ES2289778T3 - Proteinas de fusion de la region constante de la inmunoglobulina/receptor tgf-beta tipo ii. - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende una proteína de fusión del receptor de TGF-beta de tipo II (TGF-beta R II) que comprende: (a) un polipéptido codificado por el polinucleótido mostrado en la ID SEC Nº 2; (b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 8; o (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 8, y una región constante de una inmunoglobulina, en la que dicha proteína de fusión de TGF-beta R II se une a TGF-beta.
Description
Proteínas de fusión de la región constante de la
inmunoglobulina/receptor TGF-beta tipo II.
La presente invención se refiere a las proteínas
de fusión del receptor de TGF-beta soluble y a sus
usos en procedimientos de tratamiento de condiciones caracterizadas
por una sobreproducción de TGF-beta, incluyendo la
fibroproliferación.
El factor de crecimiento transformante beta
(TGF-beta) representa a una familia de polipéptidos,
de los cuales tres están presentes en mamíferos,
TGF-beta 1, TGF-beta 2 y
TGF-beta 3. Estos factores tienen efectos globales
sobre el crecimiento y la diferenciación celular (Roberts y Sporn
(1990) Handbk. Exp. Pharm. 95:419-58). Existen cada
vez más evidencias de que el TGF-beta también modula
el proceso inmune (Wahl y col. (1989) Immunol. Today
10:258-61). Además de estimular la acumulación de
células inmunes en el sitio de lesión, el TGF-beta
también proporciona una potente retroalimentación positiva para su
propia síntesis continuada (Kim y col. (1990) Mol. Cell. Biol.
10:1492-1497).
El TGF-beta puede ser un factor
importante en la etiología de los trastornos fibroproliferativos. Se
sabe que el TGF-beta estimula a las células para
que produzcan más proteínas, como colágeno, biglicano, decorina y
fibronectina, e inhibe enzimas que degradan estas proteínas. De este
modo, el TGF-beta puede causar acumulación de
tejido fibroso. Por ejemplo, en la nefropatía diabética y en la
glomerulonefritis proliferativa mesangial humana, ambos trastornos
fibroproliferativos, una característica patológica notable e
importante es la acumulación de matriz mesangial (Mauer y col.
(1984) J. Clin. Invest, 74: 1143-55). Asimismo, la
fibrosis postradiación se caracteriza por un exceso de
TGF-beta, proliferación de fibroblastos y
sobreproducción de tejido conectivo (Canney y Dean (1990) Brit. J.
Radiol. 63:620-23). Los expertos en este campo han
intentado suprimir los efectos del TGF-beta
mediante la administración de anticuerpos
anti-TGF-beta. Véase Border y col.
(1990) Nature 346:371-74; Border y col. ((1992)
Kidney Int. 41:566-570).
Los efectos biológicos del
TGF-beta están mediados por diversas proteínas
específicas de la superficie celular, incluyendo los receptores
denominados TGF-beta de tipo I, tipo II y tipo III.
La mayoría de ellos se identificaron inicialmente mediante
entrecruzamiento químico de TGF-beta marcado con
yodo radioactivo a proteínas de la superficie celular usando el
agente bifuncional DSS. Casi todas las líneas celulares sensibles al
TGF-beta expresan tanto receptores de tipo I como
de tipo II, aunque los niveles de su expresión pueden variar entre
los diferentes tipos de células. Ni el receptor de tipo I ni el de
tipo II pueden mediar una respuesta a TGF-beta en
ausencia del otro, aunque el receptor de tipo II por sí solo es
capaz de unirse a TGF-beta.
En cuanto al desarrollo de inhibidores de
TGF-beta mejorados para tratar trastornos
fibroproliferativos, es importante considerar que estos inhibidores
deben tener un peso molecular mucho más bajo y una afinidad mayor
que los anticuerpos anti-TGF-beta.
Esta combinación de características permitiría dosis mucho más bajas
y un fácil aumento de la administración. Además, una proteína
nativa no causaría reacciones cruzadas entre especies.
Por consiguiente, la presente invención se
dirige a composiciones nuevas y usos de las composiciones en
procedimientos para el tratamiento terapéutico de pacientes con
trastornos fibroproliferativos, como se describe a continuación en
este documento.
La invención también se dirige a vectores de ADN
recombinante que permiten la expresión de proteínas de fusión del
receptor de TGF-beta en células hospedadoras
bacterianas y de mamífero y a procedimientos de uso de las
mismas.
Un aspecto de la invención es una proteína de
fusión del receptor de TGF-beta que inhibe de forma
competitiva la unión de TGF-beta al receptor de
TGF-beta, en el que esta proteína es un receptor de
TGF-beta de tipo II que comprende (a) un
polipéptido codificado por el polipéptido mostrado en la ID SEC Nº
2; (b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de
la ID SEC Nº 8 o (c) un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos que es al menos el 98% idéntica a la secuencia de
aminoácidos de la ID SEC Nº 8, ligado a una segunda proteína que no
es un receptor de TGF-beta de tipo II, en el que la
segunda proteína es una región constante de una inmunoglobulina.
Otras proteínas preferidas contienen la nueva secuencia de
aminoácidos de la ID SEC Nº 11 que incluye la región de fusión en
uno cualquiera de los dos lados de la unión entre el receptor de
TGF-beta y la inmunoglobulina.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se ilustran mediante una proteína de fusión del receptor de
TGF-beta que comprende (a) un polipéptido codificado
por el polipéptido mostrado en la ID SEC Nº 2; (b) un polipéptido
que comprende la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 8 o (c) un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al
menos el 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº
8 en un vehículo farmacéuticamente aceptable, la proteína de fusión
en una cantidad suficiente para inhibir de forma competitiva la
unión de TGF-beta a un ligado de
TGF-beta.
\newpage
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de una proteína de fusión de TGF-beta RII que
comprende
(a) un polipéptido codificado por el
polinucleótido mostrado en las ID SEC Nº 2 ó 4;
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos de las ID SEC Nº 8 ó 9 o
(c) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos que es al menos el 98% idéntica a la secuencia de
aminoácidos de las ID SEC Nº 8 ó 9,
y una región constante de una inmunoglobulina,
en el que dicha proteína de fusión de TGF-beta RII
se une al TGF-beta para la preparación de una
composición farmacéutica para el tratamiento de un sujeto que padece
un trastorno fibroproliferativo.
También se incorporan en este documento
polinucleótidos aislados que codifican, tras su expresión, un
receptor de TGF-beta de tipo II unido a una segunda
proteína que no es un receptor de TGF-beta de tipo
II como se describe en este documento. Los polinucleótidos
preferidos se seleccionan entre el grupo constituido por las ID SEC
Nº 1, 2, 3, 4, 10 y 12. También se describen en este documento los
polinucleótidos que hibridan con estas secuencias en condiciones de
hibridación convencionales y que codifican una proteína con
actividad inhibidora de TGF-beta de una proteína de
fusión del receptor de TGF-beta de tipo II. También
se abarcan en este documento los polinucleótidos que codifican,
tras su expresión, una proteína codificada por las secuencias
polinucleotídicas preferidas.
Los procedimientos de la invención incluyen un
procedimiento para producir la proteína de fusión del receptor de
TGF-beta como se describe en este documento, que
comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector de
la invención, permitir que dicha célula exprese la proteína de
fusión, aislar y purificar la proteína de fusión.
Una realización es un uso de una composición en
un procedimiento para reducir los niveles de
TGF-beta en un individuo, que comprende la
administración al individuo de una cantidad eficaz de un antagonista
del TGF-beta, que es una proteína de fusión del
receptor de TGF-beta que comprende la secuencia de
aminoácidos de las ID SEC Nº 8, 9, 11 y 13.
Otra realización es el uso de una composición en
un procedimiento para reducir los niveles de
TGF-beta en un individuo con artritis, que
comprende la administración al individuo de una cantidad eficaz de
un antagonista del TGF-beta, que es una proteína de
fusión del receptor de TGF-beta que comprende la
secuencia de aminoácidos de las ID SEC Nº 8, 9, 11 y 13.
En una realización, la invención proporciona un
uso de una composición en un procedimiento para tratar a un
individuo de una enfermedad relacionada con un trastorno
fibroproliferativo. El procedimiento establece la administración
parenteral, oral o local de una cantidad suficiente de la proteína
de fusión del receptor de TGF-beta soluble al
individuo para reducir o mejorar el trastorno y/o bloquear la
actividad del TGF-beta en el individuo.
Aún en otra realización, el uso de la
composición en el procedimiento de la presente invención establece
la administración de la proteína de fusión del receptor de
TGF-beta mediante procedimientos intravenosos,
intraoculares, intraarticulares, transdérmicos o enterales. En otra
realización de la presente invención, la composición que comprende
la proteína de fusión del receptor de TGF-beta se
administra a pacientes con trastornos vasculares del colágeno,
tales como esclerosis sistémica, polimiositis, escleroderma,
dermatomiositis o lupus eritematoso sistémico.
Aún en otra realización de la presente
invención, la composición que comprende la proteína de fusión del
receptor de TGF-beta se administra a pacientes con
fibrosis intraocular y pulmonar. En una realización adicional, la
proteína de fusión del receptor de TGF-beta se
administra a pacientes con nefropatía diabética, glomerulonefritis,
vitreorretinopatía proliferativa y artritis reumatoide.
Aún en otra realización, el uso de la
composición en el procedimiento de la presente invención establece
el tratamiento de una herida en un individuo para evitar la
sobreproducción de formaciones de tejido conectivo que se asocia
con la regulación por incremento del TGF-beta. El
uso de la composición del procedimiento establece la administración
de una cantidad suficiente de la proteína de fusión del receptor de
TGF-beta al individuo para reducir la cantidad o
actividad del TGF-beta en el individuo. En
realizaciones adicionales, los tipos de heridas incluyen incisiones
quirúrgicas, laceraciones inducidas por trauma y heridas que afectan
al peritoneo para las cuales la sobreproducción de formaciones de
tejido conectivo significa adhesiones abdominales. En una
realización adicional, la sobreproducción de formaciones de tejido
conectivo que se intentan evitar incluyen cicatrices, como aquellas
en las que la cicatriz implica una restenosis de vasos sanguíneos, y
cicatrices hipertróficas y queloides.
En otra realización la invención proporciona un
uso de una composición en un procedimiento para prevenir la
fibrosis postradiación en un individuo que se ha sometido o va a ser
sometido a radioterapia. La proteína de fusión del receptor de
TGF-beta se administra a una cantidad suficiente
para prevenir la sobreproducción de formaciones de tejido
conectivo.
Ha de entenderse que tanto la descripción
general anterior como la descripción detallada siguiente son sólo
ilustrativas y explicativas y no pretenden proporcionar una
explicación adicional de la invención como se reivindica.
ID SEC Nº 1: Secuencia de nucleótidos del
vector de expresión TGF\betaRII:Fc de conejo
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA ID Nº 2: Secuencia de nucleótidos de
TGF\betaRII:Fc de conejo
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA ID Nº 3: Secuencia de nucleótidos del
vector de expresión TGF\betaRII:Fc humano
\newpage
SECUENCIA ID Nº 4: Secuencia de nucleótidos de
TGF\betaRII:Fc humano
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA ID Nº 5: Cebador sentido: conejo y
humano
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA ID Nº 6: Cebador complementario:
conejo
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA ID Nº 7: Cebador complementario:
humano
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA ID Nº 8: Secuencia de aminoácidos de
TGF\betaRII:Fc de conejo
\newpage
SECUENCIA ID Nº 9: Secuencia de aminoácidos de
TGF\betaRII:Fc humano
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA ID Nº 10: Secuencia de nucleótidos de
la "unión" de la fusión RII:Fc de conejo
\vskip1.000000\baselineskip
ID SEC Nº 11: Secuencia de los aminoácidos de
"unión" de la fusión RII:Fc de conejo
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA ID Nº 12: Secuencia de los nucleótidos
de la "unión" de la fusión RII:Fc humano
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA ID Nº 13: Secuencia de los aminoácidos
de la "unión" de la fusión RII:Fc humano
En este documento se usan los siguientes
términos:
"Recombinante", según se usa en este
documento, significa que una proteína deriva de sistemas de
expresión recombinantes (p. ej., microbianos o de mamífero).
"Microbiano" se refiere a proteínas recombinantes obtenidas en
sistemas de expresión bacterianos o fúngicos (p. ej., levaduras).
Como producto, "microbiana recombinante" define a una proteína
producida en un sistema de expresión microbiano que esencialmente
carece de sustancias endógenas nativas. Las proteínas expresadas en
la mayoría de los cultivos bacterianos, por ejemplo, en E.
coli, no tienen glucano. Las proteínas expresadas en levaduras
pueden tener un patrón de glucosilación diferente del expresado en
células de mamífero.
"Biológicamente activo", según se usa a lo
largo de toda la memoria descriptiva como una característica de los
receptores de TGF-beta, significa que una molécula
en particular comparte suficiente homología de secuencia de
aminoácidos con las realizaciones de la presente invención descritas
en este documento como para ser capaz de unir cantidades
detectables de TGF-beta y/o transmitir un estímulo
TGF-beta a una célula, por ejemplo, como componente
de una construcción híbrida del receptor, o que tiene reactividad
cruzada con anticuerpos anti-receptor de
TGF-beta obtenidos frente al receptor de
TGF-beta a partir de fuentes naturales (es decir,
no recombinantes). Preferiblemente, las fusiones del receptor de
TGF-beta biológicamente activas, dentro del alcance
de la presente invención, son capaces de unir más de 0,1 nmoles de
TGF-beta por nmol de receptor y, más
preferiblemente, más de 0,5 nmoles de TGF-beta por
nmol de receptor en ensayos de unión convencionales (véase más
adelante).
Del mismo modo, una "molécula que se une a
TGF-beta", según se usa en este documento, es
cualquier molécula que muestra la misma, o sustancialmente la
misma, actividad biológica que la proteína de fusión del receptor de
TGF-beta.
"Individuo" denota un organismo vivo, que
incluye a humanos, otros mamíferos y cualquier otro animal que
produce TGF-beta.
"Sobreproducción de
TGF-beta", según se usa en este documento, es una
cantidad de TGF-beta presente en suero o en tejido
que está significativamente por encima del nivel normal. Más
preferiblemente, la sobreproducción de TGF-beta es
un nivel de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 20 veces el
normal. Incluso más preferiblemente, la sobreproducción de
TGF-beta es un nivel de entre aproximadamente 2 y
aproximadamente 15 veces el normal. Por ejemplo, Deguchi midió la
producción en 24 h de TGF-beta de las células
broncoalveolares y refirió niveles normales de 410 +/- 225
pg/10^{7} células frente a una producción en exceso de
TGF-beta de 1.288 +/- 453 pg/10^{7} células en el
lupus eritematoso sistémico y 1.417 +/- 471 pg/10^{7} células en
escleroderma ((1992) Ann. Rheum. Dis. 51:36265). La sobreproducción
de TGF-beta puede determinarse, en combinación con
los niveles normales, mediante la medida de la proteína
TGF-beta, del ARNm de TGF-beta o de
productos cuya síntesis es estimulada por el
TGF-beta, tal como el colágeno.
El "tejido conectivo" es tejido fibroso
caracterizado por la presencia de fibroblastos y proteínas fibrosas,
tales como el colágeno y la elastina.
Un "trastorno fibroproliferativo" se
caracteriza por la proliferación de fibroblastos más la
correspondiente sobreexpresión de matriz extracelular, tal como
fibronectina, laminina y colágeno.
Una "composición terapéutica", según se usa
en este documento, se define como aquella que comprende las
proteínas de la invención y otros ingredientes fisiológicamente
compatibles. La composición terapéutica puede contener excipientes,
tales como agua y minerales, y vehículos, tales como una
proteína.
"Una cantidad suficiente" de las proteínas
de la invención, según se usa en este documento, se refiere a la
cantidad de proteína de fusión del receptor de
TGF-beta que neutraliza la actividad biológica del
exceso de TGF-beta. Se puede determinar mediante
(1) variables clínicas adecuadas de mejora, (2) evaluación
patológica de los efectos sobre la fibrosis y/o la inmunodepresión
o prevención de la fibrosis, o (3) una inhibición directa del
TGF-beta.
