DE60034586T2

DE60034586T2 - April rezeptor (bcma) und verwendungen davon

Info

Publication number: DE60034586T2
Application number: DE60034586T
Authority: DE
Inventors: Pascal Schneider; Jeffrey Stoneham THOMPSON; Teresa Brookline CACHERO; Christine Reading AMBROSE; Paul Millis RENNERT
Original assignee: Apotech R & D Sa; Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Apotech R & D SA; Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2020-10-06
Also published as: IL204401A; NO20021594D0; KR20020053066A; AU7864500A; NZ517907A; IL148839A0; EA005601B1; TR200200912T2; UA74798C2; PL355102A1; CA2386463C; AU776852B2; CZ297633B6; BG106670A; EP2324844A2; CN1399556A; US20030082175A1; RS51602B; SK286331B6; EP1847273A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendungen von Antagonisten des APRIL-Rezeptors bei der Behandlung von Krebs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mitglieder der Tumornekrosefaktor (TNF)-Familie der Cytokine sind an einem ständig größer werdenden Gebiet an kritischen biologischen Funktionen beteiligt. Jedes Mitglied der TNF-Familie wirkt durch Bindung an ein oder mehrere Mitglieder einer parallelen Familie von Rezeptorproteinen. Diese Rezeptoren geben ihrerseits intrazellulär ein Signal, um einen breiten Bereich an physiologischen oder Entwicklungsreaktionen hervorzurufen. Viele der Rezeptorsignale beeinflussen das Schicksal der Zelle und lösen oftmals terminale Differenzierung aus. Beispiele für zelluläre Differenzierung umfassen Proliferation, Reifung, Migration und Tod.
Mitglieder der TNF-Familie sind Membran gebundene Proteine vom Typ II mit einer kurzen intrazellulären N-terminalen Domäne, einer Transmembran-Domäne und den C-terminalen Rezeptorbindungsdomänen, die außerhalb der Zelloberfläche liegen. In einigen Fällen wird der extrazelluläre Teil des Proteins abgespalten, was eine sezernierte Form des Cytokins erzeugt. Während die Membran gebundenen Proteine lokal wirken, vermutlich durch über Zellkontakte vermittelte Wechselwirkung mit ihren Rezeptoren, haben die sezernierten Formen die Möglichkeit, zu zirkulieren oder zu diffundieren, und können daher an entfernten Stellen wirken. Sowohl Membran gebundene wie auch sezernierte Formen kommen als Trimere vor und es wird vermutet, dass sie ihr Signal an Rezeptoren durch Erleichterung des Clusters von Rezeptoren übermitteln.
Die Familie der TNF-Rezeptorproteine ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere Cystein-reiche, extrazelluläre Domänen aufweist. Jede Cystein-reiche Region erzeugt eine Disulfid gebundene Kerndomäne, die zu der dreidimensionalen Struktur beiträgt, welche die Ligandenbindungstasche bildet. Die Rezeptoren sind Membran gebundene Proteine vom Typ I, in denen die extrazelluläre Domäne durch den N-Terminus codiert wird, gefolgt von einer Transmembran-Domäne und einer C-terminalen intrazellulären Domäne. Die intrazelluläre Domäne ist für die Signalgebung an den Rezeptor verantwortlich. Einige Rezeptoren enthalten eine intrazelluläre „Todesdomäne", die ein Signal für Zellapoptose geben kann, und diese können starke Auslöser von Zelltod sein. Eine weitere Klasse von Rezeptoren kann Zelltod schwach auslösen; diesen scheint eine Todesdomäne zu fehlen. Eine dritte Klasse an Rezeptoren löst keinen Zelltod aus. Alle Klassen von Rezeptoren können ein Signal für Proliferation oder Differenzierung der Zelle anstelle von Tod geben, in Abhängigkeit vom Zelltyp oder dem Auftreten von anderen Signalen.
