ES2316152T3 - Osteoprotegerina. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN POLIPEPTIDO DE SECRECION, DENOMINADO OSTEOPROTEGERINA (OPG), QUE ES UN MIEMBRO DE LA SUPERFAMILIA DE RECEPTORES DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL, Y ESTA IMPLICADO EN LA REGULACION DEL METABOLISMO OSEO. ASIMISMO, SE DESCRIBEN ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN PARA OSTEOPROTEGERINA (OPG), POLIPEPTIDOS, VECTORES RECOMBINANTES Y CELULAS HUESPED PARA SU EXPRESION; ANTICUERPOS QUE SE UNEN A OPG, Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LA CONTIENEN. DICHOS POLIPEPTIDOS, SE UTILIZAN PARA TRATAR ENFERMEDADES OSEAS CARACTERIZADAS POR UNA RESORCION INCREMENTADA, COMO LA OSTEOPOROSIS.

Description

Osteoprotegerina.

Campo de la invención

La invención hace referencia a un polipéptido novedoso, denominado osteoprotegerina, que es un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, como se muestra en las Figuras 9C-9D. El polipéptido se utiliza para tratar enfermedades óseas caracterizadas por el aumento de pérdida ósea tales como la osteoporosis.

Antecedentes de la invención

Los factores de crecimiento polipeptídicos y las citoquinas son factores secretados que señalan una amplia variedad de cambios en el crecimiento, la diferenciación, y el metabolismo celular, uniéndose específicamente a receptores unidos a la superficie, discretos. Como una clase de proteínas, los receptores varían en su estructura y modo de transducción de la señal. Se caracterizan por tener un dominio extracelular que está implicado en la unión al ligando, y un dominio citoplásmico que transmite una señal intracelular apropiada. Los patrones de expresión del receptor determinan por último qué células responderán a un ligando dado, mientras la estructura de un receptor dado dicta la respuesta celular inducida por la unión al ligando. Se ha demostrado que los receptores transmiten señales intracelulares por medio de sus dominios citoplásmicos activando la fosforilación de la proteína tirosina, o de la proteína tirosina/treonina (p. ej., el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) o el receptor I del factor de crecimiento transformante \beta (TGF\betaR-I), estimulando la activación de la proteína G (p. ej., receptor \beta-adrenérgico), y modulando las asociaciones con proteínas citoplásmicas transductoras de la señal (p. ej., TNFR-1 y Fas/APO) (Heldin, Cell 80, 213-223 (1995)).

La superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) es un grupo de proteínas transmembrana de tipo I que comparte un motivo rico en cisteína conservado que se repite de tres a seis veces en el dominio extracelular (Smith, et al. Cell 76, 953-962 (1994)). En conjunto, estas unidades repetidas forman los dominios de unión al ligando de estos receptores (Chen et al., Chemistry 270, 2874-2878 (1995)). Los ligandos para estos receptores son un grupo estructuralmente relacionado de proteínas homólogas al TNF\alpha. (Goeddel et al. Cold Spring Harbor Symp. Quart. Biol. 51, 597-609 (1986); Nagata et al. Science 267, 1449-1456 (1995)). El TNF\alpha se une a receptores distintos, pero íntimamente relacionados TNFR-1 y TNFR-2. El TNF-\alpha produce una variedad de respuestas biológicas en las células que portan los receptores, incluyendo la proliferación, la diferenciación, y la citotoxicidad y la apoptosis (Beutler et al. Ann. Rev. Biochem. 57, 505-518 (1998)).

Se cree que el TNF\alpha media las respuestas inflamatorias agudas y crónicas (Beutler et al. Ann. Rev. Biochem. 57, 505-508 (1988)). La liberación sistémica de TNF\alpha induce el choque tóxico y la necrosis de los tejidos diseminados. Debido a esto, el TNF\alpha puede ser responsable de una morbidez grave y mortalidad asociada con una variedad de enfermedades infecciosas, incluyendo sepsis. Las mutaciones en FasL, el ligando para el receptor Fas/APO relacionado con TNFR (Suda et al. Cell 75, 1169-1178 (1993)), está asociado con la autoinmunidad (Fisher et al. Cell 81, 935-946 (1995)), mientras la producción en exceso de FasL puede estar implicada en la hepatitis inducida por fármacos. De este modo, los ligandos para las diversas proteínas relacionadas con TNFR median a menudo los efectos graves de muchos estados de enfermedad, lo que sugiere que los agentes que neutralizan la actividad de estos ligandos puedan tener valor terapéutico. Los receptores TNFR-1 solubles, y los anticuerpos que se unen a TNF\alpha, han sido sometidos a ensayo en cuanto a su capacidad para neutralizar el TNF\alpha sistémico (Loetscher et al. Cancer Cells 3(6), 221-226 (1991)). Una forma natural de ARNm de TNFR-1 secretado fue clonada recientemente, y su producto fue sometido a ensayo en cuanto a su capacidad para neutralizar la actividad de TNF\alpha in vitro e in vivo (Kohno et al. PNAS USA 87, 8331-8335 (1990)). La capacidad de esta proteína para neutralizar el TNF\alpha sugiere que los receptores de TNF solubles funcionan uniéndose y aclarando el TNF bloqueando de ese modo los efectos citotóxicos sobre las células que portan el TNFR.

Un objeto de la invención es identificar un nuevo miembro de la superfamilia de TNFR. Se prevé que los nuevos miembros de la familia pueden ser proteínas transmembrana o formas solubles de las mismas que comprenden dominios extracelulares y que carecen de dominios transmembrana y citoplásmicos. Los autores de la presente invención han identificado un nuevo miembro de la superfamilia de TNFR que codifica una proteína secretada que está íntimamente relacionada con el TNFR-2. Por analogía con el TNFR-1 soluble, la proteína relacionada con TNFR-2 puede regular negativamente la actividad de su ligando, y de este modo puede ser útil en el tratamiento de ciertas enfermedades humanas.

Compendio de la invención

Se ha identificado un miembro novedoso de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) a partir de una genoteca de ADNc intestinal de rata fetal. Se obtuvo un clon de ADNc completo y se secuenció. La expresión del ADNc de rata en un ratón transgénico reveló un marcado incremento de la densidad ósea, concretamente en los huesos largos, el hueso pélvico y las vértebras. El polipéptido codificado por el ADNc se denomina Osteoprotegerina (OPG) y juega un papel en la fomento de la acumulación ósea. De acuerdo con la presente invención, se ha determinado el clon de ADNc de la OPG humana.

La descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene al menos una de las actividades biológicas de la OPG. También se proporcionan los ácidos nucleicos que hibridan con los ácidos nucleicos que codifican la OPG humana mostrados en las Figuras 9C-9D (SEQ ID NO: 124). De acuerdo con la presente invención, la OPG es una OPG de mamífero y preferiblemente es la OPG humana. Los vectores recombinantes y las células anfitrionas que expresan la OPG también están incluidos así como los métodos de producción de OPG recombinante. También se describen los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente al polipéptido.

También se describen en la presente solicitud los métodos de tratamiento de las enfermedades óseas. Los polipéptidos son útiles para prevenir la resorción ósea y se pueden utilizar para tratar cualquier afección resultante de la pérdida de hueso tales como la osteoporosis, la hipercalcemia, la enfermedad ósea de Paget, y la pérdida de hueso debida a artritis reumatoide u osteomielitis, y similares. Las enfermedades óseas también pueden ser tratadas con terapia antisentido o génica utilizando los ácidos nucleicos de la invención. También se incluyen las composiciones farmacéuticas que comprenden los ácidos nucleicos y los polipéptidos de la OPG.

Descripción de las figuras

Figura 1. A. Análisis FASTA de LORF de EST novedoso. Se muestra la secuencia de aminoácidos FRI-I deducida alineada con la secuencia de TNFR-2 humano. B. El análisis del perfil de LORF de EST novedoso mostrado es la secuencia de aminoácidos FRI-I deducida alineada con el perfil de TNFR. C. Vista estructural de la superfamilia de TNFR que indica la región que es homóloga al FRI-I novedoso.

Figura 2. Estructura y secuencia del gen OPG de rata completo, un miembro novedoso de la superfamilia TNFR. A. Mapa del inserto pMOB-B1.1. El recuadro indica la posición de LORF dentro de la secuencia de ADNc (línea en negrita). El recuadro negro indica el péptido señal, y las elipses grises indican la posición de las secuencias repetidas ricas en cisteína. B, C. Secuencia de ácido nucleico y proteína del ADNc de OPG de rata. El péptido señal pronosticado está subrayado, y los sitios potenciales de glicosilación unida a N se indican en letras subrayadas en negrita. D, E. Comparación de la secuencia PILEUP (Wisconsin GCC Package, Versión 8.1) de OPG con otros miembros de la superfamilia TNFR. fas (SEQ ID NO: 128, tnfr (SEQ ID NO: 129); stv-t2 (SEQ ID NO: 130); tnfr2 (SEQ ID NO: 131); cd40 (SEQ ID NO: 132); osteo (SEQ ID NO: 133); ngfr (SEQ ID NO: 134); ox40 (SEQ ID NO: 135); 41bb (SEQ ID NO: 136).

Figura 3. Análisis PepPlot (Wisconsin GCG Package, Versión 8.1) de la secuencia de la proteína OPG de rata pronosticada. A. Representación esquemática de OPG de rata que muestra los aminoácidos hidrófobos (arriba) e hidrófilos (abajo). También se muestran los aminoácidos alcalinos (arriba) y ácidos (abajo). B. Presentación de los restos aminoácido que son formadores de lámina beta (arriba) y desorganizadores de lámina beta) definidos por Chou y Fasman (Adv. Enz. 47, 45-147 (1948)). C. Presentación de las medidas de propensión para la hélice alfa y la lámina beta (Chou y Fasman, ídem). Las curvas por encima de 1,00 muestran propensión a estructura en hélice alfa o lámina beta. La estructura puede terminar en regiones de proteína en las que las curvas caen por debajo de 1,00. D. Presentación de restos que son formadores de alfa (arriba) y desorganizadores de alfa (abajo). E. Presentación de porciones de la secuencia de proteína que se asemejan a las secuencias encontradas típicamente en el extremo amino de las estructuras alfa y beta (Chou y Fasman, ídem). F. Presentación de porciones de la secuencia de proteínas que se asemejan a las secuencias encontradas típicamente en el extremo carboxilo de las estructuras alfa y beta (Chou y Fasman, ídem). G. Presentación de porciones de las secuencias de proteínas encontradas típicamente en los giros (Chou y Fasman, ídem) H. Presentación del momento hidrófobo helicoidal (Eisenberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 140-144 (1984)) en cada posición de la secuencia. I. Presentación de hidropatía media basándose en Kyte y Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)) y Goldman et al. (revisado en Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 321-353 (1986)).

Figura 4. Patrones de expresión de ARNm para el ADNc de OPG en tejidos humanos. Las transferencias northern se sondearon con un inserto de ADNc de rata marcado con P^{32} (A, dos paneles izquierdos), o con el inserto de ADNc humano (B, panel derecho).

Figura 5. Creación de ratones transgénicos que expresan el ADNc de OPG en hepatocitos. Expresión de la transferencia northern del transgén HE-OPG en hígado de ratón.

Figura 6. Incremento de la densidad ósea en ratones transgénicos para OPG. Panel A-F. Ratones de Control. G-J, ratones que expresan OPG. En la necropsia, se tomaron radiografías de todos los animales de control y se prepararon las fotografías. En A-F, se muestran las radiografías de los animales de control y el no expresor transgénico (núm. 28). Obsérvese que los huesos tienen un córtex claramente definido y una cavidad de la médula central luminosa. En cambio, los animales con OPG (G-J) tienen un córtex poco definido y un aumento de la densidad de la zona de la médula.

Figura 7. Aumento de hueso trabecular en ratones transgénicos para OPG. A-D. Fotomicrografías representativas de huesos de animales de control. En A y B, se muestran imágenes a poca potencia (4X, 10X) de los fémures (tinción Masson Trichrome). Las tinciones para fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) demuestran osteoclastos (véanse las flechas) tanto de cartílago en resorción (C) como de hueso trabecular (D). Obsérvese la apariencia aplanada de los osteoclastos en el hueso trabecular. E-H. Fotomicrografías representativas de huesos de animales que expresan OPG. En E y F, se muestran imágenes a poca potencia (4X, 10X) de los fémures (tinción Masson Trichrome). La región clara es el cartílago de la placa de crecimiento, la zona teñida de azul es el hueso, y la zona roja es la médula. Obsérvese que en contraste con los controles, el hueso trabecular no ha sido resorbido dando como resultado la ausencia de la cavidad de la médula habitual. Asimismo, las trabéculas resultantes tienen una apariencia variegada con zonas azules y claras. Las zonas claras son remanentes de cartílago de la placa de crecimiento que nunca han sido remodelados. Basándose en las tinciones de TRAP, estos animales tienen osteoclastos (véanse las flechas) en la placa de crecimiento (G), que pueden tener un número reducido. Sin embargo, las superficies de las trabéculas lejos de la placa de crecimiento están virtualmente desprovistas de osteoclastos (H), un descubrimiento que se encuentra en contraste directo con los animales de control (véase D).

Figura 8. Los expresores de HE-OPG no tienen un defecto en el desarrollo de monocitos-macrófagos. Una causa para la osteoporosis en ratones es la producción defectuosa de M-CSF debido a una mutación puntual en el gen M-CSF. Esto da como resultado un marcado déficit de macrófagos circulantes y basados en tejidos. La sangre periférica de los expresores de OPG contenía monocitos como se evaluó mediante análisis de H1E. Para afirmar la presencia de macrófagos tisulares, se realizó la inmunohistoquímica utilizando anticuerpos F480, que reconocen un antígeno de la superficie celular sobre macrófagos murinos. A y C muestran fotomicrografías a poca potencia (4X) de los bazos de expresores en exceso normales y CR1. Obsérvese que ambos animales tienen numerosas células positivas para F480. También se encontraban monocitos-macrófagos en la médula de expresores en exceso normales (B) y HE-OPG (D) (40X).

Figura 9. Estructura y secuencia de clones de ADNc de OPG de ratón y humana. A, B. ADNc y secuencia de proteínas de ratón. C, D. ADNc y secuencia de proteínas humana. Los péptidos señal pronosticados están subrayados, y los sitios potenciales de glicosilación unida a N están indicados en negrita. E, F. Alineamiento de la secuencia y comparación de las secuencias de aminoácidos de OPG de rata, ratón y humana.

Figura 10. Comparación de la secuencias conservadas en el dominio extracelular de TNFR-1 y OPG humana. PrettyPlot (Wisconsin GCG Package, Versión 8.1) del alineamiento de TNFR1 y OPG descrito en el Ejemplo 6. Línea superior, secuencias de TNFR1 humano que codifican los dominios 1-4. Línea inferior, secuencias de OPG humana que codifican los dominios 1-4. Los restos conservados están destacados mediante recuadros rectangulares.

Figura 11. Representación tridimensional de la OPG humana. Vista lateral de la presentación Molescript de la estructura tridimensional pronosticada de los restos de la OPG humana 25 a 163, (línea ancha), co-cristalizados con TNF\beta humano (línea delgada). Como referencia para la orientación, las flechas en negrita a lo largo del esqueleto polipeptídico de la OPG están señalando en la dirección N-terminal a C-terminal. La localización las cadenas laterales del resto cisteína individual está insertada junto con el esqueleto polipeptídico para ayudar a demostrar los dominios ricos en cisteína separados. La molécula de TNF\beta está alineada como describen Banner et al. (1993).

Figura 12. Estructura de dominios ricos en cisteína de OPG. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las OPG humana (línea superior SEQ ID NO: 136) y de ratón (línea inferior) destacando la estructura del dominio pronosticado de la OPG. El polipéptido está dividido en dos mitades; el extremo N (A), y el extremo C (B). Se pronostica que la mitad N-terminal contiene cuatro dominios ricos en cisteína (marcados 1-4). Los enlaces disulfuro entre cadenas pronosticados están indicados por líneas en negrita, marcadas como "SS1", "SS2", o "SS3". Se pronostica que la tirosina 28 y la histidina 75 (subrayadas) forman una interacción iónica. Aquellos aminoácidos que se pronostica que interaccionan con un ligando de OPG están indicados mediante guiones en negrita por encima del resto apropiado. Los restos cisteína localizados en la mitad C terminal de la OPG están indicados mediante recuadros rectangulares.

Figura 13. Expresión y secreción de proteínas de fusión OPG-Fc de ratón completas y truncadas. A. Mapa que indica los puntos de fusión con el dominio Fc de la IgG1 humana indicados por puntas de flecha. B. Tinción con plata de un gel de poliacrilamida SDS de medio acondicionado obtenido de vectores de expresión de la proteína de fusión F1.Fc (OPG completa fusionada con Fc en la Leucina 401) y CT.Fc (OPG truncada en el extremo carboxi fusionada a la treonina 180). Calle 1, línea celular del vector de expresión pCEP4 parental; Calle 2, línea celular del vector Fl.Fc; Calle 3, línea celular del vector CT-Fc. C. Transferencia Western del medio acondicionado obtenido de vectores de expresión de la proteína de fusión FI.Fc y CT.Fc sondeada con el dominio Fc anti-IgG1 humana (Pierce). Calle 1, línea celular de expresión pCEP4 parental; Calle 2, línea celular del vector Fl.Fc; Calle 3, línea celular del vector CT.Fc.

Figura 14. Expresión de OPG humana en E. coli. A. Construcción de un vector de expresión bacteriano. El LORF del gen de la OPG humana se amplificó mediante PCR, después se unió a un fragmento conector oligonucleotídico (la hebra superior es el SEQ ID NO: 137; la hebra inferior es el SEQ ID NO: 127), y se ligó en el ADN vector pAMG21. El vector resultante es capaz de expresar los restos 32-401 de la OPG unidos a un resto metionina N-terminal. B. Análisis SDS-PAGE de bacterias no inducidas e inducidas que albergan el plásmido pAMG21-OPG humana-32-401. Calle 1, patrones de PM; calle 2, bacteria no inducida; calle 3, inducción a 30ºC; calle 4, inducción a 37ºC; calle 5, producto lisado celular completo de inducción a 37ºC; calle 6, fracción soluble de producto lisado celular completo; calle 7, fracción insoluble de producto lisado celular completo; calle 8, cuerpos de inclusión purificados obtenidos del producto lisado celular completo.

Figura 15. Análisis de OPG murina recombinante producida en células CHO mediante SDS-PAGE y transferencia western. Se aplicó una cantidad igual de medio acondicionado para CHO a cada calle mostrada, y se preparó mediante tratamiento con tampón reductor para la muestra (calle izquierda), o tampón no reductor para la muestra (calle derecha). Tras la electroforesis, las proteínas resueltas fueron transferidas a una membrana de nailon, después fueron sondeadas con anticuerpos anti-OPG. Las posiciones relativas de las formas monomérica de 55 kd y dimérica de 100 kd de OPG se indican mediante puntas de flecha.

Figura 16. Análisis de pulso-persecución de OPG murina recombinante producida en células CHO. Las células CHO fueron marcadas por pulsos con metionina/cisteína-S^{35}, después fueron perseguidas durante el tiempo indicado. Los cultivos marcados metabólicamente fueron separados en medio acondicionado y células, y se prepararon extractos con detergente, se aclararon, después se hicieron inmunoprecipitar con anticuerpos anti-OPG. Los productos inmunoprecipitados se resolvieron después mediante SDS-PAGE, y se expusieron a la película. Paneles superiores de izquierda a derecha; muestras analizadas en condiciones no reductoras. Paneles inferiores de izquierda a derecha; muestras analizadas en condiciones reductoras. Paneles izquierdos superior e inferior; Extractos celulares. Paneles derechos superior e inferior; Extractos de medio acondicionado. La movilidad relativa de las formas monomérica de 55 kd y dimérica de 100 kd de la OPG se indican mediante puntas de flecha.

Figura 17. Expresión de OPG en la línea celular CTLL-2. Se preparó medio acondicionado sin suero a partir de células CTLL-2 y células CHO transfectadas con mu OPG [1-141], se concentró, después se analizó mediante SDS-PAGE y transferencia western. Calle izquierda; medio acondicionado CTLL-2; Calle derecha; medio acondicionado CHO-muOPG. La movilidad relativa de las formas monomérica de 55 kd y dimérica de 100 kd de OPG se indican mediante puntas de flecha.

Figura 18. Detección de la expresión de OPG en muestras de suero y extractos de hígado obtenidos a partir de ratones de control y transgénicos para OPG. Se construyeron los ratones transgénicos como se describe en el Ejemplo 4. Se visualizó la expresión de OPG después de la SDS-PAGE seguido de transferencia Western utilizando anticuerpos anti-OPG.

Figura 19. Efectos de la proteína de fusión huOPG [22-401]-Fc sobre la formación de osteoclastos in vitro. El análisis de formación de osteoclastos se realizó como se describe en el Ejemplo 11A en ausencia (control) o presencia de las cantidades indicadas de la fusión huOPG [22-401]-Fc. La formación de osteoclastos de visualizó mediante tinción histoquímica para fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP). A. OPG añadida a 100 ng/ml. D. OPG añadida a 0,1 ng/ml. E. OPG añadida a 0,01 ng/ml. F. OPG añadida a 0,001 ng/ml. G. Control. Sin OPG añadido.

Figura 20. Disminución de la actividad TRAP en el cultivo de osteoclastos con cantidades crecientes de OPG. Se añadieron las concentraciones indicadas de proteína de fusión huOPG [22-401]-Fc para el análisis de la formación de osteoclastos y se cuantificó la actividad TRAP como se describe en el Ejemplo 11A.

Figura 21. Efecto de OPG sobre la fase terminal de la diferenciación de osteoclastos. Se añadió la fusión huOPG [22-401]-Fc para el análisis de formación de osteoclastos durante la fase intermedia de la maduración de los osteoclastos (días 5-6; OPG-CTL) o durante la fase terminal de la maduración de los osteoclastos (días 7-15; CTL-OPG). Se cuantificó la actividad TRAP y se comparó con la actividad observada en ausencia de OPG (CTL-CTL) en presencia de OPG continuo (OPG-OPG).

Figura 22. Efectos de IL-1\beta, IL-1\alpha y OPG sobre calcio ionizado en sangre en ratones. Los niveles de calcio ionizado en sangre se controlaron tras la inyección de IL-1\beta sola, IL-1\alpha sola, IL-1\beta más muOPG [22-401]-Fc, IL-1\alpha más MuOPG [22-401]-Fc, y muOPG [22-401]-Fc solo. Los ratones de control recibieron inyecciones de solución salina tamponada con fosfato (PBS) solamente. El experimento con IL-1B se mostró en A; el experimento con IL-1\alpha se mostró en B.

Figura 23. Efectos de OPG sobre los osteoclastos calváricos en ratones de control y tratados con IL1. Se describen los métodos histológicos para analizar las muestras de hueso calvárico de los ratones en el Ejemplo 11B. Las flechas indican osteoclastos presentes en los ratones tratados el día 2. Muestras calváricas de ratones que reciben cuatro inyecciones diariamente de PBS (A), una inyección de IL-1 y tres inyecciones de PBS diariamente (B), una inyección de PBS y tres inyecciones de OPG diariamente (C), una inyección de IL-1 y tres inyecciones de OPG diariamente.

Figura 24. Análisis radiográfico de acumulación de hueso en la cavidad medular de ratones normales. Se inyectó subcutáneamente a los ratones solución salina (A) o la fusión muOPG [22-401]-Fc (5 mg/kg/día) durante 14 días (B) y se determinó la densidad ósea como se describe en el Ejemplo 11C.

Figura 25. Análisis histomorfométrico de acumulación de hueso en la cavidad medular de ratones normales. Experimentos de inyección e histología ósea realizados como se describe en el Ejemplo 11C.

Figura 26. Análisis histológico de acumulación de hueso en la cavidad medular de ratones normales. Experimentos de inyección e histología del hueso realizados como se describe en el Ejemplo 11C. A. Inyección con solución salina. B. Inyección con la fusión muOPG [22-401]-Fc.

Figura 27. Actividad de OPG administrada a ratas ovacteriomizadas. En este experimento de dos semanas la tendencia a reducir la densidad ósea parece ser bloqueada por la OPG u otras terapias anti-resortivas. Se tomaron mediciones DEXA en el momento de la ovariectomía y después de 1 semana y 2 semanas de tratamiento. Los resultados se expresan como el % de cambio a partir de la densidad ósea inicial (Media \pm ETM).

Figura 28. La densidad ósea en la metáfisis femoral, medida mediante métodos histomorfométricos, tiende a ser más baja en ratas ovariectomizadas (OVX) que en animales simuladamente operados (SHAM) 17 días después de la ovariectomía. Este efecto fue bloqueado por OPG-Fc, con ratas ovariectomizadas tratadas con OPG-Fc (OVX-OPG) que tenían una densidad ósea significativamente mayor que las ratas ovariectomizadas tratadas con vehículo (OVX). (Media \pm ETM).

Descripción detallada de la invención

Se identificó un miembro novedoso de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) como una etiqueta de la secuencia expresada en exceso (EST) aislada de una genoteca de ADNc intestinal de rata fetal. Las estructuras de los clones de ADNc de rata completo y los correspondientes clones de ADNc de ratón y humano se determinaron como se describe en los Ejemplos 1 y 6. De acuerdo con la invención, el gen humano se muestra en las Figuras 9C-9D (SEQ ID NO: 124). Para comparar, los genes de rata y ratón se muestran en las Figuras 2B-2C y 9A-9B respectivamente. Las tres secuencias mostraron una fuerte similitud para los dominios extracelulares de los miembros de la familia de TNFR. Ninguno de los clones de ADNc completo aislados codificó los dominios transmembrana y citoplásmicos que cabría esperar para los receptores unidos a membrana, sugiriendo que estos ADNc codifican proteínas secretadas, solubles en lugar de receptores de la superficie celular. Una porción del gen humano que abarca los nucleótidos 1200-1353 mostrada en la Figura 9D, fue depositada en la base de datos GeneBank el 22 de Noviembre de 1995 con el número de acceso 17188769.

La distribución tisular del ARNm de rata y humano fue determinada como se describe en el Ejemplo 2. En rata, se detectó expresión de ARNm en riñón, hígado, placenta y corazón con la máxima expresión en el riñón. También se detectó en músculo esquelético y páncreas. En humanos, se detectó la expresión en los mismos tejidos junto con nódulo linfático, timo, bazo y apéndice.

El ADNc de rata fue expresado en ratones transgénicos (Ejemplo 3) utilizando el sistema de expresión del promotor ApoE específico de hígado. El análisis de la expresión mostró un marcado incremento en la densidad ósea, concretamente en los huesos largos (fémur), las vértebras y los huesos planos (pelvis). El análisis histológico de las secciones de hueso teñidas mostró una grave osteopetrosis (véase el Ejemplo 4) indicando un marcado desequilibrio entre la formación y la resorción de hueso que ha conducido a una marcada acumulación de hueso y cartílago. Un descenso en el número de osteoclastos trabeculares en los huesos de los animales expresores de OPG indica que una porción significativa de la actividad de la proteína relacionada con TNFR puede ser para evitar la resorción ósea, un proceso mediado por los osteoclastos. A la vista de la actividad en los expresores transgénicos, las proteínas relacionadas con TNFR descritas en la presente memoria se denominan OPG.

Utilizando la secuencia de ADNc de rata, se aislaron clones de ADNc de ratón y humano (Ejemplo 5). La expresión de OPG de ratón en células 293 y de OPG humana en E. coli se describe en los Ejemplos 7 y 8. La OPG de ratón fue producida como una fusión con Fc que se purificó por medio de cromatografía de afinidad con Proteína A. También se describe en el Ejemplo 7 la expresión de polipéptidos de OPG completos y truncados humanos y de ratón en células CHO y 293 o bien como polipéptidos de fusión con la región Fc de la IgG1 humana o bien como polipéptidos no fusionados. La expresión de las OPG humana y de ratón completas y truncadas en E. coli o bien como proteínas de fusión con Fc o bien como polipéptidos no fusionados se describe en el Ejemplo 8. La purificación de OPG de mamífero y bacteriana producidas recombinantemente se describe en el Ejemplo 10.

