ES2287028T3

ES2287028T3 - Composiciones y metodos para la prevencion o el tratamiento de cancer y de la perdida osea asociada con el cancer.

Info

Publication number: ES2287028T3
Application number: ES00955737T
Authority: ES
Inventors: Colin R. Dunstan
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2007-12-16
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: ZA200103565B; EP1140136A2; CN1345246A; EP1140136B1; HUP0104688A3; JP2011225581A; WO2001017543A3; DE60034871D1; DE60034871T2; US20060019887A1; WO2001017543A2; EP1800691A2; CA2349406A1; ATE362374T1; EP1800691A3; AU6788900A; JP2003508491A; CA2349406C; HUP0104688A2; IL142900A0

Abstract

El uso de un polipéptido de OPG para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la pérdida de hueso asociada con el cáncer en un mamífero, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, cáncer rectal, cáncer de vejiga, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer del tracto gastrointestinal, mieloma múltiple y adenocarcinoma de colon.

Description

Composiciones y métodos para la prevención o el tratamiento de cáncer y de la pérdida ósea asociada con el cáncer.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia al uso de OPG para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la pérdida ósea asociada con el cáncer. La invención también hace referencia al uso de OPG para la preparación de composiciones para el tratamiento del mieloma múltiple.

Antecedentes de la invención

Muchos cánceres pueden establecerse en tejidos y órganos que están apartados del sitio original de crecimiento del tumor. Tales cánceres, denominados cánceres metastásicos, pueden ocasionar complicaciones diseminadas que son a menudo fatales. El esqueleto es un sitio común para la diseminación de los tumores sólidos, superado en frecuencia solamente por el hígado y el pulmón. Como resultado de la invasión por las células cancerosas, los osteoclastos, las células primarias del hueso que promueven la resorción ósea, se vuelven hiperactivas y comienzan a romper el hueso a una velocidad acelerada. Los osteoclastos son activados por sustancias tales como el péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP) y la interleucina-1 (IL-1), ambos los cuales aumentan en el entorno del hueso y también son producidos por las células tumorales. Los pacientes con cáncer de hueso desarrollan frecuentemente lesiones óseas líticas como resultado de un aumento de la actividad de los osteoclastos. Esta condición es referida como metástasis ósea osteolítica. La lisis del hueso puede conducir a fracturas patológicas, colapso espinal, eventos hipercalcémicos y dolor de huesos y es una causa importante de mortalidad y morbilidad. Alternativamente, como en las metástasis óseas del cáncer de próstata, el aumento de la destrucción ósea osteoclástica está acompañada de un incremento, desorganizado, de la formación ósea (Kylmaelae et al. Brit. J. Cancer 71, 1061-1064 (1995)). El hueso original es eliminado, y remplazado por hueso no estructurado tejido de manera que la integridad estructural del hueso se pierde. Esto también produce dolor del hueso y otras morbilidades.

Además la actividad de los osteoclastos puede incrementar la propensión de las células cancerosas a la metástasis en el hueso y puede desarrollarse después en ese entorno. Se ha demostrado que los osteoclastos liberan citocinas tales como IL-6 que es un factor de crecimiento para algunas células tumorales hematológicas tales como las células de mieloma múltiple (O'Keefe et al. Lab. Invest. 76, 457-465 (1997)). Además, se ha demostrado que los osteoclastos liberan factores de crecimiento a partir de la matriz del hueso durante la resorción ósea. Estos incluyen factores de crecimiento de fibroblastos y el factor de crecimiento transformante \beta que son conocidos por promover el crecimiento de muchos tumores sólidos. De este modo la actividad osteoclástica podría crear un entorno fértil para la siembra metastásica en el hueso, y a medida que las células tumorales comienzan a crecer y promover la resorción ósea, ocasionar la liberación de factores de crecimiento desde el hueso para mantener la expansión tumoral.

Los agentes para la terapia cancerosa disponibles actualmente pueden reducir o inhibir el crecimiento tumoral pero tienen un pequeño efecto sobre la enfermedad del hueso lítica subyacente. Se ha informado de que algunos regímenes quimioterapéuticos contribuyen realmente a la pérdida ósea asociada con las malignidades hematológicas tales como el mieloma múltiple y la enfermedad de Hodgkin y en el caso de los agonistas de los receptores hormonales liberadores de gonadotropina. Además, una vez que el cáncer se ha diseminado al hueso, se hace más difícil de tratar utilizando los regímenes actuales. Por lo tanto es deseable poder evitar el desarrollo de la metástasis ósea y tratar las metástasis óseas para evitar la pérdida de hueso en una fase temprana.

Los agentes anti-resorción ósea inhiben el número y/o la actividad de los osteoclastos y reducen la velocidad a la cual el hueso se rompe. Tales agentes pueden ser útiles en la prevención y/o el tratamiento de la resorción ósea asociada con el cáncer de hueso. Se ha informado de que los bisfosfonatos tales como el risedronato, el ibandronato y el pamidronato, que son compuestos anti-resorción, pueden reducir la gravedad de los eventos esqueléticos (p. ej., fracturas patológicas, colapso espinal, radiación o cirugía del hueso) en modelos de tumores en ratón y en pacientes que padecen cáncer de mama y mieloma múltiple y otras metástasis óseas tumorales. Además se ha informado de que los bisfosfonatos reducen el dolor de huesos y otros eventos esqueléticos en las metástasis óseas de cáncer de próstata. No obstante, se ha demostrado que los bisfosfonatos tienen una eficacia limitada solamente con una modesta reducción de los eventos esqueléticos incluso cuando se administran a dosis elevadas mediante infusión. Cuando se toman oralmente, los bisfosfonatos tienen una eficacia reducida y pueden ocasionar irritación gastrointestinal (p. ej., acidez estomacal, dispepsia y náuseas) y en algunos casos úlceras esofágicas si no se administran apropiadamente.

La osteoprotegerina (OPG) ha sido descrita en la Publicación PCT Núm. WO97/23614 y se ha encontrado que regula negativamente la formación de osteoclastos in vitro e in vivo. La OPG aumentaba espectacularmente la densidad ósea en ratones transgénicos que expresaban el polipéptido de OPG y reducía el grado de pérdida ósea cuando se administraba a ratas ovariectomizadas. Un análisis de la actividad de la OPG en la formación de osteoclastos in vitro reveló que la OPG bloquea la diferenciación de los osteoclastos a partir de precursores de monocitos/macrófagos. La OPG parece tener especificidad en la regulación del grado de formación de osteoclastos. La OPG es un potente factor en el bloqueo de la resorción ósea y puede ser utilizada en la prevención y el tratamiento de la pérdida de masa ósea. La actividad in vitro e in vivo de inhibición de la formación de osteoclastos y el bloqueo de la pérdida de hueso también fueron observados en las proteínas de fusión que comprenden OPG y un dominio Fc.

Por consiguiente, un objeto de la invención es proporcionar composiciones alternativas para el tratamiento de la pérdida ósea asociada con el cáncer que superan muchos de los problemas asociados con la terapia actual.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar composiciones alternativas para la prevención de la pérdida de hueso asociada con el cáncer mediante el tratamiento profiláctico para disminuir la incidencia de metástasis ósea y/o retrasar el comienzo de la metástasis ósea.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar composiciones alternativas para evitar y/o tratar el mieloma múltiple.

Compendio de la invención

La invención proporciona el uso de un polipéptido de OPG para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la pérdida de hueso asociada con el cáncer en un mamífero, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, cáncer rectal, cáncer de vejiga, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer del tracto gastrointestinal, mieloma múltiple y adenocarcinoma de colon.

También está incluida la enfermedad metastásica del hueso que incrementa la resorción ósea y la formación de hueso dando como resultado metástasis ósea osteoesclerótica o metástasis osteoescleróticas que están asociadas con el dolor óseo y la pérdida de la integridad estructural del hueso como en los tumores tales como el cáncer de próstata.

El uso según las reivindicaciones también proporciona la prevención de las metástasis del cáncer de huesos tras la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de OPG.

El uso según las reivindicaciones también proporciona la prevención y el tratamiento de una enfermedad ósea metastásica en un mamífero mediante la preparación de un medicamento que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de OPG combinado con un agente para la terapia del cáncer. El agente para la terapia del cáncer puede ser cualquier agente que se utilice para tratar el crecimiento tumoral incluyendo la terapia por radiación y los fármacos quimioterapéuticos. Los ejemplos de tales agentes incluyen antraciclinas, taxol, tamoxifeno, anticuerpos, tales como los anticuerpos anti-Her2 o anti-CD20, y agonistas y antagonistas de receptores, tales como antagonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH). Las composiciones de polipéptido de OPG se pueden administrar antes, durante, o después de la administración de un agente de terapia para el cáncer.

La invención también proporciona el uso de un polipéptido de OPG para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento del mieloma múltiple.

Los polipéptidos de OPG de la invención abarcan aquellos polipéptidos que tienen la actividad de inhibir la resorción ósea y pueden ser utilizados para evitar y/o tratar la pérdida de masa ósea o evitar la metástasis ósea osteoesclerótica (sustitución del hueso estructuralmente sano por hueso desorganicado estructuralmente deficiente). En las realizaciones preferidas, los polipéptidos de OPG son proteínas de fusión que comprenden OPG y un péptido o proteína heterólogos. Tales proteínas de fusión pueden mostrar un incremento de la vida media en circulación y tiempos de aclaramiento más lentos, proporcionando de ese modo una actividad anti-resortiva más sostenida y una administración menos frecuente. En un aspecto, la proteína heteróloga es una región Fc de inmunoglobulina, o una variante, fragmento o derivado de la misma.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones bisagra, CH2 y CH3 de la IgG\gamma1 humana.

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de OPG humana [1-401].

La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de OPG [22-194]-Fc.

La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de OPG [22-201]-Fc.

La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de OPG [22-194]-Fc\DeltaC.

La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de OPG [22-201]-Fc\DeltaC.

La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos de OPG [22-194]-FcG_{10}.

La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos de metFc\DeltaC-OPG[22-194].

La Figura 9 muestra la prevención de la destrucción ósea osteolítica en modelos C26-DCT y MDA-MB-231 de metástasis tumoral en hueso. Ambos tipos de células producen destrucción ósea localizada (flechas de color amarillo) tras la inoculación directamente en el ventrículo izquierdo de ratones. Los paneles del lado izquierdo muestran que las lesiones radiográficas son evidentes 10 días después de la administración de células C26-DCT y 28 días después de la administración de células MDA-MB-231. Los paneles del lado derecho muestran la prevención de la formación de lesiones después del tratamiento con metFc\DeltaC-OPG[22-194] (25 mg/kg) cada 3 días durante 10 días (para ratones C26-DCT) o 3 veces/semana durante 4 semanas (para ratones MDA-MB-231).

