DE19654610A1

DE19654610A1 - Osteoprotegerin

Info

Publication number: DE19654610A1
Application number: DE19654610A
Authority: DE
Inventors: William J Boyle; David L Lacey; Frank J Calzone; Ming-Shi Chang
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 1997-06-26
Also published as: EP0784093B1; HUP9801122A3; AR004400A1; ES2316152T3; GB2312899A; YU69196A; BG101813A; NO973699D0; RO121386B1; CN1318588C; EP0870023A1; FR2742767A1; NZ332915A; AU710587B2; HK1001526A1; NZ326579A; CZ292587B6; GB9626618D0; EE9700164A; NO973699L

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Polypeptide, die an der Steuerung des Knochenstoffwechsels beteiligt sind. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neues Polypeptid mit der Bezeichnung Osteoprotegerin, welches ein Vertreter der Superfami lie der Tumornekrosefaktor-Rezeptoren ist. Das Polypeptid wird zur Behandlung von Knochenerkrankungen wie Osteoporose verwendet, die durch erhöhten Knochenschwund gekennzeichnet sind.

Hintergrund der Erfindung

Wachstumsfaktoren und Zytokine in Form von Polypeptiden sind sezernierte Faktoren, die vielfältige Veränderungen im Zusammen hang mit dem Zellwachstum, der Differenzierung und dem Stoff wechsel signalisieren, indem sie in spezifischer Weise an diskrete, oberflächengebundene Rezeptoren binden. Als eine Klasse von Proteinen variieren die Rezeptoren in ihrer Struktur sowie in der Art und Weise der Signalübertragung. Sie sind ge kennzeichnet durch eine extrazelluläre Domäne, die an der Ligandenbindung beteiligt ist, und eine zytoplasmatische Domäne, die ein geeignetes intrazelluläres Signal überträgt. Die Rezeptor-Expressionsmuster legen ultimativ fest, welche Zellen auf einen gegebenen Liganden ansprechen werden, während die Struktur eines gegebenen Rezeptors die durch die Ligandenbindung induzierte zelluläre Antwort festlegt. Es ist gezeigt worden, daß Rezeptoren intrazelluläre Signale über ihre zytoplasmatischen Domänen übertragen durch Aktivierung der Phosphorylierung der Proteinkomponenten Tyrosin oder Serin/Threonin (z. B. platelet-de rived growth factor receptor (PDGFR) oder transforming growth factor-β receptor-I (TGFβR-I), durch Stimulierung der G-Protein-Aktivierung (z. B. β-Adrenozeptor), und durch modulierende Assoziationen mit zytoplasmatischen, signalübertragenden Proteinen (z. B. TNFR-1 und Fas/APO) (Heldin, Cell 80, 213-223 (1995)).

Die Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR)-Superfamilie ist eine Gruppe von Typ I-Transmembranproteinen, die gemeinsam über ein konserviertes, Cystein-reiches Motiv verfügen, welches in der extrazellulären Domäne 3 bis 6mal wiederholt wird (Smith et al., Cell 76, 953-962 (1994)). Zusammen bilden diese Wiederholungsein heiten die Ligandenbindungsdomänen dieser Rezeptoren (Chen et al., Chemistry 270, 2874-2878 (1995)). Die Liganden für diese Rezeptoren gehören zu einer strukturell verwandten Gruppe von Proteinen, die Homologie zu TNFα aufweisen (Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symp. Quart. Biol. 51, 597-609 (1986); Nagata et al., Science 267, 1449-1456 (1995)). TNFα bindet an die ver schiedenen, aber nahe verwandten Rezeptoren TNFR-1 und TNFR-2. TNFα löst in Rezeptor tragenden Zellen eine Vielzahl von biologischen Antworten aus, einschließlich Proliferation, Differenzierung sowie Zytotoxizität und Apoptose (Beutler et al., Ann. Rev. Biochem. 57, 505-518 (1988)).

Es wird davon ausgegangen, daß TNFα akute und chronische entzündliche Reaktionen vermittelt (Beutler et al., Ann. Rev. Biochem. 57, 505-508 (1988)). Ein systemischer Ausstoß von TNFα induziert einen toxischen Schock und eine ausgedehnte Gew ebenekrose. Aus diesem Grund kann TNFα für die schwere Morbidität und Mortalität verantwortlich sein, die mit einer Vielzahl von infektiösen Erkrankungen einschließlich Sepsis assoziiert sind. Mutationen in FasL, dem Liganden für den TNFR-verwandten Rezeptor Fas/APO (Suda et al., Cell 75, 1169-1178 (1993)), ist mit der Autoimmunität assoziiert (Fisher et al., Cell 81, 935-946 (1995)), während eine Überproduktion von FasL an der durch Drogen induzierten Hepatitis beteiligt sein kann. Demgemäß werden die schwerwiegenden Effekte vieler Erkrankungszustände häufig durch Liganden für die vielfältigen TNFR-verwandten Proteine ver mittelt, wodurch nahegelegt wird, daß Mittel, welche die Aktivität dieser Liganden neutralisieren, eine therapeutische Bedeutung aufweisen würden. Lösliche TNFR-1-Rezeptoren sowie Antikörper, die TNFα binden, sind auf ihre Fähigkeit zur Neutralisierung von systemischem TNFα untersucht worden (Loet scher et al., Cancer Cells 3 (6), 21-226 (1991)). Eine natürlich auftretende Form einer mRNA für den sezernierten TNFR-1 wurde kürzlich kloniert, und ihr Produkt wurde auf seine Fähigkeit zur Neutralisierung der TNFα-Aktivität in vitro und in vivo unter sucht (Kohno et al., PNAS USA 87, 8331-8335 (1990)). Die Fähigkeit dieses Proteins zur Neutralisierung von TNFα weist darauf hin, daß lösliche TNF-Rezeptoren die Bindung und Clearance von TNF bewirken, wodurch die zytotoxischen Effekte auf TNFR aufweisende Zellen blockiert werden.

Ein Ziel der Erfindung liegt in der Identifizierung neuer Vertreter der TNFR-Superfamilie. Es wird davon ausgegangen, daß neue Familienmitglieder Transmembranproteine oder lösliche Formen derselben sein können, die extrazelluläre Domänen umfassen, denen jedoch zytoplasmatische und Transmembrandomänen fehlen. Wir haben einen neuen Vertreter der TNFR-Superfamilie identifiziert, welcher für ein sezerniertes Protein kodiert, das dem TNFR-2 nahe verwandt ist. In Analogie zum löslichen TNFR-1 kann das mit TNFR-2 verwandte Protein die Aktivität seines Liganden in negativer Weise regulieren und demgemäß bei der Behandlung von bestimmten menschlichen Erkrankungen nützlich sein.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein neuer Vertreter der Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR)-Superfamilie ist unter Verwendung einer intestinalen cDNA-Bibliothek einer fetalen Ratte identifiziert worden. Es wurde ein cDNA-Klon vollständiger Länge erhalten und sequenziert. Die Expression der Ratten-cDNA in einer transgenen Maus führte zu einem deutlichen Anstieg der Knochendichte, insbesondere in Röhrenknochen, Beckenknochen und Wirbeln. Das von der cDNA kodierte Polypeptid wird mit Osteoprotegerin (OPG) bezeichnet und spielt eine Rolle bei der Förderung der Knochenakkumulation.

Durch die vorliegende Erfindung werden Nukleinsäuren bereitge stellt, die für ein Polypeptid kodieren, welches mindestens eine der biologischen Aktivitäten von OPG aufweist. Ferner werden Nukleinsäuren bereitgestellt, die mit Nukleinsäuren hybridi sieren, welche für das OPG der Maus, der Ratte oder des Menschen gemäß Darstellung in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO: 122) und 9C-9D (SEQ ID NO: 124) kodieren. Vorzugs weise ist das OPG Säuger-OPG und am meisten bevorzugt humanes OPG. Ferner werden rekombinante Vektoren und Wirtszellen, die OPG exprimieren, wie auch Verfahren zur Herstellung von rekombinantem OPG umfaßt. Gleichermaßen werden Antikörper oder Fragmente derselben offenbart, die in spezifischer Weise an das Polypeptid binden.

Durch die Erfindung werden auch Verfahren zur Behandlung von Knochenerkrankungen bereitgestellt. Die Polypeptide sind geeignet zur Prävention einer Knochenresorption und können zur Behandlung irgendeines Zustandes eingesetzt werden, der zum Knochenschwund führt, wie Osteoporose, Hyperkalzämie, Paget-Krankheit, und Knochenschwund aufgrund einer rheumatoiden Arthritis oder Osteomyelitis, und dergleichen. Knochenerkrankungen können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auch mittels Antisense- oder Gentherapie behandelt werden. Schließlich werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die OPG-Nukleinsäuren und -Polypeptide umfassen.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 A. FASTA-Analyse des neuen EST LORF. Gezeigt ist das Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenz von FRI-1 gegenüber der humanen Sequenz von TNFR-2. B. Profilanalyse des neuen EST LORF. Gezeigt ist das Alignment der abgeleiteten Aminosäurese quenz von FRI-1 gegenüber dem TNFR-Profil. c. Strukturansicht der TNFR-Superfamilie, in der die Region mit Homologie zum neuen FR-1 angegeben ist.

Fig. 2 Struktur und Sequenz vollständiger Länge des OPG-Gens der Ratte, einem neuen Vertreter der TNFR-Superfamilie. A. Karte des pMOB-B1.1-Inserts. Der Kasten zeigt die Position des LORF innerhalb der cDNA-Sequenz (fette Linie). Das schwarze Kästchen zeigt das Signalpeptid, und graue Ellipsen geben die Position Cystein-reicher Wiederholungssequenzen an. B, C. Nukleinsäure- und Proteinsequenz der OPG-cDNA der Ratte. Das vorhergesagte Signalpeptid ist unterstrichen, und potentielle Stellen einer N-verknüpften Glykosylierung sind durch fette, unterstrichene Buchstaben gekennzeichnet. D, E. Verdichteter Sequenzvergleich (Wisconsin GCG Package, Version 8.1) von OPG mit anderen Vertretern der TNFR-Superfamilie, fas (SEQ ID NO 128); tnfr1 (SEQ ID NO: 129); sfu-t2 (SEQ ID NO: 130); tnfr2 (SEQ ID NO: 131); cd40 (SEQ ID NO: 132); osteo (SEQ ID NO: 133); ngfr (SEQ ID NO: 134); ox40 (SEQ ID NO: 135); 41bb (SEQ ID NO: 136).

Fig. 3 PepPlot-Analyse (Wiscons in GCG Package, Version 8.1) der vorhergesagten OPG-Proteinsequenz der Ratte. A. Schematische Darstellung von Ratten-OPG, in der hydrophobe (oben) und hydrophile (unten) Aminosäuren angegeben sind. Ebenfalls gezeigt sind basische (oben) und saure (unten) Aminosäuren. B. Dar stellung von Aminosäureresten, die gemäß Definition von Chou und Fasman (Adv. Enz. 47, 45-147 (1948)) β-Faltblatt-bildend (oben) und β-Faltblatt-brechend (unten) sind. C. Darstellung der Ausmaße der Neigung zur Ausbildung einer α-Helix- und β-Falt blatt-Struktur (Chou und Fasman, ibid.). Die Kurven über 1.00 zeigen die Neigung zur Ausbildung einer α-Helix- oder β-Falt blatt-Struktur. Die Struktur kann in Regionen des Proteins terminieren, in denen die Kurve unterhalb von 1.00 abfällt. D. Darstellung von Resten, die α-bildend (oben) oder α-brechend (unten) sind. E. Darstellung von Bereichen der Proteinsequenz, die Sequenzen ähneln, welche typischerweise am Aminoende von α- und β-Strukturen gefunden werden (Chou und Fasman, ibid.). F. Darstellung von Bereichen der Proteinsequenz, die Sequenzen ähneln, welche typischerweise am Carboxylende von α- und β-Strukturen gefunden werden (Chou und Fasman, ibid.). G. Dar stellung von Bereichen der Proteinsequenz, die typischerweise in Windungen gefunden werden (Chou und Fasman, ibid.). H. Dar stellung des helikalen hydrophoben Moments (Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 140-144 (1984)) an jeder Position in der Sequenz. I. Darstellung der mittleren Hydropathie nach Kyte und Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)) und Goldman et al. (Überblick in Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 321-353 (1986)).

Fig. 4 mRNA-Expressionsmuster für die OPG-cDNA in humanen Geweben. Northern Blots wurden mit einem mit ³²P markierten Insert der Ratten-cDNA (A, beide Abbildungen links) oder mit dem Insert aus humaner cDNA (B, rechte Abbildung) sondiert.

Fig. 5 Schaffung von transgenen Mäusen, die die OPG-cDNA in Hepatozyten exprimieren. Northern Blot-Expression des HE-OPG-Transgens in Mäuseleber.

Fig. 6 Erhöhung der Knochendichte in OPG-transgenen Mäusen. Abbildungen A-F. Kontrollmäuse. G-J, OPG exprimierende Mäuse. Bei der Nekropsie wurden von sämtlichen Tieren Röntgenaufnahmen und Photographien hergestellt. In A-F sind die Röntgenaufnahmen der Kontrolltiere und des einen transgenen Nicht-Expressors (#28) dargestellt. Beachte, daß die Knochen einen klar definierten Kortex und eine aufgehellte, zentrale Knochenmarkhöhle aufweisen. Im Gegensatz dazu weisen die OPG (G-J)-Tiere einen schwach definierten Kortex und eine erhöhte Dichte in der Markzone auf.

Fig. 7 Zunahme der Substantia spongiosa bei OPG-transgenen Mäusen. A-D. Repräsentative Mikrophotographien von Knochen der Kontrolltiere. In A und B sind schwach (4×, 10×) vergrößerte Abbildungen der Oberschenkel dargestellt (Masson Trichrome-Färbemittel). Die Färbungen für Tartrat-resistente saure Phospha tase (TRAP) zeigen Osteoklasten (siehe Pfeile), die sowohl Knorpel (C) als auch Substantia spongiosa (D) resorbieren. Beachte das abgeflachte Erscheinungsbild der Osteoklasten auf der Substantia spongiosa. E-H. Repräsentative Mikrophotographien von Knochen der OPG exprimierenden Tiere. In E und F sind schwach (4×, 10×) vergrößerte Abbildungen der Oberschenkel dargestellt (Masson Trichrome-Färbungsmittel). Die klare Region ist die Knorpelwachstumszone, der blau gefärbte Bereich ist Knochen, und der rote Bereich ist Knochenmark. Beachte, daß die Substantia spongiosa im Gegensatz zu den Kontrollen nicht resorbiert worden ist, was dazu führt, daß die gewöhnliche Markhöhle fehlt. Ferner weisen die resultierenden Trabekel ein geschecktes Erscheinungs bild mit blauen und klaren Bereichen auf. Die klaren Bereiche sind Überreste der Knorpelwachstumszone, die niemals umgeformt worden sind. Anhand von TRAP-Färbungen zeigen diese Tiere Osteoklasten (siehe Pfeile) an der Wachstumszone (G), die in ihrer Anzahl reduziert sein können. Die von der Wachstumszone abgewandten Oberflächen der Trabekel sind jedoch praktisch frei von Osteoklasten (H); dies ist ein Befund, der zu den Kontroll tieren in direktem Widerspruch steht (siehe D).

Fig. 8 HE-OPG-Expressoren weisen keinen Defekt in der Monozy ten-Makrophagen-Entwicklung auf. Eine Ursache für die Osteopetro se bei Mäusen ist die aufgrund einer Punktmutation in dem Gen M-CSF defektive Produktion von M-CSF. Dies führt zu einem deutli chen Mangel an zirkulierenden und gewebetypischen Makrophagen. Das periphere Blut von OPG-Expressoren enthielt Monozyten, wie durch H1E-Analyse ermittelt wurde. Um das Vorhandensein von gewebetypischen Makrophagen zu bestätigen, erfolgte eine Immunhistochemie unter Verwendung von F480-Antikörpern, die ein Zelloberflächenantigen auf murinen Makrophagen erkennen. A und C zeigen schwach (4×) vergrößerte Mikrophotographien der Milzorgane von normalen und CR1-Überexpressoren. Beachte, daß beide Tiere zahlreiche F480-positive Zellen aufweisen. Die Monozyten-Makrophagen waren im Knochenmark von normalen (B) und HE-OPG-Überexpressoren (D) ebenfalls vorhanden (40×).

Fig. 9 Struktur und Sequenz von murinen und humanen OPG-cDNA-Klonen. A, B. cDNA- und Proteinsequenz der Maus. C, D. cDNA- und Proteinsequenz des Menschen. Die vorhergesagten Signalpeptide sind unterstrichen, und potentielle Stellen einer N-verknüpften Glykosylierung sind fett gekennzeichnet. E, F. Sequenz-Alignment und Vergleich der OPG-Aminosäuresequenzen von Ratte, Maus und Mensch.

Fig. 10 Vergleich der konservierten Sequenzen in der extrazel lulären Domäne von TNFR-1 und humanem OPG. PrettyPlot (Wisconsin GCGPackage, Version 8.1)-Analyse des in Beispiel 6 beschriebenen TNFR1- und OPG-Alignments. In der oberen Zeile sind die für die Domänen 1-4 kodierenden humanen TNFR1-Sequenzen angegeben. In der unteren Zeile sind die für die Domänen 1-4 kodierenden humanen OPG-Sequenzen angegeben. Die konservierten Reste sind durch Kästchen hervorgehoben.

Fig. 11 Dreidimensionale Darstellung von humanem OPG. Seitenansicht der Molescript-Darstellung der vorhergesagten drei dimensionalen Struktur der humanen OPG-Reste 25 bis 163 (breite Linie), kokristallisiert mit humanem TNFβ (dünne Linie). Als Bezugspunkt für die Orientierung weisen die fett gedruckten Pfeile entlang des OPG-Polypeptidrückgrats von der N-terminalen zur C-terminalen Richtung. Die Position individueller Cystein-Seitenketten sind entlang des Polypeptidrückgrats insertiert, um das Aufzeigen der getrennten Cystein-reichen Domänen zu unter stützen. Das TNFβ-Molekül ist ausgerichtet wie beschrieben von Banner et al. (1993).

Fig. 12 Struktur der Cystein-reichen OPG-Domänen. Alignment der humanen (obere Zeile, SEQ ID NO: 136) und murinen (untere Zeile) OPG-Aminosäuresequenzen, wodurch die vorhergesagte Domänenstruktur von OPG hervorgehoben wird. Das Polypeptid ist in zwei Hälften unterteilt, den N-Terminus (A) und den C-Terminus (B). Die N-terminale Hälfte enthält nach Vorhersage vier Cystein-reiche Domänen (bezeichnet mit 1-4). Die vorhergesagten, innerhalb der Ketten befindlichen Disulfidbindungen sind mittels fett gedruckter Linien angegeben und mit "SS1", "SS2" oder "SS3" bezeichnet. Vorhersagegemäß bilden das Tyrosin 28 und das Histidin 75 (unterstrichen) eine ionische Wechselwirkung aus. Diejenigen Aminosäuren, von denen vorhergesagt wird, daß sie mit einem OPG-Liganden interagieren, sind durch fett gedruckte Punkte oberhalb des betreffenden Rests gekennzeichnet. Die in der C-terminalen Hälfte von OPG lokalisierten Cysteinreste sind durch Kästchen gekennzeichnet.

Fig. 13 Expression und Sekretion von Maus-OPG-Fc-Fusions proteinen in vollständiger Länge und in verkürzter Form. A. Karte, in der die Punkte der Fusion mit der humanen IgG1 Fc-Domäne durch Pfeilköpfe angegeben sind. B. Silberfärbung eines SDS-Polyacrylamidgels von konditioniertem Medium, erhalten von F1.Fc (OPG vollständiger Länge, fusioniert mit Fc am Leucin 401)- und CT.Fc (carboxyterminal verkürztes OPG, fusioniert mit Fc am Threonin 180)-Fusionsprotein-Expressionsvektoren. Spur 1, Mutter-Expressionsvektor-Zellinie pCEP4; Spur 2, F1.Fc-Vektor-Zellinie; Spur 3, CT.Fc-Vektor-Zellinie. C. Western Blot von konditionier tem Medium, erhalten von F1.Fc- und CT.Fc-Fusionsprotein-Expressionsvektoren, sondiert mit Antikörpern gegen die humane IgG1 Fc-Domäne (Pierce). Spur 1, Mutter-Expressionsvektor-Zellinie pCEP4; Spur 2, F1.Fc-Vektor-Zellinie; Spur 3, CT.Fc-Vektor-Zellinie.

Fig. 14 Expression von humanem OPG in E. coli. A. Herstellung eines bakteriellen Expressionsvektors. Der LORF des humanen OPG-Gens wurde mittels PCR amplifiziert und anschließend mit einem Oligonukleotid-Linkerfragment verknüpft (oberer Strang ist SEQ ID NO: 137; unterer Strang ist SEQ ID NO: 127) und mit der DNA des Vektors pAMG21 ligiert. Der resultierende Vektor ist in der Lage zur Expression der OPG-Reste 32-401, verknüpft mit einem N-terminalen Methioninrest. B. SDS-PAGE-Analyse von nicht-induzierten und induzierten Bakterien, die das Plasmid pAMG21-human OPG-32-401 enthalten. Spur 1, MW-Standards; Spur 2, nicht-induzierte Bakterien; Spur 3, Inkubation bei 30°C; Spur 4, Inkubation bei 37°C; Spur 5, Lysat vollständiger Zellen aus der Induktion bei 37°C; Spur 6, lösliche Fraktion des Gesamt-Zellysats; Spur 7, unlösliche Fraktion des Gesamt-Zellysats; Spur 8, gereinigte Einschlußkörper, erhalten aus dem Gesamt-Zellysat.

Fig. 15 Analyse von in CHO-Zellen produziertem rekombinanten murinen OPG mittels SDS-PAGE und Western Blotting. Eine gleiche Menge von CHO-konditioniertem Medium wurde auf jede dargestellte Spur aufgetragen und durch Behandlung mit reduzierendem Pro benpuffer (linke Spur) oder nicht-reduzierendem Probenpuffer (rechte Spur) präpariert. Nach der Elektrophorese wurden die aufgetrennten Proteine auf eine Nylonmembran überführt und anschließend mit Anti-OPG-Antikörpern sondiert. Die relativen Positionen der monomeren, 55 kD großen sowie der dimeren, 100 kD großen Formen von OPG sind durch Pfeilköpfe gekennzeichnet.

Fig. 16 Analyse von in CHO-Zellen produziertem, rekombinanten murinen OPG durch Pulsmarkierung. Die CHO-Zellen wurden mit ³⁵S-Methionin/Cystein pulsmarkiert und anschließend für die angegebe ne Zeitdauer einem Chase unterzogen. Metabolisch markierte Kulturen wurden in konditioniertes Medium und Zellen getrennt, und aus beiden Fraktionen wurden Detergensextrakte hergestellt, geklärt und anschließend mit Anti-OPG-Antikörpern immunpräzipi tiert. Die Immunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, bevor ein Film aufgelegt wurde. Obere linke und rechte Abbildung; Proben, die unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert wurden. Untere linke und rechte Abbildung; Proben, die unter reduzierenden Bedingungen analysiert wurden. Obere und untere linke Abbildung; Zellextrakte. Obere und untere rechte Abbildung; Extrakte konditionierter Medien. Die relative Mobilität der 55 kD großen monomeren und der 100 kD großen dimeren Formen von OPG sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet.

Fig. 17 Expression von OPG in der Zellinie CTLL-2. Serum freies, konditioniertes Medium von CTLL-2-Zellen und mit mu OPG [1-401] transfizierten CHO-Zellen wurde hergestellt, konzentriert und anschließend durch eine nicht-reduzierende SDS-PAGE und Western Blotting analysiert. Linke Spur; konditioniertes Medium von CTLL-2. Rechte Spur; konditioniertes Medium von CHO-muOPG. Die relative Mobilität der 55 kD großen monomeren und der 100 kD großen dimeren Formen von OPG sind durch Pfeilspitzen gekenn zeichnet.

Fig. 18 Nachweis der OPG-Expression in Serumproben und Leberextrakten, die von Kontroll- und OPG-transgenen Mäusen erhalten wurden. Die transgenen Mäuse wurden wie in Beispiel 4 beschrieben geschaffen. Die OPG-Expression wurde nach SDS-PAGE und anschließendem Western Blotting unter Verwendung von Anti-OPG-Antikörpern sichtbar gemacht.

Fig. 19 Effekte des huOPG [22-401]-Fc-Fusionsproteins auf die Osteoklastenbildung in vitro. Der Assay über die Osteoklastenbil dung wurde gemäß Darlegung in Beispiel 11A in Abwesenheit (Kontrolle) oder Anwesenheit der angegebenen Mengen des huOPG [22-401]-Fc-Fusionsproteins durchgeführt. Die Osteoklastenbildung wurde durch histochemische Färbung für Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) sichtbar gemacht. A. Endkonzentration an zugegebenem OPG 100 ng/ml. D. Endkonzentration an zugegebenem OPG 0,1 ng/ml. E. Endkonzentration an zugegebenem OPG 0,01 ng/ml. F. Endkonzentration an zugegebenem OPG 0,001 ng/ml. G. Kontrolle. Kein OPG zugegeben.

Fig. 20 Absenkung der Osteoklastenkultur-TRAP-Aktivität durch 10 steigende Mengen an OPG. Angegebene Konzentrationen des huOPG [22-401]-Fc-Fusionsproteins wurden dem Assay über die Osteokla stenbildung zugegeben, und die TRAP-Aktivität wurde wie in Beispiel 11A beschrieben quantifiziert.

Fig. 21 Effekt von OPG auf eine terminale Phase der Osteokla stendifferenzierung. Die huOPG [22-401]-Fc-Fusion wurde dem Assay über die Osteoklastenbildung während der intermediären Phase der Osteoklastenreifung (Tage 5-6; OPG-CTL) oder während der terminalen Phase der Osteoklastenreifung (Tage 7-15; CTL-OPG) zugegeben. Die TRAP-Aktivität wurde quantifiziert und mit den bei Abwesenheit von OPG (CTL-CTL) und bei voller Anwesenheit von OPG (OPG-OPG) beobachteten Aktivitäten verglichen.

Fig. 22 Effekte von IL-1β, IL-1α und OPG auf die Blutwerte an ionisiertem Calcium in Mäusen. Die Blutwerte für ionisiertes Calcium wurden aufgezeichnet nach Injektion von IL-1β allein, IL-1α allein, IL-1β plus muOPG [22-401]-Fc, IL-1α plus muOPG [22-401]-Fc, und muOPG [22-401]-Fc allein. Kontrollmäuse erhielten lediglich Injektionen von phosphatgepufferter Saline (PBS). Das Experiment bezüglich IL-1β ist in A dargestellt; das Experiment zu IL-1α ist in B dargestellt.

Fig. 23 Effekte von OPG auf Calvaria-Osteoklasten in Kontroll- und mit IL-1 behandelten Mäusen. Die histologischen Verfahren zur Analyse von Calvaria-Knochenproben von Mäusen sind im Bei spiel 11B beschrieben. Die Pfeile weisen auf Osteoklasten hin, die in am 2. Tag behandelten Mäusen vorhanden waren. Calvaria-Proben von Mäusen, die vier PBS-Injektionen täglich (A), eine Injektion von IL-1 und 3 Injektionen von PBS täglich (B), eine Injektion von PBS und 3 Injektionen von OPG täglich (C), eine Injektion von IL-1 und 3 Injektionen von OPG täglich erhielten.

Fig. 24 Röntgenanalyse der Knochenakkumulation in der Markhöhle von normalen Mäusen. Die Mäuse erhielten subkutane Injektionen mit Saline (A) oder muOPG [22-401]-Fc-Fusionsprotein (5 mg/kg/Tg.) für 14 Tage (B), und die Knochendichte wurde wie in Beispiel 11C beschrieben ermittelt.

Fig. 25 Histomorphometrische Analyse der Knochenakkumulation in der Markhöhle von normalen Mäusen. Die Injektionen sowie die Knochenhistologie erfolgten gemäß Darlegung in Beispiel 11C.

Fig. 26 Histologische Analyse der Knochenakkumulation in der Markhöhle von normalen Mäusen. Die Injektionen und die Knochenhi stologie erfolgten gemäß Darlegung in Beispiel 11C. A. Injektion von Saline. B. Injektion des muOPG [22-401]-Fc-Fusionsproteins.

Fig. 27 Aktivität von OPG, das an Ovarektomie-Ratten ver abreicht wurde. In diesem 2-wöchigen Experiment wird der Trend zur verminderten Knochendichte offenbar durch OPG oder andere anti-resorptive Therapien blockiert. DEXA-Messungen erfolgten zum Zeitpunkt der Ovarektomie und in den Wochen 1 und 2 der Behand lung. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als prozentuale Veränderung der ursprünglichen Knochendichte (Mittelwert ± SA).

Fig. 28 Die durch Anwendung histomorphometrischer Verfahren gemessene Knochendichte in der femoralen Metaphyse ist in Ovarektomie-Ratten (OVX) 17 Tage nach Ovarektomie geringer als in scheinoperierten Tieren (SHAM). Dieser Effekt wurde durch OPG-Fc blockiert, wobei mit OPG-Fc behandelte Ovarektomie-Ratten (OVX + OPG) eine signifikant höhere Knochendichte aufwiesen als mit Trägerstoff behandelte Ovarektoinie-Ratten (OVX). (Mittelwert ± SA).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Ein neuer Vertreter der Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR)-Superfamilie wurde identifiziert als ein aus einer intestinalen cDNA-Bibliothek einer fetalen Ratte isolierter exprimierter Sequenz-Tag (expressed sequence tag) (EST). Die Strukturen der cDNA-Klone der Ratte in vollständiger Länge und der korrespondie renden murinen und humanen cDNA-Klone wurden gemäß Darlegung in den Beispielen 1 und 6 bestimmt. Die Gene der Ratte, der Maus und des Menschen sind in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO: 122) bzw. 9C-9D (SEQ ID NO: 124) dargestellt. Sämtliche drei Sequenzen zeigen eine große Ähnlichkeit mit den extrazellulären Domänen von Mitgliedern der TNFR-Familie. Keiner der isolierten cDNA-Klone vollständiger Länge kodierte für zytoplasmatische und Transmembrandomänen, die man bei mem brangebundenen Rezeptoren erwarten würde, was darauf hinweist, daß diese cDNAs eher für lösliche, sezernierte Proteine als für Zelloberflächenrezeptoren kodieren. Ein in Fig. 9D dargestell ter, die Nukleotide 1200-1353 abdeckender Bereich des humanen Gens wurde am 22. November 1995 unter der Zugriffsnummer 17188769 bei der Genebank database hinterlegt.

Die Gewebeverteilung der mRNA der Ratte und des Menschen wurde gemäß Darlegung in Beispiel 2 ermittelt. Bei der Ratte wurde die Expression von mRNA in der Niere, der Leber, der Plazenta und im Herzen nachgewiesen, wobei die höchste Expression in der Niere vorlag. Die Expression im Skelettmuskel und in der Bauchspeichel drüse wurde ebenfalls nachgewiesen. Bei Menschen wurde die Expression in den selben Geweben und im Lymphknoten, im Thymus, in der Milz und im Blinddarm nachgewiesen.

Die Ratten-cDNA wurde unter Verwendung des Leber-spezifischen ApoE-Promotor-Expressionssystems in transgenen Mäusen exprimiert (Beispiel 3). Eine Analyse von Expressoren zeigte eine deutliche Zunahme der Knochendichte, insbesondere in Röhrenknochen (Oberschenkel), Wirbeln und flachen Knochen (Becken). Eine histologische Analyse gefärbter Knochenschnitte zeigte eine schwere Osteopetrose (siehe Beispiel 4), wodurch ein deutliches Ungleichgewicht zwischen der Knochenbildung und der Resorption angezeigt wird, das zu einer deutlichen Akkumulation von Knochen und Knorpel geführt hat. Eine Verringerung der Anzahl von trabekulären Osteoklasten in den Knochen von OPG-Expressortieren zeigt, daß ein signifikanter Teil der Aktivität des TNFR-verwandten Proteins auf die Verhinderung der Knochenresorption entfallen kann, wobei es sich hier um einen Vorgang handelt, der durch Osteoklasten vermittelt wird. Angesichts der Aktivität in transgenen Expressoren werden die vorliegend beschriebenen TNFR-verwandten Proteine als OPGs bezeichnet.

Unter Verwendung der Ratten-cDNA-Sequenz wurden murine und humane cDNA-Klone isoliert (Beispiel 5). Die Expression des murinen OPGs in 293-Zellen und des humanen OPGs in E. coli wird in den Beispielen 7 und 8 beschrieben. Das murine OPG wurde in Form eines Fc-Fusionsproteins produziert, welches durch Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt wurde. Ferner wird im Beispiel 7 die Expression von humanen und murinen OPG-Polypepti den in CHO- und 293-Zellen in vollständiger Länge und in verkürzter Form entweder als Fusionspolypeptide mit der Fc-Region von humanem IgG1 oder als unfusionierte Polypeptide beschrieben. Die Expression von humanen und murinen OPGs in vollständiger Länge und in verkürzter Form in E. coli entweder als Fc-Fusions polypeptide oder als unfusionierte Polypeptide wird in Beispiel 8 beschrieben. Die Reinigung von rekombinant produziertem Säuger- und Bakterien-OPG wird in Beispiel 10 beschrieben.