La actividad biológica de la OPG se determinó utilizando un análisis de maduración de osteoclastos in vitro, un modelo in vivo de hipercalcemia inducida por interleuquina-1 (IL-1), y estudios con inyección de la densidad ósea en ratones normales (véase el Ejemplo 11). Las siguientes proteínas recombinantes de OPG producidas en células CHO y 293 demostraron actividad en el análisis de maduración de osteoclastos en E. coli: muOPG [22-185]-Fc, muOPG [22-194]-Fc, muOPG [22-401]-Fc, muOPG [22-401], huOPG [22-201]-Fc, huOPG [22-401]-Fc. muOPG [22-180]-Fc producida en células CHO y huOPG met[32-401] producida en E. coli no demostraron actividad en este análisis in vitro.

Se produjo OPG a partir de diversas fuentes en forma de dímero y hasta cierto punto en forma de multímero superior. La OPG [22-401] de rata producida en ratones transgénicos, muOPG [22-401] y huOPG [22-401] producida como polipéptido recombinante en células CHO, y la OPG expresada como producto natural de una línea de células T citotóxicas eran predominantemente dímeros y trímeros cuando se analizaban en geles de SDS no reductores (véase el Ejemplo 9). Los polipéptidos de OPG truncados que tenían deleciones en la región de los aminoácidos 186-401 (p. ej., OPG [1-185] y OPG [1-194] eran predominantemente monoméricos sugiriendo que la región 186-401 puede estar implicada en la autoasociación de los polipéptidos de OPG. No obstante, huOPG met[32-401] producida en E. coli era en su mayor parte monomérica.

La OPG puede ser importante en la regulación de la resorción ósea. La proteína parece actuar como un receptor soluble de la familia de TNF y puede evitar una interacción receptor-ligando implicada en la ruta osteolítica. Un aspecto de la regulación parece ser una reducción del número de osteoclastos.

Ácidos Nucleicos

La descripción proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos una de las actividades biológicas de la OPG. Como se describe en la presente memoria, las actividades biológicas de la OPG incluyen, pero no están limitadas a, cualquier actividad que involucre al metabolismo óseo y en particular, incluye el aumento de la densidad ósea. Los ácidos nucleicos de la descripción se seleccionan entre los siguientes:

a) las secuencias de ácido nucleico mostradas en las Figuras 9C-9D (SEQ ID NO: 124) o hebras complementarias de las mismas;

b) los ácidos nucleicos que hibridan en condiciones restrictivas con la región codificante del polipéptido en las Figuras 2B-2C, 9A-9B y 9C-9D (SEQ ID NO: 124); y

(c) los ácidos nucleicos que hibridan en condiciones restrictivas con los nucleótidos 148 a 337 inclusive como se muestra en la Figura 1A.

d) las secuencias de ácido nucleico que son degeneradas con respecto a las secuencias de (a) y (b).

La descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican la OPG de rata, ratón y humana así como las secuencias de ácido nucleico que hibridan con ellas que codifican un polipéptido que tiene al menos una de las actividades biológicas de la OPG. Asimismo se proporcionan ácidos nucleicos que hibridan con EST de OPG de rata que abarca los nucleótidos 148-337 como se muestra en la Figura 1A. Las condiciones para la hibridación son generalmente muy restrictivas tales como 5xSSC, formamida al 50% y 42ºC descritas en el Ejemplo 1 de la memoria. Se pueden obtener fácilmente restricciones equivalentes a estas condiciones ajustando las concentraciones de sal y disolvente orgánico y la temperatura. Los ácidos nucleicos de (b) incluyen las secuencias que codifican polipéptidos relacionados con OPG que no experimentan una hibridación detectable con otros miembros conocidos de la superfamilia del receptor de TNF. En una realización preferida, los ácidos nucleicos son los mostrados en las Figuras 9C-9D (SEQ ID NO: 124).

La longitud de los ácidos nucleicos hibridantes de la invención puede ser variable puesto que la hibridación se puede producir en parte o en todas las regiones codificantes de polipéptidos como se muestra en las Figuras 9C-9D (SEQ ID NO: 124), y también se puede producir en regiones no codificantes adyacentes. Por lo tanto, los ácidos nucleicos hibridantes pueden ser truncamientos o prolongaciones de las secuencias mostradas en las Figuras 9C-9D (SEQ ID NO: 124). Los ácidos nucleicos truncados o prolongados están abarcados por la invención siempre que conserven una o más de las propiedades biológicas de la OPG. Los ácidos nucleicos hibridantes también pueden incluir regiones no codificantes adyacentes que se encuentran en 5' y/o 3' con respecto a la región codificante de OPG. Las regiones no codificantes incluyen regiones reguladoras implicadas en la expresión de OPG, tales como promotores, potenciadores, sitios de inicio de la traducción, sitios de terminación de la transcripción y similares.

Las condiciones de hibridación para los ácidos nucleicos las describen Sambrook et al. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

Se proporcionó ADN codificante de OPG de rata en el plásmido pMO-B1.1 depositado en la Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, MD el 27 de Diciembre de 1995 con el número de acceso ATCC 69970. El ADN que codificaba la OPG de ratón se proporcionó en el plásmido pRcCMV-OPG murina depositado en la Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, MD el 27 de Diciembre de 1995 con el número de acceso ATCC 69971. El ADN que codificaba la OPG humana se proporcionó en el plásmido pRcCMV-OPG humana depositado en la Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, MD el 27 de Diciembre de 1995 con el número de acceso ATCC 69969. Los ácidos nucleicos de la descripción hibridarán en condiciones restrictivas con los insertos de ADN de los números de acceso ATCC 69969, 69970, y 69971 y tienen al menos una de las actividades biológicas de la OPG.

Asimismo son proporcionados por la descripción los derivados de las secuencias de los ácidos nucleicos mostrados en las Figuras 2B, 9A y 9B. Según se utiliza en la presente memoria, los derivados incluyen secuencias de ácido nucleico que tienen adiciones, sustituciones, inserciones o deleciones de uno o más restos de manera que las secuencias resultantes codifican polipéptidos que tienen uno o más restos aminoácido que han sido añadidos, suprimidos, insertados o sustituidos y el polipéptido resultante tiene la actividad de la OPG. Los derivados de ácidos nucleicos pueden ser naturales, por ejemplo mediante variaciones de empalmes o polimorfismos, o se pueden construir utilizando las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio disponibles para el trabajador experto. Un ejemplo de una variante de origen natural de la OPG es un ácido nucleico que codifica un cambio de lys a asn en el resto 3 dentro de la secuencia líder (véase el Ejemplo 5). Se prevé que los derivados de ácidos nucleicos codifiquen cambios de aminoácidos en las regiones de la molécula que es probable que desorganicen la actividad biológica. Otros derivados incluyen un ácido nucleico que codifica una forma de OPG unida a la membrana que tiene un dominio extracelular como se muestra en las Figuras 9C-9D (SEQ ID NO: 124) junto con dominios transmembrana y citoplásmicos.

En una realización, los derivados de OPG incluyen ácidos nucleicos que codifican formas truncadas de OPG que tienen uno o más aminoácidos suprimidos del extremo carboxi. Los ácidos nucleicos que codifican la OPG pueden tener de 1 a 216 aminoácidos suprimidos del extremo carboxi. Opcionalmente, se puede extender una región Fc de un anticuerpo desde el nuevo extremo carboxi para producir un polipéptido de fusión OPG-Fc biológicamente activo. (Véase el Ejemplo 11). En las realizaciones preferidas, los ácidos nucleicos codifican una OPG que tiene la secuencia de aminoácidos desde los restos 22-185, 22-189, 22-194 o 22-201 (utilizando la numeración de la Figura 9E-F) y opcionalmente, que codifican una región Fc de una IgG humana.

También están incluidos los ácidos nucleicos que codifican las formas truncadas de OPG que tienen uno o más aminoácidos suprimidos del extremo amino. Las formas truncadas incluyen aquellas que carecen de parte o de los 21 aminoácidos que comprenden la secuencia líder. Adicionalmente, la descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican una OPG que tiene de 1 a 10 aminoácidos suprimidos del extremo amino maduro (en el resto 22) y, opcionalmente, que tiene de 1 a 216 aminoácidos suprimidos del extremo carboxi (en el resto 401). Opcionalmente, los ácidos nucleicos pueden codificar un resto metionina del extremo amino. Los ejemplos de semejantes polipéptidos de OPG truncados se describen en el Ejemplo 8.

Los ejemplos de los ácidos nucleicos de la descripción incluyen ADNc, ADN genómico, ADN sintético y ARN. El ADNc se obtiene de genotecas preparadas a partir de ARNm aislado de diversos tejidos que expresan OPG. En los seres humanos, las fuentes de tejido para la OPG incluyen riñón, hígado, placenta y corazón. El ADN genómico que codifica la OPG se obtiene de genotecas genómicas que son asequibles comercialmente de una variedad de especies. El ADN sintético se obtiene mediante síntesis química de fragmentos oligonucleotídicos solapantes seguido de ensamblaje de los fragmentos para reconstituir parte o toda la región codificante y las secuencias contiguas (véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.695.623 que describe la síntesis química de genes del interferón). El ARN se obtiene muy fácilmente por medio de vectores de expresión procarióticos que dirigen la síntesis de alto nivel del ARNm, tales como los vectores que utilizan los promotores de T7 y la ARN polimerasa.

Las secuencias de ácido nucleico de la descripción se utilizan para la detección de secuencias de OPG en muestras biológicas con el fin de determinar qué células y tejidos expresan el ARNm de OPG. Las secuencias también se pueden utilizar para escrutar el ADNc y las genotecas genómicas en cuanto a las secuencias relacionadas con la OPG. Semejante escrutinio está bastante al alcance de las capacidades de los expertos en la técnica utilizando las condiciones de hibridación apropiadas para detectar las secuencias homólogas. Los ácidos nucleicos también son útiles para modular la expresión de los niveles de OPG por medio de una terapia anti-sentido o una terapia génica. Los ácidos nucleicos también se utilizan para el desarrollo de animales transgénicos que se pueden utilizar para la producción del polipéptido y para el estudio de la actividad biológica (véase el Ejemplo 3).

Vectores y Células Anfitrionas

También se describen vectores de expresión que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican la OPG, células anfitrionas transformadas con dichos vectores y métodos para la producción de OPG. Se encuentra una visión global de la expresión de las proteínas recombinantes en Methods of Enzymology v. 185, Goeddel, D.V. ed. Academic Press (1990).

Las células anfitrionas para la producción de OPG incluyen células anfitrionas procarióticas, tales como células anfitrionas de E. coli, levadura, plantas, insectos y mamíferos. Las cepas de E. coli tales como HB101 o JM101 son adecuadas para la expresión. Las células anfitrionas de mamífero preferidas incluyen células COS, CHOd-, 293, CV-1, 3T3, de riñón de cría de hámster (BHK) y otras. se prefieren las células anfitrionas de mamífero cuando las modificaciones post-traduccionales, tales como la glicosilación y el procesamiento polipeptídico, son importantes para la actividad de la OPG. La expresión en mamíferos permite la producción de polipéptidos secretados que pueden ser recuperados del medio de crecimiento.

Los vectores para la expresión de OPG contienen un mínimo de secuencias requeridas para la propagación del vector y para la expresión del inserto clonado. Estas secuencias incluyen un origen de replicación, un marcador de selección, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, secuencias potenciadoras, un sitio de empalme de ARN y un sitio de terminación de la transcripción. Los vectores adecuados para la expresión en las células anfitrionas anteriormente mencionadas son fácilmente asequibles y los ácidos nucleicos de la descripción se insertan en los vectores utilizando técnicas de ADN recombinante normalizadas. También se incluyen los vectores para la expresión de OPG específica de tejidos. Tales vectores incluyen promotores que funcionan específicamente en el hígado, el riñón u otros órganos para la producción en ratones, y vectores virales para la expresión de OPG en células humanas elegidas como diana.

Utilizando un sistema anfitrión-vector apropiado, se produce OPG recombinantemente cultivando una célula anfitriona transformada con un vector de expresión que contiene secuencias de ácido nucleico que codifican OPG en condiciones tales que se produce OPG, y aislando el producto de expresión. La OPG se produce en el sobrenadante de las células de mamífero transfectadas o en cuerpos de inclusión de las células anfitrionas bacterianas transformadas. La OPG producida de este modo se puede purificar mediante procedimientos conocidos por un experto en la técnica como se describe más abajo. La expresión de la OPG en sistemas anfitriones de mamífero y bacterianos se describe en los Ejemplos 7 y 8. Los vectores de expresión para los anfitriones mamíferos se ilustran por medio de plásmidos tales como pDSR\alpha descrito en la Solicitud PCT Núm. 90/14363. Los vectores de expresión para las células anfitrionas bacterianas se ilustran por medio de los plásmidos pAMG21 y pAMG22-His descritos en el Ejemplo 8. El plásmido pAMG21 fue depositado en la Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, MD el 24 de Julio de 1996 con el número de acceso 98113. El plásmido pAMG22-His fue depositado en la Colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, MD el 24 de Julio de 1996 con el número de acceso 98112. Se prevé que los plásmidos específicos y las células anfitrionas descritas tengan fines ilustrativos y que también se puedan utilizar otros plásmidos y células anfitrionas disponibles para expresar los polipéptidos.

La descripción también proporciona la expresión de OPG a partir de ácidos nucleicos endógenos por medio de eventos de recombinación in vivo y ex vivo para permitir la modulación de OPG a partir del cromosoma del anfitrión. También se incluye la expresión de OPG por medio de la introducción de secuencias reguladoras exógenas (p. ej. promotores o potenciadores) capaces de dirigir la producción de OPG a partir de regiones codificantes de OPG endógenas. Asimismo se proporciona en la descripción la estimulación de secuencias reguladoras endógenas capaces de dirigir la producción de OPG (p. ej. mediante la exposición a factores potenciadores de la transcripción).

Polipéptidos

La invención proporciona OPG, un miembro novedoso de la superfamilia del receptor de TNF, que tiene una actividad asociada con el metabolismo óseo y en particular que tiene la actividad de inhibir la resorción ósea incrementado de ese modo la densidad ósea. La OPG hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de OPG humana o un derivado de la misma que tiene al menos una de las actividades biológicas de la OPG. La secuencia de aminoácidos de la OPG humana se muestra en las Figuras 9C-9D (SEC ID NO: 125). Un derivado de OPG hace referencia a un polipéptido que tiene una adición, deleción, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos de manera que el polipéptido resultante tiene al menos una de las actividades biológicas de la OPG. Las actividades biológicas de la OPG incluyen, pero no están limitadas a, actividades que implican el metabolismo óseo. Preferiblemente, los polipéptidos tendrán eliminada la secuencia líder amino terminal de 21 aminoácidos.

Los polipéptidos de OPG abarcados por la descripción incluyen el [1-401] humano, el [22-180] de ratón, el [22-401] humano, el [22-180] humano, el [1-180] humano, la fusión [22-180]-Fc humana y met-32-401 humano. La numeración de aminoácidos se muestra en el SEQ ID NO: 125 (humano). Asimismo se incluyen los derivados polipeptídicos que tienen deleciones de truncamientos carboxi terminales de parte o de todos los restos aminoácido 180-401 de OPG; uno o más cambios de aminoácidos en los restos 180-401; deleción de parte o de todo el dominio rico en cisteína de la OPG, en particular la deleción del dominio rico en cisteína distal (carboxi terminal); y uno o más cambios de aminoácidos en un dominio rico en cisteína, en particular en el dominio rico en cisteína distal (carboxi terminal). En una realización, la OPG tiene de 1 a aproximadamente 216 aminoácidos suprimidos del extremo carboxi. En otra realización, la OPG tiene de 1 a aproximadamente 10 aminoácidos del extremo amino maduro (donde el extremo amino maduro
está en el resto 22) y, opcionalmente, tiene de 1 a aproximadamente 216 aminoácidos suprimidos del extremo carboxi.

Los polipéptidos de OPG adicionales abarcados por la descripción incluyen los siguientes: fusión [22-180]-Fc humana, fusión [22-201]-Fc humana, fusión [22-401]-Fc humana, fusión [22-185]-Fc de ratón, fusión [22-194]-Fc de ratón. Estos polipéptidos son producidos en células anfitrionas de mamífero, tales como células CHO o 293. Los polipéptidos de OPG adicionales abarcados por la invención que son expresados en células anfitrionas procarióticas incluyen los siguientes: met[22-401] humano, fusión Fc-met[22-401] humana (la región Fc está fusionada al extremo amino de la secuencia codificante de OPG completa como se describe en el Ejemplo 8), fusión met[22-401]-Fc humana (la región Fc está fusionada a la secuencia de OPG completa), fusión Fc-met[22-401] de ratón, fusión met[22-401]-Fc de ratón, met[27-401] humano, met[22-185] humano, met[22-189] humano, met[22-194] humano, met[22-194] (P2SA), met[22-194] humano (P26A), met[27-185] humano, met[27-189] humano, met[27-194] humano, met-arg-gly-ser-(his)6 [22-401] humano, met-lys[22-401] humano, met-(lys)_{3}-[22-401] humano, met[22-401]-Fc (P25A) humano, met[22-401] (P25A) humano, met[22-401] (P26A) humano, met[22-401] (P26D) humano, met[22-401] de ratón, met[27-401] de ratón, met[32-401] de ratón, met[27-180] de ratón, met[22-189] de ratón, met[22-194] de ratón, met[27-189] de ratón, met[27-194] de ratón, met-lys[22-401] de ratón, HEK[22-401] de (A45T) ratón, met-lys-(his)_{7}[22-401] de ratón, met-lys[22-401]-(his)_{7} de ratón y met[27-401] (P33E, G36S, A45P) de ratón. Se entiende que los polipéptidos de OPG anteriores producidos en células anfitrionas procarióticas tienen un resto metionina amino terminal, si semejante resto no está indicado. En ejemplos específicos, se utilizó la fusión OPG-Fc producida utilizando una región de 227 aminoácidos de la IgG1-\gamma1 humana que tenía la secuencia mostrada por Ellison et al. (Nuc. Acids Res. 10, 4071-4079 (1982)). Sin embargo, también se pueden utilizar variantes de la región Fc de la IgG humana.

El análisis de la actividad biológica de los truncamientos de OPG carboxi terminales fusionados con la región Fc de IgG1 humana indica una porción de OPG de aproximadamente 164 aminoácidos que es necesaria para la actividad. Esta región abarca los aminoácidos 22-185, preferiblemente aquellos de la Figura 9C-9D (SEQ ID NO: 125), y comprende cuatro dominios ricos en cisteína característicos de los dominios ricos en cisteína de los dominios extracelulares de TNFR.

Utilizando la homología entre la OPG y los dominios de unión al ligando extracelulares de los miembros de la familia del receptor de TNF, se generó un modelo tridimensional de OPG basándose en la estructura cristalina conocida del dominio extracelular del TNFR-I (véase el Ejemplo 6). Este modelo se utilizó para identificar aquellos restos de OPG que pueden ser importantes para la actividad biológica. Se identificaron los restos cisteína que están implicados en el mantenimiento de la estructura de los cuatro dominios ricos en cisteína. Se identificaron los siguientes enlaces disulfuro en el modelo: Dominio 1: cys41 a cys54, cys44 a cys62, tyr23 e his 66 pueden actuar estabilizando la estructura de este dominio; Dominio 2: cys65 a cys80, cys83 a cys98, cys87 a cys105; Dominio 3: cys107 a cys118, cys124 a cys142; Dominio 4: cys145 a cys160, cys166 a cys185. También se identificaron los restos que estaban en íntima proximidad con TNF\beta como se muestra en las Figuras 11 y 12A-12B. En este modelo, se supone que la OPG se une a un ligando correspondiente; se utilizó TNF\beta como ligando modelo para estimular la interacción de OPG con su ligando. Basándose en este modelo, los siguientes restos pueden ser importantes para la unión al ligando: glu34, lys43, pro66 a gln91 (en particular, pro66, his68, tyr69, tyr70, thr71, asp72, ser73, his76, ser77, asp78, glu79, leu81, tyr82, pro85, val86, lys88, glu90 y gln91), glu153 y ser155.

Las alteraciones en estos restos aminoácido, ya sea individualmente o combinadas, pueden alterar la actividad biológica de la OPG. Por ejemplo, los cambios en los restos cisteína específicos pueden alterar la estructura de los dominios ricos en cisteína individuales, mientras los cambios en los restos importantes para la unión al ligando pueden afectar a las interacciones físicas de la OPG con el ligando. Los modelos estructurales pueden ayudar a identificar análogos que tienen propiedades más deseables, tales como una actividad biológica potenciada, una mayor estabilidad, o una mayor facilidad de formulación.

La invención también proporciona un dímero de OPG que comprende monómeros de OPG. La OPG parece ser activa en forma de multímero (p. ej., dímero, trímero de un número mayor de monómeros). Los multímeros de OPG pueden comprender monómeros que tienen una secuencia de aminoácidos de OPG suficiente para promover la formación de multímeros o puede comprender monómeros que tienen secuencias heterólogas tales como una región Fc de un anticuerpo. Los análisis de las deleciones carboxi terminales de la OPG sugieren que al menos una porción de la región 186-401 está implicada en la asociación de los polipéptidos de OPG. También se describe la sustitución de parte o de toda la región de aminoácidos 186-401 de la OPG por una secuencia de aminoácidos susceptible de auto-asociación. Alternativamente, los polipéptidos de OPG o sus derivados descritos pueden ser modificados para formar dímeros o multímeros mediante mutagénesis dirigida al sitio para crear restos cisteína desemparejados para la formación de enlaces disulfuro intercatenarios, mediante entrecruzamiento fotoquímico, por ejemplo exposición a luz ultravioleta, o mediante entrecruzamiento químico con moléculas conectoras bifuncionales tales como polietilenglicol bifuncional y similares.

Las modificaciones de los polipéptidos de OPG incluyen modificaciones post-traduccionales (p. ej., cadenas carbohidratadas unidas a N o unidas a O, procesamiento de los extremos N-terminal o C-terminal), anclaje de radicales químicos al esqueleto de aminoácidos, modificaciones químicas de cadenas carbohidratadas unidas a N o unidas O, y adición de un resto metionina N-terminal como resultado de la expresión en células anfitrionas procarióticas. Los polipéptidos también pueden ser modificados con una marca detectable, tal como una marca enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad para permitir la detección y el aislamiento de la proteína.

Las modificaciones adicionales de OPG incluyen proteínas quiméricas en las que la OPG es fusionada con una secuencia de aminoácidos heteróloga. La secuencia heteróloga puede ser cualquier secuencia que permita que la proteína de fusión resultante conserve la actividad de la OPG. Las secuencias heterólogas incluyen, por ejemplo, fusiones con inmunoglobulinas, tales como fusiones con Fc, que pueden ayudar a la purificación de la proteína. Se prefiere una secuencia heteróloga que promueve la asociación de monómeros de OPG para formar dímeros, trímeros y otras formas multiméricas superiores.

Los polipéptidos de la invención son aislados y purificados de otros polipéptidos presentes en los tejidos, líneas celulares y células anfitrionas transformadas que expresan OPG, o purificados de los componentes de los cultivos celulares que contienen la proteína secretada. En una realización, el polipéptido está libre de asociación con otras proteínas humanas, tales como el producto de expresión de una célula anfitriona bacteriana.

Asimismo son proporcionados por la invención los derivados modificados químicamente de la OPG que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como el incremento de la estabilidad y el tiempo de circulación del polipéptido, o la disminución de la inmunogenicidad (véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.179.337). Los radicales químicos para la transformación se seleccionan entre polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico) y similares. Los polipéptidos pueden ser modificados en posiciones al azar dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más radicales químicos anclados.

El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido se encuentra entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el término "aproximadamente" que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular establecido) para facilitar la manipulación y la fabricación. Se pueden utilizar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (p. ej. la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si los hubiera, sobre la actividad biológica, la facilidad de manipulación, el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol para una proteína terapéutica o análogo).

Las moléculas de polietilenglicol (u otros polímeros solubles en agua) deben ser anclados a la proteína teniendo en cuenta los efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Existen numerosos métodos de anclaje disponibles para los expertos en la técnica, p. ej. el documento EP 0 401 384 incorporado en la presente memoria como referencia (acoplamiento de PEG a G-CSF), véase también Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (referente a la pegilación de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol se puede unir covalentemente por medio de restos aminoácido a través de un grupo reactivo, tal como, un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los cuales se puede unir una molécula de polietilenglicol activada. Los restos aminoácido que tienen un grupo amino libre pueden incluir restos lisina y los restos aminoácido N-terminales; aquellos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir restos ácido aspártico, restos ácido glutámico y el resto aminoácido C-terminal. También se pueden utilizar grupos sulfhidrilo como grupo reactivo para anclar una o varias moléculas de polietilenglicol. Con fines terapéuticos se prefiere el anclaje a un grupo amino, tal como al anclaje el extremo N o a un grupo lisina.

Se puede desear específicamente una proteína modificada químicamente en el extremo N. Utilizando el polietilenglicol como una ilustración de las composiciones de la presente invención, se puede seleccionar una entre una amplia variedad de moléculas de polietilenglicol (por el peso molecular, la ramificación, etc.), la proporción de moléculas de polietilenglicol con respecto a las moléculas de proteína (o péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación que se vaya a realizar y el método de obtención de la proteína pegilada N-terminalmente seleccionada. El método de obtención de la preparación pegilada N-terminalmente (esto es, la separación de este radical de otros radicales monopegilados si fuera necesario) puede ser mediante purificación del material pegilado N-terminalmente de una población de moléculas de proteína pegiladas. La modificación química N-terminal selectiva se puede completar mediante alquilación reductiva que explota la reactividad diferencial de distintos tipos de grupos amino primarios (lisina frente a N-terminal) disponible para la transformación en una proteína concreta. En condiciones de reacción apropiadas, se logra una transformación sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N con un polímero que contiene grupos carbonilo.

Los dímeros de OPG sintéticos se pueden preparar por medio de diversos procedimientos de entrecruzamiento químico. Los monómeros de OPG pueden estar conectados químicamente de cualquier manera que conserve o potencie la actividad biológica de la OPG. Se pueden utilizar una variedad de entrecruzadores químicos dependiendo de qué propiedades del dímero proteico se deseen. Por ejemplo, los entrecruzadores pueden ser cortos y relativamente rígidos o más largos y más flexibles, pueden ser biológicamente reversibles, y pueden proporcionar una inmunogenicidad reducida o una vida media farmacocinética más larga.

En un ejemplo, las moléculas de OPG están conectadas a través del extremo amino por medio de una síntesis de dos etapas (véase el Ejemplo 12). En la primera etapa, la OPG es modificada químicamente en el extremo amino para introducir un tiol protegido, que después de la purificación es desprotegido y utilizado como punto de anclaje para la conjugación de sitio específico por medio de una variedad de entrecruzadores con una segunda molécula de OPG. Los entrecruzamientos amino terminales incluyen, pero no están limitados a, un enlace disulfuro, conexiones tioéter utilizando una cadena corta, entrecruzadores alifáticos bis-funcionales, y conexiones tioéter para entrecruzadores de polietilenglicol bifuncionales, de longitud variable "dumbbell" de PEG (proteína de tipo dumbbell que tiene 2 dominios globulares conectados por un segmento helicoidal largo). Asimismo la síntesis de dumbbell de PEG de dímeros de OPG incluye un subproducto de semejante síntesis, denominado "monobell" (proteína de tipo monobell que tiene 1 dominio globular con un segmento helicoidal largo). Un monobell de OPG consiste en un monómero acoplado a un PEG bifuncional lineal con un extremo libre de polímero. Alternativamente, la OPG puede ser entrecruzada directamente a través de una variedad de técnicas de entrecruzamiento homobifuncional específicas que incluyen reactivos tales como: dianhídrido dietilentriaminopentaacético (DTPA), p-benzoquinona (pBQ) o suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS^{3}) así como otros conocidos en la técnica. También es posible tiolar la OPG directamente con reactivos tales como iminotiolano en presencia de una variedad de entrecruzadores específicos de tiol, bifuncionales, tales como bismaleimida de PEG, y obtener la dimerización y/o las dumbbell en un procedimiento de una etapa.

