ES2280083T3

ES2280083T3 - Composiciones de proteinas de fusion ob y metodos.

Info

Publication number: ES2280083T3
Application number: ES97952464T
Authority: ES
Inventors: Michael Benjamin Mann; Randy Ira Hecht
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2007-09-01
Anticipated expiration: 2017-12-11
Also published as: NO992779L; NO992779D0; YU27999A; JP4659068B2; NO325096B1; PL334242A1; BG64288B1; AU5606098A; IL130396A; KR20000069617A; SK287578B6; PL194159B1; RS49927B; BR9713755A; EA004791B1; ZA9711239B; IL130396A0; CN1246154A; AR009436A1; EP1835030A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNAS COMPOSICIONES DE PROTEINAS DE FUSION FC - OB, A SUS PROCEDIMIENTOS DE PREPARACION Y USOS. ESTA INVENCION SE REFIERE EN PARTICULAR A UNA PROTEINA DE FUSION GENETICA O QUIMICA, QUE COMPRENDE LA ZONA INMUNOGLUBINA FC O DERIVADOS O ANALOGOS DE INMUNOGLUBINAS SOLDADAS A LA PARTE N - TERMINAL DE LA PROTEINA OB, A SU DERIVADO O ANALOGO.

Description

Composiciones de proteínas de fusión OB y métodos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones de proteínas de fusión Fc-OB y a métodos para su preparación y uso.

Antecedentes

Aunque la base molecular de la obesidad es, en gran medida, desconocida, la identificación del "gen OB" y la proteína codificada ("proteína OB" o "leptina") ha arrojado algo de luz sobre los mecanismos que utiliza el cuerpo para regular el depósito de grasa corporal. Véase, publicación PCT WO 96/05309 (22/12/96), Friedman et al.; Zhang et al., Nature, 372:425-432 (1994); véase también, la corrección a Nature, 374:479 (1995). La proteína OB es activa in vivo en ratones mutantes ob/ob (ratones obesos debido a un defecto en la producción del producto del gen OB), así como en ratones de tipo salvaje. La actividad biológica se manifiesta, entre otras cosas, como una pérdida de peso. Véase, en general, Barrinaga, "Obese" Protein Slims Mice, Science, 269:475-456 (1995). La proteína OB, sus derivados y su uso como moduladores para el control del peso y la adiposidad de animales, incluyendo mamíferos y seres humanos, se ha descrito con más detalle en la publicación PCT WO 96/05309 (22/12/96).

Los otros efectos biológicos de la proteína OB no están bien caracterizados. Se sabe, por ejemplo, que en ratones mutantes ob/ob, la administración de la proteína OB produce una disminución de los niveles de insulina séricos y los niveles de glucosa séricos. También se sabe que la administración de la proteína OB produce una disminución de la grasa corporal. Esto se observó en ratones mutantes ob/ob y también en ratones normales no obesos (Pelleymounter et al., Science, 269:540-543 (1995); Halaas et al., Science, 269:543-546 (1995)). Véase también, Campfield et al., Science, 269:546-549 (1995), Peripheral and central administration of microgram doses of OB protein reduced food intake and body weight of ob/ob and diet-induced obese mice but not in db/db obese mice. En ninguno de estos informes se ha observado toxicidad, incluso en las dosis más altas.

A pesar de la promesa de la aplicación clínica de la proteína OB, el modo de acción de la proteína OB in vivo no se aclarado por completo. La información sobre el receptor OB muestra una alta afinidad de unión de la proteína OB detectada en el hipotálamo de rata, lo cual indica la localización del receptor OB (Stephens et al., Nature, 377:530-532). El ratón db/db muestra un fenotipo idéntico al ratón ob/ob, es decir, obesidad extrema y diabetes de tipo II; se cree que este fenotipo es debido a un receptor OB defectuoso, en particular puesto que los ratones db/db no responden a la administración de la proteína OB. Véase Stephens et al., supra.

Con los avances en las tecnologías de ADN recombinante, la disponibilidad de proteínas recombinantes para uso terapéutico ha amenazado los avances en la formulación de proteínas y la modificación química. Un objetivo de dicha modificación es la protección de proteínas y la disminución de la degradación. Las proteínas de fusión y la unión química pueden bloquear, de forma eficaz, a una enzima proteolítica para evitar el contacto físico con el esqueleto de la proteína en sí mismo y, por tanto, evitan la degradación. Otras ventajas incluyen, bajo ciertas circunstancias, aumentar la estabilidad, el tiempo de circulación, y la actividad biológica de la proteína terapéutica. Un artículo de revista que describe la modificación de proteínas y las proteínas de fusión es Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10 (mayo 1992), publicado por Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, Londres N20, OLD, Reino Unido).

Una de estas modificaciones es el uso de la región Fc de inmunoglobulinas. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que se une al antígeno, y un dominio constante, conocido como "Fc", que proporciona el enlace a las funciones efectoras, tales como el complemento o las células fagocíticas. La porción Fc de una inmunoglobulina tiene una semivida plasmática larga, mientras que el Fab tiene vida corta (Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989)).

Se han construido productos proteicos terapéuticos utilizando el dominio Fc para proporcionar una semivida más larga o para incorporar funciones, tales como la unión al receptor Fc, la unión de proteína A, la fijación del complemento y la transferencia placentaria, que residen todas en la proteínas Fc de las inmunoglobulinas (id.). Por ejemplo, la región Fc del anticuerpo IgG1 se ha condensado con el extremo N-terminal de CD30-L, una molécula que se une a receptores CD30 expresados sobre células tumorales de la enfermedad de Hodgkin, células de linfoma anaplásico, células de leucemia de células T y otros tipos celulares malignos. Véase, la patente de EEUU nº 5.480.981. El IL-10, un agente antiinflamatorio y antirrechazo, se ha condensado con Fc\gamma2a murino para aumentar la corta semivida en circulación de la citoquina (Zheng, X. et al., The Journal of Immunology, 154:5590-5600 (1995)). Los estudios también han evaluado el uso del receptor del factor de necrosis tumoral conectado a la proteína Fc de IgG1 humana para tratar pacientes con choque séptico (Fisher, C. et al., N. Engl. J. Med., 334:1697-1702 (1996); Van Zee, K. et al., The Journal of Immunology, 156:2221-2230 (1996)). El Fc también se ha condensado con el receptor CD4 para producir una proteína terapéutica para el tratamiento del SIDA. Véase, Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989). Además, el N-terminal de la interleuquina 2 también se ha condensado con la porción Fc de IgG1 o IgG3 para solucionar la corta semivida de la interleuquina 2 y su toxicidad sistémica. Véase, Harvill et al., Immunotechnology, 1:95-105 (1995).

\newpage

Debido a la identificación de la proteína OB como una proteína terapéutica prometedora, existe la necesidad de desarrollar composiciones de análogos de OB para una aplicación clínica, junto o en lugar de la administración de la proteína OB. Este desarrollo incluye composiciones de análogos de OB, en las que las formulaciones de proteínas y las modificaciones químicas logran una menor degradación de las proteínas, una mayor estabilidad y tiempo de circulación. La presente invención proporciona estas composiciones.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones de proteínas de fusión Fc-OB, a métodos de preparación de dichas composiciones y a sus usos. En particular, la presente invención se refiere a una proteína de fusión genética que comprende la región Fc de inmunoglobulinas condensada con la porción N-terminal de la proteína OB o análogos. La proteína de fusión Fc-OB es capaz de dimerizarse a través de los restos cisteína de la región Fc. De forma inesperada, la modificación de fusión genética con Fc en el N-terminal de la proteína OB muestra ventajas en la estabilidad, velocidad de eliminación y disminución de la degradación, que no se observan en la proteína OB o con la fusión de Fc al C-terminal de la proteína OB. De forma sorprendente e importante, la modificación del N-terminal proporciona una protección inesperada de la proteína frente a la degradación, aumenta el tiempo de circulación y estabilidad, cuando se compara con la proteína OB o con la modificación con Fc del C-terminal de la proteína OB. Estas ventajas inesperadas de la modificación con Fc de la proteína OB serían ventajosas para los consumidores de la proteína OB, porque estos cambios contribuyen a necesitar una dosis menor o a una dosificación menos frecuente. Por tanto, como se describe a continuación con más detalle, la presente invención posee una serie de aspectos relacionados con la modificación genética de las proteínas a través de la fusión de la región Fc con la proteína OB, así como modificaciones específicas, preparaciones y métodos para su uso.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión Fc-OB, en la que Fc está genéticamente condensado con el N-terminal de la proteína OB. Además, la porción Fc también puede estar conectada al N-terminal de la proteína OB a través de conectores peptídicos o químicos, como se conoce en la técnica. Como se indicó anteriormente y se describe con más detalle a continuación, la proteína de fusión Fc-OB tiene propiedades de protección inesperadas frente a la degradación y un mayor tiempo en circulación y estabilidad, cuando se compara con la proteína OB o las proteínas de fusión C-terminal OB-Fc. Por tanto, otros aspectos de la presente invención incluyen no sólo composiciones de proteínas de fusión Fc-OB, sino también secuencias de ADN que codifican dichas proteínas, vectores relacionados y células hospedantes que contienen dichos vectores, ambos útiles para producir las proteínas de fusión de la presente invención.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona la preparación de proteínas de fusión Fc-OB. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante para la preparación de proteínas recombinantes. Además, dichos aspectos incluyen también métodos de fermentación y purificación.

En la presente se describen métodos para tratar el exceso de peso en un individuo o animales, incluyendo la modulación y/o el depósito de grasa mediante la administración de las proteínas de fusión Fc-OB. Debido a las características de la proteína de fusión Fc-OB, en la presente se describen métodos que reducen la cantidad y/o frecuencia de dosificación de la proteína OB utilizando el agente reductor de peso Fc-OB.

En la presente se describen terapias para el tratamiento de comorbilidades asociadas con un exceso de grasa, tales como diabetes, dis- o hiperlipidemias, esclerosis arterial, placas arteriales, la reducción o prevención de formación de piedras biliares, accidentes cerebrovasculares, y también para aumentar la sensibilidad a la insulina y/o para aumentar la masa de tejido magro.

En otro aspecto, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas relacionadas de las proteínas Fc-OB para su uso en las terapias anteriores.

