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CN112533952B - 治疗疾病或病况的组合物及其用途 - Google Patents

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CN112533952B CN201980051359.2A CN201980051359A CN112533952B CN 112533952 B CN112533952 B CN 112533952B CN 201980051359 A CN201980051359 A CN 201980051359A CN 112533952 B CN112533952 B CN 112533952B
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Abstract

本申请提供了用于确定患有疾病或病况的个体中免疫检查点配体(如PD‑L1或PD‑L1样配体)的分布和表达水平的方法、成像剂和试剂盒。还提供了抗PD‑L1抗体试剂，以及通过施用抗PD‑L1抗体试剂来治疗疾病或病症的方法。

Description

治疗疾病或病况的组合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年6月1日提交的PCT申请PCT/CN2018/089672和于2018年8月9日提交的PCT申请PCT/CN2018/099556的优先权和权益，所述申请的内容通过引用整体并入本文。
以ASCII文本文件提交序列表
以ASCII文本文件后续提交的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式(CRF)(文件名：792572000341SEQLIST.TXT，记录日期：2018年5月28日，大小：64KB)。
发明领域
本发明涉及对免疫检查点配体进行成像的抗体、成像剂、方法以及治疗疾病或病况的方法。
发明背景
程序性死亡(PD)网络涉及至少五个相互作用的分子：PD-1(程序性细胞死亡1)、两个PD-1配体(PD-L1和PD-L2)以及PD-L1的两个抑制性受体(PD-1和CD80)。PD通路在针对感染的炎症反应中对周围组织T细胞活性的调节以及对自身免疫的限制中的关键功能，似乎被肿瘤细胞和慢性病毒感染期间的病毒所劫持。PD-L1在多种组织起源的许多新分离的人肿瘤中过表达(Dong et al.Nature Medicine 2002；8:793-800；Romano et al.Journalfor Immunotherapy of Cancer 2015；3:15；Hirano et al.Cancer Research 2005；65:1089-1096)。PD-L1的表达与某些类型的人类癌症的进展和不良预后相关(Wang etal.European journal of surgical oncology:the journal of the European Societyof Surgical Oncology and the British Association of Surgical Oncology 2015；41:450-456；Cierna et al.Annals of oncology:official journal of the EuropeanSociety for Medical Oncology/ESMO 2016；27:300-305；Gandini et al.Criticalreviews in oncology/hematology 2016；100:88-98；Thierauf et al.Melanomaresearch 2015；25:503-509；Taube et al.Clinical cancer research:an officialjournal of the American Association for Cancer Research 2014；20:5064-5074)。在慢性病毒感染期间，PD-L1在许多组织中持续表达，而PD-1在病毒特异性CTL中被上调(Yaoet al.Trends in molecular medicine 2006；12:244-246)。肿瘤或病毒诱导的PD-L1可以利用多种机制促进对宿主免疫监视的规避，包括T细胞无能、凋亡、耗竭、IL-10产生、DC抑制以及Treg诱导和表达(Zou et al.Nature reviews Immunology 2008；8:467-477)。
使用免疫组织化学(IHC)确定的PD-L1表达水平，已被作为PD-1/PD-L1定向治疗临床试验中针对多种癌症类型的预测性生物标志物进行评估，所述癌症类型包括黑素瘤、肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性结直肠癌(mCRC)和转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)。由IHC确定的PD-L1水平较高的患者，似乎对PD-1/PD-L1定向治疗的反应更好。但是，PD-L1阴性的黑素瘤患者仍然可以对抗PD-1/PD-L1疗法产生持久的应答，而PD-L1阴性的NSCLC患者的应答率却很低。
由IHC在人肿瘤标本中检测PD-L1的准确性受多种因素影响。多种PD-L1抗体已被用于IHC检测，包括28-8、22C3、5H1，MIH1和405.9A11。此外，在该领域还开发了多种专有的伴随诊断方法，如VentanaSP142和Ventana SP263测定。这些测定法的比较性能特征尚不清楚。除了在肿瘤微环境中存在的异质PD-L1表达的现有问题外，还缺乏对IHC在肿瘤样本中染色的“阳性”PD-L1的明确定义。根据染色的肿瘤细胞百分比，阳性结果的分界点范围可为>1％至>50％。此外，针对IHC检测抗体，PD-L1具有有限的结合位点，因为它仅包含两个小的亲水区域，这使得通常用于甲醛固定、石蜡包埋标本(FFPE)的免疫组织化学方法更为低效。由于在PD-L1上缺乏结合位点，相比治疗性PD-L1抗体，IHC抗体通常在结构独特的位点与PD-L1结合。
此外，PD-L1仅在细胞膜上通过动态IFNγ表达或通过组成性癌基因激活表达时才具有生物学活性。致癌基因驱动的PD-L1表达相比炎症驱动的PD-L1表达，代表组织病理学和生物学上不同的实体。尽管后者主要发生在IFNγ介导的免疫攻击部位，但癌基因驱动的PD-L1表达是组成性和扩散性的。IFNγ诱导的PD-L1表达代表动态生物标志物，并存在于活跃的炎症部位，以及代表了在空间和时间上肿瘤免疫微环境快照的活检样本。肿瘤代谢微环境中的其他因素(包括缺氧)可导致PD-L1上调，并且取决于通过HIF1a发出的信号。较小的肿瘤活组织切片可能会错过相关的肿瘤-免疫界面，或者可能活检是在生物学相关PD-L1过表达后才进行的。PD-L1本身在两个潜在的临床相关的免疫突触中表达—肿瘤/T细胞界面，以及APC/T细胞界面。对于肿瘤/T细胞界面，对肿瘤/免疫界面的活检捕获是IHC检测黑素瘤PD-L1的关键决定因素。在评估转移性黑素瘤患者的PD-L1表达的研究中，有96％的PD-L1-过表达的黑素瘤有淋巴细胞浸润(TIL)，而其余4％的PD-L1过表达的黑色素瘤缺乏TIL，可能代表致癌基因驱动的PD-L1表达。此外，22％的PD-L1阴性样本与TIL相关，表明了肿瘤免疫干扰的替代机制
大多数PD-L1表达发生在肿瘤界面上，免疫细胞分泌IFNγ，导致了反直觉的假说，即PD-L1的过表达可能是TIL成功杀死肿瘤的最初保护性反应，它会随时间变为协作性地进入免疫抑制性肿瘤环境。此外，针对PD-L1检测的适合活检的部位选择仍然是个谜。尽管FFPE预处理的原发性肿瘤样本可能是最易获得的，这些样本却可能无法反映当前存在于给定患者中的总体免疫状态，尤其是如果已进行了临时治疗。在活检病变中缺乏PD-L1表达可能无法反映全身免疫学状况，并且可能无法在取决于PD-L1信号转导的疾病的其他部位获得治疗的有益效果。综上所述，准确的替代性PD-L1检测试剂和方法仍未得到满足。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公开专利申请的公开内容，均通过引用整体并入本文。
发明概述
本申请提供了抗PD-L1抗体、成像剂、制备所述成像剂的方法以及使用所述成像剂进行成像和诊断的方法；其中所述成像剂包含特异性识别免疫检查点配体(如PD-L1或PD-L1样配体)的经标记的抗体部分。本申请还提供了抗PD-L1抗体试剂、抗PD-L1抗体试剂的用途，以及用于通过向个体施用抗PD-L1抗体试剂来治疗疾病或病症的方法。
本申请的一个方面提供了治疗个体的疾病或病况的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体在HC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体在LC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，VH包含：含有SEQ IDNO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列；和/或VL包含与SEQID NOs:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体部分包含：(a)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(b)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的VL；(c)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL；(d)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(e)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL；(f)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL；(g)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(h)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL；或(i)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL。
本申请的另一个方面提供了治疗个体的疾病或病况的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗体试剂包含抗体部分，所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQID NOs:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列。
在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分是嵌合的或人源化的。
在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分选自：单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双体抗体(Diabody)、三体抗体(Tribody)和四体抗体(Tetrabody)。
在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。
在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分包括Fc片段。在一些实施方案中，所述抗体部分是全长抗体。在一些实施方案中，所述抗体部分具有选自以下的同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG的Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1或IgG4的Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述个体是人。
在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自：黑素瘤、肾细胞癌、结直肠癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈肿瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤、默克尔(Merkel)细胞癌、肝癌和宫颈癌。
在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述抗体试剂适用于经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用。
在以上描述的任何方法的一些实施方案中，所述抗体试剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。
在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述方法还包括施用有效量的第二药剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是化疗药剂。
在根据上述任何一种方法的一些实施方案中，有效量的所述抗PD-L1抗体试剂约为0.005μg/kg至约5g/kg个体总体重。
本申请的另一个方面提供了药物组合物，其包含抗PD-L1抗体试剂和药学上可接受的载体，其中所述抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体在HC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体在LC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述药物组合物是冻干的。在一些实施方案中，所述药物组合物是溶液。在一些实施方案中，所述药物组合物包含约0.001μg至约10g的所述抗体部分。
本申请的另一个方面提供了用于治疗个体的疾病或病况的药剂套盒，其包含上文所述的任何一种药物组合物和使用说明。
本申请的另一个方面提供了确定个体中免疫检查点配体的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗体部分的成像剂，其中该抗体片段特异性结合所述免疫检查点配体；以及(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中的免疫检查点配体的表达水平。在一些实施方案中，所述方法包括确定个体中两个或更多个免疫配体的分布。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，在约10分钟至约48小时(例如，约2小时至约4小时，约4小时至约8小时，或约8小时至约24小时)内从所述个体的血清中清除所述成像剂。在一些实施方案中，所述抗体部分的半衰期为约10分钟至约24小时(例如，约1小时至约2小时，约2小时至约4小时，约4小时至约12小时，或约12小时至约24小时)。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分的分子量不超过约120kDa(例如，约30-50kDa、50-100kDa或30-80kDa中的任一个)。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(例如，约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分与食蟹猴的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分与小鼠的免疫检查点配体交叉反应。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分是人的。在一些实施方案中，所述抗体部分是嵌合的。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分在酸性或中性pH下均为稳定的。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度为约55-70℃(例如，约55-60℃，约60-65℃，或约65-70℃)。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分选自：单链Fv(scFv)、双体抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：重链可变区(VH)、任选的肽接头和轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，所述肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1或PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述抗体部分包含VH和VL，其中VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3；或者，所述抗体部分与抗PD-L1抗体竞争地、特异性结合PD-L1，其中所述抗PD-L1抗体包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，基于免疫组织化学(IHC)测定或其他测定，所述目标组织为免疫检查点配体阴性。在一些实施方案中，所述目标组织的免疫检查点配体表达水平较低。在一些实施方案中，所述目标组织仅在免疫细胞浸润时表达所述免疫检查点配体。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记抗体部分来制备成像剂。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时(例如，约10分钟至1小时，约1小时至2小时，约2小时至4小时，约4小时至8小时，约8小时至24小时)进行成像。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述个体患有实体瘤。在一些实施方案中，所述实体瘤选自：结肠肿瘤、黑素瘤、肾肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤和胰腺肿瘤。在一些实施方案中，所述个体患有恶性血液肿瘤。在一些实施方案中，所述恶性血液肿瘤选自：白血病、淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，所述个体患有感染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病
本申请的另一个方面提供了诊断患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)使用根据上述任一种方法的方法确定所述个体中免疫检查点配体的分布；以及(b)如果在目标组织中检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阳性；或者如果在目标组织中未检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性。
本申请的另一个方面提供了治疗患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)使用根据上述任一种诊断方法的方法诊断所述个体；以及(b)如果诊断出所述个体为免疫检查点配体阳性，则向所述个体施用有效量的靶向所述免疫检查点配体的治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是所述免疫检查点配体或其受体的抑制剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是特异性结合所述免疫检查点配体或其受体的放射性标记的分子。在一些实施方案中，其中所述免疫检查点配体为PD-L1，向所述个体施用特异性结合PD-1或PD-L1的抗体。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。
本申请的另一个方面提供了分离的抗PD-L1抗体试剂，其包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述重链可变区包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有至多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸替换；以及所述轻链可变区包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有至多约5个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗体部分包含VH和VL，其中VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了包含抗体部分的分离的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗体部分包含：含有SEQ ID NO:1的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的VH，以及含有SEQ ID NO:3的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的VL。在一些实施方案中，所述抗体部分包含：VH和VL，其中VH包含与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个或更高)序列同一性的氨基酸序列；以及VL包含与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体部分包含：(a)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(b)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的VL；(c)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL；(d)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(e)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL；(f)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL；(g)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(h)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL；或(i)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL。
在上文所述的任一种分离的抗PD-L1抗体试剂的一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分是人的。在一些实施方案中，所述抗体部分是嵌合的。
在上文所述的任一种分离的抗PD-L1抗体试剂的一些实施方案中，所述抗体部分包含scFv。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述scFv包含与SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％中的任一个或更高)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，提供了包含抗体部分的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗体部分与上文所述的任一种分离的抗PD-L1抗体试剂中的抗体部分竞争地、特异性结合PD-L1。
本申请的另一个方面提供了成像剂，其包含用放射性核素标记的抗体部分，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1或PD-L1样配体。在一些实施方案中，提供了成像剂，其包含上文所述的任一种分离的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗体部分标记有放射性核素。
在根据本文所述的任一种成像剂的一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA。
还提供了分离的核酸、载体和分离的宿主细胞，其中所述分离的核酸编码根据本文所述分离的抗PD-L1抗体试剂中任一种的分离的抗PD-L1抗体试剂，所述载体包含所述分离的核酸，以及所述分离的宿主细胞包含所述的分离的抗PD-L1抗体试剂、所述分离的核酸或所述载体。
本申请的另一个方面提供了制备靶向免疫检查点配体的成像剂的方法，其包括：(a)使螯合化合物与特异性结合所述免疫检查点配体的抗体部分缀合，从而提供抗体部分缀合物；(b)使放射性核素与所述抗体部分缀合物接触，从而提供成像剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1或PD-L1样配体。
在一些实施方案中，提供了制备靶向PD-L1的成像剂的方法，其包括：(a)使螯合化合物与根据上文所述分离的抗PD-L1抗体试剂中任一种的分离的抗PD-L1抗体试剂的抗体部分缀合，从而提供抗PD-L1缀合物；(b)使放射性核素与所述抗PD-L1抗体缀合物接触，从而提供成像剂。
在根据本文所述的任一种制备方法的一些实施方案中，所述螯合化合物与所述抗体部分的赖氨酸缀合。
还提供了试剂盒，其包含：(a)特异性结合免疫检查点配体的抗体部分；(b)螯合化合物。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含放射性核素。
在一些实施方案中，提供了试剂盒，其包含：(a)包含用放射性核素标记的抗体部分的成像剂，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体；以及(b)未用放射性核素标记的抗体部分。
还提供了包含本文所述的任一种抗PD-L1抗体试剂和成像剂的组合物、试剂盒和制品。
附图说明
图1A和1B显示了抗hPD-L1单克隆抗体5B7与hPD-L1蛋白的结合亲和力。图1A显示的直方图展示了在不同浓度下抗hPD-L1单克隆抗体5B7与hPD-L1蛋白的结合亲和力。图1B显示了各自浓度下的平均荧光强度。
图2A和2B显示了抗hPD-L1单克隆抗体与表达hPD-L1蛋白或mPD-L1蛋白的CHO细胞的结合亲和力。
图3A和3B显示了小鼠抗hPD-L1抗体对hPD-L1结合hPD-1(A)和hB7-1(B)的阻断活性。
图4显示了与亲本嵌合抗体相比，人源化抗hPD-L1抗体对hPD-1/hPD-L1的结合的阻断活性。
图5显示了scFv-HuFC(Wt)和scFv-HuFC(Mt)的结构设计示意图。
图6显示了scFv-HuFC(Wt)和scFv-HuFC(Mt)在还原和非还原条件下的SDS-PAGE结果。
图7显示的直方图展示了与亲本抗体相比，scFv-HuFC(Wt)和scFv-HuFC(Mt)与PD-L1的结合亲和力。
图8A和8B显示了在静脉注射抗hPD-L1 scFv-HuFc融合蛋白scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt后，抗hPD-L1抗体和hIgG的血清效价。图8A显示了抗hPD-L1抗体的血清效价。图8B显示了hIgG的血清效价。
图9显示了抗hPD-L1 scFv、亲本人源化IgG1阳性对照抗体和阴性对照scFv的结构设计示意图。
图10显示了在还原和非还原条件下，scFv(PD-L1)、亲本人源化IgG1阳性对照抗体和阴性对照scFv的SDS-PAGE结果。
图11显示了不同浓度的亲本人源化IgG1阳性对照抗体和scFv(PD-L1)结合PD-L1的亲和力。
图12显示了通过差示扫描荧光法(DSF)测量的scFv(PD-L1)、亲本人源化IgG1阳性对照抗体和阴性对照scFv的疏水性暴露的温度。
图13A-13D显示了，相比低温(4℃)和酸性pH(pH＝5.5)条件(图13C和13D)，在高温(40℃)和高pH(pH＝7.4)条件下全长抗PD-L1抗体和scFv(PD-L1)结合PD-L1的亲和力(图13A和13B)，。
图14显示了使用硅胶上的即时薄层色谱法测量的68Ga-NOTA-scFv的产率。
图15显示了使用硅胶上的即时薄层色谱法测量的68Ga-NOTA-scFv的纯度。
图16显示了相比MC38细胞，68Ga-NOTA-scFv结合MC38-PD-L1细胞的亲和力。
图17显示了不同浓度下抗PD-L1 IgG1对68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv结合MC38-PD-L1细胞的阻断作用。
图18显示了使用68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv对通过注射MC38-PD-L1和MC38细胞诱导的肿瘤的体内成像。
图19显示了使用68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv对通过注射MC38-PD-L1和MC38细胞诱导的肿瘤的体内成像。
图20显示的体内成像结果表明了未标记的抗PD-L1 IgG1和68Ga-NOTA-抗PD-L1scFv竞争结合PD-L1。
图21显示了注射以下物质后30分钟小鼠肿瘤的体内成像结果：68Ga-NOTA-抗PD-L1scFv、未标记的抗PD-L1 scFv和68Ga-NOTA-抗PD-L1scFv、68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv-FC(wt)(在正常相机感光度设置下)，以及68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv-FC(wt)(在正常相机的1/4相机感光度设置下)。
图22显示了注射以下物质后1小时(上图)或2小时(下图)小鼠肿瘤的体内成像结果：68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv、未标记的抗PD-L1 scFv和68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv、68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv-FC(wt)(在正常相机感光度设置下)，以及68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv-FC(wt)(在正常相机的1/4相机感光度设置下)。
图23显示了可用于螯合放射性核素并与抗体部分缀合的示例性NOTA化合物。
发明详述
本申请提供了用于个人检测免疫检查点配体的成像剂和方法。本文所述的成像剂包含用放射性核素标记的抗体部分，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体，如PD-L1或PD-L1样配体。所述抗体部分(诸如Fab、scFv、或与Fc融合的scFv)的特征是小体积和从血液和正常器官的快速清除。在一些实施方案中，所述抗体部分经工程化，以增强热稳定性。包含标记有短寿命放射性核素的这种抗体的成像剂，可有效靶向和穿透表达免疫检查点配体的患病组织。免疫检查点配体的分布和表达水平，可以通过对施用了成像剂的个体进行体内活体成像来确定。在本发明之前，基于PD-L1和其他免疫检查点配体作为生物标记物进行准确的诊断，仍然是癌症免疫治疗领域的挑战。
因此，本申请的一个方面提供了确定个体中免疫检查点配体(如PD-L1或PD-L1样配体)的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含放射性核素标记的抗体部分的成像剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；以及(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。
本申请的另一个方面提供了包含用放射性核素标记的抗体部分的成像剂，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体(如PD-L1或PD-L1样配体)。
本发明的另一个方面提供了抗PD-L1抗体试剂，其包含：含有SEQ ID NO:1的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的VH，以及含有SEQ ID NO:3的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的VL。
还提供了包含本文所述成像剂和抗PD-L1抗体试剂的组合物、试剂盒和制品及其制备方法，以及诊断或治疗患有疾病或病况(如癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病)的个体的方法。
I.定义
如本文所用，“免疫系统检查点”或“免疫检查点”是指在免疫系统中通常作用为维持自身耐受性或调节生理性免疫应答的持续时间和幅度的抑制性通路。刺激性检查点分子是刺激或正向调节免疫系统的分子，如蛋白质。抑制性检查点分子是抑制或负向调节免疫系统的分子，如蛋白质。免疫系统检查点分子包括但不限于：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡1蛋白(PD-1)、PD-L1、PD-L2、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、B7-1、B7-H3、B7-H4、T细胞膜蛋白3(TIM3)、B和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、含V结构域免疫球蛋白(Ig)的T细胞活化抑制剂(VISTA))、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和A2A腺苷受体(A2aR)。
“免疫检查点受体”是在免疫细胞(如T细胞)上表达的免疫检查点分子。
如本文所用，术语“免疫检查点配体”是指免疫检查点受体特异性识别的天然或非天然配体。天然存在的免疫检查点配体是可由病变组织(如肿瘤细胞、被感染的细胞或发炎组织)表达的免疫检查点分子，其可以调节表达免疫检查点受体的细胞，所述免疫检查点受体特异性识别所述免疫检查点配体。非天然存在的免疫检查点配体包括合成的和重组的分子，如免疫检查点受体的治疗性抑制剂、配体和抗体。非天然存在的免疫检查点配体可以引入个体中，例如通过施用于个人。免疫检查点配体可通过刺激刺激性检查点受体的活性或抑制通路中抑制性检查点受体的活性来抑制免疫检查点。示例性天然存在免疫检查点配体包括但不限于：PD-L1、PD-L2、B7-H3(也称为CD276)、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1样配体。“PD-L1样配体”是指PD-1的天然或非天然配体。
术语“抗体”以其最广泛的意义使用，并包含各种抗体结构，包括但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。术语“抗体部分”是指全长抗体或其抗原结合片段。
全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变区可以分别称为“VH”和“VL”。两条链中的可变区通常包含三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链(LC)CDR，包括：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重链(HC)CDR，包括：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界，可以由Kabat、Chothia或Al-Lazikani的公约(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia1989；Kabat 1987；Kabat 1991)界定或确认。重链或轻链的三个CDR插入在称为框架区(FRs)的侧向延伸之间，与CDR相比所述框架区的保守性更高，并且形成一个支架以支撑高变环。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。根据重链恒定区的氨基酸序列将抗体分类。抗体的五个主要类别或同种型分别是：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们的特征在于α、δ、ε、γ和μ重链的存在。几种主要的抗体类别分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(Ig4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如包括双体抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双体抗体(ds双体抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双体抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体部分形成的多特异性抗体、骆驼源化的单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体，或与抗原结合但不包含完整的抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如亲本scFv)结合的相同抗原结合。在一些实施方案中，所述抗原结合片段可包含一个或多个来自特定的人抗体的CDR，这些CDR从一种或多种不同的人抗体移植到框架区。
“Fv”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密且非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中产生了六个高变环(每个重链和轻链有3个环)，其为抗原结合提供了氨基酸残基，并赋予了抗体抗原结合特异性。但是，即使是单个可变区(或仅包含针对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)，也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接到单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，所述scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，使scFv能够形成所需的结构以进行抗原结合。有关scFv的综述参见：Plückthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双体抗体”是指通常使用VH和VL结构域之间的短接头(如约5至约10个残基)通过构建scFv片段(参见前段)制备的小抗体片段，以实现V结构域的链间配对而不是链内配对，产生双价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双体抗体是两个“交叉”scFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同多肽链上。双体抗体更详细地描述于，例如：EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”旨在表示在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定的区已描述于：Kabat et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequencesof proteins of immunological interest”(1991)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.et al.,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum etal.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan and Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.et al.,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honeggerand Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括彼此相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义指代抗体或移植抗体或其变体的CDR，均应在本文定义和使用的术语范围内。作为比较，在下表1中列出了包含每个以上引用参考文献中定义的CDR的氨基酸残基。CDR预测算法和界面是现有技术中已知的，例如，Abhinandan andMartin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.et al.,Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；以及Adolf-Bryfogle J.et al.,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。本段落中引用的参考文献的内容均通过引用整体并入本文以用于本发明，并可包含在一个或多个权利要求中。
表1：CDR定义
Figure BDA0002927805750000181
1残基编号按照上述Kabat等人的命名法
2残基编号按照上述Chothia等人的命名法
3残基编号按照上述MacCallum等人的命名法
4残基编号按照上述Lefranc等人的命名法
5残基编号按照上述Honegger和Plückthun的命名法
“Kabat中的可变区残基编号”或“Kabat中的氨基酸位置编号”的表述及其变型，是指用于上述Kabat等人汇编的抗体的重链可变区或轻链可变区的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含更少或更多的氨基酸，其对应于可变区的FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变区可包括H2的残基52之后的单个氨基酸插入(按照Kabat，残基52a)和重链FR残基82之后的插入残基(例如按照Kabat，残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号序列进行比对，确定给定抗体的残基的Kabat编号。
除非另有说明，免疫球蛋白重链中的残基编号以上述Kabat等人的EU指数为准。“Kabat中的EU指数”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的CDR残基以外的可变区残基。
术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体，而所述链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出本发明所述的生物学活性(参见，美国专利US4,816,567；以及Morrison etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
当提及抗体或抗体部分时术语“半合成”是指，具有一个或多个天然存在的序列，以及一个或多个非天然存在的(即，合成的)序列的抗体或抗体部分。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包含尽量少的源自非人抗体的序列。对于大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(HVR)的残基被来自非人物种(供体抗体)的高变区残基替换，所述非人物种如具有所需的抗体特异性、亲和力和性能的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含不存在于受体抗体或供体抗体的残基。这些修饰是为了进一步完善抗体性能。一般而言，人源化抗体将基本上包含所有可变区中的至少一个、以及通常两个，其中所有或几乎所有的高变环都对应于非人球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有FR都是人免疫球蛋白序列的FR。所述人源化抗体还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白恒定区。更多详细信息，参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人抗体”是指具有与人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体，和/或已经使用本文公开的用于制备人抗体的任何技术制成的抗体。该人抗体的定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的多种技术来生产人抗体，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。还提供了可用于制备人单克隆抗体的方法，其描述于：Coleet al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。另参见，van Dijk and van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可以通过向经修饰的转基因动物施用所述抗原来制备人抗体，所述转基因动物经修饰在对抗原刺激应答时产生这样的抗体，但其内源基因座已失能，例如，经免疫的Xeno小鼠(关于XENOMOUSETM技术，参见例如，美国专利US6,075,181和US6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，另参见例如，Liet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
关于本文确定的多肽和抗体序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”或“同源性”定义为，在序列比对后，候选序列中与被比较的多肽中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比，所述比对将任何保守替换作为序列同一性一部分。例如，可以使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件，以本领域技术人员已知的各种方法进行比对，以确定氨基酸序列同一性的百分比。本领域熟练技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在整个待比较序列的全长上达到最大比对所需的任何算法。但是，本文出于此目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE产生％氨基酸序列同一性(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMCBioinformatics 5(1):113,2004)。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较的序列的两个位置均被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子各自中的一个位置均被腺嘌呤占据时，则所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是由两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数再乘以100的函数。例如，如果两个序列中的10个位置中有6个匹配或同源，则所述两个序列的同源性为60％。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％同源性。通常，在将两个序列对齐时进行比较，以获得最大同源性。
术语“恒定区”是指相对于免疫球蛋白的另一部分(包含抗原结合位点的可变区)，具有更多保守氨基酸序列的免疫球蛋白分子部分。恒定区包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)，以及轻链的CHL(或CL)结构域。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可以根据其恒定区的氨基酸序列归类为两种明显不同的类型中的一种，分别称为κ和λ。
人IgG Fc区的“CH1结构域”(也称为“H1”结构域的“C1”)，通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号系统)。
通常将“铰链区”定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，可以将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列对齐。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“H2”结构域的“C2”)，通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域的唯一性在于，它与另一个结构域没有紧密配对。而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入了两条N连接的分支碳水化合物链。据推测，所述碳水化合物可能会替代域-域配对，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3结构域”(也称为“C2”或“H3”结构域)包括Fc区中残基C端向CH3结构域的延申(即从约氨基酸残基341至抗体序列的C端，通常在IgG的氨基酸残基446或447)。
术语“Fc区”或“可结晶片段区”在本文用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但通常将人IgG重链Fc区定义为从位置Cys226或Pro230的氨基酸残基延伸至其羧基端。可以去除Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统，残基447)，例如在抗体生产或纯化过程中，或通过重组改造编码抗体重链的核酸。因此，完整抗体的组成可包括去除了所有K447残基的抗体群，没有去除K447残基的抗体群，以及带有或没有K447残基的抗体混合物的抗体群。适用于本文所述抗体的天然序列Fc区包括：人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”是指与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，首选的FcR是与IgG抗体(γ受体)结合的抗体，其包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和替代性剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，其主要不同之处在于其胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见，M.