Ein gut untersuchtes Beispiel der pluripotenten Natur der TNF-Familienaktivität ist das namensgebende Mitglied, TNF. TNF kann als ein Membran gebundenes Cytokin existieren oder kann abgespalten und sezerniert werden. Beide Formen binden an die beiden TNF-Rezeptoren, TNF-R55 und TNF-R75. TNF wurde ursprünglich auf der Grundlage seiner Fähigkeit, Tumorzellen direkt zu töten, beschrieben; er kontrolliert aber auch einen breiten Bereich an Immunvorgängen, was Auslösen von akuten entzündlichen Reaktionen sowie die Aufrechterhaltung der Homöostase von Lymphgewebe mit einschließt. Aufgrund der doppelten Rolle, die dieses Cytokin unter verschiedenen pathologischen Situationen spielen kann, wurden sowohl agonistische wie auch antagonistischen Reagenzien als Modifizierungsmittel für Erkrankungen entwickelt. Zum Beispiel wurden TNF und LTα (das ebenfalls durch die TNF-Rezeptoren Signale übermittelt) bei der Behandlung von Krebsarten verwendet, insbesondere von solchen, die in peripheren Stellen vorkommen, wie Sarkome der Gliedmaßen. In dieser Situation löst direkte Signalübertragung durch das Cytokin durch den Rezeptor den Tod der Tumorzelle aus (Aggarwal und Natarajan, 1996. Eur Cytokine Netw 7:93-124).
In immunologischen Situationen wurden Mittel verwendet, die Signalgebung durch TNF-Rezeptor (z. B. anti-TNF-mAb, lösliche TNF-R-Fusionsproteine) blockieren, um Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis und entzündliche Darmerkrankungen zu behandeln. In diesen Pathologien bewirkt TNF ein Auslösen der Zellproliferation und eine Effektorfunktion, wodurch Autoimmunerkrankungen verschlimmert werden, und in dieser Situation hat die Blockierung von TNF-Bindung an seine(n) Rezeptor(en) therapeutischen Nutzen (Beutler, 1999. J Rheumatol 26 Suppl 57:16-21).
Ein erst kürzlich entdecktes Ligand/Rezeptor-System scheint für ähnliche Manipulationen geeignet zu sein. Lymphotoxin beta (LTβ), ein Mitglied der TNF-Familie, das Heterotrimere mit LTα bildet, bindet an den LTβ-R. Einige Adenokarzinom-Tumorzellen, die LTβ-R exprimieren, können getötet oder differenziert werden, wenn sie mit einem agonistischen anti-LTβP-R mAb behandelt werden (Browning et al., 1996. J Exp Med 183: 867-878). Es wurde gezeigt, dass anti-LTβP-mAB oder lösliches LTβP-R-Ig-Fusionsprotein in immunologischen Situationen die Entwicklung von entzündlichen Darmerkrankungen blockieren kann, vermutlich durch Beeinflussung der Wechselwirkung von dendritischen Zellen und T-Zellen (Mackay et al., 1998. Gastroenterology 115:1464-1475).
Das TRAIL-System hat ebenfalls das Potenzial für eine Krebstherapie. TRAIL wechselwirkt mit einer Anzahl an Membran gebundenen und löslichen Rezeptoren. Zwei dieser Rezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL R2 (auch mit DR4 und DR5 bezeichnet), übermitteln Tod auslösende Signale an Tumorzellen, aber nicht an normale Zellen, die zusätzliche TRAIL-Rezeptoren exprimieren, die Tod nicht auslösen. Es wird vermutet, dass diese zusätzlichen Rezeptoren als Köder dienen. Die Verwendung von löslichem TRAIL, um Tumorzellen zu töten, beruht auf der selektiven Expression von Köderrezeptoren nicht auf normales, aber Tumorgewebe (Gura, 1997. Science 277: 768).
Tumorzellen selbst exprimieren oftmals eine Vielzahl an Köderrezeptoren, die Immunerkennung oder Effektorfunktionen blockieren. Tatsächlich überexprimieren einige Tumore TRAIL-Köderrezeptoren, offensichtlich um durch TRAIL vermittelten Tod zu vermeiden (Sheikh et al., 1999. Oncogene 18: 4153-4159). Dies schränkt die Nützlichkeit von TRAIL als ein Antitumormittel in einigen Situationen ein. Ähnliche Beobachtungen wurden bezüglich eines Köderrezeptors für FAS-L gemacht, der durch Lungen- und Kolonkrebszellen überexprimiert wird (Pitti et al., 1998. Nature 396: 699-703), und für den Antagonisten des IL-1-Rezeptors (Mantovani et al., 1998. Ann. N Y Acad. Sci. 840:338-351). Köderrezeptoren werden auch von viralen Genomen eingesetzt, um infizierte Wirtszellen vor den Verteidigungsmechanismen des Wirts zu schützen.