Die biologische Aktivität von OPG wurde ermittelt unter Anwendung eines in vitro-Assays der Osteoklastenreifung, eines in vivo-Modells für durch Interleukin-1 (IL-1) induzierte Hyperkalzämie, sowie durch Injektionsstudien über die Knochendichte in normalen Mäusen (siehe Beispiel 11). Die folgenden, in CHO- oder 293-Zel len produzierten rekombinanten OPG-Proteine zeigten Aktivität in dem in vitro-Assay der Osteoklastenreifung : muOPG [22-185]-Fc, muOPG [22-194]-Fc, muOPG [22-401]-Fc, muOPG [22-401], huOPG [22-201]-Fc, huOPG [22-401]-Fc. Das in CHO-Zellen produzierte muOPG [22-180]-Fc sowie das in E. coli produzierte huOPG met[32-401] zeigten in dem in vitro-Assay keine Aktivität.

OPG aus verschiedenen Quellen wurde als Dimer und in einem gewissen Ausmaß als höheres Multimer produziert. Das in trans genen Mäusen produzierte Ratten-OPG [22-401], die als rekom binante Polypeptide in CHO-Zellen produzierten muOPG [22-401] und huOPG [22-401], sowie das OPG, welches als natürlicherweise auftretendes Produkt von einer zytotoxischen T-Zellinie ex primiert wurde, zeigten sich bei Analyse in nicht-reduzierenden SDS-Gelen vorherrschend als Dimere und Trimere (siehe Beispiel 9). Verkürzte OPG-Polypeptide mit Deletionen in der Region der Aminosäuren 186-401 (z. B. OPG [1-185] und OPG [1-194]) lagen vorherrschend in monomerer Form vor, was darauf hinweist, daß die Region 186-401 bei der Selbstorganisation von OPG-Polypeptiden beteiligt sein kann. Das in E. coli produzierte huOPG met[32-401] lag jedoch in großem Umfang in monomerer Form vor.

OPG kann bei der Steuerung der Knochenresorption wichtig sein. Das Protein scheint als ein löslicher Rezeptor der TNF-Familie zu wirken, und es kann eine beim osteolytischen Stoffwechselweg involvierte Rezeptor/Liganden-Wechselwirkung verhindern. Ein Aspekt der Steuerung scheint eine Verringerung der Anzahl an Osteoklasten zu sein.

Nukleinsäuren

Durch die Erfindung wird eine isolierte Nukleinsäure bereitge stellt, die für ein Polypeptid kodiert, welches mindestens eine der biologischen Aktivitäten von OPG aufweist. Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung schließen die biologischen Aktivitäten von OPG jede den Knochenstoffwechsel betreffende Aktivität und insbesondere die Erhöhung der Knochendichte ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren werden ausgewählt aus den folgenden Gruppen:

a) Nukleinsäuresequenzen gemäß Darstellung in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO: 122) und 9C-9D (SEQ ID NO: 124), oder komplementäre Stränge derselben;
b) Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit der Polypeptid-kodierenden Region in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO: 122), und 9C-9D (SEQ ID NO: 124) hybridisieren;
c) Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit den in Fig. 1A dargestellten Nukleotiden 148 bis 337 einschließ lich hybridisieren; und
d) Nukleinsäuresequenzen, die gegenüber den Sequenzen gemäß (a) und (b) degeneriert sind.

Durch die Erfindung werden Nukleinsäuren, die für OPG der Ratte, der Maus und des Menschen kodieren, als auch damit hybridi sierende Nukleinsäuresequenzen bereitgestellt, welche für ein Polypeptid kodieren, das mindestens eine der biologischen Aktivitäten von OPG aufweist. Ferner werden Nukleinsäuren bereitgestellt, die mit einem OPG-EST der Ratte hybridisieren, welcher die in Fig. 1A dargestellten Nukleotide 148-337 umfaßt. Die Hybridisierungsbedingungen sind im allgemeinen von hoher Stringenz wie SXSSC, 50% Formamid und 42°C, wie in Beispiel 1 der Beschreibung beschrieben wird. Eine diesen Bedingungen gleichwertige Stringenz kann durch Einstellung der Konzen trationen an Salz und organischem Lösungsmittel sowie der Temperatur leicht erreicht werden. Die Nukleinsäuren in (b) umfassen Sequenzen, die für OPG-verwandte Polypeptide kodieren, welche mit anderen bekannten Vertretern der TNF-Rezeptor-Superfamilie keine nachweisbare Hybridisierung eingehen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäuren wie in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO: 122) und 9C-9D (SEQ ID NO: 124) dargestellt.

Die Länge der erfindungsgemäßen hybridisierenden Nukleinsäuren kann variabel sein, da die Hybridisierung in einem Teil oder in dem gesamten Bereich der Polypeptidkodierenden Regionen gemäß Darstellung in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO: 122), und 9C-9D (SEQ ID NO: 124), und auch in benachbarten nicht-kodierenden Regionen stattfinden kann. Daher können hybridisierende Nukleinsäuren Verkürzungen oder Extensionen der in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO: 122), und 9C-9D (SEQ ID NO: 124) dargestellten Sequenzen sein. Verkürzte oder verlängerte Nukleinsäuren werden erfindungsgemäß unter der Voraussetzung umfaßt, daß sie für ein Polypeptid kodie ren, welches eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften von OPG beibehält. Die hybridisierenden Nukleinsäuren können auch benachbarte nicht-kodierende Regionen einschließen, die 5′ und/oder 3′ von der für OPG kodierenden Region liegen. Die nicht kodierenden Regionen schließen regulatorische Regionen ein, die bei der Expression von OPG beteiligt sind, wie Promotoren, Enhancer, translationale Initiationsstellen, Transkription sterminationsstellen und dergleichen.

Eine Beschreibung der Hybridisierungsbedingungen für Nukleinsäu ren liefern Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Die für das OPG der Ratte kodierende DNA wurde im Plasmid pMO-B1.1 bereitgestellt, welches am 27. Dezember 1995 unter der ATCC-Zugriffsnummer 69970 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt wurde. Die für das OPG der Maus kodierende DNA wurde im Plasmid pRcCMV-murine OPG bereitgestellt, welches am 27. Dezember 1995 unter der Zugriffsnummer 69971 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt wurde. Die für humanes OPG kodierende DNA wurde im Plasmid pRcCMV-human OPG bereitgestellt, welches am 27. Dezember 1995 unter der Zugriffsnummer 69969 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt wurde. Die erfindungs gemäßen Nukleinsäuren hybridisieren unter stringenten Bedingungen mit den DNA-Inserts mit den ATCC-Zugriffsnummern 69969, 69970 und 69971 und weisen mindestens eine der biologischen Aktivitäten von OPG auf.

Ferner werden durch die Erfindung Derivate der Nukleinsäurese quenzen gemäß Darstellung in Fig. 2B, 9A und 9B bereitge stellt. Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung schließen Derivate Nukleinsäuresequenzen mit Addition, Substitution, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Resten ein, so daß die resultierenden Sequenzen für Polypeptide kodieren, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste hinzugefügt, deletiert, insertiert oder substituiert worden sind, und das resultierende Polypeptid die Aktivität von OPG aufweist. Die Nukleinsäu rederivate können natürlicherweise auftreten, wie durch Spleißva riation oder Polymorphismus, oder sie können unter Anwendung von dem Fachmann zur Verfügung stehenden Techniken zur ortsspezifi schen Mutagenese hergestellt werden. Ein Beispiel für eine natürlicherweise auftretende Variante von OPG ist eine Nu kleinsäure, die innerhalb der Leadersequenz am Rest 3 einen Wechsel von Lys zu Asn kodiert (s. Beispiel 5). Es wird davon ausgegangen, daß die Nukleinsäurederivate für Aminosäurever änderungen in Regionen des Moleküls kodieren, bei denen es am wenigsten wahrscheinlich ist, daß sie die biologische Aktivität beeinträchtigen. Andere Derivate schließen eine Nukleinsäure ein, die für eine membrangebundene Form von OPG kodiert, welche eine extrazelluläre Domäne gemäß Darstellung in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO: 122), und 9C-9D (SEQ ID NO: 124) zusammen mit zytoplasmatischen und Transmembrandomänen aufweist.

Nach einer Ausführungsform schließen Derivate von OPG Nukleinsäu ren ein, die für verkürzte Formen von OPG kodieren, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren vom Carboxyterminus deletiert sind. Beim OPG können vom Carboxyterminus 1 bis 216 Aminosäuren deletiert sein. Fakultativ kann sich der neue Carboxyterminus um eine Fc-Region eines Antikörpers verlängern, um ein biologisch aktives OPG-Fc-Fusionspolypeptid zu ergeben. (Vgl. Beispiel 11). In bevorzugten Ausführungsformen kodieren Nukleinsäuren für ein OPG mit der Aminosäuresequenz der Reste 22-185, 22-189, 22-194 oder 22-201 (gemäß Darstellung in Fig. 9E-F), und kodieren fakultativ für eine Fc-Region von humanem IgG.

Ferner sind Nukleinsäuren eingeschlossen, die für verkürzte Formen von OPG kodieren, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren vom Aminoterminus deletiert sind. Verkürzte Formen schließen solche ein, denen ein Teil oder sämtliche der die Leadersequenz umfassenden 21 Aminosäuren fehlt. Zusätzlich werden durch die Erfindung Nukleinsäuren bereitgestellt, die für ein OPG kodieren, bei dem 1 bis 10 Aminosäuren vom reifen Aminoterminus (am Rest 22) und, fakultativ, 1 bis 216 Aminosäuren vom Carboxy terminus (am Rest 401) deletiert sind. Fakultativ können die Nukleinsäuren für einen Methioninrest am Aminoterminus kodieren. Beispiele für solche verkürzten OPG-Polypeptide sind in Beispiel 8 beschrieben.

Beispiele für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren schließen cDNA, genomische DNA, synthetische DNA und RNA ein. Die cDNA wird aus Bibliotheken erhalten, die ausgehend von mRNA hergestellt wurden, welche aus vielfältigen, OPG exprimierenden Geweben isoliert wurde. Bei Menschen schließen die Gewebequellen für OPG die Niere, die Leber, die Plazenta und das Herz ein. Die für OPG kodierende genomische DNA wird aus genomischen Bibliotheken erhalten, die von einer Vielzahl von Spezies im Handel erhältlich sind. Synthetische DNA wird erhalten durch chemische Synthese von überlappenden Oligonukleotidfragmenten und nachfolgende Zusammen lagerung der Fragmente zur Rekonstitution eines Teils oder der Gesamtheit der kodierenden Region und flankierenden Sequenzen (siehe US-Patent Nr. 4 695 623, welches die chemische Synthese von Interferongenen beschreibt). RNA wird am einfachsten durch prokaryontische Expressionsvektoren erhalten, von denen große Mengen an mRNA synthetisiert werden, wie durch Vektoren, die T7-Promotoren und RNA-Polymerase nutzen.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen werden verwendet zum Nachweis von OPG-Sequenzen in biologischen Proben, um festzustel len, in welchen Zellen und Geweben OPG-mRNA exprimiert wird. Die Sequenzen können auch eingesetzt werden, um genomische und cDNA-Bibliotheken nach Sequenzen abzusuchen, die mit OPG verwandt sind. Ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet verfügt über die Fähigkeit zum Nachweis homologer Sequenzen durch Screening und Anwendung geeigneter Hybridisierungsbedingungen. Die Nukleinsäu ren sind ferner geeignet zum Modulieren der OPG-Expressionsrate durch Antisense- oder Gentherapie. Die Nukleinsäuren werden ferner eingesetzt zur Entwicklung von transgenen Tieren, die für die Herstellung des Polypeptids und für die Untersuchung der biologischen Aktivität eingesetzt werden können (siehe Beispiel 3).

Vektoren und Wirtszellen

Durch die Erfindung werden ferner Expressionsvektoren, die für OPG kodierende Nukleinsäuresequenzen enthalten, sowie Wirtszel len, die mit den Vektoren transformiert sind, und Verfahren zur Herstellung von OPG bereitgestellt. Ein Überblick über die Expression von rekombinanten Proteinen liefert Methods of Enzymology Vol. 185, D.V. Goeddel (Hrsg.), Academic Press (1990).

Wirtszellen für die Herstellung von OPG schließen prokaryontische Wirtszellen wie E. coli, sowie Hefe-, Pflanzen-, Insekten- und Säuger-Wirtszellen ein. Zur Expression sind E. coli-Stämme wie HB101 oder JM101 geeignet. Bevorzugte Säuger-Wirtszellen schließen COS-, CHO D-, 293-, CV-1-, 3T3-, baby hamster kidney (BHK)-Zellen und andere ein. Säuger-Wirtszellen sind bevorzugt, wenn posttranslationale Modifikationen wie eine Glykosylierung und ein Polypeptid-Processing für die OPG-Aktivität wichtig sind. Die Säuger-Expression ermöglicht die Produktion von sezernierten Polypeptiden, die aus dem Wachstumsmedium rückgewonnen werden können.

Die Vektoren für die Expression von OPG enthalten wenigstens Sequenzen, die für die Vermehrung des Vektors und für die Expression des klonierten Inserts erforderlich sind. Diese Sequenzen schließen einen Replikationsursprung, Selektionsmarker, Promotoren, Ribosomenbindungsstellen, Enhancer-Sequenzen, RNA-Spleißstellen und Transkriptionsterminationsstellen ein. Vektoren, die für die Expression in den zuvor genannten Wirtszel len geeignet sind, sind leicht erhältlich, und die erfindungs gemäßen Nukleinsäuren werden unter Anwendung von Standardver fahren der rekombinanten DNA-Technologie in die Vektoren insertiert. Vektoren für die Gewebe-spezifische Expression von OPG sind ebenfalls eingeschlossen. Solche Vektoren schließen Promotoren, die für eine Produktion in Mäusen spezifisch in der Leber, der Niere oder in anderen Organen funktionieren, und virale Vektoren für die Expression von OPG in targetierten humanen Zellen ein.

Unter Anwendung eines geeigneten Wirt-Vektor-Systems wird OPG rekombinant produziert, indem man eine Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der Nukleinsäuresequenzen enthält, welche für OPG kodieren, unter Bedingungen derart kultiviert, daß OPG gebildet wird, und man das Expressionsprodukt isoliert. OPG wird im Überstand von transfizierten Säugerzellen oder in Einschlußkörpern von transformierten bakteriellen Wirtszellen produziert. Das auf diese Weise gebildete OPG kann durch dem Fachmann bekannte und im nachfolgenden beschriebene Verfahren gereinigt werden. Die Expression von OPG in Säuger- und Bakterien-Wirtssystemen wird in den Beispielen 7 und 8 be schrieben. Die Expressionsvektoren für Säugerwirte werden beispielsweise durch Plasmide wie das in der PCT-Anmeldung Nr. 90/14363 beschriebene pDSRα repräsentiert. Expressionsvektoren für bakterielle Wirtszellen werden beispielsweise durch die in Beispiel 8 beschriebenen Plasmide pAMG21 und pAMG22-His re präsentiert. Das Plasmid pAMG21 wurde am 24. Juli 1996 unter der Zugriffsnummer 98113 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt. Das Plasmid pAMG22-His wurde am 24. Juli 1996 unter der Zugriffsnummer 98112 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt. Es ist davon auszugehen, daß die beschriebenen spezifischen Plasmide und Wirtszellen der Veranschaulichung dienen, und daß für die Expression der Polypeptide gleichermaßen auch andere erhältliche Plasmide und Wirtszellen eingesetzt werden können.

Die Erfindung ermöglicht ferner die Expression von OPG durch endogene Nukleinsäuren durch in vivo- oder ex vivo-Rekombina tionsereignisse, um eine Modulation von OPG auf der Ebene des Wirtschromosoms zu ermöglichen. Die Expression von OPG durch Einführung von exogenen regulatorischen Sequenzen (z. B. Promoto ren oder Enhancer), die in der Lage sind, die Produktion von OPG von endogenen, für OPG kodierenden Regionen zu steuern, ist ebenfalls umfaßt. Durch die Erfindung wird schließlich auch die Stimulierung von endogenen regulatorischen Sequenzen ermöglicht, die in der Lage sind, die Produktion von OPG zu steuern (z. B. durch Exposition mit Faktoren, die die Transkription verstärken).

Polypeptide

Durch die Erfindung wird OPG bereitgestellt, das ein neuer Vertreter der TNF-Rezeptor-Superfamilie ist und eine mit dem Knochenstoffwechsel assoziierte Aktivität sowie insbesondere die Aktivität aufweist, die Knochenresorption zu inhibieren und dadurch die Knochendichte zu erhöhen. OPG bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz vom OPG der Maus, der Ratte oder des Menschen, oder auf ein Derivat davon mit minde stens einer der biologischen Aktivitäten von OPG. Die Aminosäure sequenzen vom OPG der Ratte, der Maus und des Menschen sind in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 121), 9A-9B (SEQ ID NO: 123) bzw. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) dargestellt. Ein Derivat von OPG bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Addition, Deletion, Insertion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren, wobei das resultierende Polypeptid mindestens eine der biologischen Aktivitäten von OPG aufweist. Die biologischen Aktivitäten von OPG schließen Aktivitäten ein, die beim Knochenstoffwechsel beteiligt sind, sind aber nicht hierauf beschränkt. Vorzugsweise ist bei den Polypeptiden die aminoterminale Leadersequenz von 21 Aminosäuren entfernt.

Die erfindungsgemäß eingeschlossenen OPG-Polypeptide schließen rat [1-401], rat [22-180], rat [22-401], rat [22-401]-Fc-Fusion, rat [1-180]-Fc-Fusion, mouse [1-401], mouse [1-180], mouse [22-401], human [1-401], mouse [22-180], human [22-401], human [22-180], human [1-180], human [22-180]-Fc-Fusion, und human met-32-401 ein. Die Bezifferung der Aminosäuren erfolgt gemäß Dar stellung in SEQ ID NO: 121 (rat), SEQ ID NO: 123 (mouse) und SEQ ID NO: 125 (human). Ebenfalls eingeschlossen sind Polypeptidde rivate mit Deletionen oder carboxyterminalen Verkürzungen eines Teils oder sämtlicher Aminosäurereste 180-401 von OPG; Ver änderungen einer oder mehrerer Aminosäuren in den Resten 180-401; Deletion eines Teils oder des gesamten Bereichs der Cystein-reichen Domäne von OPG, insbesondere mit einer Deletion der distalen (carboxyterminalen) Cystein-reichen Domäne; und mit Veränderungen einer oder mehrerer Aminosäuren in einer Cystein-reichen Domäne, insbesondere in der distalen (carboxyterminalen) Cystein-reichen Domäne. Nach einer Ausführungsform sind beim OPG 1 bis etwa 216 Aminosäuren vom Carboxyterminus deletiert. Nach einer anderen Ausführungsform sind beim OPG 1 bis etwa 10 Amino säuren vom reifen Aminoterminus (wobei sich der reife Aminotermi nus am Rest 22 befindet) und, fakultativ, 1 bis etwa 216 Amino säuren vom Carboxyterminus deletiert.

Zusätzliche OPG-Polypeptide, die erfindungsgemäß umfaßt sind, schließen die folgenden ein: human [22-180]-Fc-Fusion, human [22-201]-Fc-Fusion, human [22-401]-Fc-Fusion, mouse [22-185]-Fc-Fusion, mouse [22-194]-Fc-Fusion. Diese Polypeptide werden in Säuger-Wirtszellen wie CHO- oder 293-Zellen produziert. Zusätzli che OPG-Polypeptide, die erfindungsgemäß umfaßt sind und in prokaryontischen Wirtszellen exprimiert werden, schließen die folgenden ein: human met[22-401], Fc-human met [22-401]-Fusion (die Fc-Region ist fusioniert am Aminoterminus der für OPG kodierenden Sequenz vollständiger Länge gemäß Beschreibung in Beispiel 8), human met[22-401]-Fc-Fusion (die Fc-Region ist mit der vollständigen OPG-Sequenz fusioniert), Fc-mouse met[22-401]-Fusion, mouse met[22-401]-Fc-Fusion, human met[27-401], human met[22-185], humanmet[22-189], humanmet[22-194], humanmet[22-194] (P25A), human met[22-194] (P26A), human met[27-185], human met[27-189], humanmet[27-194], humanmet-arg-gly-ser-(his)₆ [22-401], human met-lys [22-401], human met-(lys)₃-[22-401], human met[22-40l]-Fc (P25A), human met[22-401] (P25A), human met[22-401] (P26A), human [22-401] (P26D), mouse met[22-401], mouse met[27-401], mouse met[32-401], mouse met[27-180], mousemet[22-189], mouse met[22-194], mouse met[27-189], mouse met[27-194], mouse met-lys[22-40l], mouse HEK[22-401] (A45T), mouse met-lys-(his)₇[22-401], mouse met-lys[22-401]-(his)₇ und mouse met[27-401] (P33E, G36S, A456P). Es wird davon ausgegangen, daß die obigen, in prokaryontischen Wirtszellen produzierten OPG-Polypep tide einen aminoterminalen Methioninrest aufweisen, sofern ein solcher Rest nicht angegeben ist. In spezifischen Beispielen wurden OPG-Fc-Fusionsproteine hergestellt unter Verwendung einer 227 Aminosäuren umfassenden Region des humanen IgGl-γ1 mit der Sequenz gemäß Darlegung von Ellison et al. (Nuc. Acids Res. 10, 4071-4079 (1982)). Es können jedoch gleichermaßen auch Varianten der Fc-Region vom humanen IgG verwendet werden.

Die Analyse der biologischen Aktivität von carboxyterminal verkürzten OPG-Formen, die mit der Fc-Region vom humanen IgG1 fusioniert sind, zeigt, daß ein Teil von OPG von etwa 164 Amino säuren für die Aktivität erforderlich ist. Diese Region umfaßt die Aminosäuren 22-185, vorzugsweise solche gemäß Fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125), und umfaßt vier Cystein-reiche Domänen, die für die Cystein-reichen Domänen von extrazellulären TNFR-Domänen charakteristisch sind.

Unter Nutzung der Homologie zwischen OPG und den extrazellulären Liganden-Bindungsdomänen von Mitgliedern der TNF-Rezeptor-Familie wurde auf Basis der bekannten Kristallstruktur der extrazel lulären Domäne von TNFR-I ein dreidimensionales Modell von OPG erstellt (siehe Beispiel 6). Dieses Modell wurde zum Identifizie ren von solchen Resten innerhalb von OPG eingesetzt, die für die biologische Aktivität wichtig sein können. Es wurden Cysteinreste identifiziert, die bei der Aufrechterhaltung der Struktur der vier Cystein-reichen Domänen beteiligt sind. Anhand des Modells wurden die folgenden Disulfidbindungen identifiziert: Domäne 1: cys41 bis cys54 cys44 bis cys62, tyr23 und his66 können an der Stabilisierung der Struktur dieser Domäne beteiligt sein; Domäne 2: cys65 bis cys80, cys83 bis cys98, cys87 bis cys105; Domäne 3: cys107 bis cys118, cys124 bis cys142; Domäne 4: cys145 bis cys160, cys166 bis cys185. Ferner wurden Reste identifiziert, die sich in unmittelbarer Nähe zum TNFβ befinden, wie in den Fig. 11 und 12A-12B dargestellt ist. Bei diesem Modell wird angenommen, daß OPG an einen korrespondierenden Liganden bindet; TNFβ wurde als Modelligand eingesetzt, um die Wechselwirkung zwischen OPG und seinem Liganden zu simulieren. Auf der Grundlage dieses Modells können die folgenden Reste in OPG für die Ligandenbindung wichtig sein: glu34, lys43, pro66 bis gln91 (insbesondere pro66, his68, tyr69, tyr70 thr71, aps72, ser73, his76, ser77, asp78, glu79, leu81, tyr82, pro85, val86, lys88, glau90 und gln91), glu153 und ser155.

Veränderungen in diesen Aminosäureresten können die biologische Aktivität von OPG entweder allein oder in Kombination verändern. Beispielsweise können Veränderungen in spezifischen Cysteinresten zu einer Veränderung der Struktur einzelner Cystein-reicher Domänen führen, wohingegen Veränderungen in Resten, die für die Ligandenbindung wichtig sind, die physikalischen Interaktionen zwischen OPG und Ligand beeinflussen können. Strukturmodelle können das Identifizieren von Analogen unterstützen, die über weitere wünschenswerte Eigenschaften wie eine erhöhte biologische Aktivität, größere Stabilität, oder einfachere Formulierung aufweisen.

Durch die Erfindung wird auch ein OPG-Monomere umfassendes OPG-Multimer bereitgestellt. OPG scheint als Multimer aktiv zu sein (z. B. Dimer, Trimer oder eine höhere Anzahl von Monomeren). Vorzugsweise sind OPG-Multimere Dimere oder Trimere. OPG-Multimere können Monomere umfassen, welche die Aminosäuresequenz von OPG in ausreichendem Umfang aufweisen, um die Multimerbildung zu fördern, oder sie können Monomere umfassen, die heterologe Sequenzen aufweisen, wie eine Fc-Antikörperregion. Eine Analyse der carboxyterminalen Deletionen von OPG legt nahe, daß minde stens ein Teil der Region 186-401 bei der Assoziation von OPG-Polypeptiden beteiligt ist. Eine Substitution eines Teils oder der Gesamtheit der Region der OPG-Aminosäuren 186-401 durch eine zur Selbstorganisation fähige Aminosäuresequenz wird von der Erfindung ebenfalls umfaßt. Alternativ können die OPG-Polypeptide oder Derivate derselben modifiziert werden, um Dimere oder Multimere zu bilden, durch ortsgerichtete Mutagenese, um ungepaarte Cysteinreste für die Ausbildung einer Interketten-Disulfidbindung zu schaffen, durch photochemisches Vernetzen, wie durch Exposition mit UV-Licht, oder durch chemisches Vernetzen mit bifunktionellen Linker-Molekülen wie bifunktionelles Polyethylenglykol und dergleichen.

Die Modifikationen von OPG-Polypeptiden werden erfindungsgemäß umfaßt und schließen posttranslationale Modifikationen (z. B. N-verknüpfte oder O-verknüpfte Kohlenstoffketten, prozessierend von N-terminalen oder C-terminalen Enden), das Anheften von chemi schen Resten an das Aminosäurerückgrat, chemische Modifikationen von N-verknüpften oder O-verknüpften Kohlenhydratketten, und die Addition eines N-terminalen Methioninrests als Ergebnis der prokaryontischen Wirtszellexpression ein. Die Polypeptide können auch mit einem nachweisbaren Marker wie einem enzymatischen, fluoreszierenden, radioaktiven oder Affinitätsmarker modifiziert sein, um den Nachweis und die Isolierung des Proteins zu ermöglichen.

Weitere Modifikationen von OPG schließen chimäre Proteine ein, bei denen OPG mit einer heterologen Aminosäuresequenz fusioniert ist. Die heterologe Sequenz kann irgendeine Sequenz sein, die dem resultierenden Fusionsprotein die Beibehaltung der Aktivität von OPG erlaubt. Die heterologen Sequenzen schließen z. B. Immunglobu linfusionen wie Fc-Fusionen ein, welche die Reinigung des Proteins erleichtern können. Eine heterologe Sequenz, welche die Assoziation von OPG-Monomeren zur Bildung von dimeren, trimeren und anderen höheren multimeren Formen fördert, ist bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden von anderen in Geweben, Zellinien und transformierten Wirtszellen, die OPG exprimieren, vorhandenen Polypeptiden isoliert und gereinigt, oder sie werden von Komponenten in Zellkulturen gereinigt, die das sezernierte Protein enthalten. Nach einer Ausführungsform ist das Polypeptid frei von einer Assoziation mit anderen humanen Proteinen, wie das Expressionsprodukt einer bakteriellen Wirtszelle.

Durch die Erfindung werden ferner chemisch modifizierte Derivate von OPG bereitgestellt, die zusätzliche Vorteile wie eine erhöhte Stabilität und Zirkulierungsdauer des Polypeptids oder eine verminderte Immunogenität bieten können (siehe US-Patent Nr. 4 179 337). Die chemischen Reste für die Derivatisierung können ausgewählt werden aus wasserlöslichen Polymeren wie Polyethylen glykol, Ethylenglykol/Propylenglykol-Copolymeren, Carboxymethyl cellulose, Dextran, Polyvinylalkohol und dergleichen. Die Polypeptide können an zufälligen Positionen innerhalb des Moleküls oder an vorbestimmten Positionen innerhalb des Moleküls verändert werden und schließen einen, zwei, drei oder mehrere angeheftete chemische Reste ein.

Das Polymer kann irgendein Molekulargewicht aufweisen und verzweigt oder unverzweigt sein. Im Falle von Polyethylenglykol liegt das für eine leichtere Handhabung und Verarbeitung bevorzugte Molekulargewicht zwischen etwa 1 kD und etwa 100 kD (der Begriff "etwa" gibt an, daß einige Moleküle in Polyethylen glykol-Präparationen ein höheres und einige ein niedrigeres Molekulargewicht als das angegebene Molekulargewicht aufweisen).

Andere Größen können in Abhängigkeit von dem gewünschten therapeutischen Profil eingesetzt werden (z. B. der erwünschten Dauer einer anhaltenden Freisetzung, den Effekten, sofern vorhanden, auf die biologische Aktivität, der Einfachheit der Handhabung, dem Ausmaß oder dem Fehlen einer Antigenität und von anderen bekannten Effekten des Polyethylenglykols auf ein therapeutisches Protein oder Analog).

Das Anheften der Polyethylenglykolmoleküle (oder anderer chemischer Reste) an das Protein sollte unter Berücksichtigung der Effekte auffunktionelle oder antigene Domänen des Proteins erfolgen. Dem Fachmann stehen eine Reihe von Verfahren zur Anheftung zur Verfügung, z. B. EP 0 401 384, vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen (Kopplung von PEG an G-CSF), siehe auch Maliget al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (Beschreibung der Pegylierung von GM-CSF unter Verwendung von Tresylchlorid). Beispielsweise kann das Polyethylenglykol durch Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe wie eine freie Amino- oder Carboxyl gruppe kovalent gebunden werden. Reaktive Gruppen sind solche, an die ein aktiviertes Polyethylenglykolmolekül gebunden werden kann. Die Aminosäurereste mit einer freien Aminogruppe können Lysinreste und die N-terminalen Aminosäurereste einschließen; solche, die eine freie Carboxylgruppe aufweisen, können Aspara ginsäurereste, Glutaminsäurereste und die C-terminalen Aminosäu renreste einschließen. Sulfhydrylgruppen können für die Anheftung des bzw. der Polyethylenglykolmoleküle auch als reaktive Gruppe verwendet werden. Für therapeutische Zwecke ist die Anheftung an eine Aminogruppe wie die Anheftung an den N-Terminus oder eine Lysingruppe bevorzugt.

Ein N-terminal chemisch modifiziertes Protein kann besonders erwünscht sein. Unter Verwendung von Polyethylenglykol als veranschaulichendes Beispiel der vorliegenden Zusammensetzungen kann man auswählen aus einer Vielzahl von Polyethylenglykolmole külen (durch Molekulargewicht, Verzweigung, etc.) das Verhältnis zwischen Polyethylenglykolmolekülen und Protein- (oder Pep tid-)Molekülen in der Reaktionsmischung, den anzuwendenden Typ der Pegylierungsreaktion, und das Verfahren zum Erhalt des ausgewählten N-terminal pegylierten Proteins. Das Verfahren zum Erhalt der N-terminal pegylierten Präparation (d. h. das gegebe nenfalls erforderliche Abtrennen dieses Rests von anderen monopegylierten Resten) kann durch Reinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Population von pegylierten Proteinmolekülen erfolgen. Eine selektive, N-terminale chemische Modifikation kann erfolgen durch reduktive Alkylierung unter Ausnutzung der unterschiedlichen Reaktivitäten von verschiedenen Typen primärer Aminogruppen (Lysin gegenüber dem N-Terminus), die für die Derivatisierung in einem bestimmten Protein zur Verfügung stehen. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einer ein Polymer enthaltenden Carbonylgruppe erreicht.

Synthetische OPG-Dimere können anhand zahlreicher Vorgehensweisen zur chemischen Quervernetzung hergestellt werden. OPG-Monomere können in jedweder Art und Weise chemisch verknüpft werden, sofern die biologische Aktivität von OPG beibehalten oder verstärkt wird. Eine Vielzahl von chemischen Vernetzungsmitteln kann in Abhängigkeit von den gewünschten Eigenschaften des Proteindimers eingesetzt werden. Beispielsweise können Vernet zungsmittel kurz und relativ starr oder länger und flexibler sein, und sie können biologisch reversibel sein, und sie können eine reduzierte Immunogenität oder eine längere pharmakokineti sche Halbwertszeit aufweisen.

In einem Beispiel werden OPG-Moleküle unter Anwendung einer zweistufigen Synthese über den Aminoterminus verknüpft (siehe Beispiel 12). In der ersten Stufe wird OPG chemisch am Aminoter minus modifiziert, um ein geschütztes Thiol einzufügen, welches nach Reinigung entschützt wird und als Anheftungspunkt für eine ortsspezifische Konjugation über eine Vielzahl von Vernetzern mit einem zweiten OPG-Molekül dient. Aminoterminale Vernetzungen schließen eine Disulfidbindung, Thioether-Verknüpfungen unter Verwendung kurzkettiger, bifunktioneller aliphatischer Vernet zungsmittel, und Thioether-Verknüpfungen mit bifunktionellen Polyethylenglykol-Vernetzern variabler Länge (PEG "Dumbbells") ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Von der PEG-Dumbbell-Synthese von OPG-Dimeren ebenfalls umfaßt ist ein Nebenprodukt einer solchen Synthese mit der Bezeichnung "Monobell". Ein OPG-Monobell besteht aus einem Monomer, welches mit einem linearen bifunktionellen PEG mit einem freien Polymerterminus gekoppelt ist. Alternativ kann OPG direkt durch eine Vielzahl von amin spezifischen homobifunktionellen Vernetzungstechniken vernetzt werden, welche Reagenzien einschließen wie: Diethylentriaminpen taacetdianhydrid (DTPA), p-Benzochinon (pBQ) oder Bis(sulfosucci nimidyl)suberat (BS³,) wie auch andere im Stand der Technik bekannte Mittel. Das direkte Versehen von OPG mit einer Thiol gruppe ist auch möglich mit Reagenzien wie Iminothiolan in Gegenwart einer Vielzahl von bifunktionellen, thiolspezifischen Vernetzungsmitteln, wie PEG-bis-maleimid, wodurch eine Dimerisie rung und/oder Dumbbells in einem einstufigen Verfahren erzielt werden.