La Figura 10 muestra una reducción del número de focos osteolíticos radiográficamente evidentes dependiente de la dosis de metFc\DeltaC-OPG[22-194] en ratones inoculados con células C26-DCT.

Las Figuras 11A y 11B muestran la prevención y la reversión de la hipercalcemia asociadas con la malignidad en un modelo tumoral C26-DCT de ratón. En el estudio de prevención, se administró metFc\DeltaC-OPG[22-194] mediante inyección subcutánea diaria. En el estudio de reversión, se administró metFc\DeltaC-OPG[22-194] mediante una única inyección intravenosa. Los niveles medios de calcio en sangre \pm ETM.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona composiciones y métodos para la prevención y el tratamiento de la pérdida de hueso asociada con el cáncer. La presente invención también proporciona la prevención y el tratamiento del cáncer utilizando un agente anti-resorción ósea. Las composiciones y usos preferidos de la invención incluyen OPG y polipéptidos de fusión con OPG. Más concretamente, la presente invención hace referencia al uso de OPG y proteínas de fusión de OPG para la prevención y/o el tratamiento del cáncer o para la prevención y/o el tratamiento de la pérdida de hueso asociada con el cáncer.

Inesperadamente, se ha observado que la fusión de una región Fc con un polipéptido de OPG truncado demuestra ventajas que no se observan con los polipéptidos de OPG truncados no fusionados o con la OPG madura completa (donde la OPG madura completa tiene 380 aminoácidos, por ejemplo desde los restos 22 a 401 inclusive, como se muestra en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2). Adicionalmente se ha observado que la fusión de una región Fc al extremo carboxi de un polipéptido de OPG proporciona ventajas inesperadas en comparación con la fusión de una región Fc al extremo amino de un polipéptido de OPG. Por consiguiente, las proteínas de fusión de OPG, y las variantes, fragmentos y derivados de las mismas, así como los métodos de uso y preparación relacionados, se describen con más detalle más abajo.

El término "OPG" o "polipéptido de OPG" hace referencia a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) y los polipéptidos relacionados descritos en la presente memoria. Los polipéptidos relacionados incluyen variantes alélicas; variantes de empalme; fragmentos; derivados; varintes por sustitución, deleción e inserción; polipéptidos de fusión; y homólogos no humanos. Los polipéptidos de OPG pueden ser polipéptidos maduros, como se define en la presente memoria, que pueden tener o no un resto metionina amino terminal, dependiendo del método de preparación.

El término "proteína de fusión de OPG" hace referencia a una proteína de OPG, o polipéptido de OPG que está unido a un péptido o polipéptido heterólogo. Las proteínas de fusión de OPG de la invención pueden ser preparadas mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica, tal como fusión genética o química de OPG y los radicales peptídicos o polipeptídicos heterólogos. En una realización de la invención, el péptido o polipéptido heterólogo es una región Fc de una inmunoglobulina, preferiblemente una inmunoglobulina humana. Un péptido o proteína heterólogos se pueden unir o bien al extremo amino o bien al extremo carboxi de un polipéptido de OPG.

El término "polipéptido de OPG maduro" o "polipéptido de fusión de OPG maduro" hace referencia a un polipéptido o a un polipéptido de fusión que carece de una secuencia líder y también puede incluir otras modificaciones tales como el procesamiento proteolítico del extremo amino (con o sin una secuencia líder) y/o del extremo carboxi, la escisión de un polipéptido más pequeño a partir de un precursor más grande, la glicosilación unida a N y/o unida a O, y similares.

El término "Fc" hace referencia a una molécula o secuencia que comprende la secuencia de una porción del anticuerpo que no se une al antígeno, ya sea en forma monomérica o multimérica. La fuente de inmunoglobulina original de un Fc es preferiblemente de origen humano y puede ser de cualquier isotipo, p. ej., IgG, IgA, IgM, IgE o IgD. Un método de preparación de una molécula Fc aislada implica la digestión de un anticuerpo con papaína para separar las porciones del anticuerpo que se unen al antígeno y no se unen al antígeno. Otro método de preparación de una molécula Fc aislada es la producción mediante expresión de ADN recombinante seguida de purificación de las moléculas Fc expresadas de ese modo. Una Fc completa consiste en las siguientes cadenas pesadas de IgG: C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3 donde las regiones C_{H}1 y C_{H}2 están típicamente conectadas por una región bisagra flexible. En una realización, una Fc tiene la secuencia de aminoácidos de IgG_{1}, tal como se muestra en la Figura 1. Los términos "proteína Fc", "secuencia Fc", "moléculas Fc", "región Fc" y "porción Fc" se aplican por tener el mismo significado que "Fc".

El término "fragmento" cuando se utiliza asociado con Fc o polipéptidos de OPG, o con polipéptidos de fusión de los mismos, hace referencia a un péptido o polipéptido que comprende menos de la longitud total de la secuencia de un Fc o polipéptido de OPG. Semejante fragmento de puede originar, por ejemplo, a partir de un truncamiento en el extremo amino, un truncamiento en el extremo carboxi, y/o una deleción interna de uno o varios restos de la secuencia de aminoácidos. La OPG o los fragmentos Fc pueden resultar del empalme alternativo de ARN o de la actividad proteasa in vivo.

El término "variante" cuando se utiliza asociado con Fc o polipéptidos de OPG, o con polipéptidos de fusión de los mismos, hace referencia a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene una o más sustituciones, deleciones, y/o adiciones en la secuencia de aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos de Fc o el polipéptido de OPG nativos. Las variantes pueden ser de origen natural o construidas artificialmente. Las variantes de la invención se pueden preparar a partir de las correspondientes moléculas de ácido nucleico que codifican dichas variantes, que tienen una secuencia de ADN que varía por consiguiente a partir de las secuencias de ADN para Fc o los polipéptidos de OPG nativos.

El término "derivado" cuando se utiliza asociado con Fc o los polipéptidos de OPG, o con los polipéptidos de fusión de los mismos, hace referencia a variantes de Fc o del polipéptido de OPG o fragmentos de los mismos, que han sido químicamente modificados, como por ejemplo, mediante anclaje covalente de uno o más polímeros, incluyendo, pero limitados a, polímeros solubles en agua, carbohidratos unidos a N o unidos a O, azúcares, fosfatos, y/o otras moléculas semejantes. Los derivados se modifican de una manera que es diferente de los Fc u OPG nativos, en el tipo o localización de las moléculas ancladas al polipéptido. Los derivados adicionales incluyen la deleción de uno o más grupos químicos anclados naturalmente a un Fc o polipéptido de OPG.

El término "fusión" hace referencia a la unión de diferentes segmentos de péptido o proteína donde los extremos unidos de los segmentos de péptido o proteína pueden estar directamente adyacentes entre sí o pueden estar separados por radicales conectores o espaciadores tales como restos aminoácido u otros grupos conectores. Una fusión puede obtenerse mediante medios genéticos o químicos utilizando procedimientos disponibles para los expertos en la técnica aunque los medios de unión no están limitados a los descritos en la presente memoria.

Polipéptidos

El uso según la invención proporciona polipéptidos de fusión de OPG y composiciones de los mismos, y más concretamente proporciona polipéptidos de fusión que comprenden OPG y radicales Fc. Las fusiones de una región Fc con un polipéptido de OPG se puede realizar en el extremo amino de OPG, esto es, el extremo carboxi de una región Fc se fusiona con el extremo amino de la OPG. Estas proteínas de fusión (y los ácidos nucleicos que las codifican) son denominados en la presente memoria FcOPG. También puede ser deseable fusionar el extremo carboxi de la OPG con el extremo amino de una región Fc. Estas proteínas de fusión (y los ácidos nucleicos que las codifican) son denominados en la presente memoria OPGFc.

Un Fc, o una variante, fragmento o derivado del mismo, puede ser de una clase de inmunoglobulina (Ig). En una realización, un Fc es de la clase IgG, tal como IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, e IgG_{4}. En otra realización, un Fc es de IgG_{1}. Un Fc también puede comprender restos aminoácido representados por una combinación de dos o más cualesquiera de las clases de IgG, tales como los restos de IgG_{1} e IgG_{2}, o de IgG_{1}, IgG_{2} e IgG_{3}, etcétera. En una realización, una región Fc de una proteína de fusión de OPG tiene la secuencia mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) que comprende las regiones bisagra C_{H}2 y C_{H}3 de la IgG_{1} humana. (Véase Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10, 4071-4079 (1982).

Además de las variaciones de origen natural en las regiones Fc, las variantes, fragmentos y derivados de Fc pueden contener cambios de origen no natural en Fc que están construidos, por ejemplo, introduciendo sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de restos o secuencias en la Fc nativa o de origen natural, o modificando la porción Fc mediante modificación química y similares. En general, las variantes fragmentos y derivados de Fc, se preparan de manera que se conserve en gran parte el aumento de la vida media circulante de las fusiones de Fc a OPG.

Asimismo se proporcionan mediante el uso de la invención variantes de Fc y OPG con sustituciones de aminoácidos conservativas. El término "sustitución de aminoácidos conservativa" hace referencia a una sustitución de un resto aminoácido nativo por un resto no nativo de manera que haya un efecto pequeño o nulo sobre la polaridad o la carga del resto aminoácido en esa posición. Por ejemplo, una sustitución conservativa resulta del reemplazo de un resto no polar de un polipéptido por cualquier otro resto no polar. Las reglas generales para las sustituciones de aminoácidos conservativas se exponen en la Tabla I.

TABLA I Sustituciones de Aminoácidos Conservativas

1

Las sustituciones de aminoácidos conservativas también abarcan restos aminoácido de origen no natural que se incorporan típicamente mediante síntesis química de péptidos en lugar de síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos, y otras formas reversas o inversas de radicales aminoácido. Se espera que las modificaciones conservativas de la secuencia de aminoácidos (y las correspondientes modificaciones de los nucleótidos codificantes) produzcan moléculas de Fc y OPG (y proteínas de fusión de OPG) que tengan características funcionales similares a las de las proteínas Fc, OPG y proteínas de fusión de OPG no modificadas.

Además de las sustituciones mostradas en la Tabla I, cualquier resto nativo de la región Fc o del polipéptido de OPG (o de la proteína de fusión FcOPG) también puede ser sustituido por alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis de barrido con alanina" (Cunningham et al., Science 244, 1081-1085 (1989)).