De forma específica, la presente invención proporciona una proteína que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en: R_{1}-R_{2} y R_{1}-L-R_{2}, en la que R_{1} es una proteína Fc, R_{2} es una proteína OB, y L es un conector, y en la que la proteína Fc se selecciona del grupo que consiste en:

(a) los aminoácidos 1-233 de SEQ ID NO:9 y 12, y los aminoácidos 1-228 de SEQ ID NO:15 y 18;

(b) los aminoácidos 1-233 de SEQ ID NO:9 que tienen diferentes aminoácidos sustituidos o delecionados en una o más de las siguientes posiciones:

(i): uno o más restos cisteína sustituidos por un resto alanina o serina;

(ii): uno o más restos tirosina sustituidos por un resto fenilalanina;

(iii): el aminoácido en la posición 5 sustituido por una alanina;

(iv): el aminoácido en la posición 20 sustituido por glutamato;

(v): el aminoácido en la posición 103 sustituido por una alanina;

(vi): el aminoácido en la posición 105 sustituido por una alanina;

(vii): el aminoácido en la posición 107 sustituido por una alanina;

(viii): los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y/o 5 delecionados o sustituidos; y

(ix): una combinación de las subpartes i-viii;

(c) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a) o (b) que tiene un resto metionilo en el N-terminal;

(d) la proteína Fc de cualquiera de las subpartes (a) a (c), que comprende un resto químico conectado al resto de proteína, y en la que el resto químico es polietilenglicol, y

(e) un derivado de la subparte (d), en el que el polietilenglicol está unido solamente al N-terminal de dicho resto de proteína,

así como una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en: R_{1}-R_{2} y R_{1}-L-R_{2}, en la que R_{1} es una proteína Fc, R_{2} es una proteína OB, y L es un conector, y en la que la proteína Fc se selecciona del grupo que consiste en:

(i): uno o más restos cisteína sustituidos por un resto alanina o serina;

(ii): uno o más restos tirosina sustituidos por un resto fenilalanina;

(iii): el aminoácido en la posición 5 sustituido por una alanina;

(iv): el aminoácido en la posición 20 sustituido por glutamato;

(v): el aminoácido en la posición 103 sustituido por una alanina;

(vi): el aminoácido en la posición 105 sustituido por una alanina;

(vii): el aminoácido en la posición 107 sustituido por una alanina;

(ix): una combinación de las subpartes i-viii; y

(c) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a) o (b) que tiene un resto metionilo en el N-terminal,

y los vectores relacionados, células hospedantes, procesos para preparar una proteína de la invención, y composiciones farmacéuticas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: DNA (bicatenario) (SEQ ID NO:1 y 2) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:3) de metOB recombinante murino.

Figura 2: DNA (bicatenario) (SEQ ID NO:4 y 5) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) de un análogo de metOB recombinante humano.

Figura 3 (A-C): DNA (bicatenario) (SEQ ID NO:7 y 8) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:9) de metFc-OB recombinante humano.

Figura 4 (A-C): DNA (bicatenario) (SEQ ID NO:10 y 11) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:12) de un variante de metFc-OB recombinante humano.

Figura 5 (A-C): DNA (bicatenario) (SEQ ID NO:13 y 14) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:15) de un variante de metFc-OB recombinante humano.

Figura 6 (A-C): DNA (bicatenario) (SEQ ID NO:16 y 17) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:18) de un variante de metFc-OB recombinante humano.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a composiciones de proteínas de fusión Fc-OB, a métodos de preparación de dichas composiciones y a sus usos. En particular, la presente invención se refiere a la fusión genética o química de la región Fc de inmunoglobulinas con la porción N-terminal de la proteína OB. De forma inesperada, la fusión de Fc en el N-terminal de la proteína OB muestra ventajas que no se observan en la proteína OB o con la fusión de Fc en el C-terminal de la proteína OB. De forma sorprendente, la proteína Fc-OB modificada en el N-terminal proporciona una protección inesperada a la proteína frente a la degradación, un mayor tiempo de circulación y una mayor estabilidad. Por consiguiente, la proteína de fusión Fc-OB, y sus análogos o derivados, así como los métodos de uso relacionados y preparación, se describen con más detalle a continuación.

Composiciones

La secuencia Fc de la secuencia Fc-OB recombinante humana indicada en SEQ ID NO:9 (véase la figura 3) puede seleccionarse de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana IgG-1 (véase Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res., 10:4071-4079 (1982)), o cualquier otra secuencia Fc conocida en la técnica (por ejemplo, otras clases de IgG que incluyen, pero no se limitan a IgG-2, IgG-3 e IgG-4, u otras inmunoglobulinas). Los variantes, análogos o derivados de la porción Fc pueden construirse, por ejemplo, realizando diversas sustituciones de restos o secuencias.

Los restos cisteína pueden delecionarse o sustituirse con otros aminoácidos para evitar la formación de enlaces disulfuro de las secuencias Fc. En particular, el aminoácido en la posición 5 de SEQ ID NO:9 es un resto cisteína. La secuencia Fc-OB recombinante de SEQ ID NO:9 es una proteína Fc-OB de 378 aminoácidos (sin contar el resto metionina). El primer aminoácido de la secuencia para la proteína Fc-OB recombinante de la figura 3 se indica como +1, con la metionina en la posición -1.

Se puede eliminar el resto cisteína en la posición 5 o sustituirlo por uno o más aminoácidos. Un resto alanina puede sustituirse por el resto cisteína en la posición 6, produciendo el variante de secuencia de aminoácidos de la figura 4 (SEQ ID NO:12). La proteína Fc-OB recombinante de la figura 4 es una proteína Fc-OB de 378 aminoácidos (sin contar el resto metionina). El primer aminoácido de la secuencia para la proteína Fc-OB recombinante de la figura 4 se indica como +1, con la metionina en la posición -1.

De forma similar, la cisteína en la posición 5 de SEQ ID NO:9 puede sustituirse por serina u otro resto aminoácido, o puede delecionarse. Un variante o análogo también puede prepararse mediante la deleción de los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 4, y 5, como con el variante de SEQ ID NO:15 (véase la figura 5). También pueden realizarse sustituciones en estas posiciones, y se encuentran dentro del alcance de esta invención. La proteína Fc-OB recombinante de la figura 5 es una proteína Fc-OB de 373 aminoácidos (sin contar el resto metionina). El primer aminoácido de la secuencia para la proteína Fc-OB recombinante de la figura 5 se indica como +1, con la metionina en la posición -1.

También se pueden realizar modificaciones para introducir cuatro sustituciones de aminoácidos para eliminar el sitio de unión del receptor Fc y el sitio de unión del complemento (Clq). Estas modificaciones de variantes a partir de la SEQ ID NO:15 incluyen leucina en la posición 15 sustituida con glutamato, glutamato en la posición 98 sustituido con alanina, y lisinas en las posiciones 100 y 102 sustituidas por alaninas (véase la figura 6 y SEQ ID NO:18). La proteína Fc-OB recombinante de la figura 6 es una proteína Fc-OB de 373 aminoácidos (sin contar el resto metionina). El primer aminoácido de la secuencia para la proteína Fc-OB recombinante de la figura 6 se indica como +1, con la metionina en la posición -1.

De forma similar, uno o más restos tirosina puede sustituirse también por restos fenilalanina. Además, también se contemplan otros variantes de inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos. Además, las alteraciones pueden estar en forma de aminoácidos alterados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos. La proteína Fc también puede conectarse a las proteínas OB de la proteína Fc-OB mediante restos "conectores", que pueden ser químicos o ser aminoácidos de longitud variable. Estos conectores químicos son muy conocidos en la técnica. Las secuencias conectoras de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a:

(a): ala-ala-ala;

(b): ala-ala-ala-ala;

(c): ala-ala-ala-ala-ala;

(d): gly-gly;

(e): gly-gly-gly;

(f): gly-gly-gly-gly-gly;

(g): gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

(h): gly-pro-gly;

(i): gly-gly-pro-gly-gly; y

(j): cualquier combinación de las subpartes (a) a (i).

\vskip1.000000\baselineskip

La porción OB de la proteína de fusión Fc-OB puede seleccionarse de la proteína murina recombinante indicada en la SEQ ID NO:3 (véase la figura 3), o la proteína humana recombinante indicada en Zhang et al., Nature, supra, o las que carecen de un resto glutaminilo en la posición 28 (véase, Zhang et al., Nature, supra, en la página 428). También se puede utilizar el análogo de proteína OB humana recombinante indicada en la SEQ ID NO:6 (véase la figura 2), que contiene: (1) una arginina en lugar de lisina en la posición 35; y (2) una leucina en lugar de isoleucina en la posición 74 (una abreviatura para este análogo es R\rightarrowL^{35}, I\rightarrowL^{74} humana recombinante). Las secuencias de aminoácidos para las proteínas recombinante humana y recombinante murina, o análogos con o sin la porción Fc condensada en el N-terminal de la proteína OB, se indican a continuación, con un resto metionilo en la posición -1; sin embargo, como con cualquiera de las proteínas OB y análogos presentes, el resto metionilo puede estar ausente.

La proteína murina es sustancialmente homóloga con la proteína humana, en particular como una proteína madura y, además, en particular en el N-terminal. Se puede preparar un análogo de la proteína humana recombinante alterando (tal como sustituyendo restos aminoácidos), en la secuencia recombinante humana, los aminoácidos que se diferencian de la secuencia murina. Debido a que la proteína recombinante humana tiene actividad biológica en ratones, es probable que este análogo sea activo en seres humanos. Por ejemplo, utilizando una proteína humana que tiene una lisina en el resto 35 y una isoleucina en el resto 74, según la numeración de SEQ ID NO:6, en la que el primer aminoácido es valina, y el aminoácido en la posición 146 es cisteína, se puede sustituir con otro aminoácido uno o más de los aminoácidos en las posiciones 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. Se puede seleccionar el aminoácido en la correspondiente posición de la proteína murina (SEQ ID NO:3), u otro aminoácido.

También se pueden preparar moléculas "consenso" basándose en la secuencia de la proteína OB de rata (Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 209:944-952 (1995)). La proteína OB de rata se diferencia de la proteína OB humana en las siguientes posiciones (utilizando la numeración de SEQ ID NO:6): 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 y 145. Se puede sustituir con otro aminoácido uno o más aminoácidos en estas posiciones divergentes. Las posiciones subrayadas son aquellas en las que la proteína OB murina, así como la proteína OB de rata, son divergentes de la proteína OB humana y, así, son particularmente adecuadas para su alteración. En una o más de las posiciones, se puede sustituir un aminoácido de la correspondiente proteína OB de rata, u otro aminoácido.