Ein Verfahren zur Reinigung von OPG aus natürlichen Quellen und aus transfizierten Wirtszellen ist ebenfalls eingeschlossen. Das Reinigungsverfahren kann die Anwendung eines oder mehrerer standardisierter Proteinreinigungsschritte in sinnvoller Reihenfolge umfassen, um ein gereinigtes Protein zu erhalten. Die Chromatographieschritte können Ionenaustausch, Gelfiltration, hydrophobe Interaktion, Umkehrphasen-, Chromatofokussierungs-, Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Anti-OPG-Antikörpers oder Biotin-Streptavidin-Affinitätskomplexes und dergleichen ein.

Antikörper

Erfindungsgemäß umfaßt sind ferner Antikörper, die spezifisch an OPG binden. Die Antigene zur Herstellung von Antikörpern können Polypeptide oder Peptide vollständiger Länge sein, die einen Teil der OPG-Sequenz abdecken. Die immunologischen Vorgehensweisen zur Herstellung von gegenüber OPG reaktiven polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)). Die auf diese Weise hergestellten Antikörper werden unter Anwendung von standardisierten Enzym-gekoppelten Immunoassays hinsichtlich ihrer Bindungsspezifität und Epitoperkennung charakterisiert. Die Antikörper schließen auch chimäre Antikörper mit variablen und konstanten Domänenregionen ein, welche von unterschiedlichen Spezies abgeleitet sind. Nach einer Ausführungsform sind die chimären Antikörper humanisierte Antikörper mit murinen variablen Domänen und humanen konstanten Domänen. Ebenfalls umfaßt sind Regionen, die die Komplementärität bestimmen und auf ein humanes Framework-Segment aufgepfropft sind (sogenannte CDR-gepfropfte Antikörper). Chimäre und CDR-gepfropfte Antikörper werden unter Anwendung von rekombinanten Verfahren hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind. Ebenfalls umfaßt sind in Mäusen generierte humane Antikörper.

Die erfindungsgemäßen Anti-OPG-Antikörper können als Affinitäts mittel eingesetzt werden, um OPG aus biologischen Proben zu reinigen (siehe Beispiel 10). In einem Verfahren wird der Antikörper an CnBr-aktivierte Sepharose immobilisiert, und eine Säule des Antikörper/Sepharose-Konjugats wird eingesetzt, um OPG aus flüssigen Proben zu entfernen. Die Antikörper werden auch als diagnostische Reagenzien eingesetzt, um OPG in biologischen Proben anhand von nachfolgend beschriebenen Verfahren nachzuwei sen und zu quantifizieren.

Pharmazeutische Zusammensetzungen

Durch die Erfindung werden ferner pharmazeutische Zusammen setzungen bereitgestellt, die eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids zusammen mit einem pharmazeu tisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger, Lösungsvermittler, Emulgator, Konservierungsmittel und/oder Adjuvans umfassen. Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge, die angesichts eines spezifizierten Zustands und eines bestimmten Verabreichungsweges einen therapeutischen Effekt ausübt. Die Zusammensetzung kann in einer flüssigen oder lyophilisierten Form vorliegen und umfaßt ein Verdünnungsmittel (Tris-, Acetat- oder Phosphatpuffer) mit vielfältigen pH-Werten und Ionenstärken, einen Lösungsvermittler wie Tween oder Polysor bat, Träger wie humanes Serumalbumin oder Gelatine, Konservie rungsstoffe wie Thimerosal oder Benzylalkohol, und antioxidative Stoffe wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit. Ebenfalls eingeschlossen sind Zusammensetzungen, die zur Steigerung der Löslichkeit oder Stabilität mit wasserlöslichen Polymeren modifiziertes OPG umfassen. Die Zusammensetzungen können für eine kontrollierte Abgabe über einen ausgedehnten Zeitraum auch den Einbau von OPG in Liposomen, Mikroemulsionen, Micellen oder Vesikel umfassen. Ausdrücklich können OPG-Zusammensetzungen den Einbau in polymere Matrizes wie Hydrogele, Silikone, Poly ethylene, Ethylenvinylacetat-Copolymere, oder biologisch abbaubare Polymere umfassen. Beispiele für Hydrogele schließen Polyhydroxyalkylmethacrylate (p-HEMA), Polyacrylamid, Polymetha crylamid, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol und vielfältige Polyelektrolytkomplexe ein. Beispiele für biologisch abbaubare Polymere schließen Polymilchsäure (PLA), Polyglykolsäure (PGA), Copolymere von PLA und PGA, Polyamide und Copolymere von Polyamiden und Polyester ein. Andere Formulierungen zur kon trollierten Freisetzung schließen Mikrokapsel, Mikrokügelchen, makromolekulare Komplexe und polymere Kügelchen ein, die durch Injektion verabreicht werden können.

Die Auswahl einer bestimmten Zusammensetzung wird von einer Reihe von Faktoren abhängen, einschließlich des zu behandelnden Zustandes, des Verabreichungsweges und der gewünschten pharmako kinetischen Parameter. Einen umfassenderen Überblick über Komponenten, die für pharmazeutische Zusammensetzungen geeignet sind, liefert Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, A.R. Gennaro (Hrsg.), Hrsg. Mack, Easton, PA (1980).

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können durch Injektion, entweder subkutan, intravenös oder intramuskulär, oder durch orale, nasale, pulmonale oder rektale Verabreichung verabfolgt werden. Die schließlich gewählte Art und Weise der Verabreichung wird von einer Reihe von Faktoren abhängen und kann von einem Fachmann ermittelt werden.

Durch die Erfindung werden ferner pharmazeutische Zusammen setzungen bereitgestellt, die eine therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zusammen mit einem pharmazeu tisch verträglichen Adjuvans umfassen. Die Nukleinsäurezusammen setzungen sind geeignet für das Ausbringen eines Teils oder der Gesamtheit der für OPG kodierenden Region an Zellen und Gewebe als Teil eines Antisense- oder Gentherapieplans.

Behandlungsverfahren

Das Knochengewebe stellt eine Stütze für den Körper dar und besteht aus Mineralien (im wesentlichen Calcium und Phosphor), einer Matrix aus kollagenen und nicht-kollagenen Proteinen, und Zellen. Drei der in Knochen, Osteozyten, Osteoblasten und Osteoklasten auffindbaren Zelltypen sind bei dem dynamischen Prozeß involviert, durch den Knochen kontinuierlich gebildet und resorbiert wird. Die Osteoblasten fördern die Bildung des Knochengewebes, wohingegen die Osteoklasten mit der Resorption im Zusammenhang stehen. Die Resorption oder die Zersetzung der Knochenmatrix und Mineralien ist verglichen mit der Knochenbil dung ein schneller und effizienter Vorgang und kann zur Freiset zung von großen Mengen an Mineralien aus dem Knochen führen. Die Osteoklasten sind bei der Regulation der normalen Umformung von Skelettgewebe und bei der durch Hormone induzierten Resorption beteiligt. Beispielsweise wird die Resorption stimuliert durch die Sekretion von Parathormon als Antwort auf sinkende Konzen trationen an Calciumionen in extrazellulären Flüssigkeiten. Im Gegensatz dazu ist die Hemmung der Resorption die grundlegende Funktion von Calcitonin. Zusätzlich verändern Metaboliten von Vitamin D das Ansprechen von Knochen auf Parathormon und Calcitonin.

Nach der Skelettmaturität spiegelt die Menge an Knochen im Skelett das Gleichgewicht (oder Ungleichgewicht) zwischen Knochenbildung und Knochenresorption wieder. Ein Spitzenwert für Knochenmasse tritt nach Skelettmaturität vor dem 4. Lebensjahr zehnt in Erscheinung. Zwischen dem 4. und 5. Lebensjahrzehnt verlagert sich das Gleichgewicht und die Knochenresorption überwiegt. Die unausweichliche Abnahme der Knochenmasse mit steigendem Alter beginnt bei Frauen früher als bei Männern und wird bei bestimmten Frauen nach der Menopause deutlich be schleunigt (grundsätzlich bei Frauen, die von kaukasischen und asiatischen Vorfahren abstammen).

Bei der Osteopenie handelt es sich um einen Zustand, der im allgemeinen mit jeglicher Abnahme der Knochenmasse auf Werte unterhalb des normalen Bereichs zusammenhängt. Ein derartiger Zustand kann aus einer sinkenden Knochensyntheserate oder aus einer ansteigenden Knochenzerstörungsrate oder aus beidem hervorgehen. Die häufigste Form der Osteopenie ist in erster Linie die Osteoporose, die auch als postmenopausale und senile Osteoporose bezeichnet wird. Diese Form der Osteoporose ist eine Folge des mit dem Alter stattfindenden universellen Knochen schwunds und ist gewöhnlich ein Ergebnis einer ansteigenden Knochenresorption bei normaler Knochenbildungsrate. Etwa 25 bis 30% aller weißen Frauen in den Vereinigten Staaten entwickeln symptomatische Osteoporose. Es besteht eine direkte Beziehung zwischen der Osteoporose und der Inzidenz von Hüft-, Ober schenkel-, Oberschenkelhals- und intertrochantären Frakturen bei Frauen im Alter von 45 Jahren und mehr. Ältere Männer entwickeln eine symptomatische Osteoporose im Alter zwischen 50 und 70, aber die Erkrankung befällt in erster Linie Frauen.

Die Ursache der postmenopausalen und senilen Osteoporose ist unbekannt. Mehrere Faktoren, die zu dem Zustand beitragen können, sind identifiziert worden. Sie schließen die mit dem Altern einhergehende Veränderung der Hormonspiegel sowie einen inadäqua ten Calciumverbrauch ein, der auf eine absinkende intestinale Resorption von Calcium und anderen Mineralien zurückzuführen ist. Die Behandlungsformen haben gewöhnlich eine Hormontherapie oder Nahrungsergänzungen umfaßt, um zu versuchen, den Prozeß zu verzögern. Bis heute existiert jedoch keine wirksame Behandlungs form für Knochenschwund.

Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung einer Knochenerkrankung unter Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge an OPG bereitgestellt. Die Knochenerkrankung kann jedwede Störung sein, die durch einen Nettoverlust an Knochenmas se gekennzeichnet ist (Osteopenie oder Osteolyse). Im allgemeinen wird eine Behandlung mit OPG in Erwägung gezogen, wenn es notwendig ist, die Knochenresorptionsrate zu suppriemieren. Demgemäß kann eine Behandlung erfolgen, damit die Knochenresorp tionsrate zu verringern, wenn die Resorptionsrate einen Wert oberhalb des normalen Bereichs aufweist, oder um die Knochenre sorption auf Werte unterhalb des normalen Bereichs zu reduzieren, damit die unterhalb des normalen Bereichs liegenden Werte der Knochenbildung kompensiert werden.

Die mit OPG behandelbaren Zustände schließen die folgenden ein:
Osteoporose, wie primäre Osteoporose, endokrine Osteoporose (Hyperthyreoidismus, Hyperparathyreoidismus, Cushing-Syndrom und Akromegalie), erbliche und kongenitale Formen der Osteoporose (Osteogenesis imperfekta, Homozystinurie, Menkes-Syndrom und Riley-Day-Syndrom), und Osteoporose aufgrund einer Immobili sierung der Extremitäten.

Paget-Krankheit (Osteitis deformans) bei Erwachsenen und Jugendlichen.

Osteomyelitis, oder eine infektiöse Läsion im Knochen, die zu Knochenschwund führt.

Hyperkalzämie, resultierend aus soliden Tumoren (Brust, Lunge und Niere) und hämatologischen Malignitäten (multiples Myelom, Lymphom und Leukämie), idiopathische Hyperkalzämie, und Hyperkal zämie, die mit Hyperthyreoidismus und Nierenfunktionsstörungen assoziiert ist.

Osteopenie als Folge einer Operation, induziert durch Ver abreichung von Steroiden, und assoziiert mit Störungen des Dünn- und Dickdarms und mit chronischen Leber- und Nierenerkrankungen.

Knochennekrose, oder Absterben der Knochenzellen, das mit einer traumatischen Verletzung assoziiert ist, oder eine nicht traumatische Nekrose, die mit der Gaucher-Krankheit, Sichelzel lenanämie, systemischem Lupus erythematodes und anderen Störungs zuständen zusammenhängt.

Knochenschwund aufgrund von rheumatoider Arthritis. Paradontaler Knochenschwund.

Osteolytische Metastase.

Es wird davon ausgegangen, daß OPG allein oder in Verbindung mit anderen Faktoren für die Behandlung von Knochenerkrankungen eingesetzt werden kann. In einer Ausführungsform wird Osteopro tegerin in Verbindung mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Faktors eingesetzt, welcher die Knochenbildung stimuliert. Derartige Faktoren schließen die osteomorphogen Faktoren mit der Bezeichnung BMP-1 bis BMP-12, den transformierenden Wachstums faktor-β (TGF-β) und Vertreter der TGF-β-Familie, Interleukin-1-Inhibitoren, TNFα-Inhibitoren, Parathormon und Analoga desselben, Nebenschilddrüse-verwandtes Protein und Analoga desselben, Prostaglandine der E-Reihe, Bisphosphonate (wie Alendronat und andere), und knochenstärkende Mineralien wie Fluorid und Calcium ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.

Die folgenden Beispiele dienen der eingehenderen Veranschauli chung der Erfindung, wobei sie den Schutzbereich derselben jedoch nicht beschränken sollen.

Beipiel 1 Identifizierung und Isolierung der Ratten-OPG-cDNA

Die Materialien und Verfahren zur Klonierung und Analyse einer cDNA sind beschrieben von Maniatis et al., ibid. Die Polymerase kettenreaktionen (PCR) erfolgten unter Verwendung eines Thermo cyclers des Typs 9600 von Perkin-Elmer und unter Einsatz einer PCR-Reaktionsmischung (Boehringer-Mannheim) und von Primerkonzen trationen entsprechend den Herstellerangaben. Im allgemeinen wurden 25-50 µl umfassende Reaktionsansätze bei 94°C denaturiert und anschließend über 20-40 Zyklen jeweils 5 Sekunden lang bei 94°C, 5 Sekunden lang bei 50-60°C und 3-5 Minuten lang bei 72°C inkubiert. Die Reaktionen wurden anschließend 3-5 Minuten lang bei 72°C behandelt. Die Reaktionsansätze wurden nachfolgend mittels Gelelektrophorese analysiert gemäß Darlegung von Maniatis et al., ibid.

Eine cDNA-Bibliothek wurde hergestellt unter Verwendung von mRNA, die aus embryonalem d20 Darm zur EST-Analyse isoliert worden war (Adams et al., Science 252, 1651-1656 (1991)). Die Rattenembryos wurden seziert, und der gesamte, sich entwickelnde Dünn- und Dickdarm wurde entfernt und mit PBS gewaschen. Die Gesamt-Zell-RNA der Zellen wurde gereinigt durch Säureguanidinthiocyanat- Phenol-Chloroform-Extraktion (Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)). Die Poly(A)⁺-mRNA-Fraktion wurde aus der Gesamt-RNA-Präparation erhalten durch Adsorption an und Elution von Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal Corp.), wobei die vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweisen angewendet wurden. Unter Verwendung des Superscript Plasmid-Systems (Gibco BRL, Gaithers burg, MD) wurde durch random priming eine cDNA-Bibliothek hergestellt. Der für die cDNA eingesetzte Random-Primer, der eine interne NotI-Restriktionsstelle enthält, wurde zum Starten der Erststrang-Synthese eingesetzt und wies die folgende Sequenz auf:

Für die Erststrang-Synthese wurden drei getrennte Reaktions ansätze zusammengestellt, die 2,5 µg Poly(A)-RNA und 120 ng, 360 ng oder 1080 ng Random-Primer enthielten. Nach der Zweit strang-Synthese wurden die Reaktionsprodukte getrennt extrahiert mit einer Mischung aus Phenol:Chloroform: Isoamylalkohol (Verhält nis 25 : 24 : 1) und anschließend mit Ethanol gefällt. Die doppel strängigen (ds) cDNA-Produkte aus den drei Reaktionen wurden vereinigt und mit dein folgenden doppelsträngigen Oligonukleotid-Adapter ligiert:

Nach der Ligation wurde die cDNA vollständig mit NotI verdaut, dann mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) extrahiert und schließlich mit Ethanol gefällt. Die resuspendierte cDNA wurde anschließend der Größe nach fraktioniert durch Gelfil tration unter Verwendung vorgefertigter Säulen, die mit dem Superscript Plasmid-System (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) bereitgestellt wurden, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Die beiden die größten cDNA-Produkte enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, mit Ethanol gefällt und anschließend direktional ligiert mit NotI- und SalI-verdauter DNA des Vektors pMOB (Strathmann et al., 1991). Die ligierte cDNA wurde durch Elektroporation in kompetente ElectroMAX DH10B E. coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) eingeführt. Zur automatischen Sequenz analyse wurden ungefähr 10 000 Transformanten auf 20 cm × 20 cm Agarplatten ausplattiert, die mit Ampicillin angereichertes LB-Nährmedium enthielten. Die gebildeten Kolonien wurden entnommen und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen überführt, die 200 ml L-Brühe, 7,5% Glycerin und 50 µg/ml Ampicillin enthiel ten. Die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C kultiviert, und es wurde unter Verwendung eines sterilen, 96 Nadeln aufweisenden Replikainstruments ein doppelter Satz von Mikrotiterplatten hergestellt, bevor beide Sätze zur weiteren Analyse bei -80°C aufbewahrt wurden. Zur Klonierung der cDNA in vollständiger Länge wurden ungefähr 1 000 000 Transformanten auf 96 bakterielle Ampicillinplatten ausplattiert, die jeweils etwa 10 000 Klone enthielten. Die Plasmid-DNA aus jedem Pool wurde unter Verwendung des Qiagen Plasmid Maxi Kits (Qiagen Corp., Bundesrepublik Deutschland) getrennt isoliert und für PCR-Analysen in Mikroti terplatten mit 96 Vertiefungen überführt.

Um zufällige Klone der cDNA aus dem Darm der fetalen Ratte zu sequenzieren, wurden Glycerin-Vorratsansätze aufgetaut und kleine Aliquots im Verhältnis 1 : 25 mit destilliertem Wasser verdünnt. Ungefähr 3,0 µl der verdünnten Bakterienkulturen wurden der PCR-Reaktionsmischung (Boehringer-Mannheim) zugegeben, die die folgenden Oligonukleotide enthielt:

Die Reaktionsansätze wurden in einem Thermocycler (Perkin-Elmer 9600) unter den folgenden Zyklusbedingungen inkubiert: 2 Minuten lang bei 94°C; 30 Zyklen 5 Sekunden lang bei 94°C, 5 Sekunden lang bei 50°C, und 3 Minuten lang bei 72°C; 4 Minuten lang bei 72°C. Nach der Inkubation in dem Thermocycler wurden die Reaktionsansätze mit 2,0 ml Wasser verdünnt. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden weiter gereinigt unter Verwendung von Centricon-Säulen (Princeton Separations) unter Anwendung der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweisen. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden mit einem automatisierten DNA-Sequenziergerät des Typs 373A von Applied Biosystems unter Verwendung von T3-Primer (Oligonukleotid 353-23; 5′-CAATTAACCCT-CACTAAAGG-3′) (SEQ ID NO: 6f)-Taq dye-terminator reactions (Applied Biosystems) nach den vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweisen sequenziert.

Die resultierende 5′-Nukleotidsequenz, die von zufällig gepickten cDNA-Klonen erhalten wurde, wurde translatiert und anschließend unter Anwendung einer modifizierten Version des FASTA-Programms (Pearson et al., Meth. Enzyinol. 183, (1990)) mit in Datenbänken vorhandenen bekannten Proteinsequenzen verglichen. Die trans latierten Sequenzen wurden ferner analysiert auf Anwesenheit eines spezifischen Cystein-reichen Proteinmotivs, das in allen bekannten Vertretern der Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR)-Superfamilie gefunden wird (Smith et al., Cell 76, 959-962 (1994)), wobei das Sequenzprofilverfahren von Gribskov et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4355-4359 (1987)) gemäß Modifika tion von Luethy et al. (Protein Science 3, 139-146 (1994)) angewendet wurde.

Unter Verwendung der FASTA- und Profil-Suchdaten wurde als ein möglicher neuer Vertreter der TNFR-Superfamilie ein EST mit der Bezeichnung FRI-1 (Fetal Rat Intestine-1) identifiziert. FRI-1 enthielt ein ungefähr 600 bp großes Insert mit einem LORF von etwa 150 Aminosäuren. Die nächstkommende Sequenz in der Datenbank war der TNFR des humanen Typs II (TNFR-2). Die verglichene Region wies im Bereich dieses 150 Aminosäuren umfassenden LORFs eine ∼43%ige Homologie zwischen TNFR-2 und FRI-1 auf. Die unter Ver wendung der ersten und zweiten Cystein-reichen Wiederholungen der TNFR-Superfamilie durchgeführte Profilanalyse ergab einen Z-Wert von 8, was darauf hinweist, daß das Gen FRI-1 möglicherweise für ein neues Familienmitglied kodiert. Für die Ableitung der Struktur des FRI-1-Produkts wurde die intestinale cDNA-Bibliothek der fetalen Ratte nach Klonen vollständiger Länge abgesucht. Die folgenden Oligonukleotide wurden aus der ursprünglichen FRI-1-Sequenz abgeleitet:

Diese Primer wurden in PCR-Reaktionen eingesetzt, um 96 Pools von Plasmid-DNA einem Screening zu unterziehen, wobei jeder Pool plasmidäre DNA von 10 000 unabhängigen cDNA-Klone enthielt. Ungefähr 1 µg der Plasmidpool-DNA wurde in einer PCR-Reaktions mischung (Boehringer-Mannheim) amplifiziert unter Einsatz eines thermischen Cyclers mit 96 Vertiefungen von Perkin-Elmer, wobei die folgenden Zyklusbedingungen angewendet wurden: 2 Minuten lang bei 94°C, 1 Zyklus; 15 Sekunden lang bei 94°C, dann 45 Sekunden lang bei 65°C, 30 Zyklen; 7 Minuten lang bei 65°C, 1 Zyklus. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. 13 von 96 Plasmid-DNA-Pools ergaben amplifizierte DNA-Produkte mit der erwarteten relativen Molekülmasse.

Die DNA aus einem positiven Pool wurde eingesetzt, um kompetente ElectroMAX DH10B E. coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) wie oben beschrieben zu transformieren. Ungefähr 40 000 Transformanten wurden auf sterile Nitrocellulosefilter (BA-85, Schleicher und Schuell) ausplattiert und anschließend abgesucht durch Koloniehy bridisierung unter Verwendung einer mit ³²P-dCTP markierten Version des oben erhaltenen PCR-Produkts. Die Filter wurden in 5× SSC, 50% entionisiertes Formamid, 5× Denhardt′s-Lösung, 0,5% SDS, und 100 µg/ml denaturierte Lachssperm-DNA 2-4 Stunden lang bei 42°C prähybridisiert. Die Filter wurden anschließend in 5× SSC, 50% entionisiertes Formamid, 2X Denhardt′s-Lösung, 0,1% SDS, 100 µg/ml denaturierte Lachssperm-DNA, und ∼5 ng/ml markier te Sonde für eine Zeitdauer von 18 Stunden bei 42°C hybri disiert. Die Filter wurden anschließend jeweils 10 Minuten lang in 2X SSC bei RT, in 1X SSC bei 55°C und schließlich 10-15 Minuten lang bei 55°C in 0,5X SSC gewaschen. Hybridisierende Klone wurden im Anschluß an eine Autoradiographie nachgewiesen und nachfolgend für ein sekundäres Screening auf Nitrocel lulosefilter replattiert. Beim sekundären Screening wurde ein Plasmidklon (pB1.1) isoliert, anschließend in LB-Medium enthal tend 100 µg/ml Ampicillin amplifiziert, und die plasmidäre DNA wurde erhalten. Beide Stränge des 2,4 kb großen pB1.1-Inserts wurden sequenziert.

Die Sequenz des pB1.1-Inserts wurde im Rahmen einer FASTA-Suche in der öffentlichen Datenbank eingesetzt, um irgendwelche bestehenden Sequenzpaarungen und/oder -ähnlichkeiten aufzufinden. Es wurden keine Paarungen mit irgendwelchen bekannten Genen oder EST′s gefunden, obgleich es eine ungefähr 45%ige Ähnlichkeit mit den humanen und murinen TNFR-2-Genen gab. Am Basenpaar 124 der Nukleotidsequenz wird ein Methionin-Startkodon gefunden, welchem ein LORF folgt, der für 401 Aminosäurereste kodiert und am Basenpaar 1327 endet. Das 401 Aminosäurereste aufweisende Produkt besitzt vorhersagegemäß ein hydrophobes Signalpeptid von ungefähr 31 Resten an seinem N-Terminus sowie 4 potentielle Stellen einer N-verknüpften Glykosylierung. Unter Anwendung des PepPlot-Programms (Wisconsin GCG Package, Version 8.1) wurde keine hydrophobe, den Transmembranbereich abdeckende Sequenz identifi ziert. Die abgeleitete 401 Aminosäuren umfassende Sequenz wurde anschließend eingesetzt, um die Protein-Datenbank abzusuchen. Wiederum wurden keine existierenden Paarungen gefunden, obgleich es eine starke Ähnlichkeit mit vielen Vertretern der TNFR- Superfamilie zu geben schien, wobei insbesondere auf das TNFR-2 von Mensch und Maus hinzuweisen ist. Ein Sequenz-Alignment dieses neuen Proteins gegenüber bekannten Vertretern der TNFR-Superfami lie erfolgte unter Anwendung des Pileup-Programms, und das Ergebnis wurde mittels PrettyPlot (Wisconsin GCG Package, Version 8.1) modifiziert. Dieses Alignment zeigt eine klare Homologie zwischen dem FRI-1-Genprodukt vollständiger Länge und sämtlichen anderen Mitgliedern der TNFR-Familie. Die homologe Region liegt in der extrazellulären Domäne von Mitgliedern der TNFR-Familie und korrespondiert mit den in der Liganden-Bindungs domäne dieser Proteine gefundenen vier Cystein-reichen Wiederho lungen. Hierdurch wird nahegelegt, daß das Gen FRI-1 für einen neuen Vertreter der TNFR-Familie kodiert. Da keine den Transmem branbereich abdeckende Region nachgewiesen wurde zogen wir die Schlußfolgerung, daß es sich hier um einen sezernierten Rezeptor handeln dürfte, der den von TNFR-1 abgeleiteten löslichen Rezeptoren ähnlich ist (Kohno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331-8335 (1990)). Aufgrund der offenbar vorliegenden biologischen Aktivität des Gens FRI-1 (siehe unten) wurde das Produkt mit Osteoprotegerin (OPG) bezeichnet.

Beispiel 2 Expressionsmuster der OPG-mRNA in Geweben

Multiple humane Gewebe-Northern Blots (Clonetech) wurden mit einem mit ³²P-dCTP markierten FRI-1-PCR-Produkt sondiert, um die Größe des humanen Transkripts zu ermitteln und die Expressions muster zu bestimmen. Die Northern Blots wurden prähybridisiert in 5X SSPE, 50% Formamid, 5× Denhardt′s-Lösung, 0,5% SDS und 100 µg/ml denaturierte Lachssperm-DNA für eine Zeitdauer von 2 bis 4 Stunden bei 42°C. Die Blots wurden anschließend 18- 24 Stunden lang bei 42°C in 5X SSPE, 50% Formamid, 2X Den hardt′s-Lösung, 0,1% SDS, 100 µg/ml denaturierte Lachssperm-DNA mit 5 ng/ml markierter Sonde hybridisiert. Die Blots wurden anschließend jeweils 10 Minuten lang in 2X SSC bei RT, in 1X SSC bei 50°C und anschließend 10-15 Minuten lang in 0,5X SSC gewaschen.

Unter Verwendung einer von dem Rattengen abgeleiteten Sonde wurde in mehreren Geweben einschließlich Niere, Leber, Plazenta und Herz eine vorherrschende RNA-Spezies mit einer relativen Molekülmasse von etwa 2,4 kb nachgewiesen. Die höchsten Werte wurden in der Niere nachgewiesen. Im Skelettmuskel und in der Bauchspeicheldrüse wurden große mRNA-Spezies mit einer relativen Molekülmasse von 4,5 und 7,5 kb nachgewiesen. Man fand heraus, daß unter den humanen fetalen Geweben in der Niere relativ hohe Mengen der 2,4 kb großen mRNA exprimiert werden. Unter Verwendung einer humanen Sonde (siehe unten) wird in den selben Geweben lediglich das Transkript mit einer Größe von 2,4 kb nachgewiesen. Zusätzlich wurden im Lymphknoten, im Thymus, in der Milz und im Blinddarm relativ hohe Mengen des 2,4 kb großen Transkripts nachgewiesen. Die Größe des sowohl von dem Osteoprotegeringen des Menschen als auch der Ratte nachge 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019654610 00004 99880wiesenen Transkripts ist beinahe identisch mit der Länge des Ratteninserts pB1.1 FRI-1, was darauf hinweist, daß es sich um einen cDNA-Klon vollständiger Länge handelte.

Beispiel 3 Systemische Abgabe von OPG in transgenen Mäusen

Der OPG-Klon pB1.1 der Ratte wurde als Template verwendet, um die kodierende Region für die Subklonierung in einen ApoE-leber-spezifischen Expressionsvektor mittels PCR zu amplifizieren (Simonet et al., J. Clin. Invest. 94, 1310-1319 (1994), und PCT-Anmeldung Nr. US 94/11675 sowie die von den selben Anmeldern eingereichte USSN 08/221 767. Für die PCR-Amplifikation wurden die folgenden 5′- bzw. 3′-Oligonukleotidprimer eingesetzt:

Die PCR-Reaktionsmischung (Boehringer-Mannheim) wurde wie folgt behandelt: 1 Minute lang bei 94°C, 1 Zyklus; 20 Sekunden lang bei 94°C, 30 Sekunden lang bei 62°C, und 1 Minute lang bei 74°C, 25 Zyklen. Im Anschluß an die Amplifikation wurden die Proben über PCR-Säulen von Qiagen gereinigt und über Nacht mit den Restriktionsenzymen SpeI und NotI verdaut. Die Spaltprodukte wurden extrahiert und gefällt und in den ApoE-Promotor-Ex pressionsvektor subkloniert. Vor der Mikroinjektion des resul tierenden Klons HE-OPG wurde er sequenziert, um sicherzustellen, daß er keine Mutationen aufwies.

Das Plasmid HE-OPG wurde durch zwei CsCl-Dichtegradientenzen trifugationen gereinigt. Die gereinigte plasmidäre DNA wurde mit XhoI und AseI verdaut, und das 3,6 kb große transgene Insert wurde mittels Gelelektrophorese gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde verdünnt mit einer Stamminjektionslösung von 1 µg/ml in 5 mM Tris, pH-Wert F7,4, 0,2 mM EDTA. Einzellige Embryos aus Mäusen der Kreuzung BDF1 × BDF1 erhielten Injektionen im wesentlichen wie beschrieben (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4338 (1985)) mit der Abweichung, daß die Injektionsnadeln vor der Verwendung abgeschrägt und silikonisiert wurden. Die Embryos wurden über Nacht in einem CO₂-Inkubator kultiviert, und 15 bis 20 2-zellige Embryos wurden in die Eileiter von scheinschwangeren weiblichen CD1-Mäusen trans feriert.

Nach Ablauf der Schwangerschaft wurden aus der Implantation von mikroinjizierten Embryos 49 Nachkommen erhalten. Die Nachkommen schaft wurde durch PCR-Amplifikation des integrierten Transgens in genomischen DNA-Proben einem Screening unterzogen. Die Zielregion für die Amplifikation war eine 369 bp umfassende Region des humanen ApoE-Introns, das im Expressionsvektor enthalten war. Die für die PCR-Amplifikation verwendeten Oligos waren:

Die PCR-Bedingungen waren: 2 Minuten lang bei 94°C, 1 Zyklus; 1 Minute lang bei 94°C, 20 Sekunden lang bei 63°C, und 30 Sekunden lang bei 72°C, 30 Zyklen. Von den ursprünglich 49 Nachkommen erwiesen sich 9 als PCR-positive transgene Tiere.

Im Alter von 8-10 Wochen wurden 5 transgene Tiere (2, 11, 16, 17 und 28) und 5 Kontrolltiere (1, 12, 15, 18 und 30) für eine Nekropsie und pathologische Analyse eingeschläfert. Die Leber wurde aus den verbleibenden 4 transgenen Tieren durch partielle Hepatektomie isoliert. Für die partielle Hepatektomie wurden die Mäuse betäubt, und ein Leberlappen wurde chirurgisch entfernt. Aus den Lebern sämtlicher transgener Tiere sowie der 5 negativen Kontrolltiere desselben Wurfes wurde zelluläre Gesamt-RNA wie beschrieben isoliert (McDonald et al., Meth. Enzymol. 152, 219 (1987)). Mit diesen Proben wurde eine Northern Blot-Analyse durchgeführt, um das Ausmaß der transgenen Expression zu ermitteln. Ungefähr 10 µg Gesamt-RNA aus jeder Tierleber wurden mittels denaturierender Elektrophoresegele aufgetrennt (Ogden et al., Meth. Enzymol. 152, 61 (1987)), anschließend auf HYBOND-N-Nylonmembran (Amersham) überführt und mit ³²P-dCTP-markierter DNA des pB1.1-Inserts sondiert. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 42°C in 50% Formamid, 5X SSPE, 0,5% SDS, 5X Denhardt′s-Lösung, 100 µg/ml denaturierte Lachssperm-DNA mit 2-4 × 10⁶ cpm markierter Sonde/ml Hybridisierungspuffer durchgeführt. Im Anschluß an die Hybridisierung wurden die Blots 2-mal für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur in 2X SSC, 0,1% SDS, und anschlie ßend 2 × jeweils 5-10 Minuten lang bei 55°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS gewaschen. Im Anschluß an die Autoradiographie wurde die Expression des Transgens in behandelten und Kontrolltieren desselben Wurfes bestimmt.

