｔ（登録商標））、塩酸オキシモルホン（Ｏｐａｎａ（登録商標））及びフェンタニル（例えば、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ（登録商標））などのオピオイド鎮痛剤剤も軽度又は重度疼痛に有用である。
正常細胞を処置毒性から保護する及び臓器毒性を制限する試みにおいて、細胞保護剤（例えば、神経保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、心保護剤、アントラサイクリン溢血中和剤、栄養素など）を補助剤治療として使用し得る。適当な細胞保護剤は、アミホスチン（Ｅｔｈｙｏｌ（登録商標））、グルタミン、ジメスナ（Ｔａｖｏｃｅｐｔ（登録商標））、メスナ（Ｍｅｓｎｅｘ（登録商標））、デクスラゾキサン（Ｚｉｎｅｃａｒｄ（登録商標）又はＴｏｔｅｃｔ（登録商標））、キサリプロデン（Ｘａｐｒｉｌａ（登録商標））及びロイコボリン（カルシウムロイコボリン、シトロボラム因子及びフォリン酸としても既知）を含む。
コード番号、一般名又は商品名により同定した活性化合物の構造は、標準参考書「Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ」の現行版又はデータベース、例えばＰａｔｅｎｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（例えば、ＩＭＳ Ｗｏｒｌｄ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）から取られ得る。
本発明の化合物と組み合わせて使用できる上記化合物を、上に引用した文献に記載のものなど、当技術分野で記載されるように製造し、投与できる。
一実施形態において、本発明は、少なくとも１つの本発明の化合物（例えば、本発明の化合物）又はその薬学的に許容される塩を、ヒト又は動物対象の投与に適する薬学的に許容される担体と共に、単独で又は他の抗癌剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
一実施形態において、本発明は、癌などの細胞増殖性疾患を有するヒト又は動物対象を処置する方法を提供する。本発明は、治療有効量の本発明の化合物（例えば、本発明の化合物）又はその薬学的に許容される塩を、単独で又は他の抗癌剤と組み合わせて対象に投与することを含む、処置を必要とするヒト又は動物対象を処置する方法を提供する。
特に、組成物は、併用療法として製剤するか又は別々に投与することができる。
併用療法において、本発明の化合物及び他の抗癌剤を同時に、一緒に、又は逐次的に特定の時間制限なく投与し得、ここで、このような投与は、患者体内で２化合物の治療的有効なレベルを提供する。
好ましい実施形態において、本発明の化合物及び他の抗癌剤を一般に任意の順番で注入又は経口により逐次的に投与する。投薬レジメンは、疾患ステージ、患者の体力、個々の薬物の安全性プロファイル及び個々の薬物の耐容性並びに組み合わせを投与する処置医及び医療従事者に周知の他の基準により変わり得る。本発明の化合物及び他の抗癌剤を、処置に使用する特定のサイクルにより、互いに数分、数時間、数日又は数週間離れて投与する。加えて、サイクルは、処置サイクル中、一方の薬剤の他方より多い投与及び薬物投与当たりの異なる用量を含む。
本発明の別の態様において、本明細書に開示されるような１つ以上の本発明の化合物及び組み合わせパートナーを含むキットが提供される。代表的キットは、（ａ）本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩、（ｂ）例えば、上記のような少なくとも１つの組み合わせパートナーを含み、それにより、このようなキットは、投与指示を含む添付文書又は他のラベリングを含み得る。
本発明の化合物は、既知治療法、例えばホルモン投与又は特に放射線と組み合わせても有利に使用され得る。本発明の化合物は、特に放射線療法に低感受性を示す腫瘍の処置のために特に放射線増感剤として使用され得る。
一実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する副作用を低減又は緩和する薬剤を投与することができる。ＣＡＲ発現細胞の投与に付随する副作用は、ＣＲＳ及びマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）とも呼ばれる血液貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）を含むが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。ＣＲＳは、発熱、疲労、食欲不振、筋肉痛、関節痛（ａｒｔｈａｌｇｉａｓ）、悪心、嘔吐、頭痛などの臨床的体質的徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、発疹などの臨床皮膚徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐及び下痢などの臨床的消化器徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸及び低酸素血症などの臨床的呼吸器徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧の増大、低血圧、心拍出量の増加（早期）及び心拍出量の低下（後期）などの臨床的心血管徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、凝固兆候及びｄ－二量体増加、出血の有無にかかわらず低フィブリノゲン血などの症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症などの臨床腎徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症及び高ビリルビン血症などの臨床肝徴候及び症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態の変化、混乱、せん妄、単語発見困難又はフランク失語、幻覚、振戦、ジメトリア、異常歩行、発作などの臨床的神経徴候及び症状を含み得る。従って、本明細書に記載の方法は、対象に本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞を投与し、更にＣＡＲ発現細胞処置に由来する可溶性因子のレベル増加を管理する１つ以上の薬剤の投与を含み得る。一実施形態において、対象で増加し得る可溶性因子は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－２及びＩＬ－６の１つ以上である。一実施形態において、対象において増加する因子は、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－８、ＩＬ－５及びフラクタルカインの１つ以上である。そのため、これらの副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の１つ以上を中和する薬剤であり得る。一実施形態において、これらの可溶性形態の１つ以上を中和する薬剤は、抗体又はその抗原結合断片である。このような薬剤の例は、ステロイド（例えば、コルチコステロイド）、ＴＮＦα阻害剤及びＩＬ－６阻害剤を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害薬の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、及びゴリムマブなどの抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害薬の別の例は、エタネルセプトなどの融合タンパク質である。小分子ＴＮＦα阻害薬としては、限定はされないが、キサンチン誘導体（例えば、ペントキシフィリン）及びブプロピオンが挙げられる。ＩＬ－６阻害薬の例は、トシリズマブ（ｔｏｃ）、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ－９４５４２９、ＣＮＴＯ １３６、ＣＰＳＩ－２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ－１０９、ＦＥ３０１、及びＦＭ１０１などの抗ＩＬ－６抗体分子である。一実施形態において、抗ＩＬ－６抗体分子は、トシリズマブである。ＩＬ－１Ｒベースの阻害剤の例は、アナキンラである。
一実施形態において、対象にとりわけ例えばメチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイドを投与する。
一実施形態において、対象に例えばノルエピネフリン、ドーパミン、フェニレフリン、エピネフリン、バソプレシン又はこれらの組み合わせなどの昇圧剤を投与する。
一実施形態において、対象に解熱剤を投与できる。一実施形態において、対象に鎮痛剤を投与できる。
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を対象に投与できる。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えばプログラム細胞死１（ＰＤ１）は、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３、及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦβを含む。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。実施形態において、阻害性核酸、例えば阻害性核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ、又は群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）、転写－アクティベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、ＣＡＲ発現細胞の阻害分子の発現を阻害できる。一実施形態において、阻害剤は、ｓｈＲＮＡである。一実施形態において、阻害分子は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの実施形態において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、ＣＡＲの要素、例えば要素全部をコードする核酸と連結する。
一実施形態において、阻害シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子と結合する抗体又は抗体断片であり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２又はＣＴＬＡ４に結合する抗体又は抗体断片であり得る（例えば、イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０及びＭＤＸ－１０１とも称し、ヤーボイ（登録商標）として市販；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ－６７５，２０６として既知。））。一実施形態において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体又は抗体断片である。ある実施形態において、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体又は抗体断片である。ある実施形態において、薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）に結合する抗体又は抗体断片である。
ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞に発現される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：７６５－７５）。ＰＤ１に対する２リガンド、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１は、ヒト癌において豊富である（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８１：２８１－７；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５４：３０７－３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０：５０９４）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１との局所相互作用の阻害により逆転できる。ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の抗体、抗体断片及び他の阻害剤は、当技術分野で入手可能であり、本明細書に記載のＣＡＲと組み合わせて使用され得る。例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８又はＭＤＸ１１０６とも称す；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＰＤ１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＰＤ１に特異的に結合するニボルマブ（クローン５Ｃ４）及び他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号明細書及び国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに開示されている。ピディリズマブ（ＣＴ－０１１；Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットに開示されている。ペンブロリズマブ（以前はランブロリズマブとして知られ、キイトルーダＭＫ０３４７５とも称される；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ１抗体は、米国特許第８，３５４，５０９号明細書及び国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットに開示される。ＭＥＤＩ４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）は、ＰＤＬ１と結合し、リガンドとＰＤ１との相互作用を阻害するヒトモノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）は、ＰＤ－Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＰＤ－Ｌ１に対するＭＤＰＬ３２８０Ａ及び他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号明細書及び米国特許出願公開２０１２００３９９０６号明細書に記載されている。他の抗ＰＤ－Ｌ１結合剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（重鎖及び軽鎖可変領域は、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットの配列番号２０及び２１に示される）及びＭＤＸ－１ １０５（別名ＢＭＳ－９３６５５９及び例えば国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに開示される抗ＰＤ－Ｌ１結合剤）である。ＡＭＰ－２２４（Ｂ７－ＤＣＩｇ；Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ；例えば、国際公開第２０１０／０２７８２７号パンフレット及び国際公開第２０１１／０６６３４２号パンフレットに開示）は、ＰＤ１とＢ７－Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ－Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ１抗体は、とりわけ、ＡＭＰ ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、例えば米国特許第８，６０９，０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号明細書及び／又は米国特許出願公開第２０１２０１１４６４９号明細書に開示の抗ＰＤ１抗体を含む。
ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリン－３）も、特にＩＦＮ－ｇ分泌ＣＤ４＋Ｔヘルパー１及びＣＤ８＋Ｔ細胞毒性１細胞においてＴ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞疲弊に重要な役割を有する。ＴＩＭ３とそのリガンド、例えばガレクチン－９（Ｇａｌ９）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）及びＨＭＧＢ１の相互作用の阻害は、免疫応答を高め得る。ＴＩＭ３及びそのリガンドの抗体、抗体断片及び他の阻害剤は、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載のＣＡＲと組み合わせて使用され得る。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体断片、小分子又はペプチド阻害剤は、そのリガンドとの相互作用を阻害するためにＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合する。ＴＩＭ３を阻害する抗体及びペプチドは、国際公開第２０１３／００６４９０号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１００２４７５２１号明細書に開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３－２３のヒト化バージョン（Ｎｇｉｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７１：３５４０－３５５１に開示）及びクローン８Ｂ．２Ｃ１２（Ｍｏｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ，４１５：５３６－５４１に開示）を含む。ＴＩＭ３及びＰＤ－１を阻害する二特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１３０１５６７７４号明細書に開示されている。
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５阻害剤）である。一実施形態において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。例示的抗ＣＥＡＣＡＭ－１抗体は、国際公開第２０１０／１２５５７１号パンフレット、国際公開第２０１３／０８２３６６号パンフレット、国際公開第２０１４／０５９２５１号パンフレット及び国際公開第２０１４／０２２３３２号パンフレットに開示され、例えばモノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７及び５Ｆ４；又は例えば米国特許出願公開第２００４／００４７８５８号明細書、米国特許第７，１３２，２５５号明細書及び国際公開第９９／０５２５５２号パンフレットに開示のようなその組み換え形態である。一部の実施形態において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０ Ｓｅｐ ２；５（９）．ｐｉｉ：ｅ１２５２９（ＤＯＩ：１０：１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２１１４６）に記載のようにＣＥＡＣＡＭ－５と結合するか、又は例えば国際公開第２０１３／０５４３３１号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１８号明細書に記載のようにＣＥＡＣＡＭ－１及びＣＥＡＣＡＭ－５と交差反応する。
理論に拘束されることを望まないが、ＣＥＡＣＡＭ－１及びＣＥＡＣＡＭ－５などの癌胎児性抗原細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）は、少なくとも部分的に抗腫瘍免疫応答の阻害を仲介すると考えられる（例えば、Ｍａｒｋｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２ Ｍａｒ １５；１６８（６）：２８０３－１０；Ｍａｒｋｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ｎｏｖ １；１７７（９）：６０６２－７１；Ｍａｒｋｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９ Ｆｅｂ；１２６（２）：１８６－２００；Ｍａｒｋｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１０ Ｆｅｂ；５９（２）：２１５－３０；Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｊｕｎ；１１（６）：１３００－１０；Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｊｕｎ １；１７４（１１）：６６９２－７０１；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０ Ｓｅｐ ２；５（９）．ｐｉｉ：ｅ１２５２９を参照されたい）。例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１は、ＴＩＭ－３のヘテロ親和性リガンドとして、及びＴＩＭ－３介在Ｔ細胞耐容性及び疲弊に役割を有するとして記載されている（例えば、国際公開第２０１４／０２２３３２号パンフレット；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３８４８）。実施形態において、ＣＥＡＣＡＭ－１及びＴＩＭ－３の共遮断は、異種移植結腸直腸癌モデルにおいて抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている（例えば、国際公開第２０１４／０２２３３２号パンフレット；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）、前掲を参照されたい）。一部の実施形態において、ＣＥＡＣＡＭ－１及びＰＤ－１の共遮断は、例えば、国際公開第２０１４／０５９２５１号パンフレットに記載されるようにＴ細胞耐容性を減少させる。そのため、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、本明細書に記載の他の免疫調節剤（例えば、抗ＰＤ－１及び／又は抗ＴＩＭ－３阻害剤）と使用して、癌、例えば黒色腫、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌及び本明細書に記載の他の癌に対する免疫応答を増強させ得る。
ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子－３又はＣＤ２２３）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊に役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ－３及びそのリガンドの抗体、抗体断片及び他の阻害剤は、当技術分野で入手可能であり、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のＣＡＲと組み合わせて使用され得る。例えば、ＢＭＳ－９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂ）は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）は、アンタゴニストＬＡＧ－３抗体であり、ＩＭＰ７３１（Ｉｍｍｕｔｅｐ及びＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）は、枯渇性ＬＡＧ－３抗体である。他のＬＡＧ－３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分とＭＨＣクラスＩＩ分子のＩｇの組み換え融合タンパク質であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化するＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）である。他の抗体は、例えば、国際公開第２０１０／０１９５７０号パンフレットに開示されている。