APRIL (A Proliferation Inducing Ligand) ist ein neues Mitglied der Familie der TNF-Proteine. APRIL-Expression und funktionelle Untersuchungen weisen darauf hin, dass dieses Protein von Tumorzellen dazu verwendet wird, schnelle Proliferation auszulösen. Tumorzelllinien, die mit löslichem APRIL-Protein behandelt wurden oder mit cDNA für APRIL transfiziert wurden, wachsen in vitro rasch. Mit APRIL transfizierte Zellen, die in immundefiziente Mäuse implantiert wurden, wachsen rasch als Tumore. Schließlich exprimieren humane Tumorzellen, aber nicht normales Gewebe, hohe Spiegel an Messenger-RNA von APRIL. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass APRIL an einen Rezeptor bindet, der auch von Tumorzellen exprimiert wird, und so eine autokrine oder parakrine Tumorzellaktivierung hervorruft. Außerdem ist es möglich, dass APRIL in anderen Krankheitssituationen wirkt, so dass die Aktivierung oder Blockierung des APRIL-Wegs zusätzlichen Nutzen bringen würde. Zum Beispiel spielt die Unterexpression oder Überexpression von APRIL vielleicht eine Rolle bei Entwicklungsdefekten, da die Entwicklung oftmals durch das sorgfältig kontrollierte Gleichgewicht zwischen Zellproliferation und Zelltod gekennzeichnet ist. Ähnlich kann APRIL bei zellproliferativen Erkrankungen wirken, wie beispielsweise solchen, die im Zusammenhang mit einigen Autoimmunerkrankungen (z. B. Lupus) oder entzündlichen Erkrankungen auftreten, in denen die Zellpopulationen sich rasch ausbreiten (z. B., bakterielle Sepsis).
Basierend auf dem bekannten Nutzen der Verwendung von Agonisten und Antagonisten von TNF und Mitgliedern der TFN-Rezeptorfamilie als Modifizierungsmittel für Erkrankungen, bietet sich der APRIL-Weg selbst als ein wichtiges Target für die Entwicklung von Wirkstoffen. Dies gilt insbesondere für die Krebstherapie, da Tumorzellen APRIL herzustellen und zu verwenden scheinen, um ihr Wachstum zu unterstützen, und produzieren daher wahrscheinlich keine Köderrezeptoren oder andere Antagonisten des APRIL-Wegs. So unterscheidet sich der APRIL-Weg auf einzigartige Weise von, zum Beispiel, dem TRAIL- oder FAS-L-Weg, die durch Tumor-Köderrezeptoren beeinträchtigt werden können.
Derzeitige Behandlungen für Krebs sind für viele Tumorarten unzulänglich, aufgrund der geringen Effizienz, der geringer Auswirkung auf das Überleben, der Toxizität, die schwere Nebenwirkungen verursacht, oder Kombinationen daraus. Daher besteht ein Bedarf danach, zusätzliche Verfahren zur Behandlung von Krebswachstums zu identifizieren und zu entwickeln, die Effizienz gewährleisten, ohne schwere Nebenwirkungen auszulösen. Antagonisten des APRIL-Wegs, einschließlich anti-APRIL mAbs, anti-APRIL-Rezeptor mAbs, lösliche APRIL-Rezeptor-Ig-Fusionsproteine, natürliche Antagonisten, kleine Molekülantagonisten und chemische, pharmazeutische oder andere Antagonisten wären daher von Nutzen.