Die Daten der Northern Blots zeigen, daß 7 der transgenen Tiere nachweisbare Mengen der transgenen mRNA exprimieren (Tiere #2, 11, 16, 17, 22, 33 und 45). Die negativen Kontrollmäuse und eines der transgenen Tiere (#28) exprimierten keine mit dem Transgen in Zusammenhang stehende mRNA. Da OPG vorhersagegemäß ein sezerniertes Protein ist, sollte eine Überexpression von transgener mRNA stellvertretend sein für die Menge an systemisch abgegebenem Genprodukt. Von den Mäusen, die sich in der PCR und im Northern Blot positiv zeigten, exprimierten die Tiere 2, 17 und 22 die größten Mengen an transgener mRNA und können auf Wirtszellen und Gewebe umfassendere biologische Effekte ausüben.

Beispiel 4 Biologische Aktivität von OPG

Fünf der transgenen Mäuse (Tiere 2, 11, 16, 17 und 28) und 5 Kontrolltiere desselben Wurfes (Tiere 1, 12, 15, 18 und 30) wurden unter Anwendung der folgenden Vorgehensweisen für eine Nekropsie und pathologische Analyse eingeschläfert: vor der Euthanasie wurden die Identifizierungsnummern sämtlicher Tiere überprüft, und anschließend wurden sie gewogen und einer Anästhesie und Blutabnahme zugeführt. Das Blut wurde sowohl als Serum als auch als Vollblut aufgehoben für eine vollständige chemische Serum- und Hämatologie-Panel-Untersuchung. Die Röntgenaufnahme erfolgte unmittelbar nach der abschließenden Anästhesie durch letale CO₂-Inhalation und vor der Dissektion. Hieran anschließend wurden die Gewebe entfernt und für eine histologische Untersuchung in 10% gepuffertem Zn-Formalin fixiert. Die gesammelten Gewebe umfaßten Leber, Milz, Bauch speicheldrüse, Magen, Zwölffingerdarm, Ileum, Colon, Niere, Fortpflanzungsorgane, Haut- und Brustdrüsen, Knochen, Gehirn, Herz, Lunge, Thymus, Luftröhre, Ösophagus, Schilddrüse, Jejunum, Zäkum, Rektum, Nebennieren, Harnblase und Skelettmuskel. Vor der Fixierung wurden die Gewichte der vollständigen Organe Leber, Magen, Niere, Nebennieren, Milz und Thymus ermittelt. Nach der Fixierung wurden die Gewebe zu Paraffinblöcken verarbeitet, und es wurden Schnitte mit einer Dicke von 3 µm erhalten. Das Knochengewebe wurde unter Verwendung einer Ameisensäurelösung entkalkt, und sämtliche Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Zusätzlich wurden bestimmte Gewebe durch Gomori-Silberimprägnation und Masson-Färbung gefärbt. Die enzymhistoche mische Untersuchung erfolgte, um die Expression der Tartrat resistenten sauren Phosphatase (TRAP) zu ermitteln, wobei es sich hier um ein Enzym handelt, welches von Osteoklasten, vielkernigen Knochen-resorbierenden Zellen der Monozyten-Makrophagen-Ab stammung, in hohem Maße exprimiert wird. Die immunhistochemische Untersuchungen in bezug auf BrdU und das Monozyten-Makrophagen-Oberflächenantigen F480 wurden ebenfalls durchgeführt, um replizierende Zellen bzw. Zellen der Monozyten-Makrophagen-Abstammung nachzuweisen. Um die Expression des Oberflächen antigens F480 nachzuweisen, wurden mit Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Schnitte mit einer Dicke von 4 µm entparaf finiert und mit entionisiertem Wasser hydratisiert. Die Schnitte wurden mit 3% Wasserstoffperoxid abgeschreckt, mit Protein-Block (Lipshaw, Pittsburgh, PA) blockiert und anschließend mit monoklonalem Anti-Maus F480 der Ratte inkubiert (Harlan, Indianapolis, IN). Dieser Antikörper wurde durch biotinylierte Anti-Ratten-Immunglobulin-Antikörper des Kaninchens und Per oxidase-konjugiertem Streptavidin (BioGenex San Ramon, CA) mit DAB als Chromagen nachgewiesen (BioTek, Santa Barbara, CA). Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt.

Bei der Dissektion und Beobachtung der viszeralen Gewebe wurden in den transgenen Expressoren und in den Kontrolltieren desselben Wurfes keine Abnormalitäten gefunden. Eine Analyse der Organge wichte zeigt, daß die Größe der Milz in den transgenen Mäusen gegenüber den Kontrollen um etwa 38% zunahm. Bei den transgenen Expressoren wurde eine leichte Vergrößerung der Thrombozyten sowie eine erhöhte Anzahl an zirkulierenden ungefärbten Zellen gefunden. Bei den transgenen Expressoren wurde ein marginales Absinken des Thrombozytenspiegels beobachtet. Zusätzlich tendier ten die Werte für Harnsäure, Harnstickstoff und alkalische Phosphatase im Serum der transgenen Expressoren nach unten. Man stellte fest, daß die Expressoren eine erhöhte Kontrastdichte des Skeletts aufwiesen, einschließlich Röhrenknochen (Oberschenkel), Wirbel und platte Knochen (Becken). Die relative Größe der Oberschenkel bei den Expressoren unterschied sich nicht von derjenigen bei Kontrollmäusen.

Eine histologische Analyse von gefärbten Knochenschnitten aus den OPG-Expressoren zeigt eine schwere Osteopetrose mit vorhandenen Knorpelüberresten aus der primären Spongiosa, die in den Knochentrabekel in der Diaphyse des Oberschenkels beobachtet wurde. In den Oberschenkelschnitten war ein klar definierter Kortex nicht identifizierbar. Bei normalen Tieren ist die zentrale Diaphyse mit Knochenmark gefüllt. Wirbelschnitte zeigen ebenfalls osteopetrotische Veränderungen, was bedeutet, daß die durch OPG induzierten Skelettveränderungen systemisch waren. Das restliche Knochenmark wies vorherrschend myeloische Elemente auf. Megakariozyten waren vorhanden. Die Retikulinfärbungen lieferten keine Anzeichen einer Retikulinablagerung. Die immunhisto chemische Untersuchung nach F480, einem Zelloberflächenantigen, welches von Zellen der Monozyten-Makrophagen-Abstammung in der Maus exprimiert wird, zeigte das Vorhandensein von F480-positiven Zellen in den Markhöhlen. Direkt neben den trabekulären Knochen oberflächen konnten fokale, abgeflachte, F480-positive Zellen nachgewiesen werden.

Die die Knochentrabekel beschichteten mesenchymalen Zellen waren abgeflacht und schienen inaktiv zu sein. Auf der Grundlage der H und TRAP-Färbungen wurden Osteoklasten auf den Oberflächen trabekulärer Knochen in den OPG-Expressoren nur in geringer Anzahl gefunden. Im Gegensatz dazu wurden in der Knorpel resorbierenden Wachstumszone Osteoklasten und/oder Chondroklasten beobachtet, wobei ihre Anzahl im Vergleich zu Kontrollen aber reduziert sein kann. Ferner waren auf der kortikalen Oberfläche der Metaphyse, wo die Umformungsaktivität gewöhnlich stark ausgeprägt ist, ebenfalls Osteoklasten vorhanden. Der vorherr schende Unterschied zwischen den Expressoren und den Kontroll tieren ist die ausgeprägte Abnahme der trabekulären Osteoklasten, sowohl in den Wirbeln als auch in den Oberschenkeln. Das Ausmaß der Knochenakkumulation war direkt korreliert mit der Menge an OPG-transgener mRNA, die durch Northern Blotting von Gesamt-RNA der Leber nachgewiesen wurde.

Die Milzorgane der OPG-Expressoren wiesen eine erhöhte Menge an roter Milzpulpa auf, wobei die Expansion auf einer gesteigerten Hämatopoese beruht. Sämtliche hämatopoetischen Abstammungen werden repräsentiert. F480-positive Zellen waren in der roten Milzpulpa von sowohl Kontrolltieren als auch von OPG-Expressoren vorhanden. Zwei der Expressoren (2 und 17) wiesen in der Leber Foci extramedulärer Hämatopoese auf, was wahrscheinlich auf das osteopetrotische Knochenmark zurückzuführen ist.

Es gab keine feststellbaren Abnormalitäten in dem Thymus, den Lymphknoten, dem Magen-Darm-Trakt, dem Pankreato-hepatobiliären Trakt, dem Respirationstrakt, dem Fortpflanzungssystem, dem urogenitalen System, der Haut, dem Nervensystem, dem Herzen und der Aorta, der Brust, dein Skelettmuskel und im Fett.

Beispiel 5 Isolierung von muriner und humaner OPG-cDNA

Ein mit dem 5′-Ende der murinen OPG-mRNA korrespondierender cDNA-Klon wurde mittels PCR-Ampifikation aus einer Mausnieren-cDNA-Bibliothek (Clontech) isoliert. Die Oligonukleotide wurden von der OPG-cDNA-Sequenz der Ratte abgeleitet und werden nachfolgend wiedergegeben:

Die anhand dieses Verfahrens erhaltenen partiellen und die vollständige Länge aufweisenden cDNA-Produkte wurden sequenziert. Das Produkt vollständiger Länge wurde mit NotI und XbaI verdaut und anschließend direktional in den Plasmidvektor pRcCMV (Invitrogen) kloniert. Das resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pRcCMV-Mu-OPG. Die Nukleotidsequenz des klonierten Produkts wurde mit der cDNA-Sequenz vom OPG der Ratte verglichen. Im Bereich der den OPG-LORF abdeckenden, 1300 bp umfassenden Region waren die DNA-Sequenzen der Ratte und der Maus ungefähr 88% identisch. Die cDNA-Sequenz der Maus enthielt einen 401 Aminosäuren umfassenden LORF, welcher im Vergleich zu der OPG-Proteinsequenz der Ratte eine Identität ohne Lücken von ∼94% aufwies. Dies zeigt, daß die isolierte cDNA-Sequenz der Maus für das murine OPG-Protein kodiert, und daß die Sequenz und Struktur während der Evolution im hohen Maße konserviert worden sind. Die OPG-Proteinsequenz der Maus enthält an seinem N-Terminus ein identisches putatives Signalpeptid, und sämtliche vier potentiel len Stellen einer N-verknüpften Glykosylierung sind konserviert.

Eine partielle humane OPG-cDNA wurde aus einer humanen Nieren-cDNA-Bibliothek unter Verwendung der folgenden Ratten-spezifi schen Oligonukleotide kloniert:

Dieses PCR-Produkt wurde sequenziert und für die Schaffung von Primern zur Amplifikation des 3′-Endes der humanen cDNA einge setzt, wobei als Template ein humaner genomischer OPG-Klon in Lambda verwendet wurde:

Das amplifizierte PCR-Produkt wurde sequenziert und zusammen mit der Sequenz des 5′-Endes zur Schaffung von human-spezifischen 5′- und 3′-Primermolekülen verwendet, die für die Amplifikation der vollständigen, für humanes OPG kodierenden cDNA-Sequenzen geeignet sind:

Das humane PCR-Produkt vollständiger Länge wurde sequenziert und anschließend unter Verwendung von NotI und XbaI direktional in den Plasmidvektor pRcCMV (Invitrogen) kloniert. Das resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pRcCMV-human OPG. Die Nukleo tidsequenz des klonierten Produkts wurde mit den cDNA-Sequenzen des Ratten- und Maus-OPGs verglichen. Im Bereich der den OPG-LORF abdeckenden, 1300 bp umfassenden Region waren die DNA-Sequenzen der Ratte und der Maus ungefähr 78-88% identisch mit der humanen OPG-cDNA. Die humane OPG-cDNA-Sequenz enthielt ebenfalls einen 401 Aminosäuren umfassenden LORF, welcher mit den Proteinsequen zen der Ratte und der Maus verglichen wurde. Das vorhergesagte humane OPG-Protein ist ungefähr zu 85% und zu 90% identisch mit den Proteinen der Ratte bzw. der Maus. Ein Sequenz-Alignment der Proteine der Ratte, der Maus und des Menschen zeigt, daß sie während der Evolution in hohem Maße konserviert worden sind. Das humane Protein weist nach Vorhersage ein N-terminales Signalpep tid sowie 5 potentielle Stellen einer N-verknüpften Glykosylie rung auf, von denen 4 unter den OPG-Proteinen der Ratte und der Maus konserviert sind.

Die DNA- sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz vom OPG der Maus ist in den Fig. 9A und 9B (SEQ ID NO: 122) dargestellt. Die DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenz von humanem OPG ist in den Fig. 9C und 9D (SEQ ID NO: 124) dargestellt. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen vom OPG der Ratte, der Maus und des Menschen ist in den Fig. 9E und 9F dargestellt.

Die Isolierung zusätzlicher humaner OPG-cDNA-Klone ergab die Existenz eines Basenaustauschs von G zu C an Position 103 der in Fig. 9C dargestellten DNA-Sequenz. Dieser Nukleotidaustausch führt an Position 3 der in Fig. 9C dargestellten Aminosäurese quenz zur Substitution eines Lysins durch ein Asparagin. Der Rest der Sequenz in Klonen mit diesem Austausch war identisch mit der in den Fig. 9C und 9D.

Beispiel 6 Entwicklung eines dreidimensionalen OPG-Strukturmodells

Der aminoterminale Bereich von OPG weist eine Homologie zu dem extrazellulären Bereich aller bekannten Mitglieder der TNFR-Superfamilie auf (Fig. IC). Das bedeutendste Motiv in dieser Region von TNFR-verwandten Genen ist eine ∼40 Aminosäuren umfassende, Cystein-reiche Wiederholungssequenz, die sich zu distinkten Strukturen faltet (Banner et al., Cell 73, 431-445 (1993)). Dieses Motiv tritt gewöhnlich in vier (Bereich 3-6) Tandem-Wiederholungen (siehe Fig. 1C) auf und ist bekanntermaßen an der Ligandenbindung beteiligt (Beutler und van Huffel, Science 264, 667-663 (1994)). Jede Wiederholung enthält gewöhnlich sechs voneinander entfernte Cysteinreste, die bei der Ausbildung dreier Disulfidbindungen mit der Bezeichnung SS1, SS2 und SS3 innerhalb der Domäne beteiligt sind (Banner et al., ibid.). Bei einigen Rezeptoren wie TNFR2, CD30 und CD40, enthalten einige der Wiederholungsdomänen lediglich zwei innerhalb der Kette vorhande ne Disulfidbindungen (SS1 und SS3).

Die humane OPG-Proteinsequenz wurde unter Anwendung von Verfahren gemäß Luethy et al., ibid., einem Alignment mit einem Profil der extrazellulären Domäne von TNFR1 unterzogen, und die Ergebnisse wurden unter Anwendung des PrettyPlot-Programms von Wisconsin Package, Version 8.1 (Genetics Computer Group, Madison, WI) graphisch dargestellt (Fig. 10). Das Alignment zeigt eine klare Konservierung von Cyteinresten, die bei der Bildung der Domä nen 1-4 involviert sind. Dieses Alignment wurde anschließend zur Schaffung eines dreidimensionalen (3-D) Modells der humanen, N-terminalen OPG-Domäne eingesetzt, wobei als Template die bekannte 3-D-Struktur der extrazellulären Domäne von p55 TNFR1 (Banner et al., ibid.) eingesetzt wurde. Hierfür wurden die Atomkoordinaten des Peptidrückgrats und der Seitenketten identischer Reste von den Kristallstrukturkoordinaten von TNFR1 kopiert. Hieran anschließend wurden die übrigen Koordinaten für die Insertionen und unterschiedlichen Seitenketten unter Anwendung des LOOK-Programms (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA) gene riert. Das 3-D-Modell wurde unter Anwendung von LOOK anschließend durch Minimierung seiner konformationellen Energie verfeinert.

Durch Analogie mit anderen Vertretern der TNFR-Familie wird davon ausgegangen, daß OPG an einen Liganden bindet. Für das Modelling der Interaktion zwischen OPG und seinem Liganden wurde die Kristallstruktur von TNF-β eingesetzt, um eine 3-D-Darstellung eines "OPG-Liganden" zu simulieren. Diese Daten wurden unter Anwendung von Molscript (Kraulis, J. Appl. Cryst. 24, 946-950, 1991) graphisch dargestellt (siehe Fig. 11). Ein Modell für den OPG/Liganden-Komplex mit 3 TNF-β- und 3 OPG-Molekülen wurde hergestellt, wobei die relativen Positionen von OPG in der Kristallstruktur mit TNFR1 identisch sind. Dieses Modell wurde anschließend eingesetzt, um die Reste von OPG aufzufinden, die mit seinem Liganden interagieren könnten, wobei der folgende Ansatz verfolgt wurde: Der für Lösungsmittel zugängliche Bereich sämtlicher Reste in dem Komplex und ein einzelnes OPG-Modell wurden berechnet. Die Reste, deren Zugänglichkeit sich im Komplex und im Monomer unterscheiden, interagieren wahrscheinlich mit dem Liganden.

Die Aminosäuresequenzen vom OPG des Menschen und der Maus wurden unter Verwendung dieser Information erneut einem Alignment zugeführt, um Sequenzen hervorzuheben, welche jede der Cystein-reichen Domänen 1-4 umfassen (Fig. 12A und 12B). Jede Domäne weist vorhersagbare individuelle Struktureigenschaften auf:

Domäne 1

Sie enthält 4 Cysteine, die an den SS2 (C41 bis C54)- und SS3 (C44 bis C62)-Disulfidbindungen beteiligt sind. Obgleich keine auf Disulfidbrücken basierende SS1-Bindung evident ist, ist das konservierte Tyrosin an Position 28 homolog zu Y20 in TNFR1, das bekanntermaßen bei der Interaktion mit H66 zur Unterstützung der Domänenbildung beteiligt ist. OPG weist an Position 75 ein homologes Histidin auf, was darauf hinweist, daß OPG Y28 und H75 im nativen Protein zusammengesetzt sind, wie es bei homologen Resten in TNFR1 der Fall ist. Demgemäß können tatsächlich beide dieser Reste für die biologische Aktivität wichtig sein, und N-terminale OPG-Verkürzungen bis zu und über Y28 hinaus können über eine veränderte Aktivität verfügen. Zusätzlich wird anhand unseres drei-dimensionalen Modells vorhergesagt, daß die Reste E34 und K43 mit einem gebundenen Liganden interagieren.

Domäne 2

Sie enthält 6 Cysteine und enthält vorhersagegemäß SS1 (C65 bis C80)-, SS2 (C83 bis C98)- und SS3 (C87 bis C105)-Disulfidbindun gen. Diese OPG-Region enthält ebenfalls eine sich von P66 bis Q91 erstreckende Region, die sich mit dem Teil der TNFR1-Domäne 2 in einem Alignment befindet, der einen engen Kontakt mit TNFβ ausbildet (siehe oben), und mit einem OPG-Liganden interagieren kann. Nach Vorhersage anhand unserer Strukturdaten interagieren insbesondere die Reste P66, H68, Y69, Y70, T71, D72, S73, H75, T76, S77, D78, E79, L81, Y82, P85, V86, K88, E89, L90 und Q91 mit einem gebunden Liganden.

Domäne 3

Sie enthält 4 Cysteine, die an SS1 (C107 bis C118)- und SS3 (C124 bis C142)-Disulfidbindungen, nicht aber an einer SS2-Bindung beteiligt sind. Nach Vorhersage anhand unserer Strukturdaten interagieren die Reste E115, L118 und K119 mit einem OPG-Liganden.

Domäne 4

Sie enthält ähnlich der Domäne 3 4 Cysteine, die an SS1 (C145 bis C160)- und SS3 (C166 bis C185)-Disulfidbindungen, nicht aber an einer SS2-Bindung beteiligt sind. Unsere Strukturdaten ergeben, daß E153 und S155 mit einem OPG-Liganden interagieren.

Demgemäß führt das vorhergesagte OPG-Strukturmodell zur Identifi zierung einer Reihe von hochkonservierten Resten, die für dessen biologische Aktivität wahrscheinlich wichtig sind.

Beispiel 7 Herstellung von rekombinanten, sezernierten OPG-Proteinen in Säugerzellen

Um festzustellen, ob OPG tatsächlich ein sezerniertes Protein ist, wurde die OPG-cDNA der Maus mit der humanen IgG1 Fc-Domäne als Tag fusioniert (Capon et al., Nature 337, 525-531 (1989)) und in humanen 293-Fibroblasten exprimiert. Die Fc-Fusionen erfolgten unter Verwendung des Vektors pFc-A3. pFc-A3 enthält die für den Fc-Teil der schweren Kette des humanen Immunglobulins IgG-γ1 kodierende Region (Ellison et al., ibid.) von der ersten Aminosäure der Gelenkdomäne (Glu-99) bis zum Carboxyterminus und ist flankiert von einer 5′-NotI-Fusionsstelle und 3′-SalI- und XbaI-Stellen. Das Plasmid wurde durch PCR-Amplifikation der humanen Milz-cDNA-Bibliothek (Clontech) hergestellt. Die PCR-Reaktionen erfolgten in einem Endvolumen von 100 µl unter Verwendung von 2 Einheiten Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs) in 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,8), 10 mM KCl, 10 µM (NH₄)2 SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100 mit 400 µM eines jeden dNTPs und 1 ng der zu amplifizierenden cDNA-Bibliothek zusammen mit 1 µM eines jeden Primers. Die Reaktionen wurden initiiert durch Denaturierung bei 95°C für 2 Minuten sowie durch an schließende 30 Zyklen bei 95°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 73°C für 2 Minuten. Der 5′-Primer

umfaßte eine NotI-Stelle unmittelbar 5′ vom ersten Rest (Glu-99) der Gelenkdomäne von IgG-γ1. Der 3′-Primer

umfaßte SalI- und XbaI-Stellen. Das 717 bp umfassende PCR-Produkt wurde mit NotI und SalI verdaut, mittels Elektrophorese in 1%iger Agarose (FMC Corp.) isoliert, durch das Geneclean-Verfahren (BIO 101, Inc.) gereinigt und in den mit NotI und SaII verdauten Vektor pBluescript II KS (Stratagene) kloniert. Das Insert des resultierenden Plasmids, pFc-A3, wurde sequenziert, um die Naturtreue der PCR-Reaktion zu bestätigen.

Die im Plasmid pRcCMV-MuOPG klonierte cDNA der Maus wurde unter Verwendung der folgenden beiden Sätze an Primerpaaren amplifi ziert:

Das erste Paar führt zur Amplifikation des gesamten OPG-LORF und zur Schaffung einer NotI-Restriktionsstelle, welche mit der im Leserahmen befindlichen NotI-Stelle im Fc-Fusionsvektor pFcA3 kompatibel ist. pFcA3 wurde hergestellt durch Etablierung einer NotI-Restriktionsstelle 5′ vom Asparaginsäurerest 216 der humanen IgG1 Fc-cDNA. Durch dieses Konstrukt wird ein Linker eingeführt, der für 2 irrelevante Aminosäuren kodiert, welche die Verbindung zwischen dem OPG-Protein und der IgG Fc-Region abdecken. Dieses Produkt würde im Falle der Verknüpfung mit dem Fc-Anteil für sämtliche 401 OPG-Reste und direkt anschließend sämtliche 227 Aminosäurereste der humanen IgG1 Fc-Region (F1.Fc) kodieren. Das zweite Primerpaar führt zur Amplifikation der DNA-Sequenzen, die für die ersten 180 Aminosäurereste von OPG kodieren, welche dessen putative Liganden-Bindungsdomäne umfassen. Wie oben ausgeführt, wird durch den 3′-Primer eine künstliche NotI-Restriktionsstelle geschaffen, die zur direkten Fusion des C-terminal verkürzten OPG-LORF an Position Threonin 180 mit der IgG1 Fc-Domäne (Sta.) führt.

Die Verknüpfungsstelle in der Aminosäuresequenz, an welcher der OPG-Rest 401 und der Asparaginsäurerest 221 der humanen Fc-Region verknüpft werden, kann wie folgt modifiziert werden: Die für die Reste 216-220 der humanen Fc-Region kodierende DNA kann wie nachfolgend beschrieben deletiert werden, oder der mit C220 der humanen Fc-Region korrespondierende Cysteinrest kann entweder zu Serin oder Alanin mutiert werden. Das durch diese modifizierten Vektoren kodierte OPG-Fc-Fusionsprotein kann zur Transfektion von humanen 293-Zellen oder von CHO-Zellen eingesetzt werden, und rekombinantes OPG-Fc-Fusionsprotein kann wie nachfolgend beschrieben gereinigt werden.

Beide Produkte wurden direktional in den Plasmidvektor pCEP4 (Invitrogen) kloniert. pCEP4 enthält den Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus und ist in der Lage zur episomalen Replikation in 293-EBNA-1-Zellen. Unter Anwendung der vom Hersteller empfohlenen Verfahren wurden der Muttervektor pCEP4 sowie die Vektoren pCEP4-F1.Fc und pCEP4-CT.Fc mittels Lipofektion in 293-EBNA-1-Zellen eingeführt. Die transfizierten Zellen wurden anschließend zur Auswahl den Vektor exprimierender Zellen einer Selektion in 100 µg/ml Hygromycin unterzogen, und die resultie renden Arzneimittel-resistenten Massenkulturen wurden bis zur Konfluenz kultiviert. Die Zellen wurden anschließend 72 Stunden lang in serumfreiem Medium kultiviert, und das konditionierte Medium wurde entfernt und mittels SDS-PAGE analysiert. Durch Silberfärbung des Polyacrylamidgels wurden die von den Arznei mittel-resistenten 293-Kulturen produzierten Hauptproteine des konditionierten Mediums nachgewiesen. In den durch pCEP4-F1.Fc und pCEP4-CT.Fc konditionierten Medien wurden einmalige Banden der vorhergesagten Größen in großem Umfang sekretiert (siehe Fig. 13B und 13C). Das Fc-Fusionsprotein vollständiger Länge akkumulierte in einer hohen Konzentration, wodurch angezeigt wird, daß es stabil sein kann. Beide Fc-Fusionsproteine wurden in Western Blots mit anti-human IgG1 Fc-Antikörpern (Pierce) nachgewiesen, wodurch gezeigt wird, daß sie rekombinante OPG-Produkte sind.

Die OPG-Fc-Fusionsproteine vollständiger Länge wurden nach den Empfehlungen des Herstellers mittels Protein-A-Säulenchromatogra phie (Pierce) gereinigt. Das Protein wurde anschließend einer N-terminalen Sequenzanalyse durch automatisierten Edman-Abbau im wesentlichen gemäß Darlegung von Matsudaira et al. (J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)) zugeführt. Nach 19 Zyklen wurde die folgende Aminosäuresequenz ermittelt:

Diese Sequenz war identisch mit der vorhergesagten, am Aminosäu rerest 22 beginnenden Aminosäuresequenz vom OPG der Maus, wodurch nahegelegt wird, daß sich die natürliche Säuger-Leader-Spalt stelle nicht, wie ursprünglich vorhergesagt, zwischen den Aminosäureresten Y31-D32, sondern zwischen Q21-E22 befindet. Die in 293-EBNA-Zellen mit pCEP4-F1.Fc und pCEP4-CT.Fc durchgeführten Expressionsexperimente zeigen, daß OPG ein sezerniertes Protein ist und systemisch die Bindung seines Liganden bewirken kann.

Ähnliche Verfahren, wie sie zur Herstellung und Expression der muOPG[22-180]-Fc- undmuOPG[2-401]-Fc-Fusionen angewendet werden, wurden für zusätzliche murine und humane OPG-Fc-Fusionsproteine eingesetzt.

Das Konstrukt einer Fusion der für die Aminosäuren 1-185 kodierenden murinen OPG-cDNA mit der Fc-Region von humanem IgG1 [muOPG Ct(185).Fc] wurde wie folgt geschaffen. Murine OPG-cDNA aus dem Plasmid pRcCMV Mu Osteoprotegerin (in Beispiel 5 beschrieben) wurde unter Verwendung des folgenden Primerpaares in einer Polymerasekettenreaktion wie oben beschrieben am plifiziert:

Dieses Primerpaar führt zur Amplifikation der für die Aminosäure reste 63-185 (korrespondierend mit bp 278-645) des in Fig. 9A dargestellten OPG-Leserahmens kodierenden Region der murinen OPG-cDNA. Der 3′-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, die mit der im Leserahmen befindlichen NotI-Stelle des Fc-Fusionsvektors pFcA3 kompatibel ist. Das Produkt deckt ferner eine am bp 436 lokalisierte einmalige EcoRI-Restriktionsstelle ab. Das am plifizierte PCR-Produkt wurde gereinigt, mit NotI und EcoRI gespalten, und das resultierende EcoRI-NotI-Restriktionsfragment wurde gereinigt. Der Vektor pCEP4 mit dem murinen 1-401 OPG-Fc-Fusionsinsert wurde mit EcoRI und NotI gespalten, gereinigt, und mit dem oben generierten PCR-Produkt ligiert. Der resultierende, auf pCEP4 basierende Expressionsvektor kodiert für die OPG-Reste 1-185, direkt gefolgt von sämtlichen 227 Aminosäureresten der humanen IgGl-Fc-Region. Der murine OPG 1-185.Fc-Fusionsvektor wurde mittels Transfektion in 293-Zellen eingeführt, bevor diese einer Arzneimittel-Selektion unterzogen wurden und das kon ditionierte Medium wie oben beschrieben produziert wurde. Das resultierende sekretierte murine OPG 1-185.Fc-Fusionsprodukt wurde nach den Empfehlungen des Herstellers mittels Protein-A-Säulenchromatographie (Pierce) gereinigt.

Das Konstrukt der Fusion der für die Aminosäurereste 1-194 kodierenden murinen OPG-DNA mit der Fc-Region von humanem IgG1 (muOPG Ct(194).Fc) wurde wie folgt geschaffen. Die OPG-cDNA der Maus von dem Plasmid pRcCMV Mu-Osteoprotegerin wurde unter Verwendung der folgenden Primerpaare amplifiziert:

Dieses Primerpaar führt zur Amplifikation der für die Aminosäure reste 70-194 (korrespondierend mit bp 298-672) des OPG-Lese rahmens kodierenden Region der murinen OPG-cDNA. Der 3′-Primer enthält eine NotI-Restriktionsstelle, die mit der im Leserahmen befindlichen NotI-Stelle des Fc-Fusionsvektors pFcA3 kompatibel ist. Das Produkt deckt ferner eine am bp 436 lokalisierte einmalige EcoRI-Restriktionsstelle ab. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde wie oben beschrieben in den murine OPG[1-401] Fc-Fusionsvektor kloniert. Der resultierende, auf pCEP4-basierende Expressionsvektor kodiert für die OPG-Reste 1-194, direkt gefolgt von sämtlichen 227 Aminosäureresten der humanen IgG1 Fc-Region. Der murine OPG 1-194.Fc-Fusionsvektor wurde mittels Transfektion in 293-Zellen eingeführt, bevor eine Arzneimittel-Selektion erfolgte und das konditionierte Medium produziert wurde. Das resultierende sekretierte Fusionsprodukt wurde nach den Empfeh lungen des Herstellers mittels Protein-A-Säulenchromatographie (Pierce) gereinigt.

Das Konstrukt der Fusion der für die Aminosäuren 1-401 kodieren den humanen OPG-DNA mit der Fc-Region von humanem IgG1 wurde wie folgt geschaffen. Die humane OPG-DNA im Plasmid pRcCMV-hu Osteoprotegerin (in Beispiel 5 beschrieben) wurde unter Ver wendung der folgenden Oligonukleotidprimer amplifiziert:

Das resultierende PCR-Produkt kodiert für das humane OPG-Protein vollständiger Länge und schafft eine NotI-Restriktionsstelle, die mit der im Leserahmen befindlichen NotI-Stelle des Fc-Fusions vektors FcA3 kompatibel ist. Das PCR-Produkt wurde wie oben beschrieben direktional in den Plasmidvektor pCEP4 kloniert. Der resultierende Expressionsvektor kodiert für die Reste 1-401 von humanem OPG, direkt gefolgt von 227 Aminosäureresten der humanen IgG1 Fc-Region. Konditioniertes Medium von transfizierten und Arzneimittel-selektierten Zellen wurde produziert, und das huOPG F1.Fc-Fusionsprodukt wurde nach den Empfehlungen des Herstellers mittels Protein-A-Säulenchromatographie (Pierce) gereinigt.