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第１ドメイン及び第２ドメインを含む融合タンパク質であり得、ここで、第１ドメインは、阻害分子又はその断片であり、第２ドメインは、陽性シグナルと関係するポリペプチド、例えば本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。一実施形態において、陽性シグナルと結合するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８、ＣＤ２７及び／又はＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン及び／又は例えば本明細書に記載の例えばＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。一実施形態において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞により発現される。
一実施形態において、本明細書に記載のＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ｍｉＲ－１７－９２である。
医薬組成物及び治療
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のように、ＣＡＲ発現細胞、例えば複数のＣＡＲ発現細胞を１つ以上の薬学的に又は生理学的に許容される担体、希釈剤又は添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチド又はアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、１つの態様において静脈内投与のために製剤される。
本発明の医薬組成物を、処置する（又は予防する）疾患に適する方法で投与し得る。投与の量及び頻度は、患者の状態及び患者の疾患のタイプ及び重症度などの因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定され得る。
一実施形態において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ－Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞又はプラスミド成分、細菌及び真菌からなる群から選択される汚染物が実質的になく、例えば検出可能なレベルで存在しない。一実施形態において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）及びストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
「免疫学的に有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」又は「治療量」が示されるとき、本発明の組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染の程度又は転移及び患者（対象）の状態の個体差を考慮して医師が決定できる。一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を含む医薬組成物は、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重、一部の例では１０５～１０６細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞は、３×１０４、１×１０６、３×１０６、又は１×１０７細胞／ｋｇ体重で投与され得る。細胞組成物は、これらの投薬量で複数回投与され得る。細胞を、免疫療法において一般に知られる注入技術を使用して投与できる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
一態様において、活性化細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を対象に投与し、続いて血液を採り（又はアフェレーシスを実施し）、本発明に従ってそれからの細胞を活性化し、これらの活性化し、且つ増殖させた細胞を患者に再注入することが望ましいことがある。この過程を数週間毎に複数回実施できる。一態様において、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血した血液から活性化できる。一態様において、細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ又は１００ｃｃの採血した血液から活性化する。
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、留置又は移植を含む任意の簡便な方法により実施し得る。本明細書に記載の組成物を患者に経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により又は腹腔内に投与し得る。１つの態様において、本発明の細胞組成物、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞組成物を患者に皮内又は皮下注射により投与する。１つの態様において、本発明の細胞組成物、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞組成物をｉ．ｖ．注射により投与する。細胞の組成物、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞組成物を腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注射し得る。
特定の例示的態様において、対象は、白血球を採取し、エクスビボで富化又は枯渇させて、目的の細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞を選択及び／又は単離する白血球除去を受け得る。これらの細胞単離体、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞単離体を当技術分野で知られる方法により増殖させ、１つ以上の本発明のＣＡＲ構築物が導入され、それにより本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞が創製されるように処理し得る。処置を必要とする対象を、その後、高用量の化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付し得る。一態様において、移植後又は移植と同時に、対象は、増殖させた本発明のＣＡＲ発現細胞の注入を受ける。更なる態様において、増殖細胞を手術前又は後に投与する。
実施形態において、例えば本明細書に記載されるＣＡＲを発現する１つ以上の細胞を投与する前に、対象においてリンパ球枯渇が実施される。実施形態において、リンパ球枯渇は、メルファラン、シトキサン、シクロホスファミド、及びフルダラビンの１つ以上を投与することを含む。
患者に投与すべき上記処置の用量は、処置する状態の正確な性質及び処置のレシピエントにより変わる。ヒト投与のためのスケーリングは、当技術分野で認識されている習慣に従って実施できる。治療剤、例えば抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨの用量は、例えば、概して例えば成人患者に１～約１００ｍｇの範囲であり得、例えば連日で１～３０日の期間にわたって投与する。好適な１日用量は、１～１０ｍｇ／日であるが、幾つかの例において最大４０ｍｇ／日までの高用量を使用し得る（米国特許６，１２０，７６６号明細書に記載）。
一実施形態において、ＣＡＲを、例えばインビトロ転写を使用して細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に導入し、対象（例えば、ヒト）は、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の初期投与及びその後の本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１回以上の投与を受け、ここで、その後の１回以上の投与は、先の投与後、１５日、例えば１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日又は２日未満で行う。一実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１回を超える投与を対象（例えば、ヒト）に１週間当たりに行い、例えば本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の２、３又は４投与を１週間当たりに投与する。一実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１週間当たり１回を超える投与を受け（例えば、１週間当たり２回、３回又は４回投与）（本明細書ではサイクルとも称される）、続いて１週間、ＣＡＲ発現細胞を投与されず、例えばＣＡＲ Ｔ細胞投与又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞投与がなく、その後、更にＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１回以上の更なる投与（例えば、１週間当たりでＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１回を超える投与）を対象に投与する。別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞の１回を超えるサイクルの投与を受け、各サイクル間の期間は、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日又は３日より短い。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞を隔日で１週間３回投与する。一実施形態において、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞を少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間又はそれを超えて投与する。
一部の実施形態において、対象は成人対象（即ち１８歳以上）であり得る。特定の実施形態において、対象は１～３０歳であり得る。一部の実施形態において、対象は１６歳以上であり得る。特定の実施形態において、対象は１６～３０歳である。一部の実施形態において、対象は小児対象（即ち１～１８歳）である。
一態様において、ＣＡＲ発現細胞は、レンチウイルスなど、レンチウイルスのウイルスベクターを使用して作成される。このように作成されたＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、安定したＣＡＲ発現を有することになる。
一態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴは、形質導入４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日後、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ ＣＡＲベクター送達により行われ得る。一態様において、ＣＡＲ ＲＮＡを電気穿孔法により細胞、例えばＮＫ細胞又はＴ細胞に形質導入する。
一過性に発現されるＣＡＲ細胞、例えばＴ細胞又はＣＡＲ発現ＮＫ細胞（特にマウスｓｃＦｖ担持ＣＡＲ発現細胞を伴う）を使用して処置される患者で生じ得る可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。
この理論に拘束されることを望まないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗ＣＡＲ応答を発達させる患者、即ち抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体が原因であると考えられる。細胞を産生する患者の抗体は、抗原への暴露の１０～１４日の中断があるとき、ＩｇＧアイソタイプ（これはアナフィラキシーを生じない）からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けると考えられる。
