KR20010032436A

KR20010032436A - 단클론성 사람의 자연항체

Info

Publication number: KR20010032436A
Application number: KR1020007005676A
Authority: KR
Inventors: 토비씨 로드만
Original assignee: 더인스티튜트포휴먼지네틱스앤드바이오케미스트리
Priority date: 1997-11-24
Filing date: 1998-11-24
Publication date: 2001-04-25
Also published as: AU1704099A; US20030144485A1; CN1492040A; EP1032421A4; CA2310888A1; US20030144486A1; CN1285754A; CA2310888C; EP1032421A1; CN1216641C; US7122638B2; US6610833B1; US7189826B2; JP2002508152A; IL136335A0; IL136335A; WO1999026656A1

Abstract

본 발명은 단클론성 사람의 자연 IgM 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 그의 사용방법에 관한 것이다. 항체는 순환하는 사람의 자연 항체와 단클론적으로 동일하다. 아울러, 본 발명은 약제학적인 제제 및 단클론성 사람의 자연항체를 사용하여 HIV-1에 감염된 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

단클론성 사람의 자연항체{Monoclonal Human Natural Antibodies}

1994년 7월 5일 출원된 미합중국 특허출원 제 08/271,210호는 사람의 프로타민(protamine) 상에서 발현되는 알지닌이 풍부한(arginine-rich) 항원결정기(epitope)와 면역반응하며, 순환하는 사람의 자연항체를 개시하고 있다. 1997년 2월 25일에 발행된 미합중국 특허 제5,606,026호는 알지닌이 풍부한 항원결정기가 HIV-1 Tat 단백질에 존재한다고 개시하고 있으며, 더욱이 HIV-1 Tat 단백질의 다른 항원결정기와 면역반응하는 제2의 순환하는 사람의 자연항체를 개시하고 있다. 아울러, 사람의 락토페린(lactoferrin)에 존재하는 은폐된 항원결정기(cryptic epitope)와 면역반응하는 제3의 순환하는 사람의 자연항체를 개시하고 있다.

상기 언급된 세가지 순환하는 사람 자연항체는 HIV 감염 후에 감소하여, 환자가 AIDS로 진행될 때 최저치에 달한다. 이러한 항체들은 탯줄 혈액에서 성인에 이르기까지 모든 연령층의 건강한 사람의 모든 혈청에서 발견되며, 도처에 존재함으로 인해서 자연항체로 인식된다.

따라서, 순환하는 사람 자연항체를 치료와 진단에 이용할 수 있는 단클론 대응체(counterparts)를 개발하는 필요성이 끊임없이 대두되었다.

발명의 요약

본 발명은 단클론 형태의 사람의 자연항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 한 측면에 의하면, 하이브리도마 세포주(hybridoma cell line) RWL-1(ATCC CRL 12431)을 제공하는데, 이는 엡스틴 바 바이러스 (Epstein Barr virus, EBV)로 형질전환된 탯줄혈액 세포(umbilical cord blood cell) 및, 쥐:사람의 이형골수종(heteromyeloma) 세포인 HMMA의 융합산물이다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, RWL-1 세포에 의해 생산된 단클론성 사람의 IgM 항체가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 다른 하이브리도마 세포주 RTW-4(ATCC CRL 12472)가 제공되며, 이는 EBV에 의해 형질전환 된 탯줄 세포 및, 쥐: 사람 이형골수종 세포인 SHM-D33세포(ATCC CRL 1668)의 융합 산물이다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, RWL-4 세포에 의해 생산된 단클론 사람의 IgM 항체가 제공된다.

아울러, 본 발명은 하이브리도마 세포주 RTW-12(ATCC CRL 12427)를 제공하며, 이는 EBV로 형질전환된 사람의 탯줄 세포 및, 쥐: 사람 이형골수종 세포인 HMMA의 융합 산물이다.

또한, 본 발명은 RWL-12 세포에 의하여 생산된 단클론성 사람의 IgM 항체를 제공한다.

아울러, 본 발명은 RTW-4 세포와 RTW-12 세포로부터 생산된 항체 및 그들의 혼합 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 단클론 항체를 HIV-1의 감염을 치료하기 위한 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 HIV-1에 감염된 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 기탁번호 ATCC CRL 12472, ATCC CRL 12477에서 생산된 항체 및 그들의 혼합 항체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 항체를 CD+4 T 세포를 증가시키기 위한 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 HIV-1에 감염된 환자에 있어서 CD4+ T 세포를 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 실시태양에 의하면, 기탁번호 ATCC CRL 12472와 ATCC CRL 12477의 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 항체 및 그들의 혼합 항체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 사람의 IgM 단클론 항체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 제제를 제공한다.

본 발명의 이러한 측면과 다른 측면은, 발명의 상세한 설명, 특허청구범위 및 도면에 비추어 보면, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

면역 체계의 작동성 분자(effector molecule)는 외부적인 항원의 유도에 기인하지 않는, 순환하는 면역글로불린의 레퍼토리(repertoire)를 포함하는데, "자가항체(autoantibodies)" 또는 "자연항체(natural antibodies)" 등 다양하게 언급된다. 전기 항체의 존재는 오래 전부터 인식되었으며, 여러 가지 제안된 기능은 "자가 공격(self-attack)" 또는 "자가 이익(self-benefit)"으로 분류될 수 있다. 전자는 자가면역의 공포를 일으키며, 일반적으로 "자가항체(autoantibodies)"라는 용어로 쓰이며, 후자는 "자연항체(natural antibodies)"로 지칭되며, 항상성의 유지(support of homeostasis)를 의미한다.

도 1(a 내지 c)는 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide) [CNBr]에 의해 절단된 락토페린(lactoferrin, LF) 또는 SP80의 SDS PAGE이다.

도 1a는 단백질의 염색 결과를 나타낸 것이며, 이때 1은 분자량 마커, 2는 LF(M), 3은 SP80-염기성 및 4는 SP80-산성의 염색 결과를 나타내며, 세가지의 모든 단백질(2,3,4)이 동일한 절단 분획을 보인다.

도 1b는 SP80(산성과 염기성)으로 면역화된 토끼의 혈청을 이용한 면역전이분석(immunotransfer) 결과이며, 다수의 반응부위 및, LF(M)와 SP80의 반응성의 상동성(homology of reactivity)을 나타낸다.

도 1c는 건강한 남자의 혈청을 이용한 면역전이분석 결과이며, 세가지 단백질 각각의 분획 7에서만 반응성을 나타낸다.

도 2(a 내지 c)는 트리신(Tricine) SDS PAGE의 결과를 나타낸다.

도 2a는 단백질의 염색 결과를 나타낸 것이며, 이때 1은 분자량 마커, 2는 LF(M) 및 3은 SP80(산성과 염기성)의 염색 결과이며, 분획 7은 뚜렷한 2개의 밴드(band)를 나타낸다.

도 2b는 건강한 남자의 혈청을 이용한 면역전이분석의 결과이며, 분획 7B에서 국지화된(localized) 반응성을 나타낸다.

도 2c는 사람의 B세포에서 유래된 하이브리도마로부터 수득한 단클론 항체 IgM의 분획 7과의 면역반응성을 나타낸다.

도 3(a 내지 b)은 사람 혈청에 대하여(도 3a); 및, LF 분획 7B와 반응하는 단클론 항체에 대한(도 3b) 사람의 정자 두부(human sperm head) 구성요소의 세포내(in situ) 면역반응성을 FITC로 표지된 IgM으로 나타낸 것이다.

도 4(A 내지 C)는 5명의 남자와 5명의 여자로부터 채취한 혈청(1:100의 희석비율) 및 단클론 항체의 하기 물질과의 반응성을 ELISA 방법에 의하여 측정된 결과를 나타낸 것이다. 이때, A는 위로 헤엄쳐 오르는 정자의 현탁액에서 첨단체 반응(acrosome reaction)의 유도 후에 분리되는 정자 외피 단백질의 전체 요소 10㎍/㎖와의 반응성을 나타낸다.

도 4에서, B는 LF(M)의 분리 정제된 분획 7B 10㎍/㎖와의 반응성을 나타낸다.

도 4에서, C는 변성되지 않은 LF(M) 10㎍/㎖과의 반응성을 나타낸다. a 및 b의 상대적 반응성은 혈청 항체와 단클론 항체가, 모두는 아니지만, 정자 외피 전체 요소 중 특정 요소와 반응함을 나타낸다. 변성되지 않은 LF(도 c)에대한 반응성의 결여는 혈청의 자연항체와 단클론 항체가 변성되지 않은 단백질 상태에서는 드러나지 않는 LF 부위와 반응함을 입증한다.

도 5는 HIV-1의 Tat 단백질을 나타내는 아미노산의 서열을 나타내며, 펩타이드 1 내지 7 및 9 내지 12는 아미노산 잔기가 5개씩 중복 된다. 펩타이드 8은, 사람 혈청의 최대 반응성이 Tat 단백질의 알지닌이 풍부한 영역에 기인한다는 것을 명확히 하기 위하여, 알지닌 분포의 형태가 다른 펩타이드를 제공하기 위해 포함하였다. 사실, 알지닌이 풍부한 영역(펩타이드 7 내지 9)의 최대 역가는 펩타이드 8에서 나타나며, 알지닌이 풍부한 영역(펩타이드 4 내지 5)의 최대 역가는 펩타이드 4에서 나타난다.