Las posiciones en la proteína OB de rata y murina que se diferencian de la proteína OB humana madura son: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. Una proteína OB según SEQ ID NO: 6 que tiene uno o más de los anteriores aminoácidos sustituidos por otro aminoácido, tal como el aminoácido que se encuentra en la correspondiente secuencia de rata o murina, también puede ser eficaz.

Además, los aminoácidos que se encuentran en la proteína OB de mono Rhesus que se diferencian de los de la proteína OB humana madura son (los paréntesis indican las identidades en la abreviatura de una sola letra de aminoácidos): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (I), 67 (N), 68 (L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D) y 118 (L). Puesto que la proteína OB humana recombinante es activa en monos cinomolgus, una proteína OB humana según SEQ ID NO: 6 (con lisina en la posición 35 e isoleucina en la posición 74) que tiene uno o más de los aminoácidos divergentes del mono Rhesus sustituido por otro aminoácido, tal como los aminoácidos entre paréntesis, puede ser eficaz. Debe advertirse que ciertos aminoácidos divergentes de Rhesus también son los que se encuentran en la especie murina anterior (posiciones 35, 68, 89, 100 y 112). Por tanto, se puede preparar una molécula consenso murina/Rhesus/humana que tiene, usando la numeración de SEQ ID NO: 6, una lisina en posición 35 y una isoleucina en la posición 74, y tiene uno o más de los aminoácidos en las posiciones sustituido por otro aminoácido: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145.

Pueden prepararse otros análogos delecionando parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Por ejemplo, la proteína madura carece de una secuencia conductora (-22 a -1). Se pueden preparar las siguientes formas truncadas de moléculas de proteína OB humana (usando la numeración de SEQ ID NO: 6):

(a) aminoácidos 98-146,

(b) aminoácidos 1-32,

(c) aminoácidos 40-116,

(d) aminoácidos 1-99 y (conectados a) 112-146,

(e) aminoácidos 1-99 y (conectados a) 112-146, estando uno o más de los aminoácidos 100-111 colocados entre los aminoácidos 99 y 112.

\newpage

Además, las formas truncadas también pueden tener alterados uno o más de los aminoácidos que son divergentes (en la proteína OB de rata, murina o Rhesus) de la proteína OB humana. Además, cualquier alteración puede estar en forma de aminoácidos alterados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos.

En la presente también se describe una proteína de fusión Fc-OB, en la que la proteína OB se selecciona de:

(a) la secuencia de aminoácidos 1-146, como se indica en SEQ ID NO: 3 (a continuación) o SEQ ID NO: 6;

(b) la secuencia de aminoácidos 1-146, como se indica en SEQ ID NO: 6, que tiene un resto lisina en la posición 35 y un resto isoleucina en la posición 74;

(c) la secuencia de aminoácidos de la subparte (b) que tiene un aminoácido diferente sustituido en una o más de las siguientes posiciones (utilizando la numeración según SEQ ID NO: 6, y manteniendo la misma numeración incluso en ausencia de un resto glutaminilo en la posición 28): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145;

(d) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a), (b) o (c), que carece opcionalmente de un resto glutaminilo en la posición 28;

(e) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a), (b), (c) o (d), que tiene un resto metionilo en el N-terminal:

(f) un análogo de la proteína OB truncado seleccionado entre (usando la numeración de SEQ ID NO: 6):

(i): aminoácidos 98-146,

(ii): aminoácidos 1-32,

(iii): aminoácidos 40-116,

(iv): aminoácidos 1-19 y 112-146,

(v): aminoácidos 1-99 y 112-146 que tiene uno o más de los aminoácidos 100-111 colocados entre los aminoácidos 99 y 112; y

(vi): el análogo de OB truncado de la subparte (i) que tiene uno o más de los aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituido por otro aminoácido;

(vii): el análogo truncado de la subparte (ii) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8 y 32 sustituido por otro aminoácido;

(viii): el análogo truncado de la subparte (iii) que tiene uno o más de los aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 sustituido por otro aminoácido;

(vix): el análogo truncado de la subparte (iv) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituido por otro aminoácido;

(x): el análogo truncado de la subparte (v) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituido por otro aminoácido;

(xi): el análogo truncado de cualquiera de las subpartes (i)-(x) que tiene un resto metionilo N-terminal; y

(g) la proteína OB o el análogo derivado de cualquiera de las subpartes (a) a (f), formado por un resto químico conectado al resto de proteína;

(h) un derivado de la subparte (g), en el que dicho resto soluble es un resto polimérico soluble en agua;

(i) un derivado de la subparte (h), en el que dicho resto polimérico soluble en agua es polietilenglicol;

(j) un derivado de la subparte (h), en el que dicho resto polimérico soluble en agua es un resto de poliaminoácido;

(k) un derivado de la subparte (h) a (j), en el que dicho resto está unido solamente en el N-terminal de dicho resto de proteína; y

(l) una proteína OB, un análogo o un derivado de cualquiera de las subpartes (a) a (k) en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Derivados

Las presentes proteínas de fusión Fc-OB (en la presente, el término "proteína" se utiliza para incluir "péptido", Fc, OB o análogos, tales como los indicados a continuación, a menos que se indique lo contrario) se derivatizan mediante la unión de uno o más restos químicos al resto de proteína de fusión Fc-OB. Estos derivados químicamente modificados puede formularse posteriormente para la vía de administración intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intravenosa, oral, nasal, pulmonar, tópica u otras vías de administración como se analiza a continuación. Se ha descubierto que la modificación química de proteínas biológicamente activas proporciona más ventajas bajo ciertas circunstancias, tales como el aumento de la estabilidad y tiempo de circulación de la proteína terapéutica y la disminución de la inmunogenicidad. Véase, patente de EEUU nº 4.179.337, Davis et al., otorgada el 18 de diciembre, 1979. Para un informe, véase Abuchowski et al., en Enzymes as Drugs (J.S. Holcerberg y J. Roberts, eds., pp. 367-383 (1981)); Francis et al., supra.

Los restos químicos adecuados para dicha derivatización pueden seleccionarse entre diversos polímeros solubles en agua. El polímero seleccionado debe ser soluble en agua, de forma que la proteína a la que se une no precipite en un medio acuoso, tal como un medio fisiológico. Preferiblemente, para un uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar el polímero deseado basándose en consideraciones, tales como si el conjugado de polímero/proteína se va a utilizar terapéuticamente, y si es así, la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteolisis, y otras consideraciones. Para las presentes proteínas y péptidos, la eficacia de la derivatización puede determinarse mediante la administración del derivado en la forma deseada (es decir, mediante bomba osmótica o, más preferiblemente, mediante inyección o infusión, o formularse también para la administración oral, pulmonar o nasal, por ejemplo), y la observación de los efectos biológicos, como se describe en la presente.

El polímero soluble en agua puede seleccionarse del grupo que consiste, por ejemplo, en polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietoxilados, y poli(alcohol vinílico). El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación, debido a su estabilidad en agua. Además también pueden utilizarse succinato y estireno.

Las proteínas OB o Fc usadas para formular la proteína de fusión Fc-OB pueden prepararse uniendo poliaminoácidos o aminoácidos de punto de ramificación al resto de proteína Fc u OB. Por ejemplo, el poliaminoácido puede ser otra proteína portadora que, al igual que el Fc condensado con la proteína OB de la presente invención, actúa también para aumentar la semivida en circulación de la proteína, además de las ventajas logradas mediante la proteína de fusión Fc-OB anterior. Para los presentes objetivos terapéuticos o cosméticos de la presente invención, estos poliaminoácidos deben ser aquellos que no tengan o no creen una respuesta antigénica neutralizante, u otras respuestas adversas. Estos poliaminoácidos pueden seleccionarse del grupo que consiste en albúmina de suero (tal como albúmina de suero humana), otro anticuerpo o una porción del mismo (por ejemplo, la región Fc), u otros poliaminoácidos, por ejemplo, lisinas. Como se indica a continuación, la localización de la unión del poliaminoácido puede estar en el N-terminal del resto de proteína Fc-OB, o el C-terminal, u otros lugares entre ambos, y también puede estar conectado por un resto "conector" químico a la proteína Fc-OB.

El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede estar o no ramificado. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido es entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular indicado) para facilitar la manipulación y fabricación. Pueden utilizarse otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si es que tiene, sobre la actividad biológica, la facilidad en la manipulación, el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol sobre una proteína o análogo terapéuticos).

El número de moléculas de polímero unidas de esta manera puede variar, y los expertos en la técnica serán capaces de determinar el efecto sobre la función. Se puede monoderivatizar, o se puede di-, tri- o tetraderivatizar o utilizar algunas combinaciones de derivatización con los mismos o diferentes restos químicos (por ejemplo, polímeros, tales como polietilenglicoles de diferente peso molecular). La proporción de moléculas de polímero a moléculas de proteína (o péptido) varía, así como sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la proporción óptima (en términos de eficacia de la reacción, de modo que no haya un exceso de proteína o polímero sin reaccionar) vendrá determinada por factores, tales como el grado deseado de derivatización (por ejemplo, mono-, di-, tri-, etc.), el peso molecular del polímero seleccionado, si el polímero está o no ramificado, y las condiciones de reacción.

Los restos químicos deben unirse a la proteína considerando los efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Existen una serie de métodos de unión disponibles para los expertos en la técnica, por ejemplo, el documento EP 0401384 (acoplamiento de PEG a G-CSF), véase también Malik et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (describe la pegilación de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede unirse covalentemente a través de restos aminoácidos mediante un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libres. Los grupos reactivos son aquellos en los que puede unirse una molécula de polietilenglicol activada. Los restos aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir restos lisina y el resto aminoácido N-terminal. Los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir restos ácido aspártico, restos ácido glutámico, y el resto aminoácido C-terminal. También pueden utilizarse grupos sulfhidrilo como grupo reactivo para la unión de la(s) molécula(s) de polietilenglicol. Para objetivos terapéuticos, se prefiere la unión en un grupo amino, tal como la unión en el N-terminal o grupo lisina. Debe evitarse la unión en restos importantes para la unión al receptor, si se desea la unión al
receptor.