También se incluye un método para la purificación de OPG a partir de fuentes naturales y de células anfitrionas transfectadas. El procedimiento de purificación puede emplear una o más etapas de purificación de proteína normalizadas en un orden apropiado para obtener la proteína purificada. Las etapas de la cromatografía pueden incluir intercambio iónico, filtración en gel, interacción hidrófoba, fase reversa, cromatoenfoque, cromatografía de afinidad empleando un anticuerpo anti-OPG o complejo de afinidad de biotina-estreptavidina y similares.

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Anticuerpos

También están incluidos en la descripción los anticuerpos que se unen específicamente a la OPG. Los antígenos para la generación de anticuerpos pueden ser polipéptidos completos o péptidos que abarcan una porción de la secuencia de la OPG. Los procedimientos inmunológicos para la generación de anticuerpos policlonales o monoclonales reactivos con OPG son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)). Los anticuerpos producidos de este modo se caracterizan por la especificidad de unión y el reconocimiento epitópico utilizando análisis de inmunoabsorción con enzima ligada normalizados. Los anticuerpos también incluyen anticuerpos quiméricos que tienen regiones de los dominios constantes y variables derivadas de diferentes especies. En una realización, los anticuerpos quiméricos son anticuerpos humanizados que tienen dominios variables murinos y dominios constantes humanos. También están incluidas las regiones determinantes de la complementariedad injertadas en un marco humano (también denominados anticuerpos injertados con CDR). Los anticuerpos quiméricos e injertados con CDR son elaborados mediante métodos recombinantes conocidos por los expertos en la técnica. También están incluidos los anticuerpos humanos producidos en ratones.

Los anticuerpos anti-OPG de la descripción se pueden utilizar como reactivos de afinidad para purificar la OPG a partir de muestras biológicas (véase el Ejemplo 10). En un método, el anticuerpo es inmovilizado sobre Sefarosa activada con CnBr y se utiliza una columna de producto conjugado de anticuerpo-Sefarosa para separar la OPG de las muestras líquidas. Los anticuerpos también se utilizan como reactivos de diagnóstico para detectar y cuantificar la OPG en muestras biológicas mediante los métodos descritos más abajo.

Composiciones Farmacéuticas

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de la invención junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o coadyuvante farmacéuticamente aceptable. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" representa una cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una afección y una ruta de administración especificadas. La composición se puede encontrar en forma líquida o pulverizada y comprende un diluyente (tampones Tris, acetato o fosfato) que tienen diversos valores de pH y fuerzas iónicas, solubilizante tal como Tween o Polisorbato, portadores tales como seralbúmina humana o gelatina, conservantes tales como timerosal o alcohol bencílico, y antioxidantes tales como ácido ascórbico o metabisulfito de sodio. También están incluidas las composiciones que comprenden OPG modificada con polímeros solubles en agua para aumentar la solubilidad o la estabilidad. Las composiciones también pueden comprender la incorporación de OPG en liposomas, microemulsiones, micelas o vesículas para la liberación controlada a lo largo de un período de tiempo prolongado. Específicamente, las composiciones de OPG pueden comprender la incorporación en matrices poliméricas tales como hidrogeles, siliconas, polietilenos, copolímeros de etileno-acetato de vinilo, o polímeros biodegradables. Los ejemplos de los hidrogeles incluyen polihidroxialquilmetacrilatos (p-HEMA), poliacrilamida, polimetacrilamida, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico) y diversos complejos polielectrolíticos. Los ejemplos de los polímeros biodegradables incluyen poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímeros de PLA y PGA, poliamidas y copolímeros de poliamidas y poliésteres. Otras formulaciones de liberación controlada incluyen microcápsulas, microesferas, complejos macromoleculares y cuentas poliméricas que se pueden administrar mediante inyección.

La selección de una composición concreta dependerá de numerosos factores, incluyendo la afección que está siendo tratada, la ruta de administración y los parámetros farmacocinéticos deseados. Un estudio más extenso de los componentes adecuados para las composiciones farmacéuticas se encuentra en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. A.R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1980).

Las composiciones de la invención pueden ser administradas mediante inyección, ya sea subcutánea, intravenosa o intramuscular, o mediante administración oral, nasal, pulmonar o rectal. La ruta de administración seleccionada eventualmente dependerá de numerosos factores y puede ser averiguada por un experto en la técnica.

La descripción también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de los ácidos nucleicos de la invención junto con un coadyuvante farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de ácido nucleico serán adecuadas para la liberación de parte o de toda la región codificante de OPG en células y tejidos como parte de un régimen de terapia antisentido o génica.

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Métodos de Tratamiento

El tejido óseo proporciona un soporte para el organismo y consiste en mineral (en gran parte calcio y fósforo), una matriz de proteínas colagenosas y no colagenosas, y células. Tres tipos de células encontradas en el hueso, osteocitos, osteoblastos y osteoclastos, están implicados en el proceso dinámico por medio del cual el hueso es formado y resorbido continuamente. Los osteoblastos promueven la formación de tejido óseo mientras los osteoclastos están asociados con la resorción. La resorción, o la disolución de la matriz ósea y el mineral, es un proceso rápido y eficaz en comparación con la formación de hueso y puede liberar grandes cantidades de mineral del hueso. Los osteoclastos están implicados en la regulación de la remodelación normal del tejido esquelético y en la resorción inducida por las hormonas. Por ejemplo, la resorción es estimulada por la secreción de hormona paratiroidea en respuesta a concentraciones decrecientes de ión calcio en los fluidos extracelulares. Por el contrario, la inhibición de la resorción es la principal función de la calcitonina. Además, los metabolitos de la vitamina D alteran la sensibilidad del hueso a la hormona paratiroidea y a la calcitonina.

Tras la madurez esquelética, la cantidad de hueso en el esqueleto refleja el equilibrio (o desequilibrio) de la formación y resorción del hueso. La masa de hueso pico se produce después de la madurez esquelética antes de la cuarta década. Entre la cuarta y la quinta décadas, el equilibrio se desplaza y domina la resorción ósea. El inevitable descenso de la masa ósea con el paso de los años empieza antes en las mujeres que en los hombres y está claramente acelerada después de la menopausia en algunas mujeres (principalmente aquellas de ascendencia Caucásica y
Asiática).

La osteopenia es una afección relacionada generalmente con cualquier disminución de la masa ósea por debajo de los niveles normales. Semejante afección puede surgir de un descenso en la velocidad de síntesis del hueso o un incremento en la destrucción del hueso o ambos. La forma más común de osteopenia es la osteoporosis primaria, también referida como osteoporosis postmenopáusica y senil. Esta forma de osteoporosis es una consecuencia de la pérdida universal de hueso con la edad y normalmente es un resultado del aumento de la resorción ósea con una velocidad normal de formación de hueso. Aproximadamente un 25 a 30 por ciento de todas las mujeres blancas de los Estados Unidos desarrollan osteoporosis sintomática. Existe una relación directa entre la osteoporosis y la incidencia de fractura de cadera, fémur, cuello e inter-trocantérica en mujeres de 45 años y mayores. Los hombres ancianos desarrollan osteoporosis sintomática entre las edades de 50 y 70, pero la enfermedad afecta principalmente a las mujeres.

La causa de la osteoporosis post-menopáusica y senil es desconocida. Se han identificado numerosos factores que pueden contribuir a la afección. Estos incluyen la alteración de los niveles de hormonas que acompaña al envejecimiento y el consumo inadecuado de calcio atribuido a un descenso de la absorción intestinal de calcio y otros minerales. Los tratamientos han incluido normalmente terapia hormonal o suplementos dietéticos en un intento de retrasar el proceso. Hasta la fecha, sin embargo no existe un tratamiento eficaz para la pérdida de hueso.

La invención proporciona el uso de los polipéptidos de la invención para su utilización en el tratamiento de los trastornos óseos empleando una cantidad terapéuticamente eficaz de OPG. El trastorno óseo puede ser cualquier trastorno caracterizado por una pérdida neta de hueso (osteopenia u osteolisis). En general, se prevé el tratamiento con OPG cuando es necesario contener la velocidad de resorción ósea. De este modo, se puede realizar el tratamiento para reducir la velocidad de resorción ósea cuando la velocidad de resorción es superior a la normal o reducir la resorción ósea por debajo de los niveles normales con el fin de compensar los niveles de formación de hueso por debajo de los normales.

Las afecciones que son tratables con la OPG incluyen las siguientes:

Osteoporosis, tal como osteoporosis primaria, osteoporosis endocrina (hipertiroidismo, hiperparatiroidismo, síndrome de Cushing, y acromegalia), formas hereditarias y congénitas de osteoporosis (osteogénesis imperfecta, homocistinuria, síndrome de Menkes, y síndrome de Riley-Day) y osteoporosis debida a la inmovilización de las extremidades.

Enfermedad del hueso de Paget (osteitis deformans) en adultos y jóvenes

Osteomielitis, o lesión infecciosa del hueso, conduciendo a pérdida de hueso.

Hipercalcemia resultante de tumores sólidos (mama, pulmón y riñón) y malignidades hematológicas (mieloma múltiple, linfoma y leucemia), hipercalcemia idiopática, e hipercalcemia asociada con hipertiroidismo y trastornos de la función renal.

Osteopenia siguiente a cirugía, inducida por la administración de esteroides, y asociada con trastornos del intestino delgado y grueso y con enfermedades hepáticas y renales crónicas.

Osteonecrosis, o muerte de las células del hueso, asociada con lesión traumática o necrosis no traumática asociada con enfermedad de Gaucher, anemia de las células falcadas, lupus eritematoso sistémico y otras afecciones.

Pérdida de hueso debida a artritis reumatoide.

Pérdida de hueso periodontal.

Metástasis osteolítica.

Se entiende que la OPG se puede utilizar sola o junto con otros factores para el tratamiento de los trastornos óseos. En una realización, la osteoprotegerina se utiliza junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un factor que estimula la formación de hueso. Tales factores incluyen, pero no están limitados a factores morfogénicos de hueso denominados BMP-1 a BMP-12, factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) y miembros de la familia de TGF-\beta, inhibidores de interleuquina-1, inhibidores de TNF\alpha, hormona paratiroidea y sus análogos, proteína relacionada con la hormona paratiroidea y sus análogos, prostaglandinas de la serie E, bifosfonatos (tales como alendronato y otros), y minerales potenciadores del hueso tales como fluoruros y calcio.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no se consideran limitantes del alcance de la misma. Cualquiera de los ejemplos que no caiga dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas se proporciona con fines meramente comparativos.

Ejemplo 1 Identificación y Aislamiento del ADNc de OPG de rata

Los materiales y métodos para la clonación y análisis del ADNc son descritos por Maniatis et al. ídem. Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron utilizando un termociclador Perkin-Elmer 9600 utilizando una mezcla de reacción para PCR (Boehringer-Mannheim) y las concentraciones de cebador especificadas por el fabricante. En general, se desnaturalizaron 25-50 \mul de reacciones a 94ºC, seguido de 20-40 ciclos de 94ºC durante 5 segundos, 50-60ºC durante 5 segundos, y 72ºC durante 3-5 minutos. Las reacciones se trataron a 72ºC durante 3-5 minutos. Después las reacciones se analizaron mediante electroforesis en gel como describen Maniatis et al., ídem.

Se construyó una genoteca de ADNc utilizando ARNm aislado de intestino d20 embrionario para el análisis de EST (Adams et al. Science 252, 1651-1656 (1991)). Se diseccionaron embriones de rata, y los intestinos delgado y grueso en desarrollo completos se separaron y se lavaron en PBS. Se purificó el ARN celular total mediante extracción con tiocianato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo (Chomczynski y Sacchi Anal. Biochem. 162, 156-159, (1987)). Se obtuvo la fracción de ARNm poli(A+) a partir de la preparación de ARN total mediante adsorción, y elución, de Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal Corp) utilizando los procedimientos recomendados por el fabricante. Se preparó una genoteca de ADNc cebado al azar utilizando el Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithesburg, Md). El cebador de ADNc al azar que contenía el sitio de restricción NotI interno se utilizó para iniciar la síntesis de la primera hebra y tenía la siguiente secuencia:

5'-AAAGGAAGGAAAAAAGCGGCCGCTACANNNNNNNNT-3'	(SEQ ID NO: 1)
\hskip4.7cm NotI

Para la síntesis de la primera hebra se ensamblaron tres reacciones separadas que contenían 2,5 \mug de ARN poli(A) y 120 ng, 360 ng o 1.080 ng de cebador al azar. Tras la síntesis de la segunda hebra, los productos de reacción se extrajeron por separado con una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (razón 25:24:1), y después se precipitaron con etanol. Los productos de ADNc de doble hebra (dh) de las tres reacciones se combinaron y se ligaron al siguiente adaptador oligonucleotídico dh:

5'-TCGACCCACGCGTCCG-3'	(SEQ ID NO: 2)
3'-GGGTGCGCAGGCp-5'	(SEQ ID NO: 3)

Tras la ligación el ADNc fue digerido por completo con NotI, extraído con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y precipitado con etanol. El ADNc resuspendido fue fraccionado después por tamaños mediante filtración en gel utilizando columnas prefabricadas provistas de Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithersburg, Md) como recomienda el fabricante. Las dos fracciones que contenían los productos de ADNc más grandes se reunieron, se precipitaron con etanol y después se ligaron direccionalmente en el ADN del vector pMOB digerido con NotI y SalI (Strathmann et al. 1991). El ADNc ligado se introdujo en E. coli DH10B ElectroMAX competente (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) mediante electroporación. Para el análisis de secuencias automatizado se cultivaron en placa aproximadamente 10.000 transformantes sobre placas de agar de 20 cm x 20 cm que contenían medio nutriente LB con un suplemento de ampicilina. Las colonias que surgieron se seleccionaron y se dispusieron sobre placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían 200 ml de caldo L, glicerol al 7,5%, y 50 \mug/ml de ampicilina. Los cultivos se hicieron crecer durante la noche a 37ºC, se elaboró un grupo duplicado de placas de microtitulación utilizando una herramienta de replicación de 96 pines estéril, después ambos grupos se almacenaron a -80ºC para su análisis adicional. Para la clonación del ADNc completo se cultivaron aproximadamente un millón de transformantes sobre 96 placas de ampicilina bacterianas que contenían aproximadamente 10.000 clones cada una. El ADN plasmídico de cada reserva se aisló por separado utilizando Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen Corp. Alemania) y se dispuso en placas de microtitulación de 96 pocillos para los análisis mediante PCR.

Para secuenciar los clones de ADNc de intestino de rata fetal al azar, se descongelaron las soluciones de partida en glicerol, y se diluyeron pequeñas alícuotas 1:25 en destilada. Aproximadamente 3,0 \mul de los cultivos bacterianos diluidos se añadieron a la mezcla de reacción para PCR (Boehringer Mannheim) que contenía los siguientes oligonucleótidos:

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'	(SEQ ID NO: 4)
5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'	(SEQ ID NO: 5)

Las reacciones se incubaron en un termociclador (Perkin-Elmer 9600) con las siguientes condiciones de ciclo: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC durante 5 segundos; 50ºC durante 5 segundos, y 72ºC durante 3 minutos; 72ºC durante 4 minutos. Tras la incubación en el termociclador, las reacciones se diluyeron con 2,0 ml de agua. Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron adicionalmente utilizando columnas Centricon (Princeton Separations) utilizando los procedimientos recomendados por el fabricante. Los productos de la reacción de PCR se secuenciaron sobre un secuenciador de ADN automatizado 373A de Applied Biosystems utilizando reacciones Taq Dye-Terminator con un cebador T3 (oligonucleótido 353-23; 5'-CAATTAACCCTCACTAAAGG-3' (SEQ ID NO: 6) (Applied Biosystems) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante.

La secuencia de nucleótidos 5' resultante obtenida de los clones de ADNc escogidos al azar se tradujo y después se comparó con las bases de datos existentes de secuencias de proteínas conocidas utilizando una versión modificada del programa FASTA (Pearson et al. Meth. Enzymol. 183, (1990)). Las secuencias traducidas también se analizaron en cuanto a la presencia de un motivo de proteína rico en cisteína específico encontrado en todos los miembros conocidos de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) (Smith et al. Cell 76, 959-962 (1994)), utilizando el método del perfil de secuencias de Gribskov et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4355-4359 (1987)), modificado por Luethy et al. (Protein Science 3, 139-146 (1994)).

Utilizando los datos de las búsquedas FASTA y Profile, se identificó una EST, FRI-1 (Intestino de Rata Fetal-1) como un posible nuevo miembro de la superfamilia del TNFR. FRI-1 contenía un inserto de aproximadamente 600 pb con un LORF de aproximadamente 150 aminoácidos. La coincidencia más próxima en la base de datos fue el TNFR humano de tipo II (TNFR-2). La región comparada mostraba una homología de \sim43% entre TNFR-2 y FRI-1 a lo largo de este LORF de 150 aa. El análisis Profile utilizando la primera y la segunda repeticiones ricas en cisteína de la superfamilia del TNFR produjo una puntuación Z de \sim8, indicando que el gen de FRI-1 codifica posiblemente un nuevo miembro de la familia. Para deducir la estructura del producto de FRI-1, se escrutó la genoteca de ADNc de intestino de rata fetal en cuanto a clones completos. Los siguientes oligonucleótidos estaban derivados de la secuencia de FRI-1 original:

5'-GCATTATGACCCAGAAACCGGAC-3'	(SEQ ID NO: 7)
5'-AGGTAGCGCCCTTCCTCACATTC-3'	(SEQ ID NO: 8)

Estos cebadores se utilizaron en reacciones de PCR para escrutar 96 reservas de ADN plasmídico, conteniendo casa reserva ADN plasmídico de 10.000 clones de ADNc independientes. Se amplificó aproximadamente 1 \mug de ADN de la reserva plasmídica en una mezcla de reacción para PCR (Boehringer-Mannheim) utilizando un termociclador de 96 pocillos Perkin-Elmer con las siguientes condiciones de ciclo: 2 minutos a 94ºC, 1 ciclo; 15 segundos a 94ºC, después 45 segundos a 65ºC, 30 ciclos; 7 minutos a 65ºC, 1 ciclo. Los productos de la reacción de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel. Trece de las 96 reservas de ADN plasmídico dieron lugar a productos de ADN amplificados con la masa molecular relativa esperada.

El ADN de una reserva positiva se utilizó para transformar E. coli DH10B ElectroMAX competente (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) como se ha descrito antes. Aproximadamente 40.000 transformantes se cultivaron en placa sobre filtros de nitrocelulosa estériles (BA-85, Schleicher y Schuell), y después se escrutaron mediante hibridación de colonias utilizando una versión marcada con dCTP-P^{32} del producto de la PCR obtenido antes. Los filtros se pre-hibridaron en 5X SSC, formamida desionizada al 50%, 5X solución de Dendhardt, SDS al 0,5%, y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado durante 2-4 horas a 42ºC. Después los filtros se hibridaron en 5X SSC, formamida desionizada al 50%, 2X solución de Dendhardt, SDS al 0,1%, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y \sim5 ng/ml de la sonda marcada durante \sim18 horas a 42ºC. Después los filtros se lavaron en 2X SSC durante 10 minutos a RT, 1X SSC durante 10 minutos a 55ºC, y finalmente en 0,5X SSC durante 10-15 minutos a 55ºC. Los clones hibridantes se detectaron tras la autorradiografía, y después se volvieron a cultivar en placa sobre filtros de nitrocelulosa para un escrutinio secundario. Tras el escrutinio secundario, se aisló un clon plasmídico (pB1.1), después se amplificó en medio de caldo L que contenía 100 \mug/ml de amplicilina y se obtuvo el ADN plasmídico. Se secuenciaron ambas hebras del inserto pB1.1 de 2,4 kb.

La secuencia del inserto pB1.1 se utilizó para una búsqueda FASTA de la base de datos pública para detectar cualquier emparejamiento de secuencias y/o similitudes existentes. No se encontraron emparejamientos con ninguno de los genes o EST conocidos, aunque había una similitud de aproximadamente 45% con los genes TNFR-2 humano y de ratón. Se encontró un codón de iniciación de metionina en el pb 124 de la secuencia de nucleótidos, seguido de un LORF que codificaba 401 restos aa que terminaba en el pb 1327. Se pronostica que el producto de 401 restos aa tiene un péptido señal hidrófobo de aproximadamente 31 restos en su extremo N, y 4 sitios potenciales de glicosilación unida a N. No se identificó ninguna secuencia hidrófoba que se extendiera transmembrana utilizando el programa PepPlot (Wisconsin GCG Package, versión 8.1). La secuencia de 401 aa deducida se utilizó después para buscar en las bases de datos de proteínas. De nuevo, no hubo emparejamientos existentes, aunque parecía haber una fuerte similitud con muchos miembros de la superfamilia del TNFR, muy notablemente el TNFR-2 humano y de ratón. Se preparó un alineamiento de secuencias de esta proteína novedosa con miembros conocidos de la superfamilia del TNFR utilizando el programa Pileup, y después se modificó mediante PrettyPlot (Wisconsin GCG Package, versión 8.1). Este alineamiento muestra una clara homología entre el producto génico FRI-1 completo y todos los demás miembros de la familia del TNFR. La región homóloga cartografía el dominio extracelular de los miembros de la familia del TNFR, y corresponde con las tres o cuatro repeticiones ricas en cisteína encontradas en el dominio de unión al ligando de estas proteínas. Esto sugería que el gen FRI-1 codificaba un miembro de la familia del TNFR novedoso. Puesto que no se detectó ninguna región que se extendiera transmembrana los autores de la presente invención pronosticaron que esta podía ser un receptor secretado, similar a los receptores solubles derivados de TNFR-1 (Kohno et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331-8335 (1990)). Debido a la actividad biológica aparente del gen FRI-1 (ver más abajo), el producto fue denominado Osteoprotegerina (OPG).

Ejemplo 2 Patrones de Expresión del ARNm de OPG en Tejidos

Se sondearon múltiples transferencias northern de tejido humano (Clonetech) con un producto de PCR de FRI-1 marcado con dCTP-P^{32} para detectar el tamaño del transcrito humano y para determinar los patrones de expresión. Las transferencias northern se pre-hibridaron en 5X SSPE, formamida al 50%, 5X solución de Dendhardt, SDS al 0,5%, y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado durante 2-4 horas a 42ºC. Las transferencias se hibridaron después en 5X SSPE, formamida al 50%, 2X solución de Dendhardt, SDS al 0,1%, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y 5 ng/ml de sonda marcada durante 18-24 horas a 42ºC. Las transferencias se lavaron después en 2X SSC durante 10 minutos a RT, 1X SSC durante 10 minutos a 50ºC, después en 0,5X SSC durante 10-15 minutos.

Utilizando una sonda derivada del gen de rata, se detecta una especie de ARNm predominante con una masa molecular relativa de aproximadamente 2,4 kb en diversos tejidos, incluyendo riñón, hígado, placenta, y corazón. Los niveles más altos se detectan en el riñón. Se detectó una especie de ARNm grande de Mr 4,5 y 7,5 kb en el músculo esquelético y el páncreas. En suero fetal humano, se encontró que el riñón expresa niveles relativamente elevados del ARNm de 2,4 kb. Utilizando una sonda humana (véase más abajo), solamente se detecta el transcrito de 2,4 kb en estos mismos tejidos. Además, se detectaron niveles relativamente elevados del transcrito de 2,4 kb en el nódulo linfático, el timo, el bazo y el apéndice. El tamaño del transcrito detectado por el gen de la Osteoprotegerina tanto de rata como humana es casi idéntico a la longitud del inserto pB1.1 FRI-1 de rata, sugiriendo que era un clon de ADNc completo.

Ejemplo 3 Liberación sistémica de OPG en ratones transgénicos

Se utilizó el clon de OPG de rata pB1.1 como molde para amplificar mediante PCR la región codificante para subclonarla en un vector de expresión específico de hígado-ApoE (Simonet et al. J. Clin. Invest. 94, 1310-1319 (1994), y Solicitud PCT Núm. US94/11675 y el documento con el Núm. de Serie de los Estados Unidos del mismo propietario 08/221.767. Se utilizaron los siguientes cebadores oligonucleotídicos 5' y 3' para la amplificación mediante PCR, respectivamente:

5'-GACTAGTCCCACAATGAACAAGTGGCTGTG-3'	(SEQ ID NO: 9)
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATGAAACAGCCCAGTGACCATTC-3'	(SEQ ID NO: 10)

La mezcla de reacción de PCR (Boehringer-Mannheim) se trató como sigue: 94ºC durante 1 minuto,1 ciclo; 94ºC durante 20 segundos, 62ºC durante 30 segundos, y 74ºC durante 1 minuto, 25 ciclos. Después de la amplificación, las muestras se purificaron sobre columnas para PCR Qiagen y se digirieron durante la noche con las enzimas de restricción SpeI y NotI. Los productos digeridos se extrajeron y se hicieron precipitar y se subclonaron en el vector de expresión con el promotor ApoE. Antes de microinyectar el clon resultante, HE-OPG, éste fue secuenciado para asegurarse de que estaba libre de mutaciones.

El plásmido HE-OPG se purificó por medio de dos rondas de centrifugación en gradiente de densidad de CsCl. El ADN plasmídico purificado fue digerido con XhoI y AseI, y el inserto del transgén de 3,6 kb se purificó mediante electroforesis en gel. El fragmento purificado se diluyó hasta una solución inyectable de partida de 1 \mug/ml en Tris 5 mM, pH 7,4, EDTA 0,2 mM. Se inyectaron embriones unicelulares de ratones de cría BDF1 x BDF1 esencialmente como se ha descrito (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4338 (1985)), excepto que las agujas para la inyección fueron biseladas y siliconizadas antes de su uso. Los embriones se cultivaron durante la noche en una incubadora con CO_{2} y se transfirieron de 15 a 20 embriones de 2 células a los oviductos de hembras de ratón CD1 pseudopreñadas.

Al término de la preñez, se obtuvieron 49 vástagos de la implantación de los embriones microinyectados. Los vástagos fueron escrutados mediante amplificación por PCR del transgén integrado en las muestras de ADN genómico. La región diana para la amplificación fue una región de 369 pb del intrón Apo E humano que se incluyó en el vector de expresión. Los oligos utilizados para la amplificación por PCR fueron:

5'-GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3'	(SEQ ID NO: 11)
5'-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3'	(SEQ ID NO: 12)

Las condiciones para la PCR fueron: 94ºC durante 2 minutos, 1 ciclo; 94ºC durante 1 minuto, 63ºC durante 20 segundos, y 72ºC durante 30 segundos, 30 ciclos. De los 49 vástagos originales, 9 fueron identificados como fundadores transgénicos positivos para la PCR.