도 6(a 내지 b)은 70개의 사람의 혈청을 두 개의 큰 그룹인 HIV+와 HIV-(정상)로 나누어 실시한 HIV의 Tat 단백질과 항체와의 반응성을 분석 결과를 나타낸 것이며, 도 6a는 IgM의 반응성을 나타낸 것이며, 도 6b는 IgG의 반응성을 나타낸다. 이때, HIV+ 그룹은 1994년 이전에 수집된 혈청이며, 이들의 특성이 그 이후로부터 사용한 항HIV 약제에 기인하지 않는다. 각각의 역가 검정 판(assay plate)은 HIV+ 및 HIV- 모두와 정상 혈청(ST) 한가지를 포함하며, 각 혈청(X)의 기록된 역가는 X/ST로 나타내었다.

역가는 10의 간격으로 분류하였으며, 두 그룹의 혈청 빈도수를 각 간격에 표시하였다. IgM과 IgG의 HIV+ 혈청에 대한 역가 분포(특히 IgM에 대한 역가 분포)는 낮은 간격쪽으로 치우쳐 있다.

도 7(a 내지 b)은 두 개의 큰 그룹으로 나누어진 70개의 사람의 혈청인 HIV+ 및 HIV-(정상)와 반응하는 IgM(도 7a) 및 IgG(도 7b)의 역가 분포를 나타낸다. 이때, HIV+ 혈청에서 IgM의 역가가 낮거나 없는 것, 특히 IgG의 역가가 현저하게 낮은 것으로 나타나는 것이, Tat의 알지닌이 풍부한 서열과 반응하는 자연항체의 결핍이 HIV의 병리학적인 진행과 연관성을 가짐을 의미하는 것이다.

도 8(a 내지 b)는 두 개의 큰 그룹으로 나누어진 사람의 혈청인 HIV+ 및 HIV-(정상)를 대상으로 펩타이드 4와 반응하는 IgM 및 IgG의 역가 분포를 나타낸 그래프이다. 이때 HIV+ 혈청에서, Tat과 반응하는 항체 전체가 일반적으로 낮은 역가의 경향을 보이는 것과는 일치하나, 펩타이드 8과 반응하는 항체의 역가 보다는 경향이 덜하다(도 11).

도 9(a 내지 b)에서, 도 9a는 CD4+T 세포수의 산정 결과이며, 도 9b는 AIDS 진단을 받고 사망하기 전의 HIV+ 남자로부터 5년 동안 채취한 일련의 표본에서 수득한, Tat 단백질의 펩타이드 4 및 펩타이드 8(도 5)에 대한 IgM 반응성의 역가를 나타내며, CD4+T 세포수 산정을 위한 표본은 혈청분석을 위한 표본과 동시에 수득하였다. CD4+T 세포수의 감소와 자연항체의 역가 감소와의 연관성은 펩타이드 8과 반응하는 항체의 역가와 관련지을 때 주목할만하며, 자연항체의 감소가 T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 가능하게 하며, Tat에 의해 세포사멸이 진행된다는 주장을 뒷받침한다.

도 10(a 내지 b)에서, 도 10a는 CD4+T 세포수의 산정 결과이며, 도 b는 일련의 혈청 표본에서 수득한, Tat 단백질의 펩타이드 4 및 펩타이드 8(도 5)과 반응하는 IgM 항체의 역가를 나타낸 그래프이다. HIV+ 혈청은 감염기간이 11년 이상 되는 것으로 예상되며, HIV와 관련된 병변이 없고 항HIV 약제도 투약한 적이 없는 남자로부터 9년 이상에 걸쳐서 수집되었다. 혈청 분석을 위한 각 표본은 CD4+T 세포수 산정을 위한 표본과 동시에 수득하였다. 자연항체의 역가와 역가가 유지되는 양상은 정상적인 범위내에서 CD4+T 세포수를 유지하려는 양상과 관련이 있다.

도 11(a 내지 b)에서, 도 11a는 CD4+T 세포수를 산정한 결과를 나타내며, 도 b는 HIV+ 남자의 일련의 혈청 표본에서 수득한, Tat 단백질의 펩타이드 4 및 펩타이드 8(도 5)과 반응하는 IgM 항체의 역가를 나타낸 그래프이다. CD4+T 세포수의 감소가 나타난 표본4 이후부터 항HIV 치료를 시작하였으며, 치료를 시작한지 6개월 후에 채취한 표본의 세포수는 현저히 증가되었으며, 펩타이드 8과 반응하는 IgM의 역가도 대단히 증가하였다. 계속 채취된 표본들은 세포수 및 자연항체의 역가가 유지되는 양상을 보였으며 일반적으로 좋은 임상 결과를 수반하였다.

본 발명에 인용된 모든 특허, 특허출원 및 참고문헌은 원본 그대로 참조문헌에 삽입하였다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명은 사람의 락토페린에서 발현되는 은폐된 항원결정기와 면역반응하는, 사람의 단클론 형태의 자연 IgM 항체를 제공한다. 이 항체는 하이브리도마 RWL-1에 의해 생산되며, 이 하이브리도마를 1997년 11월 14일 미합중국 종균협회(American Type Culture Collection)에 ATCC CRL-12431로 기탁하였다. 하이브리도마는 하기 실시예 1에 개시된 바와 같이 엡스틴 바 바이러스로 형질전환된 탯줄 세포와, 쥐:사람의 이형골수종 세포와의 융합에 의하여 제조되었다. 하이브리도마는 IgM 동위체(isotope)인, 사람의 단클론 항체를 생산한다. 항체 생산 세포(사람의 탯줄 세포)는 신생아에서 수득되며, 항체가 IgM 동위체(따라서, 태반을 통과하지 않는다)인 것은 이 항체가 실제로 자연항체임을 증명한다.

락토페린과 면역반응하는 IgM 항체는, 다수의 정상인의 혈청에 존재한다고 알려졌으며, 병원성이 없거나 발병과 관련이 없다는 것이 명백하므로, 자연항체의 특성을 갖는 것으로 규명되었다. 이 자연항체의 반응 부위는 이전에(3) 개시된 바와 같이, 사람의 정자 두부의 세포막 복합체(plasma membrane complex)에 존재한다. 반응 부위를 분자적으로 규명하기 위한 이 연구에서 정액장(seminal plasma)에 존재하는 약 72.6kD의 단백질(2)을 확인하였으며, 본 발명에서는 정확하게 80kD으로 결정된 이 단백질이 정자 두부의 단백질 외피에도 존재하며, 실제로 80kD의 단백질은 락토페린과 일치하는 것으로 확인되었다. 주목받는 자연항체가, 모든 체액에 광범위하게 존재하는 LF와 반응하는 것이 아니라, LF 중 하나의 입체배열형태(configuration)와 특이하게 반응하는 것이 본 발명에 개시되어있다. 이러한 입체배열형태와 자연항체의 반응성이 시험관에서(in vitro) 밝혀졌으며(도 2 및 4), 이어 순환하는 LF의 변성되지 않은 단백질을 변성시켰을 때 생체내에서(in vivo), 사람의 정자 두부의 단백질 외피에 삽입된 LF에서도 반응성이 나타났다. LF는 정액장에서 변성되지 않은 입체배열형태로 존재하며, 아직 그 기전은 밝혀지지 않았으나 항체가 인식하는 형태는 정자의 세포막/외피 복합체에 침착되었을 경우로 예상된다. 그러한 형태로 전환되어 정자 표면 외피에 침착되는 것은 아마도 고환의 수정세관(seminiferous tubule)에서 정자가 성숙되는 과정 중에 일어날 것이다. 따라서, 면역 글로불린, 특히 IgM과 같이 큰 분자는 수정세관의 내강(lumina)에 들어가지 못하므로(24), 정자 형성기(sperminogenesis) 과정에서 정자의 구성요소와 면역반응이 일어나지 않는다는 점에 주목하는 것이 적절하다. 그러나 그러한 관문(barrier)은 여성의 생식관에는 존재하지 않으므로, 그곳에는 모든 종류의 순환하는 항체가 존재한다(23). 그러므로, 여성의 생식관으로 사정된 후에야, 정자 외피의 LF와 면역반응할 수 있는 자연항체가 존재한다. 이러한 상호작용은 도시된 바와 같이(도 3), 정자 외피에서 일어날 수도 있고, 정자가 수정능력을 획득하여 난모세포(oocyte)를 둘러싸고 있는 투명대(zona pellucida)를 통과하게 하는 아크로좀반응(acrosome reaction)이 진행되어 난모세포내로 들어 갈 수 있게 됨에 따라(9,10), 다른 외피와 세포막을 구성하는 요소(도 4)와 더불어 분리된 LF가 자연항체와 상호작용을 할 수 있는 능력을 확실히 획득하게 된다. 아크로좀반응은 첨단체의 막(acrosome membrane)과 원형질막(plasma membrane)의 융합을 의미하므로 위에 덧씌워진 단백질 외피의 구성 요소가 흩어지게 된다. 그러므로 자연항체가 없다면 분리된 LF는 난세포질(ooplasm)로 들어갈 준비가 된 상태이나, 이러한 능력을 자연항체가 면역학적으로 무효화 시킬 수 있다. 수정 환경에서는, LF가 난모세포막을 통하여 세포내로 이입되어(endocytose) 생식자나 전핵(pronuclei)의 DNA와 상호작용을 할 수 있다.