Se puede desear, específicamente, una proteína de fusión Fc-OB químicamente modificada en el N-terminal. Usando el polietilenglicol como una ilustración de las presentes composiciones, se puede seleccionar entre una diversidad de moléculas de polietilenglicol (por el peso molecular, la ramificación, etc.), la proporción de moléculas de polietilenglicol a moléculas de proteína (o péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación que se va a realizar, y el método de obtención de la proteína pegilada en el N-terminal seleccionada. El método para la obtención de la preparación pegilada en el N-terminal (es decir, la separación de este resto de otros restos monopegilados, si es necesario) puede ser mediante la purificación del material pegilado en el N-terminal, de una población de moléculas de proteína pegiladas. La modificación química selectiva en el N-terminal puede lograrse mediante una alquilación reductora, que aprovecha la distinta reactividad de diferentes tipos de grupos amino primario (la lisina frente al N-terminal) disponibles para la derivatización en una proteína concreta. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, se logra una derivatización sustancialmente selectiva de la proteína en el N-terminal con un polímero que contiene un grupo carbonilo. Por ejemplo, se puede pegilar la proteína selectivamente en el N-terminal realizando la reacción a un pH que permite aprovechar las diferencias de pK_{a} entre el grupo \varepsilon-amino de los restos lisina y el grupo \alpha-amino del resto N-terminal de la proteína. Mediante esta derivatización selectiva se controla la unión de un polímero soluble en agua a una proteína: la conjugación con el polímero se realiza predominantemente en el N-terminal de esta proteína, y no se produce ninguna modificación significativa de otros grupos reactivos, tales como los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. Utilizando una alquilación reductora, el polímero soluble en agua puede ser del tipo descrito anteriormente, y debe tener un único aldehído reactivo para acoplarse a la proteína. Puede usarse el propionaldehído de polietilenglicol, que contiene un único aldehído reactivo.

Se prefiere un derivado monopegilado en el N-terminal, porque la facilidad en la producción de una pegilación N-terminal terapéutica asegura un producto homogéneo, puesto que se simplifica la caracterización del producto con relación a los productos di- o tripegilados u otros productos multipegilados. El uso del anterior proceso de alquilación reductora para la preparación de un producto N-terminal se prefiere por su facilidad en la fabricación
comercial.

Complejos

La proteína de fusión Fc-OB puede administrarse complejada con una composición de unión. Esta composición de unión puede tener el efecto de prolongar el tiempo de circulación aún más que el logrado con la proteína de fusión Fc-OB. Esta composición puede ser una proteína (o, como sinónimo, un péptido). Un ejemplo de una proteína de unión es el receptor de la proteína OB o una porción del mismo, tal como una porción soluble del mismo. Pueden determinarse otras proteínas de unión estudiando la proteína OB o la proteína Fc-OB en el suero, o seleccionando de forma empírica para detectar la presencia de unión. Las proteínas de unión utilizadas no interferirán, de forma típica, con la capacidad de la proteína OB, o las proteínas de fusión Fc-OB, para unirse al receptor de la proteína OB endógeno y/o para realizar la transducción de señales.

Composiciones farmacéuticas

En la presente se describen métodos para utilizar composiciones farmacéuticas de las proteínas de fusión Fc-OB y derivados. Estas composiciones farmacéuticas puede ser para la administración mediante inyección, o para la administración oral, pulmonar, nasal, transdérmica u otras vías de administración. En general, se incluyen en la invención composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de proteínas de la invención, junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones incluyen diluyentes con diverso contenido en tampones (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos, tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (por ejemplo, timersol, alcohol bencílico), y sustancias de carga (por ejemplo, lactosa, manitol); la incorporación del material en preparaciones en partículas de compuestos poliméricos, tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), etc., o en liposomas. También puede utilizarse el ácido hialurónico, y éste puede tener el efecto de estimular la duración sostenida en la circulación. Estas composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de eliminación in vivo de las presentes proteínas y derivados. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), pp. 1435-1712. Las composiciones pueden prepararse en forma líquida, o pueden estar como un polvo seco, tal como una forma liofilizada. También se contemplan formulaciones de liberación sostenida implantables, tales como formulaciones transdérmicas.

Para su uso en la presente se contemplan formas de dosificación sólidas orales, que se describe, en general, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., 1990 (Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) en el capítulo 89. Las formas de dosificación sólidas incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, trociscos o pastillas, obleas o gránulos. También puede emplearse una encapsulación liposómica o proteinoide para formular las presentes composiciones (tal como, por ejemplo, las microesferas proteinoides indicadas en la patente de EEUU nº 4.925.673). Puede utilizarse la encapsulación liposómica, y los liposomas pueden derivatizarse con diversos polímeros (por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.013.556). Una descripción de las posibles formas de dosificación sólida para un uso terapéutico se ofrece en Marshall, K., en: Modern Pharmaceutics, editado por G.S. Banker y C.T. Rodees, capítulo 10, 1979. En general, la formulación incluye la proteína de fusión Fc-OB e ingredientes inertes que permiten la protección frente al medio del estómago, y la liberación del material biológicamente activo en el intestino.

También se contemplan, de forma específica, las formas de dosificación oral de las anteriores proteínas derivatizadas. La proteína de fusión Fc-OB puede modificarse químicamente de forma que la administración oral del derivado sea eficaz. En general, la modificación química contemplada es la unión de la menos un resto de la molécula de proteína (o péptido) en sí misma, en la que dicho resto permite (a) la inhibición de la proteolisis; y (b) la captación hacia la corriente sanguínea desde el estómago o intestino. También se desea un aumento en la estabilidad global de la proteína, y un aumento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Los ejemplos de estos restos incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliprolina (Abuchowski y Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, en: "Enzymes as Drugs", Hocenberg y Roberts, eds., Wiley-Interscience, Nueva York, NY (1981), pp. 367-383; Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4:185-189 (1982)). Otros polímeros que pueden utilizarse son poli-1,3-dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Para la utilización farmacéutica, como se indicó anteriormente, se prefieren los restos de polietilenglicol.

Para la proteína de fusión Fc-OB, el sitio de liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (por ejemplo, el duodeno, yeyuno o íleon) o el intestino grueso. Un experto en la técnica tiene disponibles formulaciones que no se disuelven en el estómago, sino que liberan el material en el duodeno o en otra parte del intestino. Preferiblemente, la liberación evita los efectos perjudiciales del medio del estómago, mediante la protección de la proteína de fusión Fc-OB o mediante la liberación del material biológicamente activo más allá del medio del estómago, tal como en el intestino.

Para asegurar una resistencia gástrica completa, es esencial un revestimiento impermeable al menos al pH 5,0. Los ejemplos de los ingredientes inertes más habituales que se utilizan como revestimientos entéricos son acetato trimelitato de celulosa (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, poli(acetato ftalato de vinilo) (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, acetato ftalato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S, y goma laca. Estos revestimientos pueden utilizarse como películas mixtas.

También puede usarse un revestimiento o mezcla de revestimientos sobre comprimidos, que no están previstos para su protección frente al estómago. Estos pueden incluir revestimientos de azúcares, o revestimientos que hacen que el comprimido sea más fácil de tragar. Las cápsulas pueden consistir en una envuelta dura (tal como gelatina) para la administración del producto terapéutico seco, es decir, polvo; para formas líquidas puede usarse una envuelta de gelatina blanda. El material de envuelta de las obleas puede ser almidón espeso u otro papel comestible. Para las píldoras, pastillas, comprimidos moldeados, o triturado de comprimidos, pueden emplearse técnicas de formación de masas en húmedo.

El producto terapéutico puede incluirse en la formulación como múltiples partículas finas, en forma de gránulos con un tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La formulación del material para la administración en cápsulas también puede ser como un polvo, lechos cortos ligeramente comprimidos o incluso como comprimidos. El producto terapéutico puede prepararse mediante compresión.

Pueden incluirse agentes colorantes y aromatizantes. Por ejemplo, la proteína puede formularse (tal como mediante encapsulación de liposomas o microesferas) y después introducirse dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrescante que contiene agentes colorantes y aromatizantes.

Se puede diluir o aumentar el volumen del producto terapéutico con un material inerte. Estos diluyentes incluyen carbohidratos, en especial manitol, \alpha-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. También pueden utilizarse ciertas sales inorgánicas como cargas, incluyendo el trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes disponibles en el mercado son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 15000, Emcompress y Avicell.

Pueden incluirse disgregantes en la formulación del compuesto terapéutico en una forma de dosificación sólida. Los materiales utilizados como disgregantes incluyen, pero no se limitan a almidón, incluyendo Explotab, un disgregante comercial con una base de almidón. También puede utilizarse almidón glicolato de sodio, Amberlite, carboximetilcelulosa de sodio, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, cáscara de naranja, carboximetilcelulosa ácida, esponja natural y bentonita. Otra forma de disgregantes son las resinas de intercambio catiónico insolubles. Pueden emplearse gomas en polvo como disgregantes y como ligantes, y éstas pueden incluir gomas en polvo, tales como agar, karaya o tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio también son útiles como disgregantes.

Pueden utilizarse ligantes para mantener aglutinado al agente terapéutico para formar un comprimido duro, e incluyen materiales procedentes de productos naturales, tales como goma arábiga, tragacanto, almidón y gelatina. Otros ligantes incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC). La polivinilpirrolidona (PVP) y la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) pueden utilizarse ambas en disoluciones alcohólicas para granular el producto terapéutico.

\newpage

Puede incluirse un agente antifricción en la formulación del producto terapéutico para evitar que se pegue durante el proceso de formulación. Pueden emplearse lubricantes como una capa entre el producto terapéutico y la pared del troquel, y éstos incluyen, pero no se limitan a ácido esteárico, incluyendo sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y ceras. También pueden usarse lubricantes solubles, tales como laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.

Pueden añadirse deslizantes que pueden mejorar las propiedades de fluidez del fármaco durante la formulación, y para ayudar a la redisposición durante la compresión. Los deslizantes pueden incluir almidón, talco, sílice de pirólisis y silicoaluminato hidratado.