A las 8-10 semanas de edad, cinco fundadores transgénicos (2, 11, 16, 17, y 28) y cinco controles (1, 12, 15, 18, y 30) fueron sacrificados para su necropsia y análisis patológico. Se aisló el hígado de los 4 fundadores restantes mediante hepatectomía parcial. Para la hepatectomía parcial, los ratones se anestesiaron y se separó quirúrgicamente un lóbulo del hígado. Se aisló el ARN celular total de los hígados de todos los fundadores transgénicos, y 5 camadas de control negativo como se ha descrito (McDonald et al. Meth. Enzymol. 152, 219 (1987)). Se realizó el análisis de transferencia northern en estas muestras para evaluar el nivel de expresión del transgén. Aproximadamente 10 \mug del ARN total del hígado de cada animal se resolvieron mediante geles desnaturalizantes de electroforesis (Ogden et al. Meth. Enzymol 152, 61 (1987)), después se transfirieron a una membrana de nailon HYBOND-N (Amersham), y se sondearon con ADN del inserto pB1.1 marcado con dCTP-P^{32}. La hibridación se realizó durante la noche a 42ºC en formamida al 50%, 5 X SSPE, SDS al 0,5%, 5 x solución de Dendhardt, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 2-4 x 10^{6} cpm de sonda marcada/ml de tampón de hibridación. Después de la hibridación, las transferencias se lavaron dos veces en 2 X SSC, SDS al 0,1% a la temperatura ambiente durante 5 minutos cada una, y después dos veces en 0,1 X SSC, SDS al 0,1% a 55ºC durante 5-10 minutos cada una. La expresión del transgén en el fundador y en las camadas de control se determinó después de la autorradiografía.

Los datos de la transferencia northern indican que 7 de los fundadores transgénicos expresan niveles detectables del ARNm del transgén (animal número 2, 11, 16, 17, 22, 33, y 45). Los ratones de control negativo y uno de los fundadores (núm. 28) expresaron ARNm no relacionado con el transgén. Puesto que se pronostica que la OPG es una proteína secretada, la expresión excesiva del ARNm del transgén debe ser un intermediario para el nivel de producto génico liberado sistémicamente. De los ratones positivos para la PCR y la transferencia northern, el animal 2, 17 y 22 expresaron los niveles más elevados de ARNm del transgén, y pueden mostrar efectos biológicos más extensos sobre las células anfitrionas y los tejidos.

Ejemplo 4 Actividad biológica de OPG

Cinco de los ratones transgénicos (animales 2, 11, 16, 17 y 28) y 5 camadas de control (animales 1, 12, 15, 18, y 30) se sacrificaron para la necropsia y el análisis patológico utilizando los siguientes procedimientos: Antes de la eutanasia, todos los animales tenían sus números de identificación verificados, después se pesaron, se anestesiaron y se recogió su sangre. La sangre se reservó tanto para suero como para sangre completa para un panel completo químico y hematológico del suero. La radiografía se realizó justo después de la anestesia terminal mediante inhalación de CO_{2} letal, y antes de la disección descriptiva. Después de esto, se separó el tejido y se fijó en Zn-formalina tamponada al 10% para el examen histológico. Los tejidos recogidos incluyeron hígado, bazo, páncreas, estómago, duodeno, íleo, colon, riñón, órganos reproductores, piel y glándulas mamarias, hueso, cerebro, corazón, pulmón, timo, tráquea, esófago, tiroides, yeyuno, cecum, recto, glándulas suprarrenales, vejiga urinaria, y músculo esquelético. Antes de la fijación se determinó el peso de los órganos completos para hígado, estómago, riñón, glándulas suprarrenales, bazo, y timo. Tras la fijación los tejidos fueron preparados en bloques de parafina, y se obtuvieron secciones de 3 \mum. El tejido óseo se descalcificó utilizando solución de ácido fórmico, y todas las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina. Además, se realizaron en ciertos tejidos la tinción con reticulina de Gomori y tricromo de Masson. Se realizó la histoquímica enzimática para determinar la expresión de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP), una enzima altamente expresada por los osteoclastos, células de resorción ósea multinucleadas del linaje de monocitos-macrófagos. También se realizó la inmunohistoquímica para los antígenos de la superficie de monocitos-macrófagos BrdU y F480 para detectar las células replicantes y las células del linaje de monocitos-macrófagos, respectivamente. Para detectar la expresión del antígeno de superficie F480, las secciones de 4 \mum embebidas en parafina, fijadas con formalina fueron desparafinadas e hidratadas con agua desionizada. Las secciones fueron sofocadas con peróxido de hidrógeno, bloqueadas con Protein Block (Lipshaw, Pittsburg, PA), e incubadas en anti-F480 monoclonal de ratón de rata (Harlan, Indianápolis, IN). Este anticuerpo fue detectado por medio de inmunoglobulinas anti-rata de conejo biotiniladas, estreptavidina conjugada con peroxidasa (BioGenex San Ramón, CA) con DAB como cromágeno (BioTek, Santa Bárbara, CA). Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina.

Tras la disección descriptiva y la observación de los tejidos viscerales, no se encontraron anomalías en los expresores transgénicos o las camadas de control. El análisis del peso de los órganos indica que el tamaño del bazo aumentaba aproximadamente un 38% en ratones transgénicos en relación con los controles. Había un ligero aumento del tamaño de las plaquetas y un incremento de las células no teñidas circulantes en los expresores transgénicos. Había un descenso marginal de los niveles de plaquetas en los expresores transgénicos. Además, los niveles de ácido úrico en suero, nitrógeno en la urea, y fosfatasa alcalina tendían todos a disminuir en los expresores transgénicos. Se encontró que los expresores tenían una radiodensidad incrementada en el esqueleto, incluyendo los huesos largos (fémures), vértebras, y huesos planos (pelvis). El tamaño relativo de los fémures en los expresores no fue diferente del de los ratones de control.

El análisis histológico de las secciones teñidas del hueso de los expresores de OPG muestra una severa osteopetrosis con la presencia de remanentes de cartílago de la esponjosa primaria observada en las trabéculas óseas en la diáfisis del fémur. No era identificable un córtex claramente definido en las secciones de fémur. En los animales normales, la diafisis central está llena de médula ósea. Las secciones de las vértebras también muestran cambios osteopetróticos que implican que los cambios esqueléticos inducidos por OPG eran sistémicos. La médula ósea residual mostró elementos mieloides predominantemente. Se encontraban presentes megacariocitos. Las tinciones de reticulina no mostraron evidencia de depósito de reticulina. La inmunohistoquímica para F480, un antígeno de la superficie celular expresado por las células de derivación de monocitos-macrófagos en los ratones, mostró la presencia de células F480 positivas en los espacios medulares. Focalmente, se pudieron observar células F480 positivas aplanadas directamente adyacentes a las superficies de hueso trabecular.

Las células del mesénquima que recubren las trabéculas óseas eran aplanadas y parecían inactivas. Basándose en las tinciones H&E y TRAP, raramente se encontraron osteoclastos sobre las superficies óseas trabeculares en los expresores de OPG. Por el contrario, se observaron osteoclastos y/o condroclastos en la región del cartílago en resorción de la placa de crecimiento, pero sus números podían ser reducidos en comparación con los controles. Asimismo, se encontraron presentes osteoclastos sobre la superficie cortical de la metáfisis donde la actividad modeladora es normalmente fuerte. La diferencia predominante entre los expresores y los controles fue el profundo descenso de los osteoclastos trabeculares, tanto en vértebras como en fémures. El grado de acumulación ósea se correspondía directamente con el nivel de ARNm del transgén de OPG detectado mediante transferencia northern del ARN de hígado total.

\newpage

Los bazos de los expresores de OPG tenían un aumento de la cantidad de pulpa roja con una expansión debida a un aumento de la hematopoyesis. Todos los linajes hematopoyéticos están representados. Las células F480 positivas estuvieron presentes tanto en el control como en los expresores de OPG en la pulpa roja. Dos de los expresores (2 y 17) tuvieron focos de hematopoyesis extramedular en el hígado y esto se debe probablemente a una médula osteopetrótica.

No hubo anomalías observables en el timo, los nódulos linfáticos, el tracto gastrointestinal, el tracto pancreato-hepatobiliar, el tracto respiratorio, el sistema reproductor, el sistema genito-urinario, la piel, el sistema nervioso, el corazón y la aorta, la mama, el músculo esquelético y la grasa.

Ejemplo 5 Aislamiento de ADNc de OPG de ratón y humana

Se aisló un clon de ADNc correspondiente al extremo 5' del ARNm de OPG de ratón de una genoteca de ADNc de riñón de ratón (Clontech) mediante amplificación por PCR. Los oligonucleótidos se derivaron de la secuencia de ADNc de OPG de rata y se muestran más abajo:

5'-ATCAAAGGCAGGGCATACTTCCTG-3'	(SEQ ID NO: 13)
5'-GTTGCACTCCTGTTTCACGGTCTG-3'	(SEQ ID NO: 14)

\vskip1.000000\baselineskip

5'-CAAGACACCTTGAAGGGCCTGATG-3'	(SEQ ID NO: 15)
5'-TAACTTTTACAGAAGAGCATCAGC-3'	(SEQ ID NO: 16)

\vskip1.000000\baselineskip

5'-AGCGCGGCCGCATGAACAAGTGGCTGTGCTGCG-3'	(SEQ ID NO: 17)
5'-AGCTCTAGAGAAACAGCCCAGTGACCATTCC-3'	(SEQ ID NO: 18)

Los productos de ADNc parciales y completos obtenidos en este procedimiento se secuenciaron. El producto completo fue digerido con NotI y XbaI, después fue clonado direccionalmente en el vector plasmídico pRcCMV (Invitrogen). El plásmido resultante fue denominado pRcCMV-Mu-OPG. La secuencia de nucleótidos del producto clonado se comparó con la secuencia de ADNc de OPG de rata. A lo largo de la región de 1.300 pb que abarca el LORF de la OPG, las secuencias de ADN de rata y ratón son aproximadamente idénticas en un 88%. La secuencia de ADNc de ratón contenía un LORF de 401 aa, que se comparó con la secuencia de proteínas de OPG de rata y se encontró que era idéntica en \sim94% sin espacios. Esto indica que la secuencia de ADNc de ratón aislada codifica la proteína OPG murina, y que la secuencia y estructura ha sido altamente conservada a lo largo de la evolución. La secuencia de proteínas de la OPG de ratón contiene un supuesto péptido señal idéntico en su extremo N, y los 4 sitios de glicosilación unida a N potenciales están conservados.

Se clonó un ADNc de OPG humana parcial a partir de una genoteca de ADNc de riñón humano utilizando los siguientes oligonucleótidos específicos de rata:

5'-GTG AAG CTG TGC AAG AAC CTG ATG-3'	(SEQ ID NO: 19)
5'-ATC AAA GGC AGG GCA TAC TTC CTG-3'	(SEQ ID NO: 20)

Este producto de la PCR fue secuenciado y utilizado para diseñar cebadores para amplificar el extremo 3' del ADNc humano utilizando un clon genómico de OPG humana en lambda como molde:

5'-TCCGTAAGAAACAGCCCAGTGACC-3'	(SEQ ID NO: 29)
5'-CAGATCCTGAAGCTGCTCAGTTTG-3'	(SEQ ID NO: 21)

El producto de la PCR amplificado fue secuenciado, y junto con la secuencia del extremo 5', fue utilizado para diseñar los cebadores específicos humanos 5' y 3' útiles para amplificar las secuencias codificantes del ADNc de OPG humana completo:

5'-AGCGCGGCCGCGGGGACCACAATGAACAAGTTG-3'	(SEQ ID NO: 22)
5'-AGCTCTAGAATTGTGAGGAAACAGCTCAATGGC-3'	(SEQ ID NO: 23)

El producto de la PCR humano completo fue secuenciado, después fue clonado direccionalmente en el vector plasmídico pRcCMV (Invitrogen) utilizando NotI y XbaI. El plásmido resultante fue denominado pRcCMV-OPG humana. La secuencia de nucleótidos del producto clonado fue comparada con las secuencias de ADNc de OPG de rata y de ratón. A lo largo de la región de 1.300 pb que abarca el LORF de OPG, las secuencias de ADN de rata y de ratón son idénticas aproximadamente en un 78-88% al ADNc de OPG humana. La secuencia de ADNc de OPG humana también contenía un LORF de 401 aa, y se comparó con las secuencias de proteínas de rata y de ratón. La proteína OPG humana pronosticada es idéntica aproximadamente en un 85%, e idéntica en \sim90% a las proteínas de rata y de ratón, respectivamente. El alineamiento de las secuencias de las proteínas de rata, ratón y humanas muestran que han sido altamente conservadas durante la evolución. Se pronostica que la proteína humana tiene un péptido señal N-terminal, y 5 sitios de glicosilación unida a N potenciales, 4 de los cuales están conservados entre las proteínas OPG de rata y de ratón.

La secuencia de ADN y de aminoácidos pronosticada de la OPG de ratón se muestran en la Figura 9A y 9B (SEQ ID NO: 122). La secuencia de ADN y de aminoácidos pronosticada de la OPG humana se muestran e la Figura 9C y 9D (SEQ ID NO: 124). En la Figura 9E y 9F se muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de rata, ratón y humanas.

El aislamiento de los clones de ADNc de la OPG humana adicionales reveló la presencia de un cambio de bases de G a C en la posición 103 de la secuencia de ADN mostrada en la Figura 9C. Este cambio de nucleótido da como resultado una sustitución de una asparragina por una lisina en la posición 3 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 9C. El resto de la secuencia de los clones que tenían este cambio fue idéntico al de la Figura 9C y 9D.

Ejemplo 6 Modelado de la estructura tridimensional de la OPG

La porción amino terminal de la OPG tiene homología con la porción extracelular de todos los miembros conocidos de la superfamilia de TNFR (Figura 1C). El motivo más notable en esta región de los genes relacionados con TNFR es una secuencia repetida rica en cisteína de \sim40 aminoácidos, que se pliega en distintas estructuras (Banner et al. Cell 73, 431-445 (1993)). Este motivo se presenta normalmente en cuatro repeticiones en tándem (intervalo 3-6) (véase la Figura 1C), y se sabe que está implicada en la unión al ligando (Beutler y van Huffel Science 264, 667-663 (1994)). Cada repetición contiene normalmente seis restos cisteína interespaciados, que están implicados en la formación de tres enlaces disulfuro intradominio, denominados SS1, SS2, y SS3 (Banner et al., ídem). En algunos receptores, tales como TNFR2, CD30 y CD40, algunos dominios de la repetición contienen solamente dos enlaces disulfuro intracatenarios (SS1 y SS3).

La secuencia de proteínas de la OPG humana fue alineada con un perfil del dominio extracelular de TNFR1 utilizando los métodos descritos por Luethy, et al., ídem, y los resultados se presentaron gráficamente utilizando el programa PrettyPlot de Wisconsin Package, versión 8.1 (Genetics Computer Group, Madison, WI) (Figura 10). El alineamiento indica una clara conservación de los restos cisteína implicados en la formación de los dominios 1-4, Este alineamiento se utilizó después para construir un modelo tridimensional (3-D) del dominio N-terminal de la OPG humana utilizando la estructura 3-D conocida del dominio extracelular de TNFR p55 (Banner et al., ídem) como molde. Para realizar esto se copiaron las coordenadas atómicas del esqueleto peptídico y las cadenas laterales de restos idénticos a partir de las coordenadas de la estructura cristalina de TNFR1. Después de esto, se generaron las coordenadas restantes para las inserciones y diferentes cadenas laterales utilizando el programa LOOK (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA). El modelo 3-D fue refinado después minimizando su energía conformacional utilizando LOOK.

Por analogía con otros miembros de la familia de TNFR, se supone que la OPG se une a un ligando. Con el propósito de modelar la interacción de la OPG con su ligando, se utilizó la estructura cristalina de TNF-\beta para estimular una representación 3-D de un "ligando de OPG". Estos datos se presentaron gráficamente (véase la Figura 11) utilizando Molscript (Kraulis, J. Appl. Cryst. 24, 946-950,1991). Se construyó un modelo para el complejo OPG/ligando con 3 TNF\beta y 3 moléculas de OPG en los que las posiciones relativas de la OPG son idénticas a la de TNFR1 en la estructura cristalina. Después se utilizó este modelo para encontrar los restos de la OPG que podrían interaccionar con su ligando utilizando el siguiente enfoque: Se calcularon la zona accesible al disolvente de todos los restos del complejo y un modelo de OPG individual. Es probable que los restos que tienen diferente accesibilidad en el complejo que en el monómero interaccionen con el ligando.

Se alinearon las secuencias de aminoácidos de la OPG humana y de ratón utilizando esta información para destacar las secuencias que comprendían cada uno de los dominios ricos en cisteína 1-4 (Figura 12A y 12B). Cada dominio tiene características estructurales individuales que pueden ser pronosticadas:

Dominio 1

Contiene 4 cisteínas implicadas en los enlaces disulfuro SS2 (C41 a C54) y SS3 (C44 a C62). Aunque no es evidente un enlace SS1 basado en puentes disulfuro, la tirosina conservada de la posición 28 es homóloga a Y20 del TNFR1, que es conocida por estar implicada en la interacción con H66 para ayudar a la formación del dominio. La OPG tiene una histidina homóloga en la posición 75, sugiriendo que Y28 y H75 de la OPG están apilados juntos en la proteína nativa, como lo están los restos homólogos en el TNFR1. Por lo tanto, ambos restos pueden ser importantes por supuesto para la actividad biológica, y los truncamientos de la OPG N-terminales hasta y más allá de Y28 pueden tener una actividad alterada. Además, se prevé que los restos E34 y K43 interaccionen con un ligando unido basado en el modelo tridimensional de los autores de la invención.

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Dominio 2

Contiene seis cisteínas y se pronostica que contiene los enlaces disulfuro SS1 (C65 a C80), SS2 (C83 C98) y SS3 (C87 a C105). Esta región de la OPG también contiene una región que se extiende de P66 a Q91 que se alinea con la porción del dominio 2 de TNFR1 que forma contactos íntimos con TNF\beta (véase más arriba), y puede interaccionar con un ligando de OPG. En restos concretos se prevé que P66, H68, Y69, Y70, T71, D72, S73, H75, T76, S77, D78, E79, L81, Y82, P85, V86, K88, E89, L90, y Q91 interaccionen con un ligando unido basándose en los datos estructurales de los autores de la presente invención.

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Dominio 3

Contiene 4 cisteínas implicadas en enlaces disulfuro SS1 (C107 a C118) y SS3 (C124 a C142), pero no un enlace SS2. Basándose en los datos estructurales de los autores de la presente invención, se prevé que los restos E115, L118 y K119 interaccionen con un ligando de OPG.

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Dominio 4

Contiene 4 cisteínas implicadas en enlaces disulfuro SS1 (C145 a C160) y SS3 (C166 a C185), pero no un enlace SS2, similar al dominio 3. Los datos estructurales de los autores de la presente invención prevén que E153 y S155 interaccionen con un ligando de OPG.

De este modo, el modelo estructural pronosticado para OPG identifica un número de restos altamente conservados que es probable que sean importantes para su actividad biológica.

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Ejemplo 7 Producción de proteína OPG secretada recombinante en células de mamífero

Para determinar si la OPG es realmente una proteína secretada, se fusionó ADNc de OPG de ratón con el dominio Fc de la IgG1 humana como etiqueta (Capon et al. Nature 337, 525-531 (1989)), y se expresó en fibroblastos 293 humanos. Las fusiones con Fc se llevaron a cabo utilizando el vector pFc-A3. pFc-A3 contiene la región codificante de la porción Fc de la cadena pesada de la IgG-\gamma1 de la inmunoglobulina humana (Ellison et al. ídem) desde el primer aminoácido del dominio bisagra (Glu-99) hasta el extremo carboxilo y está flanqueado por un sitio de fusión a NotI 5' y sitios SalI y Xba 3'. El plásmido se construyó mediante amplificación por PCR de la genoteca de ADNc de bazo humano (Clontech). Las reacciones de PCR fueron a un volumen final de 100 \mul y se emplearon 2 unidades de ADN polimerasa Vent (New England Biolabs) en Tris-HCl 20 mM (pH 8,8), KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, MgSO_{4} 2 mM, Tritón X-100 al 0,1% con 400 \muM de cada uno de los dNTP y 1 ng de la genoteca de ADNc que se va a amplificar junto con 1 \muM de cada cebador. Las reacciones se iniciaron mediante desnaturalización a 95ºC durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, y 73ºC durante 2 minutos. El cebador 5' 5' ATAGCGGCCGCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC 3' (SEQ ID NO: 24) incorporaba un sitio NotI inmediatamente 5' con respecto al primer resto (Glu 99) del dominio bisagra de la IgG-\gamma1. El cebador 3' 5' TCTAGAGTCGACTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT-3' (SEQ ID NO: 25) incorporaba sitios SalI y XbaI. El producto de la PCR de 717 pb fue digerido con NotI y SalI, aislado mediante electroforesis a través de agarosa al 1% (FMC Corp.), purificado mediante el procedimiento Geneclean (BIO 101, Inc.) y clonado en el vector pBluescript II KS digerido con NotI, SalI (Stratagene). El inserto del plásmido resultante, pFc-A3, fue secuenciado para confirmar la fidelidad de la reacción de PCR.

El ADNc de ratón clonado en el plásmido pRcCMV-MuOPG fue amplificado utilizando los siguientes dos grupos de pares de cebadores:

Par 1
5'-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3'	(SEQ ID NO: 26)
5'-CCTCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTCACGGATTGAACCTG-3'	(SEQ ID NO: 27)
Par 2
5'-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3'	(SEQ ID NO: 28)
5'-CCTCTGCGGCCGCTGTTGCATTTCCTTTCTG-3'	(SEQ ID NO: 30)

El primer par amplifica el LORF de OPG completo, y crea un sitio de restricción NotI que es compatible con el sitio NotI en marco del vector de fusión de Fc pFcA3. pFcA3 fue preparado diseñando un sitio NotI 5' con respecto al resto ácido aspártico 216 del ADNc de Fc de IgG1 humana. Este constructo introduce un conector que codifica dos aminoácidos irrelevantes que abarcan la unión entre la proteína OPG y la región Fc de la IgG. Este producto, cuando se une a la porción Fc, podría codificar los 401 restos de la OPG completos seguido directamente de los 227 restos aminoácido de la región Fc de la IgG humana (F1.Fc). El segundo par de cebadores amplifica las secuencias de ADN que codifican los primeros 180 restos aminoácido de la OPG, que abarcan su supuesto dominio de unión al ligando. Como antes, el cebador 3' crea un sitio de restricción NotI artificial que fusiona el LORF de la OPG truncado C-terminal en la treonina de la posición 180 directamente con el dominio Fc de la IgG1 (CT.fc).

La unión de la secuencia de aminoácidos que conecta el resto 401 de la OPG y el resto 221 de ácido aséptico de la región Fc humana puede ser modificada como sigue: El ADN que codifica los restos 216-220 de la región Fc humana puede ser suprimido como se describe más abajo, o se puede mutar el resto cisteína correspondiente a C220 de la región Fc humana a serina o alanina. La proteína de fusión OPG-Fc codificada por estos vectores modificados puede ser transfectada en células 293 humanas, o células CHO, y la proteína de fusión OPG-Fc recombinante puede ser purificada como se describe más abajo.

Ambos productos fueron clonados direccionalmente en el vector plasmídico pCEP4 (Invitrogen). pCEP4 contiene el origen de replicación del virus Epstein-Barr, y es susceptible de replicación episómica en células 293-EBNA-1. Los vectores pCEP4 de origen, y pCEP4-Fl.Fc y pCEP4-CT-Fc fueron sometidos a lipofección en células 293-EBNA-1 utilizando los métodos recomendados por el fabricante. Las células transfectadas fueron seleccionadas después en 100 \mug/ml de higromicina para seleccionar el vector de expresión, y los cultivos en masa resistentes al fármaco resultantes se hicieron crecer hasta la confluencia. Después las células se cultivaron en medio sin suero durante 72 horas, y el medio acondicionado se separó y se analizó mediante SDS-PAGE. Una tinción con plata del gel de poliacrilamida detecta las principales proteínas del medio acondicionado producidas por los cultivos de 293 resistentes al fármaco. En el medio acondicionado con pCEP4-Fl.Fc y pCEP4-CT.Fc, se secretaron abundantemente bandas únicas de los tamaños pronosticados (véanse las Figuras 13B y 13C). La proteína de fusión con Fc completa se acumuló a una elevada concentración, indicando que puede ser estable. Ambas proteínas de fusión con Fc fueron detectadas por medio de anticuerpos anti-Fc de IgG1 humana (Pierce) en transferencias western, indicando que son productos recombinantes de OPG.

La proteína de fusión OPG-Fc completa fue purificada mediante cromatografía en columna con Proteína A (Pierce) utilizando los procedimientos recomendados por los fabricantes. Después la proteína se sometió a análisis de la secuencia N-terminal mediante degradación de Edman automatizada como describen esencialmente Matsudaira et al. (J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). Después de 19 ciclos se leyó la siguiente secuencia de aminoácidos:

\vskip1.000000\baselineskip

NH2-E T L P P K Y L H Y D P E T G H Q L L-CO2H

(SEQ ID NO: 31)

\vskip1.000000\baselineskip

Esta secuencia era idéntica a la secuencia de aminoácidos de la OPG de ratón pronosticada que empezaba en el resto aminoácido 22, sugiriendo que el sitio de escisión líder de mamíferos natural está entre los restos aminoácido Q21 y E22, no entre Y31 y D32 como se pronosticó originalmente. Los experimentos de expresión realizados en células 293-EBNA con pCEP4-Fl.Fc y pCEP4-CT.Fc demuestran que la OPG es una proteína secretada, y puede actuar sistémicamente para unirse a su ligando.

Se emplearon procedimientos similares a aquellos utilizados para construir y expresar las fusiones muOPG[22-180]-Fc y muOPG[22-401]-Fc para proteínas de fusión OPG-Fc de ratón y humanas adicionales.

Se construyó el ADNc de OPG murina que codificaba los aminoácidos 1-185 fusionados a la región Fc de la IgG1 humana [muOPG Ct(185).Fc] como sigue. Se amplificó el ADNc de OPG murina a partir del plásmido pRcCMV Mu Osteoprotegerina (descrito en el Ejemplo 5) utilizando el siguiente par de cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa como se ha descrito antes:

1333-82:
\hskip0.8cm 5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3'	(SEQ ID NO: 32)
1333-80:
\hskip0.8cm 5'-CCT CTG CGG CCG CAC ACA CGT TGT CAT GTG TTG C-3'	(SEQ ID NO: 33)

Este par de cebadores amplifica la región del ADNc de OPG murina que codifica los restos aminoácido 63-185 (correspondientes a los pb 278-645) del marco de lectura de la OPG mostrado en la Figura 9A. El cebador 3' contiene un sitio de restricción NotI que es compatible con el sitio NotI en marco del vector de fusión con Fc pFcA3. El producto también abarca un sitio de restricción EcoRI único localizado a 436 pb. El producto de la PCR amplificado se purificó, se escindió con NotI y EcoRI, y el fragmento de restricción EcoRI-NotI resultante se purificó. El vector pCEP4 que tenía el inserto de fusión OPG-Fc 1-401 murino se escindió con EcoRI y NotI, se purificó, y se ligó al producto de la PCR generado antes. El vector de expresión basado en pCEP4 resultante codifica los restos 1-185 de la OPG seguidos directamente de los 227 restos aminoácido de la región Fc de la IgG1 humana. El vector de la fusión OPG 1-185.Fc murino se transfectó en células 293, se seleccionó mediante fármacos, y se produjo un medio acondicionado como se ha descrito antes. El producto de fusión OPG 1-185.Fc murino secretado resultante se purificó mediante cromatografía en columna con Proteína A (Pierce) utilizando procedimientos recomendados por los fabricantes.

Se construyó un ADNc de OPG murina que codificaba los restos aminoácido 1-194 fusionados a la región Fc de la IgG1 humana (muOPG Ct(194).Fc) como sigue. Se amplificó el ADNc de OPG de ratón a partir del plásmido pRcCMV Mu-Osteoprotegerina utilizando los siguientes pares de cebadores:

1333-82:
\hskip0.8cm 5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3'	(SEQ ID NO: 34)
1333-81:
\hskip0.8cm 5'-CCT CTG CGG CCG CCT TTT GCG TGG CTT CTC TGT T-3'	(SEQ ID NO: 35)

Este par de cebadores amplifica la región del ADNc de la OPG murina que codifica los restos aminoácido 70-194 (correspondiente a los pb 298-672) del marco de lectura de la OPG. El cebador 3' contiene un sitio de restricción NotI que es compatible con el sitio NotI en marco del vector de fusión con Fc pFcA3. El producto también abarca un sitio de restricción EcoRI único localizado en el pb 436. El producto de la PCR amplificado se clonó en el vector de fusión OPG[1-401] Fc murino como se ha descrito antes. El vector de expresión basado en pCEP4 resultante codifica los restos 1-194 de la OPG directamente seguido de los 227 restos aminoácido de la región Fc de la IgG1 humana. El vector de fusión OPG 1-194.Fc murino se transfectó en células 293, se seleccionó mediante fármacos, y se produjo medio acondicionado. El producto de fusión secretado resultante se purificó mediante cromatografía en columna con Proteína A (Pierce) utilizando los procedimientos recomendados por los fabricantes.

