ES2651113T3 - Tratamientos terapéuticos dirigidos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende al menos un conjugado HBn-Xn, en la que HB es un péptido de unión a heparina seleccionado entre KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:2), MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:21), KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:3); o MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:22); X es un principio activo seleccionado de: factor de crecimiento nervioso (NGF); factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF); factor neurotrófico de dopamina conservado (CDNF); ligandos de la familia del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial; factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF); neurturina (NRTN); artemina (ARTN); persefina (PSPN); citoquinas neuropoyéticas seleccionadas de interleuquina-6, interleucina-11, interleucina-27, factor inhibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, cardiotrofina 1, neuropoyetina, citoquina de tipo cardiotropina o factor 2 de crecimiento de fibroblastos; citoquinas antiinflamatorias seleccionadas entre interleuquina-4 e interleuquina-10 del receptor 2 de TNF; neurregulina-1 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); Cerebrolysin® (FPF-1070); factor 11 de diferenciación del crecimiento (GDF11); factor 1 de derivado de células del estroma (SDF-1); miostatina (factor 8 de diferenciación del crecimiento de fibroblastos (GDF8)); factor 1 de crecimiento de tipo insulina (IGF1); hormona paratiroidea (HPT); una porción de la PTH, seleccionada entre los restos de aminoácidos 1-31,1-34 (TM Forteo ® ), 1-37, 1-38, 1-44, o 1-84 de la PTH madura; péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) o un análogo de la PTHrP que tiene la secuencia (AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA, donde N es Aib (ácido 2-aminoisobutírico) (SEQ ID NO: 39), antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-IRA); quimeras IL-1/IL-1 RA; IL-1RA maduro que tiene la secuencia de aminoácidos: RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEP HALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO: 40), factor 18 de crecimiento de fibroblastos (FGF-18); proteína del grupo 2 de alta movilidad (HMG-2); un anticuerpo terapéutico seleccionado entre Remicade® (infliximab, anti-TNF-a), Humira® (adalimumab, anti-TNF), ENBREL® (etanercept, proteína recombinante anti-TNF); un anticuerpo dirigido contra el factor 9 de crecimiento nervioso; factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-9); factor de crecimiento de hepatocitos; proteínas de la superfamilia de TGF-beta seleccionadas entre TGF, TGF3, BMP2, o BMP7; análogo de angiopoyetina 3 (ANGPTL3); un agente antiinflamatorio esteroideo seleccionado del grupo que consiste en 21-acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, acetónido de fluocinolona, fluocinonida, fluocortin butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, mometasona furoato, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 25-dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato de prednisolona sodio, prednisona, prednival, prednidileno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona, y hexacetónido de triamcinolona; somatostatina (SST) o un análogo de la misma seleccionado entre las moléculas pequeñas (nombre comercial SANDOSTATIN® ), pasireotida (SOM230, nombre comercial SIGNIFOR®), lanreotida (nombre comercial: SOMATULINE® ); un principio activo de molécula pequeña seleccionado entre TR2-01829 o PRO 1,2-hidroxi-N-[3-(trifluorometil)fenil]benzamida (HS-Cf) o kartogenina y n es un número entero de al menos 1.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Tratamientos terapéuticos dirigidos Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a procedimientos y composiciones para administrar principios activos, por ejemplo, agentes terapéuticos, mediante conjugación, fusión, o enlace no directo del principio activo a uno o más péptido de unión a heparina (HB). Otros aspectos se refieren a composiciones, procedimientos y kits que comprenden péptidos de unión a heparina (HB) condensados o conjugados con los agentes terapéuticos.

Antecedentes de la invención

La administración sistémica o la actividad no específica de agentes terapéuticos, tales como citoquinas recombinantes y moléculas pequeñas, pueden desencadenar secuelas no previstas. De esta forma, sigue existiendo necesidad de una administración dirigida de las moléculas activas al sitio de interés.

El documento US2006/0172931 desvela péptidos de unión a heparina, composiciones y su uso, así como un conjugado que comprende un péptido de unión a heparina conjugado con al menos un principio activo. No obstante, la presente invención se diferencia de dicha solicitud en que los péptidos de unión a heparina son diferentes.

El documento WO 2008/023063 desvela un procedimiento para tratar cartílagos y osteoartritis que comprende administrar FGF-18 como principio activo.

El documento US 2007/0081992 desvela una composición para tratar un trastorno neurológico que comprende una proteína de fusión que comprende un BDNF unido covalentemente a una inmunoglobulina.

El documento WO 1993/019770 desvela un procedimiento para tratar diferentes inflamaciones que comprende aplicar IL-4 e IL-10 como principios activos.

El documento WO 2011/008773 desvela que ANGPTL3 induce la condriogénesis.

Sumario de la invención

Las presentes realizaciones proporcionan la liberación selectiva de proteínas terapéuticas recombinantes o moléculas pequeñas a células o tejidos que expresan proteoglicanos, por ejemplo, aunque no de forma limitativa a cartílago, tejido del cerebro y de la médula espinal, piel y tejido subcutáneo. Más específicamente, algunas realizaciones del presente documento se dirigen a novedosos péptidos de unión a heparina (HB) condensados con una proteína terapéutica o porción de la misma, opcionalmente mediante un péptido enlazador. Algunas realizaciones proporcionan la conjugación o la unión indirecta de moléculas pequeñas a HB novedosos para su administración selectiva. Las composiciones de HB-agente se pueden usar en tándem para la administración de proteínas y agentes terapéuticos a tejidos.

Un aspecto de la presente invención proporciona una composición terapéutica selectiva que comprende, por ejemplo, (HB-enlazador)n-Xm-(enlazador-HB)o, donde HB es una proteína de unión a heparina, X es un principio activo tal como una proteína terapéutica o una parte de la misma, o un molécula pequeña terapéutica, y donde n, m, y o son números enteros, y m es al menos uno y n+o es al menos uno. En algunas realizaciones, un conjugado HB- X es HB-Xn, o (HB-enlazador)n-Xn, y donde n es un n es un número entero de al menos 1. En algunas realizaciones, la composición es una proteína de fusión recombinante que comprende una HB recombinante y la proteína terapéutica (o fusión de la misma). En una ilustración de la divulgación, los componentes de la composición se pueden colocar en orden, con respecto al extremo N de la parte HB de la composición: HB-X, X-HB, HB-enlazador- X, (HB-enlazador)2-X, X-enlazador-HB, X-HB-X, HBn X-HBn, (HB-enlazador)n-X-(enlazador-HB)n, HB-X-HB-X, etc. Los componentes de la composición se colocan en orden, con respecto al extremo N de la parte HB de la composición: HB-X, X-HB, HB-enlazador-X, (HB-enlazador)2-X, X-enlazador-HB, HBn-X-HBn (HB-enlazador)n-X- (enlazador-HB)n, HB-X-HB-X, etc.

Adicionalmente, la composición puede comprender una mezcla de construcciones HB-X, en la que X representa diferentes proteínas o moléculas pequeñas (es decir, una composición que comprende HB-X1 y HB-X2, etc.). Un enlazador ilustrativo es un péptido que comprende los aminoácidos GGG. Otros enlazadores habitualmente conocidos en la técnica están abarcados para su uso en el conjugado HB-X, tales como enlazadores peptídicos conocidos y enlazadores químicos.

Más específicamente, la parte HB de la composición está cargada positivamente a través de numerosos restos lisina y arginina en el péptido HB, que se unen a proteoglicanos celulares o expresados en tejidos que están cargados negativamente mediante grupos sulfato. En realizaciones particulares, el Hb está mutado para potenciar la carga positiva mediante la sustitución del resto cisteína natural por un resto arginina o lisina. Por ejemplo, en una ilustración de la divulgación, se puede seleccionar un HB a partir de los siguientes péptidos que tienen las secuencias de restos de aminoácidos: KRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK (SEQ ID NO: 1);

KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:2) (también denominada como HB C16R); o KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO: 3) (también denominada como C16K de HB), o variantes funcionales, análogos o derivados de los mismos. En la invención, HB se puede seleccionar entre las SEQ ID NOS: 2-3.

Adicionalmente, la parte HB de la composición se puede repetir, opcionalmente, con un péptido enlazador que conecta los péptidos HB. Por tanto, por ejemplo, usando SEQ ID NO: 2 como una parte HB ilustrativa, una molécula

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

terapéutica puede comprender o estar unida a los siguientes aminoácidos: KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:4) o

KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKK RDPRLRKYK (SEQ ID NO: 5). Los péptidos enlazadores habitualmente conocidos del experto en la materia están abarcados para su uso en la presente invención, por ejemplo, tales como los desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, un péptido enlazador comprende GGG. En algunas realizaciones, un péptido enlazador comprende (GGGGS) (SEQ ID NO: 42).

En algunas realizaciones, un principio activo o fusión HB recombinante se puede seleccionar entre factores neurotróficos, incluidas neurotrofinas tales como el factor de crecimiento de los nervios (NGF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4 (NT-4), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF), o factor neurotrófico de dopamina (CDNF); ligandos de la familia del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial tales como el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), neurturina (NRTN), artemina (ARTN), o persefina (PSPN); citoquinas neuropoyéticas tales como interleuquina-6, interleucina-11, interleucina-27, factor inhibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, cardiotrofina 1, neuropoyetina, citoquina de tipo cardiotropina, o factor de crecimiento de fibroblastos 2; las citoquinas antiinflamatorias incluyen interleuquina-4 e interleuquina-10; agentes de neuroprotección incluyen neurregulina-1 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGf); u otras proteínas terapéuticas tales como Cerebrolysin® (FPF-1070), factor de diferenciación del crecimiento 11 (GDF11), factor derivado de células del estroma 1 (SDF-1), miostatina (factor de diferenciación del crecimiento de fibroblastos 8 (GDF8)); factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF1); hormona paratiroidea (HPT); péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP); antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-1RA); quimeras IL-1/IL-1RA, factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF-18); proteína del grupo 2 de alta movilidad (HMG-2, también conocida como secuencia 2 del grupo de alta movilidad (HMGB2)); un anticuerpo terapéutico o parte del mismo, tal como REMICADE® (infliximab, anti-TNF-a, Janssen Biotech, Horsham, PA), HUMiRa® (adalimumab, anti-TNF, Abbot Labs., N. Chicago, IL), ENBREL® (etanercept, proteína recombinante anti-TNF, Amgen, Thousand Oaks, CA), o un anticuerpo dirigido contra el factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF-9); factor de crecimiento de hepatocitos; proteínas de la superfamilia de TGFp, tales como TGFp, TGFp3, BMP2, o BMP7; angiopoyetina tipo 3 (ANGPTL3), somatostatina (SST) o partes funcionales, variantes, análogos o derivados de cualquiera de estos.

En algunas realizaciones, la porción terapéutica de la proteína de la fusión HB se selecciona de IGF-1, PTH, PTHrP, IL-1RA, FGF-18, o partes funcionales, análogos, o derivados de los mismos.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para tratar dolencias clínicas relacionadas con el cartílago (por ejemplo, daño o enfermedad) que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una proteína de fusión recombinante que comprende HB-X, donde X es una proteína terapéutica o parte de la misma, en la que la proteína terapéutica se seleccionado de IGF-1, PTH, PTHrP, IL-1RA, FGF-18, un anticuerpo dirigido contra el factor de crecimiento nervioso, FGF-9, factor de crecimiento de hepatocitos, TGFp, TGFp3, BMP2, BMP7, o partes funcionales, análogos, o derivados de los mismos.

En otra realización particular, HB se fusiona con el receptor glucocorticoideo, lo que facilita la administración dirigida de corticoesteroides al cartílago; cuya administración se puede llevar a cabo simultáneamente o por separado de la administración de un corticoesteroide.

En algunas realizaciones, la dolencia del cartílago es un defecto en el cartílago articular que incluye la rotura o el desprendimiento, un defecto en el menisco que incluye un desgarro parcial o completo, artrosis, ruptura o desprendimiento traumático del cartílago, espondilitis anquilosante, capsulitis, artritis psoriática, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, o raquitismo hipofosfatémico vinculado a X, o artritis idiopática juvenil. El tratamiento de la dolencia del cartílago se puede combinar con otros tratamientos como adyuvante de otras intervenciones quirúrgicas par reparación del daño articular, reparación del menisco, o reparación de ligamentos, con el fin tanto de mejorar la reparación como de prevenir el desarrollo de artrosis.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el tratamiento de una dolencia neurológica (por ejemplo, una enfermedad o trastorno) que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una proteína de fusión recombinante que comprende HB-X, donde X es una proteína terapéutica o parte de la misma, seleccionada entre factor de crecimiento de los nervios (NGF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4 (NT-4), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF), factor neurotrófico de dopamina (CDNF), factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), neurturina (NRTN), artemina (ARTN), persefina (PSPN), interleucina-6, interleucina-11, interleucina-27, factor inhibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, cardiotrofina 1, neuropoyetina, citoquina de tipo cardiotropina, FPF- 1070, factor de crecimiento de fibroblastos 2, neurregulina-1, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), IGF o factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF1).

La enfermedad neurodegenerativa se puede seleccionar entre enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, lesión cerebral, lesión de la médula espinal, degeneración de nervios periféricos, ictus, enfermedad de Huntington, enfermedad de Pick, neuropatía diabética, demencia frontotemporal, demencia con cuerpos de Lewis, degeneración corticobasal, parálisis supranuclear progresiva,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

trastornos priónicos, parálisis supranuclear progresiva, atrofia multisistémica, paraparesis espástica hereditaria, atrofias espinocerebelares, ataxia de Friedreich, amiloidosis, o síndrome de Charcot Marie Tooth.

Otra realización proporciona la administración de una composición de HB-X para el tratamiento de enfermedades oculares tales como úlcera de la córnea, abrasión de la córnea, queratopatía puntiforme superficial de Thygeson, neovascularización de la córnea, distrofia de Fuchs, queratoconjuntivitis seca, inflamación coriorretinal, cicatrices coriorretinales, degeneración coroidal, distrofia coroidal hereditaria, desprendimiento de retina, retinosquisis, retinopatía hipertensiva, retinopatía del prematuro, degeneración macular relacionada con la edad, degeneración de la retina, degeneración macular, membrana epirretinal, degeneración periférica de la retina, distrofia retinal hereditaria, retinitis pigmentosa, xeroftalmia, o hemorragia retinal.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para tratar, la inflamación que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una proteína de fusión recombinante que comprende HB-X, donde X es una proteína terapéutica o parte de la misma, seleccionada entre receptor 2 de TNF, interleuquina-4, o interleuquina-10.

En otra realización de la invención, el HB-X se proporciona en un vehículo de liberación sostenida, tal como ácido hialurónico, para extender la liberación y el efecto fisiológico de la composición de HB-X.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona datos que muestran la retención a largo plazo de una realización de HB-IGF-1 tras inyección intraarticular. Se llevó a cabo un análisis mediante transferencia Western sobre el IGF-1 o HB-IGF-1 retenido en cartílago articular, menisco, o tendón rotuliano de rata a 2, 4, 6, y 8 días después de la inyección intraarticular de cualquiera de IGF-1, HB-IGF-1, o PBS.

La Figura 2 muestra los niveles séricos de IGF-1 vs. HB-IGF-1 después de la inyección intraarticular. Ratas Lewis macho de 251-275 g (Charles River, Wilmington MA) se asignaron aleatoriamente a uno de tres grupos (n=3 para cada grupo) de HB-IGF-1, IGF-1 o suero salino. Las ratas recibieron inyecciones intraarticulares de 50 |jl que contenían bien 100 |jg de HB-IGF-1, 100 |jg de IGF-1, o suero salino en la articulación de la rodilla derecha. Se extrajo sangre de la vena de la cola a 2, 4, 8, 24, 48, y 96 horas después de la inyección. Los niveles séricos se midieron con un ELISA (R&D Systems, Mineápolis, MN). Los niveles de HB-IGF-1 en suero fueron significativamente inferiores a los niveles de IGF-1 en los tres primeros puntos temporales. los niveles de HB-IGF-1 no fueron significativamente diferentes de los del suero salino después de 2 horas. Esto muestra que la inyección intraarticular de HB-IGF-1 limita la cantidad de IGF-1 no específico en circulación, comparado con el IGF-1 no asociado a HB.