患者が一過性ＣＡＲ治療（例えば、ＲＮＡ形質導入により完成されたものなど）中に抗ＣＡＲ抗体応答を産生する高リスクにある場合、ＣＡＲＴ注入中断は、１０～１４日を超えて継続してはならない。
バイオポリマー送達方法
一部の実施形態において、本明細書に開示されるとおりの１つ以上のＣＡＲ発現細胞は、バイオポリマー足場、例えばバイオポリマーインプラントを介して対象に投与又は送達することができる。バイオポリマー足場は本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞の送達、拡大、及び／又は分散を支持し又は増強することができる。バイオポリマー足場は、天然に存在するもの又は合成であり得る生体適合性（例えば、炎症反応又は免疫応答を実質的に誘導しない）及び／又は生分解性ポリマーを含む。
好適なバイオポリマーの例としては、限定はされないが、単独での、又は任意の他のポリマー組成物と組み合わせた、任意の濃度及び任意の比率の、寒天、アガロース、アルギン酸塩、アルギン酸塩／リン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）、β－ガラクトシダーゼ（β－ＧＡＬ）、（１，２，３，４，６－ペンタアセチルａ－Ｄ－ガラクトース）、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－３－ヒドロキシ－ヘキサノエート）（ＰＨＢＨＨｘ）、ポリ（ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリビニルアルコール）（ＰＶＡ）、シルク、ダイズタンパク質、及びダイズタンパク質分離物が挙げられる。バイオポリマーは、付着又は移動促進分子、例えばリンパ球のコラーゲン受容体に結合するコラーゲン模倣ペプチド、及び／又は送達される細胞の送達、拡大、又は機能、例えば抗癌活性を増強する刺激分子で増進させる又は改変することができる。バイオポリマー足場は、注射のための例えばゲル又は半固体、又は固体組成物であり得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＡＲ発現細胞は、対象への送達前にバイオポリマー足場に播種される。実施形態において、バイオポリマー足場は、例えば、足場のバイオポリマーに配合又はコンジュゲートされた、本明細書に記載される１つ以上の追加的な治療剤（例えば、別のＣＡＲ発現細胞、抗体、又は小分子）又はＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を更に含む。実施形態において、バイオポリマー足場は、例えば、腫瘍内に注入されるか、又は腫瘍若しくは抗腫瘍効果を媒介するのに十分に腫瘍に近接した範囲内に外科的に植え込まれる。バイオポリマー組成物及びその送達方法の更なる例は、Ｓｔｅｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３３：９７－１０１；及び国際公開第２０１４／１１０５９１号パンフレットに記載されている。
以下の実験的実施例を参照することにより、本発明を更に詳細に説明する。これらの例は例示を目的として提供されるに過ぎず、特記されない限り限定することを意図するものではない。従って、本発明が以下の例に限定されると解釈されることは一切あってはならず、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形形態を包含すると解釈されなければならない。
実施例１：ＣＤ１９及びＣＤ２２を標的化するタンデム及びデュアルＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ活性
本実施例では、タンデム及びデュアルＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ活性を実証する。
タンデムキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、同じタンパク質の一部として２つの異なるｓｃＦｖドメインをタンデムで発現する。デュアルＣＡＲは、２つの完全長ＣＡＲで構成される。ここで、これらの２つのＣＡＲは、単一のレンチウイルスベクターによってコードされ、Ｐ２Ａリボソームスキップエレメントで隔てられている。ここに記載されるタンデムＣＡＲ及びデュアルＣＡＲの両方とも、同じ４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ刺激ドメインを利用する。初代Ｔ細胞の形質導入のため、タンデム及びデュアルＣＡＲをレンチウイルス発現ベクター（Ｐｅｌｐｓ）にクローニングした。
本実施例で使用されるタンデムＣＡＲは、ｃ１７１、ｃ１８２、ｃ２２４及びｃ２２７である。本実施例で試験されるデュアルＣＡＲは、ｃ２０１及びｃ２３０（これらは両方とも、ＣＤ１９ ＣＡＲの上流にＣＤ２２ ＣＡＲを有する）及びｃ２０３（これはＣＤ２２ ＣＡＲの上流にＣＤ１９ ＣＡＲを有する）である。ｃ２３０は、ｃ２０１と同じアミノ酸配列を有するが、異なるコドンを用いて作成されており、従ってこれは異なるＤＮＡ配列を有する。また、本実施例では、関連するモノＣＡＲ：ＣＤ２２を認識するＣＤ２２－６５ｓ及びＣＤ１９を認識するｃ２０６も使用される。
ＣＤ１９及びＣＤ２２発現（Ｎａｌｍ６）、ＣＤ２２発現（ＣＤ１９ＫＯ）又はＣＤ１９発現（ＣＤ２２ＫＯ）標的に応答したタンデム及びデュアルＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞応答を試験することにより、コンストラクトを比較した。エフェクターＴ細胞応答としては、限定はされないが、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生及び標的細胞死滅又は細胞溶解活性（脱顆粒）が挙げられる。
結果
ＣＡＲ Ｔ細胞の作成
ＣＡＲをコードするＰｅｌｐｓレンチウイルストランスファーベクターを使用して、ＶＳＶｇシュードタイプレンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノムウイルス材料を作製した。ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターＤＮＡをリポフェクタミン試薬との組み合わせで３つのパッケージング成分ＶＳＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖと混合して、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にトランスフェクトし、続いて１２～１８時間後に培地交換した。培地交換から３０時間後、培地を回収し、ろ過し、沈殿によって濃縮し、－８０℃で保管した。
ネガティブ選択（Ｐａｎ Ｔ細胞単離、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によってＴ細胞が濃縮されている、アフェレーシスを受けた健常ドナーの血液から出発することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞を作成した。次に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：３（Ｔ細胞対ビーズ）の比で加えることによりＴ細胞を活性化し、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２Ｍｍ Ｌ－グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ及び５５ｍＭ ２－メルカプトエタノール）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。Ｔ細胞は、２４ウェルプレートのウェル当たり１ｍｌ培地中、０．５×１０６個のＴ細胞で培養した。２４時間後、Ｔ細胞が芽球化しているとき、ウイルス上清を加えた；Ｔ細胞を５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。Ｔ細胞が増殖し始め、これを細胞濃度の測定（１Ｍｌ当たりのカウントとして）によってモニタし、２日毎にＴ細胞を新鮮なＴ細胞培地で希釈した。約１０日後にＴ細胞が静止し始めたことに伴い、対数増殖が衰える。成長速度の鈍化とＴ細胞サイズの低下（３５０Ｆｌに近付く）との組み合わせにより、後の分析のためＴ細胞を凍結保存するタイミングが決まる。ＣＡＲ Ｔ細胞は、全て研究グレードの（即ち臨床グレードでない）製造条件下で作製した。凍結保存前に、形質導入された（細胞表面上にＣＤ２２特異的及び／又はＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現する）細胞の割合をＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）でのフローサイトメトリー分析によって決定した。ウイルス形質導入は同等の発現レベルを示したことから、それぞれのＣＡＲの形質導入効率が同程度であることが指摘される。ＣＡＲ Ｔ細胞培養物の細胞数は、形質導入されていないＴ細胞（「ＵＴＤ」）と比較したとき、ＣＡＲがＴ細胞の増殖能力に及ぼす検出可能な負の効果がないことを指示している。
ＣＡＲによってリダイレクトされたＴ細胞の効力を評価する
これらのデュアルＣＡＲ Ｔ細胞の機能的能力を評価するため、上記に記載されるとおり作成したＣＡＲ－Ｔを解凍し、カウントし、癌細胞と共培養して、その死滅させる能力及びサイトカインの分泌を読み取った。一つの実験では、デュアルＣＡＲ－Ｔ ｃ２０１及びｃ２０３をモノＣＡＲ対応物ｃ２０６（ＣＡＲＴ１９）及びＣＤ２２－６５ｓと比較した。第２の実験では、デュアルＣＡＲ－Ｔ ｃ２０１及びｃ２３０をタンデムＣＡＲ－Ｔ ｃ１７１、ｃ１８２、ｃ１８８、ｃ２２４及びｃ２２７と比較し、且つモノＣＡＲ対応物ｃ２０６（ＣＡＲＴ１９）及びＣＤ２２－６５ｓと比較した。両方の実験で、非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）をノンターゲティングＴ細胞対照として供した。
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）株Ｎａｌｍ６（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９２）及びＮａｌｍ６のＣＲＩＳＰＲ改変によって作成した、それぞれのＣＤ２２陰性株（ＣＤ２２ＫＯ）並びにＣＤ１９陰性株（ＣＤ１９ＫＯ）に向けて、Ｔ細胞死滅をダイレクトした。全ての細胞株を、細胞生存／死滅のレポーターとしてルシフェラーゼを発現するように形質導入した。ＣＡＲ－Ｔの細胞溶解活性を、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１ ０．６３：１及び０．３１：１のエフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）の滴定で測定した。アッセイは、それぞれの数のＴ細胞を一定数の標的細胞（９６ウェルプレートのウェル当たり２５，０００細胞）と混合することによって開始した。２０時間後、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬を加えることによりウェルに残存する細胞を溶解させて、各ウェルに残るＬｕｃ発現癌細胞を定量化した。標的細胞が単独で入っているウェル（０％死滅率、最も高いＬｕｃシグナル）に対する相対的な「％死滅率」を計算した。ＣＤ２２ＫＯ Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃによるデータは、デュアル又はｃ２０６ ＣＡＲＴをコードするレンチウイルスの形質導入により、Ｔ細胞に抗ＣＤ１９死滅活性が移入されることを示している（図３Ａ）。ＣＤ１９ＫＯ Ｎａｌｍ６－Ｌｕｃによるデータは、デュアル、タンデム又はＣＤ２２－６５ｓ ＣＡＲＴをコードするレンチウイルスの形質導入により、Ｔ細胞に抗ＣＤ２２死滅活性が移入されることを示している（図３Ｂ）。ＵＴＤ Ｔ細胞は、バックグラウンド死滅のみを示す。３つのデュアルＣＡＲ－Ｔ全てが、両方のＫＯ Ｎａｌｍ６標的細胞のやや高いＣＤ１９媒介性及びＣＤ２２媒介性死滅を示した。