Se construyó el ADNc de OPG humana que codifica los aminoácidos 1-401 fusionados a la región Fc de la IgG1 humana como sigue. Se amplificó el ADN de OPG humana en el plásmido pRcCMV-hu osteoprotegerina (descrito en el Ejemplo 5) utilizando los siguientes cebadores oligonucleotídicos:

1254-90:
\hskip0.8cm 5'-CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3'	(SEQ ID NO: 36)
1254-95:
\hskip0.8cm 5'-CCT CTG CGG CCG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG AAT GG-3'	(SEQ ID NO: 37)

El producto de la PCR resultante codifica la proteína OPG humana completa y crea un sitio de restricción NotI que es compatible con el vector de fusión con Fc del sitio NotI en marco FcA3. El producto de la PCR se clonó direccionalmente en el vector plasmídico pCEP4 como se ha descrito antes. El vector de expresión resultante codifica los restos 1-401 de la OPG humana seguido directamente de los 227 restos aminoácidos de la región Fc de la IgG1 humana. Se produjo el medio acondicionado a partir de las células transfectadas y seleccionadas mediante fármacos y se purificó el producto de fusión huOPG Fl.Fc mediante cromatografía en columna con Proteína A (Pierce) utilizando los procedimientos recomendados por los fabricantes.

Se construyó el ADN de OPG humana que codifica los restos aminoácido 1-201 fusionados a la región Fc de la IgG1 humana [huOPG Ct(201).Fc] como sigue. El ADNc de OPG humana clonado a partir del plásmido pRcCMV-hu osteoprotegerina se amplificó mediante PCR utilizando el siguiente par de cebadores oligonucleotídicos:

1254-90:
\hskip0.8cm 5'-CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3'	(SEQ ID NO: 38)
1254-92:
\hskip0.8cm 5'-CCT CTG CGG CCG CCA GGG TAA CAT CTA TTC CAC-3'	(SEQ ID NO: 39)

Este par de cebadores amplifica la región del ADNc de la OPG humana que codifica los restos aminoácido 1-201 del marco de lectura de la OPG, y crea un sitio de restricción NotI en el extremo 3' que es compatible con vector de fusión con Fc con el sitio NotI en marco FcA3. Este producto, cuando se une a la porción Fc, codifica los restos 1-201 de la OPG seguido directamente de los 221 restos aminoácido de la región Fc de la IgG1 humana. El producto de la PCR se clonó direccionalmente en el vector plasmídico pCEP4 como se ha descrito antes. Se produjo medio acondicionado a partir de las células transfectadas y seleccionadas mediante fármacos, y los productos de fusión hu OPG Ct(201).Fc se purificaron mediante cromatografía en columna con Proteína A (Pierce) utilizando los procedimientos recomendados por el fabricante.

Se utilizaron los siguientes procedimientos para construir y expresar una OPG de ratón y humana no fusionada.

Se generó un plásmido para la expresión en mamíferos de la OPG murina completa (restos 1-401) mediante amplificación por PCR del inserto de ADNc de OPG murina de pRcCMV Mu-Osteoprotegerina y se subclonó en el vector de expresión pDSR\alpha (DeClerck et al. J. Biol. Chem. 266, 3893 (1991)). Se utilizaron los siguientes cebadores oligonucleotídicos:

1295-26:
\hskip0.8cm 5'-CCG AAG CTT CCA CCA TGA ACA AGT GGC TGT GCT GC-3'	(SEQ ID NO: 40)
1295-27:
\hskip0.8cm 5'-CCT CTG TCG ACT ATT ATA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G-3'	(SEQ ID NO: 41)

Se amplificó el marco de lectura completo de la OPG murina mediante PCR como se ha descrito antes. El producto de la PCR se purificó y se digirió con las endonucleasas de restricción HindIII y XbaI (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN) en las condiciones recomendadas por los fabricantes, después se ligó pDSR\alpha digerido con HindIII y XbaI. Se detectaron los clones recombinantes mediante digestión con endonucleasas de restricción, después se secuenciaron para asegurarse de que no se habían producido mutaciones durante las etapas de amplificación por PCR.

El plásmido resultante, pDSR\alpha-muOPG se introdujo en células de ovario de hámster Chino (CHO) mediante transfección mediada por calcio (Wigler et al. Cell 11, 233 (1977)). Las colonias individuales se seleccionaron basándose en la expresión del gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) en el vector plasmídico y se aislaron numerosos clones. Se controló la expresión de la proteína recombinante de OPG murina mediante análisis de transferencia western del medio acondicionado de las células CHO. Se seleccionaron células con una expresión elevada, y se amplificó adicionalmente la expresión de OPG mediante tratamiento con metotrexato como se ha descrito (DeClerck et al., ídem). Se produjo medio acondicionado a partir de las líneas de células CHO para la purificación adicional de la proteína OPG murina recombinante secretada.

Se generó un plásmido para la expresión en mamíferos de la OPG humana completa (aminoácidos 1-401) subclonando el inserto de ADNc en pRcCMV-hu Osteoprotegerina directamente en el vector pDSR\alpha (DeClerck et al., ídem). El plásmido pRcCMV-OPG fue digerido por completo con NotI, sus extremos se volvieron romos con Klenow, después se digirió por completo con XbaI. El ADN del vector se digirió con HindIII, sus extremos se volvieron romos con Klenow, después se digirió con XbaI, luego se ligó al inserto de OPG. Los plásmidos recombinantes se secuenciaron después para confirmar la orientación apropiada del ADNc de la OPG humana.

El plásmido pDSR\alpha-huOPG resultante se introdujo en células de ovario de hámster Chino (CHO) como se ha descrito. Se seleccionaron las colonias individuales basándose en la expresión del gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) en el vector plasmídico y se aislaron varios clones. Se controló la expresión de la proteína recombinante de la OPG humana mediante análisis de transferencia western del medio acondicionado de las células CHO. Los clones con una expresión elevada se seleccionaron, y se amplificó adicionalmente la expresión de la OPG mediante tratamiento con metotrexato. Se produjo medio acondicionado a partir de las líneas de células CHO que expresaban la OPG humana para la purificación de proteínas.

Los vectores de expresión para la OPG murina que codifican los restos 1-185 se construyeron como sigue. El ADNc de OPG murina de pRcCMV-Mu OPG se amplificó utilizando los siguientes cebadores oligonucleotídicos:

1333-82:
\hskip0.8cm 5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3'	(SEQ ID NO: 42)
1356-12:
\hskip0.8cm 5'-CCT CTG TCG ACT TAA CAC ACG TTG TCA TGT GTT GC-3'	(SEQ ID NO: 43)

Este par de cebadores amplifica la región del ADNc de la OPG murina que codifica los aminoácidos 63-185 del marco de lectura de la OPG (pb 278-645) y contiene un codón de terminación artificial directamente después del codón de la cisteína (C185), que está seguido de un sitio para la endonucleasa de restricción SalI artificial. El producto pronosticado contiene un sitio de restricción EcoRI interno útil para la subclonación en un vector preexistente. Tras la amplificación mediante PCR, el producto purificado resultante se escindió con las endonucleasa de restricción EcoRI y SalI, y el fragmento grande se purificó en gel. El producto purificado se subclonó después en el fragmento de restricción grande de un producto digerido con EcoRI y SalI de pBluescript-muOPG Fl.Fc descrito antes. El plásmido resultante se digirió con HindIII y XhoI y el fragmento pequeño se purificó en gel. Este fragmento, que contiene un marco de lectura abierto que codifica los restos 1-185 se subclonó después en un producto digerido con HindIII y XhoI del vector de expresión pCEP4. El vector resultante, pmuOPG [1-185], codifica un polipéptido de OPG truncado que termina en un resto cisteína localizado en la posición 185. Se produjo medio acondicionado a partir de las células transfectadas y seleccionadas mediante fármaco como se ha descrito antes.

\newpage

1333-82:
\hskip0.8cm 5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3'	(SEQ ID NO: 44)
1356-13:
\hskip0.8cm 5'-CCT CTG TCG ACT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TT-3'	(SEQ ID NO: 45)

\vskip1.000000\baselineskip

Este par de cebadores amplifica la región del ADNc de OPG murina que codifica los aminoácidos 70-194 del marco de lectura de la OPG (pb 298-672) y contiene un codón de terminación artificial directamente después del codón de la lisina (K194), que está seguido de un sitio para la endonucleasa de restricción SalI artificial. El producto pronosticado contiene un sitio de restricción EcoRI interno útil para la subclonación en un vector pre-existente. Después de la amplificación por PCR, el producto purificado resultante se escindió con las endonucleasas de restricción EcoRI y SalI, y el fragmento grande se purificó en gel. Después el producto purificado se subclonó en el fragmento de restricción grande de un producto digerido con EcoRI y SalI de Bluescript-muOPG Fl.Fc descrito antes. El plásmido resultante se digirió con HindIII y XhoI y el fragmento pequeño se purificó en gel. Este fragmento, que contiene un marco de lectura abierto que codifica los restos 1-185 se subclonó después en un producto digerido con HindIII y XhoI del vector de expresión pCEP4. El vector resultante, pmuOPG[1-185], codifica un polipéptido OPG truncado que termina en una lisina en la posición 194. Se produjo medio acondicionado a partir de las células transfectadas y seleccionadas mediante fármacos como se ha descrito antes.

Se generaron diversas mutaciones en el extremo 5' del gen huOPG [22-401]-Fc que introducen sustituciones, o deleciones de aminoácidos, de la OPG entre los restos 22 a 32. Todas las mutaciones se generaron con el "QuickChange® Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene, San Diego, CA) utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante. Brevemente, se trataron la mezcla de reacción que contenía el molde de ADN del plásmido huOPG [22-401]-Fc y los cebadores mutagénicos con polimerasa de Pfu en presencia de desoxinucleótidos, después se amplificaron en un termociclador como se ha descrito antes. Después se transfectó una alícuota de la reacción a E. coli XL1-Blue competente mediante choque térmico, luego se cultivó en placa. El ADN plasmídico de los transformantes se secuenció después para verificar las mutaciones.

Se utilizó el siguiente par de cebadores para suprimir los restos 22-26 del gen de la OPG humana, dando como resultado la producción de una proteína de fusión huOPG [27-401]-Fc:

1436-11:
\hskip0.8cm 5'-TGG ACC ACC CAG AAG TAC CTT CAT TAT GAC-3'	(SEQ ID NO: 140)
1436-12:
\hskip0.8cm 5'-GTC ATA ATG AAG GTA CTT CTG GGT GGT CCA-3'	(SEQ ID NO: 141)

\vskip1.000000\baselineskip

Se utilizó el siguiente par de cebadores para suprimir los restos 22-28 del gen de la OPG humana, dando como resultado la producción de una proteína de fusión huOPG [29-401]-Fc:

1436-17:
\hskip0.8cm 5'-GGA CCA CCC AGC TTC ATT ATG ACG AAG AAA C-3'	(SEQ ID NO: 142)
1436-18:
\hskip0.8cm 5'-GTT TCT TCG TCA TAA TGA AGC TGG GTG GTC C-3'	(SEQ ID NO: 143)

\vskip1.000000\baselineskip

Se utilizó el siguiente par de cebadores para suprimir los restos 22-31 del gen de la OPG humana, dando como resultado la producción de una proteína de fusión huOPG [32-401]-Fc:

1436-27:
\hskip0.8cm 5'-GTG GAC CAC CCA GGA CGA AGA AAC CTC TC-3'	(SEQ ID NO: 144)
1436-28:
\hskip0.8cm 5'-GAG AGG TTT CTT CGT CCT GGG TGG TCC AC-3'	(SEQ ID NO. 145)

\newpage

Se utilizó el siguiente par de cebadores para cambiar el codón para el resto tirosina 28 a fenilalanina del gen de la OPG humana, dando como resultado la producción de una proteína de fusión huOPG [22-401]-Fc Y28F:

1436-29:
\hskip0.8cm 5'-CGT TTC CTC CAA AGT TCC TTC ATT ATG AC-3'	(SEQ ID NO: 146)
1436-30:
\hskip0.8cm 5'-GTC ATA ATG AAG GAA CTT TGG AGG AAA CG-3'	(SEQ ID NO: 147)

\vskip1.000000\baselineskip

Se utilizó el siguiente par de cebadores para cambiar el codón para el resto prolina 26 a alanina del gen de la OPG humana, dando como resultado la producción de una proteína de fusión huOPG [22-401]-Fc P26A:

1429-83:
\hskip0.8cm 5'-GGA AAC GTT TCC TGC AAA GTA CCT TCA TTA TG-3'	(SEQ ID NO: 148)
1429-84:
\hskip0.8cm 5'-CAT AAT GAA GGT ACT TTG CAG GAA ACG TTT CC-3'	(SEQ ID NO: 149)

\vskip1.000000\baselineskip

Cada plásmido muOPG [22-401]-Fc resultante que contenía la mutación apropiada fue transferido después a células 293 humanas, la proteína de fusión OPG-Fc mutante fue purificada del medio acondicionado como se ha descrito antes. La actividad biológica de cada proteína fue evaluada en el análisis de formación de osteoclastos in vitro descrito en el Ejemplo 11.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Expresión de OPG en E. coli A. Vectores de Expresión Bacteriana pAMG21

El plásmido de expresión pAMG21 puede derivar del vector de expresión de Amgen pCFM1656 (Núm. ATCC 69576) que a su vez deriva del sistema del vector de expresión de Amgen descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.710.473. El plásmido pCFM1656 puede derivar del plásmido pCFM836 descrito (Patente Núm. 4.710.473) mediante: (a) destrucción de los dos sitios de restricción NdeI endógenos mediante rellenado de los extremos con la enzima polimerasa de T4 seguido de ligación de los extremos romos; (b) remplazamiento de la secuencia de ADN entre los sitios de restricción AatII y ClaI únicos que contienen el promotor P_{L} sintético con un fragmento similar obtenido de pCFM636 (Patente Núm. 4.710.473) que contiene el promotor PL

1

y después (c) sustitución de la secuencia de ADN pequeña entre los sitios de restricción ClaI y KpnI únicos con el siguiente oligonucleótido:

2

El plásmido de expresión pAMG21 puede derivar después de pCFM1656 realizando una serie de cambios de bases dirigidos al sitio mediante mutagénesis de oligos de PCR solapante y sustituciones en la secuencia de ADN. Comenzando por el sitio BglII (núm. de pb del plásmido 180) inmediatamente 5' con respecto al promotor de replicación del plásmido PcopB y continuando hacia los genes de replicación del plásmido, los cambios de pares de bases son los siguientes:

3

\newpage

La secuencia de ADN entre los sitios de restricción AatII (posición núm. 4364 en pCFM1656) y SacII (posición núm. 4585 en pCFM1656) únicos se sustituye por la siguiente secuencia de ADN:

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

Durante la ligación de los extremos cohesivos de esta secuencia de ADN de sustitución, se destruyen los sitios AatII y SacII externos. Existen sitios AatII y SacII únicos en el ADN sustituido.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

pAMG22-His

El plásmido de expresión pAMG22-His puede derivar del vector de expresión de Amgen pAMG22 sustituyendo la secuencia de ADN pequeña entre los sitios de restricción NdeI (núm. 4795) y EcoRI (núm. 4818) únicos de pAMG22 por el siguiente dúplex oligonucleotídico:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\newpage

pAMG22

El plásmido de expresión pAMG22 puede derivar del vector de expresión de Amgen pCFM1656 (núm. ATCC 69576) que a su vez puede derivar del sistema vector de expresión de Amgen descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.710.473 otorgada el 1 de Diciembre de 1987. El plásmido pCFM1656 puede derivar del plásmido pCFM836 descrito (Patente Núm. 4.710.473) mediante: (a) destrucción de los dos sitios de restricción NdeI endógenos mediante rellenado de los extremos con la enzima polimerasa de T4 seguido de ligación de los extremos romos; (b) remplazamiento de la secuencia de ADN entre los sitios de restricción AatII y ClaI únicos que contiene el promotor PL por un fragmento similar obtenido a partir de pCFM636 (patente Núm. 4.710.473) que contiene el promotor PL

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

y después (c) sustitución de la secuencia de ADN pequeña entre los sitios de restricción ClaI y KpnI únicos por el siguiente oligonucleótido:

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8

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(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

El plásmido de expresión pAMG22 puede derivar de pCFM1656 realizando una serie de cambios de bases dirigidos al sitio mediante mutagénesis de oligos por PCR solapante y sustituciones en la secuencia de ADN. Partiendo del sitio BglII (núm. de pb del plásmido 180) inmediatamente 5' con respecto al promotor de la replicación plasmídica PcopB y continuando hacia los genes de replicación plasmídica, los cambios en los pares de bases son los siguientes:

9

\newpage

La secuencia de ADN entre los sitios de restricción AatII (posición núm. 4364 en pCFM1656) y SacII (posición núm. 4585 en pCFM1656) únicos se sustituye por la siguiente secuencia de ADN:

10

\vskip1.000000\baselineskip

Durante la ligación de los extremos cohesivos de esta secuencia de ADN de sustitución, se destruyen los sitios AatII y SacII externos. Existen sitios AatII y SacII únicos en el ADN sustituido.

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B. OPG Met[32-401] humana

En el ejemplo, el vector de expresión utilizado fue pAMG21, un derivado de pCFM1656 (núm. de acceso ATCC 69576) que contiene sitios de restricción apropiados para la inserción de genes aguas abajo del promotor lux PR. (Véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.169.318 para la descripción del sistema de expresión lux). La célula anfitriona utilizada fue GM120 (núm. de acceso ATCC 55764). Este anfitrión tiene el promotor lacIQ y el gen lacI integrado en un segundo sitio en el cromosoma del anfitrión de un anfitrión E. coli K12 prototrofo. También son adecuados para la expresión otros vectores de expresión de E. coli y células anfitrionas utilizados comúnmente.

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 32-401 del polipéptido de la OPG humana bajo el control del promotor luxPR en el vector plasmídico de expresión pAMG21 como sigue. Para lograr esto, se realizó una PCR utilizando los oligonucleótidos núm.1257-20 y núm. 1257-19 como cebadores empleando como plásmido molde el ADN de pRcCMV-Hu OPG que contenía el ADNc de la OPG humana y sometiéndolo a termociclación durante 30 ciclos siendo cada ciclo: 94ºC durante 20 segundos, seguido de 37ºC durante 30 segundos, seguido de 72ºC durante 30 segundos. La muestra de PCR resultante se resolvió sobre gel de agarosa, el producto de la PCR se separó por corte, se purificó, y se restringió con las endonucleasas de restricción KpnI y BamHI y se purificó. Los oligonucleótidos sintéticos núm. 1257-21 y num. 1257-22 se fosforilaron individualmente utilizando polinucleótido quinasa de T4 y ATP, y después se mezclaron juntos, se calentaron a 94ºC y se dejó que se enfriaran lentamente a la temperatura ambiente para formar un dúplex de conectores oligonucleotídicos que contenía extremos cohesivos NdeI y KpnI. El dúplex de conectores fosforilados formado entre los oligonucleótidos núm. 1257-21 y núm. 1257-22 que contenía los extremos cohesivos NdeI y KpnI (véase la Figura 14A) y el producto de la PCR digerido con KpnI y BamHI y purificado generado utilizando los cebadores oligo núm. 1257-20 y núm. 1257-19 (véase arriba) fue insertado direccionalmente entre dos sitios del vector plasmídico pAMG21, esto es el sitio NdeI y el sitio BamHI, utilizando la metodología de ADN recombinante normalizada (véase la Figura 14A y las secuencias de más abajo). El conector sintético utilizó codones de E. coli y proporcionó una metionina N-terminal.

Se seleccionaron dos clones y se aisló el ADN plasmídico, y con posterioridad se confirmó la secuencia de ADN del inserto de la OPG humana. El plásmido pAMG21 resultante que contenía los aminoácidos 32-401 del polipéptido de la OPG humana precedido inmediatamente en marco por una metionina es referido como pAMG21-huOPG met[32-401] o pAMG21-huOPG met[32-401].

100

Los cultivos de pAMG21-huOPG met[32-401] en E. coli GM120 en medio 2XYT que contenía 20 \mug/ml de kanamicina fueron incubados a 30ºC antes de la inducción. La inducción de la expresión del producto génico huOPG met[32-401] a partir del promotor luxPR se logró después de la adición del autoinductor sintético N-(3-oxohexanoil)-DL-homoserina lactona al medio de cultivo a una concentración final de 30 ng/ml y los cultivos se incubaron a 30ºC o a 37ºC durante 6 horas más. Al cabo de 6 horas, se examinaron los cultivos bacterianos mediante microscopía en cuanto a la presencia de cuerpos de inclusión y después se sedimentaron mediante centrifugación. Se observaron cuerpos de inclusión refringentes en los cultivos inducidos indicando que una parte del producto génico huOPG met[32-401] recombinante era producido insolublemente en E. coli. Algunos sedimentos bacterianos se suspendieron en Tris-HCl 10 mM /pH 8, EDTA 1 mM y se sometieron a lisis directamente mediante la adición de tampón de muestra 2X Laemmli a 1X final, y \beta-mercaptoetanol a una concentración final del 5%, y se analizaron mediante SDS-PAGE. Se observó una banda teñida con coomassie sustancialmente más intensa de aproximadamente 42 kDa en el gel de SDS-PAGE que contenía productos lisados celulares totales de cultivos inducidos a 30ºC y 37ºC frente a la calle 2 que es un producto lisado celular total de un cultivo no inducido a 30ºC (Figura 14B). El producto génico esperado tendría 370 aminoácidos de longitud y tendría un peso molecular esperado de aproximadamente 42,2 kDa. Tras la inducción a 37ºC durante 6 horas, se sedimentó y se trató para el aislamiento de los cuerpos de inclusión (véase más abajo) o se trató para la microfluidificación. El sedimento tratado para la microfluidificación se resuspendió en tampón Tris-HCl 25 mM/pH 8, NaCl 0,5 M y se hizo pasar 20 veces a través de un Microfluidizer Modelo 1108 (Microfluidics Corp.) y se recogió. Se separó una alícuota de la muestra recogida (producto lisado total microfluidificado), y el resto se sedimentó a 20.000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante siguiente a la centrifugación se separó (fracción soluble microfluidificada) y el sedimento se resuspendió en una solución de Tris-HCl 25 mM/pH 8, NaCl 0,5 M, urea 6 M (fracción insoluble microfluidificada). A una alícuota de la fracción soluble total, o insoluble se añadió un volumen igual de 2X tampón de muestra de Laemmli y \beta-mercaptoetanol a una concentración final de 5%. Después las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE. Una cantidad significativa de producto génico huOPG met[32-401] recombinante parecía encontrarse en la fracción insoluble. Para purificar la proteína recombinante los cuerpos de inclusión se purificaron como sigue: Se separaron células bacterianas del medio mediante centrifugación con gradiente de densidad en una centrífuga Beckman J-6B equipada con un rotor JS-4.2 a 4.900 x g durante 15 minutos a 4ºC. El sedimento bacteriano se resuspendió en 5 ml de agua y después se diluyó a un volumen final de 10 ml con agua. Esta suspensión se transfirió a un recipiente de acero inoxidable enfriado en hielo y se sometió a desorganización sónica utilizando un Sonicador Branson equipado con una punta estándar (ajuste de potencia = 5, ciclo de trabajo = 95%, 80 explosiones). La suspensión celular sometida a sonicación se centrifugó en una ultracentrífuga Beckman Optima TLX equipada con un rotor TLA 100.3 a 195.000 x g durante 5 a 10 minutos a 23ºC. El sobrenadante se descartó y el sedimento se enjuagó con una corriente de agua de una botella para rociar. Los sedimentos se recogieron raspando con una microespátula y se transfirieron a un homogeneizador de vidrio (capacidad 15 ml). Se añadieron 5 ml de solución Percoll (Percoll líquido al 75%, cloruro de sodio 0,15 M) al homogeneizador y los contenidos se homogeneizaron hasta suspenderlos uniformemente. El volumen se incrementó a 19,5 ml mediante la adición de solución Percoll, se mezclaron, y se distribuyeron en 3 tubos Beckman Quick-Seal (13 x 32 mm). Los tubos se sellaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los tubos se centrifugaron en un rotor Beckman TLA 100.3 a 23ºC, 20.000 rpm (21.600 x g), 30 minutos. Los tubos se examinaron en cuanto a un patrón de formación de bandas apropiado. Para recuperar los cuerpos refringentes, se recuperaron las fracciones de gradiente y se reunieron, después se diluyeron con agua. Los cuerpos de inclusión se sedimentaron mediante centrifugación, y la concentración de proteína se estimó tras la SDS-PAGE.

Se disolvió una alícuota de los cuerpos de inclusión aislados como se describe más abajo en 1X tampón de muestra Laemmli con \beta-mercaptoetanol al 5% y se resolvió sobre gel de SDS-PAGE y los cuerpos de inclusión aislados proporcionaron un producto génico huOPG[32-401] recombinante altamente purificado. La banda de \sim42 kDa principal observada después de resolver los cuerpos de inclusión sobre un gel de poliacrilamida-SDS se separó de un gel separado y la secuencia de aminoácidos N-terminal se determinó esencialmente como se ha descrito (Matsudaira et al. J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). Se determinó la siguiente secuencia después de 19 ciclos:

NH_{2}-MDEETSHQLLCDKCPPGTY-COOH

(SEQ ID NO: 62)

Se encontró que esta secuencia era idéntica a los primeros 19 aminoácidos codificados por el vector de expresión pAMG21 Hu-OPG met[32-401], producido por un resto metionina proporcionado por el vector de expresión bacteriano.

C. OPG met[22-401] humana

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 22 a 401 de la OPG humana bajo el control del promotor luxR en un vector de expresión plasmídico procariótico pAMG21 como sigue. Se escindió el ADN plasmídico aislado de pAMG21-huOPG met[32-401] (véase la Sección B) con las endonucleasas de restricción KpnI y BamHI y los fragmentos resultantes se resolvieron sobre un gel de agarosa. El fragmento B (fragmento de \sim1064 pb) se aisló del gel utilizando la metodología normalizada. Los oligonucleótidos sintéticos (oligos) núm. 1267-06 y num. 1267-07 se fosforilaron individualmente y se dejó que formaran un dúplex de conectores oligo, que contenía extremos cohesivos NdeI y KpnI, utilizando los métodos descritos en la Sección B. El dúplex de conectores sintéticos utilizó codones de E. coli y proporcionó una metionina N-terminal. El conector oligo fosforilado que contenía los extremos cohesivos NdeI y KpnI y el fragmento de \sim1064 pb aislado de pAMG21-huOPG met[32-401] digerido con las endonucleasas de restricción KpnI y BamHI se insertaron direccionalmente entre los sitios NdeI y BamHI de pAMG21 utilizando la metodología de ADN recombinante normalizada. La mezcla de ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Los clones se seleccionaron, el ADN plasmídico se aisló, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen huOPG-met[22-401].