Das Konstrukt der Fusion der für die Aminosäurereste 1-201 kodierenden humanen OPG-DNA mit der Fc-Region von humanem IGg1 [huOPG Ct(201).Fc] wurde wie folgt geschaffen. Die klonierte humane OPG-cDNA des Plasmids pRrCMV-hu Osteoprotegerin wurde mittels PCR unter Verwendung des folgenden Oligonukleotid-Primerpaares amplifiziert:

Dieses Primerpaar führt zur Amplifikation der für die Aminosäure reste 1-201 des OPG-Leserahmens kodierenden Region der humanen OPG-cDNA und schafft am 3′-Ende eine NotI-Restriktionsstelle, die mit der im Leserahmen befindlichen NotI-Stelle des Fc-Fusions vektors FcA3 kompatibel ist. Dieses Produkt kodiert im Falle der Verknüpfung mit dem Fc-Anteil für die OPG-Reste 1-201, direkt gefolgt von sämtlichen 221 Aminosäureresten der humanen IgG1 Fc-Region. Das PCR-Produkt wurde wie oben beschrieben direktional in den Plasmidvektor pCEP4 kloniert. Konditioniertes Medium von transfizierten und Arzneimittel-selektierten Zellen wurde produziert, und die hu OPG Ct( 201).Fc-Fusionsprodukte wurden nach dem Empfehlungen des Herstellers mittels Protein-A-Säulen chromatographie (Pierce) gereinigt.

Die folgenden Vorgehensweisen wurden zur Herstellung und Expression von unfusioniertem murinen und humanen OPG angewendet.

Ein Plasmid für die Expression von murinem OPG vollständiger Länge (Reste 1-401) in Säugern wurde geschaffen durch PCR-Amplifikation des murinen OPG-cDNA-Inserts von pRcCMV Mu-Osteoprotegerin und Suklonierung in den Expressionsvektor pDSRα (DeClercket al., J. Biol. Chem. 266, 3893 (1991)). Die folgenden Oligonukleotidprimer wurden eingesetzt:

Der Leserahmen für murines OPG vollständiger Länge wurde mittels PCR wie oben beschrieben amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und entsprechend den Empfehlungen des Herstellers mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und XbaI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) gespalten und anschließend mit mittels HindIII und XbaI gespaltenem pDSRa ligiert. Der Nachweis rekombinanter Klone erfolgte durch Spaltung mit Restriktions endonukleasen und anschließende Sequenzierung, um sicherzustel len, daß während der PCR-Amplifikation keine Mutationen produ ziert wurden.

Das resultierende Plasmid pDSRα-muOPG wurde durch Calcium vermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 11, 233 (1977)) in Chinesische Hamster Ovary (CHO)-Zellen eingeführt. Individuelle Kolonien wurden auf der Grundlage der Expression des Dihydrofola treduktase (DHFR)-Gens im Plasmidvektor selektiert, und mehrere Klone wurden isoliert. Die Expression des murinen, rekombinanten OPG-Proteins wurde überwacht durch Western Blot-Analyse des von CHO-Zellen konditionierten Mediums. Hochexprimierende Zellen wurden ausgewählt, und die Expression von OPG wurde weiter amplifiziert durch Behandlung mit Methotrexat wie dargelegt (DeClerck et al., ibid.). Von CHO-Zellinien konditioniertes Medium wurde produziert zur weiteren Aufreinigung des rekom binanten, sekretierten, murinen OPG-Proteins.

Ein Plasmid für die Expression von humanem OPG vollständiger Länge (Aminosäuren 1-401) in Säugern wurde generiert durch Subklonieren des cDNA-Inserts von pRcCMV-hu Osteoprotegerin direkt in den Vektor pDSRα (DeClerck et al., ibid.). Das Plasmid pRcCMV-OPG wurde vollständig mit NotI gespalten, mit Klenow glattendig gemacht und anschließend vollständig mit XbaI verdaut. Die Vektor-DNA wurde mit HindIII gespalten, mit Klenow glattendig gemacht und anschließend mit XbaI verdaut, bevor sie mit dem OPG-Insert ligiert wurde. Rekombinante Plasmide wurden anschließend sequenziert, um die korrekte Orientierung der humanen OPG-cDNA zu bestätigen.

Das resultierende Plasmid pDSRα-huOPG wurde wie oben beschrieben in Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen eingeführt. Individuelle Kolonien wurden auf der Grundlage der Expression des Dihydrofola treduktase (DHFR)-Gens im Plasmidvektor selektiert, und mehrere Klone wurden isoliert. Die Expression des humanen, rekombinanten OPG-Proteins wurde durch Western Blot-Analyse des von CHO-Zellen konditionierten Mediums überwacht. Hochexprimierende Klone wurden ausgewählt, und die Expression von OPG wurde weiter amplifiziert durch Behandlung mit Methotrexat. Das von humanes OPG exprimie renden CHO-Zellinien konditionierte Medium wurde für die Protein reinigung produziert.

Die Herstellung von Expressionsvektoren für die für murines OPG kodierenden Reste 1-185 wurde wie folgt durchgeführt. Murine OPG-cDNA von pRcCMV-Mu OPG wurde unter Verwendung der folgenden Oligonukleotidprimer amplifiziert:

Dieses Primerpaar führt zur Amplifikation der für die Aminosäuren 63-185 des OPG-Leserahmens (bp 278-645) kodierenden Region der murinen OPG-cDNA und enthält ein künstliches Stopkodon direkt nach dem Cysteinkodon (C185), dem eine künstliche SalI-Restrik tionsendonukleasestelle folgt. Das vorhergesagte Produkt enthält eine für die Subklonierung in einen bereits existierenden Vektor geeignete interne EcoRI-Restriktionsstelle. Nach der PCR-Amplifikation wurde das resultierende gereinigte Produkt mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und SalI gespalten, und das große Fragment wurde durch Verwendung eines Gels gereinigt. Das gereinigte Produkt wurde anschließend in das große Restriktions fragment aus einem Verdau des oben beschriebenen pBluescript-muOPG F1.Fc mit EcoRI und SalI subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit HindIII und XhoI verdaut, und das kleine Fragment wurde durch Verwendung eines Gels gereinigt. Dieses Fragment, welches einen offenen Leserahmen enthält, der für die Reste 1-185 kodiert, wurde anschließend in den mit HindIII und XhoI verdauten Expressionsvektor pCEP4 subkloniert. Der resultie rende Vektor pmuOPG [1-185] kodiert für ein verkürztes OPG-Polypeptid, das an dem an Position 185 lokalisierten Cysteinrest endet. Das von transfizierten und Arzneimittel-selektierten Zellen konditionierte Medium wurde wie oben beschrieben produ ziert.

Dieses Primerpaar führt zur Amplifikation der für die Aminosäuren 70-194 des OPG-Leserahmens (bp 298-672) kodierenden Region der murinen OPG-cDNA und enthält ein künstliches Stopkodon direkt nach dem Lysinkodon (K194), dem eine künstliche SaII-Restrik tionsendonukleasestelle folgt. Das vorhergesagte Produkt enthält eine zur Subklonierung in einen bereits existierenden Vektor geeignete interne EcoRI-Restriktionsstelle. Nach der PCR-Amplifikation wurde das resultierende gereinigte Produkt mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und SalI gespalten, und das große Fragment wurde durch Verwendung eines Gels gereinigt. Das gereinigte Produkt wurde anschließend in das große Restriktions fragment eines Verdaus des oben beschriebenen pBluescript-muOPG F1.Fc mit EcoRI und SalI subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit HindIII und XhoI verdaut, und das kleine Fragment wurde durch Verwendung eines Gels gereinigt. Dieses Fragment, welches einen offenen Leserahmen enthält, der für die Reste 1-185 kodiert, wurde anschließend in den mit HindIII und XhoI verdauten Expressionsvektor pCEP4 subkloniert. Der resultierende Vektor pmuOPG [1-185] kodiert für ein verkürztes OPG-Polypeptid, das an einem Lysin an Position 194 endet. Das von transfizierten und Arzneimittel-selektierten Zellen konditionierte Medium wurde wie oben beschrieben produziert.

Mehrere Mutationen wurden am 5′-Ende des Gens huOPG [22-401]-Fc generiert, wodurch zwischen den Resten 22 bis 32 von OPG entweder Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen eingeführt werden. Sämtliche Mutationen wurden unter Anwendung der vom Hersteller empfohlenen Bedingungen mit dem "QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene, San Diego, CA) generiert. Kurz ausgedrückt, wurde die plasmidäre DNA huOPG [22-401]-Fc als Template und mutagene Primer enthaltende Reaktionsmischung in Gegenwart von Desoxynukleotiden mit Pfu-Polymerase behandelt und anschließend wie oben ausgeführt in einem Thermocycler am plifiziert. Ein Aliquot der Reaktion wird anschließend zur Transformation von kompetenten E. coli XL1-Blue durch Hitzeschock eingesetzt, bevor ausplattiert wurde. Die plasmidäre DNA von Transformanten wurde anschließend sequenziert, um Mutationen zu bestätigen.

Die folgenden Primerpaare wurden eingesetzt, um die Reste 22-26 des humanen OPG-Gens zu deletieren, was zur Produktion eines huOPG [27-401]-Fc-Fusionsproteins führt:

Die folgenden Primerpaare wurden eingesetzt, um die Reste 22-28 des humanen OPG-Gens zu deletieren, was zur Produktion eines huOPG [29-401]-Fc-Fusionsproteins führt:

Die folgenden Primerpaare wurden eingesetzt, um die Reste 22-31 des humanen OPG-Gens zu deletieren, was zur Produktion eines huOPG [32-401]-Fc-Fusionsproteins führt:

Die folgenden Primperpaare wurden eingesetzt, um das Kodon des humanen OPG-Gens für den Tyrosinrest 28 durch ein solches für Phenylalanlin auszutauschen, was zur Produktion eines huOPG [22-401]-Fc-Y28F-Fusionsproteins führt:

Die folgenden Primperpaare wurden eingesetzt, um das Kodon des humanen OPG-Gens für den Prolinrest 26 durch ein solches für Alanin auszutauschen, was zur Produktion eines huOPG [22-401]-Fc-P26A-Fusionsproteins führt:

Jedes resultierende, die geeignete Mutation enthaltende muOPG [22-401]-Fc-Plasmid wurde anschließend zur Transfektion von humanen 293-Zellen eingesetzt, und das mutante OPG-Fc-Fusions protein wurde aus dem konditionierte Medium wie oben beschrieben gereinigt. Die biologische Aktivität eines jeden Proteins wurde durch Anwendung des in Beispiel 11 beschriebenen in vitro-Assays zur Osteoklastenbildung analysiert.

Beispiel 8 Expression von OPG in E. coli A. Bakterielle Expressionsvektoren pAMG21

Das Expressionsplasmid pAMG21 kann von dem Amgen-Expressions vektor pCFM1656 (ATCC #69576) abgeleitet werden, welcher wiederum abgeleitet werden kann vom Amgen-Expressionsvektorsystem, das im US-Patent Nr. 4 710 473 beschrieben ist. Das Plasmid pCFM1656 kann abgeleitet werden vom beschriebenen Plasmid pCFM836 (Patent Nr. 4 710 473) durch: (a) Zerstörung der beiden endogenen NdeI-Restriktionsstellen durch Auffüllen der Enden mit dem Enzym T4-Polymerase und anschließende Ligation glatter Enden; (b) Austausch der DNA-Sequenz zwischen den einmaligen AatII- und ClaI-Restriktionsstellen, die den synthetischen P_L-Promotor enthalten, durch ein ähnliches Fragment, das erhalten wurde von pCFM636 (Patent Nr. 4 710 473) enthaltend den PL-Promotor

und anschließendes (c) Substituieren der kleinen DNA-Sequenz zwischen den einmaligen ClaI- und KpnI-Restriktionsstellen durch das folgende Oligonukleotid:

Das Expressionsplasmid pAMG21 kann anschließend abgeleitet werden von pcFM1656 durch Schaffung einer Reihe von ortsspezifischen Basenaustauschen durch PCR-überlappende Oligomutagenese und DNA-Sequenzsubstitutionen. Beginnend mit der BglII-Stelle (Plasmid bp #180) unmittelbar 5, vom Plasmid-Replikationspromotor PcopB und voranschreitend in Richtung der Replikationsgene des Plasmids sind die Basenpaaraustausche wie folgt:

Die DNA-Sequenz zwischen den einmaligen AatII (Position # 4364 in pCFM1656)- und SacII (Position #4585 in pCFM1656)-Restrik tionsstellen wird substituiert mit der folgenden DNA-Sequenz:

Während der Ligation der klebrigen Enden dieser Substitutions-DNA-Sequenz werden die außen befindlichen AatII- und SacII-Stellen zerstört. In der substituierten DNA gibt es einmalige AatII- und SacII-Stellen.

pAMG22-His

Das Expressionsplasmid pAMG22-His kann von dem Amgen-Expressions vektor pAMG22 abgeleitet werden durch Substitution der kleinen DNA-Sequenz zwischen den einmaligen NdeI (# 4795)- und EcoRI (# 4818)-Restriktionsstellen von pAMG22 mit dem folgenden Oligonu kleotid-Duplex:

pAMG22

Das Expressionsplasmid pAMG22 kann abgeleitet werden vom Amgen-Expressionsvektor pCFM1656 (ATCC #69576), der wiederum vom Amgen-Expressionsvektorsystem gemäß Darlegung im am 1. Dezember 1987 erteilten US-Patent Nr. 4 710 473 abgeleitet werden kann. Das Plasmid pcFM1656 kann abgeleitet werden von dem beschriebenen Plasmid pCFM836 (Patent Nr. 4 710 473) durch: (a) Zerstörung der beiden endogenen NdeI-Restriktionsstellen durch Auffüllen der Enden mit dem Enzym T4-Polymerase und nachfolgende Ligation glatter Enden; (b) Austausch der den synthetischen PL-Promotor enthaltenden DNA-Sequenz zwischen den einmaligen AatII- und ClaI-Restriktionsstellen durch ein ähnliches Fragment, erhalten von pCFM636 (Patent Nr. 4 710 473) enthaltend den PL-Promotor

und anschließendes (c) Substituieren der kleinen DNA-Sequenz zwischen den einmaligen ClaI- und KpnI-Restriktionsstellen mit dem folgenden Oligonukleotid:

Das Expressionsplasmid pAMG22 kann anschließend abgeleitet werden von pCFM1656 durch Schaffung einer Reihe von ortsspezifischen Basenaustauschen durch PCR-überlappende Oligomutagenese und DNA-Sequenzsubstitutionen. Beginnend mit der BglII-Stelle (Plasmid bp # 180) unmittelbar 5′ vom Replikationspromotor PcopB des Plasmids und voranschreitend in Richtung der Replikationsgene des Plasmids sind die Basenpaaraustausche wie folgt:

Die DNA-Sequenz zwischen den einmaligen AatII (Position #4364 in pCFM1656)- und SacII (Position #4585 in pCFM1656)-Restriktions stellen wird substituiert mit der folgenden DNA-Sequenz:

B. Human OPG Met[32-401]

In dem Beispiel war der verwendete Expressionsvektor pAMG21, ein Derivat von pCFM1656 (ATCC-Zugriffsnummer 69576), welcher für die Insertion von Genen stromabwärts des lux PR-Promotors geeignete Restriktionsstellen enthält. (Zur Beschreibung des lux-Ex pressionssystems, siehe US-Patent Nr. 5 169 318). Die eingesetzte Wirtszelle war GM120 (ATCC-Zugriffsnummer 55764). Dieser Wirt besitzt den Promotor lacIQ und das Gen lacI integriert in eine zweite Stelle im Wirtschromosom eines prototrophen E. coli K12-Wirtes. Andere, üblicherweise eingesetzte E. coli-Expressions vektoren und Wirtszellen sind für die Expression ebenfalls geeignet.

Eine für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 32-401 des humanen OPG-Polypeptids kodierende DNA-Sequenz wurde in den Plasmid-Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt plaziert. Hierfür wurde eine PCR unter Verwendung der Oligonukleotide #1257-20 und #1257-19 als Primer durch geführt, wobei als Template plasmidäre pRcCMV-Hu OPG-DNA, die die humane OPG-cDNA enthält, eingesetzt und ein Thermocycling über 30 Zyklen durchgeführt wurde, wobei jeder Zyklus umfaßte: 94°C für 20 Sekunden, gefolgt von 30 Sekunden bei 37°C, gefolgt von 30 Sekunden bei 72°C. Die resultierende PCR-Probe wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt, das PCR-Produkt wurde ausge schnitten, gereinigt, mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und BamHI restringiert und gereinigt. Die synthetischen Oligonukleo tide #1257-21 und #1257-22 wurden unter Verwendung von T4 Polynukleotid-Kinase und ATP einzeln phosphoryliert und an schließend miteinander vermischt sowie auf 94°C erhitzt, bevor man sie langsam auf Raumtemperatur abkühlen ließ, um einen Oligonukleotid-Linker-Duplex zu bilden, der klebrige NdeI- und KpnI-Enden enthält. Der phosphorylierte Linker-Duplex, gebildet zwischen den die klebrigen NdeI- und KpnI-Enden enthaltenden Oli gonukleotide #1257-21 und #1257-22 (siehe Fig. 14A), und das mit KpnI und BamHI verdaute und gereinigte, unter Verwendung der Oligoprimer #1257-20 und #1257-19 generierte gereinigte PCR-Produkt (siehe oben) wurde direktional zwischen zwei Stellen des Plasmidvektors pAMG21 insertiert, nämlich der NdeI-Stelle und der BamHI-Stelle, wobei Standardverfahren der rekombinanten DNA-Technologie angewendet wurden (siehe Fig. 14A und nachfolgende Sequenzen). Der synthetische Linker nutzte E. coli-Kodons und stellte ein N-terminales Methionin bereit.

Zwei Klone wurden ausgewählt und die plasmidäre DNA wurde isoliert, und das humane OPG-Insert wurde hinsichtlich seiner DNA-Sequenz anschließend bestätigt. Das resultierende Plasmid pAMG21, das die Aminosäuren 32-401 des humanen OPG-Polypeptids enthält, und dem unmittelbar vorher im Leserahmen ein Methionin vorausgeht, wird bezeichnet mit pAMG21-huOPG met[32-401] oder pAMG21-huOPG met[32-401].

Kulturen von pAMG21-huOPG met[32-401] in E. coli GM120 wurden in 20 µg/ml Kanamycin enthaltendem 2X YT-Medium vor der Induktion bei 30°C inkubiert. Die Induktion der Expression des huOPG met[32-401]-Genprodukts vom Promotor luxPR wurde erreicht im Anschluß an die Zugabe des synthetischen Autoinduktionsmittels N-(3-Oxohexanoyl)-DL-homoserinlacton zum Kulturmedium in einer Endkonzentration von 30 ng/ml sowie durch Inkubation der Kulturen für weitere 6 Stunden bei entweder 30°C oder 37°C. Nach 6 Stunden wurden die bakteriellen Kulturen mikroskopisch auf die Anwesenheit von Einschlußkörpern untersucht und anschließend durch Zentrifugation pelletiert. In induzierten Kulturen wurden refraktäre Einschlußkörper beobachtet, was darauf hinweist, daß eine gewisse Menge des rekombinanten huOPG met[32-401]-Gen produkts in E. coli in unlöslicher Form produziert wurde. Einige bakterielle Niederschläge wurden in 10 mM Tris-HCl/pH-Wert 8, 1 mM EDTA resuspendiert und direkt lysiert durch Zugabe von 2X Laemlli-Probenpuffer auf eine Endkonzentration von IX und von β-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 5%, bevor mittels SDS-PAGE analysiert wurde. Gegenüber der Spur 2 eines SDS-PAGE-Gels, in der sich ein Gesamt-Zellysat einer bei 30°C nicht induzierten Kultur befand, wurde in einem Bereich des Gels, der Gesamt-Zellysate von bei 30°C und bei 37°C induzierten Kulturen enthielt, eine wesentlich intensiver mit Coomassieblau gefärbte Bande von ungefähr 42 kD beobachtet (Fig. 14B). Das erwartete Genprodukt würde eine Länge von 370 Aminosäuren und ein erwarte tes Molekulargewicht von etwa 42,2 kD aufweisen. Im Anschluß an die Induktion bei 37°C für eine Zeitdauer von 6 Stunden wurde eine zusätzliche Kultur pelletiert und entweder zur Isolierung von Einschlußkörpern (siehe unten) oder durch Mikrofluidisation weiterverarbeitet. Der für die Mikrofluidisation aufbereitete Niederschlag wurde in 25 mM Tris-HCl/pH-Wert 8, 0,5 M NaCl-Puffer resuspendiert und 20-mal durch einen Microfluidizer Model 1108 (Microfluidics Corp.) geleitet und gesammelt. Ein Aliquot der gesammelten Probe (mikrofluidisiertes Gesamtlysat) wurde entnommen, und der Rest wurde 20 Minuten lang bei 20 000 × g sedimentiert. Im Anschluß an die Zentrifugation wurde der Überstand entfernt (mikrofluidisierte lösliche Fraktion), und der Niederschlag wurde in einer Lösung von 25 mM Tris-HCl/pH-Wert 8, 0,5 M NaCl, 6 M Harnstoff resuspendiert (mikrofluidisierte unlösliche Fraktion). Einem Aliquot entweder der löslichen oder unlöslichen Gesamtfraktion wurden ein gleiches Volumen 2X Laemlli-Probenpuffer und β-Mercaptoethanol in einer Endkonzen tration von 5% zugegeben. Die Proben wurden anschließend durch SDS-PAGE analysiert. In der unlöslichen Fraktion war offenbar eine signifikante Menge an rekombinantem huOPG met[32-401]-Genprodukt vorhanden. Für die Aufreinigung des rekombinanten Proteins wurden die Einschlußkörper wie folgt gereinigt:
Bakterielle Zellen wurden vom Medium abgetrennt durch eine 15 Minuten lange Dichtegradientenzentrifugation in einer mit einem JS-4.2-Rotor ausgerüsteten Beckman J-6B-Zentrifuge mit 4900 × g bei 4°C. Das bakterielle Sediment wurde in 5 ml Wasser resuspendiert und anschließend mit Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml verdünnt. Diese Suspension wurde in ein auf Eis gekühltes Edelstahlgefäß überführt und unter Verwendung eines mit einer Standardspitze ausgestatteten Sonifiziergerätes von Branson einem Sonifikationsaufschluß zugeführt (Leistungseinstellung = 5, Arbeitszyklus = 95%, 80 Bursts). Die sonifizierte Zellsuspension wurde 5 bis 10 Minuten lang bei 23 °C in einer mit einem TLA 100.3-Rotor ausgerüsteten Ultrazentrifuge des Typs Optima TLX von Beckman bei 195 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und der Niederschlag wurde mit einem Wasserstrom aus einer Spritzflasche gespült. Die Niederschläge wurden durch Abschaben mit einem Mikrospachtel gesammelt und in einen gläsernen Homogenisator überführt (15 ml Kapazität). Dem Homogenisator wurden 5 ml Percoll-Lösung (75% flüssiges Percoll, 0,15 M Natriumchlorid) zugegeben, und der Inhalt wurde bis zum Erhalt einer gleichförmigen Suspension homogenisiert. Das Volumen wurde durch Zugabe von Percoll-Lösung auf 19,5 ml erhöht, vermischt und in 3 Quick-Seal-Röhrchen von Beckman (13 × 32 mm) aufgeteilt. Die Röhrchen wurden nach den Empfehlungen des Herstellers verschlossen. Die Röhrchen wurden 30 Minuten lang in einem TLA 100.3-Rotor von Beckman bei 23°C mit 20 000 UpM (21 600 × g) zentrifugiert. Die Röhrchen wurden hinsichtlich geeigneter Bandierungsmuster untersucht. Zur Rückgewinnung der refraktären Einschlußkörper wurden die Gradientenfraktionen rückgewonnen und vereinigt und anschließend mit Wasser verdünnt. Die Einschlußkörper wurden durch Zentrifugation sedimentiert, und die Proteinkonzentration wurde nach einer SDS-PAGE ermittelt.

Ein Aliquot der wie nachfolgend beschrieben isolierten Ein schlußkörper wurde in 1X Laemlli-Probenpuffer mit 5% β-Mercapto ethanol gelöst und in einem SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, und die isolierten Einschlußkörper liefern ein hochgereinigtes rekom binantes huOPG [32-401]-Genprodukt. Die nach Auftrennung der Einschlußkörper in einem SDS-Polyacrylamidgel beobachtete Hauptbande von 42 kD wurde aus einem getrennten Gel ausge schnitten, und die Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz erfolgte im wesentlichen wie beschrieben (Matsudaira et al., J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). Nach 19 Zyklen wurde die folgende Sequenz bestimmt:

Es wurde gefunden, daß diese Sequenz identisch ist mit den ersten 19 Aminosäuren, die von dem Expressionsvektor pAMG21 Hu-OPG met[32-401] kodiert und von einem durch den bakteriellen Ex pressionsvektor bereitgestellten Methioninrest produziert wurden.

C. Human OPG met[32-401]

Eine für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 22 bis 401 von humanem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde wie folgt in einen prokaryontischen Plasmid-Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR eingebracht. Die isolierte plasmidäre DNA von pAMG21-huOPG met[32-401] (siehe Abschnitt B) wurde mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und BamHI gespalten, und die resultierenden Fragmente wurden in einem Agarosegel aufgetrennt. Unter Anwendung von Standardtechniken wurde das B-Fragment (Fragment mit 1064 bp) aus dem Gel isoliert. Syn thetische Oligonukleotide (Oligos) #1267-06 und #1267-07 wurden einzeln phosphoryliert und man ließ sie unter Anwendung von in Abschnitt B beschriebenen Verfahren einen Oligo-Linker-Duplex ausbilden, welcher klebrige NdeI- und KpnI-Enden enthielt. Der synthetische Linker-Duplex nutzte E. coli-Kodons und lieferte ein N-terminales Methionin. Der phosphorylierte Oligo-Linker, der kohäsive NdeI- und KpnI-Enden enthält, und das aus dem mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und BamHI verdauten Plasmid pAMG21-huOPG met [32-401] isolierte Fragment mit 1064 bp wurden unter Anwendung von üblichen Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie direktional zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen von pAMG21 insertiert. Die Ligationsmischung wurde durch Elek troporation unter Anwendung des Protokolls der Lieferfirma zur Transformation von E. coli 393-Wirtszellen verwendet. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und die DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens huOPG-met[22-401] zu bestätigen.

Kulturen der E. coli-393-Wirtszellen mit pAMG21-huOPG-met[22-401] wurden in 20 µg/ml Kanamycin enthaltendes 2X YT-Medium überführt und vor der Induktion bei 30°C inkubiert. Die Induktion der Expression des rekombinanten Genprodukts vom Promotor luxPR des Vektors pAMG21 wurde erreicht durch Zugabe des synthetischen Autoinduktionsmittels N-(3-Oxohexanoyl)-DL-homoserinlacton zum Kulturmedium in einer Endkonzentration von 30 ng/ml und durch Inkubation für weitere 6 Stunden bei entweder 30°C oder 37°C. Nach 6 Stunden wurden die bakteriellen Kulturen durch Zen trifugation sedimentiert (= 30°C I+6 oder 37°C I+6). Die bakteriellen Kulturen wurden ebenfalls entweder kurz vor der Induktion (= 30°C PräI) sedimentiert, oder alternativ wurde einer getrennten Kultur, die man für weitere 6 Stunden zum Erhalt einer nicht-induzierten (UI)-Kultur bei 30 °C inkubierte (= 30°C UI), kein Autoinduktionsmittel zugegeben. Die bakteriellen Sedimente der Kulturen 30°C PräI, 30°C UI, 30°C I+6 oder 37°C I+6 wurden resuspendiert, lysiert und mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gemäß Darlegung in Abschnitt B analy siert. Die Polyacrylamidgele wurden entweder mit Coomassieblau gefärbt und/oder für einen Western Blot auf Nitrocellulose überführt und einer Immunreaktion mit polyklonalem Anti-muOPG-Fc-Antikörper des Kaninchens gemäß Darlegung in Beispiel 10 ausgesetzt. Die Menge an Genprodukt nach der Induktion wurde entweder mit einer nicht-induzierten (30°C UI) oder einer Präinduktions (30°C PräI)-Probe verglichen.

D. Murine OPG met [22-401]

Eine für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 22 bis 401 des murinen (mu) OPG (OPG)-Polypeptids kodierende DNA-Sequenz wurde in einen prokaryontischen Plasmid-Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Unter Anwendung der in Abschnitt B beschriebenen thermocyclischen Bedingungen wurde eine PCR durchgeführt, bei der die Oligonukleo tide #1257-16 und #1257-15 als Primer und plasmidäre pRcCMV-Mu-OPG-DNA als Template eingesetzt wurden. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und BamHI gemäß Darlegung in Abschnitt B gespalten. Die synthetischen Oligos #1260-61 und #1260-82 wurden einzeln phosphoryliert, und man ließ sie unter Anwendung von in Abschnitt B beschriebenen Verfahren einen Oligo-Linker-Duplex mit kohäsiven NdeI- und KpnI-Enden ausbilden. Der synthetische Linker-Duplex nutzte E. coli-Kodons und lieferte ein N-terminales Methionin. Der zwischen den kohäsive NdeI- und KpnI-Enden aufweisenden Oligos #1260-61 und #1260-82 gebildete phosphorylierte Linker-Duplex und das unter Verwendung der Oligoprimer #1257-16 und #1257-15 generierte, mit KpnI und BamHI verdaute und gereinigte PCR-Produkt wurden unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen von pAMG21 insertiert. Die Ligationsmischung wurde zur Transformation durch Elektroporation nach den Angaben der Lieferfirma in E. coli-393-Wirtszellen eingeführt. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und die DNA- Sequenzierung erfolgte, um die DNA-Sequenz des Gens MuOPG met[22-401] zu bestätigen.

Die Bestimmung der Expression des rekombinanten Polypeptids muOPG met[22-401] aus Kulturen von 393-Zellen mit dem Plasmid pAMG21-MuOPG met[22-401] nach Induktion erfolgte unter Anwendung der im Abschnitt C beschriebenen Verfahren.

E. Murine OPG met[32-401]

Eine für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 32 bis 401 von murinem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde in einen prokaryontischen Plasmid-Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Hierfür wurden die synthetischen Oligos #1267-08 und #1267-09 unter Anwendung von in Abschnitt B beschriebenen Verfahren einzeln phosphoryliert, und man ließ sie einen Oligo-Linker-Duplex ausbilden. Der synthetische Linker-Duplex nutzte E. coli-Kodons und lieferte ein N-terminales Methionin. Der zwischen den kohäsive NdeI- und KpnI-Enden enthaltenden Oligos #1267-08 und #1267-09 ausgebildete phosphorylierte Linker-Duplex und das zuvor beschriebene (siehe Abschnitt D), mit KpnI und BamHI verdaute und gereinigte PCR-Produkt wurden unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen von pAMG21 insertiert. Die Ligationsmischung wurde nach dem Protokoll der Lieferfirma zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation verwendet. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und die DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens muOPG-met[32-401] zu bestätigen.

Die Expression des rekombinanten Polypeptids muOPG-met[32-401] von Kulturen der 393-Zellen mit dem rekombinanten Plasmid pAMG21 nach Induktion wurde unter Anwendung von im Abschnitt C be schriebenen Verfahren ermittelt.

F. Murine OPG met-lys[22-401]

Eine für ein N-terminales Methionin, gefolgt von einem Lysinrest, und an Aminosäuren 22 bis 401 von murinem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokaryontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Die synthetischen Oligos #1282-95 und #1282-96 wurden einzeln phosphoryliert, und man ließ sie unter Anwendung von in Ab schnitt B beschriebenen Verfahren einen Oligo-Linker-Duplex ausbilden. Der synthetische Linker-Duplex nutzte E. coli-Kodons und lieferte ein N-terminales Methionin. Der zwischen den kohäsive NdeI- und KpnI-Enden enthaltenden Oligos #1282-95 und #1282-96 ausgebildete phosphorylierte Linker-Duplex und das in Abschnitt B beschriebene, mit KpnI und BamHI verdaute und gereinigte PCR-Produkt wurden unter Anwendung von Standardver fahren direktional zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen von pAMG21 insertiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation unter Anwendung des Protokolls der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und die DNA-Sequenzie rung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens MuOPG-Met-Lys[22-401] zu bestätigen.

Die Expression des rekombinanten Polypeptids MuOPG Met-Lys[22-401] von transformierten 393-Zellen mit dem rekombinanten Plasmid pAMG21 nach Induktion wurde unter Anwendung von in Abschnitt C beschriebenen Verfahren ermittelt.

G. Murine OPG met-lys-(his)₇[22-401]

Eine für die N-terminalen Reste Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His (=MKH) und die anschließenden Aminosäuren 22 bis 401 von murinem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokaryontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Eine PCR wurde durchgeführt, wobei als Primer die Oligonukleotide #1300-50 und #1257-15 und als Template DNA des Plasmids pAMG21-muOPG-met[22-401] eingesetzt wurden. Die thermocyclischen Bedingungen waren wie im Abschnitt B beschrie ben. Die resultierende PCR-Probe wurde in einem Agarosegel aufgetrennt, und das PCR-Produkt wurde ausgeschnitten, gereinigt, mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI gespalten und gereinigt. Das unter Verwendung der Oligoprimer #1300-50 und #1257-15 generierte, mit NdeI und BamHI verdaute und gereinigte PCR-Produkt wurde unter Anwendung von Standardverfahren der DNA-Technologie direktional zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen von pAMG21 insertiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation unter Anwendung des Protokolls der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequen zierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens muOPG-MKH[22-401] zu bestätigen.

Die Expression des rekombinanten Polypeptids MuOPG-MKH[22-401] von transformierten 393-Zellkulturen mit dem rekombinanten Plasmid pAMG21 nach Induktion wurde unter Anwendung von im Abschnitt C beschriebenen Verfahren ermittelt.