Las modificaciones sustanciales de las características funcionales y/o químicas de una Fc o un polipéptido de OPG (y una proteína de fusión de OPG) se pueden obtener seleccionando las sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto molecular en la zona de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o carácter hidrófobo de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se pueden dividir en grupos basados en las propiedades comunes de las cadenas laterales:

1): hidrófobas: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2): hidrófilas neutras: Cys, Ser, Thr;

3): ácidas: Asp, Glu;

4): alcalinas: Asn Gln, His, Lys, Arg;

5): restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

6): aromáticas: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el cambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Tales restos sustituidos pueden ser introducidos en regiones de una molécula Fc o de OPG que sean homólogas a Fc u OPG no humana, o en regiones no homólogas de la molécula.

Los restos cisteína de las moléculas de Fc pueden ser suprimidos o remplazados por otros aminoácidos para evitar la formación de entrecruzamientos disulfuro. En particular, un resto cisteína de la posición 5 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) puede ser sustituido por uno o más aminoácidos, tales como alanina o serina. Alternativamente, el resto cisteína de la posición 5 podría ser suprimido.

Se puede preparar un fragmento de Fc mediante deleción de uno o más aminoácidos en cualquiera de las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5 como se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1). En una molécula de Fc, Fc\DeltaC, los restos aminoácido de las posiciones 1-5 inclusive son suprimidos. También se pueden realizar sustituciones en estas posiciones y están dentro del alcance de esta invención.

También se pueden elaborar variantes de Fc que muestran una reducción de la unión a los receptores de Fc que desencadenan las funciones efectoras tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la activación del complemento. Tales variantes pueden incluir leucina en la posición 20 suprimida o sustituida por un resto glutamina, glutamato en la posición 103 suprimido o sustituido por un resto alanina, y lisinas en las posiciones 105 y 107 suprimidas o sustituidas por restos alanina (siguiendo la numeración mostrada en la Figura 1). Se contemplan una o más de estas sustituciones.

En una realización, las variantes de Fc mostrarán una unión más fuerte para el receptor FcRn ("receptor de recuperación") y una vida media en la circulación más larga para la Fc nativa. Los ejemplos de tales variantes incluyen sustituciones de aminoácidos en uno o más de los restos 33, 35-42, 59, 72, 75, 77, 95-98, 101, 172-174, 215 y 220-223 como se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), donde una o más sustituciones confieren una unión más íntima de una variante de Fc para el receptor FcRn.

Otras variantes de Fc incluyen uno o más restos tirosina reemplazados, por ejemplo, por restos fenilalanina. Además, también se contemplan otras inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos variantes y están dentro del alcance del uso de la presente invención. Los ejemplos incluyen las variantes de Fc descritas en WO96/32478 y WO97/34630. Además, las alteraciones pueden ser en forma de aminoácidos alterados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos.

Una proteína de Fc también puede estar conectada a un radical de OPG del polipéptido de fusión de OPG por medio de radicales espaciadores o conectores. Tales espaciadores o conectores pueden ser proteináceos ya que comprenden uno o más aminoácidos o pueden ser conectores químicos. Tales conectores químicos son bien conocidos en la técnica. Las secuencias de aminoácidos conectoras pueden incluir pero no están limitadas a:

(a): ala-ala-ala;

(b): ala-ala-ala-ala;

(c): ala-ala-ala-ala-ala;

(d): gly-gly;

(e): gly-gly-gly;

(f): gly-gly-gly-gly-gly;

(g): gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

(h): gly-pro-gly;

(i): gly-gly-pro-gly-gly;

(j): val;

(k): ser-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

(l): gly-gly-ser-gly-ser-gly-ala-gly-ser-gly-ser-gly-gly-ser-gly-gly;

(m): un radical químico; y

(n): cualquier combinación de subpartes de (a) a (m).

La presente invención también proporciona variantes, fragmentos y derivados de OPG y son generalmente como se ha descrito antes para las moléculas de Fc, con la excepción de las localizaciones específicas de los restos aminoácido modificados. Las variantes, fragmentos y derivados de OPG están descritos en PCT WO97/23614.

En una realización preferida, el radical OPG de una proteína de fusión de OPG es una forma truncada carboxi terminal de OPG. Las formas truncadas carboxi terminales de OPG tienen uno o más aminoácidos de las posiciones 186-401 suprimidos como se muestra en la Figura 2. Por ejemplo, los truncamientos de OPG comprenden la secuencia de aminoácidos 22-X donde X es cualquier resto del 185 al 400 inclusive. En otra realización, los truncamientos de OPG comprende la secuencia de aminoácidos 22-X donde X es cualquier resto del 185 al 278 inclusive, o del 185 al 293 inclusive, o alernativamente del 194 al 278 inclusive, o del 194 al 293 inclusive. Las proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos truncados de OPG descritos en la presente memoria abarcan la unión de la OPG y los radicales peptídico o polipeptídico heterólogos directamente o a través de una molécula espaciadora o conectora donde el espaciador o conector comprende opcionalmente uno o más restos aminoácido. Las variantes y derivados de las formas de OPG truncadas descritas en la presente memoria también están abarcados por la
invención.

Las proteínas de fusión preferidas del uso de la presente invención incluyen aquellas en las que el radical OPG comprende la secuencia de aminoácidos 22-X donde X es cualquier resto desde las posiciones 194 a 201 inclusive utilizando la numeración mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2). Los ejemplos de tales proteínas de fusión incluyen los siguientes:

OPG [22-194]-Fc: (Figura 3 y SEQ ID NO: 3)

OPG [22-201]-Fc: (Figura 4 y SEQ ID NO: 4)

OPG [22-194]-Fc\DeltaC: (Figura 5 y SEQ ID NO: 5)

OPG [22-201]-Fc\DeltaC: (Figura 6 y SEQ ID NO: 6)

OPG [22-194]-FcG_{10}: (Figura 7 y SEQ ID NO: 7)

Fc\DeltaC-OPG [22-194]: (Figura 8 y SEQ ID NO: 8)

Para los polipéptidos preferidos, el término "Fc" hace referencia a la secuencia de la IgG_{1} humana mostrada en la Figura 1, el término "fc\DeltaC" hace referencia a la secuencia mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) que carece de los restos aminoácido 1-5 inclusive, y el término "FcG_{10}" hace referencia a un radical Fc que carece de los restos aminoácido 1-9 inclusive, y que tiene un conector ser-(gly)_{8}.

Moléculas de ácido nucleico

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de OPG de la invención, o las variantes, fragmentos o derivados de las mismas. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser producidas mediante tecnología de ADN recombinante conocida por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, N.Y. (1989)), y Ausubel et al., (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley y Sons, N.Y. (1994)), para las descripciones de las técnicas de mutagénesis. También se puede utilizar la síntesis química utilizando los métodos descritos por Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed. 28, 716-734 (1989)), para preparar tales variantes. También se pueden utilizar otros métodos para preparar moléculas de ácido nucleico conocidas por los expertos en la técnica.

En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico codifican variantes de la proteína de fusión de OPG con sustituciones de aminoácidos conservativas como se ha definido antes. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservativas se realizan en una OPG y/o en un radical Fc de una proteína de fusión. Asimismo se proporcionan variantes de Fc u OPG que comprenden una adición y/o deleción de uno o más sitios de glicosilación unidos a N o unidos a O, o que comprenden fragmentos polipeptídicos de Fc u OPG como se ha descrito antes. Se entiende que las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden codificar cualquier combinación de variantes, fragmentos, y polipéptidos de fusión de Fc y/o OPG descritos en la presente memoria.

En otra realización, los ácidos nucleicos de la invención contienen codones que tienen la expresión óptima de un polipéptido de fusión de OPG alterada en una célula anfitriona dada. Las alteraciones concretas de los codones dependerán del polipéptido o los polipéptidos de fusión de OPG y de la célula o las células anfitrionas seleccionadas para la expresión. Semejante "optimización de codones" se puede llevar a cabo mediante una variedad de métodos, por ejemplo, seleccionando codones que son preferidos para su uso en los genes altamente expresados en una célula anfitriona dada. Se pueden utilizar los algoritmos por ordenador que incorporan tablas de frecuencia de codones tales como "Ecohigh. Cod" para la preferencia de codones de genes bacterianos altamente expresados y son proporcionados por la University of Wisconsin Package versión 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI. Otras tablas de frecuencia de codones útiles incluyen "Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod", "Drosophila_high.cod", "Human_high.cod", "Maize_high.cod", y "Yeast_high.cod".

Vectores y Células Anfitrionas

Se inserta una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de OPG en un vector de expresión apropiado utilizando técnicas de ligadura normalizadas. El vector se selecciona típicamente para que sea funcional en la célula anfitriona concreta empleada (esto es, el vector sea compatible con la maquinaria de la célula anfitriona de manera que se puedan producir la amplificación del gen y/o la expresión del gen). Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína OPG puede ser amplificada/expresada en células anfitrionas procarióticas, de levadura, de insectos (sistemas de baculovirus) y/o eucarióticas. La selección de la célula anfitriona dependerá de si la proteína OPG va a ser modificada post-traduccionalmente (p. ej., glicosilada y/o fosforilada). Si es así, son preferibles las células anfitrionas de levadura, insecto, o mamífero.

Típicamente, los vectores de expresión utilizados en cualquiera de las células anfitrionas contendrán secuencias para el mantenimiento de plásmidos y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, referidas colectivamente como "secuencias contiguas" incluirán típicamente en ciertas realizaciones uno o más de los siguientes nucleótidos: un promotor, una o más secuencias intensificadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia intrónica completa que contiene un sitio de empalme del donador y el aceptor, una secuencia líder para la secreción, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región poliligadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se va a expresar, y un elemento marcador seleccionable.

Las secuencias contiguas pueden ser homólogas (esto es, de la misma especie y/o cepa que la célula anfitriona), heterólogas (esto es, de una especie distinta de la especie o cepa de la célula anfitriona), híbridas (esto es, una combinación de secuencias contiguas de más de una fuente), o sintéticas, o secuencias nativas que normalmente funcionan para regular la expresión de la proteína OPG y/o Fc. Como tal, la fuente de secuencias contiguas puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que las secuencias contiguas sean funcionales, y puedan ser activadas por la maquinaria de la célula anfitriona.