LF를 특징짓는 다양한 기능과 상호작용 중에서, 세포내로 이입되어 DNA와 상호 작용할 수 있는 능력이 큰 관심사로 대두되었다(7 ,8, 27 내지 29). 특히 LF와 DNA의 상호작용이 서열 특이성에 의하여 결정된다는 최근의 보고는 흥미롭다. 그러한 특이성의 분자적인 기초는 밝혀지지 않았으나, LF/DNA의 상호작용이 생체내에서 일어난다면 결정된 조절 체계내에서 일어날 것이라고 추측하는 것이 합리적이다. 아울러, 전기 체계가 체세포의 체계화된 염색체의 총체에 존재하지만, 신생의 미분화된 전핵(pronuclei)의 총체에는 존재하지 않는다는 제안은 논리적이다. 따라서, 그러한 정황에서, 서열 특이성이 LF와 DNA의 상호작용을 조절한다는 가설은 효력이 없다. 정자 외피에 있는 특정한 입체배열형태의 LF와 선택적으로 반응하고, 광범위하게 순환하는 LF와는 반응하지 않는 자연항체의 존재는 우연한 자연 선택의 기전을 나타내며 다음의 두 사실에 기초한다: (1) LF와 수정된 난모세포 DNA 총체와의 상호작용 저해 및 (2) 기타 장소에 있는 LF(더욱 널리 분포되며 중요한 기능을 하는 형태)와 순환하는 항체와의 면역반응 제한. 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마가 사람의 탯줄 혈액 B 세포에서 유래되었으므로, 이러한 자연항체가 선천적으로 존재한다는 것이 증명된다. 이 하이브리도마는 본 연구에서 중요한 자료를 제공하기 위해 사용되었다.

하기 실시예 2에서 보여지듯이, 항체는 사람의 락토페린(특히 사람 정자 두부의 단백질 외피에 존재하는 형태) 상에서 발현하는 항원결정기와 면역반응 한다. 락토페린은 정자 두부에 존재하는 80kD의 당단백질이다. 수정이 되는 동안 일어나는 아크로좀반응의 유도 후에, 락토페린(DNA와 상호작용 하여 결합하는 것이 밝혀진)은 정자와 난모세포 DNA와의 상호작용을 상당히 방해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체를 이용하는 방법 중 한가지는, 수정되기 전, 락토페린이 정자 DNA와 상호작용하는 것을 방지하기 위하여, 시험관내에서 수정 반응이 일어날 때 첨가제로 이용하는 것이다.

본 발명의 바람직한 실시태양의 다른 방법에서는, HIV-1의 Tat 단백질과 면역반응하는 단클론 IgM 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 제공된다. 하이브리도마 세포주 RWT-4와 RWT-12는 도 5의 펩타이드 4 및 펩타이드 8과 각각 면역반응한다. 이러한 하이브리도마 세포는, 하이브리도마 RWL-1의 경우와 같이, 엡스틴 바 바이러스로 형질전환된 사람 탯줄 세포와 쥐:사람의 이형골수종 세포를 융합시켜 제조하였다. RWT-4 세포는 1998년 2월 12일에 ATCC에 ATCC CRL 12472로 기탁되었으며, RWT-12 세포는 ATCC CRL 12477로 기탁되었다. 각 항체의 항원결정기 특이성은 하기 실시예 3에 기재하였다.

하이브리도마 RWL-1(ATCC CRL 12341), RWL-4(ATCC CRL 12472)와 RWT-12(ATCC CRL 12477)로부터 생산되는 단클론 IgM 항체는 이를 생산하는 세포 배양액으로부터 분리하여 암모니움 설페이트(ammonium sulfate) 침전법, HPLC, 컬럼 크로마토그래피와 같은, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 기술을 이용하여 정제할 수 있다.

본 발명의 항체들은, Science, 228:1211, 1985(RWL-1 세포에 대하여)에서 규명되고, 1997년 2월 20일에 발행된 미합중국 특허 제 5,606,026호(RTW-4와 RTW-12 세포에 대하여)에 개시된, 순환하는 IgM 항체의 단클론적으로 동등하다. 이러한 순환하는 항체는 HIV에 감염된 사람에게는 결핍되어 있고 AIDS가 발병됨에 따라 감소한다. 따라서, ATCC CRL 12341, ATCC CRL 12477 그리고 ATCC CRL 12472로부터 생산된 단클론 항체는 AIDS 발병을 예상하는 분석시험에서 양성대조군으로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 실시태양은, HIV-1에 감염된 환자를 치료하는 방법으로 RTW-4 세포, RTW-12 세포에 의하여 생산된 항체 및 그들의 혼합 항체로 구성된 그룹에서 선택되는 자연의 사람 IgM 항체를 HIV-1의 감염을 치료하기 위한 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. HIV-1에 감염된 환자나 AIDS 환자는 자연항체가 결핍되므로 이를 보충시키는 것이 이들에게 임상적으로 유용할 수 있다.

하기 실시예 5에 개시된 바와 같이, HIV-1의 Tat 단백질은 사람에서 항체의 유도를 촉진시키지 않는다(실시예 5의 표 1). 이러한 결과는 하기와 연관된다: 장기간 생존자(long term suvivors, LTS)/장기간 비진행자(long term non-progressors, LTNP), HIV-1에 양성이지만 이 질병의 어떤 징후도 보이지 않거나 AIDS로 진행이 되지 않는 환자는, 본 발명의 하이브리도마가 생산하는 IgM 항체와 동일한 순환하는 자연항체의 정상적인 수준을 유지한다. 이러한 사실로부터 질병을 치료하기 위한 치료방법으로 본 발명의 단클론 항체를 투여하는 것의 유용성을 확인할 수 있다. HIV-1의 Tat 단백질이 감염을 일으키고 유지시키는데 중요한 역할을 하고, 이 단백질이 인체 내에서 면역원성이 아닌 것으로 밝혀졌는 바, 감염된 사람에게 본 발명의 단클론 항체를 투여하는 것이 Tat 단백질에 특이하게 작용하는 항체를 도입하는 한 방법이다.

도 9 내지 11에서, HIV+ 사람에서 CD4+T 세포수와 HIV의 Tat 단백질(특히 펩타이드 4와 펩타이드 8이 나타내는 단백질 서열, 도 10)과 반응하는 두가지 IgM 자연항체의 혈청 역가가 상동성을 가짐을 확인할 수 있다. Tat의 알지닌이 풍부한 서열로 대표되는 펩타이드 8과 반응하는 항체에서 상동성을 확실히 확인할 수 있다.

도 9 내지 11은 각각 전기 상동성의 고유한 실시예를 나타낸다. 도 9는 CD4+T 세포수와 HIV+ 남자가 AIDS의 진단을 받고 사망하기 전 5년 동안 수집한 일련의 해당 혈청 표본에 대하여 항체의 역가를 분석한 자료의 임상 결과를 나타낸다. 도 10은 혈청은 감염기간이 11년 이상 되는 것으로 추정되지만 HIV와 관련된 병변이 없고 항HIV 약제도 투약한 적이 없는 HIV+ 남자로부터 채취한 표본의 해당 자료를 나타낸다. 도 11은 HIV+ 남자로부터 채취한 표본의 자료인데, 항HIV 약제의 투약 후 CD4+T 세포수와 Tat와 반응하는 항체, 특히 펩타이드 8과 반응하는 항체의 역가가 모두 정상적인 수준으로 상승했음을 보여준다. 현재 상업적으로 입수할 수 있는(즉, Sandoz Pharmaceuticals 또는 Cutter Biological로부터) 다양한 정맥주사용 IgG(IVIG)제가 시험을 거쳐 비경구적으로 투여하도록 인증을 받았으므로, IVIG 제를 본 발명의 단클론 IgM 항체를 투여하기 위한 매개체로 이용할 수 있다. 이러한 IVIG제를 사람에게 비경구적으로 투여하는 것이 안전하다고 알려져 있다.

일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 건강 상태, 체중, 동시에 치료받는 질환의 종류, 치료의 빈도 등에 따라 달라진다. 유효량은 일반적으로 체중 1kg 당 약 0.001 내지 약 10mg이다. 정확한 투여량, 투여 빈도수, 치료 기간은, 각 환자에 대하여 CD4+T 세포수 증가의 측정 및 다른 병인(pathogenetic)의 진행이 경감되는 징후 등에 의하여 모니터되어야 한다.

또 다른 실시태양에서는, 환자의 CD4+T 세포수를 증가 시키는 방법을 제공한다. 하이브리도마 ATCC CRL 12472, ATCC CRL 12477에서 생산되는 항체 및 그들의 혼합 항체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체를 CD4+T 세포를 증가시키 위한 유효량을 환자에게 투여하는 것이다. 이때 유효량은 상술한 바와 동일하다.

비경구적 투여시, 본 발명의 항체는 약제학적으로 허용가능한 비경구용 부형제와 함께 용액, 현탁액, 에멀젼, 동결 건조된 분말 등의 투여 형태 또는 약학적제제로 제제화될 수 있다. 전기 부형제의 예는 물, 생리식염수, 링거액(Ringer's solution), 덱스트로스, 5% 사람의 혈청 알부민이다. 아울러, 상술한 바와 같이 상업적으로 입수할 수 있는 IVIG제를 본 발명의 항체를 전달하기 위한 부형제로 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 제제에 본 발명의 항체가 유효량만큼 포함될 필요는 없는데, 전기 유효량의 투여는 전기 제제를 수회 투여함으로써 수행될 수 있기 때문이다.

하기에 본 발명의 실시예가 기재되어 있으며, 이는 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.

실시예 1

사람 락토페린의 은폐된 서열부분과 반응한다고 공지된 단클론 사람 IgM 항체를 분비하는 하이브리도마 RWL-1은, 하기 설명한대로, 사람의 탯줄 혈액 B 세포를 세포주 HMMA, 사람/쥐의 이형골수종와 융합시켜 제조되었다(참조: Posner MR, Ellorim H, Santos D., Hybridoma, 6:611, 1987).