H. Murine OPG met-lys[22-401](his)₇

Eine für N-terminale Met-Lys, die Aminosäuren 22 bis 401 von murinem OPG, und 7 Histidinreste im Anschluß an die Aminosäure 401 kodierende DNA-Sequenz (= muOPG MK[22-401]-H₇) wurde in den prokaryontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Eine PCR wurde durch geführt, bei der als Primer die Oligonukleotide #1300-49 und #1300-51 und als Template pAMG2I-muOPG-met[22-401]-DNA eingesetzt wurden. Die thermocyclischen Bedingungen waren wie in Abschnitt B beschrieben. Die resultierende PCR-Probe wurde in einem Agarose gel aufgetrennt, und das PCR-Produkt wurde ausgeschnitten, gereinigt, mit den Restriktionsendonukleasen NdeI und BamHI restringiert und gereinigt. Das mit NdeI und BamHI verdaute und gereinigte PCR-Produkt wurde unter Anwendung von Standardver fahren zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen in pAMG21 insertiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens muOPG MK[22-401]-H₇ zu bestätigen.

Die Expression des rekombinanten Polypeptids muOPG-MK-[22-401]-H₇ von transformierten 393-Zellen mit dem rekombinanten Plasmid pAMG21 nach Induktion wurde unter Anwendung von im Abschnitt C beschriebenen Verfahren ermittelt.

I. Murine OPG met[27-401]

Eine für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 27 bis 401 von murinem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokary ontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Eine PCR wurde durchgeführt mit den Oligonukleotiden #1309-74 und #1257-15 als Primer und plasmidärer pAMG21-muOPG-met[22-401]-DNA als Template. Die thermocyclischen Bedingungen waren wie in Abschnitt B beschrieben. Die resultie rende PCR-Probe wurde in einem Agarosegel aufgetrennt, und das PCR-Produkt wurde ausgeschnitten, gereinigt, mit den Restrik tionsendonukleasen NdeI und BamHI gespalten und gereinigt. Das mit NdeI und BamHI verdaute und gereinigte PCR-Produkt wurde unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen von pAMG21 insertiert. Die Ligations mischung wurde verwendet zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens muOPG-met[27-401] zu bestätigen.

Die Expression des rekombinanten Polypeptids muOPG-met[27-401] von einer transfizierten 393-Kultur mit dem rekombinanten Plasmid pAMG21 nach Induktion wurde unter Anwendung der in Abschnitt C beschriebenen Verfahren ermittelt.

J. Human OPG met[27-401]

Eine für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 27 bis 401 von humanem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokary ontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Eine PCR wurde durchgeführt, wobei als Primer die Oligonukleotide #1309-75 und #1309-76 und als Template plasmidäre pAMG21-huOPG-met[22-401]-DNA verwendet wurden. Die thermocyclischen Bedingungen waren wie in Abschnitt B beschrieben. Die resultierende PCR-Probe wurde in einem Agarose gel aufgetrennt, und das PCR-Produkt wurde ausgeschnitten, gereinigt, mit den Restriktionsendonukleasen AseI und BamHI restringiert und gereinigt. Das obige, mit AseI und BamHI verdaute und gereinigte PCR-Produkt wurde unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen von pAMG21 insertiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequen zierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens huOPG-met[27-401] zu bestätigen.

Die Expression des rekombinanten Polypeptids huOPG-met[ 27-401] nach Induktion von transfizierten 393-Zellen mit dem rekom binanten Plasmid pAMG21 wurde unter Anwendung von in Abschnitt C beschriebenen Verfahren ermittelt.

K. Murine OPG met[22-180]

Eine für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 22 bis 180 von murinem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokary ontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Eine PCR wurde durchgeführt mit den Oligonukleotiden #1309-72 und #1309-73 als Primer und plasmidärer pAMG21-muOPG-met[22-401]-DNA als Template. Die thermocyclischen Bedingungen waren wie in Abschnitt B beschrieben. Die resultie rende PCR-Probe wurde in einem Agarosegel aufgetrennt, und das PCR-Produkt wurde ausgeschnitten, gereinigt, mit den Restrik tionsendonukleasen NdeI und BamHI restringiert und gereinigt. Das obige, mit NdeI und BamHI verdaute und gereinigte PCR-Produkt wurde unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen von pAMG21 insertiert. Die Ligations mischung wurde verwendet zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens muOPG-met[22-180] zu bestätigen.

Die Expression des rekombinanten Polypeptids muOPG-met[22-180] von transformierten 393-Kulturen mit dem rekombinanten Plasmid pAMG21 nach Induktion wurde unter Anwendung von in Abschnitt C beschriebenen Verfahren ermittelt.

L. Murine OPG met[27-180]

Eine für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 27 bis 180 von murinem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokary ontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Eine PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der Oligonukleotide #1309-74 (siehe Abschnitt I) und #1309-73 (siehe Abschnitt K) als Primer und von plasmidärer pAMG21-muOPG met[22-401]-DNA als Template. Die thermocyclischen Bedingungen waren wie in Abschnitt B beschrieben. Die resultie rende PCR-Probe wurde in einem Agarosegel auf getrennt, und das PCR-Produkt wurde ausgeschnitten, gereinigt, mit den Restrik tionsendonukleasen NdeI und BamHI restringiert und gereinigt. Das obige, mit NdeI und BantHI verdaute und gereinigte PCR-Produkt wurde unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die NdeI- und BamHI-Stellen in pAMG21 insertiert. Die Ligations mischung wurde verwendet zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens muOPG met[27-180] zu bestätigen.

Die Expression des rekombinanten Polypeptids muOPG met[27-180] von Kulturen transformierter 393-Zellen mit dem rekombinanten Plasmid pAMG21 nach Induktion wurde unter Anwendung von in Abschnitt C beschriebenen Verfahren ermittelt.

M. Murine OPG met[22-189] und met[22-194]

Eine für ein N-terminales Methionin und entweder die Aminosäuren 22 bis 189 oder 22-194 von murinem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokaryontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Die synthetischen Oligonukleotidpaare #1337-92 und #1337-93 (=muOPG-189-Linker) oder #1333-57 und #1333-58 (=muOPG-194-Linker) wurden unter Anwendung von in Abschnitt B beschriebenen Verfahren einzeln phosphoryliert, und man ließ sie ein Oligo-Linker-Duplex-Paar ausbilden. Gereinigte plasmidäre DNA von pAMG21-muOPG-met[22-401] wurde mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und BspEI gespalten, und die resultierenden DNA-Fragmente wurden in einem Agarosegel aufgetrennt. Das 413 bp große B-Fragment wurde mittels Standardverfahren der rekombinanten DNA-Technologie isoliert. Die entweder zwischen den Oligos #1337-92 und #1337-93 (muOPG-189-Linker) oder den Oligos #1333-57 und #1333-58 (muOPG-194-Linker) gebildeten, kohäsive BspEI- und BamHI-Enden enthal tenden phosphorylierten Oligo-Linker-Duplexe und das obige, aus den mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und BspEI verdauten Plasmid pAMG21-muOPG-met[22-401] isolierte 413 bp große B-Fragment wurde unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die KpnI- und BamHI-Stellen von pAMG21-muOPG met[22-401] insertiert. Jede Ligationsmischung wurde zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma eingesetzt. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequenzierung wurde durch geführt, um die DNA-Sequenz der Gene muOPG-met[22-189] oder muOPG-met[22-194] zu bestätigen.

Die Expression der rekombinanten Polypeptide muOPG-met[22-189] und muOPG-met[22-194] von mit dem rekombinanten Plasmid pAMG21 transformierten 393-Zellen wurde unter Anwendung von in Ab schnitt C beschriebenen Verfahren ermittelt.

N. Murine OPG met[27-189] und met[27-194]

Eine für ein N-terminales Methionin und entweder die Aminosäuren 27 bis 189 oder 27-194 von murinem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokaryontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Phosphory lierte Oligo-Linker, entweder "muOPG-189-Linker" oder "muOPG-194-Linker" (siehe Abschnitt M), enthaltend kohäsive BspEI- und BamHI-Enden, und das aus dem mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und BspEI verdauten Plasmid pAMG21-muOPG-met[22-401] isolierte ∼413 bp große B-Fragment wurden unter Standardtechniken direktional zwischen die KpnI- und BamHI-Stellen des Plasmids pAMG21-muOPG-met[27-401] eingebracht. Jede Ligationsmischung wurde verwendet zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz der Gene muOPG met[27-189] oder muOPG met[27-194] zu bestätigen.

Die Expression von rekombinantem muOPG met[27-189] und muOPG met[27-194] nach Induktion von 393-Zellen mit den rekombinanten pAMG21-Plasmiden wurde unter Anwendung von in Abschnitt C be schriebenen Verfahren ermittelt.

O. Human OPG met[22-185], met[22-189] met[22-194]

Eine für ein N-terminales Methionin und entweder die Aminosäuren 22 bis 185, 22 bis 189, oder 22 bis 194 des humanen OPG-Polypep tids kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokaryontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Die synthetischen Oligonukleotidpaare #1331-87 und #1331-88 (= huOPG-185-Linker), #1331-89 und #1331-90 (= huOPG-189-Linker), oder #1331-91 und #1331-92 (= huOPG-194-Linker) wurden einzeln phosphoryliert, und man ließ sie unter Anwendung der in Abschnitt B beschriebenen Verfahren ein Oligo-Linker-Duplex-Paar ausbilden. Die gereinigte plasmidäre DNA von pAMG21-huOPG-met[27-401] wurde mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und NdeI restringiert, und die resultierenden DNA-Fragmente wurden in einem Agarosegel aufgetrennt. Das 407 bp große B-Fragment wurde unter Anwendung von Standardverfahren der rekombinanten DNA-Technologie isoliert. Die phosphorylierten Oligo-Linker-Duplexe, die entweder zwischen den Oligos #1331-87 und #1331-88 (huOPG-185-Linker), den Oligos #1331-89 und #1331-90 (huOPG-189-Linker), oder den Oligos #1331-91 und #1331-92 (huOPG-194-Linker) ausgebildet wurden [jeder Linker enthält kohäsive NdeI- und BamHI-Enden], und das obige, aus dem mit den Restrik tionsendonukleasen KpnI und NdeI verdauten Plasmid pAMG21-huOPG-met[27-401] isolierte B-Fragment mit einer Größe von 407 bp wurden unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die KpnI- und BamHI-Stellen des Plasmids pAMG21-huOPG-met[22-401] insertiert. Jede Ligationsmischung wurde verwendet zur Trans formation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidä re DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequenzierung wurde durch geführt, um die DNA-Sequenz der Gene huOPG-met[22-185], huOPG-met[22-189] oder huOPG-met[22-194] zu bestätigen.

Die Expression von rekombinantem huOPG-met[22-185], huOPG-met[22-189] oder huOPG-met[22-194] in transformierten 393-Zellen mit den rekombinanten pAMG21-Plasmiden nach Induktion wurde unter Anwendung der in Abschnitt C beschriebenen Verfahren ermittelt.

P. Human OPG met[27-185] met[27-189] met[27-194]

Eine für ein N-terminales Methionin und entweder die Aminosäuren 27 bis 185, 27 bis 189 oder 27 bis 194 des humanen OPG-Polypep tids kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokaryontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Die phosphorylierten Oligo-Linker "huOPG-185-Linker", "huOPG-189-Linker" oder "huOPG-194-Linker" (siehe Abschnitt O), die jeweils kohäsive NdeI- und BamHI-Enden enthalten, und das aus dem mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und NdeI verdauten Plasmid pAMG21-huOPG-met[27-401] isolierte B-Fragment mit einer Größe von ∼407 bp (siehe Abschnitt O) wurden unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die KpnI- und BamHI-Stellen des Plasmids pAMG21-huOPG-met[27-401] (siehe Abschnitt J) insertiert. Jede Ligationsmischung wurde verwendet zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequen zierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz der Gene huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-189] oder huOPG-met[27-194] zu bestätigen.

Die Expression von rekombinantem huOPG-met[ 27-185], huOPG-met[27-189] und huOPG-met[27-194] der mit den rekombinanten pAMG21-Plasmiden transformierten 393-Zellen wurde unter Anwendung der in Abschnitt C beschriebenen Verfahren ermittelt.

O. Murine OPG met[27-401] (P33E G36S, A45P)

Eine für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 27 bis 48 von humanem OPG, gefolgt von den Aminosäureresten 49 bis 401 von murinem OPG kodierende DNA-Sequenz wurde in den prokary ontischen Expressionsvektor pAMG21 unter Kontrolle des Promotors luxPR wie folgt eingebracht. Gereinigte plasmidäre DNA von pAMG21-huOPG-met[27-401] (siehe Abschnitt J) wurde mit den Restriktionsendonukleasen AatII und KpnI gespalten, und ein aus einem Agarosegel unter Anwendung von Standardverfahren der rekombinanten DNA-Technologie isoliertes ∼1075 bp großes B-Fragment wurde isoliert. Zusätzlich wurde die plasmidäre pAMG1-muOPG-met[22-401]-DNA (siehe Abschnitt D) mit den Restriktions endonukleasen KpnI und BamHI verdaut, und das ∼1064 bp große B-Fragment wurde wie oben beschrieben isoliert. Das isolierte, ∼1075 bp große pAMG21-huOPG-met[27-401]-Restriktionsfragrnent, welches kohäsive AatII- und KpnI-Enden enthält (siehe oben), das ∼1064 bp große pAMG21-muOPG-met[22-401]-Restriktionsfragment, welches kohäsive KpnI- und BamHI-Enden enthält, und ein ∼ 5043 bp großes Restriktionsfragment, welches kohäsive AatII- und BamHI-Enden enthält und mit der Nukleinsäuresequenz von pAMG21 zwischen AatII und BamHI korrespondiert, wurden unter Anwendung von Standardverfahren der rekombinanten DNA-Technologie ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet zur Transformation von E. coli-393-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, und die Anwesenheit des rekombinanten Inserts in dem Plasmid wurde unter Anwendung von Standardverfahren der DNA-Technologie bestätigt. muOPG-27-401 (P33E, G36S, A45P)-Gen. Die Aminosäureaustausche in muOPG von Prolin-33 zu Glutaminsäure-33, Glycin-36 zu Serin-36, und Alanin-45 zu Prolin-45 resultieren aus dem Austausch der muOPG-Reste 27 bis 48 durch die huOPG-Reste 27 bis 48.

Die Expression von rekombinantem muOPG-met[27-401] (P33E, G36S, A45P) der transformierten 393-Zellen mit dem rekombinanten Plasmid pAMG21 wurde unter Anwendung der in Abschnitt C be schriebenen Verfahren ermittelt.

R. Murine OPG met-lys-(his)₇-ala-ser-(asp)₄-lys [22-401] (A45T)

Eine DNA-Sequenz, kodierend für einen N-terminalen His-Tag und eine Enterokinase-Erkennungssequenz, welche lautet (NH₂- zum COOH-Terminus): Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Ala-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys =HEK), gefolgt von den Aminosäuren 22 bis 401 des murinen OPG-Polypeptids, wurde wie folgt unter Kontrolle des vom lac-Repressor regulierten Promotors Ps4 plaziert. pAMG22-His (siehe Abschnitt A) wurde mit den Restriktionsendonukleasen NheI und BamHI verdaut, und das große Fragment (das A-Fragment) wurde aus einem Agarosegel unter Anwendung von Standardverfahren der rekombinanten DNA-Technologie isoliert. Die Oligonukleotide #1282-91 und #1282-92 wurden einzeln phosphoryliert, und man ließ sie unter Anwendung von zuvor beschriebenen Verfahren (sie he Abschnitt B) einen Oligo-Linker-Duplex ausbilden. Der zwi schen den Oligos #1282-91 und #1282-92 mit kohäsiven NheI- und KpnI-Enden ausgebildete phosphorylierte Linker-Duplex, das mit KpnI und BamHI verdaute und gereinigte beschriebene PCR-Produkt (siehe Abschnitt D), und das A-Fragment des mit NheI und BamHI verdauten Vektors pAMG22-His wurden unter Anwendung von Stan dardverfahren der rekombinanten DNA-Technologie ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet zur Transformation von E. co li-GM120-Wirtszellen durch Elektroporation nach dem Protokoll der Lieferfirma. Klone wurden selektiert, plasmidäre DNA wurde isoliert, und eine DNA-Sequenzierung erfolgte, um die DNA-Se quenz des Gens muOPG-HEK[22-401] zu bestätigen. Die DNA-Sequen zierung ergab eine Pseudomutation in der natürlichen Sequenz von muOPG, die im muOPG-Polypeptid zu einem einzelnen Aminosäure austausch von Alanin-45 zu einem Threonin führte.

Die Expression von rekombinantem muOPG-HEK[22-401] (A45T) der GM120-Zellen mit dem rekombinanten Plasmid pAMG21 wurde unter Anwendung von den in Abschnitt c beschriebenen ähnlichen Ver fahren mit der Abweichung ermittelt, daß anstelle der Zugabe des synthetischen Autoinduktionsmittels für die Zwecke der Induktion IPTG in einer Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben wurde.

S. Human OPG met-arg-gly-ser-(his)₆[22-401]

Zur Herstellung eines 175 Basenpaare großen Fragments in Form überlappender, doppelsträngiger DNA wurden 8 Oligonukleotide geschaffen (1338-09 bis 1338-16, unten dargestellt). Die Oligos wurden aneliert, ligiert, und die 5′- und 3′-Oligos wurden zur Herstellung großer Mengen des 175 Basen langen Fragments als PCR-Primer eingesetzt. Die endgültigen PCR-Genprodukte wurden mit den Restriktionsendonukleasen ClaI und KpnI verdaut, um ein Fragment zu ergeben, welches die N-terminalen 28 Kodons von humanem OPG ersetzt. Das mit ClaI und KpnI verdaute PCR-Produkt wurde in das ebenfalls mit ClaI und KpnI geschnittene Plasmid pAMG21-huOPG [27-401] insertiert. Die ligierte DNA wurde ver wendet zur Transformation von kompetenten Wirtszellen des E. co li-Stammes 393. Klone wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, das rekombinante Proteinprodukt zu produzieren und die Genfusion mit der korrekten Nukleotidsequenz zu besitzen. Die Bestimmung der Protein-Expressionsraten erfolgte durch Untersuchungen von 50 ml Schüttelflaschen. Das Gesamt-Zellysat und das sonifizierte Sediment wurden hinsichtlich der Expression des Konstrukts ana lysiert durch Coomassieblau-gefärbte PAGE-Gele und Western-Ana lyse mit murinem Anti-OPG-Antikörper. Die Expression von huOPG Met-Arg-Gly-Ser-(His)₆ [22-401] führte zur Bildung großer Ein schlußkörper, und das Protein wurde in der unlöslichen (Sedi ment-)Fraktion lokalisiert.

T. Human OPG met-lys[22-401] und met(lys)₃[22-401]

Um die met-lys- und met-(lys)₃-Versionen von human OPG[22-401] herzustellen, wurden überlappende Oligonukleotide geschaffen, um die geeignete Anzahl an Lysinresten anzufügen. Die beiden Oligos für jedes Konstrukt wurden so geschaffen, daß sie überlappen, um die Bildung des Endprodukts in zwei PCR-Runden zu erlauben. Das Template für die erste PCR-Reaktion war eine plasmidäre DNA-Präparation, die das humane OPG 22-401-Gen enthielt. Die erste PCR führte zur Addition des (der) Lysinreste(n). Die zweite PCR erfolgte unter Einsatz des Produkts der ersten Runde und führte zu einer Addition einer Sequenz, um wieder die erste Re striktionsstelle, ClaI, zu ergeben.

Die endgültigen PCR-Genprodukte wurden mit den Restriktionsendo nukleasen ClaI und KpnI verdaut, um ein Fragment zu ergeben, welches die N-terminalen 28 Kodons von huOPG ersetzt. Das mit ClaI und KpnI verdaute PCR-Produkt wurde anschließend in das Plasmid pAMG21-huOPG [27-401] ligiert, das ebenfalls mit den beiden Restriktionsendonukleasen verdaut worden war. Die ligier te DNA wurde verwendet zur Transformation von kompetenten Wirts zellen des E. coli-Stammes 393. Die Klone wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bildung des rekombinanten Proteinprodukts und des Besitzes der Genfusion mit der korrekten Nukleotidse quenz einem Screening zugeführt. Die Bestimmung der Protein-Expressionsraten erfolgte anhand von Untersuchungen mit 50 ml Schüttelflaschen. Das Gesamt-Zellysat und das sonifizierte Sedi ment wurden hinsichtlich der Expression des Konstrukts durch Coomassieblau-gefärbte PAGE-Gele und Western-Analyse mit murinem Anti-OPG-Antikörper analysiert. Keines der Konstrukte zeigte ein nachweisbares Ausmaß an Proteinexpression, und Einschlußkörper waren nicht sichtbar. Die DNA-Sequenzen wurden durch DNA-Sequen zierung bestätigt.

Oligonukleotid-Primer zur Herstellung von Met-Lys huOPG[22-401]:

Oligonukleotid-Primer zur Herstellung von Met-(Lys)₃-huOPG[22-401]:

U. Human und Murine OPG [22-401]/Fc-Fusionen

Vier OPG-Fc-Fusionen wurden hergestellt, bei denen die Fc-Region von humanem IgG1 mit dem N-Terminus entweder der humanen oder murinen Osteoprotegerin-Aminosäuren 22 bis 401 (bezeichnet mit Fc/OPG [22-401]) oder mit dem C-Terminus (bezeichnet mit OPG[22-401]/Fc) fusioniert wurde. Zur Herstellung der Fc-Fusionen wurde der in Beispiel 7 beschriebene Fusionsvektor pFc-A3 verwendet.

Sämtliche Fusionsgene wurden unter Anwendung von Standardver fahren der PCR-Technologie hergestellt. Die Templates für die PCR-Reaktionen waren Plasmidpräparationen, die die Target-Gene enthielten. Überlappende Oligos wurden geschaffen, um den C-terminalen Bereich eines Gens mit dem N-terminalen Bereich des anderen Gens zu kombinieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Fusion der beiden Gene im korrekten Leserahmen, nachdem die geeigneten PCR-Reaktionen durchgeführt worden sind. Anfänglich wurde ein "Fusions"-Oligo für jedes Gen in eine PCR-Reaktion eingebracht mit einem für den das Target-Gen tragenden Vektor universellen Primer. Das komplementäre "Fusions"-Oligo wurde mit einem universellen Primer zur PCR des anderen Gens verwendet. Am Ende dieser ersten PCR-Reaktion wurden zwei getrennte Produkte erhalten, wobei bei jedem einzelnen Gen die Fusionsstelle vor handen ist, wodurch eine ausreichende Überlappung geschaffen wird, um die zweite PCR-Runde zur Herbeiführung der erwünschten Fusion zu starten. In der zweiten PCR-Runde wurden die ersten beiden PCR-Produkte zusammen mit universellen Primern kombi niert, und über die überlappenden Regionen wurde die fusionierte DNA-Sequenz vollständiger Länge gebildet.

Die endgültigen PCR-Genprodukte wurden mit den Restriktionsendo nukleasen XbaI und BamHI verdaut und anschließend in den Vektor pAMG21 ligiert, der ebenfalls mit den beiden Restriktionsendonu kleasen verdaut worden war. Die ligierte DNA wurde verwendet zur Transformation von kompetenten Wirtszellen des E. coli-Stammes 393. Die Klone wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bildung des rekombinanten Proteinprodukts und des Besitzes der Genfusion mit der korrekten Nukleotidsequenz einem Screening unterzogen. Die Bestimmung der Protein-Expressionsraten erfolgte durch Un tersuchungen von 50 ml Schüttelflaschen. Das Gesamt-Zellysat, das sonifizierte Sediment, und der Überstand wurden auf Expres sion der Fusion durch Coomassie-gefärbte PAGE-Gele und Western-Analyse mit murinem Anti-OPG-Antikörper analysiert.

Fc/huOPG [22-401]

Die Expression des Fusionspeptids Fc/hu OPG [22-401] wurde auf einem Coomassie-gefärbten PAGE-Gel und einem Western Blot nach gewiesen. Die Zellen weisen sehr große Einschlußkörper auf, und die überwiegende Menge des Produkts befindet sich in der unlös lichen (Sediment-)Fraktion. Zur Herstellung dieser OPG-Fc-Fusion wurden die folgenden Primer verwendet:

Fc/muOPG [22-401]

Die Expression des Fusionspeptids wurde auf einem Coomassie-gefärbten Gel und auf einem Western Blot nachgewiesen. Die Zel len weisen sehr große Einschlußkörper auf, und die überwiegende Menge des Produkts befindet sich in der unlöslichen (Sedi ment-)Fraktion. Zur Herstellung dieser OPG-Fc-Fusion wurden die folgenden Primer eingesetzt:

muOPG [22-401]/Fc

Die Expression des Fusionspeptids wurde auf einem Coomassie-gefärbten Gel und auf einem Western Blot nachgewiesen. Die Menge an rekombinantem Produkt war geringer als die OPG-Fusionsprotei ne mit der Fc-Region in der N-terminalen Position. Offensicht liche Einschlußkörper wurden nicht nachgewiesen. Die überwiegen de Menge des Produkts befand sich offenbar in der unlöslichen (Sediment-)Fraktion. Zur Herstellung dieser OPG-Fc-Fusion wurden die folgenden Primer eingesetzt:

huOPG [22-401]/Fc

Die Expression des Fusionspeptids wurde auf einem Coomassie gefärbten Gel nicht nachgewiesen, obgleich auf dem Western Blot ein schwaches positives Signal vorhanden war. Offensichtliche Einschlußkörper wurden nicht nachgewiesen. Zur Herstellung die ser OPG-Fc-Fusion wurden die folgenden Primer eingesetzt:

V. Human OPG met[22-401]-Fc-Fusion (P25A)

Dieses Konstrukt kombiniert einen Aminosäureaustausch an Posi tion 25 von Prolin zu Alanin (P25A) mit der huOPG met[22-401]-Fc-Fusion. Das Plasmid wurde mit den Restriktionsendonukleasen ClaI und KpnI verdaut, wodurch die N-terminalen 28 Kodons des Gens entfernt werden, und das resultierende kleine (weniger als 200 Basenpaare) Fragment wurde mit einem Gel gereinigt. Dieses, den Austausch von Prolin durch Alanin aufweisende Fragment wurde anschließend in das Plasmid pAMG21-huOPG [22-401]-Fc-Fusion ligiert, das mit den beiden Restriktionsendonukleasen verdaut worden war. Die ligierte DNA wurde verwendet zur Transformation von kompetenten Wirtszellen des E. coli-Stammes 393. Die Klone wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Bildung des rekombinan ten Proteinprodukts und des Besitzes der Genfusion mit der kor rekten Nukleotidsequenz einem Screening unterzogen. Die Bestim mung der Protein-Expressionsraten erfolgte durch Untersuchungen von 50 ml Schüttelflaschen. Das Gesamt-Zellysat und das sonifi zierte Sediment wurden auf Expression des Konstrukts untersucht durch Coomassie-gefärbte PAGE-Gele und Western-Analyse mit muri nem Anti-OPG-Antikörper. Die Expressionsrate des Fusionsproteins wurde auf einem Coomassie-gefärbten PAGE-Gel und auf einem We stern Blot nachgewiesen. Das Protein befand sich in der unlösli chen (Sediment-)Fraktion. Die Zellen wiese große Einschlußkörper auf.

W. Human OPG met[22-401] (P25A)

Eine für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 22 bis 401 von humanem OPG kodierende DNA-Sequenz, wobei das Prolin an Position 25 durch Alanin substituiert ist, unter der Kontrolle des Promotors luxPR in dem prokaryontischen Expressionsvektor pAMG21 wurde wie folgt konstruiert: Die synthetischen Oligos #1289-84 und #1289-85 wurden aneliert, um einen Oligo-Linker-Duplex mit kohäsiven XbaI- und KpnI-Enden auszubilden. Der syn thetische Linker-Duplex nutzte optimale E. coli-Kodons und ko dierte für ein N-terminales Methionin. Der Linker umfaßte ferner eine SpeI-Restriktionsstelle, die in der ursprünglichen Sequenz nicht vorhanden war. Der Linker-Duplex wurde unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die XbaI- und KpnI-Stel len in pAMG21-huOPG-22-401 insertiert. Die Ligationsmischung wurde durch Transformation in E. coli-GM221-Wirtszellen einge führt. Die Klone wurden zuerst hinsichtlich der Bildung des rekombinanten Proteins einem Screening unterzogen. Aus positiven Klonen wurde plasmidäre DNA isoliert, und es wurde eine DNA-Sequenzierung durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens HuOPG-Met[22-401] (P25A) zu bestätigen. Zur Herstellung des XbaI-KpnI-Linkers wurden die folgenden Oligonukleotide eingesetzt:

X. Human OPG met[22-401] (P26A) und (P26D)

Eine DNA-Sequenz, die für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 22 bis 401 von humanem OPG kodiert, wobei das Prolin an Position 26 durch Alanin substituiert ist, unter der Kontrol le des Promotors luxPR in dem prokaryontischen Expressionsvektor pAMG21 wurde wie folgt hergestellt: Die synthetischen Oligos #1289-86 und #1289-87 wurden aneliert, um einen Oligo-Linker-Duplex mit kohäsiven XbaI- und SpeI-Enden auszubilden. Der syn thetische Linker-Duplex nutzte optimale E. coli-Kodons und ko dierte für ein N-terminales Methionin. Der Linker-Duplex wurde unter Anwendung von Standardverfahren direktional zwischen die XbaI- und SpeI-Stellen in pAMG21-huOPG [22-401] (P25A) inser tiert. Die Ligationsmischung wurde durch Transformation in E. coli-GM221-Wirtszellen eingeführt. Die Klone wurden zuerst hinsichtlich der Produktion des rekombinanten Proteins einem Screening unterzogen. Aus positiven Klonen wurde plasmidäre DNA isoliert, und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens huOPG-met[22-401] (P26A) zu bestätigen. Bei einem der sequenzierten Klone zeigte sich, daß bei ihm das Pro lin an Position 26 anstelle von A 59323 00070 552 001000280000000200012000285915921200040 0002019654610 00004 59204lanin durch Asparaginsäure substituiert war, und diese Klon erhielt die Bezeichnung huOPG-met[22-401] (P26D). Zur Herstellung des XbaI-SpeI-Linkers wurden die folgenden Oligonukleotide eingesetzt:

Y. Human OPG met(22-194] (P25A)

Eine DNA-Sequenz, die für ein N-terminales Methionin und die Aminosäuren 22 bis 194 von humanem OPG kodiert, wobei das Prolin an Position 25 durch Alanin substituiert ist, unter der Kontrol le des Promotors luxPR in dem prokaryontischen Expressionsvektor pAMG21 wurde wie folgt hergestellt: Die Plasmide pAMG21-huOP-G[27-194] und pAMG21-huOPG[22-401] (P25A) wurden beide mit den Endonukleasen KpnI und BamHI verdaut. Das 450 bp große Fragment wurde aus pAMG21-huOPG[27-194] isoliert, während das 6,1 kbp große Fragment aus pAMG21-huOPG[22-401] (P25A) isoliert wurde. Diese Fragmente wurden miteinander ligiert und durch Transforma tion in E. coli-GM221-Wirtszellen eingeführt. Die Klone wurden zuerst hinsichtlich der Produktion des rekombinanten Proteins einem Screening unterzogen. Aus positiven Klonen wurde plasmidä re DNA isoliert, und eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenz des Gens huOPG-Met[22-194] (P25A) zu bestäti gen.

Beispiel 9 Assoziation von OPG-Monomeren

Gentechnisch veränderte CHO-Zellen, die muOPG [22-401] überex primieren, wurden zum Erhalt von konditioniertem Medium einge setzt, um das sekretierte rekombinante OPG unter Verwendung von polyklonalen Anti-OPG-Antikörpern des Kaninchens zu analysieren. Ein Aliquot des konditionierten Mediums wurde 20fach konzen triert und anschließend durch reduzierende und nicht-reduzieren de SDS-PAGE analysiert (Fig. 15). Unter reduzierenden Bedingun gen migrierte das Protein als ein Polypeptid mit einer relativen Molekülmasse von 50-55 kD, wie man es vorhergesagt hätte, wenn das reife Produkt an einer oder mehrerer seiner N-verknüpften Consensus-Glykosylierungsstellen glykosiliert wäre. Bei der Analyse der selben Proben durch nicht-reduzierende SDS-PAGE migrierte die überwiegende Menge des Proteins überraschenderwei se als ein Polypeptid mit ungefähr 100 kD, der doppelten Größe des reduzierten Proteins. Zusätzlich gab es eine kleinere Menge des Polypeptids mit einer relative Molekülmasse von 50-55 kD. Dieses Migrationsmuster der SDS-PAGE stimmte mit der Beobachtung überein, daß das OPG-Produkt durch Oxidation einer oder mehrerer freier Sulfhydrylgruppen Dimere bildet.

Das vorhergesagte reife OPG-Polypeptid enthält 23 Cysteinreste, von denen nach Vorhersage 18 an der Ausbildung von Disulfidbrücken innerhalb der Kette beteiligt sind, die die vier Cystein-reichen Domänen umfassen (Fig. 12A). Die fünf verbleibenden C-terminalen Cysteinreste sind bei der Sekundärstruktur, die auf der Grundlage der Homologie mit anderen Vertretern der TNFR-Familie vorhergesagt werden kann, nicht beteiligt. Insgesamt gibt es eine ungerade Nettoanzahl an Cysteinresten, und es ist formal möglich, daß mindestens ein Rest frei ist, um eine inter molekulare Disulfidbindung zwischen zwei OPG-Monomeren auszubil den.