Se puede utilizar una secuencia líder, o señal para dirigir un polipéptido de fusión de OPG fuera de la célula anfitriona. La secuencia señal está situada muy comúnmente directamente en el extremo 5' de una región codificadora de un polipéptido de fusión de OPG. Se han identificado muchas secuencias señal, y cualquiera de ellas que sea funcional en la célula anfitriona seleccionada puede ser utilizada junto con secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión de OPG. Por ejemplo, una secuencia señal puede ser homóloga (de origen natural) o heteróloga para el gen o el ADNc de OPG o Fc. Adicionalmente se puede sintetizar químicamente una secuencia señal utilizando los métodos expuestos antes. En la mayoría de los casos, la secreción de un polipéptido de OPG desde la célula anfitriona por medio de la presencia de un péptido señal dará como resultado la separación del péptido señal del polipéptido de fusión.

La secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN de OPG que se inserta en el vector. Por ejemplo, el ADN de OPG codifica una secuencia señal en el extremo amino de la proteína que es escindido durante el procesamiento post-traduccional de la molécula para formar la proteína madura (véase la Figura 2). Están incluidos en el alcance de esta invención los nucleótidos de OPG con la secuencia señal nativa así como los nucleótidos de OPG en los que la secuencia señal nativa es suprimida y reemplazada por una secuencia señal heteróloga. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser una que sea reconocida y procesada, esto es, escindida por una peptidasa señal, por la célula anfitriona. En una realización, una secuencia señal heteróloga es la secuencia señal de OPG descrita en WO97/23614. Para las células anfitrionas procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia señal nativa de OPG, la secuencia señal es sustituida por una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de los líderes de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, o la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal de OPG nativa pueden ser sustituida por los líderes de la invertasa de levadura, el factor alfa, o la fosfatasa ácida. En la expresión en células de mamífero la secuencia señal nativa es satisfactoria, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias señal de mamífero.

Los vectores preferidos para poner en práctica esta invención son aquellos que son compatibles con células anfitrionas de bacterias, insectos, y mamíferos. Tales vectores incluyen, entre otros, pCRII, pCR3, y pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA), pET15b (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII; Invitrogen), pDSR\alpha2 (Publicación PCT Núm. WO90/14363) y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY).

Los posibles vectores adicionales incluyen, pero no están limitados a, cósmidos, plásmidos o virus modificados, pero el sistema vector debe ser compatible con la célula anfitriona seleccionada. Tales vectores incluyen, pero no están limitados a plásmidos tales como los derivados del plásmido pBluescript (un fagémido basado en ColE1 de elevado número de copias, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla CA), plásmidos de clonación de PCR diseñados para clonar los productos de la PCR amplificados mediante Taq (p. ej., TOPO^{TM} TA Cloning® Kit, derivados plasmídicos PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA), y vectores de mamíferos, levaduras o virus tales como un sistema de expresión de baculovirus (derivados plasmídicos pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA). Las moléculas recombinantes pueden ser introducidas en células anfitrionas por medio de transformación, transfección, infección, electroporación, u otras técnicas conocidas. Una vez construido el vector e insertada la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión de OPG en el sitio apropiado del vector, se puede insertar el vector completo en una célula anfitriona adecuada para la amplificación y/o la expresión del polipéptido.

Las células anfitrionas pueden ser células anfitrionas procarióticas (tales como E. coli) o células anfitrionas eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de vertebrado). La célula anfitriona, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, sintetiza un polipéptido de OPG que puede ser recogido con posterioridad del medio de cultivo (si la célula anfitriona la secreta al medio) o directamente de la célula anfitriona que la produce (si esta no es secretada). La selección de una célula anfitriona apropiada dependerá de diversos factores, tales como los niveles de expresión deseados, las modificaciones polipeptídicas que son deseables o necesarias para la actividad, tales como glicosilación o fosforilación, y la facilidad de plegamiento en una molécula biológicamente activa.

Las células anfitrionas o las líneas celulares adecuadas pueden ser células de mamíferos, tales como las células de ovario de hámster Chino (CHO) (ATCC núm. CCL61 y Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)), células de riñón embrionarias humanas (HEK) 293 o células 293T (ATCC núm. CRL1573), o células 3T3 (ATCC núm. CRL1658). La selección de las células anfitrionas de mamífero adecuadas y los métodos de transformación, cultivo, amplificación, escrutinio y producción de producto son conocidos en la técnica. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas, son las líneas celulares COS-1 y COS-7 de mono (ATCC núm. CRL1651), y la línea celular CV-1 (ATCC núm. CCL70). Las células anfitrionas de mamífero ilustrativas adicionales incluyen líneas celulares de primate y líneas celulares de roedor, incluyendo las líneas celulares transformadas. Las células diploides normales, las cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, así como los explantes primarios, también son adecuados. Las células candidatas pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección de acción dominante. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen pero no están limitadas a, células N2A de neuroblastoma de ratón, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, líneas celulares de hámster BHK o HaK. Cada una de estas líneas celulares es conocida y asequible para los expertos en la técnica.

Como células anfitrionas similarmente útiles para la presente invención están las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (p. ej., HB101, DH5a, DH10, y MC1061) son bien conocidas como células anfitrionas en el campo de la biotecnología. También se pueden emplear en este método las diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas sp., otros Bacillus sp., Streptomyces sp., y similares.

Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica también están disponibles como células anfitrionas para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Las células de levadura preferidas incluyen, por ejemplo Saccharomyces cerivisae.

Adicionalmente, cuando se desea, se pueden utilizar sistemas de células de insectos en los métodos de la presente invención. Tales sistemas los describen por ejemplo Kitts et al. (Biotechniques, 14, 810-817 (1993)), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4, 564-572 (1993)) y Lucklow et al. (J. Virol., 67, 4566-4579 (1993)). Las células de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

La transformación o la transfección de un vector de expresión para un polipéptido de OPG en una célula anfitriona seleccionada se puede lograr mediante métodos bien conocidos incluyendo métodos tales como el método del cloruro de calcio, de electroporación, de microinyección, de lipofección o de DEAE-dextrano. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula anfitriona que se vaya a utilizar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el experto en la técnica, y se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al., supra.

Producción del Polipéptido

Las células anfitrionas que comprenden por transformación o transfección un vector de expresión que codifica un polipéptido de fusión de OPG pueden ser cultivadas utilizando medios normalizados conocidos por los expertos en la técnica. Los medios contendrán normalmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivar células de E. coli son por ejemplo Caldo Luria (LB) y/o Caldo "Terrífic" (TB). Los medios adecuados para cultivar células eucarióticas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden tener un suplemento de suero y/o factores de crecimiento según requiera la línea celular concreta que se esté cultivando. Un medio adecuado para los cultivos de insecto es el medio de Grace con un suplemento de Yeastolate, producto hidrolizado de lactolabúmina, y/o suero de ternera fetal según se necesite (Gibco Life Technologies, Gaithersburg, MD).

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Típicamente, se añade al medio un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de células transfectadas o transformadas como suplemento. El compuesto que se va a utilizar estará dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual se transformó la célula anfitriona. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es de resistencia a la kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será la kanamicina: cuando el elemento marcador seleccionable es de resistencia a la ampicilina, el compuesto añadido al medio de cultivo será la ampicilina.

La cantidad de polipéptido de fusión de OPG producido por una célula anfitriona puede ser evaluada utilizando métodos normalizados conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis de transferencia Western, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación mediante HPLC, inmunoprecipitación, y/o análisis de actividad tales como análisis de retraso en gel de la unión del ADN.

Cuando se prepara un polipéptido de fusión de OPG sin una etiqueta anclada, y no se encuentran disponibles anticuerpos, se pueden utilizar otros procedimientos conocidos para la purificación. Tales procedimientos incluyen, sin limitación, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de tamiz molecular, la HPLC, la electroforesis en gel nativa combinada con la elución en gel, y el isoelectroenfoque preparativo ("Isoprime" máquina/técnica, Hoefer Scientific). En algunos casos, se pueden combinar dos o más de estas técnicas para lograr el aumento de pureza deseado.

Si un polipéptido de fusión de OPG es producido intracelularmente, el material intracelular (incluyendo los cuerpos de inclusión de las bacterias gram-negativas) puede ser extraído de la célula anfitriona utilizando cualquier mecanismo normalizado conocido por el artesano experto. Por ejemplo, las células anfitrionas pueden ser lisadas para liberar el contenido del periplasma/citoplasma mediante una prensa French, homogeneización, y/o sonicación seguido de centrifugación.

Si un polipéptido de fusión de OPG ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión se pueden unir a menudo a las membranas celulares interna y/o externa y de este modo se encontrarán principalmente en el material sedimentado después de la centrifugación. El material sedimentado se puede tratar después a pH extremos o con un agente caotrópico tal como detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea, o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris-carboxietilfosfina a pH ácido para liberar, separar, y solubilizar los cuerpos de inclusión. Un polipéptido de fusión de OPG ahora en su forma soluble se puede analizar después utilizando la electroforesis en gel, la inmunoprecipitación o similar. Si se desea aislar un polipéptido de OPG, el aislamiento se puede completar utilizando métodos normalizados tales como los expuestos más abajo por Marston et al. (Meth. Enz., 182, 264-275 (1990)).

En algunos casos, un polipéptido de fusión de OPG puede no ser biológicamente activo tras el aislamiento. Se pueden utilizar diversos métodos para "replegar" o convertir el polipéptido a su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro, para restaurar la actividad biológica. Tales métodos incluyen exponer el polipéptido solubilizado a un pH normalmente superior a 7 y en presencia de una concentración concreta de un caotropo. La selección del caotropo es muy similar a las elecciones utilizadas para la solubilización de los cuerpos de inclusión, pero normalmente se utiliza el caotropo a una concentración inferior y no es necesariamente el mismo que los caotropos utilizados para la solubilización. En la mayoría de los casos la solución de replegamiento/oxidación también contendrá un agente reductor o el agente reductor más su forma oxidada a una razón específica para generar un potencial rédox concreto que permita que se produzca el barajado "shuffling" del disulfuro en la formación de los puentes de cisteína de la proteína. Algunos de los pares rédox comúnmente utilizados incluyen cisteína/cistamina, glutatión (GSH)/ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol(DTT)/ditian DTT, y 2-mercaptoetanol(\betaME)/ditio-\beta(ME). En muchos casos, se puede utilizar un co-disolvente o puede ser necesario para incrementar la eficacia del replegamiento y los reactivos más comunes
utilizados para este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, arginina y similares.