Bisher haben wir das B-Zell vermittelte Protein (BCM oder BCMA) als einen Rezeptor für APRIL identifiziert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben gefunden, dass BCMA ein Rezeptor für den Tumornekrosefaktor APRIL ist. APRIL ist das gleiche Molekül, das bereits früher in WO 99 12965 beschrieben wurde, welches durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Der APRIL-Rezeptor wird hier im Folgenden mit „APRIL-R" bezeichnet. Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von APRIL-R-Antagonisten gerichtet, wie in Anspruch 1 definiert, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Sängerspezies, die Krebs haben oder von Krebs bedroht sind. Derartige Subjekte umfassen Subjekte, die bereits an Krebs leiden, oder die bereits eine Krebstherapie erhalten haben.
Die Verwendungen dieser Erfindung ziehen teilweise Nutzen aus der Entdeckung, dass bestimmte Mittel, die therapeutische Mittel gegen Krebs sind und hierin als APRIL-R-Antagonisten definiert werden, einschließlich zum Beispiel anti-APRIL-R-Antikörper, bei der Behandlung von Subjekten verwendet werden können, bei denen die Gefahr einer Entwicklung von Krebs besteht, wie hierin definiert, oder die einer Krebsbehandlung bedürfen.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel gegen Krebs können durch jeglichen Verabreichungsweg verabreicht werden, der mit dem gewählten Mittel vereinbar ist, und kann mit jeder beliebigen pharmazeutisch zulässigen Trägersubstanz formuliert werden, die für den Verabreichungsweg geeignet ist. Bevorzugte Verabreichungswege sind parenteral und, insbesondere, intravenös, intraperitoneal und intrakapsular. Behandlungen werden auch vorzugsweise über einen ausgedehnten Zeitraum an einem ambulanten Patienten ausgeführt. Tagesdosierungen der therapeutischen Krebsmittel sollten in dem Bereich von etwa 0,01-1000 μg/kg Körpergewicht und mehr bevorzugt etwa 10-300 μg/kg Körpergewicht liegen, obwohl genaue Dosierungen in Abhängigkeit von dem bestimmten, eingesetzten, therapeutischen Krebsmittel und dem medizinischen Zustand und der Geschichte des bestimmten Subjekts variieren werden.
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung umfasst die Ausrottung einer im Wesentlichen klonierten Population (Kolonie) aus transformierten Zellen aus dem Körper eines Säugers, oder das Wachstum der Kolonie zu unterdrücken oder zu schwächen, die am häufigsten als ein Tumor bezeichnet wird. Also solche sind sie bei der Verlängerung der Leben von Nutzen und bei der Aufrechterhaltung einer Lebensqualität bei Subjekten, die an Krebs zu leiden drohen oder bereits daran leiden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt die Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO:1) einer cDNA für murines APRIL und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:3) wie in Vektor pCCM213.10 kartiert. Unterstrichen dargestellt ist das myc-Epitop und die von FasL abgeleiteten Aminosäuren. Der Anfang der für die extrazelluläre Domäne von APRIL kodierenden Sequenz wird durch Pfeile angezeigt.
2 zeigt die Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO:4) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:6) eines humanen FLAG-APRIL-Konstrukts für die Expression in Säugerzellen. Die Karte gibt die Signalsequenz (1-15); das FLAG-Epitop (AS 16-23) und den Anfang der für die extrazelluläre Domäne von humanem APRIL kodierenden Sequenz (32-Ende) an.
3A zeigt die Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO:7) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:8) eines humanen Volllängen-BCMA.
3B zeigt die Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO:11) von pJST538, einem Plasmid, das für ein humanes APRIL-R-hIgGFc-Fusionskonstrukt kodiert, und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:12).
4 zeigt die Bindung von myc-murinem APRIL an die murine B-Zell-Lymphomlinie A20. 3 getrennte Experimente zeigen spezifische Bindung von APRIL an A20-Zellen verglichen mit A) ungefärbten Zellen und nur mit R1532 gefärbten Zellen, B) mit RANKL-L und R1532 gefarbten Zellen und C) mit APRIL gefarbten Zellen und einem nicht relevanten Kaninchenserum.