탯줄 혈액은, 제왕절개 시 건강한 신생아(신원이 확인되지 않은)로부터 수득하였고, 단핵 세포는 피콜-파크(Ficoll-Paque, Pharmacia)를 이용한 밀도구배형 원심분리법(density gradient centrifugation)에 의해 분리하였다. 수득한 세포는 RPMI-1640 배지(Sigma)로 세척하고, RPMI-1640 배지에 엡스틴-바 바이러스 배양세포액을 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세포는 원심분리로 침전한 후, 송아지 태아 혈청(FCS), 싸이클로스포린 A, 페니실린/스트렙토마이신(㎖당 10 효소단위의 스트렙토마이신/100㎎ 스트렙토마이신)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 재현탁한 다음 96웰 플레이트에 웰당 30세포가 되도록 분주하였다. 정기적으로 배지를 보충하며 37℃에서 5주 동안 배양한 후, 각 웰의 배양액을, 변성된 락토페린의 7B 분획(도 2C)과 특이적으로 반응하는 IgM 단클론 항체를 ELISA법(참조: Pruslin F.H., Winston R., Rodeman T.C., J. Immunol. Meth., 137:27, 1991)으로 측정하였다.

엡스틴바 바이러스에 의하여 불멸화된 B 세포 배양액을 선발하여 세포 농도가 웰당 106세포가 될때까지 증식시켜, RPMI-1640(미보충배지)로 5회 세척하였다. 세포융합의 상대(HMMA 세포, Posner, M.R., et al., Hybridoma 6:, 611, 1987에 기술되어 있다)는 RPMI-1640, FCS, 페니실린/스트렙토마이신, 아즈아구아닌(azaguanine)에서 증식시킨 후, 미보충 RPMI-1640 배지로 세척하였다. 10⁶개의 세포를 동일한 수의 엡스틴 바 바이러스로 불멸화된 세포와 혼합하였다. 혼합 세포 배양액을 원심분리하여 침전하고, 상등액을 제거하고 세포는 따뜻한(37℃) 40% 폴리에틸렌 글리콜/RPMI-1640(pH 7.2)에 재현탁하여 1분 동안 유지하였다. 세포는 원심분리하여 침전하고, pH 7.8의 RPMI로 2회 세척한 후, 20% FCS, HAT(Sigma), 아우아바인(ouabain), 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 HY 배지(Sigma)에서 ㎖당 10⁶세포가 되도록 재현탁하여 웰당 10⁵세포가 되도록 분주하였다. 3주 후, 증식이 양성인 세포를 대상으로 특정한 항체를 방해하는지 측정하였다. 항체가 양성인 웰의 내용물을 희석하여 20% FCS, SPIT(Sigma), 페니실린/스프렙토마이신이 보충된 HY/HT(Sigma)배지에서 웰당 0.5 세포가 되도록 분주하였다. 세포는 5주 동안 (37℃) 증식시켜 각 웰의 내용물을 대상으로 단클론 항체의 특이성에 대하여 재측정하였다. 선발된 배양세포액을 배양하여 ㎖당 10⁶세포의 밀도가 되도록 증식시키고, 400RPM에서 5분간 원심분리로 침전하였다. 각 세포의 펠렛은 5㎖의 80% FCS, 10% DMSO 및 10% RPMI-1640에 현탁하여 2㎖씩 분주하여 -70℃에 냉동 보관하였다. 보관된 분주액은 해동시켜 생존율 및 항체 특이성에 대하여 재검정 하였다.

하이브리도마는 1997년 11월 14일에 미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, Rockville,MD)에 ATCC CRL 12431로 기탁하였다.

실시예 2

하기에 기재된 실시예에서 하기의 같은 재료 및 방법을 사용하였다.

LF 단백질

상업적으로 입수한 모유의 락토페린(L3770, Sigma)은 LF(M)으로 표시하였다. 정액장의 LF는 임상적으로 정상인 지원자로부터 채취한 표본들을 합한 정액으로부터 분리하였다. 이를 액화시킨 후, 정자가 없는 혈장은 원심분리에 의하여 수득하였고, DEAE 이온 교환 크로마토그래피(11)에 의하여 염기성 분획 그룹 및 산성 분획 그룹 으로 분리하였다. 각 그룹은 겔 여과(Sephacryl S 300 HR, Pharmacia)를 수행하였고, 각 그룹의 첫 번째 분획은 80kD에서 분리되었고 염기성 SP80과 산성 SP80으로 각각 표시하였다.

시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide, CNBr) 절단 및 SDS PAGE

염기성 SP80, 산성 SP80 및 LF(M)에 대한 시아노겐 브로마이드의 처리는 공지된 방법으로(12) 수행하였다.간단하게, 각 단백질의 70% 포름산 용액 10㎎/㎖을 시아노겐 브로마이드(200배의 몰농도 과량) 처리하여 상온에서 18 내지 24시간 동안 방치하였다. 이어 동결건조시킨 후, 절단된 혼합물을 SDS 폴리아크릴 아마이드 겔에서 전기영동하였다(도 1). 저분자량 분획(도 2)의 분해능을 향상시키기 위하여, 전기영동은 16.5% 트리신 겔(tricine gel, 13)에서 수행하였다.

분획 7B의 특성 규명

분획 7B를 겔에서 자른 후, H20-SDS로 추출하고 KCl을 첨가하여 침전시켜, 7B의 구성 펩타이드들을 PBS(pH 7.2)에서 투석하여 정제하였다. 처리하지 않은 정자가 없는 정액장 단백질과 변성되지 않은 LF 단백질은 PBS 용액에 용해시켰다. 두개의 펩타이드로 구성된 LF 분획 7B의 결정은 록펠러 대학교(Rockfeller University)의 질량분광광도계 실험실에서 수행되었는데, 매트릭스-어시스티드 레이저 탈착/이온화 질량 분광광도계(14)를 이용하였다. LF 분획 7B의 펩타이드 N-말단 서열 결정은 록펠러 대학교의 단백질 서열 분석부에 의해 수행되었는데, 수회 에드만 분해(Edman degradation)를 수행하고, 마이크로보 HPLC를 이용하여 PTH 분석(15)을 하였다.

면역반응성

웨스턴 블랏은 이모빌론(Immobilon-P, Millipore)에서 수행되었고 LF(M), 산성 SP80, 염기성 SP80의 일렉트로페로그램(electropherogram)을 이동시키고 화학형광법에 의하여 가시화 되었다. ELISA는 표준화된 방법에 의해 수행되었다(16 내지 18). 사람 LF(M)로 면역화된 토끼의 혈청, SP80(산성, 염기성 합동으로)으로 면역화된 토끼의 혈청과, 임상 실험실에서 폐기한 혈청 중 성별, 연령을 확인하고 "임상적으로 지적 사항 없음(no clinical findings)"을 확인한 후, 무작위로 선택하여 사람 혈청으로 사용하였다. 모든 사람 혈청과의 반응성은 오직 PAGE(도 1)의 분획 7에만 나타났으며, 뚜렷한 밴드이며 7B라 지칭하였다.

분획 7B에 특이적인 단클론 항체

단핵 세포를 건강한 신생아의 탯줄 혈액으로부터 피콜-파크(Ficoll-Pague, Pharmacia)을 사용한 밀도 구배형 원심분리법에 의하여 분리하여 엡스틴 바 바이러스로 형질전환 시켰다(19). 모세포주(parental cell line) HMMA와의 세포융합은 표준 방법으로 수행하여(20), 결과적으로 한 세트의 IgM을 분비하는 하이브리도마를 수득하였으며 단클론성은 제한된 희석의 방법으로 결정하였다. 변성된 모유 LF(M)와 SP80에 대한 혈청의 반응성은 PAGE의 한 분획에 한정되므로(도 2), 그 분획을 겔로부터 분리하여, 사람 항체에 의한 특이적 반응성이 규명된(16, 18) 다른 단백질 및 펩타이드와 함께, 분획 7과 절대적인 반응성을 보이는 단클론 항체를 선발하기 위한 ELISA법의 항원으로 사용하였다.

정자 두부에서 LF/SP80의 세포학적 위치결정

헤엄쳐 오르는 사람 정자의 분획은 자연적으로 액화된 정액장으로부터 수득하고, PBS로 3회 세척하고, 최종적으로 PBS에 1:500으로 희석된 사람 혈청이나 정제된 단클론 항체 용액(PBS내에 존재)에 현탁하여, 40℃에서 밤새도록 배양하였다. 각 현탁액은 PBS로 3회 세척하였고 수집된 정자는 FITC 표지된 항-사람의 IgM(Sigma)과 1시간 반응시켰다. 정자는 PBS로 세척하여, 현탁액 한방울을 슬라이드 위에 떨어뜨리고, FITC-특이적 필터를 사용하여, 관찰하고 사진촬영을 하였다(도 3).

정자 외피 단백질 분획

정자 외피의 구성 요소를 포함하는 분획은 정자 현탁액에서 아크로좀 반응을 유도하여(21) 수득하였다: 헤엄쳐 오르는 정자를 PBS로 조심스럽게 세척하여, 수득하고 Ca배지(2mM CaCl₂, 10mM 이온운반물질 A23187(Calbiochem), 1mM PMSF (Sigma))에 현탁하여 4시간 동안 상온에서 배양하였다. 정자 세포는 저속원심분리법에 의하여 침전시키고, 상등액은 다시 고속원심분리법으로 부유물을 제거한 후, 40oC에서 밤새도록 투석하였다. 상등액은 사람 혈청, LF 분획 7B 와 반응하는 단클론 항체와의 반응성에 대해서 ELISA법으로 검정하였다(도 4).