"Aminoácido": una unidad monomérica de un
péptido, polipéptido o proteína. Existen veinte aminoácidos que se
encuentran en péptidos, polipéptidos y proteínas naturales, todos
ellos son L-isómeros. El término también incluye
análogos de aminoácidos y D-isómeros de los
aminoácidos de la proteína y sus análogos.
"Proteína": cualquier polímero que consta
esencialmente de cualquiera de los 20 aminoácidos. Aunque
"polipéptido" se usa a menudo en referencia a polipéptidos
relativamente grandes, y "péptido" se usa a menudo en
referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la
técnica se solapa y es variado. El término "proteína", según
se usa en este documento, se refiere a péptidos, proteínas y
polipéptidos, a menos que se especifique lo contrario.
"Equivalente funcional" de un resto de
aminoácido es un aminoácido que tiene propiedades fisicoquímicas
similares al resto de aminoácido que se sustituyó por el
equivalente funcional.
"Fusión": se refiere a un enlace covalente
colineal de dos o más proteínas o fragmentos de las mismas por
medio de sus esqueletos peptídicos individuales, más preferiblemente
a través de la expresión génica de una molécula de polinucleótido
que codifica estas proteínas.
"Mutante": cualquier cambio en el material
genético de un organismo, en particular, cualquier cambio (es decir,
deleción, sustitución, adición o alteración) en una secuencia
polinucleotídica de tipo silvestre o cualquier cambio en una
proteína de tipo silvestre.
"Tipo silvestre": la secuencia
polipeptídica natural de un exón de una proteína, o una porción de
la misma, o una secuencia de proteína, o una porción de la misma,
respectivamente, como existe normalmente aparece in vivo.
"Condiciones de hibridación
convencionales": condiciones de salinidad y temperatura
sustancialmente equivalentes a de SSC X 0,5 a aproximadamente SSC X
5 y 65ºC tanto para la hibridación como para el lavado. La expresión
"condiciones de hibridación convencionales", según se usa en
este documento es, por tanto, una definición de condiciones de
funcionamiento y abarca un intervalo de condiciones de hibridación.
Las condiciones más rigurosas pueden incluir, por ejemplo,
hibridación con tampón para selección en placa (polivinilpirrolidona
al 0,2%, ficoll 400 al 0,2%; albúmina sérica bovina al 0,2%,
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5); NaCl 1 M; pirofosfato
sódico al 0,1%; SDS al 1%); sulfato de dextrano al 10% y 100
\mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonicado a
65ºC durante 10-20 horas y lavado con NaCl 75
mM/citrato sódico 7,5 mM (SSC X 0,5)/SDS al 1% a 65ºC. Las
condiciones menos rigurosas pueden incluir, por ejemplo, hibridación
con tampón para selección en placa, sulfato de dextrano al 10% y
110 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sonicado
a 55ºC durante 10-20 horas y lavado con NaCl 300
mM/citrato sódico 30 mM (SSC X 2,0)/SDS al 1% a 55ºC. Véase también
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Hijos,
Inc. Nueva York, secciones 6.3.1-6.3.6, (1989).
"Secuencia de control de la expresión": una
secuencia polinucleotídica que controla y regula la expresión de
genes cuando están ligados operativamente a esos genes.
"Unida de forma operativa": una secuencia
polinucleotídica (ADN, ARN) está unida de forma operativa a una
secuencia de control de la expresión cuando la secuencia de control
de la expresión controla y regula la transcripción y traducción de
esta secuencia polinucleotídica. La expresión "unido de forma
operativa" incluye el tener una secuencia inicial apropiada (p.
ej., ATG) frente a la secuencia polinucleotídica que va a ser
expresada y mantener la fase de lectura correcta para permitir la
expresión de la secuencia polinucleotídica bajo el control de la
secuencia de control de la expresión y la producción del polipéptido
deseado codificado por la secuencia polinucleotídica.
"Vector de expresión": un polinucleótido,
como un plásmido de ADN o fago (entre otros ejemplos comunes) que
permite la expresión de al menos un gen cuando el vector de
expresión se introduce en una célula hospedadora. El vector puede, o
no, ser capaz de replicarse en una célula.
"Aislado" (usado de forma intercambiable
con "sustancialmente puro"): cuando se aplica a ácido nucleico,
es decir, secuencias polinucleotídica, que codifican polipéptidos,
significa un polinucleótido de ARN o ADN, una porción de
polinucleótido genómico, ADNc o polinucleótido sintético que, en
virtud de su origen o manipulación: (i) no está relacionado con la
totalidad del polinucleótido con el que se asocia en la naturaleza
(p. ej., está presente en una célula hospedadora como vector de
expresión, o una porción del mismo); o (ii) está ligado a un ácido
nucleico u otro resto químico distinto al cual está ligado en la
naturaleza; o (iii) no aparece de forma natural. Por "aislado"
además se entiende una secuencia polinucleotídica que: (i) se
amplifica in vitro mediante, por ejemplo, la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR); (ii) se sintetiza químicamente;
(iii) se produce de forma recombinante mediante clonación o (iv) se
purifica, por ejemplo, mediante escisión y separación en gel.
De este modo, un "ácido nucleico
sustancialmente puro" es un ácido nucleico que no es
inmediatamente contiguo a una o más de las secuencias codificadoras
a las que normalmente es contiguo en el genoma natural del organismo
del cual deriva el ácido nucleico. Un ADN sustancialmente puro
también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido
que codifica secuencias adicionales.
"Aislado" (usado de forma intercambiable
con "sustancialmente puro"): cuando se aplica a polipéptidos
significa un polipéptido o una porción del mismo, en virtud de su
origen o manipulación: (i) está presente en una célula hospedadora
como el producto de expresión de una porción de un vector de
expresión; o (ii) está ligado a una proteína o a otro resto químico
distinto al cual está ligado en la naturaleza o (iii) no aparece de
forma natural. Por "aislado" además se entiende una proteína
que: (i) se sintetiza químicamente; o (ii) se expresa en una célula
hospedadora y se purifica separándolo de las proteínas asociadas. El
término generalmente se refiere a un polipéptido que se ha separado
de otras proteínas y ácidos nucleicos con los cuales aparece de
forma natural. Preferiblemente, el polipéptido también está separado
de sustancias, tales como anticuerpos o matrices de gel
(poliacrilamida), que se usan para purificarlo.
"Promotor heterólogo": según se usa en este
documento, es un promotor que no se asocia de forma natural con un
gen o a un ácido nucleico purificado.
"Homólogo": según se usa en este documento,
es sinónimo del término "identidad" y se refiere a la similitud
de secuencia entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos
nucleicos. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas
está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácido
(por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de
ADN está ocupada por adenina, o una posición en cada uno de los dos
polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces, las respectivas
moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología
entre dos secuencias es una función del número de coincidencias o
posiciones homólogas compartidas por las dos secuencias dividido
entre el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6
de las 10 posiciones de dos secuencias coinciden o son homólogas,
entonces las dos secuencias son 60% homólogas. A modo de ejemplo,
las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten un 50% de homología
(coinciden 3 de las 6 posiciones totales). Generalmente, se hace una
comparación cuando dos secuencias se alinean para obtener el
máximo de homología. Ejemplos de referencias para DEFINIR??.
Los términos "péptido(s)",
"proteína(s)" y "polipéptido(s)" se usan en
este documento de forma indistinta. Las expresiones "secuencia
polinucleotídica" y "secuencia de nucleótidos" se usan en
este documento indistintamente.
En la práctica de la presente invención se
emplearán, a menos que se indique lo contrario, las técnicas
convencionales de biología celular, cultivo celular, biología
molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteínas e
inmunología, que están dentro de la técnica. Dichas técnicas se
describen en la literatura. Véase, por ejemplo, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición. (Sambrook, Fritsch y
Maniatis, editores.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989;
DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N. Glover, editor), 1985;
Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, editor), 1984;
patente de EE.UU. Nº 4.683.195 (Mullis y col.,); Nucleic Acid
Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins, editores.), 1984;
Transcription and Translation (B.D. Hames y S.J. Higgins,
editores), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney,
editor). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and
Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular
Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology,
Volúmenes 154 y 155 (Wu y col., editores), Academia Press, Nueva
York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller
y M.P. Calos, editores.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory;
Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer
y Walker, editores), Academic Press, Londres, 1987; Handbook of
Experiment Immunology, Volúmenes I-IV (D.M.
Weir y C.C. Blackwell, editores), 1986; Manipulating the Mouse
Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
La presente invención utiliza polipéptidos
antagonistas de TGF-beta aislados y purificados. Los
polipéptidos antagonistas de TGF-beta aislados y
purificados usados en esta invención están sustancialmente libres de
otros materiales contaminantes de origen natural o endógeno y
contienen menos de aproximadamente el 1% en masa de proteínas
contaminantes residuales del proceso de producción. Los polipéptidos
antagonistas de TGF-beta usados en esta invención
no tienen, opcionalmente, un patrón de glucosilación nativo
asociado.
Como se usa en este documento, la expresión
"receptor de TGF-beta" se refiere a proteínas
que tienen secuencias de aminoácidos que son sustancialmente
similares al receptor de TGF-beta nativo de
mamíferos o a las secuencias de moléculas que se unen al
TGF-beta e inhiben su unión a las membranas
celulares que contienen el receptor de TGF-beta. El
receptor de TGF-beta preferido es el receptor de
TGF-beta de tipo II maduro de secuencia completa.
El receptor de TGF-beta de tipo II es una proteína
unida a membrana con un dominio intracelular, un dominio
transmembrana y una porción extracelular que se une al
TGF-beta. Se ha determinado que el receptor de
TGF-beta de tipo II humano tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en Lin y col., Cell: 68,
775-785 (1992), y corregida como se muestra en la
patente de EE.UU. Nº 5.693.607.
Los receptores de TGF-beta
preferidos de la presente invención son formas solubles del receptor
de TGF-beta de tipo II, así como moléculas solubles
que se unen a TGF-beta de tipo II. Los receptores de
TGF-beta soluble incluyen, por ejemplo, análogos o
subunidades de proteínas nativas que tienen al menos 20 aminoácidos
y que muestran al menos actividad biológica en común con el
receptor de TGF-beta de tipo II o moléculas que se
unen a TGF-beta.
Las expresiones "proteína de fusión del
receptor de TGF-beta de tipo II" o
"TGF-beta RII:Fc" se usan de forma
intercambiable y representan las realizaciones más preferidas de las
composiciones de la presente invención. Esta proteína de fusión
contiene al menos parte del receptor de TGF-beta
(tipo II) ligada a al menos parte de una segunda proteína que no es
un receptor de TGF-beta de tipo II. Específicamente,
la segunda proteína puede ser la región constante de una
inmunoglobulina (preferiblemente IgG, más preferiblemente IgG1) o
puede ser una porción de la misma, tal como la región bisagra,
C_{H}2 o C_{H}3. Las fusiones preferidas de la invención son
homodímeros, conectados el uno con el otro mediante puentes
disulfuro, pero las formas heterodiméricas también están dentro del
alcance de esta invención. Véase la Sección IV.
De este modo, las composiciones más preferidas
de la presente invención son antagonistas de
TGF-beta que son proteínas de fusión solubles,
tales como moléculas de anticuerpos quiméricos recombinantes en las
que las secuencias del receptor de TGF-beta
sustituyen a los dominios variables de una cualquiera de las dos, o
de las dos, cadenas pesada y ligera de la molécula de
inmunoglobulina, y que tienen los dominios de la región constante
sin modificar. Por ejemplo, la TGF-beta RII/IgG1
quimérica se produce a partir de un gen quimérico: una quimera
TGF-beta RII/cadena pesada gamma 1 humana. Tras la
transcripción y traducción del gen quimérico, el producto génico se
ensambla en un homodímero que tiene el receptor de
TGF-beta expuesto de forma bivalente. Dichas formas
polivalentes del receptor de TGF-beta pueden tener
una afinidad de unión al ligando TGF-beta
potenciada.
Las construcciones del receptor de
TGF-beta soluble de la invención están desprovistas
de región transmembrana (y son secretadas por la célula) pero
retienen la capacidad para unirse a TGF-beta.
Diversas proteínas bioequivalentes y análogos de
aminoácidos tienen una secuencia de aminoácidos que corresponde a
la totalidad o a parte de la región extracelular de un receptor de
TGF-beta nativo (p. ej., ID SEC Nº 8 ó 9 o
secuencias de aminoácidos sustancialmente similares o que son al
menos homólogas al 98% a las secuencias de las ID SEC Nº 8 ó 9, y
que son biológicamente activas porque se unen al ligando de
TGF-beta. Los receptores de
TGF-beta equivalentes incluyen polipéptidos que
difieren de estas secuencias en una o más sustituciones, deleciones
o adiciones y que retienen la capacidad de unión a
TGF-beta o inhiben la actividad de transducción de
la señal de TGF-beta a través de las proteínas
receptoras de TGF-beta unidos a la superficie
celular. La inhibición de la actividad de transducción de la señal
de TGF-beta puede determinarse transfectando células
con los ADN del receptor de TGF-beta recombinante
para obtener la expresión del receptor recombinante. A continuación,
las células se ponen en contacto con TGF-beta y se
examinan los efectos metabólicos resultantes. Si se produce un
efecto atribuible a la acción del ligando, entonces el receptor
recombinante tiene actividad de transducción de la señal. Idzerda y
col., J. Exp. Med. 171:861 (1990); Curtis y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 86:3045 (1989); Prywes y col., EMBO J. 5:2179 (1986) y
Chou y col., J. Biol. Chem. 262:1842 (1987) describen procedimientos
ilustrativos para determinar si un polipéptido tiene actividad de
transducción de la señal. Alternativamente, también podrían
utilizarse células primarias o líneas celulares que expresen un
receptor de TGF-beta endógeno y que tengan una
respuesta biológica a TGF-beta detectable.
Un "fragmento" de las proteínas de esta
invención es una porción o la totalidad de una proteína que es capaz
de unirse a TGF-beta. Preferiblemente, este
fragmento tiene una afinidad alta por TGF-beta. Los
fragmentos preferidos de las proteínas de fusión son fragmentos de
proteína que comprenden al menos parte de la porción extracelular
del receptor de TGF-beta de tipo II unida a al menos
parte de una región constante de una inmunoglobulina.
Preferiblemente, la afinidad está en el intervalo de aproximadamente
10^{-11} a 10^{-12} M, aunque la afinidad puede variar
considerablemente con fragmentos de diferentes tamaños, oscilando de
10^{-7} a 10^{-13} M. En una realización, el fragmento tiene
aproximadamente de 10-110 aminoácidos de longitud y
comprende el sitio de unión a TGF-beta unido a al
menos parte de la región constante de una inmunoglobulina.
Si se usa la secuencia nativa de aminoácidos del
dominio extracelular del receptor de TGF-beta (p.
ej., los aminoácidos 1 a 160 de las ID SEC Nº 8 ó 9) en las
proteínas de fusión, la secuencia de aminoácidos se parece a la de
la porción extracelular completa del receptor de tipo II. Cuando se
emplean porciones más pequeñas del receptor de
TGF-beta de tipo II, se asemejan a diversas
porciones de las porciones extracelulares del receptor de
TGF-beta de tipo II, siempre que se unan a
TGF-beta con alta afinidad. Aunque la secuencia de
un "fragmento" dado se base más preferiblemente en la región
extracelular del receptor de TGF-beta de tipo II,
la definición también comprende análogos de proteínas de la
invención que tienen alta afinidad por TGF-beta.
Dichos análogos incluyen aquellos obtenidos por sustituciones
conservadoras de aminoácidos, así como aquellos obtenidos a partir
de células mutadas que sintetizan el fragmento.