ＣＤ２２及び／又はＣＤ１９を発現する標的細胞に応答したこれらのＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン産生を測定するため、ＣＡＲ Ｔ細胞を上記と同じＡＬＬ株と共培養した。加えて、ＣＡＲ－ＴをＡＬＬ株ＳＥＭと共培養した。細胞は、１：１のエフェクター：標的比及び９６ウェルプレートのウェル当たり２５，０００細胞で２４時間培養し、その後、培地を取り出して、Ｖ－ＰＬＥＸ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－ｇキット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いたサイトカイン分析にかけた。デュアル、タンデム及びモノＣＡＲ－Ｔの全てが、ＣＤ１９を発現する標的細胞によって強力に刺激された（Ｎａｌｍ６、ＣＤ２２ＫＯ Ｎａｌｍ６及びＳＥＭ；図３Ｃ及び図３Ｄ）。しかしながら、ＣＤ２２単独（ＣＤ１９ＫＯ Ｎａｌｍ６）で刺激されたＣＡＲ－Ｔによって分泌されるＩＦＮ－ｇレベルに関するデータは、ｃ２０３及びタンデムＣＡＲ－Ｔと比較したときｃ２０１及びｃ２３０デュアルＣＡＲ－Ｔの刺激の向上を示した。ｃ２０１及びｃ２３０は、ＣＤ２２－６５ｓモノＣＡＲ－Ｔと同等のレベルのＩＦＮ－ｇを分泌した（図３Ｃ及び図３Ｄ）。
この研究では、デュアルＣＡＲ－Ｔ ｃ２０１、ｃ２０３及びｃ２３０が、タンデム及びモノＣＡＲ－Ｔよりも良好な死滅活性を示した。ＣＤ１９発現標的細胞との共培養時におけるＩＦＮ－ｇ分泌の点では、デュアルＣＡＲ－Ｔは同程度に活性であったが、ｃ２０３と比較すると、ｃ２０１が優れた活性化を示した。ｃ２０１及びｃ２３０は両方とも、この研究で試験したタンデムＣＡＲ－Ｔと比較すると、より良好な活性化を示した。
実施例２：ＣＤ１９及びＣＤ２２を標的化するデュアル及びタンデムＣＡＲ－Ｔのインビボ活性
本実施例では、デュアル及びタンデムＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ活性を実証する。
タンデムキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、同じタンパク質の一部として２つの異なるｓｃＦｖドメインをタンデムで発現する。デュアルＣＡＲは、２つの完全長ＣＡＲで構成される。この例では、これらの２つのＣＡＲは、単一のレンチウイルスベクターによってコードされ、Ｐ２Ａリボソームスキップエレメントで隔てられている。本明細書に記載されるタンデムＣＡＲ及びデュアルＣＡＲの両方とも、同じ４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ刺激ドメインを利用する。初代Ｔ細胞の形質導入のため、タンデム及びデュアルＣＡＲをレンチウイルス発現ベクター（Ｐｅｌｐｓ）にクローニングした。
本実施例で使用されるタンデムＣＡＲは、ｃ１７１、ｃ１８２、ｃ２２４及びｃ２２７である。本実施例で使用されるデュアルＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲの上流にＣＤ２２ ＣＡＲを有するｃ２０１及びｃ２３０である。ｃ２３０は、ｃ２０１と同じアミノ酸配列を有するが、異なるコドンを用いて作成されており、従ってこれは異なるＤＮＡ配列を有する。この研究において使用される関連するモノＣＡＲは、ＣＤ２２を認識するＣＤ２２－６５ｓ及びＣＤ１９を認識するｃ２０６である。デュアル及びタンデムＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性は、ＡＬＬ異種移植片再発モデルにおいてインビボで評価した。
材料及び方法
細胞株：Ｎａｌｍ６（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９２）は、ヒト急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株である。ＣＲＩＳＰＲ技術を用いてＣＤ１９遺伝子をノックアウトした（ＣＤ１９ＫＯ）。細胞は、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＭＰＩ培地で成長させて、両方とも浮遊状態で成長した。細胞はマウスにおいて、静脈内に移植したとき、残存し、拡大した。細胞はルシフェラーゼを発現するように改変しているため、基質ルシフェリンを注射した後にマウスをイメージングすることにより、腫瘍細胞成長もモニタすることができる。
マウス：Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから６週齢ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスを受領した（ストック番号００５５５７）。動物は、実験前に少なくとも３日間順化させておいた。動物は、関連する規制及びガイドラインに準拠して取り扱った。腫瘍移植前日に、動物識別のための電子トランスポンダーを左側腹部に植え込んだ。
腫瘍移植：対数増殖期のＮａｌｍ６及びＣＤ１９ＫＯ Ｎａｌｍ６細胞を回収し、５０ｍｌファルコンチューブ内において１２００ｒｐｍで５分間、成長培地で１回、次に冷滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１ｍｌ当たり５×１０６の濃度及び２０：１の比のＮａｌｍ６対ＣＤ１９ＫＯ Ｎａｌｍ６でＰＢＳに再懸濁し、氷上に置き、マウスに注射した。癌細胞を２００μｌで尾静脈から静脈内注射した。このモデルは、マウスの静脈内に移植したとき良好に成長し、これは、腫瘍量測定のためイメージングすることができる。１×１０６個の癌細胞を注射すると、３日以内に腫瘍が樹立され、正確に測定することができる。ベースライン測定値は、４～６×１０５光子／秒（ｐ／ｓ）である。７日以内に、平均生物発光測定値は２～４×１０６ｐ／ｓとなり、２０～３０日までに未治療の腫瘍はエンドポイント測定値（２～３×１０９）に達する。療法剤の抗腫瘍活性は、腫瘍が完全に生着してから試験されることが多い。従って、これらのモデルでは、ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を観察することができるウィンドウが大きい。
ＣＡＲ Ｔ細胞作成：ＣＡＲ Ｔ細胞は、全て研究グレードの（即ち臨床グレードでない）製造条件下で作製した。従来の製造法：ネガティブ選択（Ｐａｎ Ｔ細胞単離、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によってＴ細胞が濃縮されている、アフェレーシスを受けた健常ドナーの血液から出発することにより、ＣＡＲ Ｔ細胞を作成した。次に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：３（Ｔ細胞対ビーズ）の比で加えることによりＴ細胞を活性化し、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ及び５５ｍＭ ２－メルカプトエタノール）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。Ｔ細胞は、２４ウェルプレートのウェル当たり１ｍＬ培地中、０．５×１０６個のＴ細胞で培養した。２４時間後、Ｔ細胞が芽球化しているとき、ウイルス上清を加えた；Ｔ細胞を５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。Ｔ細胞が増殖し始め、これを細胞濃度の測定（１ｍＬ当たりのカウントとして）によってモニタし、２日毎にＴ細胞を新鮮なＴ細胞培地で希釈した。約１０日後にＴ細胞が静止し始めたことに伴い、対数増殖が衰える。成長速度の鈍化とＴ細胞サイズの低下（３５０Ｆｌに近付く）との組み合わせにより、後の分析のためＴ細胞を凍結保存するタイミングが決まる。凍結保存前に、形質導入された（細胞表面上にＣＤ２２特異的及び／又はＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現する）細胞の割合をＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）でのフローサイトメトリー分析によって決定した。ウイルス形質導入は同等の発現レベルを示したことから、それぞれのＣＡＲの形質導入効率が同程度であることが指摘される。ＣＡＲ Ｔ細胞培養物の細胞数は、形質導入されていないＴ細胞（「ＵＴＤ」）と比較したとき、ＣＡＲがＴ細胞の増殖能力に及ぼす検出可能な負の効果がないことを指示している。
ＣＡＲ Ｔ細胞投与：Ｎａｌｍ６研究では、腫瘍移植の７日後にマウスに投与した。従来の製造法によって作成したＣＡＲ Ｔ細胞は、１×１０６個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞で投与した。迅速プロセスで作成した細胞は、０．３及び０．１×１０６個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞で投与した。混合投与については、ｃ２０６及びＣＤ２２－６５ｓモノＣＡＲ－Ｔを以下に指示する用量で１：１の比で混合した。ＴＭＤ８研究では、腫瘍移植の９日後に、１×１０６又は３×１０６個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞をマウスに投与した。対照として、マウスは媒体（ＰＢＳ）又はＵＴＤのいずれかの投与を受けた。投与のため、細胞は３７℃の水浴中で部分的に解凍し、次に、１ｍｌの加温したＴ細胞培地を加えることにより、完全に解凍した。解凍された細胞を５０ｍｌファルコンチューブに移し、Ｔ細胞培地で１２ｍｌの最終容積に調整した。細胞を２回洗浄し、３００ｇで１０分間スピンし、次にＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）によってカウントした。次にＴ細胞をそれぞれの濃度で冷ＰＢＳ中に再懸濁し、マウスへの投与時まで氷上に保った。ＣＡＲ－Ｔは２００μｌで尾静脈から静脈内注射した。細胞は、全て同じドナーから並行して調製した。
動物モニタリング：週２回の体重測定を含め、マウスの健康状態を毎日モニタした。腫瘍もＮａｌｍ６研究のためのイメージングによって週２回モニタした。
結果
Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病異種移植片再発モデルでデュアル及びタンデムＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価した。ＣＤ２２及びＣＤ１９の両方を発現するＮａｌｍ６野生型細胞に５パーセント（５％）のＣＤ１９陰性、ＣＤ２２陽性Ｎａｌｍ６細胞（ＣＤ１９ＫＯ）を混合した。癌細胞をカウントし、組み合わせて、混合集団として注射した。０日目の腫瘍細胞移植後、腫瘍担持マウスを治療群に無作為化し、腫瘍移植後７日目にＣＡＲ Ｔ細胞を外側尾静脈から静脈内投与した。動物がエンドポイントに達するまで、腫瘍成長及び動物の健康をモニタした。
従来どおり製造したＣＡＲ－Ｔを使用した研究において、ｃ１７１、ｃ１８２、ｃ２２４及びｃ２２７タンデムＣＡＲ－Ｔをｃ２０１及びｃ２３０デュアルＣＡＲ－Ｔと比較した。参照として、ｃ２０６及びＣＤ２２－６５ｓモノＣＡＲ－Ｔを単独で又は１：１の混合で注射した。シングルＣＡＲ－Ｔ集団は、全て１×１０６個のＣＡＲ＋用量で注射した一方、混合ＣＡＲ－Ｔは、各１×１０６個のＣＡＲ＋細胞の用量（２×１０６個の合計ＣＡＲ－Ｔ、１ｅ６混合）又は各０．５×１０６個のＣＡＲ＋細胞の用量（１×１０６個の合計ＣＡＲ－Ｔ、５ｅ５混合）のいずれかで注射した。ＰＢＳ又はＵＴＤ Ｔ細胞の投与を受けたマウスは、腫瘍によって後肢の動きが低下する前に、第３週で安楽死させた。他の群は、第４～７週で安楽死させた。全治療群の平均生物発光を図４Ａにプロットする。
いずれのＴ細胞の投与も受けなかったＰＢＳ治療群が、静脈内注射したＮＳＧマウスのベースラインＮａｌｍ６腫瘍成長動態を実証する。このモデルにおけるヒトドナーＴ細胞の非特異的応答を示すため、ＵＴＤ治療群をＴ細胞対照として供したが、これは検出されなかった。ｃ２０６、ＣＤ２２－６５ｓモノＣＡＲ－Ｔは、この再発モデルでは、使用した用量で最小限の応答のみを示した。タンデムＣＡＲ－Ｔは、全て有意に遅い腫瘍成長を示したが、最後に、マウスは、腫瘍量が原因で安楽死させた。デュアルＣＡＲ－Ｔ、ｃ２０１及びｃ２３０は、治療群の数匹のマウスで完全な腫瘍根絶を示した（図４Ａを参照されたい）。１ｅ６混合群も同様の有効性を示したが、デュアルと比較すると、２倍の数のＣＡＲ＋ Ｔ細胞が必要であった。デュアルと同じ総数のＣＡＲ－Ｔの投与を受けた５ｅ５混合群は、ここで試験したタンデムＣＡＲ－Ｔと同等であったとおり、それほどの成績を示さなかった。
これらの動物において、その血液の毎週のフローサイトメトリー分析によってＣＡＲ－Ｔの拡大及び残存の動態を測定した。ＣＡＲ－Ｔ注射後の２週間の分析について、代表的なデータを示す（図４Ｂ）。両方のデュアルＣＡＲ－Ｔ並びにタンデムＣＡＲ－Ｔ ｃ１８２、ｃ２２４及びｃ２２７は、１ｅ６混合群と同程度の数の循環Ｔ細胞を示した。これらの数は、モノＣＡＲ－Ｔ及び５ｅ５混合群と比較すると多かった。