Para ayudar en la disolución del producto terapéutico en un medio acuoso puede añadirse un tensioactivo como agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes aniónicos, tales como laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctilo de sodio, y sulfotano de dioctilo de sodio. Pueden utilizarse detergentes catiónicos y pueden incluir cloruro de benzalconio o cloruro de benzetomio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que pueden incluirse en la formulación como tensioactivos son lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerilo, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensioactivos pueden estar presentes en la formulación de la proteína o derivado por sí solos, o como una mezcla en diferentes proporciones.

Los aditivos que potencialmente aumentan la captación de la proteína son, por ejemplo, los ácidos grasos ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.

Puede resultar deseable una formulación de liberación controlada. El fármaco puede incorporarse en una matriz inerte que permite la liberación mediante mecanismos difusión o lixiviado, por ejemplo, gomas. También pueden incorporarse en la formulación matrices de degradación lenta, por ejemplo, alginatos, polisacáridos. Otra forma de liberación controlada de este producto terapéutico es mediante un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), es decir, el fármaco se encierra en una membrana semipermeable que permite la entrada de agua y empuje al fármaco hacia fuera a través de un único orificio pequeño debido a efectos osmóticos. Algunos revestimientos entéricos también tienen un efecto de liberación retrasada.

Pueden usarse otros revestimientos para la formulación. Éstos incluyen una diversidad de azúcares que pueden aplicarse en una bandeja de revestimiento. El agente terapéutico también puede administrarse como un comprimido revestido con película, y los materiales utilizados a este respecto se dividen en dos grupos. El primero son los materiales no entéricos, e incluye metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, providona y polietilenglicoles. El segundo grupo consiste en los materiales entéricos que son, de modo habitual, ésteres del ácido ftálico.

Puede utilizarse una mezcla de materiales para proporcionar el revestimiento de película óptimo. El revestimiento con película puede realizarse en una bandeja de revestimiento o en un lecho fluido, o mediante revestimiento por compresión.

También se contempla en la presente la administración pulmonar de la presente proteína. La proteína se administra a los pulmones de un mamífero cuando se inhala, y atraviesa el revestimiento epitelial del pulmón hacia la corriente sanguínea (otros informes a este respecto incluyen Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7:565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (acetato de leuprolida); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (supl. 5): s.143-146 (1989) (endotelina-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, 3:206-212 (1989) (\alpha1-antitripsina); Smith et al., J. Clin. Invest., 84:1145-1146 (1989) (\alpha-1-proteinasa); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, marzo 1990 (hormona del crecimiento humana recombinante); Debs et al., The Journal of Immunology, 140:3482-3488 (1988) (interferon-\gamma y factor de necrosis tumoral \alpha); y Platz et al., patente de EEUU nº 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos).

Se contempla para su uso en la práctica de esta invención una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, que incluyen, pero no se limitan a nebulizadores, inhaladores de dosis dosificada e inhaladores de polvos, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica.

Algunos ejemplos específicos de dispositivos disponibles en el mercado adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis dosificada Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; y el inhalador de polvos Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachussets.

Todos estos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para dispensar la proteína. De forma típica, cada formulación es específica del tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propelente apropiado, además de diluyentes, adyuvantes y/o vehículos útiles en terapia.

La proteína debe prepararse, de modo más ventajoso, en forma de partículas con un tamaño medio de partícula menor que 100 \mum (o micras), lo más preferible de 0,5 a 5 \mum, para la administración más eficaz al pulmón
distal.

Los vehículos incluyen carbohidratos tales como trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa y sorbitol. Otros ingredientes para su uso en las formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Pueden emplearse tensioactivos naturales o sintéticos. Puede usarse el polietilenglicol (incluso además de su uso en la derivatización de la proteína). Pueden emplearse dextranos, tales como ciclodextrano. Pueden usarse sales biliares y otros potenciadores relacionados. Puede utilizarse celulosa y derivados de celulosa. Pueden emplearse aminoácidos, tales como su uso en una formulación tampón.

Además se contempla el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión u otros tipos de vehículos.

Las formulaciones adecuadas para su uso con un nebulizador, a chorro o ultrasónico, comprenden, de forma típica, la proteína Fc-OB, sus análogos o derivados, disuelta en agua a una concentración de aproximadamente 0,1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por ml de disolución. La formulación también puede incluir un tampón y un azúcar sencillo (por ejemplo, para la estabilización de la proteína y la regulación de la presión osmótica). La formulación de nebulizador también puede un tensioactivo, para reducir o evitar la agregación de la proteína, inducida por las superficies, provocada por la atomización de la disolución cuando se forma el aerosol.

Las formulaciones para un uso con un dispositivo inhalador de dosis dosificada comprenden, en general, un polvo finamente dividido que contiene la proteína suspendida en un propelente con la ayuda de un tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este fin, tal como un clorofluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o sus combinaciones. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitano y lecitina de soja. El ácido oleico puede ser útil como tensioactivo.

Las formulaciones para dispensar a partir de un dispositivo inhalador de polvos comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene la proteína, y también pueden incluir un agente de relleno, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa, manitol, trehalosa o xilitol, en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo, de 50% al 90% en peso de la formulación.

También se contempla la administración nasal de la proteína. La administración nasal permite el paso de la proteína hacia la corriente sanguínea directamente después de administrar el producto terapéutico a la nariz, sin la necesidad de que el producto se deposite en el pulmón. Las formulaciones para la administración nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano. También se contempla la administración mediante el transporte a través de otras membranas mucosas.

\vskip1.000000\baselineskip

Dosificación

Un experto en la técnica será capaz de determinar las dosificaciones eficaces mediante la administración y la observación del efecto terapéutico deseado. Debido a la modificación N-terminal de la proteína OB, la presente invención proporciona una protección inesperada a la proteína frente a la degradación, y aumenta el tiempo de circulación y la estabilidad, cuando se compara con la proteína OB o la modificación C-terminal de la proteína OB. Por tanto, un experto en la técnica será capaz de determinar, a partir de estos cambios, que una dosificación eficaz puede requerir dosis menores o una dosificación menos frecuente.

Preferiblemente, la formulación de la molécula será tal que entre 0,10 \mug/kg/día y 10 mg/kg/día producirán el efecto terapéutico deseado. Las dosificaciones eficaces pueden determinarse utilizando herramientas de diagnóstico a lo largo del tiempo. Por ejemplo, un diagnóstico para medir la cantidad de proteína OB o proteína de fusión Fc-OB en la sangre (o plasma o suero) puede utilizarse, en primer lugar, para determinar los niveles endógenos de proteína. Estas herramientas de diagnóstico pueden estar en forma de un ensayo de anticuerpo, tal como un ensayo de "sándwich" de anticuerpos. Al principio se cuantifica la cantidad de proteína OB endógena y se determina una línea de base. Las dosificaciones terapéuticas se determinan a medida que la cuantificación de proteína OB endógena o exógena, o de proteína de fusión Fc-OB (es decir, la proteína que se encuentra en el cuerpo, autoproducida o administrada) continúa a lo largo del desarrollo de la terapia. Por tanto, las dosificaciones pueden variar a lo largo del desarrollo de la terapia, usando una dosificación relativamente alta al principio, hasta que se observa un beneficio terapéutico, y empleando dosificaciones más bajas para mantener los beneficios terapéuticos.

De manera ideal, en situaciones en las que sólo se desea una reducción en los niveles de lípidos sanguíneos, cuando se desea el mantenimiento de la reducción de los niveles de lípidos sanguíneos, o se desea un aumento en la masa magra corporal, la dosificación será insuficiente para producir una pérdida de peso. Por tanto, durante el desarrollo inicial de la terapia de una persona obesa, pueden administrarse dosificaciones mediante las cuales se logra una pérdida de peso y una disminución concomitante de los niveles de lípidos sanguíneos o una disminución de tejido graso/aumento de masa magra concomitante. Cuando se logra una pérdida de peso suficiente, puede administrarse una dosificación suficiente para evitar la recuperación del peso, pero que sea suficiente para mantener los niveles de lípidos sanguíneos o el aumento de masa magra (o la prevención de la reducción de masa magra) deseados. Estas dosificaciones pueden determinarse de modo empírico, puesto que los efectos de la proteína OB o Fc-OB son reversibles (por ejemplo, Campfield et al., Science, 269:546-549 (1995) en 547). Por tanto, si se observa que una dosificación produce una pérdida de peso cuando no se desea una pérdida de peso, se puede administrar una dosis menor para lograr los niveles de lípidos sanguíneos o el aumento en masa de tejido magro deseados, manteniendo el peso
deseado.

Para aumentar la sensibilidad de un individuo a la insulina, pueden tomarse en cuenta consideraciones de dosificación similares. Puede lograrse un aumento en la masa magra sin pérdida de peso que sea suficiente para disminuir la cantidad de insulina (o, potencialmente, de amilina, tiazolidindionas u otros fármacos potenciales para el tratamiento de la diabetes) que se administra a un individuo para el tratamiento de la diabetes.

Para aumentar la fuerza global, puede haber consideraciones de dosificación similares. Puede lograrse un aumento de masa magra con un aumento concomitante en la fuerza global con unas dosis que son insuficientes para producir una pérdida de peso. Otros beneficios, tal como un aumento en los eritrocitos (y la oxigenación de la sangre) y una disminución en la reabsorción ósea u osteoporosis, también pueden conseguirse en ausencia de pérdida de
peso.

\vskip1.000000\baselineskip

Combinaciones

Los métodos descritos en la presente pueden utilizarse junto con otros medicamentos, tales como aquellos que son útiles para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo, insulina, probablemente tiazolidindionas, amilina o sus antagonistas), colesterol y medicamentos para disminuir la presión sanguínea (tales como aquellos que reducen los niveles de lípidos sanguíneos u otros medicamentos cardiovasculares) y medicamentos que aumentan la actividad (por ejemplo, anfetaminas). También pueden emplearse supresores del apetito (tales como aquellos que afectan a los niveles de serotonina o neuropéptido Y). Esta administración puede ser simultánea o en serie.