5 zeigt die Bindung von myc-murinem APRIL an die humane B-Zell-Lymphomlinie RAJI. 2 getrennte Experimente zeigen spezifische Bindung von APRIL an RAJI-Zellen verglichen mit A) ungefärbten Zellen und nur mit R1523 gefärbten Zellen und mit RANK-1 und R1532 gefärbten Zellen und B) mit APRIL gefärbten Zellen und einem nicht relevanten Kaninchenserum.
6 zeigt, dass die APRIL-Bindung an A20-Zellen (A) und Raji-Zellen (B) bei Verwendung von löslichem BAFF-Protein oder löslichem BCMA-Ig-Protein in Konkurrenz tritt.
7 zeigt Bindung von FLAG – humanem APRIL an verschiedene Zelllinien: A) A20-Zellen, B) HT29-Zellen, C) NIH3T3-Zellen. Spezifische Bindung wird gezeigt, indem ein Nachweis mit biotinyliertem anti-FLAG-mAb M2 verwendet wird, verglichen mit der Bindung, die bei einer nicht relevanten isotypen Kontroll-mAb oder ohne Zugabe von FLAG-APRIL gesehen wird.
8 zeigt Immunfällung von myc-mApril unter Verwendung von BCMA-Fc-Fusionsprotein. Das obere linke Panel zeigt spezifisch hBMCA-Fc/myc-mAPRIL- und die positive Kontrolle OPG-Fc/Rank-1 Immunpräzipitation, verglichen mit den oberen rechten negativen Kontrollen. Die unteren Panele belegen, dass die Mengen an geladenem Protein äquivalent waren.
9 zeigt ein Experiment im ELISA-Format, das belegt, dass FLAG-hAPRIL an das hBCMA-Fc-Fusionsprotein bindet. Verschiedene Rezeptor-Fc-Fusionsproteine wurden auf die ELISA-Platten aufgebracht und mit FLAG getaggten Liganden gebunden. A) Nachweis der gebundenen Liganden zeigte, dass nur APRIL und hBAFF spezifisch an hBCMA-Fc binden, nicht aber hCD40-Fc. B) Dosistitration, die zeigt, dass das nach Bindung von hAPRIL oder hBAFF auf mit hBCMA-Fc beschichteten Platten nachgewiesene ELISA-Signal linear von der Menge an zugegebenem Protein abhängt.
10 zeigt eine Immunpräzipitation von FLAG-hAPRIL und FLAG-hBAFF durch hBMCA-Fc-Fusionsprotein. Die oberen 4 Panele zeigen die Äquivalenz der Proteinbeladungen bei jeder Immunpräzipitation, während die unteren Panele zeigen, dass hAPRIL und hBAFF von hBCMA-Fc, aber nicht von hTRAIN-Fc immunpräzipitiert werden.
11 zeigt die BiaCore-Analyse der Bindung von myc-mAPRIL, FLAG-hBAFF und FLAG-mBAFF an hBMCA, hLTbeta-Rezeptor oder hTNF-R80 oder leer, was die spezifische Bindung nur an hBCMA zeigt.
12 zeigt APRIL-Bindung an mit BCMA transfizierten Zellen. 293EBNA-Zellen wurden mit einem Plasmid transfiziert, das Volllängen-hBCMA exprimiert. Die Zellen wurden 48 Stunden später unter Verwendung von 5 mM EDTA geerntet und mit myc-nAPRIL gefärbt. Panel A zeigt, dass das Ausmaß der Färbung von der Dosis abhängt. Panel B zeigt, dass die Färbung bis auf das Untergrundniveau absank, wenn ein lösliches BCMA-1g-Protein verwendet wurde.
13 zeigt das Wachstum von NIH3T3-Zellen, die subkutan in immundefiziente (Nu/Nu) Mäuse implantiert wurden, die mit Kontrollreagenzien oder mit BCMA-lg- Fusionsprotein behandelt wurden. In diesem Modell bilden die NIH3T3-Zellen ein Fibrosarkom.
14 zeigt das Wachstum des humanen Kolonkarzinoms SW480, das subkutan in immundefiziente (Nu/Nu) Mäuse implantiert wurde, die mit Kontrollreagenzien oder mit hBCMA-lg-Fusionsprotein behandelt wurden.