La Figura 3 es un gráfico de barras que representa gráficamente la estimulación ex vivo sostenida de la biosíntesis y proliferación del cartílago mediante HB-IGF-1 después de la inyección intraarticular en ratas. Las ratas recibieron una sola inyección intraarticular de 50 jl que contenía bien 100 jg de una realización de HB-IGF- 1, 100 jg de IGF-1, o PBS en la articulación de la rodilla derecha. Las ratas se sacrificaron 2 y 4 días después de la inyección, y los meniscos se recogieron y se cultivaron con radiomarcas. Los gráficos representan la incorporación de sulfato [35s] en el menisco 2 y 4 días después inyección intraarticular. Los resultados se muestran como promedio ± sEm.

La Figura 4 es un gráfico de barras de un estudio sobre artrosis que compara puntaciones OARSI de HB-IGF-1, IGF-1, y PBS.

La Figura 5 muestra la expresión superior de HB-IGF-1 soluble que comprende péptidos HB potenciados (HBp): C17K (SEQ ID NO:22) y C17R (SeQ ID NO: 21). La Figura 5 muestra una transferencia Western que utiliza un anticuerpo dirigido contra IGF-1 para detectar la presencia de IGF1 tras la incubación de explantes de cartílago con diferentes variantes de fusión de HB-IGF-1, donde las variantes de HB incluyen C17K (SEQ ID NO:22); C17R (SEQ ID NO: 21), C17S (SEQ ID NO: 41), HB natural (SEQ ID NO: 20). La Figura 5 muestra que las proteínas de fusión IGF-1 que comprenden las variantes C17K (SEQ ID NO:22) o C17R (SEQ ID NO: 21) dan como resultado mayor retención de IGF-1 en el cartílago en comparación con las variantes C17S (SEQ ID NO: 41) y HB natural (SEQ ID NO: 1).

La Figura 6 muestra el superior rendimiento en la purificación de HB-IGF-1 soluble con una proteínas de fusión HB HB-IGF-1 que comprende las variantes C17R (SEQ ID NO: 21) HB. La Figura 6 muestra una transferencia Western usando un anticuerpo dirigido contra IGF-1 derivado de extractos de cartílago purificados mediante cromatografía de exclusión por tamaño para detectar el rendimiento de IGF1 tras incubación de explantes de cartílago con las variantes de fusión de HB-IGF1 que comprenden bien el péptido C17R (SEQ ID NO: 21) o el péptido HB natural (SEQ ID NO: 20). La Figura 6 muestra un rendimiento de IGF-1 significativamente mayor a partir de extractos incubados con proteínas de fusión C17R de HB(C17R)-IGF-1 en comparación con las proteínas de fusión HB(WT)-IGF-1.

La Figura 7 muestra que HB (C17R) permite un rendimiento superior de HB-IGF1 a partir de cuerpos de inclusión. La Figura 7 muestra una transferencia Western usando un anticuerpo dirigido contra IGF-1 derivado de extractos de cartílago purificados a partir de cuerpos de inclusión para detectar el rendimiento de IGF1 tras incubación de explantes de cartílago con las variantes de fusión de HB-IGF1 que comprenden bien el péptido C17R (SEQ ID NO: 21) (al que se hace referencia como HBe) o el péptido HB natural (SEQ ID NO: 20). La Figura 7 muestra un rendimiento significativamente mayor de IGF-1 en cuerpos de inclusión inducidos y no inducidos obtenidos a partir de las proteínas de fusión HB(C17R)-IGF-1 (HBp-IGF-1) en comparación con los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

extractos incubados con las proteínas de fusión HB(WT)-IGF-1 (wHB-IGF-1).

La Figura 8 muestra una transferencia Western de la retención de IGF-1 en médula espinal incubada con HB- IGF-1. Tejido de médula espinal de rata se incubó durante 24 horas en medio sin adiciones (sin IGF-1), 1 ug/ml de IGF-1, o 1 ug/ml de HB-IGF-1. Después de la incubación, el tejido se lavó y bien se congeló inmediatamente ("Día 0") o bien se incubó durante 24 horas más en medio fresco antes de la recogida para eliminar las proteínas por lavado ("Día 1"). A continuación, los tejidos se analizaron mediante transferencia Western con un anticuerpo dirigido contra IGF1 para detectar la presencia de IGF-1 o HB-IGF-1 remanente en el tejido de la espina dorsal. Las Figuras 9A-9B muestran la retención de PTH en discos de cartílago incubados con PTH-HB. Los discos del cartílago se incubaron en el medio sin adición de péptido ("Sin PTH"), hormona paratiroidea 1-34 ("PTH"), o una hormona paratiroidea de fusión 1-34 con un dominio HB ("PTH-HB"). La Figura 9a muestra el péptido control de la cantidad de PTH o PTH-HB añadidos a los explantes de disco de cartílago. Después de 24 horas, los discos de cartílago se lavaron y se devolvieron para incubación en medio fresco en ausencia de péptido. La Figura 9B muestra una transferencia Western con un anticuerpo dirigido contra PTH en extractos de tejido de cartílago dos días después del lavado, mostrando que PTH solamente está retenido en los discos de cartílago incubados con PTH-HB pero no con el PTH fusionado.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la conjugación de péptidos de unión a heparina (HB) con un principio activo (por ejemplo, X) para la administración selectiva del principio activo a una célula o tejido que expresan proteoglicanos. En algunas realizaciones, el conjugado HB-principio activo se puede usar para administrar el principio activo a células o tejidos que expresan proteoglicanos, por ejemplo, aunque no de forma limitativa a cartílago, tejido del cerebro y la médula espinal, piel y tejido subcutáneo.

Más específicamente, en una ilustración de la divulgación, algunas de las realizaciones del presente documento se dirigen a péptidos de unión a heparina (HB) de SEQ ID NO: 1-3 o SEQ ID NO: 20-22. En algunas realizaciones de la invención, las SEQ ID NOS: 2-3 o SEQ ID NOS: 21-22 están fusionadas con un principio activo que es una proteína terapéutica o una parte de la misma, opcionalmente mediante un péptido enlazador. En algunas realizaciones de la invención, el principio activo es una molécula pequeña, que permite la administración de la molécula pequeña a células y tejidos que comprenden proteoglicanos, donde un péptido HB de la SEQ ID NO: 2-3 o SEQ ID NO: 21-22 se puede conjugar a la molécula pequeña mediante enlace directo o indirecto (por ejemplo, uso de enlazadores químicos). En algunas realizaciones, las composiciones que comprenden conjugados de hB-X se pueden usar para administrar una o varios múltiples proteínas o agentes terapéuticos diferentes a tejidos y células que expresan proteoglicanos.

Un aspecto ilustrativo de la presente divulgación proporciona una composición terapéutica selectiva que comprende HB-Xn, o (Hb-enlazador)n-Xn, donde HB es una proteína de unión a heparina, X es un principio activo tal como una proteína terapéutica o una parte de la misma, o un molécula pequeña terapéutica y n es un número entero de al menos 1.

La composición de la invención de uno cualquiera de los párrafos anteriores se pueden ilustrar en los que X es una proteína seleccionado de factores neurotróficos; neurotrofinas; factor de crecimiento nervioso (NGF); factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF); factor neurotrófico de dopamina conservado (CDNF); ligandos de la familia del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial; factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF); neurturina (NRTN); artemina (ARTN); o persefina (PSPN); citoquinas neuropoyéticas; interleuquina-6; interleuquina-11; interleuquina-27; factor inhibidor de leucemia; factor neurotrófico ciliar; cardiotrofina 1; neuropoyetina; citoquina de tipo cardiotropina; factor de crecimiento de fibroblastos 2; citoquinas antiinflamatorias; interleuquina-4; interleuquina-10; agentes neuroprotectores; neurregulina-1; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); Cerebrolysin® (FPF 1070), Etanercept (Enbrel®, receptor de TNF recombinante 2 soluble fusionado al componente Fc de la inmunoglobulina humana G1); factor de diferenciación del crecimiento 11 (GDF11); factor derivado de células del estroma 1 (SDF-1); miostatina (factor de diferenciación del crecimiento de fibroblastos 8 (GDF8)); hormona paratiroidea (HPT); péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP); antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-1RA); factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF-18); proteína del grupo 2 de alta movilidad (HMG-2, también conocida como secuencia 2 del grupo de alta movilidad (HMGB2)); receptor glucocorticoideo; un anticuerpo terapéutico o parte del mismo, tal como Remicade® (infliximab, anti-TNF-a, Janssen Biotech, Horsham, PA), Humira® (adalimumab, anti TNF, Abbot Labs., N. Chicago, IL), o un anticuerpo dirigido contra el factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF 9); factor de crecimiento de hepatocitos; proteínas de la superfamilia de TGFp, tales como TGFp, TGFp3, BMP2, o BMP7; u otras proteínas terapéuticas; o partes funcionales, variantes, análogos, o derivados de cualquiera de los anteriores; o principios activos de molécula pequeña.

Un aspecto particular de la presente invención proporciona una composición terapéutica selectiva que comprende HB-Xn, o (HB-enlazador)n-Xn, donde HB es una proteína de unión a heparina, seleccionados entre KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:2), MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:21),

KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:3) o MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:22); X es un principio activo seleccionada entre factor de crecimiento de los nervios (NGF); factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF); factor neurotrófico de dopamina conservado (CDNF); ligandos de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

familia del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial; factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF); neurturina (NRTN); artemina (ARTN); persefina (PSPN); citoquinas neuropoyéticas seleccionadas de interleuquina-6; interleuquina-11; interleuquina-27; factor inhibidor de leucemia; factor neurotrófico ciliar; cardiotrofina 1; neuropoyetina; citoquina de tipo cardiotropina; factor de crecimiento de fibroblastos 2; citoquinas antiinflamatorias seleccionadas entre interleuquina-4 e interleuquina-10 del receptor 2 de TNF; neurregulina-1 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); Cerebrolysin® (FPF-1070); factor de diferenciación del crecimiento 11 (GDF11); factor derivado de células del estroma 1 (SDF-1); miostatina (factor de diferenciación del crecimiento de fibroblastos 8 (GDF8)); factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF1); hormona paratiroidea (HPT); una parte de la PTH, seleccionada entre los restos de aminoácidos 1-31, 1-34 (TM Forteo®), 1-37, 1-38, 1-44, o 1-84 de la PTH madura; péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) o un análogo de la PTHrP que tiene la secuencia (AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA, donde N es Aib (ácido 2-aminoisobutírico) (SEQ ID NO: 39), antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-IRA); quimeras IL-1/IL-1 RA; IL-1RA maduro que tiene la secuencia de aminoácidos:RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGI

HGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTA MEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO: 40), factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF-18); proteína del grupo 2 de alta movilidad (HMG-2); un anticuerpo terapéutico seleccionado entre Remicade® (infliximab, anti-TNF-a), Humira® (adalimumab, anti-TNF), ENBREL® (etanercept, proteína recombinante anti-TNF); un anticuerpo dirigido contra el factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF-9); factor de crecimiento de hepatocitos; proteínas de la superfamilia de TGF-beta seleccionadas entre TGF, TGF3, BMP2, o BMP7; análogo de angiopoyetina 3 (ANGPTL3); un agente antiinflamatorio esteroideo seleccionado del grupo que consiste en 21-acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, acetónido de fluocinolona, fluocinonida, fluocortin butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, mometasona furoato, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 25-dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato de prednisolona sodio, prednisona, prednival, prednidileno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona, y hexacetónido de triamcinolona; somatostatina (SST) o un análogo de la misma seleccionado entre las moléculas pequeñas (nombre comercial SANDOSTATIN®), pasireotida (SOM230, nombre comercial SIGNIFOR®), lanreotida (nombre comercial: SOMATULINE®); un principio activo de molécula pequeña seleccionado entre TR2-01829 o pRo 1, 2-hidroxi-N-[3- (trifluorometil)fenil]benzamida (HS-Cf) o kartogenina y n es un número entero de al menos 1.

Un aspecto de la presente invención proporciona una composición que comprende además un enlazador, en la que la composición está representada por (HB-enlazador)n-Xn.

Un aspecto de la presente invención proporciona una composición en la que X es un principio activo seleccionado entre factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF1); hormona paratiroidea (HPT); una parte de la PTH, seleccionada entre los restos de aminoácidos 1-31, 1-34 (TM Forteo®), 1-37, 1-38, 1-44, o 1-84 de la PTH madura; péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) o un análogo de la PTHrP que tiene la secuencia (AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA, donde N es Aib (ácido 2-aminoisobutírico) (SEQ ID NO: 39), antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-IRA); quimeras IL-1/IL-1 RA, IL-1RA maduro que tiene la secuencia de aminoácidos:RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGI

HGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTA MEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO: 40), factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF-18).

En algunas realizaciones, la composición es una proteína de fusión recombinante que comprende una HB recombinante y la proteína terapéutica (o fusión de la misma). Cualquier combinación de un péptido HB seleccionado del grupo de las SEQ ID NO: 2-3 o 21-22 se puede usar con cualquier combinación de un principio activo, con o sin la presencia de una proteína enlazadora, donde el péptido HB se puede situar en el extremo N y/o C del principio activo, y hay uno o múltiples enlazadores peptídicos HB unidos al extremo N y/o C del principio activo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la fusión o conjugado puede comprender (HB-enlazador)n-Xm-(enlazador- HB)o, donde n, m, y o son números enteros, y m es al menos uno y n+o es al menos uno. En algunas realizaciones ilustrativas de la invención, el péptido HB se selecciona entre el grupo de la SEQ ID NO: 2-3 o 21-22.

En algunas realizaciones ilustrativas de la divulgación, los componentes de la composición se pueden colocar en orden, con respecto al extremo N de la parte HB de la composición: HB-X, X-HB, HB-enlazador-X, (HB-enlazador)2- X, X-enlazador-HB, X-HB-X, HBn-X-HBn, (HB-enlazador)nX-(enlazador-HB)n, HB-X-HB-X, etc.

En algunas realizaciones, los componentes de la composición se pueden colocar en orden, con respecto al extremo N de la parte HB de la composición: HB-X, X-HB, HB-enlazador-X, (HB-enlazador)2-X, X-enlazador-HB, HBn-X-HBn, (HB-enlazador)n-X-(enlazador-HB)n, HB-X-HB-X, etc. Adicionalmente, la composición puede comprender una mezcla de construcciones HB-X, en la que X representa diferentes proteínas o moléculas pequeñas (es decir, una composición que comprende HB-X1 y HB-X2, etc.). Un enlazador ilustrativo es un péptido que tiene los aminoácidos GGG.

Debe entenderse que la presente invención no está limitada a la metodología, protocolos, y reactivos concretos, etc.,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

descritos en el presente documento y como tal puede variar. La terminología utilizada en el presente documento tiene como fin únicamente describir realizaciones particulares, y no se pretende que limite el ámbito de la presente invención, que está definido únicamente por las reivindicaciones. Salvo que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Todas las ID génicas se refieren a genes humanos, a menos que se indique de otra manera, disponibles en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, las formas singulares incluyen las referencias plurales y viceversa, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. El término "o" es inclusivo salvo que esté modificado, por ejemplo, por "cualquiera de". Excepto en los ejemplos operativos, o donde se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en el presente documento deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Se debe entender además que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de pesos moleculares o de masas moleculares, proporcionados para los ácidos nucleicos o para los polipéptidos son aproximados, y se proporcionan como descripción.