Los miembros de la familia de receptores de
TGF-beta útiles en el uso de las composiciones en
los procedimientos de la invención incluyen cualquiera de las
proteínas nativas naturales, como equivalentes alélicos o
filogenéticos u otras variantes de los mismos, de origen natural o
producidos químicamente, incluyendo muteínas o proteínas mutantes,
así como formas recombinantes y nuevos miembros activos de la
familia. Los polipéptidos incluyen una secuencia de aminoácidos al
menos el 98% o 99% homóloga a una secuencia de aminoácidos de las ID
SEC Nº 8 ó 9. El polipéptido también puede incluir una secuencia de
aminoácidos esencialmente similar a una secuencia de aminoácidos de
las ID SEC Nº 8 ó 9. El polipéptido tiene una longitud de al menos
5, 10, 20, 50, 100 ó 150 aminoácidos e incluye al menos 5,
preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 20, lo más
preferiblemente al menos 50, 100 ó 150 aminoácidos contiguos de las
ID SEC Nº 8 ó 9.
Los polipéptidos de la invención incluyen
aquellos que se obtienen como resultado de la existencia de genes
múltiples, sucesos de transcripción alternativa, sucesos de ayuste
alternativo de ARN y sucesos de traducción y postraducción
alternativos. El polipéptido puede obtenerse completamente por
medios sintéticos o puede expresarse en sistemas, por ejemplo,
células en cultivo, lo que producía sustancialmente las mismas
modificaciones postraduccionales presentes cuando la proteína se
expresa en una célula nativa, o en sistemas que dan lugar a la
omisión de modificaciones postraduccionales presentes cuando se
expresa en una célula nativa.
También se describen polinucleótidos que derivan
de polinucleótidos que codifican, tras su expresión, el receptor de
TGF-beta de tipo silvestre (p. ej., ID SEC Nº
1-4, 10 y 12), véase también la patente de EE.UU.
5.693.607. Un ADNc que codifica una molécula de receptor de
TGF-beta de tipo II (es decir, nucleótidos del 832
al 1.311 de la ID SEC Nº 2 o ID SEC Nº 4 es una secuencia de ADN
complementario (ADNc) que codifica el receptor de
TGF-beta. Otros miembros de la familia del receptor
de TGF-beta se presentan como polinucleótidos de
TGF-beta de tipo II de tipo silvestre (REF) y
polinucleótido de tipo III de tipo silvestre (REF).
También se describen polinucleótidos aislados
representados en las ID SEC Nº 1-4, 10 y 12 que
pueden alterarse para proporcionar polinucleótidos funcionalmente
equivalentes. Un polinucleótido es un "equivalente funcional"
comparado con los de las ID SEC Nº 1-4, 10 y 12 si
cumple al menos una de las siguientes condiciones: (a) el
"equivalente funcional" es un polinucleótido que hibrida con
cualquiera de las secuencias extrañas (ID SEC Nº
1-4, 10 y 12.) en condiciones de hibridación
convencional. Más preferiblemente, codifica una proteína receptora
de TGF-beta con la misma actividad biológica que el
receptor de TGF-beta de tipo silvestre; y (b) el
"equivalente funcional" es un polinucleótido que codifica, tras
su expresión, una secuencia de aminoácidos codificada por
cualquiera de los polinucleótidos de las ID SEC Nº
1-4, 10 y 12.
Debido a la degeneración de las secuencias que
codifican los nucleótidos, se pueden usar otros polinucleótidos
para codificar receptores de TGF-beta o fusiones de
los mismos. Para el receptor de TGF-beta de tipo II,
éstas incluyen la totalidad o partes del ADN que codifica las ID
SEC Nº 8 ó 9, que están alteradas por la sustitución de diferentes
codones que codifican el mismo resto de aminoácido dentro de la
secuencia, produciendo, de este modo, un cambio silente. Dichas
secuencias alteradas se consideran equivalentes a las ID SEC Nº 8 ó
9. Por ejemplo, la Phe (F) está codificada por dos codones, TTC o
TTT, la Tyr (Y) está codificada por TAC o TAT y la His (H) está
codificada por CAC o CAT. Por otro lado, el Trp (W) está codificado
por un único codón, TGG. Por consiguiente, se apreciará que, para
una secuencia determinada de ADN que codifica una proteína en
particular, existirán muchas secuencias degeneradas de ADN que la
pueden codificar. Estas secuencias degeneradas de ADN se consideran
dentro del alcance de esta invención.
Las proteínas de fusión de la invención que
incorporan el receptor de TGF-beta de tipo II de
conejo se muestran en las ID SEC Nº 2 y 8, para las secuencias de
ADNc y de aminoácidos deducidas, respectivamente. También se
describen en este documento proteínas de fusión que incorporan el
receptor de TGF-beta de tipo II humano mostrado en
las ID SEC Nº 4 y 9, para las secuencias de ADNc y de aminoácidos
deducidas, respectivamente.
Las proteínas TFG-beta RII:Fc
preferidas de la invención incluyen la nueva secuencia de ADN de
"unión" ID SEC Nº 10 y aminoácidos de la ID SEC Nº 11. La ID
SEC Nº 10 representa los 11 codones tripletes en cualquiera de los
dos lados de la unión CTG/GTC entre el ADN del
TGF-beta RII de conejo y el ADN de la
inmunoglobulina. En la ID SEC Nº 10, la secuencia de
TGF-beta acaba después del triplete CTG y la
secuencia de inmunoglobulina comienza en el triplete GTC. La
correspondiente secuencia de "unión" de aminoácidos de conejo
deducida se representa en la ID SEC Nº 11 en la que el final de la
secuencia del receptor de TGF-beta es la leucina y
el comienzo de la secuencia de la inmunoglobulina es la valina
inmediatamente posterior. También se describe en este documento las
correspondientes secuencias de ADNc y de aminoácidos de "unión"
humanas ID SEC Nº 12 y 13, respectivamente. En la ID SEC Nº 2, la
unión correspondiente comienza en el triplete que se inicia a
partir del nucleótido 1.309 y acaba en el triplete que se inicia en
el nucleótido 1.312.
Es posible que las ID SEC Nº 10 y 12 sean el
mínimo ADN necesario para la hibridación, en condiciones
convencionales, con cualquier secuencia de ADN que codifica
cualquier proteína de fusión de receptor de
TGF-beta:Fc. No obstante, siempre que la sonda
completa hibride con ambos lados de la unión y ambos lados de la
unión del receptor TGF-beta/región constante
participen en la hibridación, puede haber secuencias más pequeñas.
Además, los expertos en la materia entenderán que las secuencias de
ADN más grandes que las ID SEC Nº 10 y 12 también serán adecuadas
para la hibridación. Un experto en la materia puede probar si una
sonda en particular, tal como las ID SEC Nº 10 y 12, es capaz de
hibridar con ambos lados de la unión marcando el extremo 5' de un
oligonucleótido sentido de cadena sencilla o un oligonucleótido
complementario de cadena sencilla con un fosfato de ATP marcado de
forma apropiada usando la polinucleótido quinasa. Una secuencia de
la invención debe hibridar, y de este modo, ser marcada por ambas
sondas de oligonucleótido. Además se entiende que la invención
abarca secuencias completamente degeneradas que codifican las
uniones de las ID SEC Nº 10 y 12.
Al igual que la mayoría de los genes de
mamíferos, los receptores de TGF-beta de mamíferos
están codificados presumiblemente por genes con más de un exón.
También pueden usarse construcciones alternativas de ARNm que
pueden atribuirse a sucesos de ayuste del ARNm diferentes tras la
transcripción y que comparten regiones grandes de identidad o
similitud con los ADNc reivindicadas en este documento. El vector
que contiene el clon de ADNc de TGF-beta RII:Fc se
usa para expresar y purificar TGF-beta RII:Fc
soluble.
Pueden aislarse otros ADNc de receptores de
TGF-beta de mamíferos usando una secuencia de ADN
del receptor de TGF-beta humano apropiada como
sonda para seleccionar una biblioteca de ADNc de mamífero en
particular mediante hibridación cruzada entre especies. El receptor
de TGF-beta de mamífero usado en la presente
invención incluye, a modo de ejemplo, el receptor de
TGF-beta de primate, humano, murino, canino, felino,
bovino, equino y porcino. Los receptores de
TGF-beta de mamífero pueden obtenerse mediante
hibridación cruzada con especies usando un ADNc de cadena sencilla
derivado de la secuencia de ADN del receptor de
TGF-beta humano como sonda de hibridación para
aislar los ADNc del receptor de TGF-beta de
bibliotecas de ADNc de mamíferos.
Los polipéptidos aislados descritos en este
documento pueden producirse mediante cualquier procedimiento
adecuado conocido en la técnica. Estos procedimientos oscilan desde
procedimientos de síntesis directa de proteínas a la construcción
de una secuencia de ADN que codifique las secuencias de polipéptidos
aisladas y expresando estas secuencias en un hospedador
transformado adecuado. Por ejemplo, puede obtenerse ADNc mediante la
selección de una biblioteca de ADNc humano con un fragmento de ADN
marcado que codifique los polipéptidos de las ID SEC Nº 8, 9, 11 ó
13 y la identificación de clones positivos mediante
autorradiografía. Se realizan rondas adicionales de purificación e
hibridación en placa usando procedimientos adicionales.
En una realización de un procedimiento
recombinante, se construye una secuencia de ADN aislando o
sintetizando una secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo
silvestre de interés. Opcionalmente, la secuencia puede mutarse
mediante mutagénesis dirigida a sitio para proporcionar análogos
funcionales de la misma. Véase, por ejemplo, Zoeller y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) y la
patente de Estados Unidos Nº 4.588.585. Otro procedimiento para
construir una secuencia de ADN que codifique un polipéptido de
interés sería mediante síntesis química usando un sintetizador de
oligonucleótidos. Preferiblemente, estos oligonucleótidos pueden
diseñarse en función de la secuencia de aminoácidos del polipéptido
deseado y, preferiblemente, seleccionando los codones favorecidos
en la célula hospedadora en las que se producirá el polipéptido
recombinante de interés.
Pueden aplicarse procedimientos convencionales
para sintetizar una secuencia polinucleotídica aislada que
codifique un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, puede
usarse una secuencia de aminoácidos completa para construir un gen
traducido de forma inversa. Véase Maniatis y col., supra.
Además, puede sintetizarse un oligómero de ADN que contenga una
secuencia de nucleótidos que codifique el polipéptido aislado en
particular. Por ejemplo, pueden sintetizarse, y después ligarse,
varios oligonucleótidos pequeños que codifiquen porciones del
polipéptido deseado. Los oligonucleótidos individuales típicamente
contienen salientes 5' ó 3' para el ensamblaje complementario.
Una vez ensamblados (por síntesis, mutagénesis
dirigida a sitio u otro procedimiento), las secuencias mutantes de
ADN que codifican un polipéptido aislado de interés en particular se
insertarán en un vector de expresión y se unirán de forma operativa
a una secuencia de control de expresión apropiada para la expresión
de la proteína en un hospedador deseado. El ensamblaje apropiado
puede confirmarse mediante secuenciación de nucleótidos, mapeo de
restricción y expresión de un polipéptido biológicamente activo en
un hospedador adecuado. Como es bien conocido en la técnica, para
obtener niveles elevados de expresión de un gen transfectado en un
hospedador, el gen debe unirse de forma operativa a secuencias
control de la expresión transcripcional y traduccional que sean
funcionales en los hospedadores de expresión elegidos.
Los vectores de expresión recombinantes se usan
preferiblemente para amplificar o expresar ADN que codifica las
fusiones del receptor de TGF-beta. Los vectores de
expresión recombinantes son construcciones de ADN que pueden
replicarse con fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que
codifican fusiones del receptor de TGF-beta o
análogos equivalentes unidos de forma operativa a elementos
reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados derivados
de genes de mamíferos, microbianos, víricos o de insectos. Una
unidad transcripcional generalmente comprende el ensamblaje de (1)
un elemento o elementos génicos que tienen una función reguladora
en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadotes de
la transcripción, (2) una secuencia estructural o codificadora que
se transcribe a ARNm y se traduce a proteína y (3) secuencias
apropiadas de inicio y terminación de la transcripción y
traducción, como se describe en detalle más adelante. Estos
elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para
controlar la transcripción. Adicionalmente, puede incorporarse la
capacidad para replicarse en un hospedador, que normalmente viene
conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para
facilitar el reconocimiento de los transformantes. Las regiones de
ADN están unidas de forma operativa cuando están relacionadas
funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal
(secuencia líder de la secreción) está unido de forma operativa al
ADN de un polipéptido si éste se expresa como un precursor que
participa en la secreción del polipéptido; un promotor está unido de
forma operativa a una secuencia codificadora si controla la
transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está
unido de forma operativa a una secuencia codificadora si se coloca
de modo que permita la traducción. Generalmente, unido de forma
operativa significa contiguo y, en el caso de secuencias líderes de
la secreción, contiguo y en fase de lectura. Los elementos
estructurales destinados a su uso en sistemas de expresión de
levaduras incluyen preferiblemente una secuencia líder que permite
la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula
hospedadora. Alternativamente, cuando la proteína recombinante se
exprese sin una secuencia líder o de transporte, puede incluirse un
resto de metionina N-terminal. Si se desea, este
resto posteriormente puede escindirse de la proteína recombinante
expresada para proporcionar un producto final.
Las secuencias de ADN que codifican receptores
de TGF-beta de mamíferos, que se van a expresar como
una proteína de fusión en microorganismos, pueden contener
preferiblemente intrones que podrían terminar la transcripción del
ADN a ARNm de forma prematura, puesto que esta terminación prematura
de la transcripción puede ser deseable, por ejemplo, cuando dieron
lugar a mutantes con truncamientos C-terminales
ventajosos, por ejemplo, deleción de una región transmembrana para
obtener un receptor soluble no unido a la membrana celular. Debido a
la degeneración del código, puede existir una considerable
variación en las secuencias de nucleótidos que codifican la misma
secuencia de aminoácidos. Como se discute anteriormente, otras
realizaciones incluyen secuencias capaces de hibridar con las
secuencias de ADNc proporcionadas en condiciones de hibridación
convencionales (50ºC, SSC X 2) y otras secuencias que hibridan o
degeneran en aquellas que codifican proteínas biológicamente activas
de la invención.
La elección de la secuencia de control de
expresión y del vector de expresión dependerá de la elección del
hospedador. Pueden emplearse una amplia variedad de combinaciones de
hospedadores/vectores de expresión. Los vectores de expresión
útiles para hospedadores eucarióticos incluyen, por ejemplo,
vectores que comprenden secuencias de control de expresión del
virus SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y
citomegalovirus. Vectores de expresión útiles para hospedadores
bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como
plásmidos de Escherichia coli, que incluyen pCR1, pBR322,
pMB9 y sus derivados, plásmidos de gama más amplia, tales como M13
y fagos filamentosos de ADN de cadena sencilla. Los vectores de
E. coli preferidos incluyen los vectores pL que contienen el
promotor pL del fago lambda (patente de EE.UU. Nº 4.874.702), los
vectores pET que contienen el promotor de la polimerasa T7 (Studier
y col., Methods in Enzymology 185: 60-89,
1990 1) y el vector pSP72 (Kaelin y col., supra). Los
vectores de expresión útiles para células de levadura, por ejemplo,
incluyen los plásmidos 2\mu y centromérico.
Además, puede usarse cualquiera de una amplia
variedad de secuencias de control de expresión en estos vectores.
Estas secuencias de control de expresión útiles incluyen las
secuencias control de expresión asociadas con los genes
estructurales de los vectores de expresión anteriores. Los ejemplos
de secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo,
los promotores tempranos y tardíos de SV40 o adenovirus, el sistema
lac, el sistema trp, el sistema TAC o
TRC, las regiones principales del operador y promotor del
fago lambda, por ejemplo pL, las regiones de control de la proteína
de recubrimiento fd, el promotor de la
3-fosfoglicerato quinasa o de otras enzimas
glicolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida, por ejemplo,
Pho5, los promotores del sistema de apareamiento alfa de levaduras y
otras secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de
células procariotas o eucariotas y sus virus, y diversas
combinaciones de los mismos.