Figure BDA0002927805750000211
Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。有关FcR的综述参见：Ravetchand Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；以及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995))。其他FcR，包括那些在未来被确定的FcR，均被本文的术语“FcR”所涵盖。
如本文所用，术语“表位”是指与抗体或抗体部分结合的抗原上特定的原子或氨基酸基团。如果两个抗体或抗体部分表现出对抗原的竞争性结合，则它们可以结合抗原内相同的表位。
如本文所用，在等摩尔浓度的第一抗体部分存在时，当第一抗体部分抑制第二抗体部分的目标抗原结合至少约50％(如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中的任一个)时，第一抗体部分与第二抗体部分“竞争”结合目标抗原，或反之亦然。在PCT公开WO03/48731中描述了基于它们的交叉竞争“结合”抗体的高通量方法。
如本文所用，术语“特异性结合”，“特异性识别”和“对…具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其为异源分子群(包括生物分子)存在下确定靶标存在的决定因素。例如，特异性识别靶标(可以是表位)的抗体或抗体部分，是相比与其它靶标的结合，与该靶标具有更大亲和力、亲合性，与该靶标的结合更容易和/或更持久。在一些实施方案中，例如通过放射免疫测定法(RIA)，测得抗体与无关靶标的结合程度小于抗体与靶标结合程度的约10％。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗体的解离常数(KD)为：≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10- 12M。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合在不同物种的蛋白中保守的蛋白表位。在一些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性结合。抗体或抗原结合域的结合特异性，可以通过本领域已知的方法实验确定。此类方法包括但不限于：Western印迹法、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIACORETM测试和肽扫描。
“分离的”抗体(或构建体)是从其生产环境(例如天然或重组)的组分中鉴定、分离和/或回收的。优选地，分离的多肽与它的生产环境中的所有其他组分没有结合。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子，是经鉴定并与通常在其产生的环境中和其结合的至少一种污染物核酸分子分离的核酸分子。优选地，分离的核酸与所有与生产环境有关的组分没有结合。编码本文所述的多肽和抗体的分离的核酸分子的形式，不同于其在自然界发现的形式或环境。因此，分离的核酸分子不同于细胞中天然存在的编码本文所述的多肽和抗体的核酸。分离的核酸包括在通常包含核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外，或处在与天然染色体位置不同的染色体位置。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，包括例如启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞可利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，则该核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该序列可操作地连接至所述多肽的DNA。如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该序列；或者，如果核糖体结合位点被定位以便进行翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的，以及在阅读阶段是连续的。但是，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点进行连接可以完成连接。如果不存在此类位点，则应按照常规做法使用合成的寡核苷酸适配子或接头。
如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另一种核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合到其所引入的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。本文将此类载体称为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染的”、“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”、“转化的”或“转导的”细胞是用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代的对象细胞及其后代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并指引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化株”和“转化细胞”，其包括原始转化细胞及其衍生的子代，而与传代次数无关。子代与亲本细胞中的核酸含量可能不完全相同，但可能包含突变。在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体子代也包括在内。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”是一种获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下一个或多个结果：减轻由疾病引起的一种或多种症状，减少疾病的程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的扩散(例如转移)，预防或延迟疾病的复发，延缓或减慢疾病的进展，改善疾病况态，缓解疾病(部分或全部)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延缓疾病的进展，增加或改善生活质量，增加体重和/或延长生存期。还包括通过“治疗”来减少癌症的病理后果(例如，肿瘤体积)。本发明的方法考虑了这些治疗方面中任一个或多个。
在癌症的语境中，术语“治疗”包括以下任何一项或全部：抑制癌细胞的生长、抑制癌细胞的复制、减轻总体肿瘤负荷并缓解一种或多种与疾病相关的症状。
在自身免疫疾病的语境中，术语“治疗”包括以下任何一项或全部：防止与自身免疫疾病相关的细胞复制，包括但不限于：能够产生自身免疫抗体的细胞，减轻自身免疫抗体负荷并改善自身免疫疾病的一种或多种症状。在传染性疾病的语境中，术语“治疗”包括以下任何一项或全部：防止导致传染性疾病的病原体的生长、繁殖或复制，并减轻一种或多种传染性疾病的症状。在缺血性疾病的语境中，术语“治疗”包括以下任何一项或全部：防止导致缺血性疾病的病原体的生长、繁殖或复制，并减轻一种或多种缺血性疾病的症状。
术语“抑制(inhibition/inhibit)”是指任何表型特征的降低或停止，或指该特征的发生率、程度或可能性的降低或停止。与参考相比，“减少”或“抑制”是指降低、减少或阻止活性、功能和/或数量。在一些实施方案中，“减少”或“抑制”是指能够整体降低20％或更多。在另一个实施方案中，“减少”或“抑制”是指能够整体降低50％或更多。在另一个实施方案中，“减少”或“抑制”是指能够整体降低75％、85％、90％、95％或更多。
如本文所用，“参照”是指用于比较目的的任何样品、标准或水平。可以从健康和/或未患病的样品中获得参照。在某些实例中，可能会从未经处理的样品中获得参照。在某些实例中，从受试者个体的未患病或处理的样品中获得参照。在某些实例中，从非受试者或患者的一个或多个健康个体那里获得参照。
如本文所用，“延缓疾病的发展”是指延迟、阻碍、减慢、阻止、稳定、抑制和/或推迟疾病(如癌症)的发展。根据疾病和/或个体的治疗史，此延迟的时间长度可能会有所不同。显然，对本领域技术人员来说，足够的或明显的延迟可实际上涵盖预防，此时个体没有患上这种疾病。例如，可能会延迟晚期癌症的发展，如转移的发展。
如本文所用，“预防”包括针对可能有某种疾病倾向而未被诊断为该疾病的个体的疾病发生或复发提供预防。
如本文所用，“抑制”功能或活动是指在与其他相同条件(目标条件或参数除外)相比时减少功能或活性。例如，相比没有该抗体时肿瘤的生长速度，抑制肿瘤生长的抗体降低了肿瘤的生长速度。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述个体是人。
“有效量”的药剂是指以用法和必要的时间周期达到所需的治疗或预防效果的有效用量。该术语还适用于通过本文所述的成像方法中的任一种提供图像以进行检测的剂量。具体剂量可能会基于以下一个或多个而变化：选择的特定试剂，随后的剂量方案，是否与其他化合物结合使用，施用时间，待成像的组织，以及在其中递送该试剂的物理递送系统。
“治疗有效量”的本发明物质/分子、激动剂或拮抗剂，可能会根据一些因素如个体的疾病状态、年龄、性别或重量，以及所述物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引起期望的应答的能力而有所不同。治疗有效量也是其中所述物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益作用超过其任何毒性或有害作用的量。治疗有效量可以通过一次或多次施用来递送。
“预防有效量”是指以用法和必要的时间周期达到所需的预防效果的有效用量。通常，但不是必须的，由于预防剂量在疾病发生之前或早期用于受试者，因此该预防有效量将小于治疗有效量。
术语“药物制剂”和“药物组合物”是指这样的制剂，其形式允许有效成分的生物活性是有效的，且不含任何对要施用该制剂的受试者来说不能接受的附加成分。该制剂可为无菌的。
在本领域中，“药学上可接受的载体”是指本领域常规使用的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、制剂助剂或载体，其与治疗剂一起组成施用于受试者的药物组合物。药学上可接受的载体在应用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且与制剂中的其他成分兼容。所述药学上可接受的载体适用于所应用的制剂。
“无菌”制剂是无菌的或基本上不含活微生物及其孢子。
与一种或多种其他治疗剂“联合施用”，包括以任何顺序同时(并行)以及连续或依次施用。
如本文所用，术语“并行地”是指施用两种或更多种治疗剂，其中至少一部分施用在时间上重叠，或者其中施用一种治疗剂落入与施用另一种治疗剂相关的短期时间内。例如，两种或更多种治疗剂施用的间隔时间不超过60分钟，如不超过30、15、10、5或1分钟中的任一个。
如本文所用，术语“依次”是指施用两种或更多种治疗剂，其中在终止施用一种或多种药剂后继续施用一种或多种其他药剂。例如，施用两种或更多种治疗剂的施用时间间隔为大于约15分钟，如约20、30、40、50或60分钟，1天、2天、3天、1周、2周或1个月，或更长时间。
如本文所用，“与...结合使用”是指除施用一种治疗方式外，还施用另一种治疗方式。因此，“与...结合使用”是指在对个体施用一种治疗方式之前、期间或之后，施用另一种治疗方式。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的使用说明，其包含有关适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症和/或涉及治疗性产品应用的警告方面的信息。
“制品”是指包含至少一种试剂，例如用于治疗疾病或病症(如癌症)的药物，或用于特异性检测本文所述生物标志物的探针的任何制品(例如，包装或容器)或试剂盒。在一些实施方案中，所述制品或试剂盒作为执行本文所述方法的单元进行促销、分发或销售。
应当理解，本文所述发明的实施方案包括“由...组成”和/或“基本上由...组成”的实施方案。
本文提及的“约”值或参数，包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及“约X”的描述，包括“X”的描述。
如本文所用，提及“非”值或参数，通常是指“该值或参数以外的值”。例如，不用于治疗X型癌症的方法，是指该方法用于治疗X型以外的其他类型的癌症。
如本文所用，术语“约X-Y”的含义与“约X至约Y”相同。
如本文以及所附权利要求书中所用，除非上下文中另有明确规定，单数形式的“一个/种(a/an)”和/或“所述/该(the)”包括复数指称。
II.成像方法
本申请的一个方面提供了使用包含用放射性核素标记的抗体部分的成像剂，确定个体中免疫检查点配体的分布和/或表达水平的方法，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体。在一些实施方案中，所述方法包括确定个体中两个或更多个免疫检查点配体的分布和/或表达水平。
在一些实施方案中，提供了确定个体中免疫检查点配体的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗体部分的成像剂，其中该抗体片段特异性结合所述免疫检查点配体；以及(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中的免疫检查点配体的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记抗体部分来制备所述成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前向所述个体施用未用放射性同位素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体部分在血清中的半衰期为约10分钟至约24小时(诸如约10分钟至2小时，1小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，或12小时至24小时中任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分不超过约120kDa(如不超过约30kDa、50kDa、80kDa或100kDa，或约30-50kDa、50-100kDa或30-80kDa中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分选自：单链Fv(scFv)、双体抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。
在一些实施方案中，提供了确定个体中免疫检查点配体的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的scFv的成像剂，其中所述scFv特异性结合所述免疫检查点配体；以及(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中的免疫检查点配体的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记scFv来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的scFv。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述scFv与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述scFv与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述scFv与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述scFv是人源化的。在一些实施方案中，所述scFv在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述scFv的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VH、任选的肽接头和VL。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，该肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，提供了确定个体中免疫检查点配体的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗体部分的成像剂，其中所述抗体部分为与Fc片段融合的scFv，且其中所述抗体片段特异性结合所述免疫检查点配体；以及(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中的免疫检查点配体的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记所述抗体部分来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VH、任选的肽接头和VL。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，该肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，提供了确定个体中PD-L1的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗体部分(例如scFv)的成像剂，其中该抗体片段特异性结合PD-L1；以及(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中PD-L1的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记所述抗体部分来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体成像。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体在血清中的半衰期为约10分钟至约24小时(如约10分钟至2小时，1小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，或12小时至24小时中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分不超过约120kDa(如不超过约30kDa、50kDa、80kDa或100kDa，或者约30-50kDa、50-100kDa或30-80kDa中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分在酸性pH下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH下)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中任一个)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分选自：单链Fv(scFv)、双体抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是与Fc融合的scFv。
在一些实施方案中，提供了确定个体中PD-L1样配体的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗体部分(例如scFv)的成像剂，其中该抗体片段特异性结合PD-L1样配体；以及(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述PD-L1样配体是天然的PD-1配体。在一些实施方案中，所述PD-L1样配体是非天然的PD-1配体，且其中所述PD-L1样配体已施用于所述个体。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中的PD-L1样配体的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记所述抗体部分来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体部分在血清中的半衰期为约10分钟至约24小时(如约10分钟至2小时，1小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，或12小时至24小时中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分不超过约120kDa(如不超过约30kDa、50kDa、80kDa或100kDa，或者约30-50kDa、50-100kDa或30-80kDa中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中任一个)。在一些实施方案中，所述抗-抗体部分选自：单链Fv(scFv)、双体抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是与Fc融合的scFv。
在一些实施方案中，提供了确定个体中PD-L1的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗PD-L1抗体部分的成像剂；以及(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像，其中所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，其中所述变体含有至多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，其中所述变体含有至多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中PD-L1的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记所述抗体部分来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含：VH和VL，其中VH包含SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性；以及VL包含SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。
在一些实施方案中，提供了确定个体中PD-L1的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗PD-L1 scFv的成像剂；以及(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像，其中所述抗PD-L1scFv包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，其中所述变体含有至多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，其中所述变体含有至多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中PD-L1的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记抗体部分来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含：VH和VL，其中VH包含SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性；以及VL包含SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含SEQID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ IDNOs:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％中的任一个)序列同一性。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。
在一些实施方案中，提供了确定个体中PD-L1的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗PD-L1抗体部分的成像剂；以及(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像，其中所述抗PD-L1抗体部分包含与Fc片段融合的抗PD-L1 scFv，且其中所述抗PD-L1scFv包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，其中所述变体含有至多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，其中所述变体含有至多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中PD-L1的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记抗体部分来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含：VH和VL，其中VH包含SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性；以及VL包含SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQID NOs:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％中的任一个)序列同一性。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。
本文所述的方法可用于确定个体或个体的目标组织中免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)的分布。所述方法还可以针对个体的一个或多个组织或器官中免疫检查点配体的表达水平提供定性或定量信息。另外，本文所述的方法可以在一段时间内对所述个体进行成像，例如，通过在向个体施用成像剂后，在不同的时间点提供多组成像结果。在一些实施方案中，在约10分钟至约24小时(诸如约10分钟至1小时，1小时至2小时，2小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，12小时至24小时，1小时至4小时，或1小时至8小时中任一个)期间进行至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次成像。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像，例如约10分钟至1小时，1小时至2小时，2小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，12小时至24小时，1小时至4小时，或1小时至8小时中的任一个期间。
使用标记的多肽进行成像的方法是本领域众所周知的，并且本文中公开的成像剂可以和任何此类已知方法一起使用。参见例如，Srivastava(ed.),RadiolabeledMonoclonal Antibodies for Imaging and Therapy(Plenum Press1988),Chase,"Medical Applications of Radioisotopes,"in Remington's PharmaceuticalSciences,18th Edition,Gennaro et al.(eds.),pp.624-652(Mack Publishing Co.,1990),以及Brown,"Clinical Use of Monoclonal Antibodies,"in Biotechnology andPharmacy 227-49,Pezzuto et al.(eds.)(Chapman&Hall1993)。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术使用发射正电子的放射性核素(PET同位素)，例如能量为约511keV，如18F、68Ga、64Cu和124I。可以通过众所周知的PET扫描技术对此类放射性核素进行成像。另参见美国专利US6,953,567、US9,884,131和国际专利申请公开WO2016149188A1，以及Kim HY.etal.,(2018)PLoS ONE 13(3):e0192821，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，SPEC或PET成像与一种或多种其他非侵入性成像方法结合，这些方法可基于或不基于来自成像剂的信号。例如，PET可以与计算机断层扫描(CT)成像、磁共振成像(MRI)、化学发光成像或电化学发光成像结合。
本文所述的成像方法适用于检测低、中或高表达水平的免疫检查点配体。在一些实施方案中，所述成像方法提供了有关免疫检查点配体的表达水平和分布的动态信息。在一些实施方案中，在可能对其他检测方法如免疫组织化学(IHC)法具有挑战性的情况下，所述成像方法能够检测免疫检查点配体。在一些实施方案中，例如，基于免疫组织化学(IHC)测定或其他测定，所述目标组织为免疫检查点配体阴性。可以用于检测是否存在免疫检查点配体的分子测定法，包括但不限于：基于聚合酶链反应(PCR)的测定，下一代测序(NGS)测定、杂交测定和ELISA。在一些实施方案中，所述目标组织的免疫检查点配体表达水平较低。在一些实施方案中，所述目标组织仅在免疫细胞浸润时表达所述免疫检查点配体。
可以使用任何合适的剂量和施用途径向个体施用成像剂。施用途径是根据已知的和公认的方法，如以合适的方式通过单次或多次推注或输注一段时间，例如经皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内、关节内、肿瘤内或口服途径的注射或输注。确定适当的剂量或施用途径，应在普通技术人员的技能范围内。动物实验为确定人类诊断应用的有效剂量提供了可靠的指导。可以按照以下文献中建立的原则进行种间有效剂量的扩展：Mordenti,J.and Chappell,W.“The Use of Interspecies Scaling inToxicokinetics,”In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi et al.,Eds,Pergamon Press,New York 1989,pp.42-46。
诊断与治疗
本文所述方法可用于诊断，并作为伴随诊断方法来治疗与异常免疫反应相关的多种疾病和病况。在一些实施方案中，所述疾病或病况与免疫缺陷有关。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，提供了诊断患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)使用本文所述的任一种确定免疫检查点配体的分布的方法确定所述个体中免疫检查点配体的分布；以及(b)如果在目标组织中检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阳性；或者如果在目标组织中未检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。
在一些实施方案中，提供了诊断患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗体部分的成像剂，其中该抗体片段特异性结合所述免疫检查点配体；(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像；以及(c)如果在目标组织中检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阳性；或者如果在目标组织中未检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中的免疫检查点配体的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记抗体部分来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体部分在血清中的半衰期为约10分钟至约24小时(如约10分钟至2小时，1小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，或12小时至24小时中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分不超过约120kDa(如不超过约30kDa、50kDa、80kDa或100kDa，或者约30-50kDa、50-100kDa或30-80kDa中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60℃、60-65℃或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分选自：单链Fv(scFv)、双体抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段(如人IgG1Fc)融合的scFv。
在一些实施方案中，提供了诊断患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗PD-L1抗体部分的成像剂；(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像；以及(c)如果在目标组织中检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为PD-L1阳性；或者如果在目标组织中未检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性；其中所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中所述成像剂发出的信号，确定所述组织中PD-L1的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记抗体部分来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段(如人IgG1 Fc)融合的scFv。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含SEQ IDNOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ IDNOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。
在一些实施方案中，提供了治疗患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)使用任一种本文所述的诊断方法诊断所述个体；和(b)如果诊断出所述个体为免疫检查点配体阳性，则向所述个体施用有效量的靶向所述免疫检查点配体或其受体的治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是免疫检查点配体或其受体的抑制剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是特异性结合免疫检查点或其受体的放射性标记分子。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1样配体。
在一些实施方案中，提供了治疗患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗体部分的成像剂，其中该抗体片段特异性结合所述免疫检查点配体；(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像；(c)如果在目标组织中检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阳性；或者如果在目标组织中未检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性；以及(d)如果诊断出所述个体为免疫检查点配体阳性，则向所述个体施用有效量的靶向所述免疫检查点配体或其受体的治疗剂(例如，所述免疫检查点配体或其受体的抑制剂，或者特异性结合所述免疫检查点配体或其受体的放射性标记的分子)。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中的成像剂发出的信号，确定所述组织中的免疫检查点配体的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记所述抗体部分来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体部分在血清中的半衰期为约10分钟至约24小时(如约10分钟至2小时，1小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，或12小时至24小时中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分不超过约120kDa(如不超过约30kDa、50kDa、80kDa或100kDa，或者约30-50kDa、50-100kDa或30-80kDa中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60℃、60-65℃或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分选自：单链Fv(scFv)、双体抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段(如人IgG1Fc)融合的scFv。
在一些实施方案中，提供了治疗患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含用放射性核素标记的抗PD-1抗体部分的成像剂；(b)使用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像；(c)如果在目标组织中检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为PD-L1阳性；或者如果在目标组织中未检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性；以及(d)如果诊断出所述个体为PD-L1阳性，则向所述个体施用有效量的靶向PD-L1或PD-1的治疗剂(例如，PD-L1或PD-1的抑制剂，诸如抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体，或者特异性结合PD-L1或PD-1的放射性标记的分子)，其中所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中所述成像剂发出的信号，确定所述组织中PD-L1的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括通过用放射性核素标记抗体部分来制备成像剂。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述成像剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。在一些实施方案中，在施用成像剂后约10分钟至约24小时进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用成像剂之前，向所述个体施用未用放射性核素标记的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段(如人IgG1 Fc)融合的scFv。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。