11

Los cultivos de pAMG21-huOPG-met[22-401] en el anfitrión 393 de E. coli se colocaron en medio 2XYT que contenía 20 \mug/ml de kanamicina y se incubaron a 30ºC antes de la inducción. La inducción de la expresión del producto génico recombinante a partir del promotor luxPR del vector pAMG21 se logró después de la adición del autoinductor sintético N-(3-oxohexanoil)-DL-homoserina lactona al medio de cultivo a una concentración final de 30 ng/ml e incubación a 30ºC o 37ºC durante 6 horas más. Al cabo de 6 horas, se sedimentaron los cultivos bacterianos mediante centrifugación (=30ºCI+6 o 37ºCI+6). Los cultivos bacterianos también se sedimentaron inmediatamente antes de la inducción (=30ºC preI) o alternativamente no se añadió autoinductor a un cultivo separado que se dejó en incubación a 30ºC durante 6 horas más para dar un cultivo no inducido (UI) (=30ºC UI). Los sedimentos bacterianos de los cultivos 30ºC PreI, 30ºC UI, 30ºC I+6, o 37ºC I+6 se resuspendieron, se lisaron, y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE) como se describe en la Sección B. Los geles de poliacrilamida se tiñeron o bien con azul de coomassie y/o se sometieron a transferencia Western sobre nitrocelulosa y se sometieron a sondeo inmunológico con anticuerpo policlonal anti-mu OPG-Fc de conejo como se describe en el Ejemplo 10. El nivel de producto génico tras la inducción se comparó con la muestra no inducida (30ºC UI) o pre-inducción
(30ºC preI).

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D. OPG met[22-401] murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 22 a 401 del polipéptido OPG (OPG) murino (mu) bajo el control del promotor luxPR en un vector de expresión plasmídico procariótico pAMG21 como sigue. Se realizó la PCR utilizando los oligonucleótidos núm. 1257-16 y núm. 1257-15 como cebadores, ADN de pRcCMV-Mu-OPG plasmídico como molde y condiciones de termociclación como se describe en la Sección B. El producto de la PCR se purificó y se escindió con las endonucleasas de restricción KpnI y BamHI como se describe en la Sección B. Los oligos sintéticos núm. 1260-61 y núm. 1260-82 se fosforilaron individualmente y se dejó que formara un dúplex de conectores oligo con los extremos cohesivos NdeI y KpnI utilizando los métodos descritos en la Sección B. El dúplex de conectores sintéticos utilizó codones de E. coli y proporcionó una metionina N-terminal. El dúplex de conectores fosforilados formado entre los oligos núm. 1260-61 y núm. 1260-82 que contenía los extremos cohesivos NdeI y KpnI y el producto de la PCR digerido con KpnI y BamHI y purificado generado utilizando los cebadores oligo núm. 1257-16 y núm. 1257-15 se insertaron direccionalmente entre los sitios NdeI y BamHI de pAMG21 utilizando la metodología normalizada. La mezcla de ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen MuOPG
met[22-401].

La expresión del polipéptido muOPG met[22-401] recombinante a partir de los cultivos de células 393 que albergaban el plásmido pAMG21-MuOPG met[22-401] después de la inducción fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

12

E. OPG met[32-401] murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 32 a 401 de la OPG murina bajo el control del promotor luxPR en un vector de expresión plasmídico procariótico pAMG21 como sigue. Para lograr esto, se fosforilaron individualmente los oligos núm. 1267-08 y núm. 1267-09 y se dejó que formaran un dúplex de conectores oligo utilizando los métodos descritos en la Sección B. El dúplex de conectores sintéticos utilizó codones de E. coli y proporcionó una metionina N-terminal. El dúplex de conectores fosforilados formado entre los oligos núm. 1267-08 y núm. 1267-09 que contenían extremos cohesivos NdeI y KpnI, y el producto de la PCR digerido con KpnI y BamHI y purificado descrito antes (véase la Sección D), se insertó direccionalmente entre los sitios NdeI y BamHI de pAMG21 utilizando la metodología normalizada. La mezcla de ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen
muOPG-met[32-401].

La expresión del polipéptido muOPG-met[32-401] recombinante a partir de los cultivos de células 393 que albergaban el plásmido recombinante pAMG21 después de la inducción se determinó utilizando los métodos descritos en la Sección C.

13

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F. OPG met-lys[22-401] murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal seguida de un resto lisina y los aminoácidos 22 a 401 de la OPG murina bajo el control del promotor lux PR en el vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Se fosforilaron individualmente los oligos sintéticos núm. 1282-95 y 1282-96 y se dejó que formaran un dúplex de conectores oligo utilizando los métodos descritos en la Sección B. El dúplex de conectores sintéticos utilizó codones de E. coli y proporcionó una metionina N-terminal. El dúplex de conectores fosforilados formado entre los oligos núm. 1282-95 y 1282-96 que contenía los extremos cohesivos NdeI y KpnI y el producto de la PCR digerido con KpnI y BamHI y purificado descrito en la sección D se insertó direccionalmente entre los sitios NdeI y BamHI de pAMG21 utilizando la metodología normalizada. La mezcla de ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen
MuOPG-Met-Lys[22-401].

La expresión del polipéptido MuOPG Met-Lys[22-401] recombinante a partir de las células 393 transformadas que albergaban el plásmido pAMG21 recombinante después de la inducción fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

14

G. OPG met-lys-(his)_{7}[22-401] murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba los restos N-terminales Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His (=MKH) seguida de los aminoácidos 22 a 401 de la OPG Murina bajo el control del promotor lux PR en el vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Se realizó la PCR utilizando los oligonucleótidos núm. 1300-50 y núm. 1257-15 como cebadores y el ADN plasmídico pAMG21-muOPG-met[22-401] como molde. Las condiciones de termociclación fueron las descritas en la Sección B. La muestra de PCR resultante se resolvió sobre un gel de agarosa, el producto de la PCR se separó por corte, se purificó, se escindió con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI y se purificó. El producto de la PCR digerido con NdeI y BamHI y purificado generado utilizando los cebadores oligo núm. 1300-50 y núm. 1257-15 se insertó direccionalmente entre los sitios NdeI y BamHI de pAMG21 utilizando la metodología del ADN normalizada. La mezcla de ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del en
MuOPG-MKH[22-401].

La expresión del polipéptido MuOPG MKH[22-401] recombinante a partir de los cultivos de 393 transformados que albergaban el plásmido pAMG21 recombinante después de la inducción fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

15

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H. OPG met-lys[22-401](his)_{7} murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una met-lys N-terminal, los aminoácidos 22 a 401 de la OPG murina, y siete restos histidina después del aminoácido 401 (=muOPG MK[22-401]-H_{7}), bajo el control del promotor lux PR en el vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Se realizó la PCR utilizando los oligonucleótidos núm. 1300-49 y núm. 1300-51 como cebadores y el ADN de pAMG21-muOPG-met[22-401] como molde. Las condiciones de termociclación fueron las descritas en la Sección B. La muestra de PCR resultante se resolvió sobre un gel de agarosa, el producto de la PCR se separó por corte, se purificó, se restringió con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI, y se purificó. El producto digerido con NdeI y BamHI y purificado se insertó direccionalmente entre los sitios NdeI y BamHI de pAMG21 utilizando la metodología normalizada. La ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen
muOPG-MK[22-401]-H_{7}.

La expresión del polipéptido muOPG MK-[22-401]-H_{7} recombinante a partir de las células 393 transformadas que albergaban el plásmido pAMG21 recombinante después de la inducción fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

16

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I. OPG met[27-401] murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 27 a 401 de la OPG murina bajo el control del promotor lux PR del vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Se realizó la PCR con los oligonucleótidos núm. 1309-74 y núm. 1257-15 como cebadores y el ADN plasmídico pAMG21-muOPG-met[22-401] como molde. Las condiciones de termociclación fueron las descritas en la Sección B. La muestra de PCR resultante se resolvió sobre un gel de agarosa, el producto de la PCR se separó por corte, se purificó, se escindió con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI y se purificó. El producto digerido con NdeI y BamHI y purificado se insertó direccionalmente entre los sitios NdeI y BamHI de pAMG21 utilizando la metodología normalizada. La mezcla de ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen muOPG-met[27-401].

La expresión del polipéptido muOPG-met[27-401] recombinante a partir del cultivo de 393 transfectadas que albergaban el plásmido pAMG21 recombinante después de la inducción fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

17

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J. OPG met[27-401] humana

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 27 a 401 de la OPG humana bajo el control del promotor lux PR del vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Se realizó la PCR con los oligonucleótidos núm. 1309-75 y núm. 1309-76 como cebadores y el ADN pAMG21-huOPG-met[22-401] plasmídico como molde. Las condiciones de termociclación fueron las descritas en la Sección B. La muestra de PCR resultante se resolvió sobre un gel de agarosa, el producto de la PCR se separó por corte, se purificó, se restringió con las endonucleasas de restricción AseI y BamHI, y se purificó. El producto de la PCR digerido con AseI y BamHI y purificado anterior se insertó direccionalmente entre los sitios NdeI y BamHI de pAMG21 utilizando la metodología normalizada. La mezcla de ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen huOPG-met[27-401].

La expresión del polipéptido huOPG-met[27-401] recombinante después de la inducción a partir de las células 393 transfectadas que albergaban el plásmido pAMG21 recombinante fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

18

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K. OPG met[22-180] murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 22 a 180 de la OPG murina bajo el control del promotor lux PR del vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Se realizó la PCR con los oligonucleótidos núm. 1309-72 y núm. 1309-73 como cebadores y el ADN pAMG21-muOPG-met[22-401] plasmídico como molde. Las condiciones de termociclación fueron las descritas en la Sección B. La muestra de PCR resultante se resolvió sobre un gel de agarosa, el producto de la PCR se separó por corte, se purificó, se restringió con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI, y se purificó. El producto de la PCR digerido con NdeI y BamHI y purificado anterior se insertó direccionalmente entre los sitios NdeI y BamHI de pAMG21 utilizando la metodología normalizada. La mezcla de ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen muOPG-met[22-180].

La expresión del polipéptido muOPG-met[22-180] recombinante a partir de los cultivos de células 393 transformadas que albergaban el plásmido pAMG21 recombinante después de la inducción fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

19

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L. OPG met[27-180] murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 27 a 180 de la OPG murina bajo el control del promotor lux PR del vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Se realizó la PCR con los oligonucleótidos núm. 1309-74 (véase la Sección I) y núm. 1309-73 (véase la Sección K) como cebadores y el ADN pAMG21-muOPG-met[22-401] plasmídico como molde. Las condiciones de termociclación fueron las descritas en la Sección B. La muestra de PCR resultante se resolvió sobre un gel de agarosa, el producto de la PCR se separó por corte, se purificó, se restringió con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI, y se purificó. El producto de la PCR digerido con NdeI y BamHI y purificado anterior se insertó direccionalmente entre los sitios NdeI y BamHI de pAMG21 utilizando la metodología normalizada. La mezcla de ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen muOPG met[27-180].

La expresión del polipéptido muOPG met[27-180] recombinante a partir de los cultivos de células 393 transformadas que albergaban el plásmido pAMG21 recombinante después de la inducción fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

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M. OPG met[22-189] y met[22-194] murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 22 a 189, o 22 a 194 de la OPG murina bajo el control del promotor lux PR del vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Se fosforilaron individualmente el par de oligonucleótidos sintéticos núm. 1337-92 y núm. 1337-93 (=conector muOPG-189) o núm. 1333-57 y núm. 1333-58 (=conector muOPG-194) y se dejó que formaran un par de dúplex conectores de oligo utilizando los métodos descritos en la Sección B. El ADN plasmídico purificado de pAMG21-muOPG-met[22-401] se escindió con las endonucleasas de restricción KpnI y BspEI y los fragmentos de ADN resultantes se resolvieron sobre un gel de agarosa. El fragmento B de \sim413 pb se aisló utilizando la metodología del ADN recombinante normalizada. Los dúplex de conectores oligo fosforilados formados entre los oligos núm. 1337-92 y núm. 1337-93 (conector muOPG-189) o los oligos núm. 1333-57 y núm. 1333-58 (conector muOPG-194) que contenían los extremos cohesivos BspEI y BamHI, y el fragmento B de \sim413 pb del plásmido pAMG21-muOPG-met[22-401] digerido con las endonucleasas de restricción KpnI y BspEI anteriores, fue insertado direccionalmente entre los sitios KpnI y BamHI de pAMG21-muOPG met[22-401] utilizando la metodología normalizada. Cada mezcla de ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN de los genes muOPG-met[22-189] o muOPG-met[22-194].

\newpage

La expresión de los polipéptidos muOPG-met[22-189] y muOPG-met[22-194] recombinantes a partir de los plásmidos pAMG21 recombinantes transformados en células 393 fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

20

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N. OPG met[27-189] y met[27-194] murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 27 a 189, o 27 a 194 de la OPG murina bajo el control del promotor lux PR del vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Se fosforilaron los conectores oligo o bien "conector muOPG-189" o bien "conector muOPG-194" (véase la Sección M) que contenían extremos cohesivos BspEI y BamHI, y el fragmento B de \sim413 pb aislado del plásmido pAMG21-muOPG-met[22-401] digerido con las endonucleasas de restricción KpnI y BspEI se insertaron direccionalmente entre los sitios KpnI y BamHI del plásmido pAMG21-muOPG-met[27-401] utilizando la metodología normalizada. Cada ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN de los genes muOPG-met[27-189] o muOPG-met[27-194].

La expresión de los polipéptidos muOPG-met[27-189] y muOPG-met[27-194] recombinantes después de la inducción de las células 393 que albergaban los plásmidos pAMG21 recombinantes fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

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O. OPG met[22-185], met[22-189], met[22-194] humana

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 22 a 185, o 22 a 189, o 22 a 194 del polipéptido de la OPG humana bajo el control del promotor lux PR del vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Se fosforilaron individualmente el par de oligonucleótidos sintéticos núm. 1331-87 y núm.1331-88 (=conector huOPG-185), núm. 1331-89 y núm. 1331-90 (=conector huOPG-189), o núm. 1331-91 y núm. 1331-92 (=conector huOPG-194) y se dejó que cada uno formara un par de dúplex conectores oligo utilizando los métodos descritos en la Sección B. El ADN plasmídico purificado de pAMG21-huOPG-met[27-401] fue restringido con las endonucleasas de restricción KpnI y NdeI y los fragmentos de ADN resultantes se resolvieron sobre un gel de agarosa. El fragmento B de \sim407 pb se aisló utilizando la metodología del ADN recombinante. Los dúplex de conectores oligo fosforilados formados entre los oligos núm. 1331-87 y núm. 1331-88 (conector huOPG-185), los oligos núm. 1331-89 y núm. 1331-90 (conector huOPG-189), o los oligos núm. 1331-91 y núm. 1331-92 (conector huOPG-194) [cada conector contiene extremos cohesivos NdeI y BamHI], y el fragmento B de \sim407 pb aislado del plásmido pAMG21-huOPG-met[27-401] digerido con las endonucleasas de restricción KpnI y NdeI anteriores, se insertaron entre los sitios KpnI y BamHI del plásmido pAMG21-huOPG-met[22-401] utilizando la metodología normalizada. Cada ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN de los genes huOPG-met[22-185], huOPG-met[22-189], o huOPG-met[22-194].

\newpage

La expresión de huOPG-met[22-185], huOPG-met[22-189] o huOPG-met[22-194] recombinantes en las células 393 transformadas que albergaban los plásmidos pAMG21 recombinantes después de la inducción fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

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P. OPG met[27-185], met[27-189], met[27-194] humana

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 27 a 185, o 27 a 189, o 27 a 194 del polipéptido de OPG humana bajo el control del promotor lux PR del vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. Los conectores oligo fosforilados "conector huOPG-185", "conector huOPG-189", o "huOPG-194" (Véase la Sección O) que contenían cada uno extremos cohesivos NdeI y BamHI, y el fragmento B de \sim407 pb aislado del plásmido pAMG21-huOPG-met[27-401] digerido con las endonucleasas de restricción KpnI y NdeI (véase la Sección O) se insertaron direccionalmente entre los sitios KpnI y BamHI del plásmido pAMG21-huOPG-met[27-401] (Véase la Sección J) utilizando la metodología normalizada. Cada ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN de los genes huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-189], o huOPG-met[27-194].

La expresión de huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-189] o huOPG-met[27-194] recombinantes a partir de los plásmidos pAMG21 recombinantes transformados en las células 393 fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

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Q. OPG met[27-401] (P33E, G36S, A45P) murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 27 a 48 de la OPG humana seguido de los restos aminoácido 49 a 401 de la OPG murina bajo el control del promotor lux PR del vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue. El ADN plasmídico purificado de pAMG21-huOPG-met[27-401] (véase la Sección J) se escindió con las endonucleasas de restricción AatII y KpnI y se aisló un fragmento B de \sim1075 pb del gel de agarosa utilizando la metodología del ADN recombinante normalizada. Adicionalmente, se digirió el ADN pAMG21-muOPG-met[22-401] plasmídico (Véase la sección D) con las endonucleasas de restricción KpnI y BamHI y se aisló el fragmento B de \sim1064 pb como se ha descrito antes. El fragmento de restricción pAMG21-huOPG-met[27-401] de \sim1075 pb aislado que contenía extremos cohesivos AatII y KpnI (véase arriba), el fragmento de restricción pAMG21-muOPG met[22-401] de \sim1064 pb que contenía extremos cohesivos KpnI y BamHI y un fragmento de restricción de \sim5043 pb que contenía extremos cohesivos AatII y BamHI y correspondiente a la secuencia de ácido nucleico de pAMG21 entre AatII y BamHI fueron ligados utilizando la metodología del ADN recombinante normalizada. La ligación se transformó en el anfitrión 393 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, y se verificó la presencia del inserto recombinante en el plásmido utilizando la metodología del ADN recombinante. Gen muOPG-27-401 (P33E, G36S, A45P). Los cambios de aminoácidos en muOPG de prolina 33 a ácido glutámico 33, de glicina 36 a serina 36, y de alanina 45 a prolina 45, da como resultado la reposición de los restos de la muOPG 27 a 48 por los restos de la huOPG 27 a 48.

La expresión de muOPG-met[27-401] (p33E, G36S, A45P) recombinante a partir de las células 393 transformadas que albergaban el plásmido pAMG21 recombinante fue determinada utilizando los métodos descritos en la Sección C.

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R. OPG met-lys-(his)_{7}-ala-ser-(asp)_{4}-lys[22-401] (A45T) murina

Se colocó una secuencia de ADN que codificaba una etiqueta de his N-terminal y una secuencia de reconocimiento de enteroquinasa que es (del extremo NH_{2} al COOH): Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Ala-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (=HEK), seguido de los aminoácidos 22 a 401 del polipéptido de OPG murina bajo el control del promotor Ps4 regulado por el represor lac como sigue. Se digirió pAMG22-His (Véase la Sección A) con las endonucleasas de restricción NheI y BamHI, y el fragmento grande (fragmento A) se aisló de un gel de agarosa utilizando la metodología del ADN recombinante normalizada. Se fosforilaron individualmente los oligonucleótidos núm. 1282-91 y núm. 1282-92 y se dejó que formaran un dúplex de conectores oligo utilizando los métodos descritos previamente (Véase la Sección B). Se ligaron el dúplex de conectores fosforilados formados entre los oligos núm. 1282-91 y núm. 1282-92 que contenían los extremos cohesivos NheI y KpnI, el producto de la PCR digerido con KpnI y BamHI y purificado descrito (véase la Sección D), y el fragmento A del vector pAMG22-His digerido con NheI y BamHI utilizando la metodología del ADN recombinante. La ligación se transformó en el anfitrión GM120 de E. coli mediante electroporación utilizando el protocolo del fabricante. Se seleccionaron los clones, se aisló el ADN plasmídico, y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen muOPG-HEK[22-401]. La secuenciación del ADN reveló una mutación espúrea en la secuencia de muOPG natural que dio como resultado un cambio de un único aminoácido de Alanina 45 de muOPG a Treonina.

La expresión de muOPG HEK[22-401] (A45T) recombinante a partir de las células GM120 que albergaban el plásmido pAMG21 recombinante fue determinada utilizando métodos similares a los descritos en la Sección C, excepto que en lugar de la adición del autoinductor sintético, se añadió IPTG a una concentración final 0,4 mM para lograr la inducción.

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22

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S. OPG met-arg-gly-ser-(his)6[22-401] humana

Se diseñaron ocho oligonucleótidos (1338-09 a 1338-16 mostrados más abajo) para producir el fragmento de 175 pares de bases como ADN de doble hebra superpuesto. Se hibridaron los oligos, se ligaron, y se utilizaron los 5' y 3' como cebadores para la PCR para producir grandes cantidades del fragmento de 175 bases. Los productos génicos de la PCR final se digirieron con las endonucleasas de restricción ClaI y KpnI para producir un fragmento que reemplaza los 28 codones N-terminales de la OPG humana. El producto de la PCR digerido con ClaI y KpnI se insertó en pAMG21-huOPG[27-401] que también había sido escindido con ClaI y KpnI. El ADN ligado se transformó en células anfitrionas competentes de la cepa 393 de E. coli. Los clones fueron escrutados en cuanto a su capacidad para producir el producto proteico recombinante y para poseer la fusión génica que tenía la secuencia de nucleótidos correcta. Los niveles de expresión de la proteína se determinaron a partir de estudios en matraces de sacudimiento de 50 ml. Se analizaron el producto lisado completo y el sedimento de la sonicación en cuanto a la expresión del constructo mediante geles de PAGE teñidos con Coomassie y análisis Western con anticuerpo anti-OPG murino. La expresión de huOPG Met-Arg-Gly-Ser-(His)_{6}[22-401] dio como resultado la formación de grandes cuerpos de inclusión y la proteína se localizó en la fracción insoluble (sedimento).

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T. OPG met-lys[22-401] y met(lys)_{3}[22-401] humana

Para construir las versiones met-lys y met-(lys)_{3} de la OPG[22-401] humana, se diseñaron oligonucleótidos superpuestos para añadir el número apropiado de restos lisina. Los dos oligos para cada constructo se diseñaron para que se superpusieran, permitiendo dos rondas de PCR para producir el producto final. El molde para la primera reacción de PCR fue una preparación de ADN plasmídico que contenía el gen OPG 22-401 humano. La primera PCR añadió uno o varios restos lisina. La segunda PCR utilizó el producto de la primera ronda y añadió la secuencia de nuevo al primer sitio de restricción, ClaI.

Los productos génicos de la PCR final se digirieron con las endonucleasas de restricción ClaI y KpnI, que remplazan los 28 codones N-terminales de la huOPG, y después se ligaron en el plásmido pAMG21-hu OPG [27-401] que también había sido digerido con las dos endonucleasas de restricción. El ADN ligado se transformó en células anfitrionas competentes de la cepa 393 de E. coli. Los clones se escrutaron en cuanto a la capacidad para producir el producto proteico recombinante y poseer la fusión génica que tenía la secuencia de nucleótidos correcta. Los niveles de expresión de la proteína se determinaron a partir de estudios en matraces de sacudimiento de 50 ml. El producto lisado celular completo y el sedimento de la sonicación se analizaron en cuanto a la expresión del constructo mediante geles de PAGE teñidos con Coomassie y análisis Western con anticuerpo murino anti-OPG. Ningún constructo tuvo un nivel detectable de expresión de proteína ni fueron visibles cuerpos de inclusión. Las secuencias de ADN se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

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Cebadores oligonucleotídicos para preparar Met-Lys huOPG[22-401]:

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Cebadores oligonucleotídicos para preparar Met-(Lys)_{3}-huOPG[22-401]:

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U. Fusiones OPG [22-401]/Fc humanas y murinas

Se construyeron cuatro fusiones OPG-Fc donde la región Fc de la IgG1 humana se fusionó en el extremo N de los aminoácidos 22 a 401 de la Osteoprotegerina humana o murina (referidas como Fc/OPG [22-401]) o en el extremo C (referidas como OPG [22-401]/Fc). Las fusiones con Fc se construyeron utilizando el vector de fusión pFc-A3 descrito en el Ejemplo 7.

Todos los genes de fusión se construyeron utilizando la tecnología de la PCR normalizada. Los moldes para las reacciones de PCR fueron preparaciones plasmídicas que contenían los genes diana. Se diseñaron oligos superpuestos para combinar la porción C-terminal de un gen con la porción N-terminal del otro gen. Este procedimiento permite fusionar los dos genes juntos en el marco de lectura correcto después de que se hayan llevado a cabo las reacciones de PCR apropiadas. Inicialmente se colocó un oligo de "fusión" para cada gen en una reacción de PCR con un cebador universal para el vector que porta el gen diana. El oligo de "fusión" complementario se utilizó con un cebador universal para la PCR del otro gen. Al final de esta primera reacción de PCR, se obtuvieron dos productos separados, con cada uno de los genes individuales con un sitio de fusión presente, creando un solapamiento suficiente para dirigir la segunda ronda de PCR y crear la fusión deseada. En la segunda ronda de la PCR, se combinaron los dos primeros productos de la PCR junto con los cebadores universales y por medio de las regiones superpuestas, se produjo la secuencia del ADN de fusión completa.

Los productos génicos de la PCR final se digirieron con las endonucleasas de restricción XbaI y BamHI, y después se ligaron en el vector pAMG21 que también se había digerido con las dos endonucleasas de restricción. El ADN ligado se transformó en células anfitrionas competentes de la cepa 393 de E. coli. Los clones se escrutaron en cuanto a la capacidad para producir el producto proteico recombinante y para poseer la fusión génica con la secuencia de nucleótidos correcta. Los niveles de expresión de la proteína se determinaron a partir de estudios en matraces de sacudimiento de 50 ml. El producto lisado celular completo, el sedimento de la sonicación, y el sobrenadante se analizaron en cuanto a la expresión de la fusión mediante geles de PAGE teñidos con Coomassie y análisis Western con anticuerpo anti-OPG murino.

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Fc/huOPG [22-401]

Se detectó la expresión del péptido de fusión Fc/hu OPG [22-401] en un gel de PAGE teñido con Coomassie y una transferencia Western. Las células tienen cuerpos de inclusión muy grandes, y la mayoría del producto se encuentra en la fracción insoluble (sedimento). Se utilizaron los siguientes cebadores para construir esta fusión OPG-Fc:

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Fc/muOPG [22-401]

Se detectó la expresión del péptido de fusión en un gel teñido con Coomassie y una transferencia Western. Las células tienen cuerpos de inclusión muy grandes, y la mayoría del producto se encuentra en la fracción insoluble (sedimento). Se utilizaron los siguientes cebadores para construir esta fusión OPG-Fc:

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muOPG [22-401]/Fc

Se detectó la expresión del péptido de fusión en un gel teñido con Coomassie y una transferencia Western. La cantidad de producto recombinante fue menor que las proteínas de fusión de OPG que tienen la región Fc en posición N terminal. No se detectaron cuerpos de inclusión obvios. La mayoría del producto parecía estar en la fracción insoluble (sedimento). Se utilizaron los siguientes cebadores para construir esta fusión OPG-Fc:

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huOPG [22-401]/Fc

No se detectó la expresión del péptido de fusión en un gel teñido con Coomassie, aunque estuvo presente una débil señal positiva por Western. No se detectaron cuerpos de inclusión obvios. Se utilizaron los siguientes cebadores para construir esta fusión OPG-Fc:

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V. Fusión OPG met[22-401]-Fc (P25A) humana

Este constructo combina un cambio de aminoácidos de prolina a alanina en la posición 25 (P25A) con la fusión huOPG met[22-401]-Fc. El plásmido fue digerido con las endonucleasas de restricción ClaI y KpnI, que separa los 28 codones N-terminales del gen, y el fragmento pequeño resultante (menos de 200 pares de bases) se purificó en gel. Este fragmento que contenía el cambio de prolina a alanina se ligó después en la fusión huOPG [22-401]-Fc del plásmido pAMG21 que se había digerido con las dos endonucleasas de restricción. El ADN ligado se transformó en células anfitrionas competentes de la cepa 393 de E. coli. Los clones se escrutaron en cuanto a la capacidad para producir el producto proteico recombinante y para poseer la fusión génica que tiene la secuencia de nucleótidos correcta. Los niveles de expresión de proteína se determinaron a partir de estudios en matraces de sacudimiento de 50 ml. Se analizaron el producto lisado celular completo y el sedimento de la sonicación en cuanto a la expresión del constructo mediante geles de PAGE teñidos con Coomassie y análisis Western con anticuerpo anti-OPG murina. El nivel de expresión del péptido de fusión se detectó sobre un gel de PAGE teñido con Coomassie y una transferencia Western. La proteína se encontró en la fracción insoluble (sedimento). Las células tenían cuerpos de inclusión
grandes.