El ADN del receptor de TGF-beta
recombinante o el ADN de TGF-beta R:Fc recombinante
se expresa o amplifica en un sistema de expresión recombinante que
comprende un monocultivo sustancialmente homogéneo de un hospedador
adecuado que tiene integrado de forma estable (mediante
transformación o transfección) una unidad transcripcional
recombinante en el ADN cromosómico o que porta la unidad
transcripcional recombinante como componente de un plásmidos
residente. Generalmente, las células que constituyen el sistema son
la progenie de un único transformante ancestral. Los sistemas de
expresión recombinantes, como se define en este documento,
expresarán la proteína heteróloga tras la inducción de los
elementos reguladores unidos a la secuencia de ADN o al gen
sintético que se desea expresar.
Las células hospedadoras adecuadas para la
expresión del receptor de TGF-beta de mamífero y sus
proteínas de fusión incluyen células procariotas, de levadura o de
eucariotas superiores bajo el control de promotores adecuados. Los
procariotas incluyen organismos Gram negativos o Gram positivos, por
ejemplo, E. coli o bacilos. Las células eucariotas
superiores incluyen líneas celulares establecidas de origen
mamífero, como se describe más adelante. Podrían emplearse también
sistemas de traducción sin células para producir el receptor de
TGF-beta de mamífero y TGF-beta R:Fc
usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente
invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su
uso con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras
y de mamíferos se describen en Pouwels y col. (Cloning Vectors: A
Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).
Las proteínas recombinantes de la invención
también pueden expresarse en hospedadores de levaduras,
preferiblemente de especies de Saccharomyces, como S.
cerevisiae. También pueden emplearse levaduras de otros géneros,
tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de
levaduras contendrán, generalmente, un origen de replicación del
plásmido 2 \mu de levadura o una secuencia de replicación autónoma
(ARS), un promotor, ADN que codifica las proteínas de la invención
y secuencias de ADN para la poliadenilación y terminación de la
transcripción y un gen de selección. Preferiblemente, los vectores
de levadura incluirán un origen de replicación y marcadores
seleccionables que permiten la transformación tanto de la levaduras
como de E. coli, por ejemplo, el gen de resistencia a
ampicilina de E. coli y los genes TRP1 o URA3 de S.
cerevisiae, que proporcionan un marcador de selección para una
cepa mutante de levadura que no tiene capacidad para crecer en
presencia de triptófano y un promotor derivado de un gen de levadura
expresado a altos niveles para inducir la transcripción de una
secuencia estructural que se encuentra después del extremo 3'. La
presencia de la lesión TRP1 o URA3 en el genoma de la célula
hospedadora de levadura proporciona, entonces, un ambiente eficaz
para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de
triptófano o uracilo.
Las secuencias promotoras adecuadas en vectores
de levaduras incluyen los promotores para la metalotioneina,
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol.
Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J.
Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y col., Biochem. 7:4900),
tales como enolasa,
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosa
fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Vectores y
promotores adecuados para el uso en la expresión de levaduras se
describen adicionalmente en R. Hitzeman y col., documento EPA
73.657. Los vectores de levadura preferidos pueden ensamblarse
usando secuencias de ADN de pUC18 para la selección y replicación
en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) y
secuencias de ADN de levadura que incluyen un promotor ADH2
sensible a la glucosa y la secuencia líder de secreción del factor
alfa. Russell y col (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier
y col. (Nature 300:724, 1982) han descrito el promotor ADH2. La
secuencia líder del factor alfa de levaduras, que dirige la
secreción de proteínas heterólogas, puede insertarse entre el
promotor y el gen estructural que se desea expresar. Véase, por
ejemplo., Kurjan y col., Cell 30:933, 1982 y Bitter y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:5330, 1984. La secuencia líder puede
modificarse para que contenga, cerca de su extremo 3', uno o más
sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la
secuencia líder a los genes extraños.
Los protocolos adecuados de transformación de
levaduras son conocidos por los expertos en la materia: Hinnen y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.75:1929, 1978 describen una
técnica ilustrativa, como la descrita por Sherman y col.,
Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986.
También se emplean de forma ventajosa diversos
sistemas de cultivo de células de mamífero o insecto para expresar
la proteína recombinante. Se prefiere especialmente la expresión de
proteínas recombinantes en células de mamífero ya que,
generalmente, estas proteínas se pliegan correctamente, se modifican
adecuadamente y son completamente funcionales. Ejemplos de líneas
celulares hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen las líneas
COS-7 de células renales de mono, descritas por
Gluzman (Cell 23:175, 1981) y otras líneas celulares capaces de
expresar un vector apropiado son, por ejemplo, las líneas celulares
L, C127, 3T3, de ovario de hámster chino (CHO), HeLa y BHK. Los
vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no
transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor y
potenciador adecuados unidos al gen que se desea expresar y otras
secuencias no transcritas que flaquean los extremos 5' y 3', tales
como los sitios de unión a ribosomas necesarios, un sitio de
poliadenilación, sitios donador y aceptor de ayuste y las secuencias
de terminación de la transcripción. Los sistemas de bacilovirus
para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto
se revisan en Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
Los vectores de expresión recombinante que
comprenden ADNc se integran de forma estable en el ADN de la célula
hospedadora. Se consiguen niveles elevados de expresión del producto
seleccionando líneas celulares que tienen un número amplificado de
ADN del vector. Se seleccionan las líneas celulares que tienen un
número amplificado de ADN del vector, por ejemplo, transformando
una célula hospedadora con un vector que comprenda una secuencia de
ADN que codifique una enzima inhibida con un fármaco conocido. El
vector también puede comprender una secuencia de ADN que codifique
una proteína deseada. Alternativamente, la célula hospedadora puede
cotransformarse con un segundo vector que comprenda la secuencia de
ADN que codifique la proteína deseada. A continuación, las células
hospedadoras transformadas o cotransformadas se cultivan, en
concentraciones crecientes del fármaco conocido, seleccionando de
este modo, las células resistentes al fármaco. Estas células
resistentes al fármaco sobreviven en concentraciones crecientes del
fármaco tóxico mediante la sobreproducción de la enzima que inhibe
el fármaco, frecuentemente como resultado de la amplificación del
gen que codifica la enzima. Cuando se produce resistencia al
fármaco mediante un aumento del número de copias del ADN del vector
que codifica la enzima reprimible, existe una coamplificación
simultánea del ADN del vector que codifica la proteína deseada en el
ADN de la célula hospedadora.
Un sistema preferido para esta coamplificación
utiliza el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), que puede
inhibirse mediante el fármaco metotrexato (MTX). Para conseguir la
coamplificación, se transforma una célula hospedadora carente del
gen activo que codifica la DHFR con un vector que contenga la
secuencia de ADN que codifique la DHFR y una proteína deseada, o se
cotransforma con un vector que contenga una secuencia de ADN que
codifique la DHFR y un vector que contenga una secuencia de ADN que
codifique la proteína deseada. Las células hospedadoras
transformadas o cotransformadas se cultivan en medios que contengan
niveles crecientes de MTX y se seleccionan aquellas líneas celulares
que sobrevivan.
Un sistema de coamplificación especialmente
preferido utiliza el gen de la glutamina sintetasa (GS), que es
responsable de la síntesis de glutamato y de amoniaco usando la
hidrólisis de ATP a ADP y fosfato para dirigir la reacción. La GS
se somete a inhibición mediante diversos inhibidores, por ejemplo,
metionina sulfoximina (MSX). De este modo, las proteínas de la
invención pueden expresarse a altas concentraciones mediante la
coamplificación de las células transformadas con un vector que
contengan la secuencia de ADN de la GS y una proteína deseada, o
cotransformadas con un vector que contenga una secuencia de ADN que
codifique la GS y un vector que contenga una secuencia de ADN que
codifique la proteína deseada, cultivando las células hospedadoras
en medios que contengan niveles crecientes de MSX y seleccionando
las células supervivientes. El sistema de coamplificación de GS,
los vectores de expresión recombinantes apropiados y las líneas
celulares se describen en las siguientes solicitudes PCT:
documentos WO 87/04462, WO 89/01036, WO 89/10404 y WO 86/05807.
Las proteínas recombinantes se expresan
preferiblemente mediante la coamplificación de DHFR o GS en una
célula hospedadora de mamífero, como células de ovario de hámster
chino (CHO) o, alternativamente, en una línea celular de mieloma
murino, tal como SP2/0-Ag14 o NS0 o una línea
celular de mieloma de rata, tal como YB2/3.0 Ag20, descritas en las
solicitudes PCT documentos WO/89/10404 y WO 86/05807.
Debe entenderse que no todos los vectores y
secuencias de control de expresión funcionarán igualmente bien para
expresar un polipéptido aislado determinado. Tampoco los
hospedadores funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de
expresión. Sin embargo, un experto en la materia puede hacer una
selección entre estos vectores, secuencias de control de expresión y
hospedadores sin necesidad de experimentación.
Las proteínas producidas por un hospedador
transformado pueden purificarse según cualquier procedimiento
adecuado. Dichos procedimientos convencionales incluyen
cromatografía (p. ej., cromatografía de intercambio iónico, de
afinidad y de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad
diferencial o mediante cualquier otra técnica convencional para
purificación de proteínas. Pueden unirse a la proteína etiquetas de
afinidad, como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, secuencia
de la cubierta del virus de la gripe y la
glutatión-S-transferasa para
permitir una fácil purificación pasándola a través de una columna de
afinidad apropiada. Las proteínas aisladas también pueden
caracterizarse físicamente usando técnicas como proteolisis,
resonancia magnética nuclear y cristalografía de rayos X.
Por ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas
que secretan proteína recombinante al medio de cultivo pueden
concentrarse primero usando un filtro de concentración de proteínas
disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de
ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras la etapa de
concentración, puede aplicarse el concentrado a una matriz de
purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada
puede comprender una molécula de TGF-beta, de
lectina o de anticuerpo, o Proteína A unida a un soporte adecuado.
Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio
aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos
colgantes de dietilaminoetilo (DEAE). Las matrices pueden ser
acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa y otros tipos
frecuentemente empleados en la purificación de proteínas.
Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio
catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen
diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o
carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente,
para la purificación adicional de una composición de
TGF-beta RII:Fc pueden emplearse una o más etapas de
cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa
(HPLC-RP), empleando medios de
HPLC-RP hidrófobos, por ejemplo, sílica gel que
tenga grupos metilo y otros grupos alifáticos colgantes. Algunas o
todas las etapas de purificación anteriores, en diversas
combinaciones, también pueden emplearse para proporcionar una
proteína recombinante homogénea.
La proteína recombinante producida en cultivo
bacteriana normalmente se aísla mediante la extracción inicial a
partir de sedimentos de células, seguido de una o más etapas de
concentración, precipitación con sales, cromatografía de
intercambio iónico acuoso o de exclusión molecular. Por último,
puede emplearse la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
para las etapas de purificación adicional. Las células microbianas
empleadas en la expresión del receptor de TGF-beta
recombinante de mamífero pueden lisarse por cualquier procedimiento
conveniente, incluyendo ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, disrupción
mecánica o el uso de agentes de lisis celular.
La fermentación de la levadura que expresa la
proteína de fusión del receptor de TGF-beta de
mamífero como una proteína secretada, simplifica en gran medida la
purificación. La proteína recombinante secretada que resulta de la
fermentación a gran escala puede purificarse mediante procedimientos
análogos a los descritos por Urdal y col. (J. Chromatog. 296:171,
1984). En esta referencia se describen dos etapas secuenciales de
HPLC en fase inversa para la purificación de GM-CSF
recombinante humano en una columna de HPLC preparatoria.
Los fragmentos de una proteína aislada (p. ej.,
fragmentos de la ID SEC Nº 8) también pueden producirse eficazmente
mediante procedimientos de recombinación, mediante digestión
proteolítica o mediante síntesis química, usando procedimientos
conocidos por los expertos en la materia. En los procedimientos de
recombinación, pueden generarse fragmentos internos o terminales de
un polipéptido mediante la eliminación de uno o más nucleótidos de
un extremo (para un fragmento terminal) o de ambos extremos (para
un fragmento interno) de una secuencia de ADN que codifica el
polipéptido aislado. La expresión del ADN sometido a mutagénesis
produce fragmentos polipeptídicos. La digestión con endonucleasas
"de extremos recortados" también puede generar ADN que
codifican una serie de fragmentos. Los ADN que codifican fragmentos
de una proteína también pueden generarse mediante escisión
aleatoria, digestión con enzimas de restricción o una combinación o
ambos.
Los fragmentos del receptor de
TGF-beta pueden generarse directamente a partir de
las proteínas intactas de receptor de TGF-beta. Los
péptidos pueden escindirse específicamente mediante enzimas
proteolíticas, que incluyen, pero sin limitaciones, plasmina,
trombina, tripsina, quimotripsina o pepsina. Cada una de estas
enzimas es específica para el tipo de enlace peptídico al que se
unen. La tripsina cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos
en los que el grupo carbonilo es de un aminoácido básico,
normalmente arginina o lisina. La pepsina y la quimotripsina
catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos de aminoácidos
aromáticos, tales como triptófano, tirosina y fenilalanina. Se
generan grupos alternativos de fragmentos proteicos escindidos
previniendo la escisión en un sitio que es susceptible a una enzima
proteolítica. Por ejemplo, la reacción de los grupos
amino-\varepsilon de la lisina con
etiltrifluorotioacetato en solución ligeramente básica produce
restos de aminoácidos bloqueados cuyo enlace peptídico adyacente
deja de ser susceptible a la hidrólisis por tripsina. Las proteínas
se pueden modificar para crear enlaces peptídicos que son
susceptibles a enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la alquilación
de restos de cisteína con \beta-halo etilaminas
produce enlaces peptídicos que son hidrolizados por tripsina
(Lindley, Nature 178: 647 (1956)). Además, se pueden usar reactivos
químicos que escinden cadenas peptídicas en restos específicos. Por
ejemplo, el bromuro de cianógeno escinde péptidos en restos de
metionina (Gross y Witkip, J. Am. Chem. Soc.,83:1510(1961)).
De este modo, tratando las proteínas con diversas combinaciones de
modificadores, enzimas proteolíticas y/o reactivos químicos, las
proteínas pueden dividirse en fragmentos de una longitud deseada
sin solapamiento de los fragmentos, o divididos en fragmentos
solapantes de una longitud deseada.
Los fragmentos también pueden sintetizarse
químicamente usando técnicas conocidas en la materia, como el método
en fase sólida Fmoc y t-Boc de Merrifield.
Merrifield, Recent Progress in Hormona Research 23: 451
(1967).
Las variantes de secuencia de aminoácidos de una
proteína (como las variantes de la ID SEC Nº 8) pueden prepararse
mediante mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la proteína o
una porción en particular de la misma. Los procedimientos útiles
incluyen mutagénesis por PCR y mutagénesis por saturación. También
puede generarse una biblioteca de variantes aleatorias de
secuencias de aminoácidos mediante la síntesis de un grupo de
secuencias de oligonucleótidos degenerados. En la técnica son bien
conocidos los procedimientos para generar variantes de secuencias
de aminoácidos de una proteína determinada usando ADN y péptidos
alterados. Los ejemplos siguientes de estos procedimientos no
pretenden limitar el alcance de la presente invención, sino que
simplemente sirve para ilustrar las técnicas representativas. Los
expertos en la materia reconocerán que a este respecto también son
útiles otros procedimientos.
Mutagénesis por PCR: Brevemente, se usa
la polimerasa Taq (u otra polimerasa) para introducir
mutaciones aleatorias en un fragmento clonado de ADN (véase Leung y
col., Technique: 11-15 (1989)). Las condiciones de
la PCR se eligen de forma que se reduzca la fidelidad de la síntesis
del ADN mediante la Taq ADN polimerasa, usando por ejemplo, una
relación dGTP/dATP de cinco y añadiendo Mn^{2+} a la reacción de
PCR. El conjunto de fragmentos de ADN amplificados se inserta en
vectores de clonación apropiados para proporcionar bibliotecas de
mutantes aleatorios.