Además, los métodos descritos en la presente pueden utilizarse junto con procedimientos quirúrgicos, tales como cirugías cosméticas diseñadas para alterar el aspecto global de un cuerpo (por ejemplo, liposucción o cirugías con láser diseñadas para reducir la masa corporal). Los beneficios para la salud de las cirugías cardíacas, tales como cirugías de bypass, u otras cirugías diseñadas para aliviar un trastorno perjudicial provocado por el bloqueo de los vasos sanguíneos por depósitos grasos, tal como una placa arterial, pueden aumentar con el uso concomitante de las presentes composiciones y métodos. Los métodos para eliminar las piedras biliares, tales como métodos ultrasónicos o con láser, también pueden utilizarse antes, durante o después del desarrollo de los presentes métodos terapéuticos. Además, los métodos descritos en la presente pueden utilizarse como adjuntos a cirugías o terapias para huesos rotos, músculo dañado u otras terapias que pueden mejorarse mediante un aumento en la masa de tejido
magro.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más a fondo la invención, pero no deben considerarse limitantes de su alcance.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Uso de una proteína Fc-OB murina mediante inyección subcutánea

Este ejemplo demuestra que la inyección subcutánea de una proteína Fc-OB murina produce una pérdida de peso en ratones normales. A ratones CD1 normales (no obesos) se le administró proteína Fc-OB murina mediante inyecciones subcutáneas a lo largo de un periodo de tiempo de 22 días. Una dosificación de 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día produjo una pérdida de 14% (\pm 1,1%) desde el peso de la línea de base en el día 22 de las inyecciones. Una dosificación de PBS produjo una pérdida de 3,9% (\pm 3,3%) desde el peso de la línea de base en el día 22 de las inyecciones. La pérdida de peso con el uso de 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día de proteína Fc-OB en ratones CD1 obesos produjo una pérdida de 10% (\pm 4,3%) desde el peso de la línea de base, y una dosificación de PBS produjo una pérdida de 8,7% (\pm 1,3%) desde el peso de la línea de base, ambas en el día 22 de las
inyecciones.

\newpage

A continuación se presentan las diferencias en porcentaje (%) desde el peso de la línea de base en ratones CD1 (8 semanas de edad):

TABLA 1 Pérdida de peso tras la inyección subcutánea

1

Como puede observarse, al final del día 22 del régimen subcutáneo, los animales que recibieron la proteína Fc-OB perdieron aproximadamente 14,1% de su peso corporal en animales magros, y 10% del peso corporal en animales obesos, comparados con animales que sólo recibieron el vehículo de PBS y comparados con la línea de base.

De forma sorprendente, los animales que recibieron la proteína Fc-OB hasta 22 días continuaron perdiendo peso hasta los 28 días, 4 días después de la última inyección. Los ratones CD1 normales (no obesos) a los que se les había administrado 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día de proteína Fc-OB murina mediante inyecciones subcutáneas que terminaron en el día 22 presentaron una pérdida de 21% desde el peso de la línea de base en el día 28, comparados con una pérdida de 41% en el día 22. De forma similar, los ratones CD1 obesos a los que se les había administrado 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día de proteína Fc-OB murina mediante inyecciones subcutáneas que terminaron en el día 22 presentaron una pérdida de 13% desde el peso de la línea de base en el día 28, comparados con una pérdida de 10% en el día 22. En el día 34, la pérdida de peso se mantuvo en una pérdida de 10% en ratones obesos, mientras que los ratones magros se recuperaron hasta una pérdida de 5%. Los controles en cada sistema desde el día 22 hasta el día 34 produjeron una media de 4% en ratones obesos y 7% de ganancia en ratones magros.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Uso de una proteína Fc-OB human mediante inyección subcutánea en ratones C57

Este ejemplo demuestra que la inyección subcutánea de una proteína Fc-OB humana produce una pérdida de peso en ratones normales. A ratones C57 normales (no obesos) se le administró proteína Fc-OB humana mediante inyecciones subcutáneas a lo largo de un periodo de tiempo de 7 días. Una dosificación de 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día produjo una pérdida de 12% (\pm 1,3%) desde el peso de la línea de base en el día 7 de las inyecciones. Una dosificación de 1 mg de proteína/kg de peso corporal/día produjo una pérdida de 8,9% (\pm 1,5%) desde el peso de la línea de base en el día 7 de las inyecciones. La pérdida de peso con el uso de 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día de proteína Fc-OB humana en ratones C57 obesos produjo una pérdida de 1,1% (\pm 0,99%) desde el peso de la línea de base, y una dosificación de 1 mg de proteína/kg de peso corporal/día produjo una pérdida de 2,5% (\pm 1,1%) desde el peso de la línea de base, ambas en el día 7 de las inyecciones.

Resultados

A continuación se presentan las diferencias en porcentaje (%) desde el peso de la línea de base en ratones C57 (8 semanas de edad):

TABLA 2 Pérdida de peso tras la inyección subcutánea

3

Como puede observarse, al final del día 17 después de un régimen subcutáneo de 7 días a 10 mg/kg/día, los animales que recibieron la proteína Fc-OB recuperaron hasta 8% de su peso corporal. Los animales que recibieron dosificaciones de 1 mg/kg/día después de un régimen subcutáneo de 7 días volvieron a 6,4% de peso corporal después de 12 días.

Estos estudios también demuestran que durante los periodos de recuperación desde el día 7 al día 22, después de la última inyección en el día 7, la recuperación del peso corporal es más lenta en los ratones C57 tratados con Fc-OB que en los ratones tratados con OB. Esto sugiere que la proteína Fc-OB no se elimina tan rápido como la proteína OB, provocando, con ello, un efecto extendido de pérdida de peso.

Ejemplo 3 Respuesta a la dosis de ratones CF7 tratados con proteína de fusión Fc-OB

Otro estudio demostró que existía una respuesta a la dosis frente a la administración continua de proteína Fc-OB. En este estudio, ratones CF7 obesos que pesan 35-40 g fueron administrados con una proteína Fc-OB humana recombinante utilizando métodos similares a los del anterior ejemplo. Los resultados se ofrecen en la tabla 3 a continuación (que compara el porcentaje de pérdida de peso corporal con la línea de base, medido como anteriormente):

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Respuesta a la dosis con administración continua

4

\newpage

Como puede observarse, un aumento de la dosis desde 0,25 mg/kg/día hasta 1 mg/kg/día aumentó la pérdida de peso desde 4% hasta 6%. También resulta notable que en el día 5, la dosificación de 1 mg/kg/día produjo una reducción de 16% en el peso corporal. Estos estudios también demuestran unas tasas de recuperación de peso lentas de 0%, lo cual sugiere que la proteína Fc-OB no se elimina con rapidez, provocando, con ello, un efecto extendido de pérdida de peso.

Ejemplo 4 Farmacocinética de Fc-OB humana recombinante en ratones CD-1 y perros

Este estudio demuestra las propiedades farmacocinéticas de la proteína met-Fc-OB humana recombinante en ratones CD-1 y perros. Después de una dosificación intravenosa o subcutánea de 1 mg/kg/día, se determinaron las concentraciones séricas de proteína met-Fc-OB humana recombinante y proteína met-OB human mediante un ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (ELISA).

En ambas especies, se observó un aumento de la exposición, según se cuantifica mediante concentraciones séricas pico mayores y áreas más grandes bajo la curva de concentración-suero (AUC), cuando se compara con la proteína met-OB humana. La Fc-OB tiene una menor eliminación sistémica que la proteína met-OB humana. Esto se observa en la menor eliminación y mayor semivida de la proteína Fc-OB frente a la proteína OB. El aumento en el tamaño no sólo provoca un aumento en la estabilidad de la proteína, sino que también se disminuye la eficacia de la eliminación renal. Como resultado, la Fc-OB se elimina con más lentitud de la circulación sistémica. Los aumentos en el tiempo pico, las concentraciones séricas pico y AUC para la proteína Fc-OB son coherentes con la menor eliminación. La proteína Fc-OB consigue una exposición sistémica sustancialmente mayor cuando se compara con la proteína OB. Los resultados se muestran en la tabla 4 a continuación:

TABLA 4 Propiedades farmacocinéticas

5

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra que en ratones normales que no son obesos y que no tienen niveles elevados de lípidos sanguíneos, la administración de la proteína Fc-OB humana recombinante produce la disminución de los niveles de colesterol, glucosa y triglicéridos. Además, este ejemplo demuestra que estos niveles permanecen bajos a lo largo de un periodo de recuperación de tres días.

A ratones CD1 normales se les administró proteína Fc-OB humana recombinante a través de inyecciones subcutáneas. Se tomaron muestras de sangre 24 horas después del día 23, el último día de la inyección. Como se analizó anteriormente, los animales perdieron peso en las dosificaciones administradas. Como se muestra en la tabla 5, los ratones presentaban una reducción sustancial en el colesterol, glucosa y triglicéridos séricos de una manera dependiente de la dosis, cuando se comparan con los controles:

TABLA 5

7

Estos datos demuestran que la proteína Fc-OB es un agente de disminución de lípidos sanguíneos eficaz.

Ejemplo 6

A un paciente humano obeso se le administró proteína Fc-OB humana para la reducción de peso. El paciente obeso también tenía niveles elevados de lípidos sanguíneos, incluyendo niveles elevados de colesterol, por encima de 200 mg/100 ml. El paciente logra una reducción satisfactoria de peso a lo largo de la terapia con Fc-OB. Se administra una dosis de mantenimiento de la proteína Fc-OB al paciente no obeso para mantener unos niveles bajos de lípidos sanguíneos, incluyendo unos niveles bajos de colesterol, por debajo de 200 mg/100 ml. La dosis administrada es insuficiente para producir una pérdida de peso mayor. La administración es crónica. Los niveles de proteína Fc-OB en circulación pueden controlarse utilizando un kit de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpos contra la proteína OB (u otra fuente antigénica si es pertinente).

Ejemplo 7

Un paciente humano no obeso se somete a una cirugía coronaria de bypass u otro tratamiento invasor para aliviar las etapas avanzadas de la formación de placas arteriales. Después de la cirugía, al paciente se le administra una dosis de mantenimiento de proteína Fc-OB para evitar la reformación de la placa arterial. La dosis administrada es insuficiente para producir una pérdida de peso. La administración es crónica. Los niveles de proteína Fc-OB en circulación pueden controlarse utilizando un kit de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpos contra la proteína OB (u otra fuente antigénica si es pertinente).

Ejemplo 8

Un paciente humano no obeso tiene hipertensión debida a una reducción del flujo sanguíneo en arterias obstruidas. Al paciente se le administra una dosis de Fc-OB suficiente para reducir la placa arterial que da como resultado arterias obstruidas. Después se controla al paciente para detectar más formación de placas arteriales e hipertensión. Si el trastorno reaparece, al paciente se le vuelve a administrar una cantidad eficaz de proteína Fc-OB, suficiente para restablecer el flujo sanguíneo, pero insuficiente para producir pérdida de peso. Los niveles de proteína Fc-OB en circulación pueden controlarse utilizando un kit de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpos contra la proteína Fc-OB (u otra fuente antigénica si es pertinente).