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W. OPG met[22-401] (P25A) humana

Se construyó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 22 a 401 de la OPG humana sustituyendo la prolina de la posición 25 por alanina bajo el control del promotor luxPR en un vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue: Se hibridaron los oligos sintéticos núm. 1289-84 y 1289-85 para formar un dúplex de conectores oligo con extremos cohesivos XbaI y KpnI. El dúplex de conectores sintéticos utilizó codones de E. coli óptimos y codificó una metionina N-terminal. El conector también incluyó un sitio de restricción SpeI que no estaba presente en la secuencia original. El dúplex de conectores se insertó direccionalmente entre los sitios XbaI y KpnI en pAMG21-huOPG-22-401 utilizando métodos normalizados. Inicialmente se escrutaron los clones en cuanto a la producción de la proteína recombinante. El ADN plasmídico se aisló de los clones positivos y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen HuOPG Met[22-401] (P25A). Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para generar el conector XbaI-KpnI:

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X. OPG met[22-401] (P26A) y (P26D) humana

Se construyó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 22 a 401 de la OPG humana sustituyendo la prolina de la posición 26 por alanina bajo el control del promotor luxPR en un vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue: Se hibridaron los oligos núm. 1289-86 y 1289-87 para formar un dúplex de conectores oligo con extremos cohesivos XbaI y SpeI. El dúplex de conectores sintéticos utilizó codones de E. coli óptimos y codificó una metionina N-terminal. El dúplex de conectores se insertó direccionalmente entre los sitios XbaI y SpeI en pAMG21-huOPG-22-401 (P25A) utilizando métodos normalizados. La mezcla de ligación se introdujo en el anfitrión GM221 de E. coli mediante transformación. Los clones se escrutaron inicialmente en cuanto a la producción de la proteína recombinante. El ADN plasmídico se aisló de los clones positivos y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen huOPG met[22-401] (P26A). Se encontró que uno de los clones secuenciados tenía la prolina de la posición 26 sustituida por un ácido aspártico en lugar de por alanina, y este clon se designó huOPG-met[22-401] (P26D). Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para generar el conector XbaI-SpeI:

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Y. OPG met[22-194] (P25A) humana

Se construyó una secuencia de ADN que codificaba una metionina N-terminal y los aminoácidos 22 a 194 de la OPG humana sustituyendo la prolina de la posición 25 por alanina bajo el control del promotor luxPR en un vector de expresión procariótico pAMG21 como sigue: Se digirieron cada uno de los plásmidos pAMG21-huOPG[27-194] y pAMG21-huOPG[22-401] (P25A) con las endonucleasas KpnI y BamHI. Se aisló el fragmento de 450 pb de pAMG21-huOPG[27-194] y se aisló el fragmento de 6,1 kpb de pAMG21-huOPG[22-401] (P25A). Estos fragmentos se ligaron juntos y se introdujeron en el anfitrión GM221 de E. coli mediante transformación. Inicialmente se escrutaron los clones en cuanto a la producción de la proteína recombinante. El ADN plasmídico se aisló de los clones positivos y se realizó la secuenciación del ADN para verificar la secuencia de ADN del gen huOPG-Met[22-194] (P25A).

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Ejemplo 9 Asociación de Monómeros de OPG

Se utilizaron células CHO diseñadas para expresar en exceso muOPG[22-401] para generar medio acondicionado para el análisis de la OPG recombinante secretada utilizando anticuerpos policlonales anti-OPG de conejo. Se concentró 20 veces una alícuota de medio acondicionado, después se analizó mediante SDS-PAGE reductora y no reductora (Figura 15). En condiciones reductoras, la proteína migraba en forma de un polipéptido de Mr 50-55 kd, como se podría preveer si el producto maduro estuviera glicosilado en uno o más de sus sitios de glicosilación unidos a N consenso. Sorprendentemente, cuando se analizaron las mismas muestras mediante SDS-PAGE no reductora, la mayoría de la proteína migró en forma de un polipéptido de aproximadamente 100 kd, dos veces el tamaño de la proteína reducida. Además, había una pequeña cantidad del polipéptido de Mr 50-55 kD. Este patrón de migración sobre SDS-PAGE coincidía con la noción de que la OPG producto estaba formando dímeros por medio de oxidación de uno o varios grupos sulfhidrilo libres.

El polipéptido de OPG maduro pronosticado contiene 23 restos cisteína, 18 de los cuales se pronostica que están implicados en la formación de puentes disulfuro intracatenarios que comprenden los cuatro dominios ricos en cisteína (Figura 12A). Los cinco restos cisteína C-terminales restantes no están implicados en la estructura secundaria que puede ser pronosticada basándose en la homología con otros miembros de la familia del TNFR. En conjunto existe un número impar neto de restos cisteína, y es formalmente posible que al menos un resto esté libre para formar un enlace disulfuro intermolecular entre dos monómeros de OPG.

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Para ayudar a elucidar los patrones de la cinesis de la OPG y la asociación de monómeros, se realizó un estudio de marcaje mediante "radiomarcaje y seguimiento". Las células CHO que expresaban muOPG [22-401] se marcaron metabólicamente como se ha descrito antes en medio sin suero que contenía metionina y cisteína S^{35} durante 30 minutos. Después de este período, se separó el medio, y se remplazó por medio completo que contenía metionina y cisteína no marcadas a niveles de un exceso de aproximadamente 2.000 veces con respecto a la concentración original de aminoácidos radiactivos. A los 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas y 12 horas después de la adición, los cultivos se cosecharon mediante separación del medio acondicionado, y se prepararon los productos lisados del medio acondicionado y las monocapas adherentes. El medio de cultivo y los productos lisados celulares se aclararon como se ha descrito antes, y después se inmunoprecipitaron utilizando anticuerpos anti-OPG como se ha descrito antes. Una vez que los productos inmunoprecipitados se hubieron lavado, se liberaron hirviendo en tampón para SDS-PAGE no reductor después se dividieron en dos mitades iguales. A una mitad, se le añadió el agente reductor \beta-mercaptoetanol a una concentración final del 5% (v/v), mientras la otra mitad se mantuvo en condiciones no reductoras. Ambos grupos de productos inmunoprecipitados se analizaron mediante SDS-PAGE como se ha descrito antes, después se prepararon para la autorradiografía y se expusieron a la película. Los resultados se muestran en la Figura 16. Las muestras analizadas mediante SDS-PAGE reductora se representan en los dos paneles de la parte inferior. Tras la síntesis, el polipéptido de OPG es transformado en un polipéptido ligeramente más grande, que probablemente representa la modificación mediante glicosilación unida a N. Después de aproximadamente 1-2 horas, el nivel de OPG en la célula disminuye espectacularmente, y concomitantemente aparece en el sobrenadante de cultivo. Esto parece ser resultado del transporte vectorial de la OPG desde la célula al medio a lo largo del tiempo, coincidente con la noción de que la OPG es una proteína secretada naturalmente. El análisis de los mismos productos inmunoprecipitados en condiciones no reductoras revela la relación entre la formación de dímeros de OPG y la secreción al medio acondicionado (Figura 16, paneles superiores). En los primeros 30-60 minutos, se transformaron monómeros de OPG en la célula mediante glicosilación aparente, seguida de formación de los dímeros. Con el tiempo, la masa de monómeros de OPG se transforma en dímeros, que desaparecen con posterioridad de la célula. Comenzando aproximadamente 60 minutos después de la síntesis, los dímeros de OPG aparecen en el medio acondicionado, y se acumulan durante la duración del experimento. Después de este período, se forman dímeros de OPG, que después se secretan al medio de cultivo. Los monómeros de OPG persisten a un nivel bajo dentro de la célula a lo largo del tiempo, y también aparecen pequeñas cantidades en el medio. Esto no parece ser el resultado de la rotura de los dímeros de OPG covalentes, si no de la producción de cantidades sub-estequiométricas de monómeros en la célula y de la posterior secreción.

La OPG producida recombinantemente a partir de células CHO transfectadas parece ser predominantemente un dímero. Para determinar si la dimerización es un proceso natural en la síntesis de OPG, los autores de la presente invención analizaron el medio acondicionado de una línea celular que se ha encontrado que expresa naturalmente la OPG. Se encontró que la línea celular CTLL-2, una línea celular de linfocitos T citotóxicos murinos (núm. de acceso ATCC TIB.214), expresaba ARNm de OPG en un escrutinio de ARN de tejidos y líneas celulares. Se encontró que el transcrito de OPG era el mismo que el ARN de 2,5-3,0 kb clonado y secuenciado identificado a partir de riñón y se encontró que codificaba una molécula secretada. El análisis de transferencia Western del medio acondicionado obtenido de células CTTL-2 muestra que la mayoría, si no toda, la proteína OPG secretada es un dímero (Figura 17). Esto sugiere que la dimerización y secreción de OPG no es un artefacto de la expresión en exceso en una línea celular, si no que es probable que sea la forma principal del producto a medida que es producido por las células que lo expresan.

Se analizaron tejidos y suero de ratón normal y transgénico para determinar la naturaleza de la molécula OPG expresada en ratones transgénicos para OPG. Puesto que el ADNc de OPG de rata se expresaba bajo el control de un elemento de control de hepatocitos, se analizaron extractos elaborados a partir del parénquima de ratones de control y transgénicos en condiciones no reductoras (Figura 18). En los extractos de los ratones transgénicos, pero no de los de control, se detectan fácilmente dímeros de OPG, junto con cantidades sub-estequiométricas de monómeros. Los dímeros y monómeros de OPG parecen idénticos a la proteína murina expresada en células CHO diseñadas genéticamente. Esto sugiere con fuerza que los dímeros de OPG son por supuesto una forma natural del producto génico, y es probable que sean componentes activos clave. Las muestras de suero obtenidas de ratones de control y transgénicos se analizaron de una manera similar mediante análisis de transferencia Western. En los ratones de control, la mayor parte de la proteína OPG migra en forma de dímero, a la vez que se detectan pequeñas cantidades de monómero. Además, se detectan cantidades significativas de una proteína relacionada con OPG más grande, que migra con una masa molecular relativa que coincide con el tamaño pronosticado de un trímero unido covalentemente. De este modo, la OPG recombinante es expresada predominantemente en forma de una proteína dimérica en ratones transgénicos para OPG, y la forma dimérica puede ser la base para el fenotipo osteopetrótico en ratones OPG. La proteína OPG recombinante también puede existir en formas "triméricas" de peso molecular superior.

Para determinar si los cinco restos cisteína C-terminales de la OPG juegan un papel en la homodimerización, se cambiaron los codones de la OPG murina para los restos cisteína 195 (C195), C202, C277, C319, y C400 por serina utilizando Quick-Change® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, San Diego, CA) como se ha descrito antes. El gen muOPG se subclonó entre los sitios NotI y XbaI del vector pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA). El plásmido resultante, pcDNA3.1-muOPG, y los cebadores mutagénicos se trataron con la polimerasa Pfu en presencia de desoxinucleótidos, después se amplificaron en un termociclador como se ha descrito antes. Después se transfectó una alícuota de la reacción en E. coli XL1-Blue competente mediante choque térmico, luego se cultivo en placa. El ADN plasmídico de los transformantes se secuenció después para verificar las mutaciones.

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Se utilizaron los siguientes pares de cebadores para cambiar el codón para el resto cisteína 195 a serina del gen de la OPG murina, dando como resultado la producción de una proteína muOPG [22-401] C195S:

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Se utilizaron los siguientes pares de cebadores para cambiar el codón para el resto cisteína 202 a serina del gen de la OPG murina, dando como resultado la producción de una proteína muOPG [22-401] C202S:

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Se utilizaron los siguientes pares de cebadores para cambiar el codón para el resto cisteína 277 a serina del gen de la OPG murina, dando como resultado la producción de una proteína muOPG [22-401] C277S:

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Se utilizaron los siguientes pares de cebadores para cambiar el codón para el resto cisteína 319 a serina del gen de la OPG murina, dando como resultado la producción de una proteína muOPG [22-401] C319S:

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Se utilizaron los siguientes pares de cebadores para cambiar el codón para el resto cisteína 400 a serina del gen de la OPG murina, dando como resultado la producción de una proteína muOPG [22-401] C400S:

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Cada plásmido de muOPG [22-401] resultante que contenía la mutación apropiada se transfectó después a células 293 humanas, la proteína de fusión OPG-Fc mutante se purificó del medio acondicionado como se ha descrito antes. La actividad biológica de cada proteína se evaluó mediante el análisis de formación de osteoclastos in vitro descrito en el ejemplo 11. Se analizó el medio acondicionado de cada transfectante mediante SDS-PAGE no reductora y transferencia western con anticuerpos anti-OPG.

La mutación de cualquiera de los cinco restos cisteína C-terminales da como resultado la producción de moléculas de OPG de 55 kd predominantemente (>95%) monoméricas. Esto sugiere con fuerza que los restos cisteína C-terminales juegan juntos un papel en la homodimerización de OPG.

Se construyeron mutantes por deleción C-terminal de OPG para cartografiar la región o las regiones del dominio C-terminal de la OPG que son importantes para la homodimerización de OPG. Estos mutantes de OPG se construyeron mediante amplificación por PCR utilizando cebadores que introducen señales de traducción de terminación prematura en la región C-terminal de la OPG murina. El oligo 5' fue diseñado para el codón de inicio de MuOPG (que contenía un sitio de restricción HindIII) y los oligonucleótidos 3' (que contenían un codón de terminación y un sitio XhoI) fueron diseñados para truncar la región terminal de muOPG que terminaba en cualquiera de los restos treonina 200 (CT 200), prolina 212 (CT212), ácido glutámico 293 (CT-293), o serina 355 (CT-355).

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Se utilizaron los siguientes cebadores para construir muOPG [22-200]:

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Se utilizaron los siguientes cebadores para construir muOPG [22-212]:

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Se utilizaron los siguientes cebadores para construir muOPG [22-293]:

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Se utilizaron los siguientes cebadores para construir muOPG [22-355]:

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Cada plásmido muOPG-ct resultante que contenía el truncamiento apropiado fue transfectado después a células 293 humanas, la proteína de fusión OPG-Fc mutante se purificó del medio acondicionado como se ha descrito antes. La actividad biológica de cada proteína se evaluó mediante el análisis in vitro de formación de osteoclastos descrito en el ejemplo 11. Los medios acondicionados también se analizaron mediante SDS-PAGE no reductora y transferencia western utilizando anticuerpos anti-OPG.

El truncamiento de la región C-terminal de la OPG tiene efecto sobre la capacidad de la OPG para formar homodímeros. CT 355 es predominantemente monomérico, aunque se forma algo de dímero. CT 293 forma lo que parecen ser cantidades molares iguales de monómero y dímero, y también agregados de elevado peso molecular. No obstante, CT 212 y CT 200 son monoméricos.

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Ejemplo 10 Purificación de OPG A. Purificación de Proteínas de Fusión OPG-Fc de mamífero

Se prepararon 5 l de medio acondicionado a partir de células 293 que expresaban una proteína de fusión OPG-Fc como sigue. Se descongeló una muestra congelada de células en 10 ml de medio 293S (DMEM-elevado contenido de glucosa, 1x L-glutamina, suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS) y 100 \mug/ml de higromicina) y se introdujo en medio de nueva aportación al cabo de un día. Después de tres días, las células se dividieron en dos matraces T175 a diluciones 1:10 y 1:20. Se realizaron dos divisiones 1:10 adicionales para aumentar a escala hasta 200 matraces T175. En este punto las células estaban a 5 días de la descongelación. Las células se hicieron crecer casi hasta la confluencia (aproximadamente tres días) en cuyo momento se aspiró el medio que contenía el suero, las células se lavaron una vez con 25 ml de PBS por matraz y se añadieron 25 ml de medio SF (DMEM-elevado contenido de glucosa, 1x L-glutamina) a cada matraz. Las células se mantuvieron a 5% de CO_{2} durante tres días en cuyo momento se recogió el medio, se centrifugó, y se filtró a través de filtros de nitrato de celulosa de 0,45 m (Corning).

Las proteínas de fusión OPG-Fc se purificaron utilizando una columna de Proteína G Sefarosa (Pharmacia) equilibrada en PBS. El tamaño de la columna varió dependiendo del volumen del medio de partida. El medio acondicionado preparado como se ha descrito antes se cargó en la columna, la columna se lavó con PBS, y la proteína pura se hizo eluir utilizando glicina 100 mM pH 2,7. Las fracciones se recogieron en tubos que contenían Tris 1 M pH 9,2 con el fin de neutralizar tan rápido como fuera posible. Las fracciones que contenían proteína se reunieron, se concentraron en Amicon Centricon 10 o Centiprep 10 y se sometieron a diafiltración en PBS. La proteína pura se almacenó a -80ºC. Mediante este procedimiento se purificaron [22-401]-Fc murina, [22-180]-Fc Murina, [22-194]-Fc Murina, [22-401]-Fc humana y [22-201]Fc humana. Por medio de este procedimiento se purificó [22-185]-Fc murina.

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B. Preparación de anticuerpos anti-OPG

Se inyectó subcutáneamente la proteína de fusión muOPG[22-401]-Fc a tres conejos New Zealand White (peso inicial 2.300-3.680 g). Cada conejo fue inmunizado el día 1 con 50 \mug de antígeno emulsionado en un volumen igual de coadyuvante completo de Freund. Se realizaron refuerzos adicionales (Días 14 y 28) mediante el mismo procedimiento con la sustitución de coadyuvante incompleto de Freund. Los títulos de anticuerpo se controlaron mediante EIA. Después del segundo refuerzo, el antisuero reveló elevados títulos de anticuerpo y se obtuvieron sangrías con producción de 25 ml de cada animal. El suero se hizo pasar primero sobre una columna de afinidad en la cual se había inmovilizado OPG-Fc murina. Los anticuerpos anti-OPG se hicieron eluir con Pierce Gentle Elution Buffer que contenía 1% de ácido acético glacial. La proteína eluida se sometió después a diálisis en PBS y se hizo pasar sobre una columna de Fc para separar cualquier anticuerpo específico para la porción Fc de la proteína de fusión OPG. La ronda a través de las fracciones que contenían anticuerpos específicos anti-OPG se sometieron a diálisis en PBS.

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C. Purificación de OPG[22-401] murina Cromatografía de Afinidad con Anticuerpo

Se sometieron a diafiltración anticuerpos anti-OPG purificados por afinidad en tampón de acoplamiento (carbonato de sodio 0,1 M pH 8,3, NaCl 0,5M), y se mezclaron con cuentas de Sefarosa activadas con CNBr (Pharmacia) durante dos horas a la temperatura ambiente. Después la resina se lavó con tampón de acoplamiento extensamente antes de bloquear los sitios no ocupados con etanolamina 1 M (pH 8,0) durante dos horas a la temperatura ambiente. Después se lavó la resina con un pH bajo (acetato de sodio 0,1 M pH 4,0, NaCl 0,5 M) seguido de un lavado a pH elevado (Tris-HCl 0,1 M pH 8,0, NaCl 0,5 M). Los últimos lavados se repitieron tres veces. La resina se equilibró finalmente con PBS antes de empaquetarla en la columna. Una vez empaquetada, la resina se lavó con PBS. Se realizó una elución blanco con glicina-HCl 0,1 M, pH 2,5), seguido de re-equilibrado con PBS.

Se aplicó el medio acondicionado concentrado de las células CHO que expresaban muOPG[22-410] a la columna a una velocidad de flujo lenta. La columna se lavó con PBS hasta que la absorbancia de UV medida a 280 nm volvió a la línea base. La proteína se hizo eluir de la columna primero con glicina-HCl 0,1 M (pH 2,5), se re-equilibró con PBS, y se hizo eluir con un segundo tampón (CAPS 0,1 M, pH 10,5), NaCl 1M). Las dos reservas de elución se sometieron a diafiltración por separado en PBS y se filtraron en condiciones estériles antes de congelar a -20ºC.

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Cromatografía Convencional

Se concentró el medio acondicionado de las células CHO 23x en un cartucho enrollado en espiral Amicon (S10Y10) y se sometió a diafiltración en tris 20 mM pH 8,0. El medio sometido a diafiltración se aplicó después a una columna Q-Sepharose HP (Pharmacia) que había sido equilibrada con tris 20 mM pH 8,0. La columna se lavó después hasta que la absorbancia a 280 nm alcanzó la línea base. La proteína se hizo eluir con un gradiente 20 veces el volumen de la columna de NaCl 0-300 mM en tris pH 8,0. La proteína OPG se detectó utilizando una transferencia western de las fracciones de la columna.

Las fracciones que contenían OPG se reunieron y se llevaron a una concentración final de NaCl 300 mM, DTT 0,2 mM. Se equilibró una columna NiNTA Superose (Qiagen) con tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, DTT 0,2 mM después de lo cual se aplicaron las fracciones reunidas. La columna se lavó con tampón de equilibrado hasta que se alcanzó la absorbancia de la línea base. Las proteínas se hicieron eluir de la columna con un gradiente de Imidazol 0-30 mM en tampón de equilibrado. Las proteínas restantes se separaron mediante lavado de la columna con Imidazol 1 M. De nuevo se utilizó una transferencia western para detectar las fracciones que contenían OPG.

Las fracciones reunidas de la columna NiNTA se sometieron a diálisis en fosfato de potasio 10 mm pH 7,0, DTT 0,2 mM. La reserva sometida a diálisis se aplicó después a una columna de hidroxiapatita cerámica (Bio-Rad) que había sido equilibrada en tampón fosfato 10 mM. Después del lavado de la columna, la proteína se hizo eluir con un gradiente de fosfato de potasio 10-100 mM en 20 veces el volumen de la columna. Esto estuvo seguido de un gradiente de 20 veces el volumen de la columna de fosfato 100-400 mM.

Se detectó OPG mediante tinción con azul de Coomassie de los geles de SDS-poliacrilamida y mediante transferencia western. Las fracciones se reunieron y se sometieron a diafiltración sobre PBS y se congelaron a -80ºC. La proteína purificada corre como un monómero y permanecerá así después de la diafiltración en PBS. El monómero es estable cuando se almacena congelado o a pH 5 a 4ºC. Sin embargo si se almacena a 4ºC en PBS, se formarán dímeros y lo que parecen ser trímeros y tetrámeros al cabo de una semana.

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D. Purificación de OPG met[22-401] humana a partir de E. coli

Se suspendió pasta celular bacteriana en EDTA 10 mM a una concentración del 15% (p/v) utilizando un homogeneizador a baja cizalla a 5ºC. Después las células se desorganizaron por medio de dos homogeneizaciones a 1.054,8 kg/cm^{2} (15.000 psi) cada una a 5ºC. El producto homogeneizado resultante se centrifugó a 5.000 x g durante una hora a 5ºC. El sedimento obtenido mediante centrifugación se lavó mediante homogeneización a baja cizalla en agua al volumen de homogeneización original seguido de centrifugación como antes. El sedimento lavado se solubilizó después al 15% (p/v) por medio de una solución de guanidina HCl 6 M (concentración final), ditiotreitol 10 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,5 a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Esta solución se diluyó 30 veces en urea 2M que contenía CAPS 50 mM, pH 10,5, glutatión reducido 1 mM y después se agitó durante 72 horas a 5ºC. La OPG se purificó a partir de esta solución a 25ºC ajustando primero a pH 4,5 con ácido acético y después mediante cromatografía sobre una columna de resina SP-HP Sepharose equilibrada con acetato de sodio 25 mM, pH 4,5. La elución de la columna se llevó a cabo con un gradiente de cloruro de sodio lineal de 50 mM a 500 mM en el mismo tampón utilizando 20 veces el volumen de la columna a una velocidad de flujo de 0,1 veces el volumen de la columna/minuto. Las fracciones pico que contenían solamente la forma de OPG deseada se reunieron y se almacenaron a 5ºC o se cambió el tampón a solución salina tamponada con fosfato, se concentraron mediante ultrafiltración, y después se almacenaron a 5ºC. Este material se analizó mediante HPLC en fase reversa, SDS-PAGE, análisis del producto lisado del amebocito de limulus en cuanto a la presencia de endotoxina, y secuenciación N-terminal. Además, también se pueden utilizar técnicas tales como espectrometría de masas, estabilidad de pH/temperatura, fluorescencia, dicroísmo circular, calorimetría de barrido diferencial, y análisis de perfilado con proteasas para examinar la naturaleza plegada de la proteína.

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Ejemplo 11 Actividad Biológica de OPG Recombinante

Basándose en la histología y la histomorfometría, pareció que la expresión hepática en exceso de OPG en ratones transgénicos disminuía notablemente el número de oesteoclastos que conducía a un aumento notable en el tejido óseo (véase el Ejemplo 4). Para adquirir una nueva percepción de los mecanismos potenciales que subyacen a este efecto in vivo, se han sometido a ensayo diversas formas de OPG recombinante en un modelo de cultivo in vitro de formación de osteoclastos (análisis de formación de osteoclastos). Este sistema de cultivo fue ideado originalmente por Udagawa (Udagawa et al. Endocrinology 125, 1805-1813 (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7260-7264 (1990)) y emplea una combinación de células de médula ósea y células de líneas celulares estromáticas de médula ósea. Se ha publicado previamente una descripción de la modificación de este sistema de cultivo utilizado para estos estudios (Lacey et al. Endocrinology 136, 2367-2376 (1995)). En este método, células de médula ósea arrastradas de fémures y tibias de ratones, se cultivan durante la noche en medio de cultivo (MEM alfa con suero bovino fetal inactivado con calor al 10%) con un suplemento de 500 U/ml de CSF-1 (factor estimulador de colonias-1, también denominado M-CSF), un factor de crecimiento hematopoyético específico para células del linaje de la familia de monocitos/macrófagos. Después de esta incubación, se recogen las células no adherentes, se someten a purificación en gradiente, y después se cultivan simultáneamente con células de la línea celular de médula ósea ST2 (1 x 10^{6} células no adherentes: 1 x 10^{5} células ST2/ml de medio). Se añade al medio un suplemento de dexametasona (100 nM) y metabolito biológicamente activo de vitamina D2 conocido como 1,25 dihidroxivitamina D3 (1,25 (OH)2 D3, 10 nM). Para potenciar la aparición de osteoclastos, se añade prostaglandina E2 (250 nM) a algunos cultivos. El período de cultivo simultáneo oscila normalmente entre 8-10 días y el medio, con todos los suplementos recién añadidos, se renueva cada 3 - 4 días. A diversos intervalos, se evalúan los cultivos en cuanto a la presencia de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) utilizando una tinción histoquímica (Sigma Kit Núm. 387A, Sigma, St. Louis, MO) o análisis de solución TRAP. El método histoquímico de TRAP permite la identificación de osteoclastos fenotípicamente que son células multinucleadas (\geq 3 núcleos) que también son TRAP+. El análisis de la solución implica lisar los cultivos que contienen osteoclastos en un tampón citrato (100 mM, pH 5,0) que contiene Triton X-100 al 0,1%. La actividad de la fosfatasa ácida resistente a tartrato se mide después basándose en la conversión de fosfato de p-nitrofenil (20 nM) en p-nitrofenol en presencia de tartrato de sodio 80 mM lo que ocurre durante una incubación de 3-5 minutos a RT. La reacción se termina mediante la adición de NaOH a una concentración final de 0,5 M. La densidad óptica a 405 nm se mide y se trazan los resultados.