在一些实施方案中，所述个体患有癌症。所述癌症可包含非实体瘤(如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包含实体瘤。可使用本文所述方法诊断的示例性癌症包括但不限于：恶性上皮瘤、胚细胞瘤和肉瘤，以及一些白血病或淋巴系统恶性肿瘤，可以是良性和恶性肿瘤，其中恶性肿瘤例如肉瘤、恶性上皮瘤和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。本文讨论的实体瘤或血液癌症包括但不限于：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肉瘤和恶性上皮瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏(Wilm's')肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌和黑素瘤。
根据美国联合癌症委员会(AJCC)分期小组的要求，本文所述方法适用于所有时期(包括I、II、III和IV期)的实体瘤或血液癌症。在一些实施方案中，所述实体瘤或血液癌症是：早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或缓解期癌症。
在一些实施方案中，所述个体患有血液癌症。可以使用本文所述的方法诊断的示例性血液癌症包括但不限于：白血病、淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性非淋巴细胞白血病(ANLL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤。可以使用本文所述的方法诊断的示例性实体瘤，包括但不限于：结肠肿瘤、黑素瘤、肾脏肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤和胰腺肿瘤。
可以通过例如肿瘤消退、肿瘤重量或大小的缩小、进展时间、生存持续时间、无进展生存、整体应答率、应答持续时间、生活质量、蛋白表达和/或活性来评估癌症治疗。可以采用确定治疗功效的方法，包括例如，通过放射性成像来测量应答。
在一些实施方案中，所述个体患有传染性疾病。所述感染可能是由病毒、细菌、原生动物或寄生虫引起的。示例性病原体包括但不限于：鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、无形体(Anaplasma)属、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、巴西钩虫(Ancylostoma braziliense)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、溶血隐秘杆菌(Arcanobacterium haemolyticum)、蛔虫(Ascaris lumbricoides)、曲霉(Aspergillus)属、星状病毒科(Astroviridae)、巴贝虫(Babesia)属、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、亨氏巴尔通体(Bartonella henselae)、BK病毒、人芽囊原虫(Blastocystis hominis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、疏螺旋体(Borrelia)属、疏螺旋体(Borrelia spp)、布鲁氏杆菌(Brucella)属、马来丝虫(Brugiamalayi)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)和其他伯克霍尔德菌种、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、杯状病毒科(Caliciviridae)、弯曲杆菌(Campylobacter)属、白色念珠菌(Candida albicans)、念珠菌(Candida spp)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、CJD朊病毒、华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、产气荚膜梭菌、梭菌(Clostridium spp)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、球孢子菌(Coccidioides spp)、冠状病毒、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、伯氏柯克斯体(Coxiella burnetii)、克里米亚-刚果出血热病毒、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、隐孢子虫(Cryptosporidium)属、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、脆双核阿米巴(Dientamoebafragilis)、埃博拉病毒(EBOV)、棘球绦虫(Echinococcus)属、查菲埃立克体(Ehrlichiachaffeensis)、尤因埃立克体(Ehrlichia ewingii)、埃立克体(Ehrlichia)属、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、肠球菌(Enterococcus)属、肠病毒属、肠病毒(主要是柯萨奇A病毒和肠病毒71(E71))、表皮癣菌(Epidermophyton spp)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7、O111和O104:H4、肝片吸虫(Fasciola hepatica)和大片吸虫(Fasciola gigantica)、FFI朊病毒、丝虫目(Filarioidea)总科、黄病毒(Flaviviruses)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、梭杆菌(Fusobacterium)属、白地霉(Geotrichum candidum)、肠贾第虫(Giardia intestinalis)、颚口线虫(Gnathostoma spp)、GSS朊病毒、瓜纳里多(Guanarito)病毒、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、亨尼巴病毒(Henipavirus)(Hendra virus Nipah virus,亨德拉病毒和尼帕病毒)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、HIV(人类免疫缺陷病毒)、威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)、人博卡病毒(HBoV)、人疱疹病毒6(HHV-6)和人疱疹病毒7(HHV-7)、人偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人副流感病毒(HPIV)、人T细胞白血病病毒1(HTLV-1)、日本脑炎病毒、JC病毒、胡宁(Junin)病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、金格杆菌(Kingella kingae)、肉芽肿杆菌(Klebsiella granulomatis)、克鲁(Kuru)朊病毒、拉沙热(Lassa)病毒、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、利什曼虫(Leishmania)属、细螺旋体(Leptospira)属、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒(LCMV)、马秋博(Machupo)病毒、马拉色霉菌(Malassezia spp)、马尔堡(Marburg)病毒、麻疹病毒、横川后殖吸虫(Metagonimus yokagawai)、微孢子门(Microsporidia phylum)、接触传染性软疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和麻风分枝杆菌新种(Mycobacterium lepromatosis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、福氏耐格原虫(Naegleria fowleri)、美洲板口线虫(Necator americanus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、星形诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)、诺卡氏菌(Nocardia spp)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(流感)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、并殖吸虫(Paragonimus spp)、肺吸虫(Paragonimuswestermani)、细小病毒B19、巴氏杆菌(Pasteurella)属、疟原虫(Plasmodium)属、杰氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、鼻病毒、小蛛立克次氏体(Rickettsia akari)、立克次氏体(Rickettsia)属、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)、裂谷热(Rift Valley Fever)病毒、轮状病毒、风疹病毒、沙比亚(Sabia)病毒、沙门氏菌属、疥螨(Sarcoptes scabiei)、SARS冠状病毒、血吸虫(Schistosoma)属、志贺氏菌(Shigella)属、辛农布雷(Sin Nombre)病毒、汉坦病毒、申氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、葡萄球菌(Staphylococcus)属、葡萄球菌属、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、绦虫(Taenia)属、猪肉绦虫(Taenia solium)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、犬弓蛔虫(Toxocara canis)或猫弓蛔虫(Toxocara cati)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、梅毒螺旋体(Treponemapallidum)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、毛癣菌(Trichophyton spp)、毛首鞭虫(Trichuris trichiura)、布鲁氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克鲁氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、大天花病毒或小天花病毒、vCJD朊病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、霍乱弧菌、西尼罗河病毒、西方马脑炎病毒、班氏吴策线虫(Wuchereriabancrofti)、黄热病毒、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)。
在一些实施方案中，所述个体患有自身免疫性疾病。示例性的自身免疫性疾病，包括但不限于：白塞氏病、全身性红斑狼疮、多发性硬化(全身性硬皮病和进行性全身性硬皮病)、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎(结节性多动脉炎和显微镜下多血管炎)、主动脉炎综合征(多发性大动脉炎)、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、韦格纳(Wegner's)肉芽肿、混合性结缔组织病、干燥综合征(Sjogren Syndrome)、成人斯蒂尔(Still’s)病、变应性肉芽肿性脉管炎、过敏性脉管炎、科根(Cogan’s)综合征、RS3PE、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛综合征、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、与IgG4相关的疾病(例如，原发性硬化性胆管炎和自身免疫性胰腺炎)、格林-巴利(Guillain-Barre)综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化，主动脉炎综合征、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、快速进行性肾小球肾炎、巨幼细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、格雷夫斯(Graves)病(甲状腺功能亢进症)、桥本氏(Hashimoto's)甲状腺炎、自身免疫性肾上腺功能不全、原发性甲状腺功能减退症、特发性阿狄森氏病(慢性肾上腺功能不全)、I型糖尿病、慢性盘状红斑狼疮、局部硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线状IgA大疱性皮肤病、后天性大疱性表皮松解、斑秃、白癜风、原田病、自身免疫性视神经病变、特发性精子缺乏症、复发性流产和炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩病)。
在一些实施方案中，所述个体患有与异常免疫反应相关的代谢性疾病。示例性代谢性疾病，包括但不限于：炎性肠病、多发性硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮。
III.成像剂
本申请的一个方面提供了成像剂，其包含用放射性核素标记的抗体部分，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体。本节中所述的任何一种成像剂都可以用于确定免疫检查点配体的分布和/或表达水平的方法，或本文所述的诊断或治疗方法。
在一些实施方案中，提供了包含用放射性核素标记的抗体部分的成像剂，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体部分在血清中的半衰期为约10分钟至约24小时(如约10分钟至2小时，1小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，或12小时至24小时中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分不超过约120kDa(例如不超过约30kDa、50kDa、80kDa或100kDa，或者约30-50kDa、50-100kDa或30-80kDa中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分选自：单链Fv(scFv)、双体抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。
在一些实施方案中，提供了包含与螯合放射性核素的螯合化合物缀合的抗体部分的成像剂，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体部分在血清中的半衰期为约10分钟至约24小时(如约10分钟至2小时，1小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，或12小时至24小时中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分不超过约120kDa(例如不超过约30kDa、50kDa、80kDa或100kDa，或约30-50kDa、50-100kDa或30-80kDa中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分选自：单链Fv(scFv)、双体抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。
在一些实施方案中，本文所述的抗体部分具有适于从体内快速清除的血清半衰期，适合在体内进行成像。在一些实施方案中，所述抗体的血清半衰期不超过约24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时、30分钟中的任一个，或更短的时间。在一些实施方案中，所述抗体部分的血清半衰期为约10分钟至约24小时，例如，包括以下中的任一个：约10分钟至约30分钟，约30分钟至约1小时，1小时至约2小时，约2小时至约3小时，约3小时至约4小时，约4小时至约6小时，约6小时至约8小时，约8小时至约12小时，约12小时至约16小时，约16小时至约20小时，约20小时至约24小时，约10分钟至约2小时，约1小时至约4小时，约4小时至约8小时，约8小时至约12小时，或约12小时至约24小时。在一些实施方案中，从体内清除所述抗体部分的时间不超过选自以下的任一个：48小时、36小时、30小时、24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、4小时、2小时、1小时、30分钟，或更少的时间。在一些实施方案中，从体内清除所述抗体部分的时间为：约10分钟至约48小时，例如包括以下中的任一个：约10分钟至约30分钟，约30分钟至约1小时，约1小时至约2小时，约2小时至约3小时，约3小时至约4小时，约4小时至约6小时，约6小时至约8小时，约8小时至约12小时，约12小时至约16小时，约16小时至约20小时，约20小时至约24小时，约24小时至约36小时，约36小时至约48小时，约10分钟至约2小时，约1小时至约4小时，约4小时至约8小时，约8小时至约12小时，或约12小时至约48小时。
在一些实施方案中，所述抗体部分具有较低的分子量，使得其可以从体内快速清除。在一些实施方案中，所述抗体部分的分子量不超过选自以下的任一个：约120kDa、110kDa、100kDa、90kDa、80kDa、70kDa、60kDa、50kDa或30kDa。在一些实施方案中，所述抗体部分的分子量为约15kDa至约30kDa，约30kDa至约50kDa，约50kDa至约100kDa，约80kDa至约120，或约15kDa至约120kDa。例如，scFv的分子量为约27kDa，Fc的分子量为约26kDa，以及scFv-Fc的分子量为约80kDa。
在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体具有适当的亲和力。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体结合的KD大于选自以下中的任一个：约10-8M、9×10-9M、8×10-9M、7×10-9M、6×10-9M、5×10-9M、4×10-9M、3×10-9M、2×10-9M、1×10-9M或9×10-10M。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体结合的KD小于选自以下中的任一个：约9×10-10M、1×10-9M、2×10-9M、3×10-9M、4×10-9M、5×10-9M、6×10-9M、7×10-9M、8×10-9M、9×10-9M或10-8M。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体结合的KD为以下中的任一个：约9×10-10M至1×10-8M，9×10-10M至1×10-9M，1×10-9M至2×10-9M，2×10-9M至3×10-9M，3×10-9M至4×10-9M，4×10-9M至5×10-9M，5×10-9M至6×10-9M，6×10-9M至7×10-9M，7×10-9M至8×10-9M，8×10-9M至9×10-9M，9×10-9M至1×10-8M，2×10-10至5×10-9，或5×10-10至1×10-8。
在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH或中性pH下稳定。在一些实施方案中，所述抗体部分在低于约7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0或更低的pH值下稳定。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性或中性pH下稳定至少以下时间中的任一个：约4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天或更长时间。在一些实施方案中，所述抗体部分在碱性pH值下是稳定的，例如在pH值高于约7.0、7.5、8.0、8.5或更高的情况下。在一些实施方案中，所述抗体部分在碱性pH值下稳定至少以下时间中的任一个：约4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、3天、5天、7天或更长时间。可以通过将成像剂或抗体部分在具有相应pH值的缓冲液中孵育一段时间(如12小时、24小时或更长时间)，并使用现有技术中已知的方法(包括SDS-PAGE、动态光散射、色谱法、NMR等)评估所述成像剂或抗体部分的完整性，从而测量其稳定性。
在一些实施方案中，所述抗体部分在升高的温度下(例如在室温或生理温度下)是稳定的。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度至少为：约50℃、55℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或更高。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度为约55℃至约70℃，例如包括以下中的任一个：约55℃-60℃，60℃-65℃，50℃-65℃，64℃-68℃，或65℃-70℃。可以使用本领域中任何已知的方法，包括例如差示扫描荧光法(DSF)，测量抗体部分的融解温度。
在一些实施方案中，使用一个或多个二硫键对所述抗体部分进行工程化，以提高抗体部分的熔解温度或稳定性。在一些实施方案中，所述抗体部分包含scFv，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。基于scFv的结构和序列，通过在适当的位置对VH中的半胱氨酸和VL中的半胱氨酸进行工程化改造，可将其他工程化的二硫键引入到所述scFv中。
考虑的抗体部分，包括但不限于：人源化抗体、部分人源化抗体、完全人源化抗体、半合成抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、人抗体和包含本文(例如“抗PD-L1抗体试剂”小节)讨论的重链和/或轻链CDR的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体部分特异性识别来自人的免疫检查点配体。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自两个或更多物种的免疫检查点配体交叉反应。所述抗体部分与动物模型和人的的交叉反应性有助于所述成像剂的临床研究。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人动物(如哺乳动物)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自啮齿类动物(如小鼠或大鼠)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人灵长类动物(如食蟹猴)的免疫检查点配体交叉反应。
在一些实施方案中，所述抗体部分是抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体部分不是全长抗体。合适的抗体部分包括但不限于：scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH以及其Fc融合物。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。适用于本文所述成像剂的抗体片段和变体在“抗体部分”小节中进一步介绍。在一些实施方案中，所述抗体部分是Fab。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段融合的scFv。
因此，在一些实施方案中，提供了包含用放射性核素标记的scFv成像剂，其中所述scFv特异性结合免疫检查点配体。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述scFv与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述scFv与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述scFv与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述scFv是人源化的。在一些实施方案中，所述scFv在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述scFv的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VH、任选的肽接头和VL。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，该肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，提供了包含用放射性核素标记的抗体部分的成像剂，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体，并且其中所述抗体部分是与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VH、任选的肽接头和VL。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，该肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，提供了成像剂，其包含与标记的螯合放射性核素(例如68Ga)的螯合化合物(例如NOTA、DOTA或其衍生物)缀合的抗体部分，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体，且其中所述抗体部分是与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，提供了成像剂，其包含与螯合放射性核素(例如68Ga)的NOTA缀合的抗体部分，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述抗体部分在血清中的半衰期为约10分钟至约24小时(如约10分钟至2小时，1小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，或12小时至24小时中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分不超过约120kDa(如不超过约30kDa、50kDa、80kDa或100kDa，或约30-50kDa、50-100kDa或30-80kDa中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分选自：单链Fv(scFv)、双体抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。
在一些实施方案中，提供了成像剂，其包含与螯合放射性核素(例如68Ga)的螯合化合物(例如NOTA、DOTA或其衍生物)缀合的scFv，其中所述抗体部分是与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，提供了成像剂，其包含与螯合放射性核素(例如68Ga)的NOTA缀合的scFv，其中所述scFv特异性结合免疫检查点配体。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述scFv与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述scFv与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述scFv是人源化的。在一些实施方案中，所述scFv在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述scFv的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VH、任选的肽接头和VL。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，该肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。
在一些实施方案中，提供了成像剂，其包含与螯合放射性核素(例如68Ga)的NOTA缀合的抗体部分，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体，且其中所述抗体部分是与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH值下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH值下)。在一些实施方案中，所述抗体部分具有约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)的熔解温度(Tm)。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VH、任选的肽接头和VL。在一些实施方案中，所述scFv从N端到C端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，该肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。
在一些实施方案中，提供了包含用放射性核素标记的抗PD-L1抗体部分的成像剂，其中所述抗PD-L1抗体部分特异性地结合PD-L1。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体在血清中的半衰期为约10分钟至约24小时(如约10分钟至2小时，1小时至4小时，4小时至8小时，8小时至12小时，或12小时至24小时中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分不超过约120kDa(如不超过约30kDa、50kDa、80kDa或100kDa，或者约30-50kDa、50-100kDa或30-80kDa中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与所述免疫检查点配体的KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分在酸性pH下是稳定的(例如在低于约6.5、6.0、5.5或5.0的pH下)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60、60-65或65-70℃中的任一个)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分选自：单链Fv(scFv)、双体抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是与Fc融合的scFv。示例性的抗PD-L1抗体部分在“抗PD-L1抗体试剂”小节中详细讨论。
放射性核素
本文所述的成像剂包括一个标签。出于诊断目的，所述标签可以是放射性核素、放射性造影剂、顺磁性离子、金属、荧光标签、化学发光标签、超声造影剂和光敏剂。此类诊断标签是众所周知的，并且可以使用任何此类已知标签。
在一些实施方案中，所述成像剂包含放射性核素。“放射性核素”通常被称为“放射性同位素(radioactive isotopes/radioisotopes)”。可能与本文所述抗体部分结合的示例性放射性核素或稳定同位素，包括但不限于：110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其他γ、β或正电子发射体。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。
可用的顺磁性离子包括：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、轧(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可包括：镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。不透射线的诊断剂可选自：化合物、钡化合物、镓化合物和铊化合物。在本领域中已知各种各样的荧光标签，包括但不限于：荧光素异硫氰酸酯、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。可用的化学发光标签包括：鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
放射免疫检测(RAID)在过去的35年中已成为临床应用的领域。在这段时间里，已经进行了将近1000例使用RAID的临床试验，并且有一些明确和重要的发现。即使在早期研究中便已认识到，使用这种技术检测被常规成像认为“隐匿”的病变可更加便利，并且无论抗体、肿瘤或放射性核素类型的研究都反复对此进行了证实。
许多放射性核素，如68Ga、99Tc、64Cu和18F，都是很好的成像剂选择。它们通常具有对安全成像而言理想的γ或β能量，并且价格便宜且易于获得，可以由生成器生产且无需载体。他们的半衰期短(少于6小时)容易使自己与抗体片段结合用于早期成像研究。
在一些实施方案中，所述成像剂包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物螯合放射性金属。在一些实施方案中，所述螯合化合物螯合金属18F。在一些实施方案中，所述螯合化合物是亲水性螯合化合物，其可以结合金属离子并有助于确保在体内的快速清除。可以根据其特定的金属结合性能选择合适的螯合化合物，并且通过已知的化学交联技术或通过使用具有侧链反应性基团的螯合剂(如双官能螯合化合物)，仅采用常规实验就可以进行取代。
特别有用的金属螯合化合物组合，包括2-苄基-DTPA (二亚乙基三胺五乙酸)及其单甲基和环己基类似物，在通常的能量范围60-4,000keV内与诊断同位素一起使用，如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99Tc、94Tc、11C、13N、15O、76Br，用于放射成像。当与非放射性金属(如锰、铁和钆)复合时，相同的螯合化合物可用于MRI。大环螯合化合物，如NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、TETA(溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸)和NETA({4-[2-(双-羧甲基氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三唑N烷-1-基}-乙酸)可与各种诊断用放射性金属(如镓、钇和铜)一起使用。通过根据目标金属量身定制环的尺寸，可以使这种金属螯合复合物非常稳定。普通技术人员将理解，通过改变连接到大环结构(如NOTA)上的基团，可以改变对不同金属和/或放射性核素的结合特性和亲和力，因此，例如NOTA的这种衍生物或类似物可以设计以结合本文讨论的任何金属或放射性核素。
DTPA和DOTA型螯合剂，其中所述配体包括硬碱螯合官能团如羧酸或胺基，对于螯合硬酸阳离子最有效，尤其是IIa族和IIIa族金属阳离子。可以通过根据目标金属量身定制环的尺寸来使这种金属螯合物非常稳定。其他环型螯合剂如大环聚醚也可以稳定地结合核素。卟啉螯合剂可与多种金属复合物一起使用。可以将一种以上类型的螯合剂与肽缀合以结合多种金属离子。螯合剂，如在美国专利US5,753,206中公开的那些，特别是硫代半卡巴腙基乙醛酰基半胱氨酸(Tscg-Cys)和硫代半卡巴腙基-乙酰半胱氨酸(Tsca-Cys)螯合剂，可有利地用于与软酸阳离子Tc、Re、Bi结合，而其他过渡金属镧系元素和锕系元素则与软碱配体紧密结合。其他硬酸螯合剂如DOTA、TETA等可用于替换DTPA和/或TscgCys基团。
在一些实施方案中，所述螯合化合物包含可以与所述抗体部分缀合的官能团。在一些实施方案中，所述螯合化合物包含可与所述抗体部分中的伯胺(-NH2)基团反应的官能团。伯胺存在于每个多肽链的N端，并且在赖氨酸(Lys)氨基酸残基的侧链。可以与所述抗体部分的伯胺(如赖氨酸侧链)缀合的示例性官能团，包括但不限于：异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺酰氯、醛类、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚氨基酯、碳二亚胺、酸酐和氟代苯基酯。这些官能团中的大多数通过酰化或烷基化与胺缀合。
在一些实施方案中，所述螯合化合物包含与所述抗体部分中的半胱氨酸侧链反应的官能团(即巯基)。示例性的巯基反应性基团，包括但不限于：卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化剂、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇和二硫化物还原剂。这些基团中的大多数通过烷基化(通常是硫醚键的形成)或二硫键交换(二硫键的形成)与巯基缀合。
在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA，包括NOTA衍生物。具有适合于与抗体部分缀合的官能团的示例性NOTA化合物，例如通过氨基酸侧链如赖氨酸和半胱氨酸，如图所示23。在一些实施方案中，所述成像剂包含与抗体部分缀合的NOTA。在一些实施方案中，所述NOTA化合物包含异硫氰酸酯(-SCN)基团。在一些实施方案中，所述NOTA化合物是p-SCN-Bn-NOTA。在一些实施方案中，所述螯合化合物包括与抗体部分中的赖氨酸残基缀合的NOTA，而NOTA与68Ga螯合。在一些实施方案中，首先将所述NOTA化合物用放射性金属如68Ga或18F-金属标记，然后与所述抗体部分缀合。
IV.抗PD-L1抗体试剂
本申请的一个方面提供了分离的抗PD-L1抗体试剂和抗PD-L1成像剂。所述分离的抗PD-L1抗体试剂可以不用或用放射性核素标记。本节所述的分离的抗PD-L1抗体试剂不涵盖抗PD-L1的治疗剂。
在一些实施方案中，提供了分离的抗PD-L1抗体试剂，其包含本文所述的抗PD-L1抗体部分中的任一种。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是与Fc片段(如IgG1 Fc片段)融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，提供了包含抗PD-L1抗体部分的分离的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。
在一些实施方案中，提供了包含抗PD-L1 scFv的分离的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1 scFv包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含：SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。