Mutagénesis por saturación: En Mayers y
col., Science, 229: 242 (1989), se describe el procedimiento de
forma general. Brevemente, la técnica incluye la generación de
mutación mediante tratamiento químico o irradiación in vitro
de ADN de cadena sencilla y la síntesis de una cadena de ADNc. La
frecuencia de mutación se modula por la intensidad del tratamiento
y se pueden obtener esencialmente todas las posibles sustituciones
de bases.
Mutagénesis mediante oligonucleótidos
degenerados: Puede generarse una biblioteca de péptidos
homólogos a partir de un conjunto de secuencias de oligonucleótidos
degenerados. La síntesis química de secuencias degeneradas puede
realizarse en un sintetizador de ADN automático y, a continuación,
los genes sintéticos pueden ligarse en un vector de expresión
apropiado. Véase Itakura y col., Recombinant DNA, Proc.
3^{er} Simposio de Cleveland sobre Macromoléculas, pág.
273-289 (A.G. Walton, editor), Elsevier, Amsterdam,
1981.
Ni la mutagénesis no aleatoria ni la dirigida
proporcionan secuencias específicas o mutaciones en porciones
específicas de una secuencia polinucleotídica que codifica un
polipéptido aislado; proporcionan variantes que incluyen
deleciones, inserciones o sustituciones de restos de una secuencia
de aminoácidos conocida del polipéptido aislado. Los sitios de
mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por ejemplo:
(1) sustituyendo primero los aminoácidos conservados y haciendo
luego elecciones más radicales dependiendo de los resultados
conseguidos; (2) delecionando el resto objetivo o (3) insertando
restos de la misma o diferente clase adyacente al sitio localizado,
o una combinación de las opciones 1 a 3.
Mutagénesis mediante alaninas: Este
procedimiento localiza aquellos restos o regiones de una proteína
deseada que son localizaciones preferidas para la mutagénesis.
Véase Cunningham y Wells, Science 244 1081-1085
(1989). En la selección de alaninas, se selecciona un resto o grupo
de restos diana y se sustituyen por alanina o polialanina. Esta
sustitución puede afectar a la interacción del aminoácido con los
aminoácidos adyacentes y/o con el ambiente acuoso o de membrana
circundante. Aquellas que tienen sensibilidad funcional a las
sustituciones pueden refinarse introduciendo más u otras variantes
en, o para, los sitios de sustitución.
Mutagénesis mediada por oligonucleótidos:
Puede usarse una versión de este procedimiento para preparar
variantes por sustitución, deleción e inserción de ADN. Véase
Adelman y col., DNA 2:183 (1983). Brevemente, el ADN deseado se
altera mediante hibridación con un cebador oligonucleotídico que
codifica una mutación de ADN en un molde de ADN, que normalmente es
la forma de cadena sencilla de un plásmido o un fago que contiene el
molde de la secuencia de ADN sin alterar o de tipo silvestre de la
proteína deseada (p. ej., la proteína). Tras la hibridación, se usa
una ADN polimerasa para hacer la segunda cadena complementaria de
ADN del molde que incorporará el cebador oligonucleotídico y
codificará para la alteración seleccionada en la secuencia de ADN
deseada. Generalmente, se usan oligonucleótidos de al menos 25
nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendría de 12 a
15 nucleótidos completamente complementarios al molde a ambos lados
de la mutación. Esto garantiza que el oligonucleótido hibridará
adecuadamente con la molécula molde de ADN de cadena sencilla.
Mutagénesis en casete: Este procedimiento
(Wells y col., Gene 34: 315 (1985)) requiere un plásmido u otro
vector que contenga el ADN de la subunidad proteica que se desea
mutar. Se identifica el codón (o codones) en el ADN de la subunidad
proteica y hay insertado un único sitio para enzimas de restricción
a cada lado del sitio (o sitios) de mutación, identificado
utilizando el procedimiento de mutagénesis dirigida por
oligonucleótido descrito anteriormente. A continuación se corta el
plásmido en estos sitios para linearizarlo. Usando procedimientos
convencionales se sintetiza el oligonucleótido de cadena doble que
codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción, pero
que contiene la mutación (o mutaciones) deseada. Las dos cadenas se
sintetizan por separado y luego se hibridan entre sí usando
procedimientos convencionales. Este oligonucleótido de cadena doble
es el "casete" y tiene extremos 3' y 5' que son compatibles con
los extremos del plásmido linearizado, de modo que puede ligarse
directamente en él. Ahora, el plásmido contiene la secuencia mutada
del ADN de la subunidad proteica deseada.
Mutagénesis combinatoria: En una versión
de este procedimiento (Ladner y col, documento WO 88/06630), se
alinean las secuencias de aminoácidos de un grupo de homólogos u
otras proteínas relacionadas, preferible para promover la mayor
homología posible. Pueden seleccionarse todos los aminoácidos que se
emparejan en una posición determinada de las secuencias alineadas
para crear un grupo degenerado de secuencias combinatorias. La
biblioteca variada se genera mediante mutagénesis combinatoria a
nivel de ácidos nucleicos y está codificada por una biblioteca
génica variada. Por ejemplo, puede ligarse enzimáticamente una
mezcla de oligonucleótidos sintéticos dentro de la secuencia
génica, de modo que el grupo degenerado de secuencias posibles se
pueden expresar como péptidos individuales o, alternativamente,
como un grupo de proteínas que contienen el grupo completo de
secuencias degeneradas.
Los derivados de proteínas de la invención
también incluyen diversas formas estructurales de la proteína
primaria que retienen la actividad biológica. Debido a la presencia
de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, la proteína de
fusión del receptor de TGF-beta puede estar en forma
de sal de ácido o de base, o puede estar en forma neutra. También
pueden modificarse restos de aminoácidos individuales mediante
oxidación o reducción. La estructura primaria de aminoácidos (p.
ej., el resto TGF-beta RII) puede modificarse
formando conjugados covalentes o por agregación con otros restos
químicos, tales como grupos glucosilo, lípidos, fosfato, grupos
acetilo y similares, o creando secuencias de aminoácidos
mutantes.
Los derivados covalentes del receptor de
TGF-beta pueden prepararse ligando grupos
funcionales específicos a las cadenas laterales de los aminoácidos
del receptor de TGF-beta o los extremos N o C
terminales. Otros derivados de TGF-beta RII:Fc
incluyen conjugados covalentes o por agregación de
TGF-beta RII o sus fragmentos con otras proteínas o
polipéptidos, tales como mediante síntesis en cultivo recombinante
como fusiones adicionales N-terminales o
C-terminales. Por ejemplo, el péptido conjugado
puede tener una secuencia polipeptídica señal (o líder) en la
región N-terminal de la proteína que dirige
cotraduccional o postraduccionalmente la transferencia de la
proteína desde su lugar de síntesis al lugar de función dentro o
fuera de la membrana o pared celular (p. ej., la secuencia líder
del factor alfa de levadura). Las proteínas receptoras de
TGF-beta pueden comprender péptidos añadidos para
facilitar la purificación o identificación del receptor de
TGF-beta (p. ej. poli-His). La
secuencia de aminoácidos del receptor de TGF-beta
también puede ligarse al péptidos
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(DYKDDDDK) (Hopp y col., Bio/Technology 6: 1204,1988) La secuencia
anterior es altamente antigénica y proporciona un epítopo que se
une de forma reversible a un anticuerpo monoclonal específico,
permitiendo ensayos rápidos y una purificación fácil de la proteína
recombinante expresada. Esta secuencia también se escinde
específicamente por la enteroquinasa de la mucosa bovina en el
resto inmediatamente posterior al par Asp-Lys. Las
proteínas de fusión protegidas con este péptido también pueden ser
resistentes a la degradación intracelular en E. coli.
Las formas polivalentes del receptor de
TGF-beta son útiles puesto que posee múltiples
sitios de unión del receptor de TGF-beta para el
ligando TGF-beta. Por ejemplo, un receptor
TGF-beta soluble bivalente puede constar de dos
repeticiones en tándem de los aminoácidos 1 a 160 de las ID SEC Nº 8
ó 9 separadas por una región enlazadora, estando las repeticiones
unidas al dominio constante de la inmunoglobulina. También pueden
construirse formas polivalentes alternativas, por ejemplo, mediante
conjugación química de las fusiones receptor de
TGF-beta:Fc a cualquier molécula transportadora
clínicamente aceptable, un polímero seleccionado entre el grupo
constituido por ficoll, polietilenglicol o dextrano usando técnicas
de conjugación convencionales. Alternativamente, la proteína de
fusión del receptor de TGF-beta puede conjugarse
químicamente con biotina y permitir a continuación que el conjugado
biotina-receptor de TGF-beta:Fc se
una a avidina, dando lugar a moléculas tetravalentes
avidina/biotina/receptor de TGF-beta. Las fusiones
del receptor de TGF-beta:Fc también pueden
conjugarse covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol
(TNP) y el conjugado resultante puede precipitarse con IgM
anti-DNP o anti-TNP, para formar un
conjugado decamérico con una valencia de 10 para los sitios de unión
del receptor de TGF-beta.
Pueden producirse análogos mutantes funcionales
de la proteína de fusión TGF-beta RII:Fc que tienen
inactivados los sitios de N-glucosilación, mediante
la síntesis y ligamiento de oligonucleótidos o mediante técnicas de
mutagénesis dirigida a sitio. Estas proteínas análogas pueden
producirse con un buen rendimiento en forma homogénea con la
cantidad de hidratos de carbono reducida usando sistemas de
expresión de levadura. Los sitios de
N-glicosilación en proteínas eucarióticas se
caracterizan por el triplete de aminoácidos
Asn-Al-Z, en donde Al es cualquier
aminoácido excepto Pro, y Z es Ser o Thr. En esta secuencia, Asn
proporciona un grupo amino en la cadena lateral para la unión
covalente de un hidrato de carbono. Este sitio puede eliminarse
sustituyendo Asn o el resto Z por otro aminoácido, delecionando Asn
o Z o insertando un aminoácido no Z entre Al y Z, o un aminoácido
que no sea Asn entre Asn y Al. También pueden obtenerse derivados
del receptor de TGF-beta mediante mutaciones del
receptor de TGF-beta o sus subunidades. Pueden
construirse análogos bioequivalente de las proteínas receptoras de
TGF-beta haciendo, por ejemplo, diversas
sustituciones de restos o secuencias o delecionando restos o
secuencias terminales o internas que no sean necesarias para la
actividad biológica.
Otros análogos incluyen proteínas
TGF-beta RII:Fc o sus fragmentos biológicamente
activos cuyas secuencias difieren de las ID SEC Nº 2 ó 4 en una o
más sustituciones conservadoras de aminoácidos o en una o más
sustituciones no conservadoras de aminoácidos o en deleciones o
inserciones que no anulan la actividad biológica de la proteína
aislada. Las sustituciones conservadoras normalmente incluyen las
sustituciones de un aminoácido por otro con características
similares, tales como sustituciones dentro de los siguientes grupos:
valina, alanina y glicina; leucina e isoleucina; ácido aspártico y
ácido glutámico; asparragina y glutamina; serina y treonina; lisina
y arginina; y fenilanalina y tirosina. Los aminoácidos hidrófobos no
polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina,
fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos polares
neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina,
asparragina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente
(básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos
cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido
glutámico. Los expertos en la materia conocen fácilmente otras
sustituciones conservadoras. Por ejemplo, para el aminoácido
alanina puede hacerse una sustitución conservadora a partir de uno
cualquiera de los aminoácidos D-alanina, glicina,
beta-alanina, L-cisteína y
D-cisteína. Para la lisina, puede hacerse una
sustitución con una cualquiera de los aminoácidos
D-lisina, arginina, D-arginina,
homo-arginina, metionina,
D-metionina, ornitina o
D-ornitina.
Generalmente, las sustituciones que puede
esperarse induzcan cambios en las propiedades funcionales de
polipéptidos aislados son aquellas en las que: (i) un resto polar,
por ejemplo, serina o treonina, se sustituye por (o sustituye a) un
resto hidrófobo, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina o
alanina; (ii) un resto de cisteína se sustituye por (o sustituye a)
cualquier otro resto; (iii) un resto con una cadena lateral
electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, se
sustituye por (o sustituye a) un resto con una cadena lateral
electronegativa, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico o
(iv) un resto con una cadena lateral voluminosa, por ejemplo,
fenilalanina, se sustituye por (o sustituye a) uno que no tiene
dicha cadena lateral, por ejemplo, glicina.
También se describen moléculas aisladas que son:
variantes alélicas, mutantes naturales, mutantes inducidos,
proteínas codificadas por ADN que hibrida en condiciones de alta o
baja rigurosidad con un ácido nucleico que codifica un polipéptido
como el de las ID SEC Nº 8 ó 9 y polipéptidos que se unen
específicamente a antisueros frente a péptidos, especialmente
antisueros frente a un sitio activo o sitio de unión. Todas las
variantes descritas en este documento se espera que: (i) retengan
la función biológica de la proteína original.
Esta invención proporciona composiciones y usos
de las composiciones para administrar a un individuo con una
dolencia médica una cantidad suficiente de una proteína de fusión
del receptor de TGF-beta, tal como
TGF-beta RII:Fc, para reducir la actividad
TGF-beta en el individuo. Esta invención además
proporciona composiciones y usos de composiciones para administrar
TGF-beta RII:Fc a un sitio donde el
TGF-beta está en exceso, tal como en estados de
enfermedad caracterizados por fibroproliferación e inmunodepresión,
tal como el que se relaciona con enfermedades infecciosas.
Aunque no se desea estar unido a ninguna teoría
en particular, parece que TGF-beta RII:Fc regula la
actividad de TGF-beta al competir por el
TGF-beta con los receptores de la superficie
celular. Además se cree que inactiva el TGF-beta,
eliminándolo de las reservas libres de TGF-beta
disponibles para interaccionar con los receptores de la superficie
celular. Dependiendo de las propiedades farmacológicas de
aclaramiento, el complejo TGF-beta
RII:Fc/TGF-beta se elimina del sitio de
TGF-beta. Esta formación de complejos con el
TGF-beta en exceso reduce la cantidad de
TGF-beta libre. Al dejar menos
TGF-beta disponible para formar complejo con los
receptores celulares, la fibroproliferación inducida por el
TGF-beta se reduce dando lugar al estancamiento de
la enfermedad.
Puede usarse la administración de las proteínas
de la invención o fragmentos de la presente invención en trastornos
fibroproliferativos. Como se menciona anteriormente, los modelos
animales de gromerulonefritis han mostrado buenos resultados con
anticuerpos anti-TGF-beta bloqueando
el exceso de TGF-beta. Estos anticuerpos serán
difíciles de administrar porque tienen un peso molecular alto y
pueden dar lugar a reacciones alérgicas graves cuando se
administran a otras especies. De este modo, en la glomerulonefritis
sería preferible administrar una proteína nativa de menor peso
molecular o con elevada analogía, tal como el
TGF-beta RII:Fc. Los trastornos renales
relacionados con el exceso de TGF-beta incluyen,
pero sin limitaciones, glomerulonefritis proliferativa mesangial,
glomerulonefritis semilunar, nefropatía diabética, fibrosis
intersticial renal, fibrosis renal en pacientes trasplantados que
reciben ciclosporina y nefropatía asociada a VIH. Estas dolencias
están relacionadas con la sobreproducción de formaciones de tejido
fibroso las cuales deberán reducirse con la administración de
TGF-beta RII:Fc.
Como no se conoce que TGF-beta
RII por sí solo tenga un efecto además de la captura de
TGF-beta, puede administrarse
TGF-beta RII:Fc con seguridad durante o al final de
la cirugía de reimplantación de retina, que es la causa más común
de vitreorretinopatía proliferativa (VRP) (Connor y col. (1989) J.