결과

본 실시예의 자료는 사람 정액장의 80kD 단백질이 LF와 일치한다(homologous)는 기존의 연구를 확인한다(1, 2). 정자를 제거한 정액장을 DEAE 이온 교환 크로마토그래피로 분획화한 결과(결과는 없음) 80kD 단백질이 산성과 염기성 두가지 형태로 존재하며 글라이칸 부위가 포함된 것을 확인하였다(22).시아노겐 브로마이드로 절단된 분획은, SDS 겔에서, 두 가지 형태의 SP80과 일치할 뿐만 아니라, 모유에서 유도된 LF와도 일치한다(도 1A, 2A). SP80(도 1)이나 모유에서 수득한 LF(결과는 없음)로 면역화된 토끼의 혈청에 대한 분획들의 면역반응성의 양상은 상호 일치한다. 정상적인 사람의 혈청은 모유의 변성되지 않은 LF 또는 정액장에서 분리한 SP80에 대하여 면역반응성을 보이지 않는다는 이전의 보고(4)를 확인시켜준다(도 4). 정상적인 사람 혈청에서 발견되는 자연항체(3,4)가 LF와 SP80의 은폐된 서열 부분(변성에 의하여 노출됨)과 반응한다는 사실을 확인한 것(도 1, 2)은 특히 주목할만하다. 그 서열 부분은 LF와 SP80의 시아노겐 브로마이드의 절단 산물을 PAGE하면 분획 7B로 격리된다(도 2). 분획 7B의 구성 성분과 특이적으로 반응하는 IgM/K를 분비하는 하이브리도마를 탯줄 혈액 세포로부터 유도할 수 있다(도 2, 4)는 사실이 자연항체의 선천적인 존재를 확실히 해준다. 질량분광광도계는 분획 7B가 10kD과 9kD의 두 펩타이드를 포함한다는 것을 나타낸다. N-말단 서열 결정으로 로딩된 주된 펩타이드의 서열이 DKVER이고 9kD 펩타이드의 서열이 SLDGG임을 밝혀냈다. LF에 대한 시아노겐 브로마이드의 절단이 메티오닌 잔기에서 일어난다는 가정과 공지된 LF 구조(12)를 참조하여 볼 때, 두 펩타이드 각각의 서열 부분은 C 로브(lobe)로부터 유래하며 C 로브에 위치한다. 펩타이드 2개의 직선 서열을 유도할 수 있는 12잔기 펩타이드의 한 세트(a set, 잔기가 5개씩 겹쳐짐)을 제조하였다(Table I). 현재까지, 전기 펩타이드를 한 개씩 검정했을 때, 어느 것과도 사람 혈청 IgM이 특이 반응성을 나타내지 않았으며, 이러한 사실은 자연항체의 기본적인 항원결정기(LF 분획 7B에 포함되어 있기는 하지만)는 입체구조에 의존한다는 것을 의미한다.

전기 항원결정기가 생체내에서(in situ) 정자 두부에 위치한다는 것은 사람 혈청의 세포-면역반응성과 LF(M)/SP80 분획 7B와 특이적으로 반응하는 단클론 항체에 의해 증명되었다(도 3). LF가 자연항체 항원결정기가 노출되는 전기 입체배열형태로, 정자 외피 단백질에 존재한다는 또 다른 증거는 도 4에 개시되어 있다. 아크로좀 반응(21)이 유도되면, 정자 두부의 첨단체 부위를 덮고 있는 단백질 외피/원형질막 조합이 흩어지게 되고, 외피의 구성 성분과 사람 혈청 IgM 및 단클론 항체가 반응함이 나타나 있다(도 4). 그러므로, 도 3 및 4는 생체내에서, 정자의 수정능력획득이후, 아크로좀 반응이 일어나면, 정자가 침투된 난모세포로 이입되는데, 정자 외피 단백질에서 떨어져 나온 LF가 사용될 수도 있다. 그러나, 여성의 생식관에는 혈장의 완전한 면역글로불린 레퍼토리가 존재하므로(23), 자연항체에 의하여 수정능력획득이 저해 될 수 있다.

LF 분획 7B의 구성요소를 포함하는 겹쳐진 12개로 이루어진 펩타이드: 이때, 서열번호 1 내지 14는 10kD이며, 서열번호 15 내지 24는 9kD이다.

서열번호	아미노산 서열	서열번호	아미노산 서열
SEQ ID 1	DKVERLKQVLLH	SEQ ID 13	KCSTSPLLEACE
SEQ ID 2	KQVLLHQQAKFG	SEQ ID 14	SPLLEACEFLRK
SEQ ID 3	QQAKFGRNGSDC	SEQ ID 15	SLDGGYVYTACK
SEQ ID 4	RNGSDCPDKFCL	SEQ ID 16	VYTACKCGLVPV
SEQ ID 5	PDKFCLFQSETK	SEQ ID 17	CGLVPVLAENYK
SEQ ID 6	FQSETKNLLFND	SEQ ID 18	LAENYKSQQSSD
SEQ ID 7	NLLFNDNTECLA	SEQ ID 19	SQQSSDPDPNCV
SEQ ID 8	NTECLARLHGKT	SEQ ID 20	PDPNCVDRPVEG
SEQ ID 9	RLHGKTTYEKYL	SEQ ID 21	DRPVEGYLAVAV
SEQ ID 10	TYEKYLGPQYVA	SEQ ID 22	YLAVAVVRRSDT
SEQ ID 11	GPQYVAGITNLK	SEQ ID 23	VRRSDTSLTWNS
SEQ ID 12	GITNLKKCSTSP	SEQ ID 24	SLTWNSVKGKKS

결과에서 보듯이, 펩타이드에 대한 사람의 혈청 IgM 또는 단클론 항체의 반응성은 나타나지 않았으므로, 이로써 항원결정기가 입체구조적이라는 것을 확인할 수 있었다.

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실시예 3: RWT-4 및 RWT-12 하이브리도마 세포주의 생산

각각의 하이브리도마는 사람의 탯줄혈액 B 세포 및 골수종을 융합시킴으로써 수득되었다.

RWT-4의 융합 상대는 마우스 및 사람의 골수종 세포의 융합에 의하여 생산된 이형골수종이었고, ATCC 5HMD33으로부터 획득하였다.

RWT-12의 골수종 융합 상대는 HMMA이었다(참조: Posner M.R. et al., Hybridoma, 6:611, 1987).

각각의 하이브리도마에 있어서, 탯줄혈액 B 세포는 실시예 1에서 상술한 방법에 의하여 수득되었으며, 불멸화되었다.

5주후에, 각각의 웰의 배양액을 Tat 단백질에 대한 반응을 ELISA에 의하여 측정하였다. 이러한 EBV로 불멸화된 세포의 선택된 배양액을 각각의 펩타이드로 측정하였다(실시예 5, 도 5에 도시됨). 펩타이드 4와 유일하게 반응하는 3개의 배양액(펩타이드 5와는 저수준치에서 반응) 및 펩타이드 8와 유일하게 반응하는 3개의 배양액(펩타이드 7 및 9와는 저수준치에서 반응)을 실시예에서 상술한 방법으로 융합 상대와 융합하기 위하여 선택되었다. 그 과정에서 : 융합된 세포(하이브리도마라고 표현됨)는 하나의 세포만이 분주되어 단클론성을 유지하도록 웰 당 0.5 세포로 분주되었다.

세포는 20% 송아지 태아 혈청, SPIT(Sigma) 및 Pen/STrep이 보충된 NY/HT(Sigma)에서 성장되었으며, 400RPM에서 5분간 회전시켜 원심분리하였다.

각각의 펠렛은 80% 송아지 태아 혈청, 10% DMSO 및 10% RPMI-1640을 함유하는 배양액에서 현탁시켰으며, 2㎖씩 분주하여 -70℃에서 보관 또는 액체 질소에 보관하였다. 이러한 분주세포는 하이브리도마 RWT-4 및 RWT012이며, 각각 98년 2월 12일 및 2월 25일자로 ATCC에 기탁하였다.

실시예 4: 하이브리도마 세포주 RWT-4 및 RWT-12의 선택적 반응성의 측정

하이브리도마에 의하여 분비된 선택적 IgM 단클론 항체를 포함하는 각각의 배양액의 항체회복력을 측정하였다.

배양액은 센트리콘 C-100(centricon C-100) 컬럼에서 농축되어, 염 및 100kDa이하의 분자량을 가진 모든 단백질이 제거되었다. 농축된 용액은 파마시아 S-300 컬럼(Pharmacia S-300 column)상에서 크기배제 컬럼을 통하여 분리되었다. 용리액의 첫번째 피크는 순도를 결정하기 위하여 SDS 폴리아크릴아마이드 겔상에서 전기영동되어 2개의 밴드는 선택적 IgM의 L쇄(light chain) 및 H쇄(heavy chain)로 나타났고, 다른 밴드는 나타나지 않았다. 용리액은 새로운 컬럼에서 재농축되어 200㎍/㎖로 하였다.

각각의 단클론 항체의 L쇄는 퍼옥시다제 표지된 항-감마 및 항-카파를 사용하여 ELISA법에 의하여 동정되었다.

각각의 단클론 항체의 H쇄(항원결정기 선택성)는 펩타이드의 세트를 사용하여 ELISA법에 의하여 동정되었다.