在一些实施方案中，提供了分离的抗PD-L1抗体试剂，所述抗PD-L1抗体试剂包含与Fc片段融合的抗PD-L1 scFv，其中所述抗PD-L1 scFv包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ IDNOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含：SEQID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ IDNOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。
抗PD-L1抗体部分
本文所述分离的抗PD-L1抗体试剂包含与PD-L1特异性结合的抗体部分。考虑的抗PD-L1抗体部分包括，例如抗PD-L1 scFv、抗PD-L1 Fab、抗PD-L1Fc融合蛋白(例如，与Fc融合的抗PD-L1 scFv)。本文所述的抗PD-L1抗体部分包括但不限于：人源化抗体、部分人源化抗体、完全人源化抗体、半合成抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、人抗体以及包含本文讨论的重链和/或轻链CDR的抗体。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分特异性识别PD-L1。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分特异性识别人PD-L1。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分特异性识别PD-L1的胞外结构域。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分特异性识别SEQ IDNO:49的氨基酸19-238的氨基酸序列内的表位。
SEQ ID NO:49人PD-L1序列
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)重链可变区(VH)和ii)轻链可变区(VL)，并且VH包含：含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代；以及VL包含：含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；以及VL包含：含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1或其变体，所述变体包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2或其变体，所述变体包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3或其变体，所述变体包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1或其变体，所述变体包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2或其变体，所述变体包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3或其变体，所述变体包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体在HC-CDR序列中含有最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体在LC-CDR序列中含有最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸替换。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQID NO:1的氨基酸序列的VH中的1、2或3个CDR；以及VL包含：含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL中的1、2或3个CDR。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:1的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:1具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:2的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:2具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:1的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含小鼠可变区和人恒定区。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)重链和b)轻链，并且所述重链包含：SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQID NO:5具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及所述轻链包含：SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:7具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)重链和b)轻链，并且所述重链包含：SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及所述轻链包含：SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:9、11和13中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs:9、11和13中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNOs:15、17和19中的任一个的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:15、17和19中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:9、11和13中的任一个的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ IDNOs:15、17和19中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:9的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:9具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:15的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:15具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:11的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:11具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:15的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:15具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:13的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:13具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:15的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:15具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:9的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:9具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:17的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:17具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:11的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:11具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:17的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:17具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:13的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:13具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:17的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:17具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:9的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:9具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:19的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:19具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:11的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:11具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:19的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:19具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:13的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:13具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ IDNO:19的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:19具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
可以将重链和轻链可变区组合成各种成对的组合，以产生许多抗PD-L1抗体部分。表3和表4提供了示例性的抗PD-L1抗体序列。表3中所示的示例性的CDR、VH和VL序列是根据国际免疫遗传信息系统(INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION
Figure BDA0002927805750000681
IMGT)来定界的。参见例如，Lefranc,MP et al.,Nucleic Acids Res.,43:D413-422(2015)，其公开的内容通过引用整体并入本文。那些熟练的技术人员应当知晓，已知许多算法(但基于IMGT的预测算法除外)可用于预测抗体重链和轻链可变区中的CDR位置，以及包含来自本文所述抗体的CDR的抗体试剂也在本发明的范围内。表4列出了在各种其他编号方案和/或定义下的示例性CDR序列。
表3：示例性的抗PD-L1抗体序列
Figure BDA0002927805750000691
表4：各种CDR定义下的示例性抗PD-L1 CDR
SEQ ID NO: 描述 序列
41 CDR-H1 GFNIKDTY
52 CDR-H1(Kabat) DTYMY
53 CDR-H1(Chothia) GFNIKDT
54 CDR-H1(AbM) GFNIKDTYMY
55 CDR-H1(Contact) KDTYMY
42 CDR-H2 IDPANDNT
56 CDR-H2(Kabat) RIDPANDNTKYAQKFQG
57 CDR-H2(Chothia) DPANDN
58 CDR-H2(AbM) RIDPANDNTK
59 CDR-H2(Contact) WMGRIDPANDNTK
43 CDR-H3 ARAKNLLNYFDY
60 CDR-H3(Kabat/Abm/Chothia) AKNLLNYFDY
61 CDR-H3(Contact) ARAKNLLNYFD
44 CDR-L1 QEISGY
62 CDR-L1(Kabat/Abm/Chothia) RASQEISGYLS
63 CDR-L1(Contact) SGYLSWL
45 CDR-L2 ATS
64 CDR-L2(Kabat/Abm/Chothia) ATSTLQS
65 CDR-L2(Contact) RLIYATSTLQ
46 CDR-L3(Kabat/Abm/Chothia) LQYAIYPLT
66 CDR-L3(Contact) LQYAIYPL
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与本文所述的抗PD-L1抗体部分中任一种第二抗PD-L1抗体部分竞争与目标PD-L1结合。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与所述第二抗PD-L1抗体部分结合相同或基本相同的表位。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与目标PD-L1的结合抑制第二抗PD-L1抗体部分与PD-L1结合的至少约70％(如至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中的任一个)，或反之亦然。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分和第二抗PD-L1抗体部分相互竞争与目标PD-L1结合，即每个抗PD-L1抗体部分与彼此竞争与目标PD-L1结合。
抗PD-L1 scFv
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv具有(从N端到C端)的构型：VL-L-VH或VH-L-VL，其中L是肽接头。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv是嵌合的、人的、部分人源化的、完全人源化的或半合成的。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv被工程化而具有增强的热稳定性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv被工程化而具有约55-70℃的熔解温度，如约55-60℃、60-65℃或65-70℃中的任一个。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。基于所述scFv的结构和序列，通过在适当的位置对VH中的半胱氨酸和VL中的半胱氨酸进行工程化改造，可将其他工程化的二硫键引入抗PD-L1scFv中。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQ IDNO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体在HC-CDR序列中含有最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及其变体，所述变体含有SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR序列中含有最多约5个(如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv从N端到C端包含：VH、任选的肽接头和VL。在一些实施方案中，所述抗PD-L1scFv从N端到C端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，所述肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗PD-L1scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；和/或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1scFv是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv从N端到C端包含：VH、任选的肽接头和VL。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv从N端到C端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，所述肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含一个或多个(如1、2、3，或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述抗PD-L1scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；和/或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含His标签。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含与抗PD-L1 scFv部分的C末端融合的His标签。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含GGGGSHHHHHH(SEQ ID NO:51)。示例性的抗PD-L1 scFv在图9中进行了说明。表5中显示了示例性的抗PD-L1 scFv序列。
表5：示例性的抗PD-L1 scFv序列。
Figure BDA0002927805750000731
抗PD-L1 scFv-Fc
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是与Fc片段融合的本文所述抗PD-L1scFv中任一种抗PD-L1 scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分通过肽接头与Fc片段融合。抗PD-L1抗体部分可包含上文“抗体部分”小节中所述的任何Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含一个或多个突变以增加清除率或缩短半衰期。例如，所述Fc片段可能具有H310A和/或H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，所述Fc片段的每条链都与相同实体融合。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv-Fc包含两个相同的本文所述抗PD-L1 scFv，各自与一条Fc片段链融合。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv-Fc是同源二聚体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1scFv-Fc是异源二聚体。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv-Fc包含SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。表6中显示了示例性的抗PD-L1 scFv-Fc序列。
表6：示例性的抗PD-L1 scFv-Fc序列。
Figure BDA0002927805750000741
Figure BDA0002927805750000751
抗PD-L1成像剂
可以将本文所述抗PD-L1抗体部分中的任一种整合到成像剂中，用于检测PD-L1。本节中有关抗PD-L1抗体试剂的特征，可与上述“成像剂”小节中描述的特征以任何适合的方式相结合。
在一些实施方案中，提供了成像剂，其包含本文所述抗PD-L1抗体部分中的任一种，其中所述抗体部分用放射性核素标记。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、86Y、90Y和89Zr。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。
在一些实施方案中，提供了成像剂，其包含本文所述抗PD-L1抗体试剂中的任一种，其中所述抗PD-L1抗体部分用放射性核素标记。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。
在一些实施方案中，提供了包含用放射性核素标记的抗PD-L1抗体部分的成像剂，其中所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。
在一些实施方案中，提供了包含用放射性核素标记的抗PD-L1 scFv的成像剂，其中所述抗PD-L1 scFv包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％中的任一个或更高)序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。
在一些实施方案中，提供了包含用放射性核素标记的抗PD-L1抗体部分的成像剂，其中所述抗PD-L1抗体部分是与Fc片段融合的抗PD-L1 scFv，其中所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ IDNOs:3、7、15、17和19中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％中的任一个或更高)序列同一性。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与螯合放射性核素的螯合化合物缀合。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。
在一些实施方案中，提供了包含与螯合放射性核素(例如68Ga)的NOTA缀合的抗PD-L1抗体部分的成像剂，其中所述抗PD-L1抗体包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。
在一些实施方案中，提供了包含与螯合了放射性核素(例如68Ga)的NOTA缀合的抗PD-L1 scFv的成像剂，其中所述抗PD-L1 scFv包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ IDNOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含SEQID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ IDNOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％中的任一个或更高)序列同一性。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。
在一些实施方案中，提供了包含与螯合了放射性核素(例如68Ga)的NOTA缀合的抗PD-L1抗体部分的成像剂，其中所述抗PD-L1抗体部分是与Fc片段融合的抗PD-L1 scFv，且其中所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体含有最多约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性；以及VL包含：SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列，或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:25、27、29、31、33、35、37和39中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％中的任一个或更高)序列同一性。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。
PD-1
PD-1/PD-L1通路和抗PD免疫疗法
1992年首先从鼠T细胞杂交瘤和经历经典细胞凋亡的造血祖细胞系中分离出编码程序性细胞死亡1(PD-1)的基因(Ishida Y,et al.The EMBO journal1992；11:3887-3895)。从结构上讲，作为CD28和CTLA4的同源物，PD-1是一种I型跨膜蛋白，并属于Ig超家族(Sharpe AH and Freeman GJ.Nature Reviews Immunology 2002；2:116-126)。通过使用不同小鼠模型的PD-1基因消融研究，显示了PD-1在负调节T细胞应答和维持外周耐受性中的关键作用。缺乏PD-1的C57BL/6背景小鼠发展为狼疮样自身免疫性疾病，原因是缺乏PD-1的T细胞针对同种异体抗原的增殖增强(Nishimura H et al.Immunity 1999；11:141-151)。在BALB/c中，但不是在免疫缺陷的BALB/c RAG2-/-背景中，PD-1敲除小鼠发展为扩张型心肌病，并因充血性心力衰竭而遭受猝死(Nishimura H et al.Science 2001；291:319-322)。后来确定了主要诱因之一是针对心脏特异性蛋白心脏肌钙蛋白I产生了高滴度自身抗体(Okazaki T,et al.Nature medicine 2003；9:1477-1483)。在NOD(非肥胖糖尿病)的背景下，PD-1缺陷导致I型糖尿病较早发作，原因是胰岛特异性T细胞的加速增殖并浸润至胰岛中(Yantha J et al.Diabetes 2010；59:2588-2596)。总体而言，PD-1分子是一种涉及外周耐受的抑制性受体(Nishimura H,Honjo T.Trends in immunology2001；22:265-268)。与CTLA-4不同，PD-1中基于免疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM)，而不是位于PD-1胞质尾部附近的ITIM结构域，募集SHP-2磷酸酶并在TCR信号转导后逆转激活诱导的磷酸化(Ishida Y,et al.The EMBO journal1992；11:3887-3895)。
一些研究对与PD-1相互作用的分子的发现做出了贡献。在1999年，B7同源物1(B7H1，后来的文献中也被称为程序性死亡配体-1[PD-L1])被鉴定为属于免疫球蛋白超家族B7-CD28家族的290个氨基酸的I型跨膜糖蛋白，其在体外可作为人T细胞应答的负调节剂(Dong H et al.Nature medicine 1999；5:1365-1369)。一年后，PD-L1被证明是PD-1的结合和功能的对应物(Freeman GJ et al.The Journal of experimental medicine 2000；192:1027-1034)。后来证明PD-L1缺陷型小鼠容易发生自身免疫疾病(Dong H etal.Immunity 2004；20:327-336)。值得注意的是，尽管PD-1和PD-L1的mRNA在许多细胞类型中均具有广谱表达，但它们都是可诱导的分子，因为它们的表达模式受转录后调控的严格控制。在静止的T细胞中未检测到PD-1蛋白，但在T细胞活化后24小时内细胞表面上发现了PD-1蛋白(Keir ME et al.Annual review of immunology 2008；26:677-704)。在正常生理条件下，PD-L1蛋白仅在周围组织中表达，如扁桃体、胎盘以及在肺和肝中的一小部分巨噬细胞样细胞(Dong H et al.Nature medicine 2002；8:793-800；Petroff MG etal.Placenta 2002；23Suppl A:S95-101)。PD-L1的外源性诱导主要是由促炎细胞因子如干扰素γ(IFN-γ)介导的，这表明PD-1/PD-L1的相互作用在控制周围组织中炎症反应的方面起着重要的作用(Zou W,Chen L.Nature reviews Immunology 2008；8:467-477)。
除了PD-L1外，另外两个实验室(TsengSYetal)也分别确定了另一个称为B7-DC(也称为PD-L2)的PD-1配体(Tseng SY et al.The Journal of experimental medicine2001；193:839-846；Latchman Y,et al.Nature immunology 2001；2:261-268)。发现PD-L2在树突状细胞(DC)上选择性表达，并且通过与PD-1的结合也负调节T细胞的应答。最近，还发现了PD-L2与排斥性导向分子家族成员b(RGMb)相互作用，该分子在肺巨噬细胞中高度富集，并可能在诱导呼吸耐受中被需要(Xiao Y,et al.The Journal of experimentalmedicine 2014；211:943-959)。值得注意的是，还发现PD-L1在活化的T细胞上具有另一种受体CD80来传递抑制信号，这也可能有助于在体内形成T细胞耐受(Butte MJ etal.Immunity 2007；27:111-122；Park JJ et al.Blood 2010；116:1291-1298)。目前，已知至少有5种相互作用分子参与了PD网络。因此，原始PD-1/PD-L1通路被重命名为更合适的“PD”通路。“针对PD-1的两种配体(PD-L1和PD-L2)和针对PD-L1的两种抑制性受体(PD-1和CD80)的存在，表明PD-1阻断或PD-L1阻断都不会完全破坏PD通路。完全破坏PD抑制通路可能需要靶向两种分子的联合策略。
PD通路在调节对感染的炎性应答时外周组织中T细胞的活性以及限制自身免疫的关键功能，似乎被肿瘤细胞和慢性病毒感染期间的病毒劫持。PD-L1在源自多种组织的许多新分离的人类肿瘤中过表达(Dong et al.Nature Medicine 2002；8:793-800；Romano etal.Journal for Immunotherapy of Cancer2015；3:15；Hirano et al.Cancer Research2005；65:1089-1096)。PD-L1的表达与某些类型的人类癌症的进展和不良预后相关(Wanget al.European journal of surgical oncology:the journal of the EuropeanSociety of Surgical Oncology and the British Association of Surgical Oncology2015；41:450-456；Cierna et al.Annals of oncology:official journal of theEuropean Society for Medical Oncology/ESMO 2016；27:300-305；Gandini etal.Critical reviews in oncology/hematology 2016；100:88-98；Thierauf etal.Melanoma research 2015；25:503-509；Taube et al.Clinical cancer research:anofficial journal of the American Association for Cancer Research 2014；20:5064-5074)。在慢性病毒感染期间，PD-L1在许多组织中持续表达，而PD-1在病毒特异性CTL中被上调(Yao et al.Trends in molecular medicine 2006；12:244-246)。肿瘤或病毒诱导的PD-L1可以利用多种机制来促进对宿主免疫监视的规避，包括T细胞无能、凋亡、耗竭、IL-10产生、DC抑制以及Treg诱导和扩增(Zou et al.Nature reviews Immunology 2008；8:467-477)。
可以将PD通路介导的肿瘤免疫逃逸视为一种“适应性耐受”模型(Chen et al.TheJournal of clinical investigation 2015；125:3384-3391；Yao et al.Europeanjournal of immunology 2013；43:576-579)。具体而言，活化的肿瘤特异性T细胞到达肿瘤部位并成为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。识别相关抗原后，TILs会产生IFN-γ，从而在肿瘤微环境中的许多细胞类型中诱导PD-L1表达、包括DC、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和B淋巴细胞。与PD-1结合后，PD-L1向T细胞提供抑制信号，并向肿瘤细胞提供抗凋亡信号，从而导致T细胞功能障碍和肿瘤存活(Taube et al.Science translational medicine 2012；4:127ra137；Spranger et al.Science translational medicine 2013；5:200ra116)。该模型不仅受到基于IHC的观察的支持，即仅在与T细胞相邻的细胞中检测到细胞表面PD-L1的表达，而且还得到了显示肿瘤部位中PD-L1表达与TIL存在密切相关的研究的支持(Gandiniet al.Critical reviews in oncology/hematology 2016；100:88-98；Taube etal.Science translational medicine 2012；4:127ra137)，以及在小鼠肿瘤模型中证明IFN-γ是主要的PD-L1体内诱导剂(Dong et al.Nature medicine 2002；8:793-800)。PD通路介导的适应性耐受假说支持以下观察，即甚至在强抗肿瘤免疫力下，大多数PD-L1+肿瘤也可以逃避免疫破坏。
根据“适应性耐受”模型，设计针对PD通路的免疫疗法以阻断PD-1和PD-L1的相互作用，从而防止对抗肿瘤免疫的耐受。即使PD-1的发现并没有导致其在抗肿瘤治疗中的应用，直到在肿瘤中发现了PD-L1的大量表达，才将PD通路与癌症治疗联系起来(Dong etal.Nature Medicine 1999；5:1365-1369)，目前FDA已经批准了两种用于治疗人类癌症的PD-1单克隆抗体。它们是由Bristol-Myers Squibb(68)开发的
Figure BDA0002927805750000841
(也称为纳武力尤单抗(nivolumab)、MDX-1106、BMS-936558和ONO-4538)，以及由默克公司(69)开发的
Figure BDA0002927805750000842
(也称为派姆单抗(Pembrolizumab)、lambrolizumab和MK-3475)。针对PD-1或PD-L1的多种单克隆抗体正在接受涉及上千名患者的数百项临床试验的严格评估。抗PD治疗产生了显著的临床效益，包括显著的肿瘤消退和生存率的大幅提高。由于抗PD治疗可通过在肿瘤部位的免疫调节来靶向肿瘤诱导的免疫缺陷，因此可提供持久的功效、可耐受的毒性和针对癌症指征的广谱性。抗PD免疫疗法的临床成功进一步验证了PD通路阻断作为一种独特的癌症疗法的有效性，该疗法不同于个性化或针对肿瘤类型的疗法。通过靶向已利用明确的免疫检查点通路来逃避免疫监视的肿瘤，抗PD免疫疗法已成为人类癌症(尤其是实体瘤)免疫疗法的中心平台。
PD-L1作为肿瘤标志物在肿瘤部位表达，以预测抗PD免疫疗法的疗效
对抗PD免疫疗法的应答率在多种实体瘤在肿瘤中与PD-L1表达水平之间呈正相关，包括黑素瘤、RCC、NSCLC、结直肠癌，以及几种血液系统恶性肿瘤如经典的霍奇金淋巴瘤。在黑素瘤临床试验中，通过IHC检测到的PD-L1过表达约占样本的45％至75％。在纳武力尤单抗研究中，基于使用28-8抗体的5％截断值，45％的患者PD-L1表达阳性。PD-L1阳性患者的应答率为44％，而PD-L1阴性患者的应答率为17％。接受纳武力尤单抗治疗的PD-L1阳性黑素瘤患者的OS为21.1个月、PFS为9.1个月，而PD-L1阴性患者则分别为12.5个月和2个月。帕博利珠单抗(抗PD-1)也已用于IHC截断值为1％的晚期黑素瘤研究中。PD-L1阳性患者(77％)的ORR为51％，而PD-L1阴性患者的ORR为6％。接受帕博利珠单抗治疗的PD-L1阳性患者的PFS为12个月，且1年OS率为84％；而PD-L1阴性患者的PFS为3个月，且1年OS率为69％。
在NSCLC中也看到了类似的趋势，其中PD-L1阳性患者似乎优先受益于PD-1/PD-L1导向的治疗。在难治性NSCLC的患者中研究了纳武力尤单抗，并使用DAKO IHC测定法进行PD-L1 IHC检测，截断值为5％。基于这些标准，将60％的患者归为PD-L1阳性，PD-L1阳性患者的应答率为67％，而PD-L1阴性患者的应答率为0％。也已在NSCLC中研究了帕博利珠单抗，使用未报道的测定法，利用了独特的50％PD-L1表达的IHC截断值。基于该截断值，25％的肿瘤为PD-L1阳性，在6个月时，PD-L1阳性患者具有67％免疫相关的ORR(irORR)、67％的PFS率和89％的OS率，相比之下PD-L1阴性患者具有0％的irORR，11％的PFS率和33％的OS率。还已在NSCLC中研究了MPDL3280A(一种抗PD-L1抗体)，使用具有0-3+分级的专有IHC平台(3+表示>10％细胞，2+表示>5％细胞，0-1表示<5％细胞)。具有3+的PD-L1表达得分的NSCLC患者的应答率为83％，相比之下具有2+或3+得分的患者为46％。具有1+/2+/3+PD-L1表达的患者的ORR为31％。
PD-L1 IHC作为一种预测性生物标志物，也已在涉及多种组织学的临床试验中进行了评估。纳武力尤单抗I期研究包括患有黑素瘤、RCC、NSCLC、转移性结直肠癌(mCRC)和转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)的患者。使用5％的阈值通过5H1抗体检测到PD-L1，并且使用该标准有60％的肿瘤为阳性。PD-L1阳性肿瘤患者的应答率为36％，而PD-L1阴性肿瘤患者的ORR为0％。使用专有的PD-L1 IHC平台，针对患有黑素瘤、RCC、NSCLC、mCRC和胃癌的患者研究了MPDL3280A。PD-L1阳性患者的应答率为39％，而PD-L1阴性患者的应答率为13％。
来自这些临床试验的数据似乎表明，根据IHC，PD-L1水平较高的患者似乎对PD-1/PD-L1导向治疗有更好的应答。然而，对于接受抗PD免疫疗法治疗的PD-L1阴性患者，有关其应答特性或生存结果却相对知之甚少。初步评估表明，选择患有黑素瘤的PD-L1阴性患者仍可对抗PD-1/PD-L1治疗获得持久的应答，而在PD-L1阴性的NSCLC患者中的应答则很少。如果该趋势在更大的试验中得到再现，则可能表示两种不同肿瘤类型之间免疫生物学的根本差异，或者可能表示在不同组织中存在IHC的技术问题。在转移性膀胱尿路上皮癌的MPDL3280A的I期临床试验中，PD-L1阳性患者在12周时的ORR为52％，相比之下PD-L1阴性患者为11％。因此，仍然需要观察PD-L1阴性患者的应答深度和持续时间。
V.抗体
本文中还提供了特异性识别免疫检查点配体(如PD-L1和PD-L1样配体)的抗体。这些抗体和源自其的抗体部分可以整合到上述小节中所述的方法和成像剂中。合适的抗体部分，包括但不限于：scFv、Fab和与Fc片段融合的scFv(以下也称为“scFv-Fc”)。本文所述的抗体部分(包括抗PD-L1抗体试剂)可能具有以下a)-h)小节中所述特性中的任意一个或多个。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述scFv具有(从N端到C端)的构型：VL-L-VH或VH-L-VL，其中L是肽接头。在一些实施方案中，所述scFv是嵌合的、人的、部分人源化的、完全人源化的、或半合成的。