Todas las patentes y otras publicaciones identificadas con el fin de describir y desvelar, por ejemplo, las metodologías descritas en dichas publicaciones que deberían utilizarse vinculadas a la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto debe considerarse como una admisión de que los inventores no tienen el derecho de anteceder dicha divulgación en virtud a una invención anterior, o por cualquier otro motivo. Todas las declaraciones, como la fecha o representación, así como el contenido de dichos documentos está basada en la información disponible para los solicitantes, y no constituye ninguna admisión sobre la exactitud de las fechas o el contenido de estos documentos.

La presente invención proporciona la administración selectiva de principios activos y restos terapéuticos, por ejemplo, proteínas o moléculas pequeñas, a tejidos concretos con los que se asocia la proteína de unión a heparinas. Más específicamente, las presentes realizaciones proporcionan novedosos motivos proteínicos de unión a heparina (HB) que están unidos o fusionados con un resto terapéutico, tal como una molécula pequeña, o una citoquina, o factor de crecimiento, o parte funcional del mismo.

Definiciones

Por comodidad de uso, algunos términos empleados en toda la solicitud (incluida la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas) se recopilan en este momento. Salvo que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica a la cual pertenece la presente invención.

El término "proteína" se pueden utilizar de forma indistinta con "polipéptido" para referirse a un polímero de restos de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Normalmente, una proteína o polipéptido tiene una longitud mínima de al menos 25 aminoácidos. El término "polipéptido" y "proteína" puede abarcar una proteína multimérica, por ejemplo, una proteína que contiene más de un dominio o subunidad. El término "péptido" tal como se usa en el presente documento se refiere de forma típica a un polímero de aminoácido unido mediante enlaces peptídicos que contiene menos de 25 aminoácidos, por ejemplo, entre aproximadamente 4 aminoácidos y aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. Las proteínas y péptidos pueden estar compuestos de aminoácidos linealmente dispuestos unidos mediante enlaces peptídicos, tanto si se producen de forma biológica, recombinante, o sintética, y si están compuestos por aminoácidos de origen natural o no natural, están incluidos dentro de esta definición. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas de más de 25 aminoácidos están abarcados en la definición de proteína. Los términos también incluyen polipéptidos que tienen modificaciones cotraduccionales (por ejemplo, escisión de péptidos señal) y modificaciones posteriores a la traducción del polipéptido, tales como, por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, acetilación, fosforilación, lipidación, escisión proteolítica (por ejemplo, escisión con metaloproteasas), y similares. Por otro lado, tal como se usa en el presente documento, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de tipo conservativo, como conoce un experto en la materia) en la secuencia natural, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, tales como la mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como mediante mutaciones en hospedadores que producen las proteínas, o errores debidos a amplificación mediante PCR u otros procedimientos de ADN recombinante. Los polipéptidos o proteínas están compuestos por aminoácidos linealmente dispuestos unidos mediante enlaces peptídicos, pero a diferencia de los péptidos, tienen una conformación bien definida. Las proteínas, en oposición a los péptidos, consisten por lo general en cadenas de 25 o más aminoácidos. Para los fines de la presente invención, el término "péptido" tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de aminoácidos constituida por una sola cadena de aminoácidos D o L o una mezcla de aminoácidos D y L unidos por enlaces peptídicos. De manera general, los péptidos contienen al menos dos restos de aminoácidos y tienen menos de aproximadamente 25 aminoácidos de longitud.

Se apreciará que las proteínas, polipéptidos, o péptidos contienen frecuentemente aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos habitualmente denominados como los 20 aminoácidos de origen natural (por ejemplo, aminoácidos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

sintéticos de origen no natural) y que muchos aminoácidos, incluidos los aminoácidos de los extremos, pueden estar modificados en un polipéptido dado, tanto según procesos naturales tales como glicosilación y otras modificaciones posteriores a la traducción, o según técnicas de modificación química que son bien conocidas en la materia. Las modificaciones conocidas que pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente invención incluyen, aunque no de forma limitativa, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un polinucleótido o derivado de polinucleótido, unión covalente de un lípido o de un derivado de lípido, unión covalente de un fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formulación, gamma-carboxilación, glicación, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por el ARN de transferencia desde aminoácidos hasta proteínas tales como arginilación, y ubiquitinación.

La incorporación de aminoácidos no naturales, incluidos aminoácidos sintéticos no naturales, aminoácidos sustituidos, o uno o más aminoácidos D en los péptidos HB y/o los péptidos o proteínas del principio activo (u otros componentes de la composición) es deseable en determinadas situaciones. Los péptidos que contienen aminoácidos D muestran una mayor estabilidad in vitro o in vivo en comparación con formas que contienen aminoácidos L. Por tanto, la construcción de péptidos que incorporan aminoácidos D puede ser especialmente útil cuando se desea, o se necesita, una mayor estabilidad in vivo o intracelular. Más específicamente, los péptidos D son resistentes a las peptidasas y proteasas endógenas, proporcionando de esta forma mejor administración oral transepitelial y transdérmica de fármacos y conjugados unidos, biodisponibilidad mejorada de los complejos permanentes en la membrana (véase más adelante para un análisis detallado) y duraciones intravasculares e intersticiales prolongadas cuando estas propiedades son deseables. El uso de péptidos con isómeros D también puede mejorar la administración transdérmica y transepitelial oral de los fármacos enlazados y otras moléculas de carga. Adicionalmente, los péptidos D no se procesas eficazmente en la mayoría de las presentaciones restringidas al complejo de histocompatibilidad mayor de clase II a linfocitos T auxiliares y, por tanto, es menos probable que induzcan respuestas inmunitarias humorales en el organismo completo. De esta forma, se pueden construir conjugados peptídicos usando, por ejemplo, formas de isómeros D de secuencias de péptidos que penetran en la célula, formas de isómeros L de sitios de escisión, y formas de isómeros D de péptidos terapéuticos. En algunas realizaciones, una proteína de fusión HB comprende restos de aminoácidos D y L, ya que el uso de los restos del aminoácido L de origen natural tiene la ventaja de que cualquier producto de descomposición debería ser relativamente no tóxico para la célula o el organismo.

En otra realización adicional, HB-X pueden ser péptidos retroinvertidos. Un "péptido retroinvertido" se refiere a un péptido con una inversión de la dirección del enlace peptídico en al menos una posición, es decir, una inversión del extremo amino y el extremo carboxi con respecto a la cadena lateral del aminoácido. Por tanto, un análogo retroinverso tiene una inversión de sus extremos, y una dirección invertida de los enlaces peptídicos aunque manteniendo aproximadamente la topología de las cadenas laterales análoga a la secuencia del péptido natural. El péptido retroinvertido puede contener aminoácidos L aminoácidos D, o una mezcla de aminoácidos L y aminoácidos D, incluso todos los aminoácidos pueden ser aminoácidos D. Los análogos de péptidos retroinvertidos son polipéptidos en que solo una parte de la secuencia está invertida y sustituida por restos de aminoácidos enantioméricos. Puesto que la parte retroinvertida de este tipo de análogos tienen extremos amino y carboxilo invertidos, los restos de aminoácidos que flanquean la parte retroinvertida están sustituidos por diaminometanos y malonatos geminales a-sustituidos de cadena secundaria, respectivamente. Se ha descubierto que las formas retroinvertidas de los péptidos que penetran en células funcionan igual de eficazmente que las formas naturales en lo que respecta a la translocación a través de una membrana. Las síntesis de análogos de péptidos retroinvertidos se describe en Bonelli, F. y col., Int J Pept Protein Res. 24(6):553-6 (1984); Verdini, A y Viscomi, G. C., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:697-701 (1985); y la patente de Estados Unidos n.° 6.261.569. Se han descrito procedimientos para síntesis en fase sólida de análogos de péptidos parcialmente retroinvertidos (EP 97994-B).

El término "variante" se refiere a un polipéptido o ácido nucleico que difiere del polipéptido o ácido nucleico de origen natural en una o más deleciones, adiciones, o modificaciones en la cadena lateral de aminoácidos o ácidos nucleicos, pero que retiene una o más funciones o actividades biológicas específicas de la molécula de origen natural. Las sustituciones de aminoácidos incluyen alteraciones en las que un aminoácido está sustituido por un resto de aminoácido de origen natural o no convencional diferente. Dichas sustituciones se pueden clasificar como "conservativas", en cuyo caso, un resto de aminoácido contenido en un polipéptido se sustituye por otro aminoácido de origen natural de carácter similar, tanto en lo que respecta a la polaridad, funcionalidad de la cadena secundaria, o tamaño. Las sustituciones abarcadas en las variantes descritas en el presente documento, también pueden ser "no conservativas", en las que un resto de aminoácido que está presente en un péptido está sustituido por un aminoácido que tiene diferentes propiedades (por ejemplo, la sustitución de un aminoácido hidrófobo o cargado por alanina) o, como alternativa, en el que un aminoácido de origen natural está sustituido por un aminoácido no convencional. También abarcado en el término "variante" cuando se usar en referencia a un polinucleótido o polipéptido, son variaciones en la estructura primaria, secundaria o terciaria, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente (por ejemplo, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de tipo natural).

Las variantes pueden incluir cambios conservativos o no conservativos en los aminoácidos, como se describe a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

continuación. Los cambios en los polinucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Las variantes también pueden incluir inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, incluidas inserciones y sustituciones de aminoácidos y otras moléculas) que normalmente no se producen en la secuencia peptídica que es la base de la variante, por ejemplo, pero sin limitarse a, la inserción de ortinita que no suele aparecer en las proteínas humanas. Las "sustituciones de aminoácidos conservativas" son el resultado de la sustitución de un aminoácido por otro que tienen propiedades estructurales y/o químicas similares. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, cada uno de los seis grupos siguientes contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: (1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); (2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); (3) Asparagina (N), Glutamina (Q); (4) Arginina (R), Lisina (K); (5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y (6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W). Véase, por ejemplo, Creighton, PROTEINS (W.H. Freeman & Co., 1984). La selección de aminoácidos conservativos puede realizarse dependiendo de la ubicación del aminoácido a sustituir en el péptido, por ejemplo, si el aminoácido está en el exterior del péptido y expuesto a disolventes, o en el interior y no expuesto a disolventes. En algunas realizaciones, los polipéptidos que incluyen sustituciones de aminoácidos no conservativas también están abarcados por el término "variantes". Tal como se usa en el presente documento, la expresión "sustitución no conservativa" se refiere a la sustitución de un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente que tiene diferentes propiedades químicas. Los ejemplos no limitantes de sustituciones no conservativas incluyen el ácido aspártico (D) sustituido por glicina (G); asparagina (N) sustituida por lisina (K); y alanina (A) sustituida por arginina (R). La selección de dichas sustituciones de aminoácidos conservativas y no conservativas está comprendidas en el nivel de conocimientos del experto en la materia.

El término "derivado" se refiere a proteínas o péptidos que se han modificado químicamente, por ejemplo, mediante ubiquitinación, etiquetado, pegilación (derivación con polietilenglicol) o adición de otras moléculas. Una molécula es también un "derivado" de otra molécula cuando contiene restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Dichos restos pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica, etc. de la molécula. Los restos pueden, como alternativa, disminuir la toxicidad de la molécula, o eliminar o atenuar un efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Los restos capaces de mediar dichos efectos se desvelan en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (21a ed., Tory, ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006).

El término "funcional" cuando se usa junto con "derivado" o "variante" se refiere a una molécula de proteína que posee una actividad biológica que es prácticamente similar a una actividad biológica de la entidad o molécula de la que es un derivado o variante. "Prácticamente similar" en este contexto significan que la actividad biológica de un polipéptido, es al menos un 50% tan activo como la referencia, por ejemplo, un polipéptido de tipo natural correspondiente, por ejemplo, al menos un 60% tan activo, un 70% tan activo, un 80% tan activo, un 90% tan activo, un 95% tan activo, l00% tan activo o incluso superior (es decir, la variante o derivado tiene una actividad más grande que el tipo natural), por ejemplo, un 110% tan activo, 120% tan actico, o más, inclusive.

La expresión "parte funcional" o "fragmento funcional" se refiere a una porción de la molécula natural (por ejemplo, la proteína natural o resto de unión al receptor de una entidad química) que media el mismo efecto que la molécula de longitud completa, por ejemplo, estimula una respuesta celular tal como el crecimiento o afecta a una señal o cascada de señalización relacionada con un efecto fisiológico deseado.

El término "fragmento de un péptido, polipéptido o molécula tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier subconjunto de polipéptido contiguo de la molécula. La expresión "fragmento de proteína", tal como se usa en el presente documento, incluye secuencias de aminoácidos tanto sintéticas como de origen natural que se pueden derivar de la secuencia de aminoácidos de origen natural, por ejemplo, un principio activo de origen natural que es una proteína, o HB (SEQ ID NO:1) o una variante de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3). Se dice que la proteína se puede "derivar de la secuencia de aminoácidos de origen natural" si se puede obtener mediante la fragmentación de la proteína de origen natural, o si se puede sintetizar basándose en un conocimiento de la secuencia de la secuencia de aminoácidos de origen natural o del material genético (ADN o ARN) que codifica esta secuencia. Por consiguiente, un "fragmento" de una molécula, implica denotar cualquier subconjunto de polipéptido de la molécula. Los fragmentos de HB que tienen la actividad de las variantes del péptido HB de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3 se desvelan en el presente documento, y que sean solubles también está abarcado para su uso en la presente invención.

Por ejemplo, los fragmentos funcionales de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3 útiles en los procedimientos que se desvelan en el presente documento tienen al menos un 30% de la actividad de un polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o SEQ NO: 3 in vivo. Dicho de otra forma, un fragmento de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3 es cualquier fragmento que, solo o fusionado con un principio activo, puede dar como resultado al menos un 30% de la misma actividad en comparación con la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3 para retener la proteína de fusión-HB en el tejido después de 24 horas tras el lavado como se desvela en el presente documento, cuando una proteína de fusión-HB que comprende la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3 se incuba con un explante de cartílago o explante de médula espinal (como se desvela en los Ejemplos). Un "fragmento" puede tener al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300 ácidos nucleicos o aminoácidos, comprendidos todos los números enteros del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

intervalo. Los fragmentos ilustrativos incluyen truncamientos en el extremo C, truncamientos en el extremo N, o truncamientos en ambos extremos C y N (por ejemplo, deleciones de, por ejemplo, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 8, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100 o más aminoácidos eliminados de los extremos N, los extremos C, o ambos). Un experto en la materia puede crear dichos fragmentos con un mero análisis de deleción. Dicho fragmento de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3 puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos o más de 10 aminoácidos, eliminados del extremo N y/o el extremo C de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3, respectivamente. En algunas realizaciones, mediante la deleción secuencial de los aminoácidos del extremo N o C de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3, y evaluar la función del fragmento peptídico resultante, solo o fusionado con un principio activo puede identificar un fragmento funcional de HB para su uso en la presente invención. Se pueden crear fragmentos funcionales con múltiples fragmentos más pequeños. Estos se pueden unir colocando enlazadores peptídicos. Los enlazadores se pueden seleccionar fácilmente para mantener la conformación natural. Un experto en la materia puede evaluar fácilmente evaluar la función de un conjugado HB-X para su retención en el tejido y causar un efecto biológico mediante el principio activo X (según se describe en los Ejemplos) en comparación con una proteína de fusión-HB que comprende la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. Usando un ensayo in vivo tal como el ensayo de cartílago que se desvela en los Ejemplos, si el fragmento peptídico HB tiene al menos un 30% de la actividad biológica del HB correspondiente a la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 como se desvela en el presente documento, entonces, el fragmento peptídico de HB de una proteínas de fusión HB(fragmento)-X se considera un HB-fragmento válido utilizado en las proteínas de fusión y los procedimientos que se desvelan en el presente documento. En algunas realizaciones, un fragmento de la sEq ID NO: 2 r SEQ ID NO:3 puede tener menos de 20, o menos de 15 o menos de 10, o menos de 5 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3. No obstante, como se ha indicado anteriormente, el fragmento debe tener al menos 4 aminoácidos, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 500 ácidos nucleicos o aminoácidos, comprendido cualquier número entero del intervalo.