Um den Verlauf der OPG-Kinetik und -Monomerassoziation aufzu klären, erfolgte eine Pulsmarkierung. muOPG[22-401] exprimieren de CHO-Zellen wurden wie oben beschrieben 30 Minuten lang in serumfreiem Medium enthaltend ³⁵S-Methionin und -Cystein metabo lisch markiert. Nach dieser Zeitdauer wurde das Medium entfernt und durch vollständiges Medium enthaltend unmarkiertes Methionin und Cystein in Mengen eines ungefähr 2000fachen Überschusses der ursprünglichen Konzentration an radioaktiven Aminosäuren er setzt. Zu den Zeitpunkten 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 6 Stunden und 12 Stunden nach der Zugabe wurden die Kulturen geerntet durch Entfernung des konditionierten Mediums, und Lysate der konditionierten Medien und adhärierende Monolayer wurden präpariert. Die Kulturmedien und die Zellysate wurden wie oben beschrieben geklärt und anschließend unter Verwendung von Anti-OPG-Antikörpern wie oben beschrieben immunpräzipitiert. Nach dem Waschen der Immunpräzipitate wurden sie durch Kochen in nicht-reduzierendem SDS-PAGE-Puffer freigesetzt und in zwei gleiche Hälften aufgeteilt. Einer Hälfte wurde das Reduktions mittel β-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 5% (Vol./Vol.) zugegeben, während die andere Hälfte unter nicht reduzierenden Bedingungen gehalten wurde. Beide Ansätze von Immunpräzipitaten wurden wie oben beschrieben durch SDS-PAGE analysiert, bevor sie für eine Röntgenaufnahme vorbereitet und dieser zugeführt wurden. Die Ergebnisse sind in Fig. 16 darge stellt. Die durch reduzierende SDS-PAGE analysierten Proben sind in den unteren beiden Abbildungen angegeben. Nach der Synthese wird das OPG-Polypeptid rasch zu einem geringfügig größeren Polypeptid prozessiert, wobei es sich hier wahrscheinlich um eine Modifikation durch N-verknüpfte Glykosylierung handelt. Nach ungefähr 1 bis 2 Stunden nimmt die Menge an OPG in der Zelle dramatisch ab und erscheint gleichzeitig im Kulturüber stand. Dies ist offenbar das Ergebnis des mit der Zeit statt findenden vektorielle Transports von OPG aus der Zelle in das Medium, was mit der Beobachtung übereinstimmt, daß OPG ein na türlicherweise sekretiertes Protein ist. Eine Analyse der selben Immunpräzipitate unter nicht-reduzierenden Bedingungen ergibt die Beziehung zwischen der Bildung von OPG-Dimeren und der Se kretion in das konditionierte Medium (Fig. 16, obere Abbil dungen). In den ersten 30 bis 60 Minuten werden die OPG-Monomere in der Zelle prozessiert durch offenbare Glykosylierung und anschließende Dimer-Bildung. Im Verlauf der Zeit wird die über wiegende Menge der OPG-Monomere in dimere Formen umgewandelt, die nachfolgend aus der Zelle verschwinden. Etwa 60 Minuten nach der Synthese erscheinen OPG-Dimere im konditionierten Medium und werden über die Zeitdauer des Experiments akkumuliert. Im An schluß an diese Zeitdauer werden OPG-Dimere gebildet, welche anschließend in das Kulturmedium sezerniert werden. OPG-Monomere sind im Verlauf der Zeit in einer geringen Anzahl innerhalb der Zelle persistent, und kleine Mengen erscheinen auch im Medium. Dies ist offenbar nicht das Ergebnis des Zusammenbrechens von kovalenten OPG-Dimeren, sondern vielmehr der Produktion von substöchiometrischen Mengen von Monomeren in der Zelle und der nachfolgenden Sekretion.

Rekombinant produziertes OPG von transfizierten CHO-Zellen liegt offenbar überwiegend in Dimer-Form vor. Um zu ermitteln, ob die Dimerisierung ein natürlicher Vorgang der Synthese von OPG ist, analysierten wir das konditionierte Medium einer Zellinie, die natürlicherweise OPG exprimiert. Die Zellinie CTLL-2, eine muri ne zytotoxische T-Lymphozytenzellinie (ATCC Zugriffsnummer TIB-214) erwies sich in einem Screening von Gewebe- und Zellinien-RNA als OPG-mRNA exprimierend. Es zeigte sich, daß das OPG-Transkript dasselbe war wie die klonierte und sequenzierte 2,5-3,0 kb große, in der Niere identifizierte RNA, und daß es für ein sekretiertes Molekül kodiert. Eine Western Blot-Analyse von durch CTLL-2-Zellen konditioniertem Medium zeigt, daß die größ te, wenn nicht die gesamte Menge des OPG-Proteins als Dimer sekretiert wird (Fig. 17). Hierdurch wird angezeigt, daß die Dimerisierung und Sekretion von OPG kein Artefakt der Überex pression in einer Zellinie darstellt, sondern wahrscheinlich die Hauptform des Produkts repräsentiert, wie es von exprimierenden Zellen produziert wird.

Gewebe und Serum von normalen und transgenen Mäusen wurden ana lysiert, um die Natur des in OPG-transgenen Mäusen exprimierten OPG-Moleküls zu ermitteln. Da die OPG-cDNA der Ratte unter Kon trolle eines Hepatozyten-Kontrollelements exprimiert wurde, wurden Extrakte analysiert, die aus dem Parenchym von Kontroll- und transgenen Mäusen unter nicht-reduzierenden Bedingungen hergestellt worden waren (Fig. 18). Anders als bei Kontroll-Mäusen wurden in Extrakten von transgenen Mäusen OPG-Dimere zusammen mit stöchiometrischen Mengen von Monomeren rasch nach gewiesen. Die OPG-Dimere und -Monomere sind offenbar identisch mit dem in gentechnisch hergestellten CHO-Zellen exprimierten rekombinanten murinen Protein. Dies deutet stark darauf hin, daß OPG-Dimere tatsächlich eine natürliche Form des Genprodukts und wahrscheinlich aktive Schlüsselkomponenten sind. In ähnlicher Weise wurden durch Anwendung einer Western Blot-Analyse Serum proben analysiert, die von Kontroll- und transgenen Mäusen er halten wurden. Bei den Kontroll-Mäusen migriert die überwiegende Menge der OPG-Proteine als Dimer, während kleine Mengen an Mono mer ebenfalls nachgewiesen werden. Zusätzlich werden signifikan te Mengen eines größeren OPG-verwandten Proteins nachgewiesen, welches mit einer relativen Molekülmasse migriert, die mit der vorhergesagten Größe eines kovalent verknüpften Trimers überein stimmt. Demgemäß wird rekombinantes OPG in OPG-transgenen Mäusen überwiegend als dimeres Protein exprimiert, und die dimere Form kann die Grundlage für den Osteopetrose-Phänotyp von OPG-Mäusen sein. Das rekombinante OPG-Protein kann auch in höhermolekularen "trimeren" Formen existieren.

Um festzustellen, ob die fünf C-terminalen Cysteinreste von OPG eine Rolle bei der Homodimerisierung spielen, erfolgte unter Verwendung des QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kits (Stratagene, San Diego, CA) gemäß obiger Darlegung ein Austausch der murinen OPG-Kodons für die Cysteinreste 195 (C195), C202, C277, C319 und C400 durch solche für Serin. Das muOPG-Gen wurde zwischen die Notl- und Xbal-Stellen des Vektors pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA) subkloniert. Das resultierende Plas mid pcDNA 3.1-muOPG und mutagene Primer wurden in Gegenwart von Desoxynukleotiden mit Pfu-Polymerase behandelt und anschließend wie oben beschrieben in einem Thermocycler amplifiziert. Ein Aliquot der Reaktion wird anschließend zur Transfektion von kompetenten E. coli XL1-Blue durch Hitzeschock verwendet, bevor ausplattiert wurde. Die plasmidäre DNA von Transformanten wurde anschließend sequenziert, um Mutationen zu bestätigen.

Die folgenden Primerpaare wurden eingesetzt, um das Kodon des murinen OPG-Gens für den Cysteinrest 195 durch ein solches für Serin zu ersetzen, was zur Produktion eines Proteins muOPG [22-401] C195S führt:

Die folgenden Primerpaare wurden eingesetzt, um das Kodon des murinen OPG-Gens für den Cysteinrest 202 durch ein solches für Serin zu ersetzen, was zur Produktion eines Proteins muOPG [22-401] C202S führt:

Die folgenden Primerpaare wurden eingesetzt, um das Kodon des murinen OPG-Gens für den Cysteinrest 277 durch ein solches für Serin zu ersetzen, was zur Produktion eines Proteins muOPG [22-401] C277S führt:

Die folgenden Primerpaare wurden eingesetzt, um das Kodon des murinen OPG-Gens für den Cysteinrest 319 durch ein solches für Serin zu ersetzen, was zur Produktion eines Proteins muOPG [22-401] C319S führt:

Die folgenden Primerpaare wurden eingesetzt, um das Kodon des murinen OPG-Gens für den Cysteinrest 400 durch ein solches für Serin zu ersetzen, was zur Produktion eines Proteins muOPG [22-401] C400S führt:

Jedes resultierende, die geeignete Mutation enthaltende muOPG [22-401]-Plasmid wurde anschließend zur Transfektion von humanen 293-Zellen eingesetzt, und das mutante OPG-Fc-Fusionsprotein wurde wie oben dargelegt aus konditioniertem Medium gereinigt. Die biologische Aktivität eines jeden Proteins wurde durch An wendung des in Beispiel 11 beschriebenen in vitro-Assays zur Osteoklastenbildung analysiert. Das konditionierte Medium einer jeden Transfektante wurde analysiert durch nicht-reduzierende SDS-PAGE und Western Blotting mit Anti-OPG-Antikörpern.

Eine Mutation von irgendeinem der fünf C-terminalen Cysteinreste führt zur Produktion von überwiegend (< 90%) monomeren 55 kD OPG-Molekülen. Dies deutet stark darauf hin, daß die C-termina len Cysteinreste zusammen eine Rolle bei der OPG-Homodimerisie rung spielen.

C-terminale OPG-Deletionsmutanten wurden hergestellt, um die Region(en) der für die OPG-Homodimerisierung wichtigen C-termi nalen Domäne von OPG zu kartieren. Diese OPG-Mutanten wurden hergestellt durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Pri mern, durch die in die C-terminale Region von murinem OPG unrei fe Translationsterminationssignale eingeführt werden. Das 5′-Oligo wurde nach dem MuOPG-Startkodon (enthaltend eine HindIII-Restriktionsstelle) geschaffen, und die 3′-Oligonukleotide (ent haltend ein Stopkodon und eine XhoI-Stelle) wurden geschaffen, um die C-terminale Region von muOPG entweder bis zum Threonin rest 200 (CT 200), zum Prolin 212 (CT 212), zur Glutaminsäure 293 (CT-293), oder zum Serin 355 (CT-355) zu verkürzen.

Die folgenden Primer wurden zur Herstellung von muOPG [22-200] eingesetzt:

Die folgenden Primer wurden zur Herstellung von mOPG [22-212] eingesetzt:

Die folgenden Primer wurden zur Herstellung von muOPG [22-293] eingesetzt:

Die folgenden Primer wurden zur Herstellung von muOPG [22-355] eingesetzt:

Jedes resultierende, die passende Verkürzung aufweisende muOPG-ct-Plasmid wurde zur Transfektion von humanen 293-Zellen ver wendet, und das mutante OPG-Fc-Fusionsprotein wurde wie oben beschrieben aus konditioniertem Medium gereinigt. Die biologi sche Aktivität eines jeden Proteins wurde unter Anwendung des in Beispiel 11 beschriebenen in vitro-Assays zur Osteoklastenbil dung analysiert. Die konditionierten Medien wurden auch durch nicht-reduzierende SDS-PAGE und durch Western Blotting unter Verwendung von Anti-OPG-Antikörpern analysiert.

Eine Verkürzung der C-terminalen Region von OPG bewirkt die Fähigkeit von OPG zur Bildung von Homodimeren. CT 355 ist über wiegend monomer, obgleich einige Dimere gebildet werden. CT 293 bildet offenbar gleiche molare Mengen an Monomer und Dimer sowie ebenfalls höhermolekulare Aggregate. CT 212 und CT 200 sind jedoch monomer.

Beispiel 10 Reinigung von OPG A. Reinigung von Säuger-OPG-Fc-Fusionsproteinen

5 l eines von ein OPG-Fc-Fusionsprotein exprimierenden 293-Zel len konditionierten Mediums wurden wie folgt hergestellt. Eine gefrorene Zellprobe wurde in 10 ml 2935-Medium (glucosereiches DMEM, 1 × L-Glutamin, 10% hitzeinaktiviertes fetales bovines Serum (FBS) und 100 µg/ml Hygromycin) aufgetaut und nach 1 Tag mit frischem Medium ernährt. Nach 3 Tagen wurden die Zellen in Verdünnungen von 1 : 10 und 1 : 20 auf zwei T175-Flaschen aufge teilt. Zwei zusätzliche 1 : 10-Aufteilungen erfolgten für die Herstellung von 200 T175-Flaschen. Zu diesem Zeitpunkt waren die Zellen 5 Tage lang aufgetaut. Die Zellen wurden fast bis zur Konfluenz (etwa 3 Tage) kultiviert, und zu diesem Zeitpunkt wurde Serum enthaltendes Medium abgezogen, und die Zellen wurden 1-mal mit 25 ml PBS pro Flasche gewaschen, und jeder Flasche wurden 25 ml SF-Medium (glucose reiches DMEM, 1 × L-Glutamin) zugegeben. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei 5% CO₂ gehalten, und das Medium wurde geerntet, zentrifugiert und durch 0,45 µm Cellulosenitratfilter (Corning) filtriert.

Die OPG-Fc-Fusionsproteine wurden unter Verwendung einer Protein G-Sepharosesäule (Pharmacia) gereinigt, welche in PBS equili briert worden war. Die Säulengröße variierte in Abhängigkeit von dem Volumen an Ausgangsmedium. Das wie oben beschrieben präpa rierte konditionierte Medium wurde auf die Säule geladen, und die Säule wurde mit PBS gewaschen, und reines Protein eluierte unter Verwendung von 100 mM Glycin, pH-Wert 2,7. Die Fraktionen wurden in Röhrchen gesammelt, die 1 M Tris, pH-Wert 9,2, ent hielten, um so schnell wie möglich zu neutralisieren. Die Pro tein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, in einer Amicon-Centricon 10 oder -Centriprep 10 konzentriert und in PBS diafil triert. Das reine Protein wird bei -80°C aufbewahrt.

Anhand dieses Verfahrens wurden Murine [22-401]-Fc, Murine [22-180]-Fc, Murine [22-194]-Fc, human [22-401]-Fc und human [22-201]-Fc gereinigt. Murine [22-185]-Fc wird anhand dieses Ver fahrens aufgereinigt.

B. Herstellung von Anti-OPG-Antikörpern

Drei Kaninchen des Typs New Zealand White (5-8 Pfd. anfängliches Gewicht) erhielten das muOPG[22-401]-Fc-Fusionsprotein subkutan injiziert. Jedes Kaninchen wurde am Tag 1 immunisiert mit 50 µg Antigen, emulgiert in einem gleichen Volumen an Freund′s voll ständigem Adjuvans. Weitere Auffrischungen (Tage 14 und 28) erfolgten anhand derselben Vorgehensweise mit Substitution durch Freund′s unvollständigem Adjuvans. Die Antikörpertiter wurden durch EIA überwacht. Nach der zweiten Auffrischung ergaben die Antiseren hohe Antikörpertiter, und von jedem Tier wurden 25 ml gebildetes Blut erhalten. Die Seren wurden zuerst über eine Affinitätssäule geleitet, an der murine OPG-Fc immobilisiert worden war. Die Anti-OPG-Antikörper wurden eluiert mit Pierce Gentle Elution Buffer enthaltend 1% Eisessigsäure. Das eluierte Protein wurde anschließend in PBS dialysiert und über eine Fc-Säule geleitet, um jedwede für den Fc-Teil des OPG-Fusionspro teins spezifische Antikörper zu entfernen. Die Durchlauffraktio nen, die Anti-OPG-spezifische Antikörper enthielten, wurden in PBS dialysiert.

C. Reinigung von murine OPG [22-401] Antikörper-Affinitätschromatographie

Affinitäts-gereinigte Anti-OPG-Antikörper wurden in Kopplungs puffer (0,1 M Natriumcarbonat, pH-Wert 8,3, 0,5 M NaCl) diafil triert und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit CNBr-aktivier ten Sepharose-Kügelchen (Pharmacia) vermischt. Das Harz wurde anschließend ausgiebig mit Kopplungspuffer gewaschen, bevor unbesetzte Stellen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 1 M Ethanolamin (pH-Wert 8,0) blockiert wurden. Das Harz wurde an schließend zuerst bei niedrigem pH-Wert (0,1 M Natriumacetat, (pH-Wert 4,0, 0,5 M NaCl) und anschließend bei einem hohen pH-Wert (0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,5 M NaCl) gewaschen. Die letzten Wäschen wurden 3mal wiederholt. Das Harz wurde schließ lich vor der Packung in die Säule mit PBS equilibriert. Sobald die Packung erfolgt war, wurde das Harz mit PBS gewaschen. Eine Blindelution erfolgte mit 0,1 M Glycin-HCl, pH-Wert 2,5, gefolgt von einer Reequilibrierung mit PBS.

Das konzentrierte, von muOPG[22-410] exprimierenden CHO-Zellen konditionierte Medium wurde auf die Säule mit einer geringen Fließgeschwindigkeit aufgetragen. Die Säule wurde mit PBS gewa schen, bis die bei 280 nm gemessene UV-Absorption wieder die Grundlinie erreichte. Das Protein wurde aus der Säule zuerst mit 0,1 M Glycin-HCl (pH-Wert 2,5) eluiert, bevor mit PBS reequili briert und mit einem zweiten Puffer (0,1 M CAPS, pH-Wert 10,5, 1 M NaCl) eluiert wurde. Die beiden Elutionspools wurden ge trennt in PBS diafiltriert und vor dem Einfrieren auf -20°C steril filtriert.

Konventionelle Chromatographie

Das von CHO-Zellen konditionierte Medium wurde 23fach in einer 20 spiralförmigen Wundpatrone von Amicon (S10Y10) konzentriert und in 20 mM Tris, pH-Wert 8,0, diafiltriert. Das diafiltrierte Medium wurde anschließend auf eine Q-Sepharose HP (Pharmacia)- Säule aufgetragen, welche mit 20 mM Tris, pH-Wert 8,0, equili briert worden war. Die Säule wurde anschließend gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm die Grundlinie erreichte. Das Protein wurde mit einem 20 Säulenvolumen umfassenden Gradienten von 0- 300 mM NaCl in Tris, pH-Wert 8,0, eluiert. Das OPG-Protein wurde durch Anwendung eines Western Blots der Säulenfraktionen nach gewiesen.

Die OPG enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und auf eine Endkonzentration von 300 mM NaCl, 0,2 mM DTT gebracht. Eine NiNTA-Superose (Qiagen)-Säule wurde mit 20 mM Tris, pH-Wert 8,0, 300 mM NaCl, 0,2 mM DTT equilibriert, bevor die vereinigten Fraktionen aufgetragen wurden. Die Säule wurde mit Equilibrie rungspuffer gewaschen, bis die Grundabsorption erreicht war. Die Proteine wurden aus der Säule mit einem 0-30 mM Imidazol-Gra dienten in Equilibrierungspuffer eluiert. Die verbleibenden Proteine wurden von der Säule mit 1 M Imidazol gewaschen. Wie derum wurde ein Western Blot angewendet, um die OPG enthaltenden Fraktionen nachzuweisen.

Die vereinigten Fraktionen aus der NiNTA-Säule wurden dialysiert in 10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,0, 0,2 mM DTT. Der dialysier te Pool wurde anschließend auf eine keramische Hydroxylapatit-Säule (Bio-Rad) aufgetragen, welche mit 10 mM Phosphatpuffer equilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule wurde das Protein mit einem 20 Säulenvolumen umfassenden 10-100 mM Kalium phosphat-Gradienten eluiert. Hieran schloß sich ein 20 Säulenvo lumen umfassender Gradient von 100-400 mM Phosphat an.

OPG wurde mittels Coomassieblau-Färbung der SDS-Polyacrylamidge le und durch Western Blotting nachgewiesen. Die Fraktionen wur den vereinigt und in PBS diafiltriert und bei -80°C eingefro ren. Das gereinigte Protein läuft als Monomer und wird in dieser Form nach Diafiltration in PBS verbleiben. Das Monomer ist sta bil, wenn es eingefroren oder bei pH-Wert 5 und 4°C aufbewahrt wird. Bei der Lagerung bei 4°C in PBS werden sich nach 1 Woche jedoch Dimere und solche Formen bilden, die offenbar Trimere und Tetramere sind.

D. Reinigung von human OPG met[22-401] aus E. coli

Die bakterielle Zellpaste wurde unter Verwendung eines Humogeni sators mit geringer Scherkraft bei 5°C in 10 mM EDTA in einer Konzentration von 15% (Gew./Vol.) suspendiert. Die Zellen wur den anschließend durch zwei Homogenisationen mit jeweils 15 000 psi bei 5°C aufgebrochen. Das resultierende Homogenat wurde 1 Stunde lang bei 5°C mit 5000 × g zentrifugiert. Das Zentrifugalsediment wurde durch Homogenisation mit geringer Scherkraft in einer dem ursprünglichen Homogenisationsvolumen entsprechenden Wassermenge gewaschen und nachfolgend wie zuvor zentrifugiert. Das gewaschene Pellet wurde anschließend bei Raumtemperatur für 30 Minuten löslich gemacht auf 15% (Gew./Vol.) durch eine Lösung von (Endkonzentration) 6 M Guani din-HCl, 10 mM Dithiotreitol, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,5. Diese Lösung wurde 30fach verdünnt in 2 M Harnstoff enthaltend 50 mM CAPS, pH-Wert 10,5, 1 mM reduziertes Glutathion, bevor 72 Stun den lang bei 5°C gerührt wurde. Das OPG wurde aus dieser Lösung bei 25°C gereinigt, indem zunächst der pH-Wert mit Essigsäure auf 4,5 eingestellt und anschließend eine Chromatographie unter Verwendung einer Säule von SP-HP-Sepharoseharz durchgeführt wurde, das mit 25 mM Natriumacetat, pH-Wert 4,5, equilibriert worden war. Die Elution der Säule erfolgte bei einer Fließge schwindigkeit von 0,1 Säulenvolumen/Minute mit einem 20 Säulen volumen umfassenden linearen Natriumchlorid-Gradienten von 50 mM bis 550 mM in dem selben Puffer. Die lediglich die erwünschte OPG-Form enthaltenden Peak-Fraktionen wurden vereinigt und bei 5°C aufbewahrt, oder der Puffer wurde durch Phosphat-gepufferte Saline ausgetauscht, und es erfolgte eine Konzentration durch Ultrafiltration und eine anschließende Aufbewahrung bei 5°C. Dieses Material wurde analysiert mittels Umkehrphasen-HPLC, SDS-PAGE, Limulus Amöbozyten-Lysat-Assay auf Anwesenheit von Endoto xin, und N-terminale Sequenzierung. Zusätzlich können zur Unter suchung der gefalteten Beschaffenheit des Proteins Techniken eingesetzt werden wie Massenspektrometrie, pH/Temperaturstabili täts-, Fluoreszenz-, Zirkulardichroismus-, Differentialscanning- Kalorimetrie-, und Protease-Profil-Assays.

Beispiel 11 Biologische Aktivität von rekombinantem OPG

Auf der Grundlage der Histologie und Histomorphometrie wurde die Anzahl an Osteoklasten durch hepatische Überexpression von OPG in transgenen Mäusen offenbar deutlich reduziert, was zu einer deutlichen Zunahme des Knochengewebes führte (siehe Beispiel 4). Um eine tieferen Einblick in potentielle Mechanismen zu erhal ten, die diesem in vivo-Effekt zugrundeliegen, sind vielfältige Formen von rekombinantem OPG in einem in vitro-Kulturmodell zur Osteoklastenbildung untersucht worden (Assay zur Osteoklasten bildung). Dieses Kultursystem wurde ursprünglich von Udagawa ausgearbeitet (Udagawa et al., Endocrinology 125, 1805-1813 (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7260-7264 (1990)) und macht Verwendung von einer Kombination aus Knochenmarkzellen und Zellen von Knochenmark-Stromazellinien. Eine Beschreibung des für diese Untersuchungen angewendeten modifizierten Kultursy stems ist zuvor veröffentlicht worden (Lacey et al., Endocrino logy 136, 2367-2376 (1995)). Bei diesem Verfahren werden aus den Femuren und Tibias von Mäusen ausgespülte Knochenmarkzellen über Nacht in Kulturmedium kultiviert (α-MEM mit 10% hitzeinakti viertem fetalen bovinen Serum), ergänzt mit 500 U/ml CSF-1 (Ko lonie-stimulierender Faktor 1, auch mit M-CSF bezeichnet), einem für Zellen der Monozyten/Makrophagen-Familienabstammung spezifi scher hämatopoetischer Wachstumsfaktor. Im Anschluß an diese Inkubation werden die nicht-adhärierenden Zellen gesammelt, einer Gradientenreinigung zugeführt und anschließend mit Zellen der Knochenmarkzellinie ST2 kokultiviert (1 × 10⁶ nicht-adhärie rende Zellen: 1 × 10⁵ ST2-Zellen/ml Medium). Das Medium wird mit Dexamethason (100 nM) und dem als 1,25-Dihydroxyvitamin D3 be kannten biologisch aktiven Metaboliten von Vitamin D3 angereichert (1,25 (OH) 2 D3, 10 nM). Um das Erscheinen von Osteoklasten zu verstärken, wird einigen Kulturen Prostaglandin E2 (250 nM) zugegeben. Die Zeitdauer der Kokultivierung liegt gewöhnlich im Bereich von 8 bis 10 Tagen, und das Medium, bei dem sämtliche Zusatzstoffe frisch zugegeben werden, wird alle 3 bis 4 Tage erneuert. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden die Kulturen auf Anwesenheit von Tartrat-resistenter saurer phospha tase (TRAP) entweder unter Anwendung einer histochemischen Fär bung (Sigma Kit #387A, Sigma, St. Louis, MO) oder durch den TRAP-Lösungsassay untersucht. Das histochemische TRAP-Verfahren erlaubt die phänotypische Identifizierung von Osteoklasten, die viele ( 3) Zellkerne aufweisen und ebenfalls TRAP+ sind. Der Lösungsassay beinhaltet die Lyse der Osteoklasten enthaltenden Kulturen in einem 0,1% Triton X-100 enthaltenden Citratpuffer (100 mM, pH-Wert 5,0). Die Aktivität der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase wird anschließend auf der Basis der Umwand lung von p-Nitrophenylphosphat (20 nM) zu p-Nitrophenol in Ge genwart von 80 mM Natriumtartrat gemessen, die während einer 3 bis 5 Minuten langen Inkubation bei RT auftritt. Die Reaktion wird abgebrochen durch Zugabe von NaOH in einer Endkonzentration von 0,5 M. Die optische Dichte bei 405 nm wird gemessen, und die Ergebnisse werden ausgewertet.

Vorhergehende Studien (Udagawa et al., ibid.) unter Anwendung des Assays zur Osteoklastenbildung haben gezeigt, daß diese Zellen Rezeptoren für ¹²⁵I-Calcitonin exprimieren (Autoradiogra phie) und auf Knochenoberflächen Pits machen können, die in Kombination mit der TRAP-Positivität bestätigen, daß die viel kernigen Zellen einen Osteoklasten-Phänotyp aufweisen. Zusätzli che Befunde zur Stützung des Osteoklasten-Phänotyps der vielker nigen Zellen, die im Osteoklasten-Bildungsassay in vitro ent stehen, sind, daß die Zellen nach Immunzytochemie αv- und β3-Integrine und nach in situ-Hybridisierung (ISH) den Calcitonin-Rezeptor und die TRAP-mRNA exprimieren.

Die huOPG [22-401]-Fc-Fusion wurde aus dem von CHO-Zellen kon ditionierten Medium gereinigt und nachfolgend im Osteoklasten-Bildungsassay eingesetzt. Bei 100 ng/ml huOPG [22-401]-Fc war die Osteoklastenbildung praktisch zu 100% inhibiert (Fig. 19A). Die in lysierten Kulturen in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten gemessenen TRAP-Werte wurden in Gegenwart von OPG mit einem ID₅₀-Wert von ungefähr 3 ng/ml ebenfalls inhibiert (Fig. 20). Das Ausmaß der TRAP-Aktivität in Lysaten war offen bar mit der relativen, durch TRAP-Zytochemie ermittelten Anzahl an Osteoklasten korreliert (vgl. Fig. 19A-19G und 20). Ge reinigtes humanes IgG1 und TNFbp wurden in diesem Modell eben falls untersucht, und es wurde gefunden, daß sie keine hemmenden oder stimulierenden Effekte aufweisen, wodurch angedeutet wird, daß die inhibitorischen Effekte von huOPG [22-401]-Fc auf den OPG-Teil des Fusionsproteins zurückzuführen sind. Zusätzliche Formen der humanen und murinen Moleküle sind untersucht worden, und die kumulativen Daten sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Effekte vielfältiger zahlreicher OPG-Formen auf die in vitro- Osteoklastenbildung

Die kumulativen Daten legen nahe, daß die murinen und humanen OPG-Aminosäuresequenzen 22-401 in vitro vollständig aktiv sind, wenn sie entweder mit der Fc-Domäne fusioniert sind oder unfu sioniert vorliegen. Sie inhibieren in einer dosisabhängigen Weise und besitzen im Bereich von 2-10 ng/ml halbmaximale Akti vitäten. Eine Verkürzung des murinen C-Terminus am Threoninrest 180 führt zur Inaktivierung des Moleküls, wohingegen Verkürzun gen am Cystein 185 und darüber hinaus vollständige Aktivität aufweisen. Der an Position 185 lokalisierte Cysteinrest bildet vorhersagegemäß eine SS3-Bindung in der Region der Domäne 4 von OPG. Eine Entfernung dieses Rests in anderen TNFR-verwandten Proteinen ist zuvor als die biologische Aktivität aufhebend beschrieben worden (Yan et al., J. Biol. Chem. 266, 12 099-12 104 (1994)). Unser Befund, daß muOPG [22-180]-Fc inaktiv ist, wäh rend muOPG [22-185]-Fc aktiv ist, stimmt mit diesen Befunden überein. Hierdurch wird nahegelegt, daß die Aminosäurereste 22-185 eine Region für die OPG-Aktivität definieren.

Diese Befunden zeigen an, daß das rekombinante OPG-Protein, wie auch transgen exprimiertes OPG, die Osteoklastenbildung unter drückte, wie anhand des Osteoklasten-Bildungsassays festgestellt wurde. Die Experimente hinsichtlich des Zeitverlaufs zur Unter suchung des Erscheinens von TRAP+-Zellen, β3+-Zellen und F480+-Zellen in Kulturen, die kontinuierlich mit OPG exponiert wurden, zeigen, daß OPG das Erscheinen von TRAP+- und β+-Zellen, nicht aber von F480+-Zellen blockiert. Im Gegensatz dazu erscheinen TRAP+- und β3+-Zellen in Kontrollkulturen am 4. Tag nach Kultur beginn. In mit OPG behandelten Kulturen können lediglich F480+-Zellen gefunden werden, und sie sind offenbar qualitativ in derselben Anzahl wie in den Kontrollkulturen vorhanden. Demgemäß ist bei dem Mechanismus der OPG-Effekte in vitro offenbar eine Blockierung der Osteoklastendifferenzierung nach dem Erscheinen von Monozyten-Makrophagen, aber vor dem Erscheinen von Zellen beteiligt, die entweder TRAP oder β3-Integrine exprimieren. Zusammengenommen zeigen diese Befunde, daß OPG nicht mit dem allgemeinen Wachstum und der Differenzierung von Monozyten/Ma krophagen-Vorläufern im Knochenmark interferiert, sondern aus ihnen folgt vielmehr, daß OPG in spezifischer Weise die selekti ve Differenzierung von Osteoklasten aus Monozyten/Makrophagen-Vorläufern blockiert.

Zur genaueren Untersuchung, zu welchem Zeitpunkt OPG die Osteo klastendifferenzierung hemmte, wurde eine Variation des in vi tro-Kulturverfahrens angewendet. Bei dieser beschriebenen (Lacey et al., ibid.) Variation werden Makrophagen des Knochenmarks als Osteoklastenvorläufer eingesetzt. Die Osteoklastenvorläufer werden abgeleitet durch Entnahme der nach einer Übernacht-Inku bation in CSF-1/M-CSF nicht-adhärierenden Knochenmarkzellen und Kultivieren der Zellen für zusätzliche 4 Tage mit 1000-2000 U/ml CSF-1. Nach einer Kulturdauer von 4 Tagen, die als Wachstumsphase bezeichnet wird, werden die nicht-zusammenhängen den Zellen entfernt. Die adhärierenden Zellen, welche Knochen mark-Makrophagen sind, können anschließend für bis zu 2 Tage vielfältigen Behandlungen in Gegenwart von 1000-2000 U/ml CSF-1 ausgesetzt werden. Diese 2tägige Periode wird intermediäre Differenzierungsperiode genannt. Anschließend werden die Zell schichten wieder abgespült, und dann werden ST-2-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/ml), Dexamethason (100 nM) und 1,25 (OH) 2 D3 (10 nM) für die letzten 8 Tage zugegeben, was als terminale Differenzie rungsperiode bezeichnet wird. Während dieser terminalen Periode können gleichermaßen Testagentien zugegeben werden. Die Aneig nung phänotypischer Marker der Osteoklastendifferenzierung er folgt während dieser terminalen Periode (Lacey et al., ibid.).