Derivados

Las presentes proteínas de fusión de OPG, y las variantes y fragmentos de las mismas, son transformadas mediante el anclaje de uno o más radicales químicos. Como ejemplo, una fusión de OPG y un polipéptido Fc pueden ser transformados o bien en el radical OPG o bien en el Fc, o en ambos. Estos derivados modificados químicamente pueden ser formulados adicionalmente para la administración intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intravenosa, oral, nasal, pulmonar, tópica u otras rutas de administración como se comenta más abajo. Se ha encontrado que la modificación química de proteínas biológicamente activas proporciona ventajas adicionales en ciertas circunstancias, tales como el incremento de la estabilidad y el tiempo de circulación de la proteína terapéutica y la disminución de la inmunogenicidad. Véase, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.179.337. Para una revisión, véase Abuchowski et al., en Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg y J. Roberts, eds. págs. 367-383 (1981)); Francis et al., supra.

Los radicales químicos adecuados para semejante transformación se pueden seleccionar entre diversos polímeros solubles en agua. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar el polímero deseado basándose en consideraciones tales como si el polímero será utilizado terapéuticamente, o si lo es, la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteolisis, y otras consideraciones. Para las proteínas de la presente invención, se puede lograr la eficacia de la transformación administrando el derivado, en la forma deseada (es decir, mediante una bomba osmótica, o, más preferiblemente, mediante inyección o infusión, o, adicionalmente formulada para la liberación oral, pulmonar o nasal, por ejemplo), y observando los efectos biológicos descritos en la presente memoria.

El polímero soluble en agua se puede seleccionar del grupo que consiste, por ejemplo, en polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sean homopolímeros o copolímeros al azar), y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno, polioles polietoxilados y poli(alcohol vinílico). El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. Asimismo, se pueden utilizar también succinato y estireno. Además, se pueden seleccionar poliaminoácidos del grupo que consiste en seralbúmina (tal como seralbúmina humana), u otros poliaminoácidos, p. ej. lisinas.

El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, del peso molecular establecido) para facilitar la manipulación y fabricación.

El número de moléculas de polímero ancladas de ese modo a un polipéptido de fusión de OPG puede variar, y un experto en la técnica será capaz de averiguar el efecto sobre la función. Se puede mono-transformar, o se puede proporcionar una di-, tri-, tetra- o alguna combinación de transformaciones con los mismos radicales químicos o radicales químicos diferentes (p. ej., polímeros, tales como diferentes pesos de polietilenglicoles). La proporción de moléculas de polímero con respecto a las moléculas de proteína (o péptido) variará, como lo hará su concentración en la mezcla de reacción. En general, la razón óptima (en términos de eficacia de la reacción es aquella que no excede la proteína o el polímero que no ha reaccionado) se determinará mediante factores tales como el grado de transformación deseado (p. ej., mono, di-, tri-, etc.), del peso molecular del polímero seleccionado, de si el polímero es ramificado o no ramificado, y de las condiciones de reacción.

Los radicales químicos deben estar anclados a una proteína de fusión de OPG considerando los efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Existen numerosos métodos de anclaje disponibles para los expertos en la técnica (EP 0401384 (acoplamiento de PEG a G-CSF); Malik et al., Exp. Hematol. 20, 1028-1035 (1992) (que informa de la pegilación de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo)). Por ejemplo, se puede unir el polietilenglicol covalentemente a través de restos aminoácido que tienen un grupo amino libre (p. ej., lisina, arginina, o el resto aminoácido N-terminal) o un grupo carboxilo (p. ej., ácido áspartico, ácido glutámico, y el resto aminoácido C-terminal). También se pueden utilizar restos aminoácido que tienen un grupo sulfhidrilo libre (p. ej., cisteína). Para los fines terapéuticos se prefiere el anclaje a un grupo amino, tal como el anclaje al extremo N o al grupo lisina. El anclaje a los restos importantes para la unión al receptor debe ser evitado si se desea la unión al receptor.

Se puede desear específicamente modificar la proteína de fusión de OPG químicamente N-terminalmente. Utilizando el polietilenglicol como ejemplo de radical químico, se puede obtener una preparación de polipéptido de fusión de OPG N-terminalmente pegilado tranformando sustancialmente el polipéptido en los grupos amino libres y separando el material N-terminalmente pegilado de la población de moléculas de proteína pegiladas. Alternativamente, se puede lograr una modificación química N-terminal selectiva mediante alquilación reductiva que explota la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina versus el N-terminal) disponibles para la transformación de una proteína concreta. En condiciones de reacción apropiadas, se obtiene la transformación sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N con un polímero que contiene grupos carbonilo. Se puede utilizar polietilenglicol propionaldehído, que contiene un único aldehído reactivo.

Se prefiere un derivado N-terminalmente pegilado para facilitar la producción de un agente terapéutico. La pegilación N-terminal asegura un producto homogéneo ya que la caracterización del producto se simplifica con relación a los productos di-, tri- u otros productos multi-pegilados. Se prefiere el uso del procedimiento de alquilación reductiva anterior para la preparación de un producto N-terminal en la fabricación comercial.

Usos de los polipéptidos

Los polipéptidos de fusión de la invención se utilizan para preparar medicamentos para la prevención y/o el tratamiento de la pérdida de masa ósea asociada con el cáncer en un mamífero, tal como la prevención y/o el tratamiento de la reposición de hueso estructuralmente sano con hueso desorganizado; o en la prevención de la metástasis en los huesos. La pérdida de hueso se manifiesta en una variedad de afecciones incluyendo las siguientes: Hipercalcemia resultante de tumores sólidos (mama, pulmón y riñón) y malignidades hematológicas (mieloma múltiple y metástasis osteolítica). La reposición de hueso estructuralmente sano con hueso incompetente desorganizado se observa en las metástasis de hueso osteoescleróticas.

En una realización de la invención, los polipéptidos de fusión de OPG de la invención, en virtud del incremento de actividad y de vida media circulante, se utilizan ventajosamente para preparar medicamentos para tratar la pérdida de hueso resultante de la destrucción osteolítica del hueso causada por tumores malignos o metastásicos. Los polipéptidos de OPG de la invención se pueden utilizar para tratar la pérdida de hueso asociada con los cánceres de mama, próstata, tiroides, riñón, pulmón, esófago, recto, vejiga, cérvix, ovario e hígado así como el cáncer del tracto gastrointestinal. También está incluida la pérdida de hueso asociada con ciertas malignidades hematológicas tales como el mieloma múltiple.

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Las proteínas de fusión de OPG de la invención se van a administrar solas o combinadas con otros agentes terapéuticos, en particular, combinadas con otros agentes terapéuticos para el cáncer. Tales agentes incluyen generalmente la terapia por radiación o la quimioterapia. La quimioterapia puede implicar un tratamiento con uno o más de los siguientes: antraciclinas, taxol, tamoxifeno, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, y otros fármacos conocidos por el trabajador experto. En una realización, el agente terapéutico para el cáncer es un antagonista de la hormona de liberación de la hormona luteinizante (LHRH) que comprende la siguiente estructura:

A-B-C-D-E-F-G-H-I-J

donde

A es piro-glu, Ac-D-Nal, Ac-D-Qal; Ac-Sar, o Ac-D-Pal;

B es His o 4-Cl-D-Phe;

C es Trp, D-Pal, D-Nal, L-Nal-D-Pal(N-O), o D-Trp;

D es Ser;

E es N-Me-Ala, Tyr, N-Me-Tyr, Ser, Lys(iPr), 4-Cl-Phe, His, Asn, Met, Ala, Arg o Ile;

F es

3

donde

R y X son independientemente, H y alquilo; e Y comprende una pequeña entidad polar.

G es Leu o Trp;

H es Lys(iPr), Gln, Met, o Arg;

I es Pro; and

J es Gly-NH2 o D-Ala-NH2;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otra realización, un antagonista de LHRH comprende el péptido:

N-Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2.

En la presente memoria se utilizan las abreviaturas y convenciones normalizadas y los siguientes restos no normalizados se abrevian como sigue:

Nal: 3-(2-naftil)alaninilo

4-Cl-Phe: (4'-clorofenil)alaninilo

Pal: 3-(3'-piridil)alaninilo

Pal(N-O): 3-(3'-piridino-N-oxido)alaninilo

iPr-Lys: N-epsilon-2-propil-lisinilo

Qal: 3-(2'-quinolinil)alaninilo

Las formas alternativas de los decapéptidos antagonistas de LHRH también son abarcadas por la presente invención. Tales decapéptidos se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.843.901.

También están incluidos los anticuerpos terapéuticos incluyendo los anticuerpos de ratón, híbridos de ratón-humano, injertados en CDR, humanizados o completamente humanizados, o los anticuerpos sintéticos tales como aquellos seleccionados mediante escrutinio de genotecas de anticuerpos. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen aquellos que se unen a las proteínas de la superficie celular Her2, CDC20, CDC33, glicoproteína de tipo mucina y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) presente en las células tumorales y opcionalmente inducen un efecto cistostático y/o citotóxico sobre las células tumorales que presentan estas proteínas. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen HERCEPTIN para el tratamiento del cáncer de mama y RITUXAN para el tratamiento del linfoma no-Hodgkin. También están incluidos como agentes para la terapia del cáncer polipéptidos que inducen selectivamente la apoptosis en las células tumorales, tales como el polipéptido relacionado con TNF TRAIL. Las proteínas de fusión de OPG se pueden administrar antes, durante, o después del tratamiento con un agente para la terapia del cáncer. Las proteínas de fusión de OPG se pueden administrar profilácticamente para evitar o mitigar el comienzo de la pérdida ósea por cáncer metastásico o se pueden administrar para el tratamiento de una afección existente de pérdida de hueso debida a metástasis.

Los polipéptidos de fusión de OPG de la invención se pueden utilizar para preparar medicamentos para evitar y/o tratar la pérdida de hueso asociada con el mieloma múltiple o para prevenir y/o tratar la propia enfermedad. El mieloma múltiple es un tumor derivado de las células B que produce una morbilidad y una mortalidad significativas. La manifestación clínica común más sorprendente es la pérdida de hueso focal debida a un incremento de la activación de los osteoclastos en regiones localizadas. La mayoría de los pacientes con mieloma (\sim95%) se presenta normalmente con lesiones óseas destructivas visibles mediante análisis radiológico, y padecen un dolor esquelético extremo, intratable. Los pacientes con mieloma son particularmente susceptibles a fracturas patológicas del hueso implicado, que se producen o bien espontáneamente o bien debido a una lesión trivial. Las lesiones esqueléticas que se producen durante el mieloma no solamente conducen a fracturas óseas, sino también a la deformidad y ocasionalmente a la compresión de los nervios, particularmente en la columna vertebral. En algunos pacientes, se produce un incremento patológico del calcio en suero (hipercalcemia), y puede ocasionar problemas significativos durante el tratamiento de la enfermedad. La OPG puede ser administrada a los pacientes para bloquear la resorción ósea y la liberación de calcio, reduciendo de ese modo el riesgo de fracturas y deformidad espinal.