El término "tipo natural" se refiere a la secuencia de polinucleótidos normal de origen natural que codifica una proteína, o parte de la misma, o secuencia de proteína, o parte de la misma, respectivamente, que existe de manera normal in vivo.

El término "mutante" se refiere a un organismo o célula con cualquier cambio en su material genético, en particular un cambio (es decir, deleción, sustitución, adición o alteración) con respecto a una secuencia de polinucleótidos de tipo natural o cualquier cambio relativo a una secuencia de proteínas de tipo natural. El término "variante" se pueden utilizar de forma indistinta con "mutante". Aunque frecuentemente se asume que un cambio en el material genético da como resultado un cambio en la función de la proteína, los términos "mutante" y "láser" se refieren a un cambio en la secuencia de una proteína de tipo natural independientemente de si este cambio altera la función de la proteína (por ejemplo, aumenta, disminuye, transmite una nueva función) o de si dicho cambio no tiene efectos sobre la función de la proteína (por ejemplo, la mutación o variación es silente).

La expresión "prácticamente similar," cuando se usa en referencia a una variante o proteína o péptido o a un derivado funcional del mismo, en comparación con la proteína original, significa que la secuencia sujeto particular varía de la secuencia del polipéptido en una o más sustituciones, deleciones o adiciones, pero retiene al menos un 50%, o más, por ejemplo, al menos el 60%, 70%, 80%, 90% o más, inclusive, de la función de la proteína. En la determinación de las secuencias polinucleotídicas, todas las secuencias polinucleotídicas sujeto que son capaces de codificar secuencias de aminoácidos prácticamente similares se consideran como prácticamente similares a una secuencia polinucleotídica de referencia, independientemente de las diferencias en la secuencia de codones. Una secuencia de nucleótidos es "prácticamente similar" a una secuencia de nucleótidos dada si: (a) el nucleótido del polinucleótido dado se hibrida con las regiones de codificación del polinucleótido natural, o (b) el polinucleótido dado es capaz de hibridarse con el polinucleótido natural en condiciones moderadamente rigurosas y su proteína codificada tiene una actividad biológica similar a la de la proteína natural; o (c) la secuencia de polinucleótidos está degenerada como resultado del código genético con respecto a las secuencias de nucleótidos definidas en (a) o (b). Las proteínas prácticamente similares tendrán una similitud superior a aproximadamente el 80% a la correspondiente secuencia de la proteína natural.

Los términos "homólogo" u "homólogos" se utilizan indistintamente y, cuando se utilizan para describir un polinucleótido o polipéptido, indican que dos polinucleótidos o polipéptidos, o las secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y se comparan de forma óptima, por ejemplo, usando BLAST, versión 2.2.14 con los parámetros predeterminados para una alineación son idénticos, con las inserciones o deleciones de nucleótidos o las inserciones o deleciones de aminoácidos adecuadas, de forma típica, en al menos un 70% de los nucleótidos para una elevada homología. Para un polipéptido, debería haber al menos un 30% de identidad de aminoácidos en el polipéptido, o al menos un 50% para un homología superior. El término "homólogo" u "homólogos" tal como se usa en el presente documento, también se refiere a la homología con respecto a la estructura. La determinación de homólogos de genes o polipéptidos puede realizarla el experto en la materia con facilidad. Cuando está en el contexto con un porcentaje definido, la homología de porcentaje definido significa al menos el porcentaje de similitud entre aminoácidos. Por ejemplo, un 85% de homología se refiere a al menos un 85% de similitud entre aminoácidos.

Para la comparación de la secuencia, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, en caso necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula a continuación el porcentaje de identidad de secuencia para la una o varias secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados. En los casos donde sea necesario o se desee, ee puede llevar a cabo la alineación óptima de las secuencias para comparación, usando una variedad de enfoques, que son bien conocidos en la técnica.

El término "heterólogo", en referencia a secuencias de ácidos nucleicos, proteínas o polipéptidos, significa que estas moléculas no se encuentran de forma natural en dicha célula. Por ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de fusión descrita en el presente documento, que se inserta en una célula, por ejemplo, en el contexto de un vector de expresión de proteína, es una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga.

El término "agente" o "compuesto" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una entidad química o producto biológico, o combinación de entidades químicas o productos biológicos, administrado a un sujeto para tratar o prevenir o controlar una enfermedad o dolencia. La entidad química o producto biológico es, preferentemente, pero no es necesariamente una molecular de bajo peso molecular, sino que también puede ser un compuesto más grande, o cualquier molécula orgánica o inorgánica, incluyendo ácidos nucleicos modificados y no modificados tales como ácidos nucleicos de sentido contrario, ARNi, tales como sARNip o ARNsh, péptidos, peptidomiméticos, receptores, ligandos y anticuerpos, aptámeros, polipéptidos, análogos de ácido nucleico, o variante de los mismos. Por ejemplo, un agente puede ser un oligómero de ácidos nucleicos, aminoácidos, o carbohidratos incluyendo, aunque no de forma limitativa, proteínas, péptidos, oligonucleótidos, ribozimas, ADNzimas, glucoproteínas, Agentes ARNi (por ejemplo, ARNip), lipoproteínas, aptámeros, y modificaciones y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un principio activo es un ácido nucleico, por ejemplo, ARNim o un derivado o variante del mismo. En algunas realizaciones, un conjugado HB-X que comprende un agente de ácido nucleico, por ejemplo, un agente de ARNi o ARNim se puede unir (por ejemplo, conjugar) a un péptido HB mediante un resto enlazador que permite que el agente ARNim o ARNi interactúe con el ADN. En algunas realizaciones, el resto enlazador es un resto reversible, por ejemplo, un agente de ARNi o ARNim se puede liberar desde el péptido HB en la ubicación de la célula o tejido diana.

Tal como se usa en el presente documento, el término "fusionado" significa que al menos una proteína o péptido que está físicamente asociado con una segunda proteína o péptido. En algunas realizaciones, la fusión es típicamente un enlace covalente, sin embargo, otros tipos de enlaces abarcados en el término "condensado" incluyen, por ejemplo, la unión mediante interacción electrostática, o una interacción hidrófoba, y similares. El enlace covalente puede abarcar enlaces como proteína de fusión o enlace químicamente acoplado, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro formado entre dos restos de cisteína.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" significa una proteína creada uniendo dos o más secuencias de polipéptidos entre sí. Los polipéptidos de fusión abarcados en la presente invención incluyen productos de traducción de una construcción de gen quimérico que une las secuencias de ADN que codifican el péptido HB o mutantes del mismo, codificando la secuencia de ADN un segundo polipéptido para formar un único marco de lectura abierto. En otras palabras, un "polipéptido de fusión" o una "proteína de fusión" es una proteína recombinante de dos o más proteínas que están unidas mediante un enlace peptídico o varios enlaces peptídicos. La proteína de fusión también puede comprender un enlazador peptídico entre el péptido HB y el principio activo, por ejemplo, un péptido o polipéptido terapéutico de la proteína de fusión.

En algunas realizaciones, las proteínas de fusión se pueden producir, por ejemplo, mediante una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína se une al ácido nucleico que codifica otra proteína de forma que constituyen un único marco de lectura abierto que puede traducirse en las células a un único polipéptido que contiene todas las proteínas previstas. El orden de disposición de las proteínas puede variar. Como ejemplo no limitante, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el péptido HB está fusionado en marco a un extremo, el extremo tanto 5'como 3', de un gen que codifica un primer ligando (por ejemplo, X), tal como una proteína o un péptido terapéutico. De esta manera, sobre la expresión del gen, el péptido HB se expresa funcionalmente y se fusiona con el extremo N o el extremo C de X (por ejemplo, el péptido o proteína terapéuticos). En determinadas realizaciones, la modificación de la sonda polipeptídica es tal que la funcionalidad del péptido HB sigue quedando prácticamente inalterada en términos de su actividad biológica mediante su fusión con el primer ligando X, tal como el péptido terapéutico. En algunas realizaciones, una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión HB-X tiene también una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un enlazador, que está situado entre ácido nucleico que codifica el péptido HB y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica X (por ejemplo, el péptido o proteína terapéuticos). En algunas realizaciones, la proteína de fusión hB-X se configura de tal forma que la funcionalidad del péptido HB o de X (por ejemplo, la proteína o péptido terapéuticos) no se ve significativamente alterada negativamente por la fusión.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "asociado con" significa que una entidad está en asociación o contacto físico con otra. Por tanto, un péptido HB "asociado" con un principio activo puede unir tanto de forma covalente como de forma no covalente el péptido HB con el principio activo. La asociación puede estar mediada por un resto enlazador, especialmente cuando la asociación es covalente. El término "asociación" o "interacción" o

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

"asociado con" se utilizan indistintamente en el presente documento, en referencia a la asociación o interacción de un péptido HB con el principio activo, tanto mediante una unión indirecta como con una unión directa.

Tal como se usa en el presente documento, el término "conjugado" o "conjugación" o "unido" tal como se usa en el presente documento, se refiere a la unión de dos o más restos para formar una entidad. Un conjugado abarca tanto un conjugado de péptido-molécula pequeña como los conjugados de péptido-proteína/péptido. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención proporcionan la conjugación de un péptido HB unido con otra entidad, por ejemplo un principio activo, por ejemplo, un resto tal como una proteína/péptido terapéutico o molécula pequeña. Tal como se describe en el presente documento, la unión puede ser mediante enlazadores, modificación química, enlazadores peptídicos, enlazadores químicos, enlaces covalentes o no covalentes, o proteínas de fusión o mediante cualquier otro medio conocidos para un experto en la materia. La unión puede ser permanentes o reversible. En algunas realizaciones, algunas moléculas enlazadoras (enlazadores químicos o peptídicos) pueden incluirse para aprovechar las propiedades deseadas de cada enlazador y de cada proteína o molécula del conjugado. Los enlazadores flexibles y los enlazadores que aumentan la solubilidad de los conjugados se contemplan para su uso en solitario o con otros enlazadores que se describe en el presente documento. Los enlazadores peptídicos se pueden unir mediante la expresión del ADN que codifica el enlazador a una o más de las proteínas del conjugado. Los enlazadores se pueden escindir con ácido, fotoescindirse y se enlazadores termolábiles. Las personas expertas en la materia conocen bien los procedimientos de conjugación, y están abarcados para su uso en la presente invención.

Como alternativa, dos o más entidades que se unen pueden estar unidas mediante enlace indirecto. Un enlace indirecto incluye una asociación entre un péptido HB y un principio activo, en el que el péptido HB y el principio activo están unidos mediante un "resto enlazador", por ejemplo, no están unidos directamente. Un enlace directo incluye cualquier enlace en el que no se requiera un resto enlazador. En una realización, un enlace directo incluye una interacción química o física en la que los dos restos, es decir, el resto de direccionamiento y el resto de unión, interactúan de forma que quedan atraídos entre sí. Los ejemplos de interacciones directas incluyen las interacciones covalentes, interacciones no covalentes, hidrófobas/hidrófilas, iónicas (por ejemplo, electrostáticas, atracción culómbica, ion-dipolo, transferencia de carga), Van der Waals, o enlace de hidrógeno, y enlace químico, incluida la formación de un enlace covalente. Por consiguiente, en una realización, un resto de direccionamiento, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo y el ligando no están unidos mediante un enlazador, por ejemplo, están unidos directamente. En una realización adicional, un resto de direccionamiento y el ligando están electrostáticamente asociados entre sí.

El término "conjugado" se refiere a la unión de al menos dos entidades unidas entre sí. La unión de las dos entidades puede ser directa (por ejemplo, mediante enlaces covalentes o no covalentes) o indirecta (por ejemplo, mediante enlazadores etc.)

El término "enlazador" se refiere a cualquier medio, entidad o resto usado para unir dos o más entidades. Por ejemplo, un péptido HB como se desvela en el presente documento, se puede unir a un principio activo X (por ejemplo, una proteína terapéutica o péptido) usando un resto enlazador. Un enlazador puede ser un enlazador covalente o un enlazador no covalente. Los ejemplos de enlazadores covalentes incluyen enlaces covalentes o un resto covalente unido a uno o más de las proteínas a enlazar. El enlazador también puede ser un enlace no covalente, por ejemplo un enlace organometálico a través de un centro metálico tal como un átomo de platino. Para enlaces covalentes, se pueden usar varias funcionalidades, tales como grupos amida, incluidos derivados de ácido carbónico, éteres, ésteres, incluidos ésteres orgánicos e inorgánicos, amino, uretano, urea y similares. Para proporcionar el enlace, la molécula efectora y/o la sonda se pueden modificar mediante oxidación, hidroxilación, sustitución, reducción etc. para proporcionar un sitio para acoplamiento. Los enlazadores se pueden escindir con ácido, fotoescindirse y se enlazadores termolábiles. Las personas expertas en la materia conocen bien los procedimientos de conjugación, y están abarcados para su uso en la presente invención. En algunas realizaciones, un resto enlazador para unir un péptido HB a un ácido nucleico es un enlazador cruzado de ciclo-propapirroloindol. Los restos enlazadores incluyen, aunque no de forma limitativa, restos enlazadores químicos, o por ejemplo, un resto enlazador peptídico. En algunas realizaciones, un enlazador entre un péptido hB y un principio activo o un enlazador peptídico se puede formar haciendo reaccionar el polímero y un enlazador seleccionado, por ejemplo, del grupo que consiste en cloroformiato de p-nitrofenilo, carbonildiimidazol (CDI), carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC), anhídrido cis-aconítico, y mezclas de estos compuestos. Se apreciará que la modificación que no disminuya significativamente la función del péptido HB que se desvela en el presente documento o del principio activo (por ejemplo, proteína o péptido terapéuticos) sea preferida.

Un aspecto de la presente invención proporciona una composición en la que el enlazador es un péptido que comprende la secuencia GGG o GGGGS.

El término "recombinante", cuando se usa para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, vírico, semisintético y/o sintético, que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con todo o una parte de las secuencias de polinucleótidos con las que están asociados en la naturaleza. El término recombinante, como se usa con respecto a un péptido, polipéptido, proteína o proteína de fusión recombinante, significa un polipéptido producido mediante la expresión procedente de un polinucleótido recombinante. El término recombinante tal como se usa en el presente documento con respecto a una célula hospedadora significa una célula hospedadora en la que se ha introducido un polinucleótido recombinante. En el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

presente documento, recombinante también se utiliza para referirse a, con referencia a un material (por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, una proteína, o un vector) que el material se ha modificado mediante la introducción de un material heterólogo (por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector).

El término "vectores" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar o mediar la expresión de un ácido nucleico heterólogo al que se ha unido en una célula hospedadora; un plásmido es una especie del género englobada por el término "vector." El término "vector" se refiere, de forma típica, a una secuencia de ácidos nucleicos que contiene un origen de replicación y otras entidades necesarias para la replicación y/o mantenimiento en una célula hospedadora. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes y/o secuencias de ácidos nucleicos, a las que están operativamente unidas se denominan, en el presente documento, como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad están frecuentemente en la forma de "plásmidos" que hacen referencia a moléculas de ADN bicatenario que, en su forma de vector no están unidos al cromosoma y que comprenden de forma típica entidades para la expresión estable o transitoria o el ADN codificado. Otros vectores de expresión que se pueden usar en los procedimientos que se desvelan en el presente documento incluyen, pero no se limitan a plásmidos, episomas, cromosomas artificiales de bacterias, cromosomas artificiales de levaduras, bacteriófagos o vectores víricos, y dichos vectores se pueden integrar en el genoma del hospedador o replicarse de forma autónoma en la célula concreta. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. También se pueden usar otras formas de vectores de expresión conocidos para los expertos en la materia que sirven a funciones equivalentes, por ejemplo, vectores extracromosómicos autorreplicantes o vectores que se integran en el genoma de un hospedador. Los vectores preferidos son los capaces de replicación autónoma y/o expresión de los ácidos nucleicos a los que están unidos.