最初の２つの研究では、デュアルＣＡＲ Ｔ細胞ｃ２０１及びｃ２３０が、ＮＡＬＭ６癌及びそのＣＤ１９陰性バリアントを根絶する能力を有することが実証された。その有効性は、ここで試験したそれぞれのモノＣＡＲ－Ｔ並びにタンデムＣＡＲ－Ｔよりも優れていた。
実施例３：活性化プロセスを用いたｃ２０１細胞の小規模製造
本例は、活性化プロセスを用いた小規模でのＣＤ１９標的化及びＣＤ２２標的化デュアルＣＡＲ－Ｔ細胞の製造し易さの評価について記載する。
凍結Ｔ細胞のアリコートを３７℃の水浴中で解凍し、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ ＣＭ（Ｇｉｂｃｏ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地＋１００Ｕ／ｍＬヒトＩＬ２を補足）に入れ、１５００ｒｐｍで５分間スピンした。細胞をカウントし、２４ウェルプレートに３×１０６細胞／ｍＬ、１ｍＬ／ウェルで播いた。各ウェルにＴｒａｎｓＡｃｔを１／１００（１０μＬ／ウェル）で加えた。ＧＭＰグレードのｃ２０１ウイルスを、ｑＰＣＲ力価に基づき種々の感染多重度（ＭＯＩ）で加えた。非形質導入対照（ＵＴＤ）も同じく播いた。２４時間の培養後、細胞を回収し、ＰＢＳ＋１％ＨＳＡで３回洗浄した。次に細胞をカウントし、最終１×１０６細胞／ｍＬで２４ウェルプレートに再び播いた。
再び播いてから７２時間後、細胞を回収し、カウントし、各試料から５×１０５細胞のアリコートを取ってフローサイトメトリー分析にかけた。細胞を１００μｌ／ウェルのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（ＢＶ５１０）で１５分間染色し、次に２回洗浄した。次に抗体混合物（表６）を５０μｌ／ウェルで４℃にて２５分間加えた。細胞を再び２回洗浄し、次にＰＢＳ中１．６％ＰＦＡ、１００μｌ／ウェルで１５分間固定した。固定後、細胞を先述のとおり洗浄し、１５０μｌ／試料の最終容積でフローサイトメトリー緩衝液中に再懸濁した。ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）での各試料のＬｉｖｅ ＣＤ３陽性ゲートで５ｅ４個の細胞が取得され、データをＦｌｏｗＪｏ ｖ．１０ソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。この手順を、再び播いてから１４４時間後に繰り返した。
Figure 2023503161000032
フロー分析により、それぞれの抗イディオタイプ抗体によって検出されるとおり（図５Ａ及び図５Ｂ）、大多数のＣＡＲ＋細胞が、ＣＤ１９及びＣＤ２２標的化ＣＡＲを両方とも発現していることが明らかになった。デュアルに対するモノＣＡＲ発現の比率は、時間とともにデュアルＣＡＲ発現の方にシフトし、１４４時間後には安定化した。同時に、ＣＡＲ発現総量も同じく増加した。両時点とも、ＣＡＲ発現はＭＯＩに依存し、高いＭＯＩほど増加が示された。ここでは、数ドナーの１つの代表例のデータを示す。
実施例４：活性化プロセスを用いたｃ２０１細胞の大規模製造
本例は、活性化プロセスを用いた大規模なフルスケールの臨床規模でのＣＤ１９標的化及びＣＤ２２標的化デュアルＣＡＲ－Ｔ細胞の製造し易さの評価について記載する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化プロセスは、表７に概要を示すとおりの培地の調製から始まる。凍結保存された白血球アフェレーシス製剤を出発材料として使用し、Ｔ細胞濃縮処理した。
Figure 2023503161000033
凍結保存された白血球アフェレーシスを解凍し、洗浄し、次にＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ技術を用いたＴ細胞選択及び濃縮を行った。Ｍｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズで選択された生細胞を、非加湿インキュベーションチャンバであるＰｒｏｄｉｇｙ（登録商標）のｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔに播種した。培養下にある間に、その成分の中でも特に、ＣＴＳ（商標）添加剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＩＬ－２及び２％免疫細胞血清代替物を含有するＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）ベースの培地であるラピッドメディアに細胞を懸濁して、Ｔ細胞活性化及び形質導入を促進した。生存有核細胞（ＶＮＣ）をＴｒａｎｓＡＣＴ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で活性化し、両方のＣＡＲをコードするｃ２０１レンチウイルスベクターで形質導入した。レンチウイルス形質導入は、播種当日、培養培地中の細胞希釈液にＴｒａｎｓＡＣＴを加えた後に実施した。細胞は、ＧＭＰグレードのｃ２０１ウイルスで形質導入し、ｑＰＣＲ力価に基づき１の感染多重度（ＭＯＩ）で加えた。レンチウイルスベクターは、使用直前に室温で最長３０分間解凍した。
０日目のプロセスの開始から培養物の洗浄及び回収が始まるまで、ＣＡＲ－Ｔ細胞は播種から２０時間培養した。培養後、細胞懸濁液は、ｃｅｎｔｒｉｃｕｌｔチャンバ内で２回の培養物洗浄及び１回の回収物洗浄を受けた。
１日目におけるＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）での回収物洗浄後、細胞懸濁液を試料採取して、生細胞数及び生存率を決定した。次に細胞懸濁液を遠心機に移して手動でペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットをＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に再懸濁すると、最終的なＤＭＳＯ濃度が約１０％の製剤産物が得られた。次に細胞を個々のｃｒｙｏｂａｇに分配し、分析用試料分をｃｒｙｏｖｉａｌに分配した。
センチネルバイアルを解凍し、次に細胞をカウントし、２４ウェルプレートに最終１×１０６細胞／ｍＬで再び播いた。再び播いてから７２時間後、細胞を回収し、カウントし、各試料から５×１０５細胞のアリコートを取ってフローサイトメトリー分析にかけた。細胞を１００μｌ／ウェルのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（ＢＶ５１０）で１５分間染色し、次に２回洗浄した。次に抗体混合物（表５）を５０μｌ／ウェルで４℃にて２５分間加えた。細胞を再び２回洗浄し、次にＰＢＳ中１．６％ＰＦＡ、１００μｌ／ウェルで１５分間固定した。固定後、細胞を先述のとおり洗浄し、１５０μｌ／試料の最終容積でフローサイトメトリー緩衝液中に再懸濁した。ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）での各試料のＬｉｖｅ ＣＤ３陽性ゲートで５ｅ４細胞が取得され、データをＦｌｏｗＪｏ ｖ．１０ソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。この手順を、再び播いてから１４４時間後に繰り返した。
フルスケールのＡＲＭプロセスにより、形質導入後１４４時間で決定したとき、１２％のＣＡＲ総発現率；９％のデュアルＣＡＲ＋細胞及び３％のモノＣＡＲ２２＋細胞のＣＡＲ－Ｔ産物が生じた（図５Ｃ）。小規模活性化プロセス実験で見られたとおり、総ＣＡＲ％並びにモノＣＡＲに対するデュアルＣＡＲの比率は、時間とともに増加した。
実施例５：ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２を標的化するデュアル及びモノＣＡＲ－Ｔのインビボ活性
本実施例は、従来方法（ＴＭ）及び活性化プロセス（ＡＰ）に従い製造されたデュアル及びモノＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ活性を実証する。本実施例で使用されるデュアルＣＡＲ－Ｔは、活性化されたプロセスによって作製される、ＣＤ１９ ＣＡＲの上流にＣＤ２２ ＣＡＲを有するｃ２０１である。この研究で使用される関連するモノＣＡＲ－Ｔは、ＣＤ２２を認識する、且つＴＭによって作製されるＣＤ２２－６５ｓ及びＣＤ１９を認識する、且つＴＭ及びＡＰによって作製されるＣＡＲ１９（マウスｓｃＦｖ）である。デュアル及びモノＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性をＡＬＬ異種移植モデルにおいてインビボで評価した。
材料及び方法
実施例２に、この動物試験の概要を示す。この例では、ヒト急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株である野生型Ｎａｌｍ６（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９２）を使用した。
ＣＡＲ Ｔ細胞投与：腫瘍移植の７日後にマウスに投与した。従来の製造法によって作成したＣＤ２２－６５ｓ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、３、１及び０．３×１０６個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞で投与した。ＡＰで作成したＣＡＲ１９細胞は、１及び０．３×１０６個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞で投与した；ＴＭによって作成したＣＡＲ１９は、１、０．３及び０．１×１０６個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞で投与した。ＡＰで作成したｃ２０１デュアルＣＡＲ－Ｔ細胞は、０．３、０．１及び０．０３×１０６個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞で投与した。対照として、マウスは媒体（ＰＢＳ）又はＵＴＤのいずれかの投与を受けた。
結果
Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病異種移植モデルにおいて、デュアル及びモノＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を評価した；Ｎａｌｍ６細胞は、ＣＤ１９及びＣＤ２２の両方を発現する。０日目の腫瘍細胞移植後、腫瘍担持マウスを治療群に無作為化し、腫瘍移植後７日目にＣＡＲ Ｔ細胞を外側尾静脈から静脈内投与した。動物がエンドポイントに達するまで、腫瘍成長及び動物の健康をモニタした。
ＰＢＳ又はＵＴＤ Ｔ細胞の投与を受けたマウスは、腫瘍によって後肢の動きが低下する前に、第３週で安楽死させた。他の群は、第４～７週で安楽死させた。全治療群の平均生物発光を図６Ａにプロットする。いずれのＴ細胞の投与も受けなかったＰＢＳ治療群が、静脈内注射したＮＳＧマウスのベースラインＮａｌｍ６腫瘍成長動態を実証する。このモデルにおけるヒトドナーＴ細胞の非特異的応答を示すため、ＵＴＤ治療群をＴ細胞対照として供したが、これは検出されなかった。より良く比較するため、０．３×１０６用量群の異なるＣＡＲ－Ｔを図６Ｂに併せてグラフ化した。ＴＭ作成ＣＡＲ－Ｔは、両方とも、より低い活性を示し、ＣＡＲ１９（ＴＭ）については腫瘍成長にやや遅れがあった。対照的に、ＡＰ ＣＡＲ－Ｔは、両方とも、腫瘍量が著しく減少したとともに、ｃ２０１（ＡＰ）ＣＡＲ－Ｔは、５匹中４匹のマウスで腫瘍根絶（ＢＬＩベースラインレベル）に至っている。
これらの動物において、その血液の毎週のフローサイトメトリー分析によってＣＡＲ－Ｔの拡大及び残存の動態を測定した。まとめたデータを図６Ｃに示す。０．３×１０６用量のＣＡＲ－Ｔ群間で比較すると、ＡＰ処理したＣＡＲ－Ｔが、より良好な拡大を示した。ｃ２０１及びＣＡＲ１９（両方ともにＡＰ）の比較では、それぞれ０．３及び１×１０６用量について、ＣＡＲ－Ｔの同程度の拡大が示される。
本研究では、ＡＰで製造したときにもｃ２０１の効力が明白である。ｃ２０１ ＡＰは、インビボでの抗腫瘍活性及び細胞拡大の点で、ＣＡＲ１９（ＡＰ）並びにＣＡＲ１９及びＣＤ２２－６５ｓ（ＴＭ）よりも優れていた。
本開示を詳細に記載したが、本明細書に記載されるとおりの且つ添付の特許請求の範囲にある本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、修正形態、変形形態及び均等な態様が可能であることは明らかであろう。更に、本開示にある例は、全てが非限定的な例として提供されることが理解されなければならない。