L쇄의 동정

ELISA : 1. 표지되지 않은 rb ＞ IgM 2. 단클론 또는 전체 사람의 IgM(Sigma) 3. 퍼옥시다제 표지된 항-카마 또는 항-람다
퍼옥시다제 표지된 항-람다	0 항체	전체 IgM	RWT-4 단클론 항체
1:4k	01	.24	.73
1:6k	01	.16	.54
1:10k	0	.12	.37
항-카파
1:4k	04	.55	.06
1:6k	01	.36	.04
1:10k	0	.23	.02
결론: RWT-4의 L쇄는 람다
항-람다	0 항체	전체 IgM	RWT-12 단클론 항체
1:4k	02	.89	.03
1:6k	01	.65	.02
1:10k	07	.45	.01
항-카파
1:4k	04	＞1.00	.80
1:6k	03	.83	.57
1:10k	02	.56	.39
결론: RWT-12의 L쇄는 카파

Tat 펩타이드 선택성의 측면에서 항원결정기의 동정

펩타이드	ST	RWT-4 단클론 항체	RWT-12 단클론 항체
1	.01	.03	.05
2	.02	.02	.04
3	.03	.01	0
4	.48	.94	.02
5	.20	.35	.12
6	.07	.01	.07
7	.16	.07	.36
8	.12	.07	.42
9	0	.02	.01
10	0	.01	.03
11	0	0	0
12	.33	.16	.72
전체 Tat 단백질	.49	.55	.44

펩타이드 12는 실시예 5 및 도 6에서 펩타이드 8로 표현되었다. 따라서, 표를 참조하면 다음과 같다.

실시예 4	도 2
7	7
12	8
8	9
9	10
10	11
11	12
12	8

희석: ST 혈청 1:100

하이브리도마 세포의 단클론 항체 1㎕/㎖

이러한 자료는 20개의 시료를 독립적으로 분석하였을 때, 각각의 항체/항원 반응의 평균을 나타낸 것이다.

실시예 5

본 실시예에서, 하기의 재료 및 방법이 사용되었다.

혈청

사람

도 6에 도시된 70개의 HIV+ 및 70개의 HIV- 혈청은 1994년 이전에 수집되었으며, Tat 단백질과의 반응성이 분석되었다. 따라서, HIV+ 집단의 특성은 그 이후에 사용된 항-HIV 치료제에 기인하지 않는다. 70개의 HIV+ 혈청 중에서, 52개는 표 1의 항원결정기 분석에 사용되었으며, 추가로 8개의 HIV+ 혈청이 포함되어 치료제를 사용하지 않은 HIV+ 환자로부터의 수득된 전체 60개의 혈청으로 하였다. HIV+ 일련의 세트를 위한 혈청(도 9, 10 및 11)은 임상 자료 및 치료제를 사용하여 임상 검사를 하기 위한 시료의 분주액으로 하였다. 표 1의 80개의 정상(HIV-) 혈청은 연령, 성별 및 "임상증상 없음"에 의하여 검사를 위하여 시료로부터 준비되었으며, 실험실에 있는 개인들에 의하여 제공되었다.

침팬지

성인 침팬지로부터 채취되어 정상으로 확인된 22개의 혈청은 YERKES Regional Primate Center(Emory Unibersity)로부터 공여받은 16마리(웅성 7마리, 자성 9마리); LEMSIP(NYU Medical Center)로부터 공여받은 6마리(자성 2마리, 웅성 4마리)로부터 수득되었다. 후자의 그룹에서 자성 1마리 및 웅성 1마리의 혈청은 HIV 감염된 세포를 접종한 후, 각각 22개월 및 10개월 동안 채취되었다.

원숭이

정상 원숭이의 32개의 혈청은 YERKES로부터 공여받은 20마리의 레수스 마카크스(rhesus macaques); LEMSIP로부터 공여받은 1마리 및 LARC(Laboratory Animal Research Center, Rockefeller University)로부터 공여받은 1마리; LARC로부터 공여받은 돼지 꼬리 마카크스 4마리 및 바분 5마리로부터 수득되었다. 아울러, 혈청은 SIV(Mac 239)로 감염된 세포를 접종한 후의 레수스 마카크스 1마리; 및, Lingi Zhong박사(Aaron Diamond AIDS Research Center, Rockefeller University)로부터 공여받은 SIV Mac 239 배양액의 세포가 없는 상등액으로 접종한 후 6개월째의 레수스의 혈장으로부터의 2개의 시료를 수득하였다.

토끼

뉴질랜드 흰색 토끼(처치 전) 20마리(웅성 10마리, 자성 10마리)로부터 채취된 혈청은 James Nolan(Hospital for Special Surgery, New York)에 의하여 제공되었으며, 10개는 LARC로부터 공여받았다. HIV Tat 단백질로 면역화시킨 후, 토씨의 혈청의 1개의 실표는 Intracel Corp(Isaquah, WA)로부터 수득되었다.

마우스

정상적인 성인 마우스의 30마리로부터 채취된 혈청: 즉, 발브 C(Balb C)계 12마리, C57 흑색계 6마리, MRL-lpr계 2마리 및 스위스 웹스터(Swiss Webster)계 10마리는 LARC로부터 공여받았다. HIV Tat 단백질/아쥬반트로 면역화된 일련의 3개의 시료는 발브 C계 1마리 및 스위스 웹스터계 1마리에 투여되었으며, 아쥬반트 단독을 발브 C계 1마리 및 스위스 웹스터계 1마리에 투여하였다. 표 1의 자료에 포함된 혈청은 각각의 마우스의 최종 접종후 16주째 채취한 시료를 나타낸다.

항원

재조합 Tat 단백질은 Intracel Corp.으로부터 제공받았으며, 동결건조된 형태였다. 단백질 각각의 바이알의 반응성 및 반응 희석비율은 사람의 표준 혈청(16)에 의하여 표준화되었다. 공지된 HIV Tat(17)의 아미노산 배열과 일치하는 아미노산 서열과 중복되는 Tat 펩타이드(도 5)는 상술한 방법(14)에 의하여 수득되었다. 가장 최근의 리뷰(26)에서 Tat은 다양한 HIV 생물군에 의하여 나타나는 아미노산 서열로부터 탈선이 적으며, 잘 보존된 HIV 단백질임으로 밝혀졌다.

ELISA

모든 혈청은 반복적인 동결건조-해동으로 인한 효과를 최소화시키기 위하여,작은량의 분주세포액으로 -70℃에서 보존되었다. ELISA 방법은 표준화되고 통계학적으로 분석되었다(예를 들면 15 및 16). 각각의 혈청/항원은 독립적으로 최소한 3회 분석되었다. 각각의 항원에 대한 보정된 혈청의 흡광도는 혈청/항원의 판독값에서 혈청의 바탕 흡광도(0 항원)를 뺌으로써 나타내었다. 0.10의 보정된 흡광도는 양성으로 판정되었다. 만일 보정된 흡광도가 0.08 내지 0.15이면, 추가로 분석을 3회 수행하였다. 사람 및 침팬지의 혈청을 분석하는데 있어서, 단일 표준 혈청(ST)은 각각의 역가 플레이트에 포함되었으며, 최종 역가는 X/ST로 계산되었다. 퍼옥시다제 표지된 항-사람의 IgG 또는 IgM(KPL)은 모든 사람 및 침팬지의 혈청에 사용되었다. 항-원숭이 IgM 또는 IgG(KPL)는 침팬지의 혈청과 반응하지 않는 것으로 판명되었으나, 다른 원숭이의 혈청에 대한 선택성의 모든 기준 및 혈청-희석 비례에 의하여 적절하게 분석되었다. 이와 유사하게, 항-마우스 IgM 또는 IgG(Sigma) 및 항-토끼 IgM 또는 IgG(KPL)는 선택성 및 희석단계에 따른 반응성에 대하여 검정되었다. 각각의 종에 대한 퍼옥시다제 표지된 항체는 염소의 혈청으로부터 유래되었으며, 잔여 항체를 차단하는 단계를 포함하는 ELISA, 즉 1%의 정상 염소의 혈청이 종-선택적 분석 혈청의 적용 이전에 항원의 세척 단계에 적용되었으며, 결과로 나타난 반응성의 어느 것도 염소의 항체에 기인하지 않는 것으로 확인되었다.

	IgM	IgG
각각의 종의 혈청 펩타이드의 개수	1	4	8	Tat	1	4	8	Tat
사람
남자 40	0	40	38	40	0	38	31	38
여자 40	0	40	40	40	1	40	36	40
HIV+ 60	0	60	46	60	1	60	21	60
침팬지
수컷 침팬지 11	0	11	10	11	0	11	9	11
암컷 침팬지 11	0	11	11	11	0	11	8	11
HIV+ 2	0	2	2	2	0	2	2	2
시미안
원숭이 32	0	0	0	0	0	32	2	21
SIV+ 3	0	0	0	1	0	3	3	3
토끼
정상 30	0	2	0	0	0	3	0	0
Tat+ 1	1	0	0	1	1	1	0	1
마우스
정상 30	0	0	0	0	0	2	0	1
아쥬반트 2	0	0	0	0	0	0	0	0
Tat+ 2	0	0	0	0	2	0	0	2

결과

사람

도 6은 HIV+ 및 HIV-(정상) 혈청의 Tat 단백질에 대한 IgM 및 IgG의 반응성에 대한 분석 결과를 나타낸다. 실시예의 방법에서 기재하였듯이, HIV+ 혈청은 1994년 중반이전에 항-HIV 치료제(예를 들어, AZT)를 투여받지 않은 환자로부터 수득된 것이다. 두개의 그룹으로 나뉘어진 70개의 혈청의 각각의 역가의 비교는, HIV+의 IgM의 역가(도 6a)가 HIV- 그룹보다 현저히 감소됨을 확인할 수 있다. 그러나, 동일한 혈청의 Tat 단백질과 반응하는 IgG의 역가의 분포(도 6b)는 두 개의 그룹을 비교하였을 때 무작위이며, 각각의 혈청(자료 없음)은 Tat 반응성 IgM의 역가와 관련된다. 이러한 IgG의 역가는 자연항체의 돌연변이 형태이거나(27, 28) 또는 연관이 없는 항원에 비의존적으로 유도된 항체와 Tat 반응성으로 나타나는 Tat 단백질의 영역과 일치한다.