Estudios previos (Udagawa et al. ídem) utilizando el análisis de formación de osteoclastos han demostrado que estas células expresan receptores para la calcitonina-I^{125} (autorradiografía) y pueden formar fosas en las superficies de los huesos, que combinadas con el carácter positivo para TRAP confirman que las células multinucleadas tienen fenotipo de osteoclastos. Una evidencia adicional que apoya el fenotipo de osteoclasto de las células multinucleadas que surgen in vitro en el análisis de formación de osteclastos es que las células expresan integrinas \alphav y \beta3 mediante inmunohistoquímica y receptores de calcitonina y ARNm de TRAP mediante hibridación in situ (ISH).

Se purificó la fusión huOPG[22-401]-Fc del medio acondicionado de las células CHO y se utilizó con posterioridad en el análisis de formación de osteoclastos. A 100 ng/ml de huOPG[22-401]-Fc, la formación de osteoclastos fue inhibida virtualmente en 100% (Figura 19A). Los niveles de TRAP medidos en los cultivos lisados en los pocillos de la placa de microtitulación también fueron inhibidos en presencia de OPG con una DI_{50} de aproximadamente 3 ng/ml (Figura 20). El nivel de actividad TRAP en los productos lisados parecía corresponderse con el número relativo de osteoclastos observados mediante citoquímica TRAP (compárense las Figuras 19A-19G y 20). También se sometieron a ensayo IgG1 y TNFbp humanos purificados en este modelo y se encontró que no tenían efectos inhibidores ni estimuladores sugiriendo que los efectos inhibidores de la huOPG [22-401]-Fc se debían a la porción OPG de la proteína de fusión. Se han sometido a ensayo formas adicionales de las moléculas humana y murina y los datos cumulativos se resumen en la Tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Efectos de diversas formas de OPG en la formación de osteoclastos in vitro

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Los datos cumulativos sugieren que las secuencias de los aminoácidos 22-401 de la OPG murina y humana son totalmente activos in vitro, cuando están fusionadas al dominio Fc, o cuando no están fusionadas. Inhiben de una manera dependiente de la dosis y poseen actividades semi-máximas en el intervalo de 2-10 ng/ml. El truncamiento del extremo C murino en el resto treonina 180 inactiva la molécula, mientras el truncamiento en la cisteína 185 y más allá tiene toda la actividad. Se pronostica que el resto cisteína localizado en la posición 185 forma un enlace SS3 en la región del dominio 4 de la OPG. Se ha demostrado previamente que la separación de este resto en otras proteínas relacionadas con TNFR anula la actividad biológica (Yan et al. J. Biol. Chem. 266, 12099-12104 (1994)). El descubrimiento de los autores de la presente invención de que muOPG[22-180]-Fc es inactiva mientras muOPG[22-185]-Fc es activa coincide con estos descubrimientos. Esto sugiere que los restos aminoácido 22-185 definen una región para la actividad de la OPG.

Estos descubrimientos indican que como la OPG expresada transgénicamente, la proteína OPG recombinante también anulaba la formación de osteoclastos cuando se sometía a ensayo en el análisis de formación de osteoclastos. Los experimentos a lo largo del tiempo que examinan la apariencia de células TRAP+, células \beta3+, células F480+ en cultivos expuestos continuamente a OPG demuestran que la OPG bloquea la aparición de células TRAP+ y \beta3+, pero no de células F480+. En cambio, empiezan a aparecer células TRAP+ y \beta3+ tan pronto como 4 días después del establecimiento del cultivo en los cultivos de control. Solamente se pueden encontrar células F480+ en cultivos tratados con OPG y parecen estar presentes cualitativamente en el mismo número que en los cultivos de control. De este modo, el mecanismo de los efectos de la OPG in vitro parece implicar un bloqueo de la diferenciación de osteoclastos en una etapa más allá de la aparición de monocitos-macrófagos pero antes de la aparición de células que expresan las integrinas TRAP o \beta3. En conjunto estos descubrimientos indican que la OPG no interfiere en el crecimiento y la diferenciación general de los precursores de monocitos-macrófagos a partir de médula ósea, si no más bien sugieren que la OPG bloquea específicamente la diferenciación selectiva de osteoclastos a partir de precursores de monocitos-macrófagos.

Para determinar más específicamente cuándo era inhibidora la OPG en la ruta de diferenciación de los osteoclastos, se empleó una variación del método de cultivo in vitro. Esta variación, descrita en (Lacey et al. supra), emplea macrófagos de médula ósea como precursores de osteoclastos. Los precursores de osteoclastos fueron obtenidos recogiendo las células de médula ósea no adherentes después de una incubación durante la noche en CSF-1/M-CSF, y cultivando las células durante 4 días más con 1.000 - 2.000 U/ml de CSF-1. Tras 4 días de cultivo, denominados fase de crecimiento, se separaron las células no adherentes. Las células adherentes, que son macrófagos de la médula ósea, se pueden exponer después hasta durante 2 días a diversos tratamientos en presencia de 1.000 - 2.000 U/ml de CSF-1. Este período de 2 días se denomina período de diferenciación intermedia. Después de eso, las capas de células se enjuagan de nuevo y después se añaden células ST-2 (1 x 10^{5} células/ml), dexametasona (100 nM) y 1,25 (OH)2 D3 (10 nM) durante los 8 últimos días para el denominado período de diferenciación terminal. Los agentes de ensayo también se pueden añadir durante este período terminal. La adquisición de marcadores fenotípicos de diferenciación de osteoclastos se obtiene durante este período terminal (Lacey et al. ídem).

Se sometió a ensayo huOPG [22-401]-Fc (100 ng/ml) en cuanto a su efecto sobre la formación de osteoclastos en este modelo añadiéndolo durante los períodos de diferenciación intermedia, terminal o, alternativamente, ambos. Se realizaron tanto la citoquímica TRAP como los análisis en solución. Los resultados del análisis en solución se muestran en la Figura 21. HuOPG [22-401]-Fc inhibió la aparición de actividad TRAP cuando se añadió en las fases intermedia y terminal o solamente terminal. Cuando se añadía en la fase intermedia y después se separaba del cultivo mediante enjuagado, la huOPG [22-401]-Fc no bloqueaba la aparición de actividad TRAP en los productos lisados del cultivo. Los resultados de la citoquímica son paralelos a los datos del análisis en solución. En conjunto, estas observaciones indican que la huOPG [22-401]-Fc solamente necesita estar presente durante el período de diferenciación terminal para que ejerza todos sus efectos supresores sobre la formación de osteoclastos.

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B. Experimentos de sensibilización con IL1-\alpha e IL1-\beta in vivo

La IL1 aumenta la resorción ósea tanto sistémicamente como localmente cuando se inyecta subcutáneamente sobre la cráneo de ratones (Boyce et al., Endocrinology 125, 1142-1150 (1989)). Los efectos sistémicos se pueden evaluar por el grado de hipercalcemia y los efectos locales histológicamente evaluando la magnitud relativa de la respuesta mediada por osteoclastos. El propósito de estos experimentos fue determinar si la muOPG [22-401]-Fc recombinante podría modificar las acciones local y/o sistémica de la IL1 cuando se inyectaba subcutáneamente sobre la misma región del cráneo que IL1.

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Experimento con IL-1\beta

Se dividieron ratones macho (ICR Swiss White) de 4 semanas de edad en los siguientes grupos de tratamiento (5 ratones por grupo): Grupo de control: animales tratados con IL1 (los ratones recibieron 1 inyección/día de 2,5 \mug de IL1-\beta); animales tratados con una dosis baja de muOPG [22-401]-Fc (los ratones recibieron 3 inyecciones/día de 1 \mug de muOPG [22-401]-Fc; dosis baja de muopg [22-401]-Fc e IL1-\beta; animales tratados con una dosis elevada de muOPG [22-401]-Fc (los ratones recibieron 3 inyecciones/día de 10 \mug de muOPG [22-401]-Fc); dosis elevada de muOPG [22-401]-Fc e IL1-\beta. Todos los ratones recibieron el mismo número total de inyecciones de factor activo o vehículo (seralbúmina bovina al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato). Todos los grupos se sacrificaron el día después de la última inyección. Los pesos y los niveles de calcio ionizado en sangre se miden antes de la primera inyección, cuatro horas después de la segunda inyección y 24 horas después de la tercera inyección de IL1, justo antes de que los animales fueran sacrificados. Tras el sacrificio se separaron los cráneos y se trataron para su corte en parafina.

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Experimento con IL-1\alpha

Se dividieron ratones macho (ICR Swiss White) de 4 semanas de edad en los siguientes grupos de tratamiento (5 ratones por grupo): Grupo de control: animales tratados con IL1 alfa (los ratones recibieron 1 inyección/día de 5 \mug de IL1-alfa); animales tratados con una dosis baja de muOPG [22-401]-Fc (los ratones recibieron 1 inyección/día de 10 \mug de muOPG [22-401]-Fc; dosis baja de muopg [22-401]-Fc e IL1-alfa (dosificación como antes); animales tratados con una dosis elevada de muopg [22-401]-Fc (los ratones recibieron 3 inyecciones/día de 10 \mug de muOPG [22-401]-Fc; dosis elevada de muOPG [22-401]-Fc e IL1-\alpha. Todos los ratones recibieron el mismo número de inyecciones/día de factor activo o vehículo. Todos los grupos se sacrificaron el día después de la última inyección. Los niveles de calcio ionizado en sangre se midieron antes de la primera inyección, cuatro horas después de la segunda inyección y 24 horas después de la tercera inyección de IL1, justo antes de que los animales fueran sacrificados. Los pesos de los animales se midieron antes de la primera inyección, cuatro horas después de la segunda inyección y 24 horas después de la tercera inyección de IL1, justo antes de que los animales fueran sacrificados. Tras el sacrificio se separaron los cráneos y se trataron para su corte en parafina.

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Métodos histológicos

Las muestras de hueso del cráneo se fijaron en cinc-formalina, se descalcificaron en ácido fórmico, se deshidrataron por medio de etanol y se montaron en parafina. Se cortaron secciones (5 \mum de grosor) a través del cráneo adyacente a la sutura lamboide y se tiñeron con hematoxilina y eosina o se hicieron reaccionar para la actividad de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (Sigma Kit núm. 387A) y se contratiñeron con hematoxilina. Se evaluó la resorción ósea en los ratones tratados con IL1-\alpha con métodos histomorfométricos utilizando Osteomeasure (Osteometrics, Atlanta, GA) trazando los rasgos histológicos sobre un rodillo digitalizador utilizando un anclaje para una cámara Lucida montada en un microscopio. Los números de osteoclastos, las superficies cubiertas de osteoclastos, y las superficies erosionadas se determinaron en los espacios medulares del hueso del cráneo. Los lados inyectados y no inyectados del cráneo se midieron por separado.

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Resultados

IL1-\alpha e IL1-\beta produjeron hipercalcemia a las dosis utilizadas, concretamente el segundo día, presumiblemente por la inducción del aumento de resorción ósea sistémicamente. La respuesta hipercalcémica fue bloqueada por muOPG [22-401]-Fc en los ratones tratados con IL1-beta y disminuyó significativamente en los ratones tratados con IL1-alfa, un efecto muy evidente el día 2 (Figura 22A-22B).

El análisis histológico de los cráneos de los ratones tratados con IL1-alfa y beta muestra que los tratamientos con IL1 sola producen un marcado incremento en los índices de resorción ósea incluyendo: número de osteoclastos, superficie recubierta de osteoclastos, y superficie erosionada (superficies que muestran un festoneado profundo debido a la acción osteoclástica (Figura 23B, Tabla 2). En respuesta a IL1-\alpha e IL1-\beta, los incrementos en la resorción ósea fueron similares en los lados inyectados y no inyectados de los cráneos. Las inyecciones de muopg [22-401]-Fc redujeron la resorción ósea en los ratones tratados tanto con IL1-\alpha como beta y en los ratones que recibieron vehículo solo pero esta reducción se observó solamente en los lados de los cráneos en los que se había inyectado muopg
[22-401]-Fc.

La explicación más probable para estas observaciones es que la muOPG [22-401]-Fc inhibía la resorción ósea, una conclusión apoyada por la reducción del número de osteoclastos total y el porcentaje de superficie de hueso disponible que está siendo sometida a resorción ósea, en la región del cráneo adyacente a los sitios en los que se ha inyectado muOPG [22-401]-Fc. Las acciones de muOPG [22-401]-Fc parecían ser muy marcadas localmente por la histología, pero el hecho de que la muOPG [22-401]-Fc también calmara la hipercalcemia inducida por IL1 sugiere que la muOPG [22-401]-Fc tiene efectos más sutiles sobre la resorción ósea sistémicamente.

41

C. Efectos Sistémicos de muOPG [22-401]-Fc en Ratones en Crecimiento

Se dividieron ratones macho BDF1 de 3-4 semanas de edad, intervalo de peso 9,2-15,7 g en grupos de diez ratones por grupo. A estos ratones se les inyectó subcutáneamente solución salina o muOPG [22-401]-Fc 2,5 mg/kg bid durante 14 días (5 mg/kg/día). Los ratones fueron radiografiados antes del tratamiento, el día 7 y el día 14. Los ratones fueron sacrificados 24 horas después de la inyección final. Se separó el fémur derecho, se fijó en cinc-formalina, se descalcificó en ácido fórmico y se embebió en parafina. Se cortaron secciones por la región media de la metáfisis femoral distal y el eje femoral. Se determinó la densidad ósea, mediante histomorfometría, en seis regiones adyacentes que se extendían desde el límite de la metáfisis de la placa de crecimiento, por la esponjosa primaria y secundaria y en la diáfisis femoral (eje). Cada región tenía 0,5 x 0,5 mm^{2}.

Cambios radiográficos

Después de siete días de tratamiento había una evidencia de una zona de densidad ósea incrementada en la esponjosa asociada con las placas de crecimiento en los ratones tratados con OPG en relación con la observada en los controles. Los efectos fueron particularmente sorprendentes en las metáfisis femoral distal y tibial proximal (Figura 24A-24B). No obstante también fueron evidentes bandas de densidad incrementada en los cuerpos vertebrales, la cresta ilíaca y la tibia distal. A los 14 días, las regiones con opacidad se habían extendido adicionalmente a los ejes femoral y tibial aunque la intensidad de la radioopacidad había disminuido. Adicionalmente, no había diferencias en la longitud de los fémures al completarse el experimento o en el cambio de longitud a lo largo de la duración del experimento implicando que la OPG no altera el crecimiento óseo.

Cambios Histológicos

La metáfisis femoral distal mostró una densidad ósea incrementada en las regiones a 1,1 a 2,65 mm de distancia de la placa de crecimiento (Figuras 25 y 26A-26B). Esta es una región en la que el hueso es rápidamente eliminado por la resorción ósea mediada por los osteoclastos en ratones. En estos ratones jóvenes que crecen rápidamente, el incremento de hueso en esta región observado con el tratamiento con OPG coincide con una inhibición de la resorción ósea.

D. Efectos de la Osteoprotegerina sobre la Pérdida de Hueso Inducida por Ovariectomía en Rata

Se ovariectomizaron ratas Fischer hembra de doce semanas de edad (OVX) o se simuló que se operaban y se realizaron medidas de absorciometría dual de rayos x (DEXA) de la densidad ósea en la metáfisis femoral distal. Tras un período de recuperación de 3 días, los animales recibieron diariamente inyecciones durante 14 días como sigue: Diez animales supuestamente operados recibieron vehículo (solución salina tamponada con fosfato); Diez animales OVX recibieron vehículo (solución salina tamponada con fosfato); Seis animales recibieron OPG-Fc 5 mg/kg SC; Seis animales OVX recibieron pamidronato (PAM) 5 mg/kg SC; Seis animales OVX recibieron estrógeno (ESTR) 40 \mug/kg SC. Después de 7 y 14 días de tratamiento los animales tuvieron la densidad ósea medida mediante DEXA. Dos días después de la última inyección los animales se sacrificaron y se separaron la tibia y el fémur derechos para la evaluación histológica.

Las medidas DEXA de la densidad ósea mostraron una tendencia a la reducción de la densidad ósea después de la ovariectomía que fue bloqueada por la OPG-Fc. Sus efectos fueron similares a los agentes anti-resortivos conocidos estrógeno y pamidronato. (Figura 27). El análisis histomorfométrico confirmó estas observaciones con el tratamiento con OPG-Fc que produjo una densidad ósea que fue significativamente superior en las ratas OVX que la observada en ratas OVX no tratadas (Figura 28). Estos resultados confirman la actividad de la OPG en la pérdida de hueso asociada con la retirada de estrógeno endógeno después de la ovariectomía.

Resumen in vivo

Las acciones in vivo de la OPG recombinante son paralelas a los cambios observados en ratones transgénicos para OPG. La reducción del número de osteoclastos observada en transgénicos para OPG es reproducida inyectando OPG recombinante localmente a lo largo del cráneo en ratones normales y en ratones transgénicos tratados con IL1-\alpha o IL1-\beta. Los ratones transgénicos para OPG desarrollan un fenotipo osteopetrótico con rellenado progresivo de la cavidad medular con hueso y cartílago remodelado que se extiende desde las placas de crecimiento desde el día 1 en adelante después del nacimiento. En ratones de tres semanas de edad normales (en crecimiento), los tratamientos con OPG también condujeron a la retención de hueso y cartílago no remodelado en regiones de formación de hueso endocondral, un efecto observado radiográficamente y confirmado histológicamente. De este modo, la OPG recombinante produce cambios fenotípicos en animales normales similares a los observados en los animales transgénicos y los cambios coinciden con la inhibición de la resorción ósea inducida por la OPG. Basándose en análisis in vitro de la formación de osteoclastos, una porción significativa de esta inhibición es debida a una formación de osteoclastos deteriorada. Coincidiendo con esta hipótesis, la OPG bloquea la osteoporosis inducida por ovariectomía en rata. Se sabe que la pérdida de hueso en este modelo está mediada por osteoclastos activados, sugiriendo un papel para la OPG en el tratamiento de la osteoporosis primaria.

Ejemplo 12 Derivados por Pegilación de OPG Preparación de productos conjugados PEG-OPG N-terminales mediante alquilación reductiva

Se cambió el tampón de huOPG [22-194] P25A a NaOAc 25-50 mM, pH 4,5-4,8 y se concentró a 2-5 mg/ml. Esta solución se utilizó para realizar la alquilación reductiva de la OPG con aldehídos de PEG monofuncionales a 5-7ºC. Los aldehídos de PEG monofuncionales, lineales o ramificados, PM = 1 a 57 kDa (asequibles de Shearwater Polymers) se añadieron a la solución de OPG en forma de sólidos en cantidades que constituían 2-4 moles de aldehído PEG por mol de OPG. Tras la disolución del polímero en la solución de proteína, se añadió cianoborohidruro de sodio para dar una concentración final de 15 a 20 mM en la mezcla de reacción a partir de una solución de partida 1 a 1,6 M recién preparada en agua DI fría. El progreso de la reacción y el grado de PEGilación de la OPG se controló por medio de una HPLC de exclusión por tamaños sobre una columna G3000SW_{XL} (Toso Haas) eluyendo con NaPO_{4} 100 mM, NaCl 0,5 M, etanol al 10%, pH 6,9. Típicamente se dejó que la reacción continuara durante 16-18 horas, después de lo cual la mezcla de reacción se diluyó 6-8 veces y el pH se hizo disminuir a 3,5-4. La mezcla de reacción se fraccionó mediante cromatografía de intercambio iónico (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia) eluyendo con NaOAc 20 mM pH 4 con un gradiente lineal de NaCl 0,75 M sobre 25 veces el volumen de la columna a una velocidad de flujo de 30 cm/h. Las fracciones de OPG mono-, di- o poli-PEGilada se reunieron y se caracterizaron mediante SEC HPLC y SDS-PAGE. Mediante secuenciación N-terminal, se determinó que el producto conjugado monoPEG-OPG, el principal producto de reacción en la mayoría de los casos, era en 98% OPG modificada con PEG N-terminalmente.

Este procedimiento se utilizó generalmente para preparar los siguientes productos conjugados PEG-OPG N-terminales (donde la OPG es HuOPG met[22-194] P25A: monoPEG de 5 kd, PEG mono-ramificada de 10 kD, monoPEG de 12 kD, monoPEG de 20 kD, PEG mono-ramificada de 20 kD, monoPEG de 25 kD, monoPEG de 31 kD, monoPEG de 57 kD, diPEG de 12 kD, diPEG de 25 kD, diPEG de 31 kD, diPEG de 57 kD, triPEG de 25 kD.

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Preparación de productos conjugados PEG-OPG mediante acilación

Se cambió el tampón de huOPG [22-194] P25A a tampón BICINE 50 mM, pH 8 y se concentró a 2-3 mg/ml. Esta solución se utilizó para realizar la acilación de la OPG con ésteres de PEG-N-hidroxisuccinimidilo monofuncionales a la temperatura ambiente. Los ésteres de PEG-N-hidroxisuccinimidilo, lineales o ramificados, PM = 1 a 57 kDa (asequibles de Shearwater Polymers) se añadieron a la solución de OPG en forma de sólidos en cantidades que constituían 4-8 moles de éster de PEG-N-hidroxisuccinimidilo por mol de OPG. El progreso de la reacción y el grado de PEGilación de la OPG se controló por medio de una HPLC de exclusión por tamaños sobre una columna G3000SW_{XL} (Toso Haas) eluyendo con NaPO_{4} 100 mM, NaCl 0,5 M, etanol al 10%, pH 6,9. Típicamente se dejó que la reacción continuara durante 1 hora, después de lo cual la mezcla de reacción se diluyó 6-8 veces y el pH se hizo disminuir a 3,5-4. La mezcla de reacción se fraccionó mediante cromatografía de intercambio iónico (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia) eluyendo con NaOAc 20 mM pH 4 con un gradiente lineal de NaCl 0,75 M sobre 25 veces el volumen de la columna a una velocidad de flujo de 30 cm/h. Las fracciones de OPG mono-, di- o poli-PEGilada se reunieron y se caracterizaron mediante SEC HPLC y SDS-PAGE.

Este procedimiento se utilizó generalmente para preparar los siguientes productos conjugados PEG-OPG: poliPEG de 5 kd, poliPEG de 20 kD, poliPEG ramificada de 40 kD, poliPEG de 50 kD.

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Preparación de PEG-OPG dimérica

Se prepara huOPG [22-194] P25A para la tiolación a 1-3 mg/ml en tampón fosfato a un pH casi neutro. Se añade anhídrido S-acetil-mercaptosuccínico (AMSA) en un exceso molar de 3-7 veces mientras se mantiene el pH a 7,0 y la reacción se agita a 4ºC durante 2 horas. La OPG monotiolada se separa de la OPG no modificada y politiolada mediante cromatografía de intercambio iónico y el tiol protegido se desprotege mediante tratamiento con hidroxilamina. Tras la desprotección, se separa la hidroxilamina mediante filtración en gel y la OPG monotiolada resultante se somete a una variedad de químicas de entrecruzamiento específicas para tiol. Para generar un dímero unido por disulfuro, se deja que la OPG tiolada a >1 mg/ml experimente oxidación con aire mediante diálisis en tampón fosfato ligeramente alcalino. El dímero de tioéter - OPG covalente se preparó haciendo reaccionar el entrecruzador de bis-maleimida, N,N-bis(3-maleimido-propianil)-2-hidroxi-1,3-propano con la OPG tiolada a > 1 mg/ml a una razón molar de 0,6 x de entrecruzador:OPG en tampón fosfato a pH 6,5. De un modo similar, se producen dumbbell de PEG mediante reacción de cantidades subestequiométricas de entrecruzadores de bis-maleimida-OPG con OPG tiolada a > 1 mg/ml en tampón fosfato a pH 6,5. Cualquiera de los productos conjugados diméricos anteriores puede ser purificado adicionalmente utilizando cromatografías de intercambio iónico o de exclusión por tamaños.

Los productos conjugados PEG-OPG diméricos (donde la OPG es HuOPG met[22-194] P25A preparados utilizando los procedimientos anteriores incluyen dímero de OPG unido por disulfuro, dímero de tioéter de OPG covalente con un entrecruzador de tipo amina alifática, dumbbells y monobells de PEG de 3,4 kD y 8 kD.

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Los productos conjugados PEG-OPG se sometieron a ensayo en cuanto a la actividad in vitro utilizando el análisis de maduración de osteoclastos descrito en el Ejemplo 11A y en cuanto a la actividad in vivo midiendo el incremento de la densidad ósea después de la inyección en ratones como se describe en el Ejemplo 11C. La actividad in vivo se muestra más abajo en la Tabla 3.

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TABLA 3 Actividad biológica in vivo de OPG Pegilada

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Si bien se ha descrito la invención en lo que se considera que son sus realizaciones preferidas, ésta no está limitada a la realización descrita.

Claims (17)

1. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 9C-9D (SEQ ID NO: 125) desde los restos 22 a 401 inclusive, o un fragmento o truncamiento del mismo, donde uno o más polímeros solubles en agua están anclados al polipéptido y donde el polipéptido inhibe la formación de osteoclastos.

2. El polipéptido de la Reivindicación 1, que comprende los restos 22 a 401 de la Figura 9C-9D (SEQ ID NO: 125).

3. El polipéptido de la Reivindicación 1, que comprende un fragmento de los restos 22 a 401 de la Figura 9C-9D (SEQ ID NO: 125).

4. El polipéptido de la Reivindicación 1, que comprende el truncamiento de los restos 22 a 401 de la Figura 9C-9D (SEQ ID NO: 125).

5. El polipéptido de la Reivindicación 1, donde el fragmento o truncamiento comprende una deleción o un truncamiento carboxi terminal de parte o de todos los restos aminoácido 180 a 401 de la Figura 9C-9D (SEQ ID NO: 125).

6. El polipéptido de la Reivindicación 1, donde el fragmento o truncamiento comprende los restos 22 a 185 de la Figura 9C-9D (SEQ ID NO: 125).

7. El polipéptido de la Reivindicación 1, donde el polímero soluble en agua se selecciona entre uno o más de polietilenglicol, copolímero de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, y poli(alcohol vinílico).

8. El polipéptido de la Reivindicación 1, donde el polímero soluble en agua está anclado a una posición predeterminada del polipéptido.

9. El polipéptido de la Reivindicación 1, que comprende dos o más polímeros solubles en agua anclados.

10. El polipéptido de la Reivindicación 7, donde el polietilenglicol está anclado al extremo amino.

11. El polipéptido de las Reivindicaciones 7 o 10, donde el polietilenglicol tiene un peso molecular seleccionado entre uno o más de 5 kD, 10 kD, 12 kD, 20 kD, 25 kD, 31 kD, y 57 kD.

12. Un dímero de osteoprotegerina (OPG) entrecruzado formado por uno o más polímeros solubles en agua anclados a y conectando dos polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de la Figura 9C-9D (SEQ ID NO: 125) desde los restos 22 a 401 inclusive, o un fragmento o truncamiento del mismo, donde el dímero inhibe la formación de osteoclastos.

13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de la Reivindicación 1 en un portador, coadyuvante, solubilizante, estabilizante y/o antioxidante farmacéuticamente aceptable.

14. El uso del polipéptido de la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno óseo.

15. El uso de la Reivindicación 14, donde el trastorno óseo es la pérdida excesiva de hueso.

16. El uso de la Reivindicación 14, donde el trastorno óseo se selecciona entre uno o más de osteoporosis, enfermedad del hueso de Paget, hipercalcemia, hiperparatiroidismo, osteopenia inducida por esteroides, pérdida de hueso debida a artritis reumatoide, pérdida de hueso debida a osteomielitis, metástasis osteolítica, y pérdida de hueso periodontal.

17. El uso de la Reivindicación 14 donde el medicamento comprende adicionalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de una sustancia seleccionada entre una o más de una proteína morfogénica de hueso BMP-1 a BMP-12, un miembro de la familia del TGF-beta, un inhibidor de IL-1, un inhibidor de TNF alfa, una hormona paratiroidea o un análogo de la misma, una proteína relacionada con la hormona paratiroidea o un análogo de la misma, una prostaglandina de la serie E, un bifosfonato, y un mineral potenciador del hueso.