Claims (33)

  1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子であって、前記ＣＡＲ分子は、
    （ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインとを含む第１のＣＡＲ；及び
    （ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む第２のＣＡＲ
    を含み、
    （ｉ）前記第１の膜貫通ドメイン及び前記第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第１の膜貫通ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、前記第２の膜貫通ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；
    （ｉｉ）前記第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び前記第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、前記第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記第１の一次シグナル伝達ドメイン及び前記第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、前記第２の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる、核酸分子。
  2. 前記第１のＣＡＲは、
    ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン及び第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；
    ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン；及び第１の一次シグナル伝達ドメイン；又は
    ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び第１の一次シグナル伝達ドメイン
    を含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記第２のＣＡＲは、
    ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；及び第２の共刺激シグナル伝達ドメイン；
    ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；及び第２の一次シグナル伝達ドメイン；又は
    ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び第２の一次シグナル伝達ドメイン
    を含む、請求項１又は２に記載の核酸分子。
  4. 核酸分子であって、
    （ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲであって、前記ＣＤ２２結合ドメインは、重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、前記ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、
    （ｉ）それぞれ配列番号２０、２１、２２、２８、２９及び３０；
    （ｉｉ）それぞれ配列番号２３、２４、２２、３１、３２及び３３；又は
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号２５、２６、２７、３４、３２及び３０
    のアミノ酸配列を含む、第１のＣＡＲ；及び
    （ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲであって、前記ＣＤ１９結合ドメインは、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、前記ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、
    （ｉ）それぞれ配列番号３５、３６、３９、４０、４１及び４２；
    （ｉｉ）それぞれ配列番号３５、３７、３９、４０、４１及び４２；又は
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号３５、３８、３９、４０、４１及び４２
    のアミノ酸配列を含む、第２のＣＡＲ
    をコードする核酸分子。
  5. （ｉ）前記第１のＣＡＲの前記ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；及び／又は
    （ｉｉ）前記第２のＣＡＲの前記ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 前記第１の膜貫通ドメイン及び前記第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 前記第１の膜貫通ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第２の膜貫通ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列と少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％異なる、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  8. 前記第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び前記第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  9. 前記第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列と少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％異なる、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. 前記第１の一次シグナル伝達ドメイン及び前記第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  11. 前記第１の一次シグナル伝達ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第２の一次シグナル伝達ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列と少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％異なる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  12. （ｉ）前記第１のＣＡＲは、配列番号１３若しくは１８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含み；及び／又は
    （ｉｉ）前記第２のＣＡＲは、配列番号１４若しくは１７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
  13. 前記ＣＡＲ分子は、配列番号１２若しくは１６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  14. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子を含む細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）であって、前記ＣＡＲ分子は、
    （ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲ；及び
    （ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲ
    を含み、
    （ｉ）前記第１の膜貫通ドメイン及び前記第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第１の膜貫通ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、前記第２の膜貫通ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；
    （ｉｉ）前記第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び前記第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、前記第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記第１の一次シグナル伝達ドメイン及び前記第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、前記第２の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）。
  15. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子をコードする核酸分子を含む細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）であって、前記ＣＡＲ分子は、
    （ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲであって、前記ＣＤ２２結合ドメインは、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、前記ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、
    （ｉ）それぞれ配列番号２０、２１、２２、２８、２９及び３０；
    （ｉｉ）それぞれ配列番号２３、２４、２２、３１、３２及び３３；又は
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号２５、２６、２７、３４、３２及び３０
    のアミノ酸配列を含む、第１のＣＡＲ；及び
    （ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲであって、前記ＣＤ１９結合ドメインは、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、前記ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、
    （ｉ）それぞれ配列番号３５、３６、３９、４０、４１及び４２；
    （ｉｉ）それぞれ配列番号３５、３７、３９、４０、４１及び４２；又は
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号３５、３８、３９、４０、４１及び４２
    のアミノ酸配列を含む、第２のＣＡＲ
    を含む、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）。
  16. （ｉ）前記第１のＣＡＲの前記ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；及び／又は
    （ｉｉ）前記第２のＣＡＲの前記ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４又は１５に記載の細胞。
  17. （ｉ）前記第１のＣＡＲは、配列番号１３若しくは１８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含み；及び／又は
    （ｉｉ）前記第２のＣＡＲは、配列番号１４若しくは１７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含み、