Tat 단백질과 반응하는 IgM을 나타내는 두가지 사람의 그룹의 각각의 항원결정기의 분석(표 Ⅰ)은 인접하지 않은 서열에 제한된다: 즉, 시스테인이 풍부한 영역을 갖는 펩타이드 4, 5 및 아르기닌이 풍부한 영역으로 대표되는 펩티드 7 내지 9(도 1). 표 Ⅰ의 자료에서, 펩타이드 4에 의하여 대표되는 항원결정기뿐만 아니라 모든(80) HIV-(정상)의 남자 및 여자는 Tat 단백질과 반응하는 IgM의 유의적인 역가를 갖는 한편, 2개를 제외한 모든 것은 펩타이드 8에 의하여 대표되는 유의한 역가를 가진다. 60개의 HIV+ 혈청의 모두는 낮으나, 유의성 있는 IgM항체의 Tat 단백질에 대한 반응의 역가를 가지며, 서열은 펩티드 4로 나타나는 한편, 60개의 혈청중 46개는 펩타이드 8로 나타나는 알지닌이 풍부한 Tat 단백질과 반응하는 IgM을 갖는다. 양성의 범위에 있는 이러한 HIV+ 혈청은, 펩타이드 8에 대한 IgM의 반응성은 낮은 수준이며(도 7), 결핍의 수준이고, 펩타이드 4보다 그 정도가 심하다(도 7). 다시말해서, IgG 항체(표 Ⅰ)는 IgM 자연항체의 돌연변이 형태(27, 28)라고 할 수 있고/있거나 몇몇 외부적인 항원의 유도에 의하여 비의존적으로 유도될 수 있다. 후자는 아마도 HIV- 혈청에서 발현되고, 펩타이드 1(도 5)과 반응하는 IgG이며, 따라서 Tat에 의하여 유도되지 않으며 HIV+ 혈청(표 Ⅰ)일 것이다. 도 7 및 8의 결과는 Tat과 반응하는 자연 항체가 펩타이드 4(도 8)보다 펩타이드 8(도 7)과 더 강하게 반응함을 나타낸다. HIV의 병인화 과정 및 Tat 단백질과 반응하는 IgM 자연항체의 역가와의 상호관계 및 CD4+ T 세포수의 산정과 병의 진행과정지수의 규명과의 상호관계(29)는 도 9 내지 11에 개시되어 있다. Tat 단백질에 대한 IgM의 분석 역가, 펩타이드 4, 펩타이드 8 및 CD4+ T 세포수의 산정에 대한 임상 자료는 각 개인의 일련의 시료로부터 수득된 자료이다. 도 9는 HIV+ 남자로부터 AIDS 진단을 받고 사망에 이르기까지 5년이상에 걸쳐 수득된 일련의 시료이다. Tat 단백질에 대한 각가의 IgM 역가는 동일한 시료에 대한 펩타이드 4 및 펩타이드 8 IgM 값의 조합을 나타낸다. 특별히, 펩타이드 8을 떨어뜨렸을 때 현저히 증가하는 반응성은 사망전 8개월전에 수집된 시료에서 CD4+ T 세포에 의하여 나타나는 것과 일치하였다. 도 10은 항-HIV제를 투약받지 않고 HIV 병인의 증상이 없으며, 감염이 11년 이상이라고 추정되는 HIV+ 남자로부터 수득된 일련의 시료이고, 장기간 생존율 또는 장기간 비발병율로 나타난다. Tat 단백질, 펩타이드 4 및 펩타이드 8과 반응하는 IgM 자연항체의 역가의 유지 양상은 정상(HIV-)인의 역가와 유사하였다(14, 16). 역가의 높은 수준, 특별히 펩타이드 8에 대한 역가의 높은 수준은 정상 범위내에서 CD4+ T 세포수의 유지와 관련이 있다. 유사한 연관성은 CD4+ T 세포의 감소이후 항바이러스 치료를 받는 개인으로부터 수득한 시료에서 볼 수 있다(도 7). 치료기간이후 CD4+ T 세포수 및 자연항체의 역가, 특히 펩타이드 8에 대한 역가는 상승하였다. 이후의 성공적으로 치료된 시료는 CD4+ T 세포수 및 항체역가가 정상 수준에서 유지되었으며, 환자의 평안한 상태와 평행하였다.

침팬지

정상적인 침팬지 22마리 모두의 혈청(테이블Ⅰ)은 Tat 단백질과 펩티드4와 반응성이 있는 IgM 및 IgG 항체의 중대한 역가값을 갖는다. 펩타이드 8에 대하여, 이들 그룹 중 21개가 IgM에 대한 반응성을 보였으며, 17개가 IgG에 대하여 반응성을 보였다. HIV에 접종된 각 2 마리의 챔팬지의 혈청은 Tat 단백질, 펩타이드 4 및 8에 의하여 대표되는 서열들과 중요한 IgM 및 IgG 반응성을 보였으며, 다른 서열들과는 반응성을 보이지 않았다. 따라서, 침팬지의 자연적인 항체 목록은 사람의 그것과 유사함을 알 수 있다.

원숭이

32 개의 정상적인 혈청(테이블Ⅰ) 어느 것 에서도, Tat 단백질과 반응성이 있는 IgM이나 이들을 구성하는 다른 펩타이드들이 전혀 발견되지 않았다. SIV에 감염된 3 마리의 원숭이들 중에서 하나가 Tat 단백질과 반응성을 보였다. 그러나, 32 마리 모두는 펩타이드 4와 IgM 반응성을 보였고, 이들 중 21 마리가 Tat 탄백질과 IgG 반응성을 보였다. 정상적인 2마리의 원숭이로부터 혈청과 SIV에 감염된 3 마리 모두의 혈청은 펩타이드 8과 IgG 반응성을 보였다.

토끼

정상적인 토끼 30 마리의 혈청중에서, 두개가 펩타이드 4와 IgM 반응성을 보였으나, 이들에서도 Tat 단백질과의 IgM 반응성은 발견되지 않았다. 이들 두개의 혈청과, 추가로 정상적인 토끼의 혈청 몇개가 펩타이드 4와 IgG 반응성을 보였으나, 이들 역시 Tat 단백질과는 반응하지 않았다. 전기 Tat 단백질에 면역이 된 토끼의 혈청은 펩타이드 1 및 Tat 단백질과 IgM 반응성을 보였고, 또한, 펩타이드 1, Tat 단백질 및 펩타이드 4와의 IgG 반응성을 보였다. 이러한 분포는, 정상적이거나 Tat 단백질에 면역이 된 토끼의 혈청 모두에서 일어나는 펩타이드 4의 IgM 및 IgG 반응성이 조합된 Tat 단백질에서 발견되지 않은 외부적인 항원에 대한 응답이라는 것을 반영하는 것임을 의미하는 것이다. Tat 단백질에 면역이 된 토끼의 혈청에서 일어나는 전기 펩타이드 1과의 IgM 및 IgM 반응성은, 펩타이드 1 반응성이 Tat 단백질과 비교적 높은 반응성을 보인다는 점을 감안하면, 면역원에 의하여 유도된 것이라 해석될 수 있다.

마우스

30 마리의 정상적인 마우스들 중에서 Tat/아쥬반트 면역된 두마리의 혈청과 아쥬반트만으로 면역된 두마리 마우스들의 혈청들은 Tat 단백질 또는 다른 단백질 어느것과도 전혀 반응성을 보이지 않았다(테이블Ⅰ). 이들 중 두개의 혈청은 펩타이드 4와 IgM 반응성을 보였으며, 또 다른 한마리의 혈청은 Tat 단백질과 IgG 반응성을 보였다. 아쥬반트만으로 면역된 두마리 마우스 혈청은 반응성을 전혀 보이지 않은 반면, Tat/아쥬반트 면역된 두마리 쥐의 혈청들은 펩타이드 1 및 Tat 단백질과 매우 높은(〉1.0) 반응성을 보였다. 이로부터, 토끼와 마우스에 있어서, Tat 단백질이 펩타이드 1에 나타난 서열에 직접적으로 반응하는 항체의 강력한 유도물질임이 명백하다.

고찰

Tat 단백질은 HIV 감염으로 인한 발병의 초기 단계에서, 바이러스가 세포에 부착하여 세포내로 들어갈 때 중요한 역할을 한다. 시험관내 연구에 의하여 밝혀진 바에 의하면, Tat이 주로 Tat 펩타이드 7 내지 9(도 5)로 나타내어지는 염기성 도메인(30, 31)에 의하여 중개되는, 바이러스의 내재화에 참여한다는 것을 의미한다. 바이러스의 세포내 증식 또한 Tat에 의존하는데, Tat이 바이러스 RNA의 Tar 부위와 결합하여 트랜스-활성을 유발한다(18, 19). Tat 펩타이드 4, 5(도 5)로 나타내어지는 Tat의 시스테인(cysteine) 부위는 Tat/Tar이 결합하여 결과적으로 HIV 복제가 가능하게 하는 핵심적인 역할을 한다(18, 19). 그러므로, Tat의 두가지 활성-바이러스가 세포내로 주입되도록 중개하는 것 및 내재화된 바이러스가 복제할 수 있도록 활성화 시키는 것-은 두가지 자연 IgM 항체에 대한 항원결정기를 포함하는 Tat의 아미노산 서열에 따라 결정되는데, 이러한 자연항체는 본 발명에서 검사한 모든 사람의 혈청 및 침팬지 혈청에는 존재하지만 다른 포유류, 즉 원숭이, 토끼, 쥐에는 존재하지 않는다(Table I).