在一些实施方案中，所述scFv被工程化为具有增强的热稳定性。在一些实施方案中，所述scFv被工程化为具有约55-70℃的熔解温度，如约55-60℃中、60-65℃中或65-70℃中的任一个。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。基于scFv的结构和顺序，通过在适当的位置将VH中的半胱氨酸和VL中的半胱氨酸工程化，可以将其他工程化的二硫键引入到scFv中。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含Fc片段。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分包含通过肽接头与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含一个或多个突变以增加清除率或缩短半衰期。例如，所述Fc片段可具有H310A和/或H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，所述Fc片段包含免疫球蛋白IgG重链恒定区，其含有铰链区(从Cys226开始)、IgG CH2结构域和CH3结构域。如本文所用，术语“铰链区”或“铰链序列”是指位于接头和CH2结构域之间的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含含有铰链区的Fc片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc片段始于铰链区，并延伸至IgG重链的C末端。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含不含有铰链区域的Fc片段。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含Fc片段，其选自以下Fc片段：IgG、IgA、IgD、IgD、IgE、IgM及其组合和杂合物。在一些实施方案中，所述Fc片段源自人IgG。在一些实施方案中，所述Fc片段包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、或其组合、或杂合IgG的Fc区。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含IgG1的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含IgG4的CH2和CH3结构域。已知IgG4 Fc的活性比IgG1 Fc低，因此对于某些应用可能是理想的。在一些实施方案中，所述Fc片段源自小鼠免疫球蛋白。
在一些实施方案中，IgG CH2结构域始于Ala231。在一些实施方案中，CH3结构域始于Gly341。可以理解的是，人IgG的C末端Lys残基可以任选地不存在。还应该理解的是，本发明范围内考虑了不影响Fc所需结构和/或稳定性的Fc区保守氨基酸替换。
在一些实施方案中，Fc片段的每条链都融合到相同的抗体部分上。在一些实施方案中，所述scFv-Fc包含两个相同的本文所述的scFv，其各自与Fc片段的一条链融合。在一些实施方案中，所述scFv-Fc是同源二聚体。
在一些实施方案中，所述scFv-Fc包含两个不同的scFv，其各自与Fc片段的一条链融合。在一些实施方案中，所述scFv-Fc是异源二聚体。所述scFv-Fc中不同多肽的异源二聚化可以通过本领域已知的方法来促成，包括但不限于，通过KiH(knob-into-hole)技术进行异源二聚化。KiH技术的结构和组装方法可参见例如，US5,821,333、US7,642,228、US2011/0287009和PCT/US2012/059810，其通过引用整体并入本文。这项技术的开发是通过以下步骤来实现的：在一个FC的CH3结构域中将小的氨基酸残基替换为大的氨基酸残基来引入一个“凸起”(或突起)，以及在另一个FC的CH3结构域中将一个或多个大的氨基酸残基替换为小的氨基酸残基来引入一个“孔”(或凹穴)。在一些实施方案中，所述融合蛋白中的Fc片段的一条链包含一个凸起，而所述Fc片段的第二条链包含一个孔。
用于形成凸起的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选地选自：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选为色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成凸起的原始残基具有小的侧链体积，如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。用于在CH3结构域中形成凸起的示例性氨基酸替换，包括但不限于：T366W、T366Y或F405W替换。
用于形成孔的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选地选自：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一个实施方案中，用于形成孔的原始残基具有大的侧链体积，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。用于在CH3结构域中形成孔的示例性氨基酸替换，包括但不限于：T366S、L368A、F405A、Y407A、Y407T和Y407V替换。在一些实施方案中，所述凸起包含T366W替换，以及所述孔包含T366S/L368A/Y407V替换。可以理解的是，本申请还考虑并涵盖了促进异源二聚化的现有技术中对已知Fc区的其他修饰。
考虑了其他scFv-Fc变体(包括分离的抗PD-L1 scFv-Fc变体，例如全长抗PD-L1抗体变体)，其包含本文所述的任何变体(例如，Fc变体、效应子功能变体、糖基化变体、半胱氨酸工程化变体)或它们的组合。
a)抗体亲和力
所述抗体部分的结合特异性可以通过本领域已知的方法通过实验确定。此类方法包括但不限于：Western印迹法、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIACORETM测试和肽扫描。
在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如，PD-L1或PD-L1样配体)结合的KD为：约10-7M至约10-12M，约10-7M至约10-8M，约10-8M至约10-9M，约10-9M至约10- 10M，约10-10M至约10-11M，约10-11M至约10-12M，约10-7M至约10-12M，约10-8M至约10-12M，约10-9M至约10-12M，约10-10M至约10-12M，约10-7M至约10-11M，约10-8M至约10-11M，约10-9M至约10-11M，约10-7M至约10-10M，约10-8M至约10-10M，或约10-7M至约10-9M。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如，PD-L1或PD-L1样配体)结合的KD大于约选自以下任一个：10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是人类免疫检查点配体(例如，人PD-L1或PD-L1样配体)。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是食蟹猴免疫检查点配体(例如，食蟹猴PD-L1或PD-L1样配体)。在一些实施方案中，所述抗体部分特异性识别免疫检查点配体胞外结构域中的表位，如SEQ ID NO:4的氨基酸19-238。
在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)结合的Kon为：约103M-1s-1至约108M-1s-1，约103M-1s-1至约104M-1s-1，约104M-1s-1至约105M-1s-1，约105M-1s-1至约106M-1s-1，约106M-1s-1至约107M-1s-1，或约107M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)结合的Kon为：约103M- 1s-1至约105M-1s-1，约104M-1s-1至约106M-1s-1，约105M-1s-1至约107M-1s-1，约106M-1s-1至约108M- 1s-1，约104M-1s-1至约107M-1s-1，或约105M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)结合的Kon为：不超过选自103M-1s-1、104M- 1s-1、105M-1s-1、106M-1s-1、107M-1s-1或108M-1s-1中任一个。
在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如，PD-L1或PD-L1样配体)结合的Koff为：约1s-1至约10-6s-1，约1s-1至约10-2s-1，约10-2s-1至约10-3s-1，约10-3s-1至约10-4s-1，约10-4s-1至约10-5s-1，约10-5s-1至约10-6s-1，约1s-1至约10-5s-1，约10-2s-1至约10-6s-1，约10-3s-1至约10-6s-1，约10-4s-1至约10-6s-1，约10-2s-1至约10-5s-1，或约10-3s-1至约10-5s-1。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如，PD-L1或PD-L1样配体)结合的Koff为：至少约选自1s-1、10-2s-1、10-3s-1、10-4s-1、10-5s-1或10-6s-1中任一个。
b)嵌合或人源化抗体
在一些实施方案中，所述抗体部分是嵌合抗体。一些嵌合抗体描述于例如，美国专利号4,816,567中；以及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是与亲本抗体相比，已更改其类别或子类的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变区，其中HVR，例如CDR(或其部分)来自非人抗体，以及FR(或其部分)来自人抗体序列。任选地，人源化抗体还将包括至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，所述HVR残基源自的抗体)的相应残基替换，例如，以便恢复或改善抗体的特异性或亲和力。
人源化抗体及其制作方法在例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中进行了综述。并且在例如Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；Queen等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，Methods36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)的移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“重铺(resurfacing)”)；Dall’Acqua，Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组(shuffling)”)；和Osbourn等，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“指导性选择”方法)中进一步描述。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等，J.Immunol.151:2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体共有序列的框架区(参见，例如，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；筛选FR文库得到的框架区(参见，例如，Baca等，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)and Rosok等，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
c)人抗体
在一些实施方案中，所述抗体部分是人抗体(称为人结构域抗体或人DAb)。可以使用本领域已知的各种技术来生产人抗体。人抗体通常描述于，van Dijk and van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001),Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008),以及Chen,Mol.Immunol.47(4):912-21(2010)。能够产生完全人单结构域抗体(或DAb)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如，US20090307787A1、美国专利US8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
可以通过向经过修饰的转基因动物施用免疫原来制备人抗体(例如人类DAb)，以产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体以应答抗原刺激。此类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合到动物染色体中。在这种转基因小鼠中，所述内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。有关从转基因动物中获取人抗体的方法综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。另参见例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利US6,075,181和US6,150,584；描述
Figure BDA0002927805750000911
技术的美国专利US5,770,429；描述K-M
Figure BDA0002927805750000912
技术的美国专利US7,041,870，以及描述
Figure BDA0002927805750000913
技术的美国专利申请US2007/0061900。由此类动物产生的完整抗体的人可变区，可以被进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区结合。
人抗体(例如人DAb)也可以通过基于杂交瘤的方法制成。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系(参见例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于，Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其他方法包括描述于以下文献中的方法，例如美国专利US7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系生产单克隆人IgM抗体)，以及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(三体瘤技术)也描述于，Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)，以及Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
还可通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变区序列来产生人抗体(例如，人DAb)。然后可以将这种可变区序列与所需的人恒定区结合。下文描述了从抗体文库中选择人抗体的技术。
d)文库衍生的抗体
可以通过筛选具有所需活性(activity/activities)的抗体的组合文库来分离抗体部分。例如，现有技术中已知多种方法用于产生噬菌体展示文库，以及筛选此类文库以获得具有所需结合特性的的抗体。此类方法综述于例如，Hoogenboom et al.,Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)，以及进一步描述于例如，McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks andBradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。已描述了构建单结构域抗体文库的方法，参见例如美国专利US7,371,849。
在一些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆了全部的VH和VL基因，并在噬菌体库中随机重组，可以针对抗原结合的噬菌体进行筛选，其描述于Winter etal.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)。噬菌体通常展示抗体片段，即scFv片段或Fab片段。来自免疫源的文库为免疫原提供了高亲和力的抗体，而无需构建杂交瘤。或者，可以将原始库(repertoire)(例如从人类)克隆出来，以将单一来源的抗体提供给多种非自身以及自身抗原而无需任何免疫措施，其描述于Griffiths et al.,EMBO J,12:725-734(1993)。最后，还可以通过从干细胞中克隆未重排的V基因片段，并使用包含随机序列的PCR引物编码高变CDR3区，并在体外实现体外重排，以合成原始文库，其描述于Hoogenboom andWinter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)。描述人抗体噬菌体库的专利出版物，包括例如：美国专利US5,750,373，以及美国专利公开US2005/0079574、US2005/0119455、US2005/0266000、US2007/0117126、US2007/0160598、US2007/0237764、US2007/0292936和US2009/0002360。
分离自人抗体文库的抗体或抗体片段被本文认为是人抗体或人抗体片段。
e)替换、插入、缺失和变体
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸替换的抗体变体。替代性诱变的目的位点包括HVR(或CDR)和FR。保守替换显示于表2中“优选替换”的标题下。表2在“示例性替换”的标题下提供了更多实质性变化，并在下文提及氨基酸侧链类别时进一步描述。可以将氨基酸替换引入目的抗体中，并筛选具有所需活性的产品，例如，保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表2：氨基酸替换
Figure BDA0002927805750000921
Figure BDA0002927805750000931
可根据常见的侧链特性对氨基酸进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met,Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守替换将需要把这些类别中一个类别的成员替换为另一个类别的成员。
一种类型的替换变体涉及替换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体，相对于亲本抗体将具有特定生物学特性的一些修饰(例如改善)(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)，和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性的替换变体是亲和力成熟的抗体，其可以方便地产生，例如，使用如本文所述的基于噬菌体展示的亲和力成熟技术。简而言之，突变了一个或多个HVR残基，并在噬菌体上展示了多种抗体变体，并针对特定的生物学活性(例如结合亲和力)对其进行了筛选。
可以在HVR中进行改变(例如替换)，例如以提高抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”中进行，所述“热点”即在体细胞成熟过程中以高频率进行突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)，并测试所得变体的VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级库中重新选择的亲和力成熟，描述于例如，Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸指导的诱变)中任一种，将多样性引入针对成熟所选择的可变基因中。然后创建一个二级库。然后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR指导的方法，其中随机分配了多个HVR残基(例如一次4-6个残基)。可以特异性鉴定涉及抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。尤其是CDR-H3和CDR-L3，通常是被靶向的。
在一些实施方案中，可在一个或多个HVR内发生替换、插入或缺失，只要这种改变不会显著降低抗体与抗原结合的能力。例如，可以在HVR中进行没有实质性减少结合亲和力的保守替换(例如，本文提供的保守替换)。此类改变可在HVR的“热点”或CDR之外。在上面提供的VHH序列变体的一些实施方案中，每个HVR都没有改变，或者包含不超过一个、两个或三个氨基酸替换。
一种可用于鉴定可被靶向以进行诱变的抗体残基或区域的方法，称为“丙氨酸扫描诱变”，其描述于Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085。在该方法中，确定了残基或目标残基基团(例如，带电荷残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)进行替换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始替换功能敏感的氨基酸位置引入进一步替换。可选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构可识别抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可作为候选的替换被靶向或删除。可以筛选变体以确定它们是否包含所需的属性。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有100个或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合体，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。末端插入的实例包括带有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体，包括抗体的N或C末端与酶(例如用于ADEPT)或与增加抗体血清半衰期的多肽的融合物。
f)糖基化变体
在一些实施方案中，所述抗体部分被改变以增加或减少所述构建体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列可以方便地在抗体上添加或缺失糖基化位点，从而创建或删除一个或多个糖基化位点。
如果抗体部分包含Fc区(例如scFv-Fc)，则可能会改变与其连接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的、二叉链的寡糖，其通常通过N-连接到Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如，Wright et al.TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可能包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在二叉链寡糖的“茎”结构中与GlcNAc相连的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对所述抗体部分中的寡糖进行修饰，以产生具有一些改善的特性的抗体变体。
在一些实施方案中，所述抗体部分具有碳水化合物结构，其缺乏(直接或间接)与Fc区连接的岩藻糖。例如，此类抗体中的岩藻糖含量可为：1％至80％，1％至65％，5％至65％，或20％至40％。如通过MALDI-TOF质谱所测量的，相对于与Asn 297连接的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖结构)的总和，通过计算在Asn297处的糖链中岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量，其描述于例如WO2008/077546。Asn297是指位于Fc区约297位的天冬酰胺残基(EU编号的Fc区残基)；但是，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可能位于297位上游或下游的约±3个氨基酸处，即在294位至300位。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如，美国专利公开US2003/0157108(Presta，L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体有关的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系实例包括：蛋白岩藻糖基化不足的Lec13 CHO细胞(Ripka etal.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请US2003/0157108A1,Presta,L；以及WO2004/056312A1,Adams et al.,尤其是在实施例11)，以及敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8敲除的CHO细胞(参见例如，Yamane-Ohnuki etal.Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
在一些实施方案中，所述抗体部分具有一分为二的寡糖，例如，GlcNAc将其中与所述抗体的Fc区连接的二叉链寡糖一分为二。此类抗体变体可能减少了岩藻糖基化和/或改善了ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如，WO2003/011878(Jean-Mairet et al.)；美国专利US6,602,684(Umana et al.)；以及US2005/0123546(Umana et al.)。还提供了在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可能改善了CDC功能。此类抗体变体描述于例如，WO1997/30087(Patel et al.)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)。
g)Fc区变体
在一些实施方案中，可以在所述抗体部分的Fc区(例如scFv-Fc)中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位点含有氨基酸修饰(例如替换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在一些实施方案中，所述Fc片段具有一些但不是全部的效应子功能，这使其成为下述应用的理想候选者，其中所述抗体部分的体内半衰期很重要，但一些效应子功能(如补体和ADCC)不必要或有害。可以在体外和/或体内进行细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/损失。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保所述抗体缺乏FcγR结合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞、NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上FcR的表达概述于，Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)中第464页的表4。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例，描述于美国专利US5,500,362(参见例如，Hellstrom,I.et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))，以及Hellstrom,I et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；US5,821,337(参见Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可选地，也可以采用非放射性方法(参见例如，流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(Cell Technology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0002927805750000961
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。可用于此类测定的效应细胞，包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地或另外地，可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如在动物模型中，其诸如公开于Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)。还可以进行C1q结合测定，以确认所述抗体无法与C1q结合，并因此缺乏CDC活性。参见例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用现有技术中已知的方法，进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如，Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有减少的效应子功能的抗体，包括那些被替换了Fc区残基238、265、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的抗体(美国专利US6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中两个或更多个位置具有替换的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被替换为丙氨酸(美国专利US7,332,581)。
描述了具有增强或减弱的与FcR结合的一些抗体变体(参见例如，美国专利US6,737,056；WO2004/056312，以及Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含具有一个或多个氨基酸替换的Fc区，这些氨基酸替换改善了ADCC，例如，在Fc区的位置298、333和/或334的替换(EU编号的残基)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行了改变，其导致改变的(即改善或减弱的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，其描述于例如，美国专利US6,194,551、WO99/51642，以及Idusogie et al.J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
在一些实施方案中，所述抗体部分(例如，scFv-Fc)变体包含含有一个或多个氨基酸替换的Fc区变体，所述替换改变了半衰期和/或改变了与新生儿Fc受体的结合。具有延长的半衰期及改善的与新生儿Fc受体(FcRn)(负责将母体IgG转移至胎儿)结合的抗体(Guyeret al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))，其描述于US2005/0014934A1(Hinton et al.)。这些抗体包含具有一个或多个替换的Fc区，所述替换改变了Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在一个或多个Fc区域残基具有替换的那些Fc变体，例如Fc区残基434的替换(美国专利US7,371,826)。
有关Fc区域变体的其他实例，另参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利US5,648,260；美国专利US5,624,821；以及WO 94/29351。
h)半胱氨酸工程化抗体变异体
在一些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化的抗体部分，例如“thioMAb”，其中所述抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基替换。在特定的实施方案中，所述替换的残基出现在所述抗体的可及位点。通过用半胱氨酸替换这些残基，从而将可反应的硫醇基团放置在抗体的可及位点，并可用于将抗体与其他部分(如药物部分或接头-药物部分)缀合以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在一些实施方案中，以下残基中的任一个或多个可以用半胱氨酸替换：重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可以按照例如美国专利US7,521,541所述来产生半胱氨酸工程化的抗体部分。
i)抗体衍生物
在一些实施方案中，本文所述的抗体部分可以进一步被修饰以包含现有技术中已知且容易获得的其他非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例，包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和右旋糖酐或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中的稳定性而在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量的，也可以是支链或非支链的。与抗体连接的聚合物数量可有所不同，如果连接有多于一种聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根据考虑因素(包括但不限于：待改善的抗体的具体特性或功能，在确定的条件下该抗体衍生物是否将用于诊断，等)来确定用于衍生化的聚合物的数量和/或类型。
在一些实施方案中，可以进一步修饰抗体部分以包含一种或多种生物活性蛋白、多肽或其片段。本文中可互换使用的“生物活性的”或“具有生物活性的”是指在体内表现出生物活性以实现特定功能。例如，它可能意味着与诸如蛋白质、DNA等特定生物分子的组合，然后促进或抑制了这种生物分子的活性。在一些实施方案中，生物活性蛋白或其片段包括作为活性药物施用于患者以预防或治疗疾病或病况的蛋白或多肽，和用于诊断目的的蛋白或多肽(如诊断测试或体外测定中使用的酶)，以及施用于患者以预防疾病的蛋白和多肽如疫苗。
VI.制备方法
在一些实施方案中，提供了制备靶向免疫检查点配体的成像剂的方法。本文所述的成像剂可通过以下概述的众多方法和实施例中更具体描述的方法来制备。
在一些实施方案中，提供了制备靶向免疫检查点配体的成像剂的方法，其包括：(a)将螯合化合物与特异性结合免疫检查点配体的抗体部分(例如scFv)缀合，以提供抗体部分缀合物；以及(b)使放射性核素与所述抗体部分缀合物接触，从而提供成像剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述螯合化合物与所述抗体部分的赖氨酸缀合。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述螯合化合物和/或放射性核素与所述成像剂分离。
在一些实施方案中，提供了制备靶向免疫检查点配体的成像剂的方法，其包括：(a)将螯合化合物与本文所述的抗体部分中的任一种缀合，以提供抗体部分缀合物，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体；以及(b)使放射性核素与所述抗体部分缀合物接触，从而提供成像剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述螯合化合物与所述抗体部分的赖氨酸缀合。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述螯合化合物和/或放射性核素与所述成像剂分离。
在一些实施方案中，提供了制备靶向免疫检查点配体的成像剂的方法，其包括：(a)将螯合化合物与放射性核素接触；以及(b)使螯合放射性核素的螯合化合物与本文所述抗体部分中的任一种缀合，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体，从而提供成像剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体为PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述放射性核素选自：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述螯合化合物与所述抗体部分的赖氨酸缀合。在一些实施方案中，所述方法还包括将所述螯合化合物和/或放射性核素与所述成像剂分离。
在一些实施方案中，提供了制备靶向免疫检查点配体的成像剂的方法，其包括：(a)使特异性结合免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)的scFv与p-SCN-Bn-NOTA缀合，以提供抗体部分缀合物；(b)使68Ga与scFv缀合物接触，从而提供成像剂。在一些实施方案中，通过使scFv和p-SCN-Bn-NOTA的混合物通过柱子(例如NAP-5柱)来分离所述scFv缀合物。在一些实施方案中，通过使68Ga与scFv缀合物的混合物通过柱子(例如NAP-5柱)来分离所述成像剂。
抗体表达与生产
可以使用本领域中任何已知的方法制备本文所述的抗体部分，包括下文和实施例中描述的那些。
单克隆抗体
单克隆抗体是从基本上均一的抗体群组中获得的，即包含该群组的单个抗体是相同的，除了可能少量存在的可能自然发生的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)以外。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征不是离散抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以使用首先由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制成，或者可以由重组DNA方法(美国专利US4,816,567)制成。在杂交瘤方法中，如上文所述，对小鼠或其他合适的宿主动物(如仓鼠或美洲驼)进行了免疫接种以诱导淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白的抗体。或者，也可以体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986)。骆驼中的免疫也可见实施例1。