    （ｉ）前記第１のＣＡＲの前記ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；及び／又は
    （ｉｉ）前記第２のＣＡＲの前記ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の細胞。
  18. （ｉ）前記第１のＣＡＲは、配列番号１３若しくは１８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含み；及び／又は
    （ｉｉ）前記第２のＣＡＲは、配列番号１４若しくは１７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の細胞。
  19. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子を含む細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）であって、前記ＣＡＲ分子は、
    （ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメインと、第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインとを含む第１のＣＡＲ；及び
    （ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメインと、第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインとを含む第２のＣＡＲ
    を含み、
    （ｉ）前記第１の膜貫通ドメイン及び前記第２の膜貫通ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第１の膜貫通ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、前記第２の膜貫通ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；
    （ｉｉ）前記第１の共刺激シグナル伝達ドメイン及び前記第２の共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第１の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、前記第２の共刺激シグナル伝達ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なり；及び／又は
    （ｉｉｉ）前記第１の一次シグナル伝達ドメイン及び前記第２の一次シグナル伝達ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ核酸分子に含まれるヌクレオチド配列は、前記第２の一次シグナル伝達ドメインをコードし、且つ前記核酸分子に含まれるヌクレオチド配列と異なる、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）。
  20. ＣＡＲ分子を含む（例えば、免疫エフェクター細胞）を含む細胞であって、前記ＣＡＲ分子は、
    （ａ）ＣＤ２２に結合する第１の抗原結合ドメイン；第１の膜貫通ドメイン；第１の共刺激シグナル伝達ドメイン；及び／又は第１の一次シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲであって、前記ＣＤ２２結合ドメインは、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、前記ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、
    （ｉ）それぞれ配列番号２０、２１、２２、２８、２９及び３０；
    （ｉｉ）それぞれ配列番号２３、２４、２２、３１、３２及び３３；又は
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号２５、２６、２７、３４、３２及び３０
    のアミノ酸配列を含む、第１のＣＡＲ；及び
    （ｂ）ＣＤ１９に結合する第２の抗原結合ドメイン；第２の膜貫通ドメイン；第２の共刺激ドメイン；及び／又は第２の一次シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲであって、前記ＣＤ１９結合ドメインは、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、前記ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３は、
    （ｉ）それぞれ配列番号３５、３６、３９、４０、４１及び４２；
    （ｉｉ）それぞれ配列番号３５、３７、３９、４０、４１及び４２；又は
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号３５、３８、３９、４０、４１及び４２
    のアミノ酸配列を含む、第２のＣＡＲ
    を含む、細胞。
  21. （ｉ）前記第１のＣＡＲの前記ＣＤ２２結合ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；及び／又は
    （ｉｉ）前記第２のＣＡＲの前記ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも約８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９又は２０に記載の細胞。
  22. （ｉ）前記第１のＣＡＲは、配列番号１３若しくは１８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含み；及び／又は
    （ｉｉ）前記第２のＣＡＲは、配列番号１４若しくは１７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸を含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の細胞。
  23. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子をコードする核酸を含む医薬組成物であって、任意選択で、賦形剤、担体、希釈剤及び／又は安定剤を含む医薬組成物。
  24. 抗腫瘍免疫を提供する方法であって、それを必要としている対象に、有効量の、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子をコードする核酸を含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む方法。
  25. 抗原（例えば、ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２）に関連する疾患を有する対象を治療する方法であって、それを必要としている前記対象に、有効量の、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ分子をコードする核酸を含む、例えば発現する細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を投与することを含む方法。
  26. 前記細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋ Ｔ細胞）又はＮＫ細胞である、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. ＣＤ１９及び／又はＣＤ２２に関連する前記疾患は、増殖性疾患、例えば癌又は悪性腫瘍、前癌病態、例えば骨髄形成異常、骨髄異形成症候群若しくは前白血病又はＣＤ１９及び／若しくはＣＤ２２の発現に関連する非癌関連適応疾患から選択される、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記疾患は、癌、例えば血液癌である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記血液癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ芽球白血病（ＢＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常若しくは骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病又はこれらの組み合わせから選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記血液癌は、小児ＢＡＬＬである、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記血液癌は、成人ＢＡＬＬである、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記血液癌は、ＮＨＬである、請求項２８に記載の方法。
  33. 請求項１４～２２のいずれか一項に記載の細胞の集団を作製する方法であって、
    （ｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば凍結又は新鮮白血球アフェレーシス産物から単離されたＴ細胞）の集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を刺激する薬剤及び／又は前記細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤と接触させること（例えば、結合させること）；
    （ｉｉ）前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸分子と接触させ、それにより前記核酸分子を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を提供すること、及び
    （ｉｉｉ）保管（例えば、凍結保存培地中において前記細胞の集団を再製剤化すること）又は投与のため、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を回収すること
    を含み、
    （ａ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に実施されるか、又はステップ（ｉ）の開始後２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１８時間以内に実施され、及び
    ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）の開始後３０（例えば、２６）時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後２４時間以内に実施されるか、
    （ｂ）ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）と一緒に実施されるか、又はステップ（ｉ）の開始後２０時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８時間以内、例えばステップ（ｉ）の開始後１８時間以内に実施され、及び
    ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉｉ）の開始後３０時間以内、例えばステップ（ｉｉ）の開始後２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０時間以内に実施されるか、又は
    （ｃ）ステップ（ｉｉｉ）からの前記細胞の集団は、拡大されないか、又は例えば生細胞数によって評価されるとき、ステップ（ｉ）の開始時における前記細胞の集団と比較して５、１０、１５、２０、２５、３０、３５若しくは４０％以下、例えば１０％以下だけ拡大され、
    任意選択で、ステップ（ｉｉ）の前記核酸分子は、ウイルスベクター上にあり、任意選択で、ステップ（ｉｉ）の前記核酸分子は、ウイルスベクター上にあるＲＮＡ分子であり、任意選択で、ステップ（ｉｉ）は、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団に、前記ＣＡＲをコードする核酸分子を含むウイルスベクターを形質導入することを含む、方法。
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