Clin. Invest. 83:1661-1666). Otra dolencia
fibroproliferativa importante es la artritis reumatoide (AR), que
está también relacionada con el exceso de producción de
TGF-beta. Los datos indican que el bloqueo de
TGF-beta en cualquier momento del desarrollo o en
estadios crónicos de la AR puede ayudar a detener el deterioro
progresivo de la articulación y el hueso. Por lo tanto, las
fusiones de la presente invención pueden administrarse a pacientes
con dolor articular precoz y a pacientes con dolor articular
prolongado y articulaciones deterioradas. La actual teoría es que
el deterioro articular en la AR se debe a una sobreproducción de
TGF-beta. Se ha medido el exceso de
TGF-beta en las articulaciones después de inyectar a
animales de experimentación paredes celulares de estreptococos,
cuya presencia se cree que causa la AR (AR). Puesto que los
anticuerpos anti-TGF-beta bloquean
los cambios artríticos en este modelo, se cree que las fusiones de
la invención también pueden tener un efecto positivo. Otras
dolencias relacionadas con niveles en exceso de
TGF-beta incluyen fibrosis pulmonar idiopática y
mielofibrosis. Para formar complejos con el
TGF-beta en exceso y reducir el desarrollo del
tejido fibroso en exceso, las proteínas de la invención están
destinadas a ser administradas en estas dolencias.
Las proteínas de la presente invención pueden
usarse para tratar trastornos vasculares del colágeno que están
relacionados con la sobreproducción de TGF-beta.
Actualmente se cree que existe una sobreproducción de
TGF-beta en los trastornos vasculares del colágeno,
tales como esclerosis sistémica progresiva (ESP), polimiositis,
escleroderma, dermatomiositis, fascitis eosinofílica y morfea. Los
trastornos vasculares del colágeno también pueden relacionarse con
la aparición del síndrome de Raynaud. Entre otros efectos, la
sobreproducción de TGF-beta también puede estar
implicada en la fibrosis pulmonar intersticial, fase final de un
trastorno pulmonar que se relaciona con trastornos autoinmunes
tales como lupus eritematoso sistémico (LES) y escleroderma
(Deguchi, (1992) Ann. Rheum. Dis. 51:362-65); o
puede estar causada por contacto químico, alergias al polvo y
alergia al polen. Puede administrarse una cantidad terapéuticamente
eficaz de las proteínas de la invención para neutralizar la
actividad biológica del TGF-beta, lo que a su vez
prevendría la fibrosis no deseada.
Las proteínas de la presente invención también
pueden usarse para prevenir la sobreproducción de cicatrices
patológicas en pacientes que se sabe forman queloides o cicatrices
hipertróficas. Por ejemplo, puede administrarse
TGF-beta RII:Fc para prevenir la formación de
cicatrices patológicas o la sobreproducción de cicatrices
patológicas durante la cicatrización de diversos tipos de heridas,
tales como incisiones quirúrgicas y laceraciones traumáticas. La
proteína de fusión TGF-beta RII:Fc puede aplicarse a
heridas cutáneas antes de que se cierren para ayudar a la
cicatrización sin formación de cicatrices patológicas. Las proteínas
de la invención pueden colocarse en heridas abdominales quirúrgicas
para ayudar a prevenir la formación de adhesiones que se producen
con demasiada frecuencia tras este tipo de cirugía. La presente
invención proporciona la administración local de suficiente fusión
para formar complejos con la sobreproducción local de
TGF-beta y prevenir la sobreproducción de procesos
cicatrizantes.
El exceso de TGF-beta también se
ha descrito en la poliposis nasal, una dolencia caracterizada por
múltiples pólipos (Ohno y col. (1992) J. Clin. Invest. 89:
1662-68). Las proteínas de fusión pueden ayudar a
disminuir los niveles de TGF-beta y reducir la
hiperproliferación que da lugar a los pólipos. Por ejemplo,
TG-beta RII:Fc puede administrarse tras la cirugía
de eliminación de pólipos para prevenir la sobreproducción de
cicatrices patológicas y la recurrencia de los pólipos, y también
puede administrarse para inhibir la formación de pólipos en el
intestino.
Las proteínas de la invención también pueden
administrarse tras la angioplastia coronaria, preferiblemente
colocada a lo largo del interior de las arterias afectadas. Según
Karas y col., ((1991) Clin. Cardiol. 14:791-801) se
observa restenosis o cicatrices patológicas y reestrechamiento de
las arterias tras la angioplastia coronaria aproximadamente en un
tercio de los pacientes operados. Puesto que la red fibrosa que
finalmente se desarrolla en una cicatriz normalmente se acumula de
forma rápida, la administración precoz de, por ejemplo,
TGF-beta RII:Fc reduciría el exceso de
TGF-beta en esta área y disminuiría la excesiva
proliferación del tejido conectiva y la restenosis.
El exceso de TGF-beta también se
ha observado en la fibrosis cardiaca tras un infarto y en la
vasculopatía hipertensiva. Las proteínas de la invención pueden
administrarse para ayudar en estas dolencias a una apropiada
cicatrización sin exceso de tejido cicatrizal o formaciones de
tejido fibroso. El exceso de TGF-beta se ha
observado también en los tejidos de pacientes que reciben
radioterapia. Estos tejidos se caracterizan por el desarrollo de
tejido conectivo en exceso, adelgazamiento epitelial y oclusión de
vasos sanguíneos relacionado con el sobrecrecimiento de células
epiteliales. La administración de un TGF-beta RII:Fc
formará complejos con el TGF-beta en exceso y
contribuirá a la cicatrización sin fibrosis excesiva.
La formulación, procedimiento de administración
y posología de las proteínas de la invención dependerá del
trastorno que se desea tratar y de los antecedentes médicos del
paciente. Estos factores se pueden determinar fácilmente en el
transcurso del tratamiento. Se pueden identificar los pacientes
idóneos con dolencias causadas por un exceso de
TGF-beta mediante pruebas de laboratorio,
antecedentes médicos y hallazgos físicos. El exceso de
TGF-beta también se puede determinar directamente
mediante inmunoensayo del suero del paciente o del tejido afectado.
El TGF-beta en exceso también se puede determinar
mediante bioensayo, como el ensayo de proliferación celular
descrito en Kekow y col., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:
8321-25. El TGF-beta en exceso
también se puede determinar indirectamente midiendo el nivel de ARNm
de TGF-beta (por ejemplo, en la reacción en cadena
de la polimerasa de Kekow y col.).
Los antecedentes médicos pueden revelar hechos
que apoyen un diagnóstico de trastorno fibroproliferativo,
trastorno vascular del colágeno, inmunodepresión o posibilidad de
cicatrización problemática de heridas, como adhesiones peritoneales
tras la cirugía, o restenosis de vasos sanguíneos tras la
angioplastia coronaria. Se considera que las dolencias que se
identifican como relacionadas con niveles elevados de
TGF-beta y/o proliferación de tejido fibroso causan
exceso de TGF-beta. Los pacientes pueden tener un
amplio espectro de hallazgos físicos indicativos de dichos
trastornos. Las biopsias de pies se han usado para analizar el
TGF-beta en pacientes con esclerosis sistémica. En
la artritis se observan articulaciones hinchadas y calientes. Según
los usos de las composiciones en el procedimiento de la presente
invención, la formulación comprende proteínas de la invención en
una forma administrable. Los usos de las composiciones en el
procedimiento de la presente invención proporcionan proteínas de la
invención formuladas en modos que son fácilmente aparentes para los
expertos en la materia. Preferiblemente, las proteínas de la
invención están disueltas en vehículos fisiológicamente
compatibles.
Los vehículos fisiológicamente compatibles para
las proteínas de la invención incluyen soluciones intravenosas,
tales como solución salina normal, albúmina sérica, dextrosa al 5%,
preparaciones de plasma, otras soluciones que contienen proteínas y
soluciones TPN. El vehículo preferido para la administración
parenteral es una solución acuosa isotónica estéril, tales como
solución salina o dextrosa al 5%. Es aún más preferida la solución
salina normal con albúmina sérica bovina. Para su uso en la
potenciación de la respuesta inmune en vacunas, las proteínas de la
invención pueden mezclarse con la formulación de la vacuna.
Dependiendo del modo de administración, las
proteínas de la invención pueden estar en forma de preparaciones de
dosis líquidas o semisólidas, tales como por ejemplo, líquidos,
suspensiones o similares. Alternativamente, puede colocarse una
solución en un implante, tal como una bomba osmótica, para su
liberación lenta durante un periodo prolongado de tiempo.
Alternativamente, pueden proporcionarse las proteínas de la
invención en formulaciones de vehículo de liberación sostenida,
como vehículos de polímeros semipermeables en forma de supositorios
o microcápsulas. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº
3.773.919 para matrices microcapsulares de liberación sostenida,
como poliláctidos; Sidmon y col., Biopolymers 22 (1),
547-556 (1983) para copolímeros de ácido
L-glutámico y
gamma-etil-L-glutamato;
Langer y col., J. Biomed. Res. 15, 167-277 (1981)
para poli(2-hidroxietilmetacrilato) o
similares.
El modo de administración suministra las
proteínas de la invención a un individuo de forma segura y
fisiológicamente eficaz. Las proteínas de la invención pueden
administrarse por vía intraocular, intranasal, subcutánea,
intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal,
intraarticular, enteral u otras vías convencionales de
administración. En una realización preferida, las proteínas de la
invención se administran localmente en el sitio del tejido afectado
mediante bolo o perfusión. Por ejemplo, para la VRP, el modo
preferido de administración es una única inyección intraocular.
También se prefiere la administración local en heridas peritoneales
para evitar la formación de adhesiones y en otras heridas para
estimular la cicatrización sin queloides ni cicatrices patológicas
visibles. Para la poliposis nasal, son preferibles gotas nasales. La
administración local y sistémica es igualmente preferida en la
fibrosis pulmonar (inyección parenteral o spray o gotas nasales). La
artritis reumatoide (AR) puede tratarse mediante administración
intraarticular o sistémica.
La administración sistémica es el modo preferido
de administración en la glomerulonefritis y en trastornos cutáneos
generalizados (tales como esclerosis sistémica progresiva, fascitis
difusa y morfea generalizada). También se prefiere la
administración sistémica cuando las proteínas de la invención se
usan para potenciar la respuesta a vacunas. Las proteínas de la
invención pueden administrarse con la vacuna mediante inyección
subcutánea, intramuscular o intradérmica.
La dosis de proteínas de la invención que debe
administrarse puede ser determinada fácilmente por los expertos en
la materia, en función de los síntomas del paciente descritos
anteriormente. La dosis de proteínas de la invención que debe
administrarse en un bolo es preferible que esté entre 20 ng y 300
mg. El bolo se puede repetirse durante varios días, o las proteínas
de la invención pueden perfundirse de forma continua. Si se
administra como una infusión intravenosa, la cantidad de proteínas
de la invención para prefundir en un periodo de 24 horas es de
aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg.
La cantidad de proteínas de la invención para
administrar también puede determinarse manteniendo la concentración
tisular local de TGF-beta a un nivel por debajo del
normal, o aproximadamente de 1 a 1.000 \mug/ml.
Preferiblemente, las proteínas de la invención
se aplican por vía tópica, inyectadas en el sitio del problema o
inyectada por vía intravenosa. Lo más preferiblemente, las proteínas
de la invención se administran mediante bolos en el sitio donde se
quiere controlar el TGF-beta. Mediante la inyección
intravenosa, las proteínas de la invención deben administrarse a un
flujo que mantenga una concentración sérica circulante suficiente
para reducir el exceso de TGF-beta. Preferiblemente,
el tratamiento del paciente se inicia con una dosis relativamente
baja de proteínas de la invención. La dosis baja preferiblemente
debe continuarse hasta que se alivie o mejore adecuadamente la fase
aguda de la enfermedad del paciente, según indiquen los apropiados
hallazgos físicos y los resultados analíticos. Esta mejora puede
ser evidente en dos o tres semanas. En ausencia de mejora
significativa, la dosis de proteínas de la invención debe
incrementarse.
También se incluyen dentro del alcance de la
invención los procedimientos de terapia génica de administración de
las moléculas de la invención. Los términos "transformación" o
"transformar" se refieren a cualquier modificación genética de
las células e incluye tanto "transfección" como
"transducción". Según se usa en este documento,
"transfección de células" se refiere a la adquisición por una
célula de nuevo material genético mediante la incorporación de ADN
añadido. De este modo, la transfección se refiere a la inserción de
un ácido nucleico (p. ej., ADN) en una célula usando procedimientos
físicos o químicos. Los expertos en la materia conocen diversas
técnicas de transfección. Por el contrario, "transducción de
células" se refiere al proceso de transferencia de un ácido
nucleico dentro de la célula usando un virus de ADN o ARN. Puede
incorporarse en el cromosoma de la célula transducida una o más
secuencias polinucleotídicas aisladas que codifican una o más
proteínas TGF-beta RII:Fc contenidas dentro del
virus. Alternativamente, se transduce una célula con un virus, pero
la célula no tendrá el polinucleótido aislado incorporado a sus
cromosomas, aunque será capaz de expresar interferón
extracromosómicamente dentro de la célula. Según una realización,
las células se transforman (es decir, se modifican genéticamente)
ex vivo. Las células se aíslan a partir de un mamífero
(preferiblemente un humano) y se transforman (es decir, se
transducen o transfectan in vitro) con un vector que contiene
un polinucleótido aislado, tal como un nucleótido de
TGF-beta RII:Fc unido de forma operativa a una o más
secuencias de control de expresión para expresar una proteína
recombinante secretada. A continuación, las células se administran
a un receptor mamífero para el suministro de la proteína in
situ. Preferiblemente, el receptor mamífero es un humano y las
células que se desea modificar son células autólogas, es decir, las
células se aíslan a partir del receptor mamífero. Se ha publicado el
aislamiento y cultivo de células in vitro. Según otra
realización, las células se transforman o, de lo contrario, se
modifican genéticamente in vivo. Las células del receptor
mamífero (preferiblemente un humano), se transforman (es decir, se
transducen o transfectan) in vivo con un vector que contiene
el polinucleótido aislado similar y la proteína se administra in
situ.
Los polinucleótidos aislados que codifican la
proteína de fusión se introducen en la célula ex vivo o
in vivo mediante procedimientos de transferencia genética,
tales como transfección o transducción, para proporcionar una
célula modificada genéticamente. Un experto en la materia conocen
diversos vectores de expresión (es decir, vehículos para facilitar
el suministro del polinucleótido aislado en una célula diana).
Normalmente, el material introducido incluye un polinucleótido
aislado de la invención junto con un promotor para controlar la
transcripción. Si se administra el polinucleótido de
TGF-beta RII:Fc a tejidos específicos, puede ser
deseable dirigir la expresión de este gen. Por ejemplo, se han
descrito muchos promotores en la literatura que sólo se expresan en
determinados tejidos. De este modo, seleccionando el promotor
adecuado (constitutivo frente a inducible; potente frente a débil),
es posible controlar tanto la existencia como el nivel de expresión
de una proteína de fusión en la célula modificada genéticamente. Si
el gen que codifica la proteína de fusión está bajo el control de
un promotor inducible, el suministro de la proteína in situ
se desencadena exponiendo la célula genéticamente modificada in
situ a condiciones que permiten la transcripción de la proteína,
por ejemplo, mediante la inyección de inductores específicos de los
promotores inducibles que controlan la transcripción del agente.
Recientemente, se han desarrollado sistemas muy sofisticados que
permiten una regulación precisa de la expresión génica mediante
moléculas pequeñas administradas de forma exógena. Estos incluye,
el sistema FK506/rapamicina (Rivera y col., Nature Medicine
2(9): 1028-1032, 1996); el sistema
tetraciclina (Gossen y col., Science 268:
1766-1768,1995), 1995), el sistema de ecdisona (No y
col. Proc. Nat. Acad. Sci., USA 93:
3346-3351, 1996) y el sistema de progesterona (Wang
y col., Nature Biotechnology 15: 239-243,
1997).
Por consiguiente, la cantidad de proteína de
fusión que se administra in situ se regula controlando dichos
factores como (1) la naturaleza del promotor usado para dirigir la
transcripción del polinucleótido insertado (es decir, si el
promotor es constitutivo o inducible, potente o débil, o específico
de tejido); (2) el número de copias del polinucleótido exógeno que
se inserta en la célula; (3) el número de células transducidas o
transfectadas que se administran (p. ej., que se implantan) al
paciente; (4) el tamaño de un implante (p. ej., injerto o sistema
de expresión encapsulado) en procedimientos ex vivo; (5) el
número de implantes en procedimientos ex vivo; (6) el número
de células transducidas o transfectadas mediante administración
in vivo; (7) el periodo de tiempo que las células
transducidas o transfectadas o los implantes se dejan en el sitio
tanto en los procedimientos ex vivo como in vivo y (8)
la tasa de producción de la proteína de fusión por las células
modificadas genéticamente.