Las células de mieloma no participan directamente en la destrucción ósea, pero en lugar de eso producen señales extracelulares que conduce a la diferenciación y activación de los osteoclastos. Los osteoclatos a su vez producen los niveles más altos de citocina IL-6 potente de todos los tipos de células del organismo, concretamente cuando se activan. La IL-6 es un factor de crecimiento de las células B, y es requerida para el crecimiento de células de mieloma tanto murinas como humanas in vitro. Un ligando de la proteína OPG relacionada con el TNF (OPGL) es responsable de la inducción de la diferenciación y activación de los osteoclastos (Véase WO98/46751). Las células de mieloma pueden producir directa o indirectamente este factor para los osteoclastos, dando como resultado la lisis ósea local circundando las células de mieloma embebidas en los espacios de la médula ósea. Los osteoclastos normales adyacentes a la célula de mieloma producen a su vez IL-6, que conduce a la expansión local de las células tumorales. Las células de mieloma se expanden de una manera clónica y ocupan espacios óseos que están siendo creados por la resorción ósea inapropiada.

Se ha observado que la administración de OPG en roedores induce una muerte rápida de la población de osteoclastos. Una reducción de los osteoclastos eliminaría el incremento de la producción de IL-6 por los osteoclatos y afectaría al crecimiento y la supervivencia de las células de mieloma en el hueso trabecular. De este modo, el tratamiento con OPG en pacientes con mieloma no solamente bloquearía la hiper-resorción ósea, si no que también podría afectar a la expansión y supervivencia del propio tumor. Se sabe que las células B expresan el receptor de OPGL, referido como receptor de diferenciación y activación de osteoclastos u ODAR. Las células de mieloma también expresan ODAR, y además pueden producir OPGL. La expresión tanto de OPGL como de ODAR en la misma población celular puede crear un estímulo autocrino que afecta a la supervivencia de las células de mieloma. De este modo, el tratamiento con OPG podría afectar directamente a la supervivencia delas células tumorles, disminuyendo o eliminando de ese modo, la carga tumoral observada en los pacientes con mieloma.

Composiciones Farmacéuticas

El uso según la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de fusión de OPG, y variantes, fragmentos y derivados de las mismas. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser para la administración por inyección, o para la administración oral, pulmonar, nasal, transdérmica u otras formas de administración. En general, el uso según la invención da como resultado composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de una proteína de fusión de OPG junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, coadyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de OPG es una cantidad suficiente para reducir la velocidad y/o el grado de pérdida de hueso como se determina mediante los análisis y procedimientos descritos en la presente memoria.

Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen diluyentes de diverso contenido en tampón (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (p. ej., Tween 80, Polysorbate 80), anti-oxidantes (p. ej., ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (p. ej., Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias para conferir volumen (p. ej., lactosa, manitol); incorporación del material a preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), etc. o a liposomas. También se puede utilizar ácido hialurónico, y este puede tener el efecto de promover la duración prolongada en la circulación. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo, y la velocidad de aclaramiento in vivo de las presentes proteínas y derivados. Véase p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712. Las composiciones se pueden preparar en forma líquida, o pueden estar en polvo seco, por ejemplo en forma liofilizada. También se contemplan las formulaciones de liberación sostenida implantables, tales como las formulaciones transdérmicas.

Para su uso en la presente invención se contemplan formas de dosificación sólidas orales, que se describen generalmente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) en el Capítulo 89. Las formas de dosificación sólidas incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, trociscos o grageas, sellos o peletes. Asimismo, se puede utilizar una encapsulación liposomal o proteinoide para formular las presentes composiciones (como, por ejemplo, microesferas proteinoides referidas en la Patente de los Estados unidos Núm. 4.925.673). Se puede utilizar la encapsulación liposomal y se pueden transformar los liposomas con diversos polímeros (p. ej., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.013.556). Marshall, K. proporciona una descripción de las posibles formas de dosificación sólidas para agentes terapéuticos en: Modern Pharmaceutics Editado por G. S. Banker y C. T. Rhodes Capítulo 10, 1979. En general, la formulación incluirá una proteína de fusión de OPG, o una variante, fragmento o derivado de la misma, e ingredientes inertes que permitan la protección contra el entorno del estómago, y liberen el material biológicamente activo en el intestino.

Una proteína de fusión de OPG puede ser opcionalmente químicamente modificada de manera que la liberación oral del derivado sea eficaz. Generalmente, la modificación química contemplada es el anclaje de al menos un radical a la propia molécula de proteína (o péptido), donde dicho radical permita (a) la inhibición de la proteolisis; y (b) la absorción a la corriente sanguínea desde el estómago o el intestino. También se desea el incremento de la estabilidad global de la proteína y el incremento del tiempo de circulación en el organismo. Los ejemplos de tales radicales incluyen polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidona) y poliprolina. Abuchowski y Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts. En: "Enzymes as Drugs", Hocenberg y Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), págs. 367-383; Newmark, et al., J. Appl. Biochem. 4: 185-189 (1982). Otros polímeros que se podrían utilizar son el poli-1,3-dioxolano y el poli-1,3,6-tioxocano. Para uso farmacéutico, como se ha indicado antes, se prefieren los radicales de polietilenglicol.

Para asegurar la resistencia a la degradación en el estómago después de la administración oral, es esencial un recubrimiento impermeable a un pH de al menos 5. Los ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que se utilizan como recubrimientos entéricos para las formulaciones orales son el acetato trimelitato de celulosa (CAT), el ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), el HPMCP 50, el HPMCP 55, el poli(acetato ftalato de vinilo) (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, el acetato ftalato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S, y Shellac. Estos recubrimientos se pueden utilizar como películas mixtas.

Se puede incluir una proteína de fusión de OPG en una formulación en forma de productos multiparticulados finos en forma de gránulos o peletes de un tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La formulación del material para la administración de cápsulas también podría estar en forma de polvo, de tapones ligeramente comprimidos o incluso en forma de comprimidos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen diluyentes tales como carbohidratos, especialmente manitol, \alpha-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. También se pueden utilizar como cargas ciertas sales inorgánicas incluyendo trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes asequibles comercialmente son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.

Se pueden incluir disgregantes en las formulaciones de dosificaciones sólidas. Los materiales utilizados como disgregantes incluyen pero no están limitados a almidón incluyendo el disgregantes comercial con una base de almidón, Explotab. Se pueden utilizar sal de sodio de glicolato de almidón, Amberlite, sal de sodio de carboximetilcelulosa, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, piel de naranja, carboximetilcelulosa ácida, esponja natural y bentonita. Otras formas de disgregantes son las resinas de intercambio catiónico insolubles. Se pueden utilizar gomas pulverizadas como disgregantes y como aglutinantes y estos pueden incluir gomas pulverizadas tales como agar, Karaya o tragacanto. También son útiles como disgregantes el ácido algínico y su sal de sodio.

Se pueden utilizar aglutinantes para formar tabletas duras e incluir materiales de productos naturales tales como acacia, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). Se podrían utilizar polivinilpirrolidona (PVP) e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) ambas en soluciones alcohólicas para granular el agente terapéutico.

Los lubricantes que se pueden añadir a una formulación incluyen pero no están limitados a; ácido esteárico incluyendo sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. Asimismo se pueden utilizar lubricantes solubles tales como laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de diferentes pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.

Se podrían añadir antiapelmazantes que podrían mejorar las propiedades de flujo durante la formulación del fármaco y ayudar a la transposición durante la compresión. Los antiapelmazantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirogénica y silico aluminato hidratado.

Para ayudar a la disolución de una composición de una proteína de fusión de OPG, se podría añadir un tensioactivo como agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes aniónicos tales como laurilsulfato de sodio, dioctilsulfosuccinato de sodio y dioctilsulfonato de sodio. Se podrían utilizar detergentes catiónicos y podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de benzetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que se podrían incluir en la formulación como tensioactivos son lauromacrogol 400, esterato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensioactivos podrían estar presentes en la formulación de la proteína o derivado o bien solos o bien en forma de una mezcla de diferentes proporciones.

Los aditivos que intensifican potencialmente la absorción de una proteína son, por ejemplo, los ácidos grasos ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.

Puede ser deseable una formulación de liberación controlada. Se puede incorporar una proteína de fusión de OPG a una matriz inerte lo que permite la liberación por mecanismos o bien de difusión o bien de lixiviación p. ej., gomas. También se pueden incorporar a la formulación matrices de degeneración lenta, p. ej., alginatos, polisacáridos. Otra forma de liberación controlada de este agente terapéutico es mediante un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), esto es, el fármaco es encerrado en una membrana semipermeable que permite que entre agua e impulse el fármaco a través de una pequeña abertura sencilla debido a los efectos osmóticos. Algunos revestimientos entéricos también tienen un efecto de liberación retardada.

Se pueden utilizar otros recubrimientos en la formulación. Por ejemplo, una tableta recubierta con una película puede comprender materiales de dos grupos diferentes. El primer grupo incluye materiales no entéricos tales como metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxi-propilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, sal de sodio de carboximetilcelulosa, providona y los polietilenglicoles. El segundo grupo consiste en los materiales entéricos que son comúnmente ésteres de ácido ftálico. Se podría utilizar una mezcla de materiales para proporcionar el recubrimiento de película óptimo. El recubrimiento con película se puede llevar a cabo en un aparato de recubrimiento en plato giratorio o en un lecho fluidificado o mediante recubrimiento por
compresión.

También se contempla en la presente memoria la liberación pulmonar de un polipéptido o proteína de fusión de OPG. La proteína es liberada en los pulmones de un mamífero mientras se inhala y atraviesa el recubrimiento epitelial del pulmón hacia la corriente sanguínea. (Otros informes sobre esto incluyen Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135-144 (1990)(acetato de leuprolida); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (supl. 5): s.143-146 (1989)(endotelina-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3: 206-212 (1989)(\alpha1-antitripsina); Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145-1146 (1989)(\alpha1-proteinasa); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990 (hormona de crecimiento humana recombinante); Debs et al., The Journal of Immunology 140: 3482-3488 (1988)(interferón a y factor de necrosis tumoral \alpha) y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.284.656 (factor estimulador de las colonias de granulocitos).