免疫试剂通常包括抗原蛋白或其融合变体。如果需要人类来源的细胞，通常使用外周血淋巴细胞(“PBLs”)，如果需要非人哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，形成杂交瘤细胞。参见，Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),pp.59-103。
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将这样制备的杂交瘤细胞接种并生长于合适的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤和氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，它们是阻止HGPRT-缺陷细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些能够有效融合，支持选定的抗体生产细胞稳定且高水平生产抗体，并对诸如HAT培养基等敏感的细胞。在这些当中，优选的是鼠类骨髓瘤细胞系，如来自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系，这些肿瘤可获自美国加利福尼亚州圣迭戈市的Salk研究所细胞分布中心(Salk Institute Cell Distribution Center)，以及SP-2细胞(及其衍生细胞，例如X63-Ag8-653)，这些细胞可获自美国弗吉尼亚州马纳萨斯市的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。还描述了人骨髓瘤和小鼠-人异型骨髓瘤细胞系以用于生产人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
针对所述抗原的单克隆抗体的产生，测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。优选地，通过免疫沉淀法或通过体外结合测定法来确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性，如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法。
可以针对所需抗原的单克隆抗体是否存在，测定杂交瘤细胞在其中培养的培养基。优选地，可以通过免疫沉淀法或通过体外结合测定法来确定所述单克隆抗体的结合亲和力和特异性，如放射免疫测定法(RIA)或酶联测定法(ELISA)。这些技术和测定法在现有技术中是已知的。例如，可以通过Munson et al.,Anal.Biochem.,107:220(1980)的斯卡查德(Scatchard)分析来确定结合亲和力。
鉴定出杂交瘤细胞会产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体后，可通过有限稀释程序将该克隆进行亚克隆，然后按标准方法(Goding，同上)生长。适用于此目的的培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，所述杂交瘤细胞可作为肿瘤在哺乳动物体内生长。
由所述亚克隆分泌的单克隆抗体，通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和力层析，从培养基、腹水或血清中恰当地分离出来。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法制成，例如美国专利US4,816,567中所述的方法，以及如上所述的方法。编码所述单克隆抗体的DNA，可使用常规方法进行分离和测序(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的首选来源。分离后，可将DNA放入表达载体中，然后将其转染到宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不产生其他免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以便在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。有关在细菌中重组表达编码所述抗体的DNA的综述文章，包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)，以及Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，所述抗体可分离自使用McCafferty et al.,Nature,348:552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库。Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体库分离鼠和人抗体的方法。随后的出版物描述了通过链改组生产高亲和力(nM范围)人抗体(Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及以组合感染和体内重组的策略构建特大型噬菌体文库(Waterhouse et al.,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993))。因此，对于分离单克隆抗体，这些技术是传统单克隆抗体杂交瘤技术可行的备选方案。
还可以通过例如用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠序列来修饰DNA(美国专利US4,816,567；Morrison,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价结合到免疫球蛋白编码序列。通常将此类非免疫球蛋白多肽替换为抗体的恒定区，或将其替换为抗体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包含对一个抗原具有特异性的抗原结合位点和对一不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。
本文所述的单克隆抗体可为单价的，其制备方法在现有技术中是众所周知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰的重链的重组表达。通常会在Fc区域的任何位置截断重链，以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基可以被另一个氨基酸残基取代或被缺失以防止交联。体外方法也适用于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术来消化抗体以产生其片段，尤其是Fab片段。
也可以使用合成蛋白化学中已知的方法，包括那些涉及交联剂的方法，在体外制备嵌合抗体或杂交抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例，包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁酰亚胺酸甲酯。
另外，关于单克隆抗体的生产参见实施例1。
编码抗体部分的核酸分子
本申请还提供了包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸编码本文所述的抗体部分(例如，抗PD-L1抗体部分)的一条或多条链。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体部分(例如，抗PD-L1抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体部分(例如抗PD-L1抗体部分)重链的多核苷酸和编码抗体部分轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸，而第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。在一些实施方案中，提供了编码scFv(例如抗PD-L1 scFv)的核酸分子。
在一些此类实施方案中，重链和轻链由一个核酸分子或两个独立的核酸分子表达为两个独立的多肽。在一些实施方案中，如当抗体是scFv时，单个多核苷酸编码包含连接在一起的重链和轻链的单个多肽。
在一些实施方案中，编码抗体部分(例如，抗PD-L1抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，所述前导序列在翻译时位于所述重链或轻链的N末端。如上文所述，前导序列可以是原生的重链或轻链前导序列，或者可以是另一种异源前导序列。
可以使用本领域常规的重组DNA技术构建核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是适合在选定的宿主细胞中表达的表达载体。
载体
提供了包含编码本文所述抗体部分(例如，抗PD-L1抗体部分)中任一种重链和/或轻链的多核苷酸的载体。还提供了包含编码本文所述scFv(例如抗PD-L1 scFv)中任一种的多核苷酸的载体。这样的载体包括但不限于：DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。
在一些实施方案中，载体包括编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重链和轻链从载体中表达为两个独立的多肽。在一些实施方案中，所述重链和轻链是作为单个多肽的一部分表达的，例如，当抗体是scFv时。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的多核苷酸，而第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，将第一载体和第二载体转染到具有相似量(如相似摩尔量或相似质量)的宿主细胞中。在一些实施方案中，将第一载体和第二载体以5∶1至1∶5的摩尔比或质量比转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，采用的编码重链的载体和编码轻链的载体的质量比为1：1至1∶5。在一些实施方案中，采用的编码重链的载体和编码轻链的载体的质量比为1∶2。
在一些实施方案中，选择了经优化以在CHO或CHO衍生的细胞、或NSO细胞中表达多肽的载体。示例性的此类载体，描述于例如，Running Deer et al.,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)。
宿主细胞
在一些实施方案中，本文所述的抗体部分(例如抗PD-L1抗体部分)可在原核细胞(如细菌细胞)中表达；或在真核细胞中如真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达。例如，可以根据本领域已知的方法进行这种表达。可用于表达多肽的示例性真核细胞，包括但不限于：COS细胞，包括COS7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；PER.
Figure BDA0002927805750001051
细胞(Crucell)；以及NSO细胞。在一些实施方案中，可在酵母中表达本文所述的抗体部分(例如，抗PD-L1抗体部分)。参见例如，美国公开US2006/0270045A1。在一些实施方案中，特定真核宿主细胞的选择是基于其对抗体部分的重链和/或轻链进行所需的翻译后修饰的能力来进行的。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生的多肽的唾液酸化水平高于293细胞产生的相同多肽的唾液酸化水平。
可通过任何方法将一种或多种核酸引入到所需的宿主细胞中，包括但不限于：磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法，描述于例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。可以根据任何合适的方法，将核酸瞬时或稳定地转染到所需的宿主细胞中。
本发明还提供了包含本文所述的任何多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含抗PD-L1抗体的宿主细胞。任何能够过表达异源DNA的宿主细胞都可以用于分离编码目的抗体、多肽或蛋白的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例，包括但不限于：COS、HeLa和CHO细胞。另参见PCT公开WO87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞，包括原核生物(如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtillis))和酵母菌(如酿酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)；或乳杆菌(K.lactis))。
在一些实施方案中，所述抗体部分是在无细胞系统中产生的。非限制性示例性无细胞系统，描述于例如，Sitaraman et al.,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo et al.,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。
抗体部分的纯化
所述抗体部分(例如抗PD-L1抗体部分)可以通过任何适当的方法进行纯化。此类方法包括但不限于，亲和基质或疏水相互作用色谱法的使用。合适的亲和配体包括ROR1ECD和与抗体恒定区结合的配体。例如，可以将蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱用来结合恒定区，并纯化包含Fc片段的抗体部分。疏水性相互作用色谱，例如丁基或苯基色谱柱，也可适用于纯化某些多肽如抗体。离子交换色谱(例如阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱)也可适用于纯化某些多肽如抗体。混合模式色谱法(例如，反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可适用于纯化某些多肽如抗体。在本领域中已知有许多纯化多肽的方法。
VII.治疗方法
对于疾病的预防或治疗，可以将本文所述的抗PD-L1抗体试剂施用于个体(例如哺乳动物，如人)以治疗或预防疾病或病况。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的疾病或病况的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体在HC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体在LC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换。在一些实施方案中，提供了治疗个体的疾病或病况的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ IDNO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的疾病或病况的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性氨基酸序列；和/或b)VL包含与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自：黑素瘤、肾细胞癌、结直肠癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈肿瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤、默克尔细胞癌、肝癌和宫颈癌。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述抗体部分是嵌合的或人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分选自：单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双体抗体(Diabody)、三体抗体(Tribody)和四体抗体(Tetrabody)。在一些实施方案中，所述抗体部分是单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体部分包含Fc片段。在一些实施方案中，所述抗体部分是全长抗体。在一些实施方案中，所述抗体部分具有选自以下的同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG的Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1或IgG4的Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，有效量的所述抗PD-L1抗体试剂约为0.005μg/kg至约5g/kg个体总体重。在一些实施方案中，所述抗体试剂是经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的疾病或病况的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中所述抗体部分包含：(a)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(b)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的VL；(c)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL；(d)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(e)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL；(f)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL；(g)含有SEQID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(h)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL；或(i)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的疾病或病况的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的疾病或病况的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的黑素瘤的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的黑素瘤的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的肾细胞癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的肾细胞癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中任一个氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的结直肠癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的结直肠癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的尿路上皮癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的尿路上皮癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的霍奇金淋巴瘤的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的霍奇金淋巴瘤的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的小细胞肺癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的小细胞肺癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的非小细胞肺癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的非小细胞肺癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的头颈肿瘤的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的头颈肿瘤的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的胃癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的胃癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的B细胞淋巴瘤的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的B细胞淋巴瘤的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的肝癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的肝癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的默克尔细胞癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的默克尔细胞癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗个体的宫颈癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，提供了治疗个体的宫颈癌的方法，其包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含抗体部分，且其中所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个所示的氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中所示的任一个氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述个体是哺乳动物(例如人、非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述个体是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在一些实施方案中，所述个体年龄小于约60岁(例如包括小于约50岁、40岁、30岁、25岁、20岁、15岁或10岁中的任一个)。在一些实施方案中，所述个体年龄大于约60岁(包括例如，大于约70岁、80岁、90岁或100岁任一个)。在一些实施方案中，所述个体被诊断为或在遗传上易患本文所述的一种或多种疾病或病况(如黑素瘤、肾细胞癌、结直肠癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈肿瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤、默克尔细胞癌、肝癌或宫颈癌)。在一些实施方案中，所述个体具有与本文所述一种或多种疾病或病症相关的一个或多个风险因素。
抗PD-L1抗体试剂的剂量和施用方法
施用于个体以治疗本文所述的疾病或病况的抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的剂量，可随着具体抗体试剂(或抗体部分)、施用方式以及所治疗疾病或病况的类型而变化。在一些实施方案中，所述疾病或病况的类型是癌症。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量，是有效引起客观应答(如部分应答或完全应答)的用量。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量是足以引起个体的完全应答的用量。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量是足以引起个体的部分应答的用量。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量是足以在用该抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)治疗的个体的人群中产生以下总应答率的用量：大于约选自20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、64％、65％、70％、75％、80％、85％或90％中的任一个。例如，可以基于RECIST水平确定个体对本文所述的治疗方法的应答。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量是足以延长个体的无进展生存期的用量。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量是足以延长个体的总体生存期的用量。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量，是足以在用该抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)治疗的个体的人群中产生大于约选自50％、60％、70％或77％中的任一个的临床益处的用量。
在一些实施方案中，单独或与第二、第三和/或第四种药剂组合使用的所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量，是相比治疗之前相同受试者的的对应肿瘤大小、癌细胞数量或肿瘤生长率，或相比在未接受该治疗的其他受试者的相应活性，足以减小肿瘤的大小、减少癌细胞的数量或降低肿瘤生长率至少约选自10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一个的用量。可以使用标准方法来测量此效果的大小，如用纯化酶进行体外测定、基于细胞的测定、动物模型或人体测试。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量，是当该组合物施用于个体时，其引起低于引起毒理学效应(即高于临床上可接受的毒性水平的效应)的水平或处在可以控制或耐受的潜在副作用水平的用量。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量，是按照相同给药方案时接近于组合物的最大耐受剂量(MTD)的用量。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量大于选自MTD的约80％、90％、95％或98％中的任一个。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量包括在以下范围内：约0.001μg至约10g，例如，约0.001μg至约0.01μg，约0.01μg至约0.1μg，约0.1μg至约1μg，约1μg至约10μg，约10μg至约100μg，约100μg至约1mg，约1mg至约10mg，约10mg至约100mg，约100mg至约1g，或约1g至约10g。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量至少为约0.001μg、0.01μg、0.1μg、1μg、10μg、100μg、1mg、10mg、100mg、1g或5g。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量不超过0.05μg、0.1μg、1μg、10μg、100μg、1mg、10mg、1g或10g。
在上述方面中的任一个的一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量为约0.005μg/kg至约5g/kg总体量范围，例如，约0.005μg/kg至约0.05μg/kg，约0.05μg/kg至约0.5μg/kg，约0.5μg/kg至约5μg/kg，约5μg/kg至约50μg/kg，约50μg/kg至约500μg/kg，约500μg/kg至约5mg/kg，约5mg/kg至约50mg/kg，约50mg/kg至约500mg/kg，或约500mg/kg至约5g/kg。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量为至少约0.005μg/kg、0.05μg/kg、0.5μg/kg、5μg/kg、50μg/kg、500μg/kg、5mg/kg、50mg/kg、500mg/kg或2.5g/kg。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂(或抗体部分)的有效量不超过0.01μg/kg、0.05μg/kg、0.5μg/kg、5μg/kg、50μg/kg、500μg/kg、5mg/kg、50mg/kg、500mg/kg或5g/kg。
可以通过多种途径将所述抗PD-L1抗体试剂施用于个体(如人)，包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、吸入、囊内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、经粘膜和经皮。在一些实施方案中，施用于个体时，所述抗PD-L1抗体试剂包含在药物组合物中。在一些实施方案中，可使用所述组合物的持续缓释制剂。在一些实施方案中，经静脉内施用所述组合物。在一些实施方案中，经腹膜内施用所述组合物。在一些实施方案中，经静脉内施用所述组合物。在一些实施方案中，经腹膜内施用所述组合物。在一些实施方案中，经肌内施用所述组合物。在一些实施方案中，经皮下施用所述组合物。在一些实施方案中，经静脉内施用所述组合物。在一些实施方案中，经口服施用所述组合物。
联合疗法
本申请还提供了将抗PD-L1抗体试剂施用于个体以治疗疾病或病况(如癌症)的方法，其中所述方法还包括施用第二药剂或疗法。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法是用于治疗疾病或病况的标准或常用药剂或疗法。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包括化疗药剂。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包括外科手术。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包括放射疗法。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包括免疫疗法。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包括激素疗法。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包含血管生成抑制剂。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包含酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体药物与所述第二药剂或疗法同时施用。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体药物与所述第二药剂或疗法并行施用。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体药物与所述第二药剂或疗法依次施用。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体药物与所述第二药剂或疗法以相同的单位剂量形式施用。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体药物与所述第二药剂或疗法以不同的单位剂量形式施用。
在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法选自：本妥昔单抗(Brentuximab)、BMS-986016、Urelumab单抗、Mogamulizumab单抗、Varlilumab单抗、DS-8273a、泊马度胺(Pomalidomide)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾卡哚司他(Epacadostat)、BMS-986205、吲哚莫德(Indoximod)、ABT-399、莫托莫德(Motolimod)、西妥昔单抗(cetuximab)、BMS-986012、格列巴单抗-维多汀(Glembatumumab vedotin)、BMS-986148、ALT-803、卡比拉珠单抗(Cabiralizumab)、ABBV-085、贝伐单抗、培美曲塞(pemetrexed)、厄洛替尼(erlotinib)、克唑替尼(crizotinib)、BMS-986156、利瑞鲁单抗(Lirilumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、干扰素-γ、BMS-986179、BMS-986178、ABBV-368、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、白介素2、达雷木单抗(Daratumumab)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、NKTR-214、ABBV-927、JTX-2011、安德西昔单抗(Andecaliximab)、BMS-986207、迪妥昔单抗(Dinutuximab)-β、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、ABBV-428、X4P-001、曲妥珠单抗-DM1、伊匹单抗(Ipilimumab)、干扰素α-2b、MK-4166、吲哚莫德、利妥昔单抗、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、埃诺珠单抗(Enoblituzumab)、GSK3174998、乌妥昔单抗(Ublituximab)、TGR-1202、MK-1248、PV-10、米妥昔单抗-索拉维坦(Mirvetuximab soravtansine)、AFM13、马戈昔单抗(Margetuximab)、IMP321、APX005M、AMG820、sEphB4-HAS、MK-4280、登赛珠单抗(Demcizumab)、GSK3359609、重组EphB4-HSA融合蛋白、Resimmune、放射疗法、AM0010、白介素12、干扰素γ-1b、MK-7684、IMM-101、恩替诺特(entinostat)、考比替尼(cobimetinib)、凡鲁珠单抗(vanucizumab)、PEG-干扰素α-2b、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、乙酰水杨酸、MOXR0916、RO6874281、他泽司他(tazemetostat)、依鲁替尼(ibrutinib)、泊洛妥珠单抗-维多汀(polatuzumab vedotin)、来那度胺(lenalidomide)、苯达莫司汀(Bendamustine)、CHOP、RG7888、凡鲁珠单抗、RO7009789、依米妥珠单抗(Emactuzumab)、色妥珠单抗-阿木留金(Cergutuzumab amunaleukin)、RO6958688、达雷木单抗、达雷木单抗、CDX-1401、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗-恩坦辛(Trastuzumab emtansine)、阿霉素、环磷酰胺、多西他赛、RG6058、ALX148、达雷木单抗、埃非佐莫德(Efizonerimod)、莫加利珠单抗、奥来克单抗(Oleclumab)、莫那利珠单抗(Monalizumab)、MEDI0562、IMC-CS4、MEDI5083、乌托鲁单抗(Utomilumab)、PF-04518600、PD0360324、阿扎胞苷(Azacitidine)、苯达莫司汀、M9241、维莫非尼、PDR001、LY3321367、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、洛扎利珠单抗(Plozalizumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、TAK-580、洛瓦妥珠单抗-特昔林(Rovalpituzumab tesirine)、本妥昔单抗-维多汀(Brentuximab vedotin)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、MBG453、GWN323、地西他滨、康纳单抗(Canakinumab)、CJM112、曲美替尼、EGF816、NIS793、REGN1979、REGN3767、阿卡替尼(Acalabrutinib)、乐伐替尼(Lenvatinib)、伏立诺他(Vorinostat)、迪纳昔克利(Dinaciclib)、达拉非尼(dabrafenib)、阿西替尼(Axitinib)、依鲁替尼、阿贝马昔克利(Abemaciclib)、艾瑞布林(Eribulin)、BL-8040、地塞米松、CMP-001、阿法替尼、安卡舍替(Amcasertib)、ARRY-382、阿扎胞苷、罗米地辛(romidepsin)、B-701、BGB324、比美替尼(Binimetinib)、比瑞纳畔(Birinapant)、卡非佐米(Carfilzomib)、GM-CSF、德伐替尼(Defactinib)、恩科拉非尼(Encorafenib)、依诺波沙(Enobosarm)、依西美坦(Exemestane)、亮丙瑞林(leuprolide)、G100、GR-MD-02、伊马替尼(Imatinib)、IMO-2125、INCB054828、伊他替尼(Itacitinib)、INCB050465、来曲唑、帕博西尼(palbociclib)、MK-1454、纳帕布卡辛(Napabucasin)、尼达尼布(Nintedanib)、尼拉帕尼(Niraparib)、奥拉帕尼(Olaparib)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、泼尼松、帕唑帕尼(Pazopanib)、PEGPH20、PLX3397、普瑞莱登(Preladenant)、鲁索替尼(Ruxolitinib)、沙格司亭(Sargramostim)、SCH900353、SD-101、维莫德吉(Vismodegib)、X4P-001、XL888、Ziv-阿柏西普(Ziv-aflibercept)、依鲁替尼、达沙替尼、普那布林(Plinabulin)、维尼帕尼(Veliparib)、PT2385、EGF816、INC280、色瑞替尼(Ceritinib)、加仑赛替(Galunisertib)、替西罗莫司(Temsirolimus)、伊立替康、卡培他滨、安卡舍替、IPI-549、西达本胺(Chidamide)、CB-839、TAK-659、司曲替尼(Sitravatinib)、格列替尼(Glesatinib)、司曲替尼、莫西汀(mocetinostat)、阿瓦度胺(Avadomide)、RRX-001、奥马索龙(Omaveloxolone)、丙戊酸盐(Valproate)、CB-1158、阿扎胞苷、米哚妥林、阿糖胞苷、依鲁替尼、莫西汀、奥西替尼(Osimertinib)甲磺酸酯、吉非替尼、AZD6738、西地尼布、MEDI9197、AZD5069、白蛋白结合型紫杉醇、AZD4547、AZD1775、维斯赛替(vistusertib)、加仑赛替、LY2510924、AZD4635、泊西达替尼(Pexidartinib)、司美替尼(Selumetinib)、曲贝替定(Trabectedin)、恩沙替尼(Ensartinib)、阿莱替尼(Alectinib)、罗西莱替尼(Rociletinib)、CPI-444、依托泊苷、卡铂、崔莱克利(trilaciclib)、卢卡帕尼(Rucaparib)、维尼帕尼、劳拉替尼(lorlatinib)、舒尼替尼(Sunitinib)、Beigene-290、BGB-3111、萨沃替尼(Savolitinib)、阿帕替尼(Apatinib)、美瑞替尼(merestinib)、西他司他(Citarinostat)、恩罗非尼(Emurafenib)、卡博替尼(Cabozantinib)、帕唑帕尼、WNT974、FGF401、PBF509、LXH254、瑞戈非尼(Regorafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、LCL101、依维莫司、帕比司他(panobinostat)、卡普替尼(Capmatinib)、BLZ945、Ad-CEA疫苗、Axalimogene filolisbac、Vigil、TPIV 200、PVX-410、Hiltonol、DC/AML融合细胞疫苗、LTX-315、LV305、膀胱内BCG治疗、ADXS-PSA、p53MVA、pTVG-HP质粒DNA疫苗、6MHP、GVAX胰腺、GVAX、DNX-2401、DPX-Survivac疫苗、树突状细胞疗法、冷冻手术、Prevnar 13、mDC3/8、NY-ESO-1、gp100:280-288、CRS-207、ISA101、Viagenpumatucel-L、树突状细胞疫苗、WT1疫苗、TG4010、CV-301、PD-L1/IDO肽疫苗、DCVax-L、NEO-PV-01、CimaVax-EGF疫苗、减毒麻疹病毒、Prostvac、CMB305、Sipuleucel-T、ONCOS-102、柯萨奇病毒A21、柯萨奇病毒A22、Pelareorep、Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3、Talimogenelaherparepvec、表达HSV-tk的腺病毒、Pexa-Vec、Enadenotucirev、MCPyV TAg特异性自体CD8+T细胞、IMCgp100、TIL治疗、iC9-GD2 T细胞、E7 TCR T细胞、pIL-12、ISF35、NY-ESO-1TCR PBMC、HPV特异性T细胞、NK免疫疗法、Axicabtagene ciloleucel、AZD9150、聚ICLC和Imprime PGG。