Los términos "sujeto" e "individuo" se usan de forma indistinta en el presente documento, y se refieren a un animal, por ejemplo un ser humano, al cual un tratamiento, incluido un tratamiento profiláctico, con la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, se proporciona. El término "sujeto", tal como se usa en el presente documento, se refiere a animales no humanos. Las expresiones "animales no humanos" y "mamíferos no humanos", se utilizan indistintamente en el presente documento, e incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos, tales como primates no humanos, (especialmente los primates superiores), oveja, perro, roedor (por ejemplo ratón o rata), cobaya, cabra, cerdo, gato, conejos, vacas, y no mamíferos tales como pollos, anfibios, reptiles etc. En una realización, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es una animal experimental o un animal sustituto como un modelo de enfermedad. El término no denota una edad o sexo concreto. Por tanto, se pretenden que queden cubiertos sujetos tanto adultos como recién nacidos, tanto varones como hembras. Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, vacas, cabras y ratones. Se pretende además que el término sujeto incluya especies transgénicas.

Se pretende que el término "tejido" incluya células intactas, sangre, preparaciones de sangre tales como plasma y suero, huesos, articulaciones, cartílago, tejido neuronal (cerebro, médula espinal, y neuronas), músculos, musculatura lisa y órganos.

Los términos "enfermedad" o "trastorno" se utilizan indistintamente en el presente documento, se refieren a una alternancia en el estado de un organismo o en cualquiera de los órganos, que interrumpe o perturba la realización de las funciones y/o que causa síntomas tales como incomodidad, disfunción, distrés, o incluso la muerte a la persona atacada o aquellas en contacto con una persona. Una enfermedad o trastorno también puede estar relacionado con un moquillo, decadencia, padecimiento, patología, trastorno, mal, afección, lamento, indisposición, afección.

La expresión "dolencia relacionada con el cartílago" o "dolencia clínica relacionada con el cartílago" se refiere a cualquier defecto en el cartílago articular. El término abarca, aunque no de forma limitativa, una ruptura o desprendimiento del cartílago, un defecto en el menisco que incluye un desgarro parcial o completo, daño o lesión que afecta el menisco y/o rótula, artrosis (citada en el presente documento como "OA"), incluida la artrosis de rodilla, dedo, muñeca, cadera, tobillos, codo, dedos del pie, hombro y dorsal, ruptura o desprendimiento traumático del cartílago, espondilitis anquilosante, capsulitis, artritis psoriática, artritis reumatoide (AR), lupus sistémico eritematoso, artritis idiopática juvenil, condropatía, condrosarcoma, condromalacia, policondritis, policondritis con recaída, epífisiolisis, osteocondritis disecante, condrodisplasia, costocondritis, raquitismo hipofosfatémico vinculado a X, osteocondroma, condrosarcoma (maligno), susceptibilidad a artrosis (tipos 1-6), espondilosis, osteocondrosis, condrosarcoma primario, condrodisplasia, síndrome de Tietze, distrofia dermocondrocorneal de Francois, displasia de la epífisis, múltiple, (tipos 1-5), cartílagos auricular osificado con deficiencia mental, degeneración progresiva del músculo y carga ósea, osteocondromatosis carpotarsal, acondroplasia, condrocalcinosis (tipos 1-2), genocondromatosis, condrodisplasia (trastorno del desarrollo sexual), condroma, Acondrogénesis (tipos 1A, 1B, 2, 3, 4, tipo Langer-Saldino), tipo II Acondrogénesis-hipocondrogénesis, Atelosteogénesis, (tipo 1, 2 y III), Piknoacondrogénesis, pseudoacondroplasia, artrosis de los dedos, familia, displasia sitrófica, discondrosteosis - nefritis, cartílagos de coloboma de ala nasal con telecantos, hipoplasia del cartílago del ala --coloboma -telecanto, síndrome de Pierre Robin --condrodisplasia fetal, dispondiloencondromatosis, acondroplasia regional --displasia del músculo abdominal, osteocondritis disecante, condrocalcinosis articular familiar, traceobroncomalacia, condritis, discondrosteosis, síndrome de Maffucci, displasia de Jequier-Kozlowski esquelética, condrodistrofia, osteoartropatía craneal, síndrome de Tietze, displasia de cadera --encondromata -eccondromata, enfermedad de Bessel-Hagen, condromatosis (benigna), encondromatosis (benigna), condrocalcinosis debida a la deposición de cristales de apatito, síndrome de Meyenburg-Altherr-Uehlinger, encondromatosis-enanismo-hipoacusia, síndrome de Astley-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Kendall, osteocondromatosis sinovial, condrocalcinosis familiar articular, acondroplasia grave con retraso en el desarrollo y acantosis nigricans, condrocalcinosis, síndrome de Keutel, síndrome de Stanescu, fibrocondrogénesis, hipocondroplasia,

Una "composición" o "composición farmacéutica" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una composición que normalmente contienen un excipiente, tal como un transportador farmacéuticamente aceptable que es habitual en la técnica y que es adecuado para su administración a un conjugado HB-X para un tejido o un sujeto. De forma adicional, las composiciones para administración tópica (por ejemplo, mucosa oral, mucosa respiratoria) y/o para administración oral pueden formar soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación continua, enjuagues orales, o polvos, como es sabido en la materia y como se describe en el presente documento. Las composiciones también pueden incluir estabilizantes y conservantes. Para ejemplos de transportadores, estabilizantes y adyuvantes, University of the Sciences in Philadelphia (2005) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons, 21a Ed.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "que trata", y "tratamiento" se refieren a la reducción o disminución mensurable de uno o más síntomas o marcadores mensurables de una enfermedad o trastorno; aunque no se pretende limitarse a estos, las enfermedades o trastornos de especial interés incluyen enfermedades autoinmunitarias y miositis. La disminución mensurable incluye cualquier reducción estadísticamente significativa en un marcador o síntoma mensurable. En algunas realizaciones, el tratamiento es un tratamiento profiláctico.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado, por ejemplo, una disminución o prevención de los efectos asociados con varias patologías o dolencias, tal como una reducción en un síntoma de una enfermedad autoinmunitaria en el sujeto. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un conjugado HB-X tal como se desvela en el presente documento, para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un mamífero, preferentemente un ser humano. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado HB-X puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, edad, sexo, y peso del sujeto, y la capacidad del compuesto terapéutico X para desencadenar una respuesta deseada en el sujeto. Una cantidad terapéuticamente eficaz es aquella en la que los efectos tóxicos o perjudiciales del agente terapéutico se compensan con los efectos terapéuticos beneficiosos. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz es una "cantidad eficaz", que tal como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de agente terapéutico de la composición farmacéutica para aliviar al menos uno o algunos de los síntomas de la enfermedad o trastorno. Una "cantidad eficaz" para los fines del presente documento está determinada, por tanto, por consideraciones tales que son conocidos en la técnica y es la cantidad para conseguir una mejora que incluye, pero sin limitaciones, una mejora en la tasa de supervivencia o una recuperación más rápida, o una mejora o eliminación de al menos un síntoma y otro indicador de la enfermedad que se está tratando que sean medidas adecuadas para el experto en la materia. Se debe tener en cuenta que la proteína de fusión HB-X tal como se desvela en el presente documento se puede administrar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable y que se puede administrar sola o como un principio activo combinado con transportadores, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables.

La expresión "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un conjugado HB-X que es eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Normalmente, puesto que una dosis profiláctica de conjugado HB-X se administra al sujeto antes de, o en un estado anterior de la enfermedad y, en algunas realizaciones, una cantidad profilácticamente eficaz es menor que la cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad profilácticamente eficaz de un conjugado HB-X es también aquella en que cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales del compuestos se compensan con los efectos terapéuticos beneficiosos.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "prevenir", "que previene" y "prevención" se refieren a la evitación o retraso en la manifestación de uno o más síntomas o marcadores mensurables de una enfermedad o trastorno, por ejemplo, de una enfermedad autoinmunitaria. Un retraso en la manifestación de un síntoma o marcador es un retraso relativo al momento en el que dicho síntoma o marcador se manifiesta en un sujeto de control o no tratado con una posibilidad o susceptibilidad equivalente a desarrollar la enfermedad o el trastorno. Los términos "prevenir", "que previene" y "prevención" incluyen no solamente la evitación o prevención de un síntoma o un marcador de la enfermedad, sino también una severidad o grado reducido en uno cualquiera de los síntomas o marcadores de la enfermedad, con respecto a los síntomas o marcadores en un individuo de control o no tratado con una posibilidad o susceptibilidad equivalente a desarrollar la enfermedad o el trastorno, o con respecto a síntomas o marcadores que puedan aparecer según los antecedentes o mediciones estadísticas de las poblaciones afectadas por la enfermedad o trastorno. Por "severidad reducida" se entiende al menos un 10% de reducción en la severidad o grado de un síntoma o marcador de la enfermedad mensurable, con respecto al control o la referencia, por ejemplo, al menos el 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o incluso 100% (es decir, sin síntomas o marcadores mensurables).

Tal como se usa en el presente documento, los términos "que administra", y "que introduce" se utilizan indistintamente en el presente documento, y se refieren a la colocación del conjugado HB-X de la presente invención en un sujeto por un procedimiento o vía que da como resultado la localización al menos parcial del conjugado HB-X

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

en un sitio deseado. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar mediante cualquier vía adecuada que dé como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto.

Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral” tal como se usan en el presente documento significan modos de administración diferentes a la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal, e intrasternal. Las expresiones “administración sistémica”, "administrado de forma sistémica", "administración periférica" y "administrado de forma periférica" tal como se usa en el presente documento, significa la administración de HB-X de forma que penetre en el sistema del animal y, por tanto, esté sometido al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se utiliza en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, según el criterio médico establecido, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

La expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" tal como se usa en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un líquido o una carga sólida, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante, implicado en el arrastre o transporte de los agentes sujeto desde un órgano, o parte del cuerpo, hasta otro órgano o parte del cuerpo. Cada transportador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con el resto de ingredientes de la formulación.

El término "reducido" o "reduce" o "disminuye" tal como se usa en el presente documento significa de manera general una disminución en una cantidad estadísticamente significativa con respecto a una referencia. Para evitar dudas, "reducido" significa una disminución estadísticamente significativa de al menos un 10% en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo una disminución en al menos un 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, al menos 90% o más, hasta e incluyendo un 100% de disminución(es decir, nivel ausente en comparación con una muestra de referencia), o cualquier disminución entre 10-100% en comparación con un nivel de referencia, como se define este término en el presente documento.

Los términos "aumentado" o "aumento" tal como se usa en el presente documento significan se manera general un aumento en una cantidad estadísticamente significativa; tal como un aumento estadísticamente significativo de al menos un 10% en comparación con un nivel de referencia, incluido un aumento de al menos un 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos 100% o más, inclusive, incluido, por ejemplo, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces de aumento o más en comparación con un nivel de referencia, como se define este término en el presente documento.

El término "alto" tal como se usa en el presente documento, significa de manera general más alto en una cantidad estadísticamente significativa con respecto a una referencia; tal como un valor estadísticamente significativo al menos un 10% superior al de un nivel de referencia, por ejemplo al menos un 20% superior, al menos un 30% superior, al menos un 40% superior, al menos un 50% superior, al menos un 60% superior, al menos un 70% superior, al menos un 80% superior, al menos un 90% superior, al menos un 100% superior, inclusive, tal como al menos 2 veces superior, al menos 3 veces superior, al menos 4 veces superior, al menos 5 veces superior, al menos 10 veces superior o más, en comparación con un nivel de referencia.

El término "sujeto" tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal en el que es útil modular una respuesta en un tejido al que se dirige el resto HB de la composición. El sujeto puede ser un animal salvaje, doméstico, comercial o de compañía tal como un ave o un mamífero. El sujeto puede ser un ser humano. Aunque, en una realización de la invención, se contempla que las composiciones terapéuticas que se desvelan el presente documento, también son adecuadas para el tratamiento terapéutico de seres humanos, es también aplicable a vertebrados de sangre caliente, por ejemplo, mamíferos, tales como primates no humanos, (especialmente los primates superiores), oveja, perro, roedores (por ejemplo, ratón o rata), cobaya, cabra, cerdo, gato, conejos, vacas, y no mamíferos tales como pollos, patos o pavos. En algunas realizaciones, el sujeto es una animal experimental o un animal sustituto como un modelo de enfermedad.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a compuestos y composiciones que se pueden administrar a mamíferos sin excesiva toxicidad. La expresión "transportadores farmacéuticamente aceptables" excluye medios de cultivo de tejidos. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, y similares, y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Los transportadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Algunos transportadores farmacéuticamente aceptables se pueden utilizar para proporcionar la liberación sostenida de las composiciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, el ácido hialurónico y las formas de gel de ácido hialurónico se utilizan en inyecciones intraarticulares, y se pueden utilizar para proporcionar liberación continua de las composiciones de HB-X.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento" y "para tratar" se utilizan para indicar la producción de resultados beneficiosos o deseados, tales como para aliviar los síntomas, o eliminar la causa de una enfermedad o trastorno ya sea de manera temporal o permanente, ralentizar la aparición de síntomas y/o la evolución del trastorno, o prevenir la evolución de la enfermedad. Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto a un tratamiento terapéutico y profiláctico como a medidas preventivas. Los beneficios o resultados clínicos deseados incluyen, aunque no de forma limitativa, alivio de síntomas, disminución de la extensión del autismo, estado estabilizado (es decir, que no empeora) de la patología implicada, retraso o ralentización en la evolución de la enfermedad, mejora o alivio de la patología. Se administra un "régimen eficaz" durante un ciclo eficaz (un tratamiento suficiente o una cantidad durante un periodo de tiempo suficiente) para conseguir un nivel de los resultados deseados. El seguimiento de la eficacia se puede realizar por procedimientos conocidos en la técnica para la enfermedad o sus síntomas particulares.

Conjugados HB-X

Un aspecto ilustrativo de la presente divulgación tal como se desvela en el presente documento comprende una composición terapéutica que comprende, por ejemplo, (HB-enlazador)n-Xm-(enlazador-HB)o, donde HB es una proteína de unión a heparina, X es un principio activo tal como una proteína terapéutica o una parte de la misma, o un molécula pequeña terapéutica, y donde n, m, y o son números enteros, y m es al menos uno y n+o es al menos uno.