Im Rahmen dieses Modells wurde huOPG [22-40l]-Fc (100 ng/ml) untersucht auf seine Effekte auf die Osteoklastenbildung, indem es entweder während der intermediären, terminalen, oder, alter nativ, während beider Differenzierungsperioden zugegeben wurde. Sowohl TRAP-Zytochemie- als auch Lösungs-Assays wurden durch geführt. Die Ergebnisse des Lösungs-Assays sind in Fig. 21 dargestellt. HuOPG [22-401]-Fc inhibierte das Auftreten der TRAP-Aktivität, wenn es sowohl in der intermediären als auch in der terminalen Phase oder lediglich in der terminalen Differen zierungsphase zugegeben wurde. Im Falle der Zugabe während der intermediären Phase und der anschließenden Entfernung aus den Kulturen durch Abspülen blockierte huOPG [22-401]-Fc nicht das Auftreten der TRAP-Aktivität in Kulturlysaten. Die zytochemi schen Ergebnisse verlaufen parallel zu den Daten des Lösungs-Assays. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, daß huOPG [22-401]-Fc lediglich während der terminalen Differenzierungs periode anwesend zu sein braucht, um sämtliche seiner suppressi ven Effekte auf die Osteoklastenbildung auszuüben.

B. In vivo-Immunitätsexperimente mit IL1-α und IL1-β

IL1 erhöht die Knochenresorption sowohl systemisch als auch lokal, wenn es über die Calvaria von Mäusen subkutan injiziert wird (Boyce et al., Endocrinology 125, 1142-1150 (1989)). Die systemischen Effekte können anhand des Ausmaßes an Hyperkalzämie und der lokalen Effekte histologisch bewertet werden, indem die relative Stärke des Osteoklasten-vermittelten Ansprechens er mittelt wird. Das Ziel dieser Experimente lag in der Klärung der Frage, ob rekombinantes muOPG [22-401]-Fc die lokalen und/oder systemischen Wirkungen von Il1 modifizieren könnte, wenn es über dieselbe Region der Calvaria wie IL1 subkutan injiziert wird.

Experiment mit IL-1β

Männliche Mäuse (ICR-Swiss white) im Alter von 4 Wochen wurden in die folgenden Behandlungsgruppen aufgeteilt (5 Mäuse pro Gruppe): Kontrollgruppe: mit IL1 behandelte Tiere (Mäuse erhiel ten 1 Injektion/Tag von 2,5 µg IL1-β); mit niedriger Dosis von muOPG [22-40l]-Fc behandelte Tiere (Mäuse erhielten 3 Injektio nen/Tag von 1 µg muOPG [22-401]-Fc); niedrige Dosis von muOPG [22-401]-Fc und IL1-β; mit hoher Dosis von muOPG [22-401]-Fc behandelte Tiere (Mäuse erhielten 3 Injektionen/Tag von 10 µg muOPG [22-401]-Fc); hohe Dosis von muOPG [22-401]-Fc und IL1-β. Sämtliche Mäuse erhielten die selbe Gesamtanzahl an Injektionen von entweder aktivem Faktor oder Träger (0,1% bovines Serumal bumin in Phosphat-gepufferter Saline). Sämtliche Gruppen wurden am Tag nach der letzten Injektion eingeschläfert. Die Gewichte und Blutwerte an ionisiertem Calcium werden vor den ersten In jektionen, 4 Stunden nach der zweiten Injektion und 24 Stunden nach der dritten IL1-Injektion kurz vor dem Einschläfern der Tiere gemessen. Nach dem Einschläfern wurde die Calvaria ent fernt und für die Herstellung von Paraffinschnitten vorbereitet.

Experimente mit IL1-α

Männliche Mäuse (ICR-Swiss white) im Alter von 4 Wochen wurden in die folgenden Behandlungsgruppen unterteilt (5 Mäuse pro Gruppe): Kontrollgruppe: mit IL1-α behandelte Tiere (Mäuse er hielten 1 Injektion/Tag von 5 µg IL1-α); mit niedriger Dosis von muOPG [22-401]-Fc behandelte Tiere (Mäuse erhielten 1 Injek tion/Tag von 10 µg muOPG [22-401]-Fc); niedrige Dosis von muOPG [22-401]-Fc und IL1-α (Dosierung wie oben); mit hoher Dosis von muOPG [22-401]-Fc behandelte Tiere (Mäuse erhielten 3 Injektio nen/Tag von 10 µg muOPG [22-401]-Fc); hohe Dosis von muOPG [22-401]-Fc und IL1-α. Sämtliche Mäuse erhielten dieselbe Anzahl an Injektionen/Tag von entweder aktivem Faktor oder Träger. Sämtli che Gruppen wurden am Tag nach der letzten Injektion eingeschlä fert. Die Messung der Blutwerte an ionisiertem Calcium erfolgte vor der ersten Injektion, 4 Stunden nach der zweiten Injektion und 24 Stunden nach der dritten IL1-Injektion kurz bevor die Tiere eingeschläfert wurden. Die Gewichte der Tiere wurden vor der ersten Injektion, 4 Stunden nach der zweiten Injektion und 24 Stunden nach der dritten IL1-Injektion und 24 Stunden nach der dritten IL1-Injektion kurz vor dem Einschläfern der Tiere gemessen. Nach dem Einschläfern wurde die Calvaria entfernt und für die Herstellung von Paraffinschnitten vorbereitet.

Histologische Verfahren

Knochenproben des Schädeldaches wurden in Zinkformalin fixiert, in Ameisensäure entkalkt, durch Ethanol entwässert und in Paraf fin eingebettet. Schnitte (5 µm dick) durch die Calvaria erfolg ten neben der Sutura lamdoideus, und sie wurden entweder mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt oder hinsichtlich der Tartrat resistenten sauren Phosphatase-Aktivität (Sigma Kit #387A) umge setzt und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Bewertung der Kno chenresorption in den mit IL1-α behandelten Mäusen erfolgte mittels histomorphometrischer Verfahren unter Anwendung der Osteomessung (Osteometrics, Atlanta, GA), bei der histologische Merkmale durch Verwendung einer an einem Mikroskop angebrachten Kamera auf eine A/D-Umsetzerplatte aufgezeichnet werden. Die Bestimmung der Anzahl an Osteoklasten, der mit Osteoklasten geschichteten Oberflächen, sowie der zerfressenen Oberflächen erfolgte in den Markhöhlen des Schädeldachknochens. Die inji zierten und nicht-injizierten Seiten der Calvaria wurden ge trennt gemessen.

Ergebnisse

Bei den eingesetzten Dosierungen kam es, insbesondere am zweiten Tag, durch IL1-α und IL1-β zu einer Hyperkalzämie, was vermut lich auf die Induktion einer erhöhten systemischen Knochenre sorption zurückzuführen ist. Die hyperkalzämische Reaktion wurde in den mit IL1-β behandelten Mäusen durch muOPG [22-401]-Fc blockiert und verminderte sich in mit IL1-α behandelten Mäusen signifikant, wobei der Effekt am zweiten Tag am offensichtlich sten war (Fig. 22A, 22B).

Eine histologische Analyse der Schädeldächer von mit IL1-α und -β behandelten Mäusen zeigt, daß Behandlungen mit IL1 alleine zu einem deutlichen Anstieg der mit der Knochenresorption im Zu sammenhang stehenden Indizes führen, einschließlich: Anzahl an Osteoklasten, mit Osteoklasten besetzte Oberflächen, und zer fressene Oberflächen (Oberflächen, die aufgrund der osteoklasti schen Wirkung eine tiefe Aussackung aufweisen) (Fig. 23B, Ta belle 2). Die Zunahmen der Knochenresorption als Antwort auf IL1-α oder IL1-β waren auf den injizierten und nicht-injizierten Seiten der Calvaria ähnlich. Injektionen mit muOPG [22-401]-Fc führten zu einer Verminderung der Knochenresorption sowohl in mit IL1-α und IL1-β behandelten Mäusen als auch in Mäusen, die den Träger allein erhielten, aber diese Abnahme wurde lediglich auf den mit muOPG [22-401]-Fc injizierten Seiten der Calvaria beobachtet.

Die wahrscheinlichste Erklärung für diese Beobachtungen ist, daß muOPG [22-401]-Fc die Knochenresorption inhibierte, und diese Schlußfolgerung wird gestützt durch die Reduktion der Gesamtzahl von Osteoklasten und des Prozentgehaltes der für eine Knochenre sorption zur Verfügung stehenden Knochenoberfläche in der Region der Calvaria nahe den Stellen der Injektion von muOPG [22-401]-Fc. Die Wirkungen von muOPG [22-401]-Fc schienen aufgrund histo logischer Untersuchungen lokal am deutlichsten zu sein, aber die Tatsache, daß muOPG [22-401]-Fc auch die durch IL1 induzierte Hyperkalzämie abdämpft, legt nahe, daß muOPG [22-401]-Fc syste misch mehr feine Effekte auf die Knochenresorption ausübt.

C. Systemische Effekte von muOPG [22-401]-Fc in wachsenden Mäusen

Männliche BDF1-Mäuse im Alter von 3 bis 4 Wochen mit einem Ge wicht im Bereich von 9,2-15,7 g wurden in jeweils 10 Mäuse um fassende Gruppen aufgeteilt. Diese Mäuse erhielten subkutane Injektionen mit Saline oder muOPG [22-401]-Fc 2,5 mg/kg bid für eine Zeitdauer von 14 Tagen (5 mg/kg/Tag). Die Mäuse wurden vor der Behandlung, am Tag 7 und am Tag 14 einer Röntgenaufnahme zugeführt. Die Mäuse wurden 24 Stunden nach der letzten Injek tion eingeschläfert. Der rechte Oberschenkel wurde entfernt, in Zinkformalin fixiert, in Ameisensäure entkalkt und in Paraffin eingebettet. Schnitte erfolgten durch die mittlere Region der distalen femoralen Metaphyse und den Femurschaft. Die Knochen dichte wurde mittels Histomorphometrie in 6 benachbarten Regio nen ermittelt, die sich von der metaphysären Grenze der Wachs tumszone durch die primäre und sekundäre Spongiosa bis in die femorale Diaphyse (Schaft) erstrecken. Jede Region betrug 0,5 × 0,5 mm

Unterschiede der Röntgenaufnahmen

Nach einer Behandlungsdauer von 7 Tagen gab es in den OPG-behan delten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen Anzeichen einer Zone mit erhöhter Knochendichte in der mit den Wachstumszonen assoziierten Spongiosa. Die Effekte waren in den distalen, femo ralen und den proximalen tibialen Metaphysen besonders deutlich ausgeprägt (Fig. 24A-24B). Banden erhöhter Dichte waren jedoch auch in den Wirbelkörpern, der Ileum-Knochenleiste und der dis talen Tibia vorhanden. Nach 14 Tagen hatten sich die Regionen der Opazität weiter in die femoralen und tibialen Knochenschäfte erstreckt, obgleich die Intensität der Radioopazität vermindert war. Zusätzlich gab es hinsichtlich der Länge der Oberschenkel beim Abschluß des Experiments oder hinsichtlich der Veränderung der Länge über die Zeitdauer des Experiments keine Unterschiede, was bedeutet, daß OPG das Knochenwachstum nicht verändert.

Histologische Veränderungen

Die distale femorale Metaphyse zeigt in Regionen mit einem Ab stand von 1,1 bis 2,65 mm von der Wachstumszone eine erhöhte Knochendichte (Fig. 25 und 26A bis 26B). Dies ist eine Re gion, in der es durch Osteoklasten-vermittelte Knochenresorption in Mäusen zu einem raschen Knochenschwund kommt. In diesen schnell wachsenden jungen Mäusen stimmt die bei der Behandlung mit OPG in dieser Region beobachtete Knochenzunahme mit einer Hemmung der Knochenresorption überein.

D. Effekte von Osteoprotegerin auf den durch Ovarektomie induzierten Knochenschwund in der Ratte

12 Wochen alte weibliche Fisher-Ratten wurden einer Ovarektomie (OVX) oder einer Scheinoperation zugeführt, und es erfolgten duale Röntgenabsorptiometrie (DEXA)-Messungen der Knochendichte in der distalen femoralen Metaphyse. Nach einer Erholungsdauer von 3 Tagen erhielten die Tiere über einen Zeitraum von 14 Tagen täglich folgende Injektionen: 10 scheinoperierte Tiere erhielten Trägerstoff (Phosphat-gepufferte Saline); 10 OVX-Tiere erhielten Trägerstoff (Phosphat-gepufferte Saline); 6 OVX-Tiere erhielten OPG-Fc 5 mg/kg SC; 6 OVX-Tiere erhielten Pamidronat (PAM) 5 mg/ kg SC; 6 OVX-Tiere erhielten Östrogen (ESTR) 40 kg/kg SC. Nach einer Behandlungsdauer von 7 und 14 Tagen wurde die Knochendich te der Tiere durch DEXA gemessen. 2 Tage nach der letzten Injek tion wurden die Tiere eingeschläfert, und die rechte Tibia und der Femur wurden für eine histologische Auswertung entnommen.

Die DEXA-Messungen der Knochendichte zeigten einen Trend zur Reduktion der Knochendichte nach Ovarektomie, welcher durch OPG-Fc blockiert wurde. Seine Effekte waren denjenigen der bekannten Antiresorptionsmittel Östrogen und Pamidronat ähnlich. (Fig. 27). Die histomorphometrische Analyse bestätigte diese Be obachtungen und zeigte, daß eine Behandlung mit OPG-Fc in OVX-Ratten zu einer signifikant höheren Knochendichte führt, als sie bei unbehandelten OVX-Ratten festgestellt wurde (Fig. 28). Diese Ergebnisse bestätigen die Aktivität von OPG beim Knochen schwund, der mit einem Entzug von endogenem Östrogen im Anschluß an eine Ovarektomie assoziiert ist.

Zusammenfassung der in vivo-Wirkungen

Die in vivo-Wirkungen von rekombinantem OPG verlaufen parallel zu den Veränderungen, die bei OPG-transgenen Mäusen beobachtet wurden. Die bei den OPG-transgenen Mäusen festgestellte Vermin derung der Anzahl an Osteoklasten wird reproduziert durch loka les Injizieren von rekombinantem OPG über die Calvaria von nor malen Mäusen und Mäusen, die mit IL1-α oder IL1-β behandelt wurden. Die OPG-transgenen Mäuse entwickeln einen Osteopetrose-Phänotyp mit progressivem Auffüllen der Markhöhle mit Knochen und nicht-umgeformtem Knorpel, der sich von den Wachstumszonen erstreckt, vom Tag 1 nach der Geburt beginnend. In normalen 3 Wochen alten (wachsenden) Mäusen führten die Behandlungen mit OPG ebenfalls zur Retention von Knochen und nicht-umgeformtem Knorpel in Regionen intercartilaginärer Knochenbildung, wobei dieser Effekt radiographisch beobachtet und histologisch bestä tigt wurde. Demgemäß führt rekombinantes OPG zu phänotypischen Veränderungen von normalen Tieren, die denen ähnlich sind, die bei den transgenen Tieren beobachtet werden, und die Veränderun gen stimmen mit der durch OPG induzierten Hemmung der Knochenre sorption überein. Auf der Grundlage von in vitro-Assays zur Osteoklastenbildung liegt ein signifikanter Anteil dieser Hem mung an einer beeinträchtigten Osteoklastenbildung. In Überein stimmung mit dieser Hypothese blockiert OPG in der Ratte eine durch Ovarektomie induzierte Osteoporose. Der Knochenschwund in diesem Modell wird bekanntermaßen durch aktivierte Osteoklasten vermittelt, was darauf hinweist, daß OPG bei der Behandlung von primärer Osteoporose eine Rolle spielt.

Beispiel 12 PEG-Derivate von OPG Herstellung von N-terminalen PEG-OPG-Konjugaten durch reduktive Alkylierung

Der Puffer von HuOPG met [22-194] P25A wurde durch 25-50 mM NaOAc, pH-Wert 4,5-4,8, ersetzt, und die Konzentration wurde auf 2-5 mg/ml eingestellt. Diese Lösung wurde zur Steuerung einer reduktiven OPG-Alkylierung mit monofunktionellen PEG-Aldehyden bei 5-7°C eingesetzt. Der OPG-Lösung wurden lineare oder ver zweigte monofunktionelle PEG-Aldehyde mit einer relativen Mole külmasse von 1 bis 57 kD (erhältlich von Shearwater Polymers) als Feststoffe in Mengen von 2-4 Mol PEG-Aldehyd pro Mol OPG angegeben. Nach Auflösung des Polymers in der Proteinlösung wurde Natriumcyanometallborhydrid einer frisch zubereiteten 1-1,6 M Stammlösung in kaltem entionisierten Wasser zugegeben, um in der Reaktionsmischung eine Endkonzentration von 15 bis 20 mM zu erhalten. Das Voranschreiten der Reaktion und das Ausmaß der Derivatisierung von OPG durch PEG (OPG-PEGylierung) wurde über wacht durch Größenausschluß-HPLC auf einer G3000SW_XL-Säule (Toso Haas), eluierend mit 100 mM NaPO₄, 0,5 M NaCl, 10% Ethanol, pH-Wert 6,9. Typischerweise ließ man die Reaktion 16 bis 18 Stunden lang ablaufen, wonach die Reaktionsmischung 6 bis 8fach verdünnt und der pH-Wert auf 3,5-4 abgesenkt wurde. Die Reaktionsmischung wurde fraktioniert durch Ionenaustauschchromatographie (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia), eluierend mit 20 mM NaOAc, pH-Wert 4, mit einem 25 Säulenvolumen umfassenden linearen Gradienten auf 0,75 M NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 30 cm/Std. Frak tionen von mono-, di- oder poly-PEGyliertem OPG wurden vereinigt und mittels SEC HPLC und SDS-PAGE charakterisiert. Durch N-ter minale Sequenzierung wurde nachgewiesen, daß das monoPEG-OPG-Konjugat als Hauptreaktionsprodukt in den meisten Fällen zu 98% N-terminal PEG-modifiziertes OPG war.

Diese Vorgehensweise wurde allgemein angewendet, um die folgen den N-terminalen PEG-OPG-Konjugate herzustellen (wo OPG HuOPG met [22-194] P25A ist; 5 kD monoPEG, 10 kD mono-verzweigtes PEG, 12 kD monoPEG, 20 kD monoPEG, 20 kD mono-verzweigtes PEG, 25 kD monoPEG, 31 kD monoPEG, 57 kD monoPEG, 12 kD diPEG, 25 kD diPEG, 31 kD diPEG, 57 kD diPEG, 25 kD triPEG.

Herstellung von PEG-OPG-Konjugaten durch Acylierung

Der Puffer von HuOPG met [22-194] P25A wurde ausgetauscht durch 50 mM BICINE-Puffer, pH-Wert 8, und die Konzentration wurde auf 2-3 mg/ml eingestellt. Diese Lösung wurde verwendet, um die Acylierung von OPG mit monofunktionellen PEG N-Hydroxysuccinimi dylestern bei Raumtemperatur zu steuern. Der OPG-Lösung wurden lineare oder verzweigte PEG N-Hydroxysuccinimidylester mit einer relativen Molekülmasse von 1 bis 57 kD (erhältlich von Shearwa ter Polymers) als Feststoffe in Mengen zugegeben, die 4-8 Mol PEG N-Hydroxysuccinimidylester pro Mol OPG entsprechen. Das Vor anschreiten der Reaktion und das Ausmaß der Derivatisierung von OPG mit PEG wurde überwacht durch Größenausschluß-HPLC auf einer G3000SW_XL-Säule (Toso Haas), eluierend mit 100 mM NaPO₄, 0,5 M NaCl, 10% Ethanol, pH-Wert 6,9. Typischerweise ließ man die Reaktion 1 Stunde lang ablaufen, wonach die Reaktionsmischung 6 bis 8fach verdünnt und der pH-Wert auf 3,5-4 abgesenkt wurde. Die Reaktionsmischung wurde fraktioniert durch Ionenaustausch chromatographie (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia), eluierend mit 20 mM NaOAc, pH-Wert 4, mit einem 25 Säulenvolumen umfassenden linearen Gradienten auf 0,75 M NaCl bei einer Fließgeschwindig keit von 30 cm/Std. Fraktionen von mono-, di- oder poly-PEGyliertem OPG wurden vereinigt und mittels SEC HPLC und SDS-PAGE charakterisiert.

Diese Vorgehensweise wurde allgemein angewendet, um die folgen den PEG-OPG-Konjugate herzustellen: 5 kD polyPEG, 20 kD polyPEG, 40 kD poly-verzweigtes PEG, 50 kD polyPEG.

Herstellung von dimerem PEG-OPG

HuOPG met [22-194] P25A wird zur Thiolierung bei 1-3 mg/ml in einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert nahe dem neutralen Be reich vorbereitet. S-Acetylthiobernsteinsäureanhydrid (AMSA) wird unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes bei 7,0 in einem 3-7-fachen molaren Überschuß zugegeben, und der Reaktionsansatz wird 2 Stunden lang bei 4°C gerührt. Das monothiolierte OPG wird von unmodifiziertem und polythioliertem OPG durch Ionen austauschchromatographie getrennt, und das geschützte Thiol wird durch Behandlung mit Hydroxylamin entschützt. Nach dem Entschüt zen wird das Hydroxylamin durch Gelfiltration entfernt, und das resultierende monothiolierte OPG wird einer Vielzahl von thiol spezifischen chemischen Vernetzungsmitteln zugeführt. Um ein über Disulfidbindungen verknüpftes Dimer zu schaffen, läßt man das thiolierte OPG bei < 1 mg/ml durch Dialyse in schwach basi schem Phosphatpuffer eine Luftoxidation durchlaufen. Das kova lente Thioether-OPG-Dimer wurde hergestellt durch Umsetzung des Bis-maleimid-Vernetzungsmittels N,N-Bis(3-maleimidopropianyl)-2-hydroxy-1,3-propan mit dem thiolierten OPG bei < 1 mg/ml bei einem molaren Verhältnis von Vernetzungsmittel zu OPG von 0,6 in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5. In ähnlicher Weise werden die PEG-Dumbbells hergestellt durch Umsetzung von sub stöchiometrischen Mengen von Bis-maleimid-PEG-Vernetzungsmitteln mit thioliertem OPG bei < 1 mg/ml in Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5. Jedes der obigen dimeren Konjugate kann durch Einsatz von Ionenaustausch- oder Größenausschluß-Chromatographie weiter aufgereinigt werden.

Unter Anwendung der obigen Verfahren hergestellte dimere PEG-OPG-Konjugate (bei denen OPG HuOPG met [22-194] P25A ist) schließen Disulfid-verknüpftes OPG-Dimer, kovalentes Thioether-OPG-Dimer mit einem aliphatischen Vernetzungsmittel des Amin typs, 3,4 kD große und 8 kD große PEG-Dumbbells und -Monobells ein.

Die PEG-OPG-Konjugate wurden hinsichtlich ihrer in vitro-Aktivi tät unter Anwendung des in Beispiel 11A beschriebenen Assays zur Osteoklastenreifung, und hinsichtlich ihrer in vivo-Aktivität durch Messung der erhöhten Knochendichte nach Injektion von Mäusen gemäß Darlegung in Beispiel 11C untersucht. Die in vivo-Aktivität ist in der folgenden Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3

Biologische in vivo-Aktivität von PEG-OPG-Konjugaten

Obgleich die Erfindung in bezug auf ihre derzeit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, soll sie durch die offenbarten Ausführungsformen nicht beschränkt werden, sondern es ist im Gegensatz hierzu beabsichtigt, zahlreiche Modifikatio nen und Äquivalente abzudecken, die von den Grundgedanken der Erfindung und dem Schutzumfang der anhängenden Ansprüche einge schlossen werden, deren Schutzbereich in größtmöglicher Inter pretationsbreite zu ermitteln ist, um sämtliche derartige Modi fikationen und Äquivalente zu umfassen.

Claims

1. Isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, welches mindestens eine der biologischen Aktivitäten von OPG umfaßt, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) den in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO: 122), und 9C-9D (SEQ ID NO: 124) dargestellten Nukleinsäuren oder komplementären Strängen derselben;
b) Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit den Polypeptid-kodierenden Regionen gemäß Darstellung in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B, (SEQ ID NO: 122), und 9C-9D (SEQ ID NO: 124) hybridisieren;
c) Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit den in Fig. 1A dargestellten Nukleotiden 148 bis 373 einschließlich hybridisieren; und
d) Nukleinsäuren, die gegenüber den Nukleinsäuren gemäß (a), (b) und (c) degeneriert sind.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, welche cDNA, genomische DNA, synthetische DNA oder RNA ist.

3. Polypeptid, kodiert von der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1.

4. Nukleinsäure nach Anspruch 1, welche eine oder mehrere für die Expression in Escherichia coli bevorzugte Kodons ein schließt.

5. Nukleinsäure nach Anspruch 1 mit einem daran angehefteten nachweisbaren Marker.

6. Nukleinsäure nach Anspruch 1, umfassend die Polypeptid-ko dierende Region der Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 120), 9A-9B (SEQ ID NO: 122) oder 9C-9D (SEQ ID NO: 124).

7. Nukleinsäure nach Anspruch 6 mit der in Fig. 9C-D darge stellten Sequenz (SEQ ID NO: 124) der Nukleotide 158 bis 1297.

8. Expressionsvektor, welcher die Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 umfaßt.

9. Expressionsvektor nach Anspruch 8, bei dem die Nukleinsäure die Polypeptid-kodierende Region gemäß Darstellung in Fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 124) umfaßt.

10. Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem Expres sionsvektor gemäß Anspruch 8.

11. Wirtszelle nach Anspruch 10, welche eine eukaryontische Zelle ist.

12. Wirtszelle nach Anspruch 11, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CHO-, COS-, 293-, 3T3-, CV-1- und BHK-Zellen.

13. Wirtszelle nach Anspruch 10, welche eine prokaryontische Zelle ist.

14. Wirtszelle nach Anspruch 13, welche Escherichia coli ist.

15. Transgener Säuger, welcher den Expressionsvektor gemäß An spruch 8 umfaßt.

16. Transgener Säuger gemäß Anspruch 15, welcher ein Nager ist.

17. Transgener Säuger gemäß Anspruch 16, welcher eine Maus ist.

18. Verfahren zur Herstellung von OPG mit den folgenden Schrit ten:
Kultivieren von Wirtszellen, die mit der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 transformiert oder transfiziert sind, unter ge eigneten Nährstoffbedingungen; und
Isolieren des Polypeptidprodukts der Expression der Nuklein säuren.

19. Gereinigtes und isoliertes Polypeptid, welches OPG umfaßt.

20. Polypeptid nach Anspruch 19, welches Säuger-OPG ist.

21. Polypeptid nach Anspruch 20, welches humanes OPG ist.

22. Polypeptid nach Anspruch 19, welches im wesentlichen frei von anderen humanen Proteinen ist.

23. Polypeptid nach Anspruch 21 mit der Aminosäuresequenz gemäß Darstellung in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 121), 9A-9B (SEQ ID NO: 123) oder 9C-9D (SEQ ID NO: 125), oder ein Deri vat desselben.

24. Polypeptid nach Anspruch 23 mit der Aminosäuresequenz gemäß Darstellung in Fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) von den Re sten 22 bis 401 einschließlich.

25. Polypeptid nach Anspruch 23 mit der Aminosäuresequenz gemäß Darstellung in Fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) von den Re sten 32 bis 401 einschließlich.

26. Polypeptid nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Produkt der Expression einer exogenen DNA-Sequenz ist.

27. Polypeptid nach Anspruch 26, wobei die DNA cDNA, genomische DNA oder synthetische DNA ist.

28. Polypeptid nach Anspruch 19, welches mit einem wasserlösli chen Polymer modifiziert worden ist.

29. Polypeptid nach Anspruch 28, wobei das wasserlösliche Poly mer Polyethylenglykol ist.

30. Polypeptid, umfassend:
eine Aminosäuresequenz von mindestens etwa 164 Aminosäuren, die 4 Cystein-reiche Domänen umfassen, welche für die Cy stein-reichen Domänen von extrazellulären Regionen des Tu mornekrosefaktor-Rezeptors charakteristisch sind; und
eine die Knochendichte erhöhende Aktivität.

31. Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß Darstel lung in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 121), 9A-9B (SEQ ID NO: 123) oder 9C-9D (SEQ ID NO: 125) mit einem Aminoterminus am Rest 22, und bei dem die Aminosäuren 1 bis 216 vom Car boxyterminus deletiert sind.

32. Polypeptid nach Anspruch 31, umfassend die Aminosäuresequenz von den Resten 22-185, 22-189, 22-194, oder 22-201 ein schließlich.

33. Polypeptid nach Anspruch 32, ferner umfassend eine Fc-Region von humanem IgG1, die sich vom Carboxyterminus erstreckt.

34. Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß Darstel lung in den Fig. 2B-2C (SEQ ID NO: 121), 9A-9B (SEQ ID NO: 123) oder 9C-9D (SEQ ID NO: 125) mit einem Aminoterminus am Rest 22, bei dem die Aminosäuren 1 bis 10 vom Aminotermi nus und, fakultativ, die Aminosäuren 1 bis 216 vom Carbox yterminus deletiert sind.

35. Polypeptid nach Anspruch 34, umfassend die Aminosäuresequenz von den Resten 27-185, 27-189, 27-194, 17-401, oder 32-401 einschließlich.

36. Polypeptid nach Anspruch 35, ferner umfassend eine Fc-Region von humanem IgG1, die sich vom Carboxyterminus erstreckt.

37. Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: huOPG [22-201]-Fc
huOPG [22-401]-Fc
huOPG [22-180]-Fc
huOPG met [22-401]-Fc
huOPG Fc-met[22-401]
huOPG met [22-185]
huOPG met [22-189]
huOPG met [22-194]
huOPG met [27-185]
huOPG met [27-189]
huOPG met [27-194]
huOPG met [32-401]
huOPG met-lys [22-401]
huOPG met [22-401]
huOPG met [22-401]-Fc (P25A)
huOPG met [22-401] (P25A)
huOPG met [22-401] (P26A)
huOPG met [22-401] (P26D)
huOPG met [22-194] (P25A)
huOPG met [22-194] (P26A)
huOPG met met-(lys)₃ [22-401]
huOPG met met-arg-gly-ser-(his)₆ [22-401].

38. Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß Anspruch 37 ko diert.

39. Antikörper oder Fragment desselben, welcher spezifisch an OPG bindet.

40. Antikörper nach Anspruch 39, welcher ein monoklonaler Anti körper ist.

41. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von OPG in einer biologischen Probe mit den Schritten:
Inkubieren der Probe mit dem Antikörper gemäß Anspruch 39 unter Bedingungen, die dem Antikörper das Binden an OPG erlauben; und
Nachweisen des gebundenen Antikörpers.

42. Verfahren zur Ermittlung der Fähigkeit einer ausgewählten Substanz zur Bindung an OPG mit den Schritten:
Inkubieren von OPG mit der ausgewählten Substanz unter Be dingungen, die eine Bindung erlauben; und
Messen der gebundenen Substanz.

43. Verwendung einer für OPG kodierenden Nukleinsäure zur Regu lation der OPG-Werte bei Säugern.

44. Verwendung nach Anspruch 43, bei der die Nukleinsäure einen Anstieg der Gewebemengen an OPG fördert.

45. Verwendung nach Anspruch 44, bei der der Säuger ein Mensch ist.

46. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeu tisch wirksame Menge von OPG in einem pharmazeutisch ver träglichen Träger, Adjuvans, Löslichmacher, Stabilisator und/oder Antioxidationsmittel.

47. Zusammensetzung nach Anspruch 46, bei der das OPG humanes OPG ist.

48. Zusammensetzung nach Anspruch 47, bei der das OPG die Amino säuresequenz gemäß Darstellung in Fig. 9B aufweist.

49. Verwendung des Polypeptids gemäß Anspruch 19 zur Behandlung einer Knochenstörung.

50. Verwendung nach Anspruch 49, bei der das Polypeptid humanes OPG ist.

51. Verwendung nach Anspruch 49, bei der die Knochenstörung übermäßiger Knochenschwund ist.

52. Verwendung nach Anspruch 51, bei der die Knochenstörung aus gewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Osteoporose, Pa get-Krankheit, Hyperkalzämie, Hyperparathyreoidismus, Ste roid-induzierte Osteopenie, Knochenschwund aufgrund rheuma toider Arthritis, Knochenschwund aufgrund einer Osteomyeli tis, osteolytische Metastase, und paradontalem Knochen schwund.

53. Verwendung nach Anspruch 49 zusammen mit einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Knochen-morpho genen Proteinen BMP-1 bis BMP-12, Vertretern der TGF-β-Fami lie, IL-1-Inhibitoren, TNFa-Inhibitoren, Parathormon und Analoga desselben, Parathormon-verwandtem Protein und Analo ga desselben, Prostaglandine der E-Reihe, Bisphosphonaten, und Knochen-stärkenden Mineralien.

54. Osteoprotegerin-Multimer, welches aus Osteoprotegerin-Mono meren besteht.

55. Multimer nach Anspruch 54, welches ein Dimer ist.

56. Multimer nach Anspruch 54, gebildet durch intermolekulare Disulfidbindungen.

57. Multimer nach Anspruch 54, gebildet durch Assoziation von Fc-Regionen, die von humanem IgG1 abgeleitet sind.

58. Multimer nach Anspruch 54, welches im wesentlichen frei ist von Osteoprotegerin-Monomeren und inaktiven Multimeren.

59. Multimer nach Anspruch 54, bei dem die Monomere die Amino säuresequenz gemäß Darstellung in Fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) von den Resten 22-401, oder ein Derivat derselben umfassen.

60. Multimer nach Anspruch 54, bei dem die Monomere die Amino säuresequenz gemäß Darstellung in Fig. 9C-9D (SEQ ID NO: 125) von den Resten 22 bis 194 umfassen.