그러한 항원결정기 특이성에 따라서, 전기 자연항체가 HIV 감염 후 초기 단계에서 HIV의 병인화에 대한 저항력을 갖는, 사람 숙주 기전을 제공하거나 그것에 기여한다고 할 수 있다. 사람 숙주에서 바이러스의 주입 및 세포내 복제의 방해(retardation)가 전기 항체에 의하여 이루어지고, 레서스 머카크(rhesus macaque, 원숭이)에서 방해가 없다면, HIV 감염된 사람보다 SIV 감염된 레서스 머카크에서 T 림프세포의 교체(turnover)가 훨씬 빨리 일어나는 결과를 설명할 수도 있다(32 ,33). HIV+ 사람의 말초 혈액 세포에서 CD4+T 세포 집락 및 Tat에 반응하는 자연항체의 역가가 어떠한 방식으로 감소하는가에 대한 정확한 기전이 명확하게 확립되지 않았으나, CD4+T 세포와 Tat에 반응하는 자연항체의 역가 사이의 관계는 본 발명의 도 9 내지 11의 일련의 표본에 나타나 있다. 각 일련의 표본에서, CD4+T 세포수는 항체 역가의 유지 및 감소와 평행하다.

그러나, Tat과 관련된 병원성이 전기 자연항체에 의하여 운좋게도 저지되는 것은 Tat이 항체와 반응하는 서열 부위를 자가항원으로 인식하여 결과적으로 면역관용을 유도하는 면역 체계에 의하여 제한된다(21, 22).

최근에 많은 관심을 끌고 있는 선천성 및 후천성 면역의 독립적이면서도 서로 조화되는 원리(6 내지 8)가, 자기인식과 뒤따르는 면역관용의 기전과 각 단계에대한 더욱 자세한 설명을 제공하기를 바란다. 현재까지는, 자가관용의 기본적이며 도구가 되는 단계는 자연항체의 생산과 관련된 T 및/또는 B 세포의 감소 또는 무작동인 것으로 밝혀졌다(23). 따라서, Tat 항원의 적재가 증가함에 따라, Tat에 반응하는 자연항체의 생산이 억제되고, Tat의 공격 활성에 대한 항체의 저지 능력을 상실하게 되고, 질병진행의 잠복기가 끝나게 된다. 실험실내에서 Tat의 병원성의 활성은 공지된 바와 같이 세포사멸의 유도이다(29). Tat과 반응하는 자연항체가 Tat의 활동을 방해하여, HIV 감염 후 초기의 표면적인(apparent) 잠복기의 유지에 기여한다는 제안은, LTS(long term survivor, 장기간 생존자)(12) 또는 LTNP(long term non progressor, 장기간 비발병자)(13)으로 불리우는 사람들이 T 세포 세포사멸의 증거를 거의 보이지 않으며(21), 본 발명에서 개시된 바와 같이(도 10) 자연항체의 수준을 정상적으로 유지한다는 결과를 뒷받침한다. 침팬지가 AIDS로의 진행하는데 있어서, 내성은 T 세포 수준의 유지와 Tat이 유도하는 세포사멸의 증거가 거의 없다는 사실을 수반한다.

세포사멸에 의한 T 세포 결핍의 기초가 되는 기전은 완전히 이해되지 않았으나, Fat/Fat 리간드 체계가 HIV에 의해 유도된 CD4+T 세포의 세포사멸의 조절인자가 아니라는 사실이 최근의 연구에 의해 확립되었다(35, 36).

그러나, 특히 놀랄만한 것은 실험실내에서 SIV(mac 239)에 의해 유도된 말초 혈액 단핵 세포의 세포사멸은 Fas/Fas 리간드 체계에 의하여 중개된다는 최근의 보고이다. 세포사멸 중개 기전에 관한 SIV와 HIV의 차이점은 본 연구의 논제와 특별한 관련이 있는데-HIV의 사람 면역 체계와의 상호 작용은 특별히 독특하다. HIV와 SIV의 또 다른 중요한 차이점은 바이러스 복제에 대한 인터페론의 저해 효과에 관한 생체외 연구에 의해 나타내어진다. 그러한 효과는 우선적으로 바이러스 DNA 합성과 관련이 있는 것으로 나타나는데, SIV 감염된 세포에서는 인터페론에 의해서 DNA 합성이 봉쇄되지만 HIV 감염된 세포에서는 봉쇄되지 않는다(38).

T 세포와 B 세포의 세포사멸은 Tat의 작용때문인 것으로 여겨졌다(29). 치매(dementia)를 초래하는 신경퇴화(neurodegeneration)에 Tat이 관련된다는 보고가 많이 되었다. 이 보고에는 배양된 사람 태아의 뉴런(human fetal neuron)의 Tat의 양에 의존하는 세포사멸(39)과 AIDS의 진단을 받고 사망한 환자의 뇌조직에서 탐지된 뉴런의 세포사멸(40)가 포함된다. 실험실에서 나타난 Tat의 신경독성 효과가 생체내에서도 일어날 수 있는 확률은 Tat이 혈액뇌관문(blood brain barrier)을 투과할 수 있는 잠재 능력에 의해 뒷받침된다. 정자 염색체 단백질, 프로타민(protamine)에 의한 혈관 투과 능력 및 혈액뇌관문의 통과에 대한 다양한 분석으로 프로타민의 알지닌(arginine) 농도 때문인 것으로 나타났다(41). 전기 능력이 본 발명에서 펩타이드 7 내지 9(도 5)로 나타내어지는 Tat의 알지닌이 풍부한 서열에 원래부터 존재한다. Tat 펩타이드 8과 반응하는 사람 자연항체에 대한 항원결정기 분석과 특별한 관련이 있는데, 그 분석에 의하면 전기 자연항체에 대한 항원결정기가 HIV Tat 단백질뿐만 아니라 프로타민의 알지닌이 풍부한 서열에 존재한다(16).

사람의 자연항체와, IgM 및 IgG의 항원결정기 유사성은 각각 동일한 항체의 동위체 한쌍을 나타내는 것을 의미한다. 건강한 사람의 그룹으로부터 수득한 일련의 표본에서 두 가지 자연항체의 IgM 역가는 변화가 없지만, IgG의 역가는 변하므로 IgM이 항상성을 유지하는 동위체라고 앞서 제안했다(16). 자연항체의 클래스 변화(class switch)의 기전과 효용성이 아직까지 밝혀지지 않았고, 쉽게 밝혀지지도 않겠지만, 바라건데, 선천성 그리고 후천성 면역에서 동위체의 변화(switch)를 분자적, 기능적 측면에서 알아내는 최근의 연구 과정상에서 명백해 질 것이다(42).

따라서, 현재는 Tat에 반응하는 사람의 자연항체의 IgM과 IgG 동위체에 역할을 배당하는 것은 가능하지 않다. 그러나, HIV+인 사람에서 Tat에 반응하는 항체가 면역적 유발에 의해 생성되지 않는다는 것이 확실하다(표 1). Tat에 반응하는 항체가 원숭이, 토끼, 쥐에서는 유도되므로(도 1), 항체 유도의 실패는 사람 면역 체계에만 독특한 것으로 보인다. 침팬지가 사람과 유전적인 동질성이 가장 높다고 추측되므로(20), 그러한 독특성이 유전적 특이성에 기인함은 Tat에 반응하는 침팬지 혈청 항체의 특이성에 의해 뒷받침된다(표 1). 사람 혈청과 유사한 것이 확실하다: HIV 감염 전 후에 침팬지는 Tat 펩타이드 4 및 8(도 5)과 반응하지만 다른 것과는 반응하지 않는 IgM과 IgG 항체를 가지고 있다(표 1). 그러나, AIDS로의 질병진행에 대한 선천적 내성이 HIV+ 사람보다 침팬지에서 확실하게 강한 것은(10, 11), 아마도 면역관용을 유도하는데 관여하는 면역 체계 구성 인자의, 유전적 동질성의 차이 때문일 것이다(21, 22). 그렇다면 다음과 같은 의문이 생긴다: 그런 동질의 유전적 성질이 LTS/LTNP(장기간 생존자/장기간 비발병자)가 부여받은(12, 13) HIV 파괴성에 대한 방어 능력과 관련이 있을까?

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〈151〉 1997-11-24

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〈170〉 KOPATIN 1.5

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Claims

기탁번호 ATCC CRL-12431인 하이브리도마 세포주.
제 1항의 하이브리도마에 의하여 생산되고, 사람의 정자 두부(sperm head) 상에서 발현되는 락토페린과 면역반응하는 사람의 IgM 단클론 항체.
기탁번호 ATCC CRL-12477인 하이브리도마 세포주.
제 3항의 하이브리도마에 의하여 생산되고, 분리된 사람의 IgM 단클론 항체.
기탁번호 ATCC CRL-12472인 하이브리도마 세포주.
제 5항의 하이브리도마에 의하여 생산되고, 분리된 사람의 IgM 항체.
하이브리도마 세포주 ATCC CRL-12472, ATCC CRL-12477로부터 생산된 항체 및 그들의 혼합 항체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 분리된 사람의 IgM 단클론 항체를 HIV-1의 감염을 치료하기 위한 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 HIV-1에 감염된 환자를 치료하는 방법.
하이브리도마 세포주 ATCC CRL-12472, ATCC CRL-12477에서 생산된 항체 및 그들의 혼합 항체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 분리된 사람의 IgM 단클론 항체를 CD4+ T 세포를 증가시키기 위한 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 HIV-1에 감염된 환자에 있어서 CD4+ T 세포를 증가시키는 방법.
하이브리도마 세포주 ATCC CRL-12472, ATCC CRL-12477에서 생산된 항체 및 그들의 혼합 항체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 분리된 사람의 IgM 단클론 항체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 제제.
제 9항에 있어서,

약제학적으로 허용되는 부형제는 IVIG제인 것을 특징으로 하는

약학적 제제.