Se contempla para su uso en la práctica de esta invención una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para la liberación pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo pero no limitados a nebulizadores, inhaladores de dosis medidas, e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos disponibles en el mercado adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medidas de Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; y el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Todos estos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para dispensar una proteína de fusión de OPG, o una variante, fragmento o derivado de la misma. Típicamente, cada formulación es específica del tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propelente adecuado, además de los diluyentes, coadyuvantes y/o portadores útiles en terapia.

Una proteína de fusión de OPG se debe preparar muy ventajosamente en forma particulada con un tamaño de partícula medio de menos de 10 \mum (o micrones), muy preferiblemente 0,5 a 5 \mum, para una liberación muy eficaz en el pulmón distal.

Los portadores incluyen carbohidratos tales como trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa, y sorbitol. Otros ingredientes para su uso en las formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Se pueden utilizar tensioactivos naturales o sintéticos. Se puede utilizar polietilenglicol (incluso aparte de su uso en la transformación de la proteína o análogo). Se pueden utilizar dextranos, tales como ciclodextrano. Se pueden utilizar sales biliares y otros intensificadores relacionados. Se pueden utilizar celulosa y derivados de celulosa. Se pueden utilizar aminoácidos, tal como su uso en una formulación tampón. Asimismo se contempla el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión, u otros tipos de portadores.

También se contempla la liberación nasal de una proteína de fusión de OPG. La liberación nasal permite el paso de la proteína a la corriente sanguínea directamente después de administrar el producto terapéutico en la nariz, sin la necesidad de depositar el producto en el pulmón. Las formulaciones para la liberación nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano. También se contempla la liberación vía transporte a través de otras membranas mucosas.

Dosificaciones

Los polipéptidos de fusión de OPG se van a administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz para prevenir y/o tratar la pérdida de hueso asociada con la enfermedad metastásica del hueso. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un polipéptido de fusión de OPG es aquella cantidad que reduce la pérdida de masa ósea. La masa ósea se mide mediante una variedad de métodos conocidos tales como la absorciometría de fotón simple (SPA), la absorciometría de fotón dual (DPA), la absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA), la tomografía computarizada cuantitativa (QCT), y la ultrasonografía (Véase Johnston et al. en Primer on the Metabolic Bone Disease and Disorders of Mineral Metabolism, 2ª ed., M.J. Favrus, ed. Raven Press págs. 237-146)). Un experto en la técnica puede utilizar estos métodos para determinar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de fusión de OPG. Una cantidad terapéuticamente eficaz también puede ser determinada midiendo los cambios en los marcadores bioquímicos para el recambio óseo, tal como la osteocalcina en suero, la fosfatasa alcalina en suero, los péptidos de extensión del procolágeno I del suero, los telopéptidos C-terminales o N-terminales del colágeno en orina o suero, el calcio en orina, la hidroxiprolina y la piridinolina y la desoxipiridinolina en orina. Es generalmente reconocido que un descenso en los niveles de los marcadores bioquímicos mencionados antes indica que la resorción ósea disminuye y la pérdida de masa ósea se está reduciendo. Alternativamente, también se puede determinar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de fusión de OPG midiendo el incremento de la resistencia del hueso, en particular el incremento en la resistencia a la torsión (retorcimiento) del hueso.

En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de fusión de OPG es de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En virtud del incremento de la vida media de un polipéptido de fusión, y especialmente una fusión de OPG con una región Fc de inmunoglobulina, la administración será menos frecuente que para un polipéptido de OPG no modificado. La frecuencia de administración puede ser aproximadamente una vez al mes, o alternativamente, una vez cada dos meses, o una vez cada tres meses. Un experto en la técnica apreciará que la dosificación exacta y la frecuencia de la administración dependerán de numerosos factores, incluyendo la formulación, la ruta de administración, la afección que esté siendo tratada, etcétera, y que puede ser fácilmente determinada por un operario experto.

La cantidad de proteína de fusión de OPG que se ha administrado puede ser determinada utilizando análisis de diagnóstico para la proteína de fusión. Tales análisis de diagnóstico pueden estar en forma de un análisis de anticuerpos, tal como un análisis sándwich de anticuerpos, donde el anticuerpo se une específicamente a la proteína de fusión de OPG, pero no se une a la OPG endógena, naturalmente circulante o a una forma de la proteína heteróloga fusionada con OPG que también puede circular naturalmente, tal como una región Fc de un anticuerpo de origen natural. Los análisis basados en anticuerpos para la determinación de los niveles de proteína de fusión de OPG se pueden llevar a cabo en una variedad de formatos que son conocidos por el experto en la técnica.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no se consideran limitantes del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Construcción y Expresión de Polipéptidos de Fusión de OPG

Se construyen generalmente los plásmidos que codifican OPG[1-194]-Fc, OPG[1-201]-Fc, OPG[1-194]-Fc\DeltaC, OPG[1-201]-Fc\DeltaC, OPG[1-194]-FcG_{10}, y metFc\DeltaC-OPG[22-194] para su uso en la producción de los correspondientes polipéptidos de fusión de OPG como se describe en WO97/23614. Las secuencias de los polipéptidos se muestran en las Figuras 3-8, respectivamente.

La expresión de un polipéptido de fusión de OPG en células anfitrionas de mamífero y bacterias se llevó a cabo como se describe en WO97/23614.

Ejemplo 2 Actividad OPG en un Modelo de Cáncer de Mama para la Enfermedad Lítica del Hueso

Se inyectaron ratones Balb/c nu/nu hembra de 7-8 semanas de edad con células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (1,0 x 10^{5} células/ratón; núm. de acceso ATCC HTB-26) directamente en la circulación general vía ventrículo izquierdo. Inmediatamente después de la inoculación del tumor, los ratones se trataron mediante inyección intravenosa o bien con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o bien con met Fc\DeltaC-OPG[22-194] (25mg/kg) tres veces por semana durante 4 semanas. El número de lesiones/ratón se evaluó a partir de radiografías. El hueso, el corazón, el pulmón, el hígado, los riñones, las glándulas suprarrenales, los ovarios, el cerebro, el páncreas y el bazo se evaluaron histológicamente en cuanto a la presencia de focos tumorales como se describe más abajo.

Como se muestra en la Figura 9, las lesiones radiográficas eran evidentes en los huesos largos 4 semanas después de la inoculación con células MDA-MB-231. La destrucción ósea asociada era completamente inhibida mediante la administración intravenosa de met Fc\DeltaC-OPG[22-194] a una dosis de 25 mg/kg tres veces por semana comenzando en el momento de la inoculación (6,2 \pm 0,8 vs. 0,0 \pm 0,0 lesiones/ratón, p < 0,001).

Ejemplo 3 Actividad OPG en un Modelo de Adenocarcinoma de Ratón para Enfermedad Lítica del Hueso

Se inyectaron ratones CDF1 hembra de 7-8 semanas de edad con células de adenocarcinoma C26-DCT murino (obtenidas del Tumor Repository of the National Cancer Institute; 1,0 x 10^{5} células/ratón) directamente en la circulación general vía ventrículo izquierdo. Inmediatamente después de la inoculación del tumor, los ratones fueron tratados mediante inyección intravenosa o bien con PBS o bien met Fc\DeltaC-OPG[22-194] (25mg/kg) cada 3 días durante 9 días. El día 10 se obtuvieron radiografías de los ratones y se tomaron muestras de los tejidos para su evaluación histológica.

Como se muestra en la Figura 9, las lesiones radiográficas son evidentes 10 días después de la inoculación intra-cardíaca de células C26-DCT (3,1 \pm 0,6 lesiones/ratón) y la destrucción ósea es inhibida mediante la inyección intravenosa de FcdC-OPG[22-194].

En un estudio adicional, los ratones fueron inoculados con células C26-DCT, como antes, y tratados mediante inyección intravenosa o bien con PBS o bien con met Fc-OPG[22-194] a 3, 1, 0,3, o 0,1 mg/kg cada 3 días durante 9 días. El día 10 se tomaron radiografías de los ratones. Las radiografías fueron evaluadas y los tejidos fueron manipulados como se describe más abajo. Las lesiones radiográficas eran reducidas de una manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento con met Fc\DeltaC-OPG [22-194] intravenoso. (Figura 10).

Ejemplo 4 Actividad OPG en un Modelo de Adenocarcinoma de Ratón para Hipercalcemia

Se adquirieron ratones Balb/c x DBA/2 (CDF1) macho de 10-12 semanas de edad de Harlan Sprague Dawley (San Diego, CA) o de Charles River (Wilmington, MA).

Se obtuvo tumor C-26, inducido originalmente en un ratón Balb/c hembra mediante instilación intrarrectal repetida de N-nitroso-N-metiluretano (NMU) (Corbett et al. Cancer Res. 35, 2434-2439 (1975)), del Tumor Repository of the National Cancer Institute en forma de fragmentos de tejidos. Los fragmentos fueron desorganizados mecánicamente y colocados en cultivo en condiciones para el cultivo de tejidos normalizadas (37ºC, 5-6% CO_{2}), que dieron lugar a una línea celular adherente que se pudo propagar continuamente y congelar tal cual con posterioridad. El medio empleado para el paso de las células in vitro es DMEM más 10% FCS, 1x pen-estrep/glutamina y 1x aminoácidos no esenciales. Se utilizó un vial congelado separado de una provisión común para el inicio de todos los experimentos. Después del restablecimiento inicial del cultivo, las células se cosecharon mediante tripsinización, seguido de varios lavados y resuspensión en DMEM sin aditivos a una concentración de 2,5 x 10^{6} células/ml. Los animales fueron inyectados subcutáneamente (SQ) sobre una zona afeitada del flanco derecho con 0,2 cc (0,5 x 10^{6} células). En estas condiciones se encontró que el desarrollo del tumor era muy compatible con una variabilidad mínima.

El tratamiento comenzó el día 8 (estudios de prevención) o cuando los niveles de calcio ionizado en sangre alcanzaron un nivel >1,60 mmoles/L (estudios de tratamiento). El tratamiento duró 8 días en los estudios de prevención y 4 en los estudios de tratamiento. En los estudios de prevención se administró diariamente metFc\DeltaC-OPG[22-1941] en un vehículo de PBS en forma de inyección subcutánea en el flanco. En los estudios de tratamiento, se administró met Fc\DeltaC-OPG[22-194] en forma de una única inyección intravenosa en vehículo de PBS. En ambos estudios los animales normales y los que portaban tumores recibieron una inyección similar de PBS.