Los vectores de expresión compatibles con las
células hospedadoras de mamífero para el uso en terapia génica
incluyen, por ejemplo, plásmidos; vectores retrovirales de aves,
murinos y humanos; vectores de adenovirus; vectores de virus del
herpes; parvovirus y virus pox no replicativos. En particular, los
virus recombinantes de replicación defectuosa pueden generarse en
líneas celulares empaquetadoras que producen sólo virus de
replicación defectuosa. Véase Current Protocols in Molecular
Biology: Secciones 9.10-9.14 (Ausubel y col.,
editores). Greene Publishing Associates, 1989. Los vectores virales
específicos para su uso en sistemas de transferencia génica
actualmente están bien establecidos. Véase por ejemplo: Madzak y
col., J. Gen. Virol., 73:1533-36 (1992)
(papovavirus SV40); Berkner y col., Curr. Top. Microbiol.
Immunol., 158:39-61 (1992) (adenovirus); Moss y
col., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:
25-38 (1992) (virus de la variolavacuna); Muzyczka,
Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123
(1992) (virus adeno-relacionados); Margulskee,
Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93
(1992) (virus del herpes simple (HSV) y virus de
Epstein-Barr (HBV)); Miller, Curr. Top.
Microbiol. Immunol., 158: 1-24 (1992)
(retrovirus);
Brandyopadhyay y col., Mol. Cell. Biol., 4: 749-754 (1984) (retrovirus); Miller y col., Nature, 357: 455-450 (1992) (retrovirus); Anderson, Science, 256: 808-813 (1992) (retrovirus). Los vectores preferidos son virus de ADN que incluyen adenovirus (preferiblemente vectores basados en Ad-2 o Ad-5), virus del herpes (preferiblemente vectores basados en virus del herpes simple) y parvovirus (preferiblemente vectores basados en parvovirus "defectivos" o no autónomos, más preferiblemente vectores basados en virus adenoasociados, más preferiblemente vectores basados en AAV-2). Véase, por ejemplo, Ali y col., Gene Therapy 1: 367-384, 1994; patente de EE.UU. Nº 4.797.368 y 5.399.346 y la descripción siguiente.
Brandyopadhyay y col., Mol. Cell. Biol., 4: 749-754 (1984) (retrovirus); Miller y col., Nature, 357: 455-450 (1992) (retrovirus); Anderson, Science, 256: 808-813 (1992) (retrovirus). Los vectores preferidos son virus de ADN que incluyen adenovirus (preferiblemente vectores basados en Ad-2 o Ad-5), virus del herpes (preferiblemente vectores basados en virus del herpes simple) y parvovirus (preferiblemente vectores basados en parvovirus "defectivos" o no autónomos, más preferiblemente vectores basados en virus adenoasociados, más preferiblemente vectores basados en AAV-2). Véase, por ejemplo, Ali y col., Gene Therapy 1: 367-384, 1994; patente de EE.UU. Nº 4.797.368 y 5.399.346 y la descripción siguiente.
Los virus adenoasociados (AAV) también se han
empleado como vectores para terapia génica somática. El AAV es un
virus de ADN pequeño de cadena sencilla (cs) con una organización
genómica simple (4,7 kb) que lo convierten en un sustrato ideal
para la ingeniería genética. Dos fases de lectura abierta codifican
una serie de polipéptidos rep y cap. Los polipéptidos
rep (rep78, rep68, rep62 y rep40)
están implicados en la replicación, rescate e integración del
genoma de AAV. Las proteínas cap (VP1, VP2 y VP3) forman la cápside
del virión. Flanqueando a las fases de lectura abierta de rep
y cap, en los extremos 5' y 3' hay repeticiones terminales
invertidas (RTI) de 145 pb, las primaras 125 pb de estas cuales son
capaces de formar estructuras dobles con forma de Y o T. Los
dominios rep y cap completos pueden escindirse y
sustituirse por un transgén terapéutico o indicador, lo que es
importante para el desarrollo de vectores AVV. Véase B.J. Carter,
en Handbook of Parvoviruses, editor, P. Tijsser, CRC Press,
pág. 155-168 (1990). Se ha demostrado que las RTI
representan la secuencia mínima necesaria para la replicación,
rescate, empaquetamiento e integración del genoma de AAV. El ciclo
vital del AAV es bifásico, compuesto de episodios latente y lítico.
Durante una infección latente, los viriones de AAV se introducen en
una célula como ADNcs encapsulado, inmediatamente después son
enviados al núcleo donde el ADN del AAV se integra en un cromosoma
del hospedador sin la aparente necesidad de la división de la
célula hospedadora. En ausencia de un virus auxiliar, el genoma
integrado del AAV permanece latente pero capaz de ser activado y
rescatado. La fase lítica del ciclo vital comienza cuando una
célula portadora del provirus de AAV se estimula con una infección
secundaria por un virus del herpes o un adenovirus que codifica las
funciones auxiliares requeridas por el AAV para ayudar a su escisión
de la cromatina del hospedador (B.J. Carter, supra). El ADN
de cadena sencilla (cs) parental infectante se expande a una forma
replicante doble (FR) de ADN de manera dependiente de rep.
Los genomas de AAV rescatados se empaquetan en las cápsides
proteicas preformadas (simetría icosahédrica de aproximadamente 20
nm de diámetro) y se liberan como viriones infecciosos que tienen
empaquetados genomas de ADNcs + o - tras la lisis de la célula. Los
AAV tienen un importante potencial en terapia génica. Las partículas
virales son muy estables y los AAV recombinantes (rAAV) tienen
características "similares a fármacos" ya que los rAAV pueden
purificarse mediante sedimentación o bandeo en gradiente de CsCl.
Son estables con calor y pueden liofilizarse a polvo y rehidratar
manteniendo su actividad completa. Su ADN estable se integra en los
cromosomas del hospedador de modo que su expresión es prolongada.
Su gama de hospedadores es amplia y el AAV no causa ninguna
enfermedad conocida, de modo que los vectores recombinantes no son
tóxicos. Recientemente se ha demostrado que el baculovirus
recombinante, derivado originalmente del baculovirus, virus de la
polihedrosis nuclear múltiple de Autographa californica
(AcMNPV), es capaz de transducir células de mamífero in
vitro. (Véase Hofmann, C., Sandig, V., Jennings, G., Rudolph,
M., Schlag, P. y Strauss, M. (1995), "Efficient gene transfer into
human hepatocytes by baculovirus vectors", Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92, 10099-10103; Boyce, F.M. y
Bucher, N.L.R. (1996) "Baculovirus-mediated gene
transfer into mammalian cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93, 2348-2352). El baculovirus recombinante tiene
varias ventajas potenciales para la terapia génica. Estas incluyen
una capacidad muy grande de inserción del ADN, una falta de
respuesta inmune preexistente en humanos, falta de replicación en
mamíferos, falta de toxicidad en mamíferos, falta de expresión de
genes virales en células de mamífero debido a la especificidad para
insectos de los promotores transcripcionales del baculovirus y,
potencialmente, una falta de respuesta de linfocitos T citotóxicos
dirigida contra esta proteínas virales.
La invención se ilustrará a través de los
ejemplos no limitantes.
Un clon de longitud completa (MIS_3fl1), que
codifica el receptor de TGF-beta (TGF\beta) de
tipo II, se aísla a partir de una biblioteca de ADNc de ovario de
conejo, como se ha descrito (di Clemente y col., Mol. Endocrinol.
8:1006 [1994]). El gen de la proteína de fusión TGF\betaRII:Fc
recombinante de conejo, que consta del domino extracelular del
receptor de tipo II de conejo (nucleótidos 832-1.311
de la ID SEC Nº 2) fusionado con la porción Fc de la IgG1 humana
(nucleótidos 1.312-1.995 de la ID SEC Nº 2), se
construye como sigue:
Fragmento 1) se amplifica un fragmento de 479
pb, que contiene el dominio extracelular del receptor de
TGF-\beta de tipo II de conejo a partir del clon
MIS_3fl1 mediante PCR convencional usando los cebadores
oligonucleotídicos apropiados (ID SEC Nº 5 y ID SEC Nº 6). Estos
oligonucleótidos confieren en sitios para las enzimas de restricción
NotI y SalI que flanquean al producto resultante de PCR, que
posteriormente se digiere con estas dos enzimas de restricción.
Fragmento 2) se digiere pSAB132 (Miller y col.,
J. Exp. Med. 178:211 [1993]) con la enzima de restricción
NotI y se eliminan los grupos fosfato terminales mediante digestión
con fosfatasa alcalina intestinal de ternero.
Fragmento 3) se construye pSAB144. La región
constante de la cadena pesada (H) de la IgG1 humana que contiene la
región bisagra y las secuencias de C_{H}2 y C_{H}3 se aíslan con
los cebadores específicos de cadena H mediante amplificación por
PCR del ADNc del ARN de células COS-7 transfectadas
con plásmidos que contienen inserciones genómicas de 3 kilopares de
bases (Miller y col., J. Exp. Med. 178:211 [1993]). Los
cebadores oligonucleotídicos específicos de la cadena pesada están
diseñados para que las secuencias amplificadas por PCR C_{H}2 y
C_{H}3 de IgG1 resultantes estén flanqueadas por un sitio de
reconocimiento para las enzimas de restricción SalI en 5' y Not I
en 3'. pSAB144 se digiere con las enzimas de restricción NotI y SalI
para liberar un fragmento de 700 pares de bases que contiene la
porción Fc de la IgG1 humana.
Los fragmentos 1, 2 y 3 se ligan entre sí y se
transforma en bacterias competentes para la transformación. Los
plásmidos de los transformantes se recuperan y la correcta
orientación de los fragmentos ensamblados se analiza mediante la
digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel. Esta
construcción comprende el gen de fusión TGF\betaRII:Fc
recombinante de conejo y se confirma que la secuencia codificadora
está completa mediante secuenciación del ADN (ID SEC Nº 1 y 2).
El gen de la proteína de fusión TGF\betaRII:Fc
recombinante de conejo se transfecta en células de ovario de
hámster chino (CHO) mediante electroporación a 280 voltios. Tras la
transfección inicial, las células que expresan la dihidrofolato
reductasa (DHFR) se seleccionan mediante subcultivo en medio de
cultivo selectivo sin glicina, hipoxantina ni timidina. A
continuación, las colonias resultantes se transfieren a placas de
24 pocillos y se analiza la expresión del gen de la proteína de
fusión TGF\betaRII:Fc de conejo. Los cultivos con los niveles de
expresión más elevados se someten a amplificación mediante la
exposición a cantidades crecientes de metotrexato. Las células
capaces de crecer en metotrexato 25 nM se clonan mediante dilución
límite en placas de 96 pocillos. Los clones con expresión más
elevada se transfieren a cultivos en suspensión y el clon que
expresa los niveles más altos de TGF\betaRII:Fc se seleccionan
para la producción de TGF\betaRII:Fc.
Los profesionales de la materia pueden construir
y expresar un gen recombinante similar que contenga el dominio
extracelular del receptor de TGF\beta de tipo II humano aislando
el gen del receptor de TGF\beta de tipo II humano a partir del
ADNc de ovario humano disponible en el mercado (Clontech) y
sustituyendo el cebador oligonucleotídico descrito en la ID SEC Nº
7 por el cebador oligonucleotídico descrito en la ID SEC Nº 6. Se
describe la secuencia de ADN del gen de la proteína de fusión
TGF\betaR:Fc humana resultante(ID SEC Nº 3 y ID SEC Nº
4).
El gen de la proteína de fusión TGF\betaR:Fc
recombinante de conejo (ID SEC Nº 2 incluida dentro del vector de
expresión de la ID SEC Nº 1) se transfecta en células COS mediante
electroporación a 280 voltios. Las células transfectadas se
cultivan en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%. Después
de 5 días, las células se retiran del cultivo mediante
centrifugación y se valora la expresión de TGF\betaRII:Fc
recombinante de conejo en el sobrenadante mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida en presencia de SDS(SDS/PAGE). Se
analiza la capacidad del TGF\betaRII:Fc presente en el
sobrenadante del cultivo celular para unirse a TGF\beta. El
[^{125}I]-TGF\beta (NEN Life Science Products)
se incuba durante 2,5 horas con medio de cultivo celular
condicionado que contiene TGF\betaRII:Fc de conejo, o IgG control,
y Proteína A-sefarosa, que se une a la porción Fc
de la IgG. Los complejos proteína A:Fc resultantes se recuperan
mediante centrifugación, se lavan en solución salina tamponada con
fosfato y se analiza en SDS/PAGE y autorradiografía. El
TGF\betaRII:Fc inmunoprecipita al
[^{125}I]-TGF\beta pero no a la IgG control.
La proliferación de las células epiteliales
pulmonares de visón (CCL64) se inhibe con TGF\beta1. De este
modo, se puede analizar la capacidad de TGF\betaR:Fc para bloquear
el efecto anti-proliferativo de TGF\beta1. Las
células CCL64 se mantienen en MEM suplementado con 100 unidades/ml
de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y suero bovino fetal
al 10%. Para el análisis, se incubaron diluciones seriadas de
TGF\betaR:Fc con 0,1 ng/ml de TGF\betal durante 1 h en el medio
de ensayo (MEM suplementado con 100 unidades/ml de penicilina, 100
\mug/ml de estreptomicina y suero bovino fetal al 10%) en una
placa de cultivo tisular de microvaloración de 96 pocillos. Las
células CCL64 se resuspenden en el medio de ensayo y se añade a la
placa de ensayo a una concentración de 4.000 células por pocillo.
Las células se incuban a 37ºC durante 72 horas y se pulsa con
[^{3}H] timidina (70-86 Ci/mmol) durante 4 horas
más. La síntesis de ADN, que refleja la proliferación celular, se
determina midiendo la incorporación de [^{3}H] timidina. Cuando se
deja que las células proliferen en medio solo, la cantidad de
[^{3}H] timidina incorporada es de 188.745 cuentas por minuto
(CPM). Cuando se incluye TGF\betal en el medio, se inhibe la
proliferación y la cantidad de [^{3}H] timidina incorporada es de
49.088 cuentas por minuto. A continuación se muestran los resultados
cuando se añaden cantidades crecientes de TGF\betaR:Fc o IgG
control a los medios:
La cantidad de TGF\betaRII:Fc necesaria para
inhibir el efecto anti-proliferativo de 0,1 ng/ml de
TGF\beta1 en un 50% equivale a 0,5 \mug/ml.
A lo largo de todo el experimento se utilizaron
ratas Sprague-Dawley macho con un peso de 400 g y
aproximadamente 3 a 4 meses de edad (Bantin y Kingman, Edwards,
WA). Todo el proceso quirúrgico se realiza bajo anestesia general
por inyección intraperitoneal de xilazina (2,2 mg/kg, AnaSed TM,
Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA) y ketamina (540 mg/kg, Ketaset
TM, Aveco Co., Fort Dodge, IA). Se denuda la arteria carótida común
izquierda con un catéter de balón 2F introduciendo el catéter por
la arteria carótida externa. Las arterias carótida común izquierda
distal y carótida externa se exponen a través de la herida de la
línea media del cuello. El catéter se pasa tres veces con el balón
suficientemente distendido con solución salina para generar una
ligera resistencia; este procedimiento produce la distensión de la
propia carótida, la carótida externa se liga después de la retirada
del catéter y se cierra la herida.
Los tratamientos experimentales incluyen una
serie de inyecciones intravenosas de 1 ml de receptor de
TGF-beta de tipo II:Fc (ID SEC Nº 8) en PBS
administradas cada dos días (después de la operación) a 5 mg/kg.