疾病或病况
本文所述的抗PD-L1抗体试剂可用于治疗任何疾病或病况。在一些实施方案中，所述疾病或病况包括感染。在一些实施方案中，所述疾病或状况是感染(如细菌感染或病毒感染)。在一些实施方案中，所述疾病或病况是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体试剂用于治疗癌症的方法中。可以使用本文所述的任何方法治疗的癌症，包括未血管化或尚未充分血管化的肿瘤，以及已血管化的肿瘤。如本申请所述，用抗PD-L1抗体试剂治疗的癌症类型，包括但不限于：恶性上皮肿瘤、胚细胞瘤、肉瘤、良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤例如肉瘤、恶性上皮肿瘤和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。
在各种实施方案中，所述癌症是早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症、缓解期癌症、复发性癌症、辅助治疗设置中的癌症、新辅助治疗设置中的癌症，或对治疗来说基本上是难治性的癌症。
可以通过本申请方法治疗的癌症实例，包括但不限于：肛门癌、星形细胞瘤(例如小脑和大脑的)、基底细胞癌、膀胱癌、骨癌(骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑瘤(例如神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、小脑或大脑星形细胞瘤(例如星形细胞瘤、恶性神经胶质瘤、髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤)、乳腺癌、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌(例如子宫癌)、食道癌、眼癌(例如眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、胃部(胃)癌、胃肠道间质瘤(GIST)、头颈癌、肝细胞癌(肝)癌(例如，肝部癌和肝癌)、白血病、肝癌、肺癌(例如、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、淋巴样肿瘤(例如、淋巴瘤)、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓增生异常综合症、鼻咽癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、腹膜癌、垂体瘤、淋巴瘤、直肠癌、肾癌、肾盂和输尿管癌(移行细胞癌)、横纹肌肉瘤、皮肤癌(例如非黑素瘤(如鳞状细胞癌)、黑素瘤和默克尔细胞癌)、小肠癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、结节性硬化症和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)。
在一些实施方案中，所述癌症选自：黑素瘤、肾细胞癌、结直肠癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈肿瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤、默克尔细胞癌、肝癌和宫颈癌。
VIII.组合物、试剂盒和制品
本文中还提供了包含以下中的任一种的组合物(如制剂)：本文所述的成像剂或所述分离的抗PD-L1抗体试剂、编码所述抗体部分(如抗PD-L1抗体部分)的核酸、含有编码所述抗体部分的核酸的载体、或含有所述核酸或载体的宿主细胞。
本文所述的成像剂或分离的抗PD-L1抗体试剂的合适制剂，可以通过将所述成像剂或具有所需纯度的分离的抗PD-L1抗体试剂和任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来获得(Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition,Osol,A.Ed.(1980))，其形式为冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并包含缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的反离子如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。WO97/04801中描述了适合皮下施用的冻干制剂。可以使用适合的稀释剂将这些冻干制剂重构为高蛋白浓度，并且该重构制剂可以经皮下施用于本文中待成像、诊断或治疗的个体。
用于体内施用的制剂必须无菌。这可以通过例如无菌过滤膜的过滤来容易地完成。
还提供了包含以下中的任一种的试剂盒：成像剂、分离的抗PD-L1抗体试剂和/或任选的螯合化合物和/或放射性核素。所述试剂盒可用于本文所述的成像、诊断和治疗方法中任一种。
在一些实施方案中，提供了试剂盒，其包含特异性结合免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)的抗体部分，以及螯合化合物(例如NOTA、DOTA或其衍生物)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含放射性核素(例如68Ga)。在一些实施方案中，所述螯合化合物螯合放射性核素。
在一些实施方案中，提供了试剂盒，其包含含有用放射性核素(例如68Ga)标记的抗体部分的成像剂，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)。在一些实施方案中，所述抗体部分与螯合放射性核素的螯合部分(例如NOTA、DOTA或其衍生物)缀合。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含未用放射性核素标记的抗体部分。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含能够递送所述成像剂或分离的抗PD-L1抗体试剂的装置。应用于诸如肠外递送的一类装置，是用于将组合物注射到受试者体内的注射器。吸入装置也可用于特定应用。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于治疗疾病或病况的治疗剂，例如癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述治疗剂是免疫检查点配体或其受体的抑制剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是特异性结合免疫检查点或其受体的放射性标记的分子。
本申请的试剂盒被置于合适的包装内。合适的包装，包括但不限于：小瓶、瓶子、罐子、柔性包装(例如，密封的密拉(Mylar)或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供其他组件如缓冲液和解释性信息。
因此，本申请还提供了制品。所述制品可以包括容器以及在该容器上或与该容器粘合的标签或包装插页。合适的容器包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶子、罐子、柔性包装等。通常，容器容纳有组合物，并可能具有无菌入口(例如，该容器可能是一个静脉输液袋或一个小瓶，带有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述标签或包装插页表明该组合物用于个体具体病况的成像、诊断或治疗。所述标签或包装插页将还包含用于将在该组合物施用于个体并用于对个体成像的说明。所述标签可表明重组和/或使用的方向。容纳该组合物的容器可为多种用途的小瓶，其允许重构制剂的重复施用(例如2-6次施用)。包装插页是指通常包含在诊断产品的商业包装中的说明，其中该说明包含有关使用此类诊断产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。此外，该制品还可包括第二容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可能还包括从商业和用户角度出发所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
所述试剂盒或制品可包括多个单位剂量的组合物和使用说明，并以足够存储和在药房(例如，医院药房和配制复方的药房)使用的数量包装。
那些熟练的技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内可以有多个实施方案。现在将参照以下非限制性实例更详细地描述本发明。以下实施例进一步说明了本发明，但是当然不应以任何方式限制本发明的范围。
示例性实施方案
实施方案1。有效量的抗PD-L1抗体试剂在制备治疗个体的疾病或病况的药物中的用途，其中所述抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体在HC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体在LC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换。
实施方案2。实施方案1所述的用途，其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ IDNO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方案3。实施方案1或2所述的用途，其中：a)VH包含与SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列；和/或b)VL包含与SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性的氨基酸序列。
实施方案4。实施方案3所述的用途，其中所述抗体部分包含：(a)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(b)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL；(c)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL；(d)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(e)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的VL；(f)含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL；(g)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VL；(h)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL；或(i)含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL。
实施方案5。实施方案1所述的用途，其中所述抗体部分包含与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案6。有效量的抗PD-L1抗体试剂在制备治疗个体的疾病或病况的药物中的用途，其中所述抗体试剂包含抗体部分，所述抗体部分包含：a)分别含有重链可变区(VH)中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH含有SEQ ID NOs:1、5、9、11和13中的任一个氨基酸序列；以及b)分别含有轻链可变区(VL)中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL含有SEQ ID NOs:3、7、15、17和19中的任一个氨基酸序列。
实施方案7。实施方案1-6中任一项所述的用途，其中所述抗体部分是嵌合的或人源化的。
实施方案8。实施方案1-4、6和7中任一项所述的用途，其中所述抗体部分选自：单链Fv(scFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双体抗体(Diabody)、三体抗体(Tribody)和四体抗体(Tetrabody)。
实施方案9。实施方案1-4和6-8中任一项所述的用途，其中所述抗体部分是单链抗体。
实施方案10。实施方案9所述的用途，其中所述抗体部分是scFv。
实施方案11。实施方案1-4和6-8中任一项所述的用途，其中所述抗体部分包含Fc片段。
实施方案12。实施方案11所述的用途，其中所述抗体部分是全长抗体。
实施方案13。实施方案12所述的用途，其中所述抗体部分具有选自以下的同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
实施方案14。实施方案11-13中任一项所述的用途，其中所述Fc片段是IgG的Fc片段。
实施方案15。实施方案14所述的用途，其中所述Fc片段是IgG1或IgG4的Fc片段。
实施方案16。实施方案11-15中任一项所述的用途，其中所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
实施方案17。实施方案1-16中任一项所述的用途，其中所述个体是人。
实施方案18。实施方案1-17中任一项所述的用途，其中所述疾病或病况是癌症。
实施方案19。实施方案18所述的用途，其中所述癌症选自：黑素瘤、肾细胞癌、结直肠癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈肿瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤、默克尔细胞癌、肝癌和宫颈癌。
实施方案20。实施方案1-19中任一项所述的用途，其中所述抗体试剂适用于经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用。
实施方案21。实施方案1-20中任一项所述的用途，其中将所述药物与有效量的第二药剂组合使用。
实施方案22。实施方案21所述的用途，其中所述第二药剂是化疗药剂。
实施方案23。治疗个体的疾病或病况的方法，包括向个体施用有效量的抗PD-L1抗体试剂，其中所述抗PD-L1抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体在HC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体在LC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换。
实施方案24。实施方案23所述的方法，其中有效量的所述抗PD-L1抗体试剂约为0.005μg/kg至约5g/kg个体总体重。
实施方案25。药物组合物，其包含抗PD-L1抗体试剂和药学上可接受的载体，其中所述抗体试剂包含含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，且其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或其变体，所述变体在HC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或其变体，所述变体在LC-CDR中至多总共含有约5个氨基酸替换。
实施方案26。实施方案25所述的药物组合物，其中所述药物组合物是冻干的。
实施方案27。实施方案25所述的药物组合物，其中所述药物组合物是溶液。
实施方案28。实施方案25-27中任一项所述的药物组合物，其包含约0.001μg至约10g的所述抗体部分。
实施方案29。用于治疗个体的疾病或病况的试剂盒，其包含实施方案25-28中任一项所述的药物组合物和使用说明。
实施例
以下实施例旨在纯粹作为本发明的示例，因此不应看作以任何方式限制本发明。以下实施例和详细说明仅以说明的方式而非以限制的方式提供。
实施例1：针对人PD-L1的单克隆抗体的制备和表征
免疫接种
将8-10周龄雌性PD-L1缺陷小鼠(H Dong et al.Immunity.2004Mar；20(3):327-36)在多个部位进行皮下免疫(s.c.)，使用200μl的乳化液，其包含100μg的hPD-L1mIg融合蛋白和完全弗氏佐剂(CFA)(Sigma-Aldrich)。每只动物均接受两次或三次乳化液加强免疫，该乳化液包含以不完全弗氏佐剂(IFA)(Sigma-Aldrich)配制的相同浓度的hPD-L1mIg融合蛋白。每次免疫后两周从动物采集血样进行血清效价测试。在达到足够的滴度后，通过腹膜内注射(i.p.)使动物接受存在于PBS中的60μg PD-L1mIg融合蛋白的加强注射。加强注射后5天，处死动物并无菌收获脾脏。
将整个脾脏离解为单细胞悬液。使用ACK缓冲液裂解红细胞。然后将脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞(来自ATCC)以1：1的比例在50ml锥形离心管中混合。离心后，弃去上清液，并用50％聚乙二醇(Roche)诱导细胞融合。在HAT选择培养基中将融合细胞培养8-10天。使用ELISA分析上清液中内容物与hPD-1表达细胞结合的能力，并使用流式细胞分析进一步确认阳性克隆。使用限制性稀释技术对阳性杂交瘤进行5次亚克隆，以实现纯单克隆培养。
抗hPD-L1单克隆抗体的表征
抗hPD-L1单克隆抗体的结合特异性
通过流式细胞术(FACSVerse，BD Biosciences)，使用hPD-L1转染的CHO细胞(CHO/hPD-L1细胞)确定了抗hPD-L1 mAb的结合特异性。具体而言，将CHO/hPD-L1细胞与递增量的抗hPD-L1 mAb 5B7(0.06ng、0.125ng、0.25ng、0.5ng、1ng、2ng、4ng和100ng)一起在冰上孵育30分钟。在流式细胞分析之前，将细胞清洗并进一步与抗mIgG-APC(eBioscience)孵育。如图1A和1B所示，抗hPD-L1 mAb 5B7以剂量依赖性方式高特异性地与hPD-L1结合。
使用小鼠免疫球蛋白分型试剂盒(BD Biosciences)，确定了该单克隆抗体的亚型为IgG1κ。
物种交叉反应
使用小鼠PD-L1(CHO/mPD-L1)转染的CHO细胞评估抗hPD-L1 mAb与小鼠PD-L1的物种交叉反应性。在流式细胞分析之前，将细胞与抗hPD-L1mAb一起孵育。图2A显示了抗hPD-L1 mAb与人PD-L1结合的特异性。如图2B所示，抗hPD-L1 mAb也与小鼠PD-L1结合。
配体结合的阻断
为了评估抗hPD-L1 mAb对PD-L1结合PD-1的阻断作用，进行了以下阻断实验：将100ng hPD-L1 hIg融合蛋白与指定剂量的mAb(400、300、200、100、50ng/10ul)或对照Ig在4℃下预孵育30分钟，然后再用于结合CHO/hPD-1细胞。然后洗涤细胞，并进一步用山羊抗hIgG-APC染色。用流式细胞术评估mAb的阻断作用。使用类似的方法，还评估了PD-L1 mAb对PD-L1结合B7-1(CD80)的阻断能力。
图3A显示抗hPD-L1 mAb可以剂量依赖性方式阻断hPD-L1与hPD-1的结合。图3B显示，mAb也可以类似的方式阻断hPD-L1与hB7-1的结合。可以看出，mAb可以阻止PD-L1与其结合伴侣的结合。
产生抗hPD-L1抗体的杂交瘤细胞的测序
为了对产生抗体的杂交瘤细胞测序，收集1×107杂交瘤细胞并用PBS洗涤。使用RNeasy小提试剂盒(Qiagen)从杂交瘤中提取mRNA。使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)合成了RACE-Readyfirst-strand cDNA。逆转录后，以现成的cDNA为模板，通过试剂盒提供的5'通用引物(UPM)以及用小鼠IgG1重链可变区和轻链可变区序列设计的3'基因特异性引物(GSP1)，进行5'RACE PCR反应。通过凝胶电泳分析确定RACE产物。然后使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)，将PCR产物克隆到T载体中。转化后，通过测序分析验证质粒。使用VBASE2(worldwide wweb.vbase2.org)分析了重链可变区和轻链可变区的序列，并在表3中列出。
实施例2：抗hPD-L1抗体的人源化和表征
抗hPD-L1抗体的人源化
基于抗hPD-L1杂交瘤细胞的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列，进行人源化。作为初始步骤，产生了包含亲本小鼠VH和VL序列的小鼠-人嵌合mAb、人IgG恒定区和人κ链。根据嵌合抗体的特征，设计并使用了3个VH和3个VL人源化序列，并用于生成9个人源化抗体。表2列出了嵌合和人源化抗hPD-L1抗体的VH和VL序列。
人源化抗hPD-L1抗体的表征
人源化抗hPD-L1抗体的阻断活性
为了检查与亲本嵌合抗体相比，人源化抗体(3种VH和3种VL的组合，总共9种)的阻断活性，进行了类似实施例1的配体结合阻断实验，但使用hPD-L1mIg融合蛋白而不是人源化和嵌合的抗体。图4显示所有人源化抗体均以剂量依赖的方式抑制了PD-L1与CHO/hPD-1细胞的结合。可以看出，所有组合都具有接近于亲本嵌合抗体的阻断活性。在剂量较低时，某些人源化抗体的阻断活性甚至高于亲本嵌合抗体。
实施例3：抗hPD-L1 scFv-hFc抗体的制备和表征
scFv-hFc抗体的序列设计和合成
使用人源化抗hPD-L1抗体变体2的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)生成scFv-hFc抗体。具体而言，所述重链和轻链由接头连接，其后是铰链序列(GACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCC,SEQ ID NO:50)和人免疫球蛋白IgG1 Fc部分(CH2-CH3区)。另外，将H310A(即从CAC到GCC)和H435Q(即从CAC到CAG)突变引入到CH2和CH3区中，以使抗体在体内快速清除(图5)。表6中显示了带有野生型CH2-CH3区(scFv-hFc Wt)和带有突变CH2-CH3区域(scFv-hFc Mt)的scFv-hFc抗体的序列。
将scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt的DNA序列分别克隆到pcDNA3.3载体中，并用于瞬时转染ExPi293细胞。用蛋白G-琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare)纯化细胞培养上清液中的蛋白，以进行功能分析。
scFv-hFc抗体的表征
通过SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定了抗hPD-L1 scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt抗体。如图所示6，在SDS-PAGE凝胶上已还原和非还原的条件下，均鉴定了scFv-hFc抗体。通过FACS检查，与亲本抗体相比，scFv-hFc抗体与hPD-L1的结合亲和力结果如图7所示。如柱状图所示，scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt均显示与亲本抗体相似的结合亲和力。与亲本抗体(抗PD-L1IgG1)相比，scFv-hFc抗体(scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt)与hPD-L1的结合亲和力和动力学采用Fortebio Octet系统进行了进一步分析。表8显示了抗PD-L1 IgG1、抗PD-L1 IgG1-C52W(即具有IgG1 Fc区的C52W突变的抗PD-L1抗体)、scFv-hFc Mt和scFv-hFc Wt的结合亲和力和动力学参数。
表7：抗hPD-L1 scFv-hFc和亲本对照抗体的结合动力学参数
样本 K<sub>D</sub>(M) K<sub>on</sub>(1/Ms) K<sub>off</sub>(1/s) R<sup>2</sup>
抗PD-L1 IgG1 1.54E-11 1.77E+5 2.72E-5 0.9834
抗PD-L1 IgG1 C52W 3.40E-10 1.33E+5 4.53E-4 0.9732
抗PD-L1 scFv-hFc Wt 3.48E-10 6.98E+6 2.43E-4 0.97
抗PD-L1 scFv-hFc Mt 2.32E-10 1.66E+6 3.85E-4 0.9812
通过向体内注射scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt抗体，然后在注射后第1、2、3、4和6天测量scFv-Fc抗体和hIgH的血清效价，进行药代动力学研究。如图8A和8B所示，与scFv-hFcMt相比，scFv-hFc Wt显示出更高的抗体和hIgG血清效价。
实施例4：抗PD-L1 scFv的生成和表征
人源化抗PD-L1scFv的生成和小规模表达
抗hPD-L1 scFv、亲本人源化IgG1阳性对照抗体和阴性对照scFv的构建体设计示意图如图9所示。具体而言，人工合成了来自人源化抗hPD-L1抗体的含有VH和VL抗原结合域的片段和它们之间的肽接头，其包括两个方向(即VH-接头-VL，以及VL-接头-VH)。将(Gly4-Ser)4(SEQ ID NO:47)肽和GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:48)肽接头用于所有scFv的构建中。此外，还通过在VH44/VL100或VH105/VL43引入单个突变(根据Kabat编号系统)构建了sc-dsFv。包含VH和VL的片段还分别包括位于5’端和3’端的限制性核酸内切酶HindIII和EcoRI识别位点，以及在C端的His标签序列。通过重叠PCR在5末端将包含VH和VL的片段与人IgG1重链CH1-CH2-CH3或IgG1轻链CL融合。然后将融合的重链和轻链克隆到pCDNA3.1(+)表达载体的相应HindIII和EcoRI识别位点中。设计并合成了总共八个scFv。所述scFv包含表5中显示的序列。此外，每个scFv均包含通过短肽接头(即SEQ ID NO:51)融合到C末端的His标签。还合成了亲本人源化IgG1阳性对照抗体和阴性对照scFv(irr-对照scFv)的构建体。
将所述构建体瞬时转染到expiCHO细胞中。18小时后添加一次性喂食，并在连续培养5天后收获上清液。通过蛋白L琼脂糖柱(GE Healthcare)和superdex-75增加柱(GEHealthcare)纯化上清液中的蛋白，以进行功能分析。同样地转染和纯化了亲本人源化IgG1阳性对照抗体和阴性对照scFv。通过Fortebio Octet技术测量了scFv的效价。通过Nanodrop微量分光光度计确定最终纯化的scFv的浓度。选择50mg/L的产率最高的sc-dsFv用于同位素标记，并称为scFv(PD-L1)。图10显示了在还原和非还原条件下，scFv(PD-L1)、亲本人源化IgG1阳性对照抗体和阴性对照scFv的SDS-PAGE结果。
scFv(PD-L1)的表征
通过FACS测量的scFv(PD-L1)的PD-L1结合活性
收获CHO/PD-L1稳定细胞，并用FACS缓冲液(1XPBS，1％FBS)洗涤两次。然后将细胞分别用不同稀释度的亲本人源化IgG1阳性对照抗体(抗PD-L1IgG1)或scFv(PD-L1)在冰上染色30分钟。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，再用60ng的缀合有PE的抗人Fc抗体(抗HuFc-PE，BD)染色，或用60ng的缀合有PE的抗His标签抗体(抗Hista-PE，eBioscience)染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并悬浮在300mL的FACS缓冲液中。如图11中的直方图所示，亲本人源化IgG1阳性对照抗体(抗PD-L1 IgG1)及scFv(PD-L1)的结合活性均证明了其浓度依赖性。
通过ForteBio Octet RED96测量的scFv(PD-L1)结合PD-L1的亲和力
所有样品均在PBS缓冲液(pH＝7.4)中制备。将生物素标记的hPD-L1小鼠Fc融合蛋白以预定的加载阈值加载到SA传感器上。将scFv(PD-L1)以3.125nM-50nM的浓度梯度应用于传感器。减去背景值以校正传感器漂移。使用ForteBio的数据分析软件，将数据拟合至1∶1结合模型，以获得缔合(Kon)和解离(Koff)速率。根据Koff/Kon计算KD值。如表9所示，scFv(PD-L1)的结合亲和力与亲本人源化IgG1阳性对照抗体相似。
表8：scFv(PD-L1)和亲本人源化IgG1阳性对照抗体的结合亲和力分析
样品 K<sub>D</sub>(M) K<sub>off</sub>(1/s) K<sub>on</sub>(1/Ms) R<sup>2</sup>
抗人PD-L1 IgG1 6.92E-09 2.25E-04 3.26E+04 0.9993
scFv(PD-L1) 7.11E-09 7.01E-04 9.85E+04 0.995
通过差示扫描荧光法(DSF)测量的scFv(PD-L1)的疏水性暴露温度
如上所述表达并纯化了scFv(PD-L1)、亲本人源化IgG1阳性对照抗体和阴性对照scFv(irr-对照scFv)。使用了两种缓冲液条件(pH7.4的1×PBS和pH5.5的柠檬酸钠缓冲液)，并使用Hitrap G25色谱柱(GE Healthcare)通过浓缩蛋白质储备液的缓冲液交换实现了该缓冲液条件。更换缓冲液后，在Nanodrop(Thermofisher)上测定洗脱液的蛋白浓度。scFv(PD-L1)和irr-对照scFv的最终浓度为1mg/ml，且亲本人源化IgG1阳性对照抗体的浓度为0.5mg/ml。在紧邻使用前，用相应的缓冲液将SYPRO Orange储备溶液(5000×)稀释至25×的浓度。然后将稀释的染料添加到蛋白样品中，以达到5×的SYPRO Orange最终工作浓度。用CFX96实时PCR系统(Bio-Rad Laboratories)测量SYPRO Orange信号。根据与SYPRO橙色荧光信号兼容的“FRET”通道，确定激发/发射滤波器设置。将样品暴露于25℃至95℃的温度梯度，加热速率为1℃/min，增量为0.5℃。表示在该温度梯度期间SYPRO Orange信号变化的-d(RFU)/dT曲线如图12的所示。-d(RFU)/dT曲线的第一波谷被定义为疏水性暴露温度(Tm1或Th)，并通过CFX ManagerTM软件用数学二阶导数法计算得出。如图12所示，scFv(PD-L1)表现出的Tm1为61℃，亲本人源化IgG1阳性对照抗体表现出的Tm1为62℃，而阴性对照scFv表现出的Tm1为54℃。在PBS缓冲液和柠檬酸钠缓冲液中，scFv(PD-L1)表现出与亲本抗体相似的热稳定性。
在低温和酸性pH条件下scFv(PD-L1)的稳定性
对scFv(PD-L1)和亲本人源化IgG1阳性对照抗体进行40℃加速稳定性测试。简而言之，将scFv(PD-L1)和对照抗体置于浓度为1mg/mL的4℃或40℃稳定性测试室(MemmertICH110L)中。每两周从腔室中取出样品，并使用FACS测量其与PD-L1的结合亲和力。如图13A-13D所示，在高温(40℃)和高pH(pH7.4)条件下，scFv(PD-L1)的结合亲和力随时间急剧降低。在低温(4℃)和酸性pH(pH5.5)条件下，scFv(PD-L1)具有相对稳定的特性。
实施例5：抗hPD-L1 scFv的放射性标记以及放射性标记的抗hPD-L1scFv的表征
68Ga-NOTA-抗PD-L1抗体部分的制备
以下描述的实验以抗hPD-L1 scFv为实例，制备用于检测人PD-L1的成像剂。使用类似的实验程序，通过用另一抗hPD-L1抗体部分(例如，scFv、scFv-Fc或全长抗体)替换下述抗hPD-L1 scFv，以制备具有其他抗hPD-L1抗体部分的成像剂。
抗hPD-L1 scFv和NOTA的结合
以2.318mg/mL的浓度(在20mM柠檬酸/柠檬酸钠/氯化钠中缓冲，+0.8％(m/v)，pH5.5)配制scFv抗体。在该scFv抗体溶液中加入400μL的0.05M NaHCO3-Na2CO3(pH8.7)，然后以16000rpm的转速离心20分钟。去除上清液以达到最终体积100μL。以上步骤再重复一遍，并将最终的100μL溶液转移到1.5mL离心管中。将2.64μL的p-SCN-Bn-NOTA以927μM的最终浓度加入离心管中，然后在37℃孵育1小时。
在将scFv/NOTA溶液添加到NAP-5柱中之前，将其用PBS预平衡。然后用0.4mL的PBS洗涤柱，并用0.5mL的PBS洗脱。将洗出液等分为0.05mL的部分，并在-20℃下储存。
用68Ga标记NOTA-抗PD-L1 scFv
用0.05N HCl将68Ga洗涤至最终浓度为21mCi/mL。然后将46.5μL的1.25M乙酸钠加入以达到最终为4的pH值。将50μL的NOTA-抗PD-L1 scFv(0.05mg/ml)加入到350uL 68Ga中，然后于25℃孵育10分钟。使用薄层色谱纸测定68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv的标记率。当使用0.1M柠檬酸盐作为膨胀剂时，标记率被测定为17％。当使用PBS作为膨胀剂时，标记率被测定为100％。
68Ga-NOTA-PD-L1 scFv的纯化
纯化68Ga-NOTA-PD-L1 scFv，首先用PBS平衡NAP-5柱，然后添加400μL的68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv。然后用400μL PBS洗涤柱，再用另外400μL PBS洗脱。
68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv的质量控制
使用即时薄层色谱-硅胶-凝胶(ITLC-SG)测量该纯化的68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv的放射化学纯度，以0.1M的柠檬酸钠作为展开剂，以标记的产品为起点，以及显影剂的前沿为解离的68Ga。如图14和15所示，68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv的产率为17％，纯度为93.5％。
68Ga-NOTA-抗PD-L1scFv与人PD-L1在体外特异性结合
68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv细胞结合测定。将MC38和MC38-PD-L1细胞分别接种在24孔板的12孔中，密度为2.5×105个细胞/孔。将细胞在37℃下过夜培养。在第二天，将68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv添加到的各孔中，最终浓度为0.20、0.40、0.80、1.60、3.20和6.40nM(每个浓度有两个重复)，并在37℃下孵育细胞1小时。用冰冷的PBS洗涤三遍后，用0.1M NaOH溶解细胞，并使用γ计数仪测量放射性。使用GraphPad Prism软件，计算68Ga-NOTA-抗PD-L1scFv的KD值。如图所示16，相比MC38细胞，针对MC38-PD-L1(也称为“MC38-B7H1”)细胞，68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv表现出具有更高的结合亲和力，与MC38-PD-L1结合的KD值为1.53±0.44nM。
68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv竞争性结合分析。将MC38细胞接种到8个孔中，并将MC38-PD-L1细胞接种到24孔板的16个孔中，密度为2.5×105个细胞/孔。第二天，以20、40、80和160nM的最终浓度添加抗PD-L1 IgG1。分别以0.20、0.40、0.80、1.60、3.20和6.40nM的最终浓度，一式两份添加抗PD-L1 IgG1和68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv。将细胞在37℃下孵育1小时。用冰冷的PBS洗涤三遍后，用0.1M NaOH溶解细胞，并使用γ计数仪测量放射性。
如图所示17，抗PD-L1 IgG1阻断了68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv与MC38-PD-L1细胞的结合。结果表明，68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv与人PD-L1的结合是特异性的。
68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv在活体内的成像
活体内成像测定
胰蛋白酶消化后，培养并计数MC38细胞和MC38-PD-L1细胞。将1x106个MC38-PD-L1细胞注射入5只6-8周龄雌性小鼠的右腋窝中，并将1x106个MC38细胞注射入相同小鼠的左腋窝中。另外5只6-8周龄雌性小鼠仅向右腋窝注射1×106个MC38-PD-L1细胞。6天后肿瘤达到直径约0.5cm，此时该动物通过尾静脉注射接受200uCi 68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv。注射后0.5个小时、1个小时和2个小时，进行实时成像，曝光时间为5分钟。
图18中显示了在注射后1小时和2小时后拍摄的最大曝光图像。相比左腋窝(注射MC38细胞)的肿瘤，右腋窝(注射MC38-PD-L1细胞)的肿瘤表现出更强的表达。与注射后1小时相比，注射后2小时左腋窝肿瘤更明显。在肝脏和心脏组织中观察到低的摄取和暴露，而在肾脏中观察到高的摄取。