Un aspecto particular de la presente invención tal como se desvela en el presente documento proporciona una composición terapéutica selectiva que comprende, por ejemplo, (HB-enlazador)n-Xm-(enlazador-HB)ü, donde HB es una proteína de unión a heparina seleccionada entre KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:2), MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:21), KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:3); o MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:22), X es un principio activo seleccionada entre factor de crecimiento de los nervios (NGF); factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF); factor neurotrófico de dopamina conservado (CDNF); ligandos de la familia del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial; factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF); neurturina (NRTN); artemina (ARTN); persefina (PSPN); citoquinas neuropoyéticas seleccionadas de interleuquina-6; interleuquina-11; interleuquina-27; factor inhibidor de leucemia; factor neurotrófico ciliar; cardiotrofina 1; neuropoyetina; citoquina de tipo cardiotropina; factor de crecimiento de fibroblastos 2; citoquinas antiinflamatorias seleccionadas entre interleuquina-4 e interleuquina-10 del receptor 2 de TNF; neurregulina-1 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); Cerebrolysin® (FPF-1070); factor de diferenciación del crecimiento 11 (GDF11); factor derivado de células del estroma 1 (SDF-1); miostatina (factor de diferenciación del crecimiento de fibroblastos 8 (GDF8)); factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF1); hormona paratiroidea (HPT); una parte de la PTH, seleccionada entre los restos de aminoácidos 1-31, 1-34 (TM Forteo ®), 1-37, 1-38, 1-44, o 1-84 de la PTH madura; péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) o un análogo de la PTHrP que tiene la secuencia (AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA, donde N es Aib (ácido 2-aminoisobutírico) (SEQ ID NO: 39), antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-IRA); quimeras IL-1/IL- 1 RA; IL-1RA maduro que tiene la secuencia de

aminoácidos:RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGI HGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTA MEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO: 40), factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF-18); proteína del grupo 2 de alta movilidad (HMG-2); un anticuerpo terapéutico seleccionado entre Remicade® (infliximab, anti-TNF-a), Humira® (adalimumab, anti-TNF), ENBREL® (etanercept, proteína recombinante anti-TNF); un anticuerpo dirigido contra el factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF-9); factor de crecimiento de hepatocitos; proteínas de la superfamilia de TGF-beta seleccionadas entre TGF, TGF3, BMP2, o BMP7; análogo de angiopoyetina 3 (ANGPTL3); un agente antiinflamatorio esteroideo seleccionado del grupo que consiste en 21-acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, acetónido de fluocinolona, fluocinonida, fluocortin butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, mometasona furoato, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 25-dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato de prednisolona sodio, prednisona, prednival, prednidileno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona, y hexacetónido de triamcinolona; somatostatina (SST) o un análogo de la misma seleccionado entre las moléculas pequeñas (nombre comercial SANDOSTATIN®), pasireotida (SOM230, nombre comercial SIGNIFOR®), lanreotida (nombre comercial: SOMATULINE®); un principio activo de molécula pequeña seleccionado entre TR2-01829 o pRo 1, 2-hidroxi-N-[3- (trifluorometil)fenil]benzamida (HS-Cf) o kartogenina y donde n, m, y o son números enteros, y m es al menos uno y n+o es al menos uno.

En algunas realizaciones, un conjugado HB-X es HB-Xn, o (HB-enlazador)n-Xn, y donde n es un n es un número entero de al menos 1. El HB se puede unir al extremo N o C, o tanto el extremo N como el extremo C, del principio activo X. En algunas realizaciones, un conjugado HB-X es una proteína de fusión recombinante que comprende un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

HB recombinante y la proteína terapéutica. En algunas realizaciones, un conjugado HB-X comprende un péptido HB como se describe en el presente documento y una molécula pequeña. En ambos casos, el péptido HB puede estar unido (por ejemplo, conjugado) con un principio activo con o sin un enlazador.

En algunas realizaciones, los componentes de un conjugado HB-X se pueden colocar en orden, con respecto al extremo N de la parte HB de la composición: HB-X, X-HB, HB-enlazador-X, (HB-enlazador)n-X, X-(enlazador-HB)n, HBn-X-HBn, (HB-enlazador)n-Xm-(enlazador-HB)n, HBn-Xm-HBn-Xm, etc.

En algunas realizaciones de la divulgación, un conjugado HB-X puede comprender al menos 1, o al menos 2, o al menos 3, o al menos aproximadamente 4, o al menos aproximadamente 6, o al menos aproximadamente 7, o al menos aproximadamente 8, o al menos aproximadamente 9, o al menos aproximadamente 10, o más de 10 péptidos HB de la SEQ ID NO: 1-3 o 20-22. Un conjugado HB-X con más de un péptido HB puede tener todos los péptidos HB del mismo tipo (por ejemplo, todos los péptidos HB comprenden la SEQ ID NO: 2) o pueden comprender cualquier combinación de diferentes péptidos de la SEQ ID N: 1-3, o 20-22. En algunas realizaciones, un conjugado HB-X puede comprender al menos un enlazador asociado con un péptido HB, por ejemplo, cada HB presente en un conjugado HB-X puede estar asociado a un enlazador. Como alternativa, en algunas realizaciones, cuando un conjugado HB-X comprende más de un péptido HB, no todos los péptidos HB de un conjugado HB-X tienen que estar asociados a un enlazador. Los péptidos HB pueden estar intercalados aleatoriamente o no aleatoriamente entre una secuencia de principios activos en un conjugado HB-X, por ejemplo, como ejemplo ilustrativo, HB-X-X-X- HB-X-X-X-HB, o X-X-HB-X-HB-X-HB-X-X-X-HB-etc. Dicha intercalación aleatoria o no aleatoria de péptidos HB entre X entidades activas puede producirse con o sin enlazadores, tal como se desvela en el presente documento.

Adicionalmente, la composición puede comprender una mezcla de construcciones HB-X, en la que X representa diferentes proteínas o moléculas pequeñas (es decir, una composición que comprende HB-X1 y HB-X2, etc.).

En algunas realizaciones, un conjugado HB-X puede comprender al menos 1, o al menos 2, o al menos 3, o al menos aproximadamente 4, o al menos aproximadamente 6, o al menos aproximadamente 7, o al menos aproximadamente 8, o al menos aproximadamente 9, o al menos aproximadamente 10, o más de 10 principios activos (X). Los principios activos pueden ser una proteína o péptido terapéutico tal como se desvela en el presente documento, o una molécula pequeña.

Proteínas de unión a heparina (HB)

La presente invención se ilustra por motivos de unión a heparina proteínicos (HB) que están unidos o fusionados con un resto terapéutico o principio activo, tal como una molécula pequeña, o una citoquina, o factor de crecimiento, o parte funcional del mismo. En algunas realizaciones de la divulgación, el péptido HB se puede seleccionar entre péptidos que tienen las secuencias de restos de aminoácidos: KRKKKgKgLGKKRDPcLrKYK (SEQ ID NO:1); KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:2) (C16R); o KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:3) (C16K). En algunas realizaciones, el péptido HB se puede seleccionar entre péptidos que tienen las secuencias de restos de aminoácidos: MKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK (SEQ ID NO:20); MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:21) (C17R); o MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:22) (C17K).

La presente invención se refiere a motivos de unión a heparina proteínicos (HB) que están unidos o fusionados con un resto terapéutico o principio activo, tal como una molécula pequeña, o una citoquina, o factor de crecimiento, o parte funcional del mismo. En algunas realizaciones, el péptido hB se puede seleccionar entre péptidos que tienen los restos de aminoácidos KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:2) (C16R); o

KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:3) (C16K). En algunas realizaciones, el péptido HB se puede seleccionar entre péptidos que tienen las secuencias de restos de aminoácidos: MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:21) (C17R); o MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:22) (C17K).

En algunas realizaciones de la divulgación, una parte HB de la composición está cargada positivamente a través de numerosos restos lisina y arginina; y se une a proteoglicanos celulares o tisulares que están cargados negativamente mediante grupos sulfato. En realizaciones particulares de la invención, un HB está mutado para potenciar la carga positiva, sustituyendo el restos de cisteína natural que se encuentra en la posición 16 del HB que tienen los restos de la SEQ ID NO:1 por una arginina (SEQ ID NO:2) (C16R) o lisina (SEQ ID NO:3) (C16K). El HB se puede repetir con o sin la inclusión de un péptido enlazador. Los ejemplos de construcciones de péptidos HB en tándem con enlazadores se puede representar como HB-enlazador-HB-X, en la que HB-enlazador-HB comprende la variante de HB de la SEQ ID NO: 2 y tiene los aminoácidos:

KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:4); o HB-enlazador-HB- enlazador-HB-X, en la que HB-enlazador-HB-enlazador-HB tiene los restos:

KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:5). En algunas realizaciones, las construcciones de péptidos HB en tándem con enlazadores se puede representar como HB-enlazador-HB-X, en la que una construcción HB-enlazador-HB que comprende la variante de HB de la SEQ ID NO: 3 tiene los aminoácidos:

KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:23); o HB-enlazador-HB- enlazador-HB-X, en la que el HB-enlazador-HB-enlazador-HB que comprende la variante de HB de la SEQ ID

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

NO: 3 tiene los restos:

KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGGGKRKKKGKGLGKK RDPKLRKYK (SEQ ID NO:24). En algunas realizaciones, las construcciones de HB en tándem comprenden la misma construcción de HB. En realizaciones alternativas, se pretende que las construcciones de péptido HB en tándem puedan comprender diferentes combinaciones de péptidos HB, por ejemplo, cualquier combinación de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, en cualquier orden. Como ejemplo ilustrativo, una construcción de péptido HB en tándem puede comprender la SEQ ID NO: 2-enlazador-SEQ ID NO:3-enlazador-SEQ ID nO:3-X. En algunas realizaciones, una construcción de péptido HB en tándem comprende una combinación de péptidos HB de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 solamente.

Enlazadores

La unión entre un péptido HB y se puede ser mediante enlazadores, tales como, pero sin limitarse a, modificación química, enlazadores peptídicos, enlazadores químicos, enlaces covalentes o no covalentes, o proteínas de fusión o mediante cualquier otro medio conocidos para un experto en la materia. La unión puede ser permanentes o reversible. En algunas realizaciones, se pueden incluir varios enlazadores para aprovechar las propiedades deseadas de cada enlazador y de cada proteína del conjugado. Los enlazadores flexibles y los enlazadores que aumentan la solubilidad de los conjugados se contemplan para su uso en solitario o con otros enlazadores que se describe en el presente documento. Los enlazadores peptídicos se pueden unir mediante la expresión del ADN que codifica el enlazador a una o más de las proteínas del conjugado. Los enlazadores se pueden escindir con ácido, fotoescindirse y se enlazadores termolábiles. Las personas expertas en la materia conocen bien los procedimientos de conjugación, y están abarcados para su uso en la presente invención.

En algunas realizaciones, un péptido HB se puede unir a un principio activo X, cuando el principio activo es un péptido o proteína terapéutica mediante un enlazador peptídico. Los enlazadores peptídicos se pueden unir mediante la expresión del ADN que codifica el enlazador a una o más de las proteínas del conjugado. En algunas realizaciones, un enlazador peptídico es GGG. Opcionalmente, el enlazador peptídico se unirá en uno o ambos del extremo amino y el extremo carboxi del péptido Hb con un enlazador corto flexible, por ejemplo que comprende al menos aproximadamente 2, 3, 4 o más restos glicina, serina y/o alanina. En algunas realizaciones, uno de estos enlazadores comprende el motivo (GGGGS) (SEQ ID NO: 42), y puede estar presente en una o más copias. En algunas realizaciones, el enlazador comprende restos de aminoácidos cargados positivamente.

De acuerdo con la presente invención, el péptido HB puede estar unido a un principio activo mediante cualquier medio adecuado, como se conoce en la materia, véanse por ejemplo, las patentes de Estados Unidos con números 4.625.014, 5.057.301 y 5,514.363.

Una gran variedad de procedimientos para la conjugación de un péptido HB como se desvela en el presente documento con X, por ejemplo, un primer ligando (por ejemplo una proteína o péptido terapéuticos) son conocidos en la técnica. Dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en Hermanson (1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press), en el documento US 6.180.084 y el documento US 6.264.914 e incluyen, por ejemplo procedimientos usados para unir haptenos a proteínas transportadoras como se utiliza de forma rutinaria en inmunología aplicada (véase Harlow y Lane, 1988, "Antibodies: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Se reconoce que, en algunos casos, un péptido HB y/o una proteína o péptido terapéuticos pueden perder eficacia o funcionalidad después de la conjugación dependiendo, por ejemplo, del procedimiento de conjugación o del grupo químico utilizado en el mismo. No obstante, dada la gran variedad de procedimientos de conjugación, el experto pueden encontrar un procedimiento de conjugación que no afecte o afecte poco a la eficacia o funcionalidad de las entidades, tales como un péptido HB y el péptido terapéutico con el que se va a conjugar.

En algunas realizaciones, un péptido HB se puede conjugar con un principio activo (X) mediante reticulación. Los reactivos de reticulación incluyen glutaraldehído (GAD), oxirano bifuncional (OXR), etilenglicol diglicidil éter (EGDE), N-hidroxisuccinimida (NHS), y una carbodiimida soluble en agua, preferentemente 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Como conoce el experto en la materia, se puede utilizar cualquier química de reticulación, incluido, pero sin limitaciones, tioéter, tioéster, malimida y tiol, amina-carboxilo, amina-amina, y otros relacionados en los manuales de química orgánica, tales como, Elements of Organic Chemistry, Isaak y Henry Zimmerman Macmillan Publishing Co., Inc. 866 Third Avenue, Nueva York, N.Y. 10022.

Otros enfoques de unión para conjugar el péptido HB con el principio activo, incluyen pero no se limitan a la peroxidasa de rábano picante (HRP) aminocaproico o un reticulador bifuncional, por ejemplo, reticulante reactivo con carbonilo y reactivo con sulfhidrilo. Los reactivos de reticulación heterobifuncionales contienen normalmente dos grupos reactivos que se pueden acoplar a dos dianas funcionales diferentes de proteínas y otras macromoléculas en un procedimiento en dos o tres etapas, lo que puede limitar el grado de polimerización frecuentemente asociado con los reticulantes homobifuncionales. Dichos protocolos multietapa pueden ofrecer un gran control del tamaño del conjugado y de la relación molar de los componentes.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

En algunas realizaciones, un péptido HB se conjuga con un principio activo ácido nucleico, por ejemplo, un agente ARNi o ARNmi usando un enlazador de protamina, como se desvela en las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos con números US2002/0132990 y US2004/0023902. En particular, cuando un enlazador es una protamina o agente análogo a protamina, los procedimientos, reactivos y referencias que describen la preparación de la protamina asociada con un péptido HB se describen en el documento US 2011/0177155 y en las solicitudes de patente de Estados Unidos US2007/012152 y US 2010/0209440. En algunas realizaciones, un enlazador de protamina abarcado para su uso en la presente invención comprende la SEQ ID NO: 1-6 desvelada en el documento US 2010/0209440.

Los procedimientos adecuados para la conjugación de un péptido HB como se desvela en el presente documento con X (por ejemplo, un primer ligando (por ejemplo una proteína o péptido terapéuticos) incluyen, por ejemplo, conjugación con carbodiimida (Bauminger y Wilchek, 1980, Meth. Enzymol. 70: 151-159). Como alternativa, un resto se puede acoplar a un agente de direccionamiento como se describe en Nagy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7269-7273 (1996), y Nagy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1794-1799 (1998). Otro procedimiento de conjugación que se puede usar es, por ejemplo, la oxidación con peryodato sódico seguido por alquilación reductora de los reactivos adecuados y reticulación con glutaraldehído.

Se puede usar una variedad de diferentes enlazadores para conjugar un péptido HB como se describe en el presente documento con X (por ejemplo, un primer ligando (por ejemplo una proteína o péptido terapéuticos), por ejemplo, aunque no de forma limitativa, la peroxidasa de rábano picante (HRP) aminocaproico o un reticulante bifuncional, por ejemplo, reticulante reactivo con carbonilo y reactivo con sulfhidrilo. Los reactivos de reticulación heterobifuncionales contienen normalmente dos grupos reactivos que se pueden acoplar a dos dianas funcionales diferentes de proteínas y otras macromoléculas en un procedimiento en dos o tres etapas, lo que puede limitar el grado de polimerización frecuentemente asociado con los reticulantes homobifuncionales. Dichos protocolos multietapa pueden ofrecer un gran control del tamaño del conjugado y de la relación molar de los componentes.

En algunas realizaciones, un enlazador es un enlazador de la región bisagra de la inmunoglobulina, como se desvela en las patentes de Estados Unidos 6.165.476, 5.856.456, las solicitudes estadounidense 2010/0063258 y la solicitud internacional WO2012/142515.