En el transcurso del estudio, los ratones se pesaron diariamente (durante el tratamiento), y se controlaron los niveles de calcio ionizado en sangre o bien en días alternos en los estudios de prevención (antes de la administración del fármaco ese día) o bien diariamente en los estudios de tratamiento. Se tomaron muestras de sangre retro-orbitalmente y las determinaciones de calcio ionizado en sangre se realizaron utilizando un analizador de calcio ionizado/pH en sangre (Chiron Diagnostics #634, Norwood, MA).

Evaluación Histológica

Al concluir el estudio se recogió una pata de cada animal (fémur y tibia conectados). Los huesos se fijaron en cinc-formalina tamponada con fosfato, se descalcificaron en ácido fórmico y se embebieron en parafina. Se tomaron secciones de la región media del fémur distal y la tibia proximal, se hicieron reaccionar para demostrar la actividad fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP), y se contratiñeron con hematoxilina. En este procedimiento de tinción los osteoclastos se teñían de rojo, mientras los demás tipos de células, hueso y cartílago se teñían de diferentes matices de azul.

Se realizaron mediciones de la zona inmediatamente distal con respecto a la placa de crecimiento de la tibia proximal (en la zona de la esponjosa primaria), y en la zona del eje cortical de la tibia distante 2 mm de la primera zona de medición utilizando un programa de análisis óseo Osteomeasure (Osteometrics Inc., Decatur, GA). Se seleccionaron dos regiones separadas de la tibia para la medición de manera que se pudiera obtener una determinación exacta del aumento de la resorción ósea inducida por el tumor. El campo de la medición consistía en una zona cuadrada de 1 mm x 1 mm en ambas localizaciones y no incluía la placa de crecimiento de la primera región. Los parámetros medidos eran el número y la superficie activa de los osteoclastos, y la superficie ósea. Los resultados fueron registrados como número de osteoclastos (OcN), perímetro de los osteoclastos (superficie activa de los osteoclastos) (OcPm), perímetro del hueso (superficie ósea) (BPm). Con el fin de considerar un osteoclasto para la medición, éste tenía que ser TRAP positivo y estar en contacto con una superficie ósea. La superficie del osteoclasto activo era la porción del osteoclasto que estaba en contacto directo con una superficie ósea. Todas las mediciones se realizaron trazando la imagen de la sección sobre una placa de digitalización con la ayuda de un anclaje lúcido de la cámara del microscopio.

Resultados

El tratamiento con OPG moderaba los efectos del adenocarcinoma C-26 sobre la pérdida de peso corporal. Los ratones que recibían una dosis diaria de 2,5 mg/kg de OPG perdían una media de 5,2 gramos de peso corporal mientras los animales que portaban tumores no tratados perdían una media de 6,2 gramos. Los ratones que portaban un tumor con PBS tenían tumores que eran 3,47 \pm 0,72% vs 2,5 mg/kg de OPG, 3,42 \pm 0,82%. Los pesos eran: PBS 0,75 \pm 0,14 g y OPG 2,5: 0,79 \pm 0,16 g.

La OPG evita y revierte los incrementos de niveles de calcio ionizado en sangre inducidos por el tumor C-26

Cuando se comenzaba el tratamiento el día 9 después de la implantación del tumor, la OPG inhibía dependientemente de la dosis el incremento de los niveles de calcio ionizado en sangre completa inducido por el tumor (véase la Figura 11A). Antes de comenzar el tratamiento con OPG, los ratones que portaban tumores presentaban niveles de calcio ionizado en sangre completa ligeramente incrementados (1,34 \pm 0,06 mmoles/L vs 1,25 \pm 0,02 mmoles/L). En los grupos tratados con vehículo estos niveles continuaban incrementando durante todo el experimento con niveles máximos de 1,84 \pm 0,12 mmoles/L alcanzados los días 13 y 15, y disminuían ligeramente en torno al día 16. Los grupos tratados con OPG demostraban una inhibición de este incremento dependiente de la dosis en los niveles de calcio ionizado en sangre completa durante todo el período de tratamiento, alcanzando los niveles de calcio ionizado un máximo de 1,38 \pm 0,06 mmoles/L el día 15 en el grupo con 2,5 mg/kg. Este nivel de calcio era moderada pero significativamente más alto que el encontrado en los animales de control que no portaban tumores. El tratamiento con OPG no tenía efecto sobre los niveles de calcio en los ratones que no portaban tumores.

Cuando se permitía que los ratones se volvieran francamente hipercalcémicos antes del tratamiento, una única dosis de 5,0 mg/kg de OPG producía un rápido descenso en los niveles de calcio con un descenso significativo evidente alrededor de las 12 horas y se alcanzaba la monocalcemia a las 24 horas de tratamiento. (Véase la Figura 11B). La OPG mantenía los niveles de calcio en el intervalo normal durante el resto del experimento.

La OPG evita y revierte los incrementos de superficies óseas revestidas de osteoclastos y el número de osteoclastos inducidos por el tumor C-26

Las superficies revestidas de osteoclastos y el número de osteoclastos eran marcadamente elevados en ratones hipercalcémicos que portan tumores C26. El tratamiento con una dosis de 2,5 mg/kg de OPG o bien antes o bien después del desarrollo de la hipercalcemia ocasionaba la desaparición casi completa de los osteoclastos. Las mediciones de la superficie de los osteoclastos, una indicación de la cantidad de resorción ósea, aumentaban significativamente en los animales que portaban tumores, 8,95 \pm 2,10%, en comparación con los controles que no portaban tumores 3,91 \pm 1,10%. Una dosis de 2,5 mg/kg de OPG suministrada diariamente antes del desarrollo de hipercalcemia reducía estos dependientemente de la dosis a 0,13 \pm 0,07% que es significativamente inferior que incluso en los animales de control que no portaban tumores.

El número de osteoclastos por mm de superficie ósea también se elevaba en los animales que portaban tumores a 4,41 \pm 1,03/mm en comparación con los controles que no portaban tumores 2,00 \pm 0,52/mm. Una dosis diaria de 2,5 mg/kg de OPG reducía dependientemente de la dosis el número de osteoclastos por mm a 0,12 \pm 0,06/mm que es significativamente inferior que incluso en los animales que no portaban tumores.

El tratamiento con OPG disminuye el tamaño y el número de osteoclastos dependientemente de la dosis

La superficie de los osteoclastos como porcentaje de las mediciones de la superficie ósea así como el número de osteoclastos por mm de superficie ósea fueron ambos significativamente elevados en los animales de control que portan tumores 8,95 \pm 1,64% y 4,12 \pm 0,72 osteoclastos por mm respectivamente, cuando se compararon con los animales normales que no portaban tumores 3,66 \pm 1,01% y 1,83 \pm 0,54 osteoclastos por mm. Una dosis diaria de 2,5 mg/kg de OPG redujo significativamente estos valores incluso por debajo del intervalo normal a 1,26 \pm 0,93% y 0,73 \pm 0,55 osteoclastos por mm.

<110> AMGEN INC.

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<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF CANCER AND BONE LOSS ASSOCIATED WITH CANCER

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<130> A-605

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<140> 09/389,545

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<141> 1999-09-03

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 232

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 1

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4

5

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<210> 2

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<211> 401

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 2

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6

7

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<210> 3

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<211> 407

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 3

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8

9

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<210> 4

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<211> 413

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 4

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10

11

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<210> 5

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<211> 400

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 5

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12

13

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<210> 6

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<211> 406

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<212> PRT

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<213> Human

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<400> 6

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14

15

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<210> 7

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<211> 404

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<212> PRT

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<213> Human

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<400> 7

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16

17

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<210> 8

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<211> 401

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<212> PRT

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<213> Human

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<400> 8

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18

19

Claims

1. El uso de un polipéptido de OPG para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la pérdida de hueso asociada con el cáncer en un mamífero, donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer esofágico, cáncer rectal, cáncer de vejiga, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer del tracto gastrointestinal, mieloma múltiple y adenocarcinoma de colon.

2. El uso según la reivindicación 1, donde el polipéptido de OPG va a ser administrado antes, durante, o después de la administración de un agente para la terapia del cáncer, y donde el agente para la terapia del cáncer se selecciona del grupo que consiste en radiación, quimioterapia, anticuerpos, o polipéptidos distintos de anticuerpos.

3. El uso según la reivindicación 1 o 2, donde el polipéptido de OPG comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:2 o un polipéptido truncado del mismo.

4. El uso según la reivindicación 3, donde el polipéptido de OPG comprende un truncamiento carboxi terminal de una porción o todos los restos aminoácido 186 - 401 de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO:2.

5. El uso según la reivindicación 3, donde el polipéptido de OPG comprende los restos aminoácido 22-194 inclusive como se muestra en el SEQ ID NO:2.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde el polipéptido de OPG es un polipéptido de fusión de OPG.

7. El uso según la reivindicación 6, donde el polipéptido de fusión de OPG comprende una fusión de una región Fc con un extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido de OPG.

8. El uso según la reivindicación 7, donde el polipéptido de fusión de OPG comprende una región Fc fusionada con los restos aminoácido 22-194 del SEQ ID NO:2.

9. El uso según la reivindicación 8, donde el polipéptido de fusión de OPG consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en el SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO: 8.

10. El uso según la reivindicación 2, donde la quimioterapia comprende antraciclinas, taxol, tamoxifeno, doxorrubicina, y 5-fluorouracilo.

11. El uso según la reivindicación 2, donde los anticuerpos se unen a Her2, CDC20, CDC33, glicoproteína de tipo mucina, o receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) sobre la superficie de las células tumorales.

12. El uso según la reivindicación 2, donde el agente para la terapia del cáncer comprende un antagonista de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) de la siguiente estructura:

A-B-C-D-E-F-G-H-I-J

donde

A es piro-glu, Ac-D-Nal, Ac-D-Qal, Ac-Sar, o Ac-D-Pal;

B es His o 4-Cl-D-Phe;

C es Trp, D-Paf, D-Nal, L-Nal-D-Pal(N-0), o D-Trp;

D es Ser,

F es

20

donde

R y X son independientemente H y alquilo, e Y comprende una entidad polar pequeña;

G es Leu o Trp.

H es Lys(iPr), Gln, Met, o Arg;

I es Pro; y

J es Gly-NH_{2} o D-Ala-NH_{2}.

13. El uso según la reivindicación 12, donde el antagonista de LHRH comprende el péptido: N-Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2.

14. El uso según la reivindicación 1 o 7, donde la cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de OPG o un polipéptido de fusión de OPG está entre 0,1 mg/kg y 10 mg/kg.

15. El uso de un polipéptido de OPG para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento del mieloma múltiple.