Después de 14 días tras la denudación con el catéter de balón,
todas las ratas se anestesiaron y las arterias carótidas se fijaron
mediante perfusión a una presión de 120 mm Hg con paraformaldehído
al 1% y glutaraldehído al 1,25% en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 a
través de una cánula grande colocada en la aorta abdominal. Diez
minutos después de la fijación, a los animales se les administró
una inyección intravenosa de azul de Evans (0,3 ml en solución
salina al 5%). Después de 5 minutos de perfusión, se extrajeron las
arterias carótidas izquierda y la común derecha completas,
incluyendo el arco aórtico. Los vasos se fijan adicionalmente
mediante inmersión en el mismo fijador que se uso para la
perfusión.
La presencia o ausencia de endotelio en los
segmentos arteriales se analiza mediante la obtención de tres
segmentos de la arteria carótida izquierda teñida de azul y denudada
y su inclusión en parafina para hacer cortes usando un microtomo
"Micron". Para medir las áreas de la íntima, se obtuvieron
microfotografías de 34 cortes de cada animal. Las microfotografías
se digitalizan y analizan con un programa de análisis de imagen
(NIH Image 1.55 para MacIntosh). Las áreas de la íntima se miden
determinando el área entre el lumen y la lámina elástica interna.
Las áreas medias se determinan midiendo el área entre la lámina
elástica interna y externa. Los cocientes del área íntima/media se
calculan a partir de las medidas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La prueba T no pareada entre los tratamiento dio
como resultado una p=0,0001 estadísticamente significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
La prueba T no pareada entre los tratamientos
dio como resultado una p=0,0018 estadísticamente significativa, lo
que indica que el tratamiento con la ID SEC Nº 8 reducía
significativamente la formación de íntima respecto a la media,
cuando se comparaba con los grupos no tratados.
\vskip1.000000\baselineskip
Una característica de la fibrosis pulmonar es la
acumulación en exceso de colágeno en los pulmones. La cantidad de
colágeno en el tejido depende de la tasa de síntesis de colágeno y
de degradación de colágeno y en los casos de fibrosis, la tasa de
síntesis de colágeno predomina sobre la tasa de degradación de
colágeno.
Se adquieren de Charles River (Boston, MA)
hámster Glonden Syrain sin enfermedad respiratoria crónica con un
peso de 120 a 130 g y se mantuvieron en jaulas de plástico en grupos
de 4 en las instalaciones aprobadas por la Asociación Americana
para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. Se deja
que los animales se aclimaten durante una semana a las condiciones
del laboratorio antes de iniciar los experimentos. Los animales
tiene libre acceso a pienso Rodent Laboratory Chow 5001 (Purina
Mills. Inc., St. Louis, MO) y agua, y se mantienen en una
habitación con aire filtrado y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12
h. Para los estudios bioquímicos e histopatología, los hámsteres se
asignarán a los siguientes grupos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El sulfato de bleomicina se disuelve en solución
salina isotónica estéril apirógena inmediatamente antes de la
instilación intratraqueal (IT). Los hámsteres de los grupos
apropiados, anestesiados con pentobarbital (25-35
mg/kg ip) reciben bleomicina (5,5 unidades/kg/4 ml) o un volumen
equivalente (4 ml/kg) de solución salina isotónica apirógena por
vía transoral. El receptor de TGF-\beta de tipo
II:Fc se administra por vía intraperitoneal (IP) o intratraqueal a
los hámsteres de los grupos apropiados a una dosis terapéutica dos
veces a la semana durante 21-28 días tras la
instilación. Posteriormente, los animales de cada grupo se
sacrificaron mediante una sobredosis de pentobarbital sódico
(100-125 mg/kg ip) y los pulmones se procesaron para
los estudios bioquímicos e histológicos.
Los pulmones de los animales utilizados para los
estudios bioquímicos se perfunden in situ a través del
ventrículo derecho con solución salina enfriada en hielo para lavar
la sangre de la vasculatura pulmonar a través de una abertura en el
ventrículo izquierdo. Los lóbulos del pulmón sin tejido
parenquimatoso se disecan rápidamente, se introducen en nitrógeno
líquido para una rápida congelación y se conservan a -80ºC. Los
pulmones congelados se descongelan posteriormente y se homogeneizan
en tampón Tris 0,02 M, KCl 0,1 M (pH 7,6) con un homogeneizador
Polytron. Varias alícuotas de 1 ml del homogeneizado se conservan a
-80ºC hasta el momento de realizar diversos ensayos bioquímicos.
El contenido de hidroxiprolina del homogeneizado
de pulmón, como medida del contenido de colágeno, se cuantifica
mediante las técnicas de Woessner, Arch. Biochem. Biophys. 93:440447
(1961) y la peroxidación de lípidos mediante el procedimiento
descrito por Giri y col., Biochem. Pharmacol.54:
1205-1216 (1997).
Los hámsteres se anestesian hasta un nivel de
cese cardiaco. Se abre el tórax, se sujeta el corazón en su base y
se cánula la tráquea. Se extraerán los pulmones y corazón en bloque,
se pesarán y colocarán en un baño de solución salina normal y los
pulmones se instilan con un fijador de
glutaraldehído-paraformaldehído al 1% en tampón
cacodilato 0,12 M a 400 mOsm a 30 cm de presión de H_{2}O. Los
pulmones se fijan por medio de esta presión durante aproximadamente
2 horas y luego se conservan en fijador con las tráqueas ocluidas.
Antes de su inclusión, el pulmón se separa del corazón y de todo el
tejido no pulmonar mediante disección roma y extracción. Los
bloques de tejido se cortan a partir de al menos dos bloques
sagitales (2-3 mm de grosor) de los lóbulos derecho
superior, derecho inferior e izquierdos de cada pulmón. Cada bloque
se corta con un área de aproximadamente 1 cm^{2}. Los bloques se
deshidratan en una serie de grados crecientes de etanol y se
incluye en parafina. Se hacen los cortes (5 \mum de grosor) a
partir de los bloques de parafina y se tiñen con hematoxilina y
eosina para su evaluación histológica.
Los valores de los diferentes determinantes
bioquímicos de los pulmones de los animales control y tratados se
expresan por mg de proteína o ADN pulmonar. Sin embargo, debe
apreciarse que la expresión de los datos basados en los mg de
proteína o ADN de pulmón tenderá a introducir una reducción
artificial de los valores en los animales tratados. Este problema
se atribuye a la infiltración de leucocitos, a la presencia de
proteína plasmática residual en los pulmones, incluso después de la
perfusión, y a la proliferación de las células de tipo II y
fibroblastos en un estudio prolongado en los pulmones de hámster
tratados con bleomicina. Para evitar un descenso artificial de los
valores, los datos se expresarán por pulmón. Véase Starcher y col.,
Am. Rev. Resp. Dis., 117:299-305 (1973) y Witschi,
Essays Toxicol., 6:125-191(1975).
Los datos se analizan en términos de valores
promedio con sus desviaciones típicas y errores típicos de las
medias. Se aplicarán la prueba t de Student, las distribuciones chi
cuadrado, el coeficiente de correlación, el análisis de varianza
(ANOVA) y la prueba de comparación múltiple para evaluar la
significación de las diferencias entre los grupos control y tratado
usando un paquete estadístico para ordenador (SAS/STAT Guide, 6ª
Edición. Cary, N.C. pág. 183-260 (1985)).
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de las proteínas de la invención se
valora en un modelo experimental de glomerulonefritis. La
glomerulonefritis intersticial se induce en ratas con una única
inyección de suero nefrotóxico anti-membrana basal
glomerular (NTS) derivado en conejos. La lesión experimental es una
glomerulonefritis proliferativa mesangial aguda y se caracteriza
por la expansión de la matriz mesangial e hipercelularidad. Las
células dañadas también expresan más ARNm de
TGF-beta 1 y TGF-beta 1, que a su
vez estimula la síntesis de dos proteoglicanos, biglicano y
decorina. Es particularmente interesante el progreso reproducible de
la nefritis a través de la cicatrización glomerular y
tubulointersticial hasta la enfermedad renal en fase final.
Primero se induce la glomerulonefritis en las
ratas mediante una inyección intravenosa de suero NTS. A
continuación, durante seis días, dos grupos de ratas se tratan con
inyecciones intravenosas diarias de solución salina (el grupo
control negativo) o proteínas de la invención. El décimo día los
animales se sacrifican y se hacen cortes de los riñones, que se
tiñen con solución de ácido periódico de Schiff para resaltar los
cambios patológicos. Los riñones de los controles negativos
presentan glomerulonefritis completamente desarrollada con material
fibroso amorfo de rojizo a rosa en la mayoría de los glomérulos. Los
riñones del control positivo tienen un patrón de tinción similar a
un glomérulo normal. El riñón tratado con proteínas de la invención
también tiene una apariencia normal, lo que indica que las
proteínas de la invención bloquean la respuesta debida a la
secreción de sobreproducción de TGF-beta.
El grado de lesión glomerular puede
cuantificarse realizando un recuento celular glomerular de 30
glomérulos seleccionados aleatoriamente de animales normales y
animales nefríticos en cada grupo. El día 10 había más células en
los glomérulos de las ratas tratadas con NTS. La función renal
también se valoró midiendo los niveles de albúmina en orina y
cuantificando el aclaramiento de creatinina.
Otra medida del efecto de las proteínas de la
invención sobre el proceso de la enfermedad es cuantificar la
cantidad de acumulación de matriz extracelular en los glomérulos. El
grado de expansión de la matriz glomerular se determina como el
porcentaje de cada glomérulo ocupado por la matriz mesangial según
el procedimiento de Raij y col. (1984) Kidney Int. 26:
137-43. Es de esperar que los riñones tratados con
TGF-beta RII:Fc tengan porcentajes similares de
matriz mesangial a los de los riñones normales y significativamente
menos matriz mesangial que la de los riñones del control
negativo.
\vskip1.000000\baselineskip
La artritis se induce en ratas LEW hembra sin
patógenos (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Ind.) con un peso
de aproximadamente 100 gramos. Cada una recibe una dosis de
fragmentos de pared celular de estreptococos del Grupo A (SCW) (30
\mug de rhamnosa/g peso corporal), inyectada por vía
intraperitoneal (ip) según la técnica descrita por Brandes y col.
(1991) J. Clin. Invest. 87:1108. Las ratas LEW inyectadas con SCW y
las control reciben la administración de una inyección
intraarticular (IA) en uno de los tobillos traseros de una de las
siguientes soluciones:
1. proteínas de la invención en 25 \mul de
PBS,
2. PBS solo, o
3. una IgG control
Las articulaciones se controlaron clínicamente
determinando la cantidad de eritema articular, tumefacción y
distorsión en una escala de 0 (normal) a 4 (inflamación grave). Se
toman radiografías y se evalúa la presencia de tumefacción del
tejido blando, estrechamiento del espacio articular, erosiones óseas
y deformidad. Se obtienen muestras de tejido y se preparan para el
análisis histopatológico como se describe en Brandes y col.,
ibid. Se aísla el ARN total del tejido sinovial escindido
según el protocolo de Allen y col. (1990) J. Exp. Med. 171:231.
La inyección de SCW produce una respuesta
inflamatoria aguda que puede detectarse clínicamente en horas y en
un máximo de 3 a 5 días. Cuando el receptor de
TGF-beta de tipo II:Fc se inyecta directamente en la
articulación antes de la administración ip de SCW, la inflamación a
las 24 horas está significativamente por debajo de la observada en
las articulaciones con el anticuerpo no relacionado. En el punto
máximo de la respuesta aguda, la inflamación de estas
articulaciones tratadas se mantiene muy por debajo de la de las
articulaciones tratadas con el anticuerpo no relacionado. Incluso
si se inyectan receptor de TGF-beta de tipo II:Fc en
las articulaciones cuando la inflamación está bien desarrollada
(día 13), la proteína de fusión sigue teniendo un efecto
antiinflamatorio significativo en comparación con el anticuerpo no
relacionado. Puesto que las proteínas de la invención también se
unen a TGF-beta, tienen un efecto beneficioso
similar cuando si se administran de forma precoz o más tardía
durante el proceso inflamatorio. Otros modelos experimentales bien
establecidos de AR incluyen la artritis inducida por colágeno y
adyuvante. Véase, por ejemplo, Janusz MJ y col., Inflamm Res.
46:503-508 (1997); Myers y col., Life Sci
61:1861-1878 (1997) y Kock y col., Clin Immunol
Immunopathol 86: 199-208 (1998).
<110> BIOGEN IDEC MA INC.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas de fusión del receptor de
TGF-beta de tipo II y procedimientos.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2159.132EP01/EKS/DOS
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US98/07587
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
16-04-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/044.641
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
18-04-1997
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9.077
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conejo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de organismo
desconocido: Conejo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1.164
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conejo
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de organismo
desconocido: Conejo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9.077
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conejo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1.165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conejo
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conejo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggaaaaaa gcggccgctc tgccatgggt cgggggctg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
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<213> Conejo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttttgtcg accagatccg gactgctggg tggt
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttttgtcg accaagtcag gattgctggt gtta
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 388
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conejo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 388
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conejo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgaggaat acaccaccag cagtccggat ctggtcgaca aaactcacac atgcccaccg
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccca
\hfill66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Conejo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Glu Glu Tyr Thr Thr Ser Ser Pro Asp Leu
Val Asp Lys Thr His}
\sac{Thr Cys Pro Pro Cys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcagaaga atataacacc agcaatcctg acttggtcga caaaactcac acatgcccac
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtgccca
\hfill68
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
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<400> 13
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\sa{Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu
Val Asp Lys Thr His}
\sac{Thr Cys Pro Pro Cys Pro}
Claims (10)
1. Una composición que comprende una proteína de
fusión del receptor de TGF-\beta de tipo II
(TGF-\beta R II) que comprende:
(a) un polipéptido codificado por el
polinucleótido mostrado en la ID SEC Nº 2;
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos de la ID SEC Nº 8; o
(c) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos que es al menos el 98% idéntica a la secuencia de
aminoácidos de la ID SEC Nº 8,
y una región constante de una
inmunoglobulina, en la que dicha proteína de fusión de
TGF-\beta R II se une a
TGF-\beta.
2. Una composición que comprende una proteína de
fusión del receptor TGF-\beta de tipo II
(TGF-\beta R II) que comprende:
(d) un polipéptido codificado por el
polinucleótido mostrado en la ID SEC Nº 2;
(e) un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos de la ID SEC Nº 8; o
(f) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos que es al menos el 98% idéntico a la secuencia de
aminoácidos de la ID SEC Nº 8,
y una región constante de una
inmunoglobulina, en la que dicha proteína de fusión de
TGF-\beta R II se une a
TGF-\beta para su uso como
medicamento.
3. La composición de la reivindicación 2, en la
que la región constante es la de IgG1.
4. La composición de la reivindicación 2 ó 3, en
la que la región constante comprende la porción de las regiones
bisagra, CH2 o CH3 de la IgG1.
5. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en la que dicha proteína de fusión de
TGF-\beta R II es un homodímero.
6. Uso de una proteína de fusión de
TGF-\beta R II que comprende:
(a) un polipéptido codificado por el
polinucleótido mostrado en las ID SEC Nº 2 ó 4;
(b) un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos de las ID SEC Nº 8 ó 9; o
(c) un polipéptido que comprende una secuencia
de aminoácidos que es al menos el 98% idéntica a las ID SEC Nº 8 ó
9,
y una región constante de una
inmunoglobulina, en la que dicha proteína de fusión de
TGF-\beta R II se une a
TGF-\beta para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de un sujeto que padece un
trastorno
fibroproliferativo.
7. El uso de la reivindicación 6, en el que el
trastorno fibroproliferativo es artritis, nefropatía diabética,
glomerulonefritis, vitreorretinopatía proliferativa, mielofibrosis o
un trastorno vascular del colágeno seleccionado entre el grupo
constituido por esclerosis sistémica, polimiositis, escleroderma,
dermatomiositis o lupus eritematoso sistémico.
8. El uso de la reivindicación 6 ó 7, en el que
la región constante es la de IgG1.
9. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que la región constante comprende la
porción de las regiones bisabra, CH2 o CH3 de la IgG1.
10. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, en el que dicha proteína de fusión de
TGF-\beta R II es un homodímero.
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