En algunas realizaciones, se pueden producir una proteína de fusión HB-X en un sistema no celular como se desvela en la solicitud estadounidense 2010/0063258,

Las secuencias enlazadoras ilustrativas incluyen, por ejemplo: (i) la región de la cola de la isoforma larga de la membrana de IgA 1 (malL): SCSVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN (SEQ ID NO: 43), (ii) la región de la cola de la isoforma larga de la variante de membrana de IgA 1 (ma 1L con cys adicionales): SCCVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN (SEQ ID NO: 44), (iii) la región de la cola de la isoforma corta de la membrana de IgA 1 (mals con una deleción en el extremo N de 6 aminoácidos):

DWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN (SEQ ID NO: 45), (iv) la región de la cola de la forma unida a membrana de IgA2: SCCVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN (SEQ ID NO: 46), (v) la región de la cola de la forma unida a membrana de IgD: YLAMTPLIPQSKDENSDDYTTFDDVGS (SEQ ID NO: 47), (vi) la región de la cola de la forma unida a membrana de IgE: ELDVCVEEAEGEAPW (SEQ ID NO: 48), (vii) la región de la cola de la forma unida a membrana IgG:

ELQLEESCAEAQDGELDG (SEQ ID NO: 49), y (viii) la región de la cola de la forma unida a membrana de IgM EGEVSADEEGFEN (SEQ ID NO: 50).

En otras realizaciones, una secuencia enlazadora se deriva del segmento de la cola de una forma secretora o soluble de una inmunoglobulina. Las secuencias enlazadoras ilustrativas incluyen, por ejemplo: (i) la región de la cola de la forma soluble de IgA1: KPTHVNVSVVMAEVDGTCY (SEQ ID NO: 51), (ii) la región de la cola de la forma soluble de IgA2: KPTHVNVSVVMAEVDGTCY (SEQ ID NO: 52), (iii) la región de la cola de la forma soluble de IgD: YVTDHGPMK (SEQ ID NO: 53), y (iv): la región de la cola de la forma soluble de IgM: PTLYNVSLVMSDTAGTCY (SEQ ID NO: 54).

En determinadas realizaciones, puede ser deseable tener una secuencia enlazadora que contenga un resto cisteína libre para permitir la formación de un enlace disulfuro entre enlazadores, formando de esta forma proteínas de fusión de HB. En otras realizaciones, puede ser deseable alterar las secuencias enlazadoras para eliminar los restos cisteína libres, por ejemplo, mutando uno o más restos de cisteína en un enlazador a otro resto, tal como serina, alanina o glicina. Los ejemplos de secuencias enlazadoras derivadas de las regiones de la cola de las de las inmunoglobulinas unidas a membrana que se han alterado para eliminar los restos de cisteína libres incluyen:

(i) SXSVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN, en la que X es serina, alanina o glicina (SEQ ID NO: 55), (ii) SXXVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN, en la que cada X se selecciona independientemente entre serina, alanina o glicina (SEQ ID NO: 56), (iii) SXXVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN, en la que cada X se selecciona independientemente entre serina, alanina o glicina (SEQ ID NO: 57), (iv) ELDVXVEEAEGEAPW, en la que X es serina, alanina o glicina (SEQ ID NO: 58), y (v) ELQLEESXAEAQDGELDG, en la que X es serina, alanina o glicina (SEQ ID NO: 59). Los ejemplos de secuencias enlazadoras derivadas de las regiones de la cola

10

15

20

25

30

35

40

de formas secretoras de inmunoglobulinas que se han alterado para eliminar los restos de cisteína libres incluyen: (i) KPTHVNVSVVMAEVDGTXY, en la que X es serina, alanina o glicina (SEQ ID NO: 60), (ii) KPTHVNVSVVMAEVDGTXY, en la que X es serina, alanina o glicina (SEQ ID NO: 61), y (iii) PTLYNVSLVMSDTAGTXY, en la que X es serina, alanina o glicina (SEQ ID NO: 62).

Principios activos - proteínas terapéuticas para conjugar con un péptido HB

La importancia y utilidad de las composiciones descritas en el presente documento se ilustran mediante la aplicación de la composición a la reparación de cartílagos, en la que la proteína de fusión es HB-IGF-1. Las lesiones traumáticas en la articulación, tales como las que implican la rotura del ligamento cruzado anterior (LCA) llevan a un aumento en el riesgo de desarrollar artrosis. Por otro lado, es posible que este riesgo no se resuelva mediante la restauración quirúrgica de la función (Lohmander y col., 35 Am. J. Sports Med. 1756 (2007)), que puede estar relacionada con una respuesta inflamatoria y catabólica inicial después de la lesión en la articulación. Lohmander y col., 42 Arthritis Rheum. 534 (1999); Lohmander y col., 48 Arthritis Rheum. 3130 (2003); Irie y col., 10 Knee 93 (2003). Las intervenciones terapéuticas en este período de tiempo pueden ser especialmente importantes para oponerse a estos procesos catabólicos y estimular la reparación del cartílago.

IGF-1 es el factor prototipo en circulación que estimula la biosíntesis del cartílago. Daughaday y col.,19 J. Clin. Endocrinol. Metab. 743 (1959); McQuillan y col., 240 Biochem. J. 423 (1986); Jones & Clemmons, 16 Endocrine Rev. 3 (1995). También actúa para oponerse a estímulos catabólicos. Luyten y col., 267 Arch. Biochem. Biophys. 416 (1988); Tyler, 260 Biochem. J. 543 (1989). Como resultado, los investigadores han deseado durante mucho tiempo usar IGF-1 como terapia para la reparación del cartílago. Trippel, 43 J. Rheumatol. Supl. 129 (1995). La administración de IGF-1 y otros factores de crecimiento es muy limitada, sin embargo, debido a su corta semivida en la articulación. los investigadores han desarrollado opciones para la terapia génica con IGF-1 y para IGF-1 encapsulado en hidrogeles para permitir la liberación controlada a largo plazo al cartílago de la articulación. Aunque prometedores, se ha demostrado en ensayos clínicos que estas técnicas son de ámbito lento. Evans y col., 7 Nat. Rev. Rheum. 244 (2011).

Un ejemplo de proteína IGF-1 de rata tiene los restos de aminoácidos:

GPETLCGAELVDALQFVCGPRGFYFNKPTGYGSSIRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLK PTKSA (SEQ ID NO:6). Véase, por ejemplo, Tokunou y col., 22 FASEB J. 1886 (2008).

Un ejemplo de IGF-1 humana tiene los restos de aminoácidos:

GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPL KPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA (SEQ ID NO:7). Véase también ID génica: 3489 (IGF1 humano). Otro ejemplo de IGF-1 humano (variante) tiene la secuencia de restos de aminoácidos: GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEM YCAPLKPAKSA. (SEQ ID NO:8). Una variante del IGF-1 humano que tiene actividad biológica (véase el documento WO 92/03477; GenBank: CAA01451.1) tiene los restos de aminoácidos:

megpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa (SEQ ID NO:9).

Se sabe que el truncamiento del extremo N del IGF-1 retiene la actividad biológica, por ejemplo, la deleción de los aminoácidos del extremo N GPE. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un IGF-1 humano (variante) abarcado para su uso en la presente invención tiene la secuencia de restos de aminoácidos:

TLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYC APLKPAKSA. (SEQ ID NO: 63).

Por tanto, en algunas realizaciones un HB-enlazador-proteína de fusión HB-X recombinante, en la que HB es una variante C16R, el enlazador es GGG, y X es una variante del IGF-1 humano de la SEQ ID NO: 7, tiene la secuencia de aminoácidos:

KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDA

LQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQR HTDMPKTQKEVHLKNASRGSA (SEQ ID NO: 10); otro HB-enlazador-HB-enlazador-HB-X recombinante, en la que HB es una variante C16R, el enlazador es GGG, y X es una variante del IGF-1 humano (SEQ ID NO: 7) se puede representar gráficamente:

5

10

15

20

25

KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGL

GKKRDPRLRKY KGPETT X’GAET .VDAI .QFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRR APQTGIVDECCFRS CDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA (SEQ ID NO:ll).

En algunas realizaciones, una variante del IGF-1 de la SEQ ID NO:7 se puede sustituir por la SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, la C16R de HB (por ejemplo, SEQ iD NO: 2) se puede sustituir por C17R de HB (por ejemplo, MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK; SEQ ID NO: 21). Un ejemplo de fusión de C17R de HB con el IGF- 1 humano de longitud completa (de la SEQ ID NO: 7) tiene los aminoácidos:

MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAP QTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA (SEQ ID NO:12). En algunas realizaciones, un ejemplo de fusión de C16R de HB con el IGF-1 humano de longitud completa (de la SEQ ID NO: 7) (por ejemplo, hB-IGF) tiene los aminoácidos:

KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETECGAEEVDAEQEVCGDRGEYFNKPTGYGSSSRRAPQ TG1VDECCERSCDERREEMYCAPEKPAKSARSVRAQR1ITDMPKTQKEV11EKNASRGSA (SEQ ID NO: 16).

En algunas realizaciones, C16R de HB (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) o C17R de HB (SEQ ID NO: 21) se puede sustituir por C16K de HB (SEQ ID NO: 3) o HB C17K (MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK; SEQ ID NO: 22). Por ejemplo, en otro ejemplo, una fusión de C17K de HB con el IGF-1 humano de longitud completa (por ejemplo, SEQ iD NO: 7) tiene los aminoácidos:

MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAP QTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA (SEQ ID NO:13). Los truncamientos del IGF-1 humano correspondientes a la SEQ ID NO: 8 fusionada a C17R de HB tiene la secuencia de aminoácidos de:

MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAP QTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA (SEQ ID NO: 14) o

KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQ TGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA (SEQ ID NO:18), y una fusión de HB C17K con el IGF-1 humano maduro:

MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETECGAEI VDAEQFVCGDRGEYENKPTGYGSSSRRAP QTG1VDECCERSCDERREEMYCAPEKPAKSA (SEQ ID NO: 15)

Las variantes de las anteriores HB-proteínas de fusión se pueden construir de forma que carezcan de la metionina inicial del extremo N del péptido HB, por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, es decir,

Claims (24)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   1. Una composición que comprende al menos un conjugado HBn-Xn, en la que HB es un péptido de unión a heparina seleccionado entre KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:2), MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:21), KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:3); o MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:22); X es un principio activo seleccionado de:

   factor de crecimiento nervioso (NGF); factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF); factor neurotrófico de dopamina conservado (CDNF); ligandos de la familia del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial; factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF); neurturina (NRTN); artemina (ARTN); persefina (PSPN); citoquinas neuropoyéticas seleccionadas de interleuquina-6, interleucina-11, interleucina-27, factor inhibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, cardiotrofina 1, neuropoyetina, citoquina de tipo cardiotropina o factor 2 de crecimiento de fibroblastos; citoquinas antiinflamatorias seleccionadas entre interleuquina-4 e interleuquina-10 del receptor 2 de TNF; neurregulina-1 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); Cerebrolysin® (FPF-1070); factor 11 de diferenciación del crecimiento (GDF11); factor 1 de derivado de células del estroma (SDF-1); miostatina (factor 8 de diferenciación del crecimiento de fibroblastos (GDF8)); factor 1 de crecimiento de tipo insulina (IGF1); hormona paratiroidea (HPT); una porción de la PTH, seleccionada entre los restos de aminoácidos 1-31,1-34 (TM Forteo ®), 1-37, 1-38, 1-44, o 1-84 de la PTH madura; péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) o un análogo de la PTHrP que tiene la secuencia (AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA, donde N es Aib (ácido 2-aminoisobutírico) (SEQ ID NO: 39), antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-IRA); quimeras IL-1/IL-1 RA; IL-1RA maduro que tiene la secuencia de aminoácidos: RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEP HALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF

   ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO: 40), factor 18 de crecimiento de fibroblastos (FGF-18); proteína del grupo 2 de alta movilidad (HMG-2); un anticuerpo terapéutico seleccionado entre Remicade® (infliximab, anti-TNF-a), Humira® (adalimumab, anti-TNF), ENBREL® (etanercept, proteína recombinante anti-TNF); un anticuerpo dirigido contra el factor 9 de crecimiento nervioso; factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-9); factor de crecimiento de hepatocitos; proteínas de la superfamilia de TGF-beta seleccionadas entre TGF, TGF3, BMP2, o BMP7; análogo de angiopoyetina 3 (ANGPTL3); un agente antiinflamatorio esteroideo seleccionado del grupo que consiste en 21-acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, acetónido de fluocinolona, fluocinonida, fluocortin butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, mometasona furoato, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 25-dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato de prednisolona sodio, prednisona, prednival, prednidileno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona, y hexacetónido de triamcinolona; somatostatina (SST) o un análogo de la misma seleccionado entre las moléculas pequeñas (nombre comercial SANDOSTATIN®), pasireotida (SOM230, nombre comercial SIGNIFOR®), lanreotida (nombre comercial: SOMATULINE®); un principio activo de molécula pequeña seleccionado entre TR2-01829 o PRO 1,2-hidroxi-N-[3-(trifluorometil)fenil]benzamida (HS-Cf) o kartogenina y n es un número entero de al menos 1.
2. 2. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un enlazador, en la que la composición está representada por (HB-enlazador)n-Xn.
3. 3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en la que X es un principio activo seleccionado entre factor 1 de

   crecimiento de tipo insulina (IGF1); hormona paratiroidea (HPT); una porción de la PTH, seleccionada entre los restos de aminoácidos 1-31, 1-34 (Tm Forteo®), 1, -37, 1-38, 1-44, o 1-84 de la PTH madura; péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) o un análogo de la PTHrP que tiene la secuencia (AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA, donde N es Aib (ácido 2-aminoisobutírico) (SEQ ID NO: 39), antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-IRA); quimeras IL-1/IL-1 RA, IL-1RA maduro que tiene la secuencia de aminoácidos :RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEP

   HALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSF

   ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO: 40), factor 18 de crecimiento de fibroblastos (FGF-18).
4. 4. La composición de la reivindicación 2 o 3, en la que el enlazador es un péptido que comprende la secuencia GGG o GGGGS.
5. 5. La composición de la reivindicación 4, en la que la porción HB-enlazador de la composición se selecciona entre KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:4), o

   KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKG KGLGKK RDPRLRKYK (SEQ ID N0:5).
6. 6. La composición de la reivindicación 1-5, en la que X o el enlazador está:

   fusionado al extremo N de HB o fusionado al extremo C de HB.