图19显示了在注射68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv后0.5小时、1小时和2小时，动物#1至#6的体内成像结果。动物#1至#4仅在右腋窝中接受MC38-PD-L1细胞，而动物#5和#6除右腋下接受MC38-PD-L1细胞外左腋窝也接受MC38细胞。结果显示，在0.5小时内可检测到放射性信号，而肾脏吸收并未随时间显著下降。动物#1显示清晰的影像，并且可能与肿瘤的特定生长状况有关。
体内成像测定中的结合竞争
胰蛋白酶消化后，培养并计数MC38细胞和MC38-PD-L1细胞。将1×106个MC38-PD-L1细胞注射到5只6-8周龄雌性小鼠(#2、#3、#4、#7和#8)的右腋窝中。还将1x106个MC38细胞注射到#7和#8小鼠的左腋窝中。6天后，肿瘤直径达到约0.5厘米。动物#3、#4、#7和#8通过尾静脉注射接受了未标记的抗体抗PD-L1 IgG1和140uCi的68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv。以68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv浓度的50倍浓度注射未标记的抗PD-L1 IgG1抗体。仅作为对照，动物#2接受了140uCi的68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv。注射后0.5个小时、1个小时和2个小时，进行活体成像，曝光时间为5分钟。如图所示20，动物#2显示68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv与B7H1(PD-L1)的结合，而当以68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv浓度的50倍浓度注射时，未标记的ab-220抗体阻断了68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv与B7H1(PD-L1)的结合。
68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv和68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv-Fc之间的比较
胰蛋白酶消化后，培养并计数MC38细胞和MC38-PD-L1细胞。将1x106个MC38-PD-L1细胞注射入5只6-8周龄雌性小鼠的右腋窝中，并将1x106个MC38细胞注射入相同小鼠的左腋窝中。6天后肿瘤达到直径约0.5厘米，此时动物通过尾静脉注射接受200μCi 68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv、未标记的抗PD-L1 scFv和200μCi 68Ga-抗PD-L1 scFv或200μCi 68Ga-NOTA-抗PD-L1scFv-Fc。注射后0.5个小时、1个小时和2个小时，进行活体成像，曝光时间为5分钟。对于注射了68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv-Fc的小鼠，使用正常的相机感光度设置和降低的相机感光度设置(正常条件的1/4)拍摄图像。
图21显示了注射成像剂后30分钟的成像结果并排比较。该图从左到右显示了：注射了68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv的小鼠、注射了未标记的抗PD-L1scFv和68Ga-NOTA-抗-PD-L1scFv的小鼠、注射了68Ga-NOTA-抗PD-L1scFv-FC(wt)的小鼠在正常相机感光度设置下的成像结果，以及同样的注射了68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv-FC(wt)的小鼠在降低的相机感光度设置下的成像结果。
图22显示了注射成像剂后60分钟(上图)和120分钟(下图)的成像结果并排比较。该图从左到右显示了：注射了68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv的小鼠、注射了未标记的抗PD-L1scFv和68Ga-NOTA-抗-PD-L1 scFv的小鼠、注射了68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv-FC(wt)的小鼠在正常相机感光度设置下的成像结果，以及同样的注射了68Ga-NOTA-抗PD-L1 scFv-FC(wt)的小鼠在降低的相机感光度设置下的成像结果。
序列表
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<120> 治疗疾病或病况的组合物及其用途
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Cys Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Gln Leu Ala Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg cattggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
gtgcagctcg ccagtctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
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<220>
<223> 合成构建体
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
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<212> DNA
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcact 60
ctcagttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca 120
gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc acatcgactt tagattctgg tgtcccaaaa 180
aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240
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gggaccaagc tggagctgaa acgg 324
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Cys Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Gln Leu Ala Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
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gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
gtgcagctcg ccagtctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagct 360
agcaccaagg gccccagcgt gttccctctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcgga 420
accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 480
aacagcggcg ctctgaccag cggagtgcac accttccctg ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtactccc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcctaag 660
agctgcgaca agacccacac ctgccctccc tgccccgccc ccgagctgct gggcggaccc 720
agcgtgttcc tgttccctcc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg cacccccgag 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 840
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acctaccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成构建体
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
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Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
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Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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<223> 合成构建体
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
tcctgcaaag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gccccgaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccaa cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctca 357
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
gaggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
tcctgcaaag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gcccagaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccaa cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctca 357
<210> 15
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 16
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga tagagtcact 60
atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggtatca gcagaaaaaa 120
cgcctgatct acgccacatc gactttagat tctggtgtcc caagtaggtt cagtggcagt 180
gggtctggga cagattttac tctcaccatc agcagccttc agcctgaaga ttttgcaacc 240
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<210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 18
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga tagagtcact 60
atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca 120
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aggttcagtg gcagtaggtc tgggacagat tatactctca ccatcagcag ccttcagcct 240
gaagattttg caacctatta ctgtctacaa tatgctattt atccgctcac gttcggtcag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgg 324
<210> 19
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 20
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga tagagtcact 60
atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggtatca gcagaaacca 120
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gaagattttg caacctatta ctgtctacaa tatgctattt atccgctcac gttcggtcag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgg 324
<210> 21
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
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Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
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Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
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Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 22
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gcccagaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccag cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctcaggc 360
agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc ggcgagggca gcaccaaggg cgacatccag 420
atgacccagt ctccatcctc cttatctgcc tctgtgggag atagagtcac tatcacttgt 480
cgggcaagtc aggaaattag tggttactta agctggcttc agcagaaacc aggtaaggct 540
cctaaacgcc tgatctacgc cacatcgact ttacagtctg gtgtcccaag taggttcagt 600
ggcagtaggt ctgggacaga ttatactctc accatcagca gccttcagcc tgaagatttt 660
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ctggagatca aacgggacaa gacccacacc tgccctccct gccccgcccc cgagctgctg 780
ggcggaccca gcgtgttcct gttccctccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc 840
acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcctcg ggaggagcag 960
tacaactcca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgctcccat cgagaagacc 1080
atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag cctcaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 1140
gacgagctga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccacccct 1260
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cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380
tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggataataa 1419
<210> 23
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Gln Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 24
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
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cctggacagg gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
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ggcagtaggt ctgggacaga ttatactctc accatcagca gccttcagcc tgaagatttt 660
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aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcctcg ggaggagcag 960
tacaactcca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tggcccagga ctggctgaac 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgctcccat cgagaagacc 1080
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gacgagctga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 1200
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tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggataataa 1419
<210> 25
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 26
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
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atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctcaggt 360
ggcggtggct ctggaggtgg tgggagcggt ggcggcggat ctgggggtgg cggaagcgac 420
atccagatga cccagtctcc atcctcctta tctgcctctg tgggagatag agtcactatc 480
acttgtcggg caagtcagga aattagtggt tacttaagct ggcttcagca gaaaccaggt 540
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<210> 27
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 28
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
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tcctgcaagg cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gcccagaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccag cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctcaggc 360
agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc ggcgagggca gcaccaaggg cgacatccag 420
atgacccagt ctccatcctc cttatctgcc tctgtgggag atagagtcac tatcacttgt 480
cgggcaagtc aggaaattag tggttactta agctggcttc agcagaaacc aggtaaggct 540
cctaaacgcc tgatctacgc cacatcgact ttacagtctg gtgtcccaag taggttcagt 600
ggcagtaggt ctgggacaga ttatactctc accatcagca gccttcagcc tgaagatttt 660
gcaacctatt actgtctaca atatgctatt tatccgctca cgttcggtca ggggaccaag 720
ctggagatca aacggggagg tggtgggtct caccatcacc atcaccat 768
<210> 29
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 30
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagt gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg ccaatgataa tactaaatat 180
gcccagaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccag cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagccaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctcaggt 360
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atccagatga cccagtctcc atcctcctta tctgcctctg tgggagatag agtcactatc 480
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aaggctccta aacgcctgat ctacgccaca tccactttac agtctggtgt cccaagtagg 600
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accaagctgg agatcaaacg gggaggtggt gggtctcacc atcaccatca ccat 774
<210> 31
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Cys Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Cys Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 32
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
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cctggacagg gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
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atccagatga cccagtctcc atcctcctta tctgcctctg tgggagatag agtcactatc 480
acttgtcggg caagtcagga aattagtggt tacttaagct ggcttcagca gaaaccaggt 540
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ttcagtggca gtaggtctgg gacagattat actctcacca tcagcagcct tcagcctgaa 660
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<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
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Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
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195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<223> 合成构建体
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Val Thr Val Ser Ser
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
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<211> 774
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
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Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
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<210> 44
<211> 6
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
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<211> 3
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<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
<400> 47
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Gly Gly Gly Ser
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<211> 18
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 48
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1 5 10 15
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<210> 49
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
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Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
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195 200 205
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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gacaagaccc acacctgccc tccctgcccc 30
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<211> 11
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<220>
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<400> 51
Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His
1 5 10
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Asp Thr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Lys Asp Thr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Asp Pro Ala Asn Asp Asn
1 5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys
1 5 10
<210> 59
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys
1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp
1 5 10
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu
1 5
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln
1 5 10
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
1 5

Claims (28)

1.有效量的抗PD-L1抗体试剂在制备治疗个体的疾病或病况的药物中的用途，其中所述抗体试剂包含含有重链可变区VH和轻链可变区VL的抗体部分，且其中：
a) 所述VH包含：SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的HC-CDR1，SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的HC-CDR2，以及SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的HC-CDR3；和
b) 所述VL包含：SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列的LC-CDR1，SEQ ID NO: 45所示的氨基酸序列的LC-CDR2，以及SEQ ID NO: 46所示的氨基酸序列的LC-CDR3。
2.根据权利要求1所述的用途，其中：
a) 所述VH包含：SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的HC-CDR1，SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的HC-CDR2，以及SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的HC-CDR3；和
b) 所述VL包含：SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列的LC-CDR1，SEQ ID NO: 45所示的氨基酸序列的LC-CDR2，以及SEQ ID NO: 46所示的氨基酸序列的LC-CDR3。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中：
a) 所述VH包含与SEQ ID NOs: 1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和/或
b) 所述VL包含与SEQ ID NOs: 3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少80%的序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述抗体部分包含：
(a) 含有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的VL；
(b) 含有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的VL；
(c) 含有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的VL；
(d) 含有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的VL；
(e) 含有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的VL；
(f) 含有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的VL；
(g) 含有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的VL；
(h) 含有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的VL；或
(i) 含有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的VL。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗体部分包含与SEQ ID NO: 21或23的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
6.有效量的抗PD-L1抗体试剂在制备治疗个体的疾病或病况的药物中的用途，其中所述抗体试剂包含抗体部分，所述抗体部分包含：
a) 分别含有重链可变区VH中的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中VH是SEQ ID NOs: 1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列；以及
b) 分别含有轻链可变区VL中的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中VL是SEQ ID NOs: 3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-2和5-6中任一项所述的用途，其中所述抗体部分是嵌合的或人源化的。
8.根据权利要求1-2和5-6中任一项所述的用途，其中所述抗体部分选自：单链Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双体抗体、三体抗体和四体抗体。
9.根据权利要求1-2和5-6中任一项所述的用途，其中所述抗体部分是单链抗体。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述抗体部分是scFv。
11.根据权利要求1-2和5-6中任一项所述的用途，其中所述抗体部分包含Fc片段。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述抗体部分是全长抗体。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述抗体部分具有选自以下的同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
14.根据权利要求11所述的用途，其中所述Fc片段是IgG的Fc片段。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述Fc片段是IgG1或IgG4的Fc片段。
16.根据权利要求11所述的用途，其中所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
17.根据权利要求1-2和5-6中任一项所述的用途，其中所述个体是人。
18.根据权利要求1-2和5-6中任一项所述的用途，其中所述疾病或病况是癌症。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述癌症选自：黑素瘤、肾细胞癌、结直肠癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、头颈肿瘤、胃癌、B细胞淋巴瘤、默克尔(Merkel)细胞癌、肝癌和宫颈癌。
20.根据权利要求1-2和5-6中任一项所述的用途，其中所述抗体试剂适用于经静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用。
21.根据权利要求1-2和5-6中任一项所述的用途，其中将所述药物与有效量的第二药剂组合使用。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述第二药剂是化疗药剂。
23.根据权利要求1-2和5-6中任一项所述的用途，其中有效量的所述抗PD-L1抗体试剂为0.005μg/kg至5g/kg个体总体重。
24.药物组合物，其包含抗PD-L1抗体试剂和药学上可接受的载体，其中所述抗体试剂包含含有重链可变区VH和轻链可变区VL的抗体部分，且其中：
a) 所述VH包含：SEQ ID NO: 41所示的氨基酸序列的HC-CDR1，SEQ ID NO: 42所示的氨基酸序列的HC-CDR2，以及SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列的HC-CDR3；和
b) 所述VL包含：SEQ ID NO: 44所示的氨基酸序列的LC-CDR1，SEQ ID NO: 45所示的氨基酸序列的LC-CDR2，以及SEQ ID NO: 46所示的氨基酸序列的LC-CDR3。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述药物组合物是冻干的。
26.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述药物组合物是溶液。
27.根据24-26中任一项所述的药物组合物，其包含0.001μg至10g的所述抗体部分。
28.用于治疗个体的疾病或病况的试剂盒，其包含权利要求24-27中任一项所述的药物组合物和使用说明。
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