Ejemplo 9

Un paciente humano tiene piedras biliares. Las piedras biliares no se eliminan o se quiere evitar la formación de más piedras biliares, o las piedras se eliminan pero se mantiene la vesícula biliar (como, por ejemplo, mediante la utilización de cirugía con láser o ultrasónica) y se quiere evitar la formación de más piedras biliares. Al paciente se le administra una cantidad eficaz de proteína Fc-OB para dar como resultado la prevención de la acumulación de más piedras biliares o la reacumulación de piedras biliares. Los niveles de proteína Fc-OB en circulación pueden controlarse utilizando un kit de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpos contra la proteína Fc-OB (u otra fuente antigénica si es pertinente).

Ejemplo 10

Un paciente humano diabético desea utilizar unas dosificaciones reducidas de insulina para el tratamiento de la diabetes. Al paciente se le administra una dosis eficaz de proteína Fc-OB para dar como resultado un aumento en la masa de tejido magro. La sensibilidad a la insulina del paciente aumenta, y la dosificación de insulina necesaria para aliviar los síntomas de la diabetes disminuye, en términos de una disminución en las unidades de insulina necesarias, o en términos de una disminución en el número de inyecciones de insulina necesarias por día. Los niveles de proteína Fc-OB en circulación pueden controlarse utilizando un kit de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpos contra la proteína OB (u otra fuente antigénica si es pertinente).

Ejemplo 11

Un paciente humano no obeso desea un aumento en la masa de tejido magro para fines terapéuticos, tales como la recuperación de una enfermedad que eliminó masa de tejido magro. Al paciente se le admistra una cantidad eficaz de proteína Fc-OB para dar como resultado el aumento deseado en masa de tejido magro. El aumento en la masa de tejido magro se controla utilizando barrido DEXA. Los niveles de proteína Fc-OB en circulación pueden controlarse utilizando un kit de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpos contra la proteína OB (u otra fuente antigénica si es pertinente).

Materiales y métodos

Animales. Se utilizaron ratones CD1 de tipo salvaje y ratones (+/+) C57B16 para los anteriores ejemplos. La edad de los ratones en el momento del tiempo inicial era de 8 semanas, y los animales se estabilizaron frente al peso.

Alimentación y medidas del peso. Los ratones recibieron pienso para roedores triturado (PMI Feeds, Inc.) en comederos para alimento en polvo (Allentown Caging and Equipment) que permiten una medida más precisa y sensible que el uso de pienso en bloques habitual. El peso se midió en el mismo momento cada día (2:00 p.m.) durante el periodo deseado. El peso corporal el día anterior a la inyección se definió como peso de línea de base. Los ratones utilizados pesaban 18-22 gramos.

Alojamiento. Los ratones se alojaron individualmente, y se mantuvieron bajo condiciones humanitarias.

Administración de proteína o vehículo. Se administró proteína (como se describe a continuación) o vehículo (disolución salina tamponada con fosfato, pH 7,4) mediante inyecciones subcutáneas o por vía intravenosa.

Controles. Los animales control son aquellos que fueron inyectados sólo con vehículo sin proteína de fusión Fc-OB ni proteína OB añadida al vehículo.

Proteína. Las secuencias ID NO:1, 2 y 3 muestran el ADN y la proteína OB murina recombinante (figura 1), y las secuencias ID NO:4, 5 y 6 muestran el ADN y un análogo de proteína OB humana recombinante (figura 2). Como se indica anteriormente, la proteína OB humana recombinante de la SEQ ID NO: 6 tiene un resto lisina en la posición 35, y un resto isoleucina en la posición 74. Además, la proteína humana recombinante indicada en Zhang et al., Nature, supra, y la publicación PCT WO 96/05309 (22/12/96), y los análogos de proteínas recombinantes murina y humana de las figuras 1 y 2 son ilustrativas de la proteína OB que puede utilizarse para formar la proteína de fusión Fc-OB de los presentes métodos de tratamiento y fabricación de un medicamento. Otras proteínas OB o Fc también pueden utilizarse para formar la proteína de fusión Fc-OB.

En la presente, el primer aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la proteína OB recombinante se indica como +1 y es valina, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido C-terminal es el número 146 (cisteína) (véanse las figuras 1 y 2). El primer aminoácido en la secuencia de la proteína Fc-OB humana recombinante de la figura 3 se indica como +1 y es glutamato, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido C-terminal es el número 378 (cisteína). El primer aminoácido en la secuencia del variante de la proteína Fc-OB humana recombinante de la figura 4 se indica como +1 y es glutamato, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido C-terminal es el número 378 (cisteína). El primer aminoácido en la secuencia del variante de la proteína Fc-OB humana recombinante de la figura 5 se indica como +1 y es ácido aspártico, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido C-terminal es el número 373 (cisteína). El primer aminoácido en la secuencia del variante de la proteína Fc-OB humana recombinante de la figura 6 se indica como +1 y es ácido aspártico, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido C-terminal es el número 373 (cisteína).

Vector de expresión y cepa hospedante

El vector de expresión plásmido utilizado es pAMG21 (ATCC nº de registro 98113), que es un derivado de pCFM1656 (ATCC nº de registro 69576) y contiene sitios de restricción apropiados para la inserción de genes cadena abajo del promotor lux PR (véase la patente de EEUU nº 5.169.318 para una descripción del sistema de expresión lux). El ADN de Fc-OB, descrito a continuación y mostrado en las figuras 3-6, se creó y se acopló al vector de expresión pAMG21 linealizado con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI, y se transformó en una cepa hospedante de E. coli, FM5. Las células FM5 de E. coli se derivaron en Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, desde la cepa K-12 de E. coli (Bachmann et al., Bacterial. Rev., 40:116-167 (1976)) y contienen el gen represor del fago lambda integrado cI_{857} (Sussman et al., C.R. Acad. Sci., 254:1517-1579 (1962)). La producción de vectores, la transformación de células y la selección de colonias se realizaron mediante métodos convencionales (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Las células hospedantes se cultivaron en medio LB.

Construcción del ADN de Fc-OB

El plásmido pFc-A3 (descrito a continuación) sirve como fuente de la secuencia de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana IgG-1 desde el aminoácido número 99 (Glu) hasta el carboxilo-terminal natural. La secuencia de IgG-1 humana puede obtenerse en Genebank (P01857).

La secuencia de OB humana se describió anteriormente, así como en Zhang et al., Nature, supra, y en la publicación PCT WO 96/05309. El ADN de OB se acopló en el vector de expresión pCFM1656 linealizado con las endonucleasas de restricción XbaI y BamHI utilizando procedimientos de clonación convencionales, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. El plásmido pCFM1656 que porta la secuencia de ADN de OB sirve como fuente de secuencia para el gen de OB humana recombinante.

La fusión genética de estas dos secuencias se realizó mediante el método de extensión por solapamiento con PCR (Ho, S.N. et al., Site Directed Mutagenesis By Overlap Extensión Using The Polymerase Chain Reaction, Gene, 17:51-59 (1989)). El producto de la PCR se escindió con la endonucleasa de restricción NdeI para crear un extremo 5'-cohesivo, y con la endonucleasa de restricción BamHI para crear un terminal 3'-cohesivo. El vector, pAMG21, se escindió de forma parecida. Se realizó un acoplamiento con el fragmento de fusión y el vector linealizado. El ADN acoplado se transformó mediante electroporación en una cepa hospedante de E. coli. Los clones que sobrevivieron en placas de agar de selección de kanamicina (50 \mug/ml) se comprobaron para detectar la expresión de proteína de tamaño Fc-OB. Se aisló el plásmido de los clones individuales y se verificó la secuencia de la región codificadora del gen.

Cuando se desean otras modificaciones del gen Fc-OB, se volvieron a utilizar técnicas de PCR para lograr los cambios mediante modificación. Se realizaron dos conjuntos de cambios en el N-terminal de la porción Fc de la proteína de fusión (SEQ ID NO: 9) para crear los variantes de SEQ ID NO: 12 y 15. Se construyó otro variante para introducir cuatro sustituciones de aminoácidos para eliminar el sitio de unión al receptor de Fc (la leucina en la posición 15 se sustituyó por glutamato), y el sitio de unión del complemento (C1q) (el glutamato en la posición 98 se sustituyó por alanina, la lisina en la posición 100 se sustituyó por alanina, y la lisina en la posición 102 se sustituyó por alanina (véase, Xin Xiao Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600 (1995)). El molde para este constructo fue SEQ ID NO: 15, y el variante resultante es SEQ ID NO: 18.

Construcción del vector pFC-A3

Un plásmido, pFc-A3, que contiene la región que codifica la porción Fc de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana IgG-1 (véase, Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res., 10:4071-4079 (1982)), desde el primer aminoácido Glu-99 del dominio de bisagra hasta el carboxilo-terminal, más un sitio de fusión 5'-NotI y los sitios 3'-SalI y XbaI, se fabricó mediante amplificación por PCR de un banco de ADNc de bazo humano. Las reacciones de PCR se realizaron con un volumen final de 100 ml y emplearon 2 unidades de ADN polimerasa Vent en Tris-HCl 20 mM (pH 8,8), KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, MgSO_{4} 2 mM, Triton X-100 al 0,1% con 400 mM de cada dNTP y 1 ng del bando de ADNc que se va a amplificar, junto con 1 \muM de cada cebador. Las reacciones se iniciaron mediante una desnaturalización a 95ºC durante 2 min, seguido de 30 ciclos a 95ºC durante 30 seg, 55ºC durante 30 seg, y 73ºC durante 2 min. El 5'-cebador incorpora un sitio NotI inmediatamente 5' al primer resto (Glu-99) del dominio de bisagra de IgG-1. El 3'-cebador incorpora sitios SalI y XbaI. El producto de la PCR de 717 pares de bases se digirió con NotI y SalI, el fragmento de ADN resultante se aisló mediante electroforesis a través de agarosa al 1%, y se purificó y se clonó en el vector pBluescript II KS digerido con NotI y SalI (Stratagene). El inserto en el plásmido resultante, pFc-A3, se secuenció para confirmar la fidelidad de la reacción de PCR.