   5 7. La composición de la reivindicación 6, en la que la proteína de fusión se selecciona entre las siguientes:

   KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAEL VDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPA KSARSVRAQR HTDMPKTQKEVHLKNASRGSA (SEQ ID NO: 10);

   KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKG KGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQT GIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGS A (SEQ ID NO: 1 1);

   MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGS SSRRAPQTGTVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVH LKNASRGSA (SEQ ID NO: 12);

   MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGS SSRRAPQTGTVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVH LKNASRGSA (SEQ ID NO: 13);

   MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGS SSRR APQTGTVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA (SEQ ID NO: 14);

   MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGS SSRRAPQ TGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA (SEQ ID NO: 15);

   KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSS RRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLK NASRGSA (SEQ ID NO: 16);

   KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSS RRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLK NASRGSA (SEQ ID NO: 17);

   KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSS RRAP

   QTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA (SEQ ID NO: 18); o

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSS RRAP QTGIVDECCFRSCDFRRLEMYCAPLKPAKSA (SEQ ID NO: 19).
7. 8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en la que el HBn-Xn comprende (HB-enlazador)n-Xm- (HB-enlazador)o, en la que m es un número entero de al menos 1 y n + o es un número entero de al menos 1; dos o más péptidos HB diferentes seleccionados entre KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:2), o KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:3) o al menos 2 conjugados HBn-Xn.
8. 9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 6 u 8, en la que X se selecciona entre una cualquiera o una combinación de proteínas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 6-9, SEQ ID NO: 30-41, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 73-76.
9. 10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que X es una molécula pequeña seleccionada entre las moléculas pequeñas de octreotida (nombre comercial SANDOSTATIN®), pasireotida (SOM230, nombre comercial SIGNIfOr®), lanreotida (nombre comercial: SOMATULINE®) [00141]

   y principios activos de molécula pequeña seleccionados entre TR2-01829 o PRO 1, 2-hidroxi-N-[3- (trifluorometil)fenil]benzamida (HS-Cf) o kartogenina.
10. 11. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende al menos un HB-Xn o (HB- enlazador)n-Xn, en la que X es una proteína terapéutica seleccionada entre factor 1 de crecimiento de tipo insulina (IGF-1); hormona paratiroidea (HPT); una porción de la PTH seleccionada entre los restos de aminoácidos 1-31, 134 (tM Forteo®), 1-37, 1-38, 1-44, o 1-84 de la PTH madura; péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) o un análogo de la PTHrP que tiene la secuencia (AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA, donde N es Aib (ácido 2-aminoisobutírico) (SEQ ID NO: 39), antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-IRA); quimeras IL-1/IL-1 RA; factor 18 de crecimiento de fibroblastos (FGF-18), un anticuerpo dirigido contra el factor de crecimiento nervioso, FGF-9, factor de crecimiento de hepatocitos, TGFp, TGFp3, BMP2, BMP7, análogo de angiopoyetina 3 (ANGPTL3), somatostatina (SST) o un análogo de la misma seleccionado entre las moléculas pequeñas (nombre comercial SANDOSTATIN®), pasireotida (SOM230, nombre comercial SIGNIFOR®), lanreotida (nombre comercial: SOMATULINE®), receptor de TNF 2, interleuquina-4 e interleuquina-10; IL-11; un agente antiinflamatorio esteroideo seleccionado del grupo que consiste en 21-acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, acetónido de fluocinolona, fluocinonida, fluocortin butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, mometasona furoato, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 25-dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato de prednisolona sodio, prednisona, prednival, prednidileno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona, y hexacetónido de triamcinolona, para su uso en el tratamiento de dolencias clínicas relacionadas con el cartílago (por ejemplo, daño o lesión) seleccionadas entre un defecto en el cartílago articular que incluye la rotura o el desprendimiento, un defecto en el menisco que incluye un desgarro parcial o completo, artrosis, ruptura o desprendimiento traumático del cartílago, espondilitis anquilosante, capsulitis, artritis psoriática, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, artritis idiopática juvenil, raquitismo hipofosfatémico vinculado a X o uno o más síntomas de un trastorno articular o pérdida o daño del cartílago, incluidos uno o más síntomas del grupo de: inflamación de articulaciones, dolor articular, enrojecimiento de la articulación, laxitud de la articulación, síntomas de artritis leve, derrame articular hemorrágico, derrame articular inflamatorio, hipermovilidad de la articulación, derrame articular no inflamatorio.
11. 12. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende al menos un HB-Xn o (HB- enlazador)n-Xn, en la que X es una proteína terapéutica seleccionada entre hormona paratiroidea (PTH); una porción de la PTH, seleccionada entre los restos de aminoácidos 1-31, 1-34 (TM Forteo®), 1, -37, 1-38, 1-44, o 1-84 de la PTH madura; péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) o un análogo de la PTHrP que tiene la secuencia (AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA, donde N es Aib (ácido 2-aminoisobutírico) (SEQ ID NO: 39); antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-1RA); factor 18 de crecimiento de fibroblastos (FGF-18), un anticuerpo dirigido contra el factor de crecimiento nervioso; factor 9 de crecimiento de fibroblastos (FGF-9); factor de crecimiento de hepatocitos; proteínas de la superfamilia de TGF seleccionadas entre TGF, TGFP3, BMP2, o BMP7 para su uso en el tratamiento de dolencias clínicas relacionadas con el cartílago (por ejemplo, daño o lesión) seleccionadas entre un defecto en el cartílago articular que incluye la rotura o el desprendimiento, un defecto en el menisco que incluye un desgarro parcial o completo, artrosis, ruptura o desprendimiento traumático del cartílago, espondilitis anquilosante, capsulitis, artritis psoriática, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, artritis idiopática juvenil, o raquitismo hipofosfatémico vinculado a X.
12. 13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende al menos un HB-Xn o (HB- enlazador)n-Xn, en la que X es una proteína terapéutica o porción de la misma, seleccionada entre factor de

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    55

    60

    crecimiento de los nervios (NGF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4 (NT-4), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF), factor neurotrófico de dopamina (CDNF), factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), neurturina (NRTN), artemina (ARTN), persefina (PSPN), interleucina-6, interleucina-11, interleucina-27, factor inhibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, cardiotrofina 1, neuropoyetina, citoquina de tipo cardiotropina, FPF- 1070, factor 2 de crecimiento de fibroblastos, neurregulina-1, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), quimeras IL-1/IL-1 RA, IL-1RA madura que tiene la secuencia de aminoácidos: RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFL

    GIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAAC PGWFLCTAMEAD

    QPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE (SEQ ID NO: 40), receptor de TNF 2, interleuquina-4 e interleuquina-10; IL-11; un agente antiinflamatorio esteroideo seleccionado del grupo que consiste en 21-acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, acetónido de fluocinolona, fluocinonida, fluocortin butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, mometasona furoato, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 25-dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato de prednisolona sodio, prednisona, prednival, prednidileno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona, y hexacetónico de triamcinolona para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular o una dolencia ocular mediada por inflamación, tal como úlcera de la córnea o abrasión de la córnea, queratopatía puntiforme superficial de Thygeson, neovascularización de la córnea, distrofia de Fuchs, queratoconjuntivitis seca, inflamación coriorretinal, cicatrices coriorretinales, degeneración coroidal, distrofia coroidal hereditaria, desprendimiento de retina, retinosquisis, retinopatía hipertensiva, retinopatía del prematuro, degeneración macular relacionada con la edad, degeneración de la retina, degeneración macular, membrana epirretinal, degeneración periférica de la retina, distrofia retinal hereditaria, retinitis pigmentosa, xeroftalmia, o hemorragia retinal.
13. 14. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende al menos un HB-Xn o (HB-enlazador)n- Xn, en la que X es una proteína terapéutica o porción de la misma, seleccionada entre factor de crecimiento de los nervios (NGF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4 (NT-4), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF), factor neurotrófico de dopamina (CDNF), factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), neurturina (NRTN), artemina (ARTN), persefina (PSPN), interleucina-6, interleucina-11, interleucina-27, factor inhibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, cardiotrofina 1, neuropoyetina, citoquina de tipo cardiotropina, FPF-1070, factor 2 de crecimiento de fibroblastos, neurregulina-1, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), IGF o factor 1 de crecimiento de tipo insulina (IGF-1) para su usar en el tratamiento de una dolencia neurológica tal como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, lesión cerebral, lesión de la médula espinal, degeneración de nervios periféricos, ictus, enfermedad de Huntington, enfermedad de Pick, neuropatía diabética, demencia frontotemporal, demencia con cuerpos de Lewis, degeneración corticobasal, parálisis supranuclear progresiva, trastornos priónicos, parálisis supranuclear progresiva, atrofia multisistémica, paraparesis espástica hereditaria, atrofias espinocerebelares, ataxia de Friedreich, amiloidosis, o síndrome de Charcot Marie Tooth.
14. 15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende al menos un HB-Xn o (HB-enlazador)n- Xn donde X es una proteína terapéutica o porción de la misma, seleccionada entre receptor 2 de TNF, interleuquina- 4, o interleuquina-10 para su uso en el tratamiento de la inflamación.
15. 16. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para suministrar un principio activo X seleccionado entre: factor de crecimiento nervioso (NGF); factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF); factor neurotrófico de dopamina conservado (CDNF); ligandos de la familia del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial; factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF); neurturina (NRTN); artemina (ARTN); persefina (PSPN); citoquinas neuropoyéticas seleccionadas de interleuquina-6, interleucina-11, interleucina- 27, factor inhibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, cardiotrofina 1, neuropoyetina, citoquina de tipo cardiotropina o factor 2 de crecimiento de fibroblastos; citoquinas antiinflamatorias seleccionadas entre receptor 2 de TNF, interleuquina-4 e interleuquina-10; neurregulina-1 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); Cerebrolysin® (FPF-1070); factor 11 de diferenciación del crecimiento (GDF11); factor 1 de derivado de células del estroma (SDF-1); miostatina (factor 8 de diferenciación del crecimiento de fibroblastos (GDF8)); factor 1 de crecimiento de tipo insulina (IGF1); hormona paratiroidea (HPT); una porción de la PTH, seleccionada entre los restos de aminoácidos 1-31, 1-34 (Tm Forteo ®), 1, -37, 1-38, 1-44, o 1-84 de la PTH madura; péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) o un análogo de la PTHrP que tiene la secuencia (AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA, donde N es Aib (ácido 2-aminoisobutírico) (SEQ ID NO: 39); antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-IRA); quimeras IL-1/IL-1 RA; factor 18 de crecimiento de fibroblastos (FGF-18); proteína del grupo 2 de alta movilidad (HMG-2); un anticuerpo terapéutico seleccionado entre Remicade® (infliximab, anti-TNF-a), Humira® (adalimumab, anti-TNF), ENBREL® (etanercept, proteína

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    55

    60

    recombinante anti-TNF); un anticuerpo dirigido contra el factor de crecimiento nervioso; factor 9 de crecimiento de fibroblastos (FGF-9); factor de crecimiento de hepatocitos; proteínas de la superfamilia de TGF-beta seleccionadas entre TGF, TGF3, BMP2, o BMP7; análogo de angiopoyetina 3 (ANGPTL3); un agente antiinflamatorio esteroideo seleccionado del grupo que consiste en 21-acetoxipregnenolona, alclometasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximetasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flunisolida, acetónido de fluocinolona, fluocinonida, fluocortin butilo, fluocortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandrenolida, propionato de fluticasona, formocortal, halcinonida, propionato de halobetasol, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, etabonato de loteprednol, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, mometasona furoato, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 25- dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato de prednisolona sodio, prednisona, prednival, prednidileno, rimexolona, tixocortol, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona, y hexacetónido de triamcinolona; somatostatina (SST) o un análogo de la misma seleccionado entre las moléculas pequeñas (nombre comercial SANDOSTATIN®), pasireotida (SOM230, nombre comercial SIGNIFOR®), lanreotida (nombre comercial: SOMATULINE®); un principio activo de molécula pequeña seleccionado entre TR2-01829 o 1,2-hidroxi-N-[3- (trifluorometil)fenil]benzamida (HS-Cf) o kartogenina a una célula o tejido que expresa proteoglicanos en la que el tejido es preferentemente tejido de cartílago, tejido neuronal, piel o tejido subcutáneo.
16. 17. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la composición comprende; un hidrogel;

    un hidrogel con péptido autoensamblado; o

    un hidrogel con péptido autoensamblado que comprende al menos uno o una combinación de péptidos seleccionada entre: RADARADARADARADA (SEQ ID NO: 77), KLDLKLDLKLDL (SEQ ID NO: 78) o AcN- KLDLKLDLKLDL-CNH2 (SEQ ID NO: 79).
17. 18. La composición para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 11 o 12, en la que el HB-Xn o (HB-enlazador)n- Xn está presente en o dentro de un implante biológico que es un aloinjerto osteocondrial o del menisco.
18. 19. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica al menos un péptido de unión a heparina (HB) seleccionado entre KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:2), MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:21), KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:3); o MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:22); y que comprende opcionalmente al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un principio activo (X) seleccionado entre:

    factor de crecimiento nervioso (NGF); factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4); factor neurotrófico ciliar (CNTF); factor neurotrófico mesencefálico derivado de astrocitos (MANF); factor neurotrófico de dopamina conservado (CDNF); ligandos de la familia del factor neurotrófico derivado de la línea celular glial; factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF); neurturina (NRTN); artemina (ARTN); persefina (PSPN); citoquinas neuropoyéticas seleccionadas de interleuquina-6, interleucina-11, interleucina-27, factor inhibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, cardiotrofina 1, neuropoyetina, citoquina de tipo cardiotropina o factor 2 de crecimiento de fibroblastos; citoquinas antiinflamatorias seleccionadas entre receptor 2 de TNF, interleuquina-4 e interleuquina-10; neurregulina-1 y factor de crecimiento endotelial vascular (VeGf); Cerebrolysin® (FPF-1070); factor 11 de diferenciación del crecimiento (GDF11); factor 1 de derivado de células del estroma (SDF-1); miostatina (factor 8 de diferenciación del crecimiento de fibroblastos (GDF8)); factor 1 de crecimiento de tipo insulina (IGF1); hormona paratiroidea (HPT); una porción de la PTH, seleccionada entre los restos de aminoácidos 1-31, 1-34 (TM Forteo®), 1, -37, 1-38, 1-44, o 1-84 de la PTH madura; péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) o un análogo de la PTHrP que tiene la secuencia (AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLNKLHTA, donde N es Aib (ácido 2-aminoisobutírico) (SEQ ID NO: 39), antagonista del receptor de la interleuquina 1 (IL-IRA); quimeras IL-1/IL-1 RA; factor 18 de crecimiento de fibroblastos (FGF-18); proteína del grupo 2 de alta movilidad (HMG-2); un anticuerpo terapéutico seleccionado entre Remicade® (infliximab, anti-TNF-a), Humira® (adalimumab, anti-TNF), ENBREL® (etanercept, proteína recombinante anti-TNF); un anticuerpo dirigido contra el factor de crecimiento nervioso; factor 9 de crecimiento de fibroblastos (FGF-9); factor de crecimiento de hepatocitos; proteínas de la superfamilia de TGF-beta seleccionadas entre TGF, TGF3, BMP2, o BMP7; análogo de angiopoyetina 3 (ANGPTL3); somatostatina (SST) o un análogo de la misma seleccionado entre las moléculas pequeñas (nombre comercial SANDOSTATIN®), pasireotida (SOM230, nombre comercial SIGNIFOR®), lanreotida (nombre comercial: SOMATULINE®), o que comprende opcionalmente al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un enlazador.
19. 20. El vector de la reivindicación 19, en el que la secuencia de ácidos nucleicos codifica al menos un HB-Xn o proteína de fusión Xn-HBn, en la que HB es un péptido de unión a heparina seleccionado entre KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:2), MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:21), KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:3) o KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK (SEQ ID NO:22); X es un principio activo, y n es un número entero de al menos 1; o al menos un (HB-enlazador) n-Xn o al menos una proteína de fusión Xn-(HB-enlazador)n, o al menos un (HB-enlazador)n-Xm-(HB-enlazador) o proteína de fusión, en la que HB es un péptido de unión a heparina seleccionado entre KrKkKGKGLGKKRDPCLRKYK (SEQ ID nO:2), o KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK (SEQ ID NO:3); X es un principio activo, en la que m es un número entero de al

    menos 1 y n + o es un número entero de al menos 1.
20. 21. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, en el que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el X o enlazador está;

    en la posición 5' del ácido nucleico que codifica HB o 5 en la posición 3' del ácido nucleico que codifica HB.
21. 22. Una línea celular que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.

    imagen1

    na 2

    imagen2

    H8 IGF

    imagen3

    FtG. 4

    Incorporación de sulfato (Normalizado solo con suero salino)

    o o j-* isa ro

    o cji q en o en

    imagen4

    FIG. 5

    14—

    * 1 t

    12 3 4

    !.HB{C17K)-IGF-1
22. 2. HBÍC17RHGF-1
23. 3. HBÍC17SHGF-1
24. 4. HB-IGF-1

    Expresión de las variantes de HB-IGF-1 en los extractos de detergente

    imagen5

    FIG. 7

    imagen6

    1) eHB-IGF-1 no inducido

    2) eHB-IGM inducido

    3) wHB-IGF-1 no inducido

    4) wHB-IGF-1 inducido

    FIG. 8

    imagen7

    imagen8