Métodos de producción

Los métodos que aparecen a continuación para la producción se han utilizado para producir proteínas de fusión Fc-OB y un análogo de la proteína metionil-OB humana o murina recombinante biológicamente activa. Pueden emplearse métodos similares para preparar una proteína metionil-OB humana biológicamente activa.

Proceso de fermentación

Se utilizó un proceso de fermentación discontinua. Las composiciones de los medios se indican a continuación.

Una porción de los medios que consisten principalmente en fuentes de nitrógeno fue esterilizada (aumentando la temperatura hasta 120-123ºC durante 25-35 minutos) en el recipiente de fermentación. Después de enfriar se añadieron asépticamente fuentes de carbono, magnesio, fosfato y oligoelementos. Al fermentador se le añadieron 500 ml de un cultivo durante la noche de las anteriores bacterias productoras de proteína murina recombinante (cultivadas en medio LB). Cuando la densidad óptica del cultivo (medida a 600 nm como indicadora de la densidad celular) alcanzó 15-25 unidades de absorción, se añadió una disolución autoinductora (0,5 mg/ml de lactona de homoserina) (1 ml/l) al cultivo para inducir la expresión de genes recombinantes. Se dejó que el proceso de fermentación continuase durante 10 a 16 horas más, seguido de la recolección del caldo de cultivo mediante centrifugación.

Composición de los medios:

Fermentación discontinua:

: 34 g/l: extracto de levadura

: 78 g/l: peptona de soja

: 0,9 g/l: cloruro de potasio

: 5,0 g/l: hexafosfato

: 1,7 g/l: ácido cítrico

: 120 g/l: glicerol

: 0,5 g/l: MgSO_{4}\cdot7H_{2}O

: 0,2 ml/l: disolución de oligoelementos

: 0,5 ml/l: antiespumante P2000

\vskip1.000000\baselineskip

Disolución de oligoelementos:

: Cloruro férrico (FeCl_{3}\cdot6H_{2}O): 27 g/l

: Cloruro de cinc (ZnCl_{2}\cdot4H_{2}O): 2 g/l

: Cloruro de cobalto (CoCl_{2}\cdot6H_{2}O): 2 g/l

: Molibdato de sodio (NaMoO_{4}\cdot2H_{2}O): 2 g/l

: Cloruro de calcio (CaCl_{2}\cdot2H_{2}O): 1 g/l

: Sulfato cúprico (CuSO_{4}\cdot5H_{2}O): 1,9 g/l

: Ácido bórico (H_{3}BO_{3}): 0,5 g/l

: Cloruro de manganeso (MnCl_{2}\cdot4H_{2}O): 1,6 g/l

: Citrato de sodio dihidrato: 73,5 g/l

Proceso de purificación para la proteína de fusión Fc-OB humana

La purificación de la proteína de fusión Fc-OB humana se realizó mediante las etapas que aparecen a continuación (a menos que se indique lo contrario, las siguientes etapas se realizaron a 4ºC). La purificación de la proteína OB murina y humana se describe en la publicación PCT WO 96/05309, supra.

1. Pasta celular. Se suspendió una pasta celular de E. coli en volúmenes de 5 veces de agua destilada. Las células en el agua se rompieron aún más mediante dos pases a través de un microfluidificador. Las células rotas se centrifugaron a 4,2k rpm durante 1 hora en una centrífuga Beckman JB-6 con un rotor J5-4.2.

2. Lavado de los cuerpos de inclusión. El sobrenadante de lo anterior se retiró y el sedimento se resuspendió con cinco volúmenes de agua destilada. La mezcla se centrífugo como en la etapa 1.

3. Solubilización. El sedimento se solubilizó con 10 volúmenes de Tris 50 mM, pH 8,5, hidrocloruro de guanidina 8 M, ditiotreitol 10 mM, y se agitó durante una hora a temperatura ambiente. La disolución se constituyó con dihidrocloruro de cistamina 40 mM y se agitó durante una hora.

4. La disolución de la etapa 3 se añadió a 20 a 30 volúmenes de la siguiente disolución de replegamiento: Tris 50 mM, pH 8,5, arginina 0,8 M, urea 2 M, y cisteína 4 mM. La disolución de replegamiento se agitó durante 16 horas a 8ºC.

5. Intercambio de tampón. La disolución de la etapa 4 se concentró y se diafiltró en Tris 10 mM, pH 8,5.

6. Precipitación ácida. La disolución de la etapa 5 se ajustó a pH 4,75 con ácido glacial al 50% y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La disolución se filtró.

7. Cromatografía de intercambio catiónico. La disolución de la etapa 6 se ajustó a pH 7,0 y se cargó sobre una columna CM Sepharose Fast Flow a 10ºC. Se realiza un gradiente de volumen con veinte columnas en fosfato 10 mM, pH 7,0, NaCl desde 0 a 0,1 M.

8. Cromatografía de intercambio aniónico. La reunión de elución de CM de la etapa 7 se diluye 5 veces con Tris 5 mM, pH 7,5, y se carga en una columna Q Sepharose Fast Flow a 10ºC. Se realiza un gradiente de volumen con 20 columnas en Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl desde 0 a 0,2 M.

9. Cromatografía de interacción hidrófoba. La reunión de Q Sepharose se constituye con sulfato de amonio 0,75 M y se carga sobre una columna de interacción hidrófoba Macroprep de metilo. Se realiza un gradiente de volumen con 20 columnas en fosfato 10 mM, pH 7,0, sulfato de amonio desde 0,75 M a 0 M.

10. Intercambio de tampón. La reunión de la etapa 9 se concentra según sea necesario y se dializa frente a tampón PBS.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: Mann, Michael B.

\hskip3cm

Hecht, Randy I.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES DE PROTEÍNA DE FUSIÓN OB Y MÉTODOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Amgen Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1840 Dehavilland Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Thousand Oaks

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 91320-1789

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/770.973

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 20-diciembre-1996

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Knight, Matthew W.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE INSCRIPCIÓN: 36.846

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: A-416

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 491 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 41

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met = ATG"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 491 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 147 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met (ATG) comienza en -1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 454 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met = ATG"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 454 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 147 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met (ATG) comienza en -1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1150 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met = ATG"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1150 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 379 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met (ATG) comienza en -1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

16

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1150 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met = ATG"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1150 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 379 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met (ATG) comienza en -1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1135 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met = ATG"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1135 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 374 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met (ATG) comienza en -1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1135 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: característica_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met = ATG"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1135 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 374 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota = "Met (ATG) comienza en -1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

30

Claims

1. Una proteína que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en: R_{1}-R_{2} y R_{1}-L-R_{2}, en la que R_{1} es una proteína Fc, R_{2} es una proteína OB, y L es un conector, y en la que la proteína Fc se selecciona del grupo que consiste en:

(i): uno o más restos cisteína sustituidos por un resto alanina o serina;

(ii): uno o más restos tirosina sustituidos por un resto fenilalanina;

(iii): el aminoácido en la posición 5 sustituido por una alanina;

(iv): el aminoácido en la posición 20 sustituido por glutamato;

(v): el aminoácido en la posición 103 sustituido por una alanina;

(vi): el aminoácido en la posición 105 sustituido por una alanina;

(vii): el aminoácido en la posición 107 sustituido por una alanina;

(ix): una combinación de las subpartes i-viii;

(e) un derivado de la subparte (d), en el que el polietilenglicol está unido solamente al N-terminal de dicho resto de proteína.

2. La proteína de la reivindicación 1, en la que la secuencia conectora es uno o más aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: glicina, asparagina, serina, treonina y alanina.

3. La proteína de la reivindicación 1, en la que el conector se selecciona del grupo que consiste en:

(a) ala-ala-ala;

(b) ala-ala-ala-ala;

(c) ala-ala-ala-ala-ala;

(d) gly-gly;

(e) gly-gly-gly;

(f) gly-gly-gly-gly-gly;

(g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

(h) gly-pro-gly;

(i) gly-gly-pro-gly-gly; y

(j) cualquier combinación de las subpartes (a) a (i).

4. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una fórmula selecciona del grupo que consiste en: R_{1}-R_{2} y R_{1}-L-R_{2}, en la que R_{1} es una proteína Fc, R_{2} es una proteína OB, y L es un conector, y en la que la proteína Fc se selecciona del grupo que consiste en:

(i): uno o más restos cisteína sustituidos por un resto alanina o serina;

(ii): uno o más restos tirosina sustituidos por un resto fenilalanina;

(iii): el aminoácido en la posición 5 sustituido por una alanina;

(iv): el aminoácido en la posición 20 sustituido por glutamato;

(v): el aminoácido en la posición 103 sustituido por una alanina;

(vi): el aminoácido en la posición 105 sustituido por una alanina;

(vii): el aminoácido en la posición 107 sustituido por una alanina;

(ix): una combinación de las subpartes i-viii; y

(c) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a) o (b) que tiene un resto metionilo en el N-terminal.

5. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 4, que codifica una proteína con una secuencia conectora de uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: Gly, Asn, Ser, Thr y Ala.

6. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 4, que codifica una proteína con un conector seleccionado del grupo que consiste en:

(a) ala-ala-ala;

(b) ala-ala-ala-ala;

(c) ala-ala-ala-ala-ala;

(d) gly-gly;

(e) gly-gly-gly;

(f) gly-gly-gly-gly-gly;

(g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly;

(h) gly-pro-gly;

(i) gly-gly-pro-gly-gly; y

(j) cualquier combinación de las subpartes (a) a (i).

7. Un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 4.

8. El vector de la reivindicación 7, en el que el vector es pAMG21 (ATCC 98113) y la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 4.

9. Una célula hospedante procariota o eucariota que contiene el vector de la reivindicación 7.

10. Un proceso para producir una proteína de la reivindicación 1, que comprende las etapas de cultivar, bajo condiciones adecuadas, la célula hospedante de la reivindicación 9, y aislar la proteína producida.

11. El proceso de la reivindicación 10, que comprende además la etapa de purificar la proteína producida.

12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una proteína según la reivindicación 1 en un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en exceso de peso, diabetes, niveles altos de lípidos sanguíneos, esclerosis arterial, placas arteriales, la reducción o prevención de formación de piedras biliares, insuficiente masa de tejido magro, insuficiente sensibilidad a la insulina, y accidentes cerebrovasculares.