15A zeigt das Wachstum des humanen Kolonkarzinoms HT29, das subkutan in immundefiziente (Nu/Nu) Mäuse implantiert wurde, die mit Kontrollreagenzien oder mit hBCMA-lg-Fusionsprotein behandelt wurden.
15B zeigt das Wachstum des humanen Lungenkarzinoms A549, das subkutan in immundefiziente (Nu/Nu) Mäuse implantiert wurde, die mit Kontrollreagenzien oder mit hBCMA-lg-Fusionsprotein behandelt wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Definitionen
Um den Gegenstand der beanspruchten Erfindung deutlicher und prägnanter herauszustellen, werden die folgenden Definitionen für spezifische Begriffe gegeben, die in der folgenden geschriebenen Beschreibung und den angehängten Ansprüchen verwendet werden.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung beschrieben, in welche die folgenden Definitionen eingeschlossen sind:
Die Begriffe „APRIL-Rezeptor" oder „APRIL-R", wenn hierin verwendet, umfassen native Sequenzen von APRIL-R und APRIL-R-Varianten. Der APRIL-R kann aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden, wie aus murinen oder humanen Gewebearten oder aus einer anderen Quelle, oder durch rekombinante oder synthetische Verfahren hergestellt werden. Der Begriff APRIL-R bezieht sich weiterhin auf ein Polypeptid, das in der Lage ist, an das Mitglied der Tumornekrosefamilie APRIL oder an dessen Homologe oder Fragmente zu binden. Im Rahmen dieser Erfindung ist der APRIL-R BCMA.
Der Begriff „BCMA" oder „BCM" bezieht sich auf das neue Protein für B-Zell-Reifung, wie beschrieben in Gras et al. (1995), International Immunology, 7:1093-1106, "BCMAp: an integral membrane Protein in the golgi apparatus of human mature B lymphocytes"; Y. Laabi et al. (1992), EMBO J., 11, 3897-3904, "A new gene BCM an Chromosome 16 is fused to the interleukin 2 gene by a t(4;16) (q26;p13) translocation in a malignant T cell lymphoma".
Eine „native Sequenz von APRIL-R" umfasst ein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie APRIL-R, das von der Natur abstammt. Eine solche native Sequenz von APRIL-R kann aus der Natur isoliert werden oder kann durch rekombinante oder synthetische Mittel hergestellt werden. Die native Sequenz von APRIL-R können natürlich vorkommende, trunkierte oder sezernierte Formen des APRIL-R (z. B. lösliche Formen, die zum Beispiel eine Sequenz einer extrazellulären Domäne enthalten), natürlich vorkommende variante Formen (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich auftretende Allel-Varianten des APRIL-R sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die native Sequenz von APRIL-R eine native reife oder Volllängen-Sequenz des APRIL-R-Polypeptids, welche die Aminosäuren 1 bis 184 von SEQ ID NO: 8 enthält, oder ein Fragment davon.
Die „extrazelluläre Domäne von APRIL-R" oder „APRIL-R ECD" bezieht sich auf eine Form von APRIL-R, die im Wesentlichen frei von Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen von APRIL-R ist. Gewöhnlich wird die extrazelluläre Domäne von APRIL-R weniger als 1 % solcher Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen aufweisen, und wird vorzugsweise weniger als 0,5 % solcher Domänen aufweisen. Gegebenenfalls wird APRIL-R ECD die Aminosäurereste 1 bis 51, oder 1 bis 52, oder 1 bis 53 von SEQ ID NO: 8 enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das APRIL-R ECD die Aminosäurereste 4 bis 51, von SEQ ID NO:8 oder mehr bevorzugt die Aminosäurereste 8 bis 41 von SEQ ID NO:8. Es versteht sich für einen Fachmann, dass die für das APRIL-R-Polypeptid der vorliegenden Erfindung identifizierte Transmembran-Domäne entsprechend der Kriterien identifiziert wird, die routinemäßig im Fachgebiet für die Identifizierung dieser Art von hydrophober Domäne eingesetzt werden. Die genauen Grenzen einer Transmembran-Domäne können variieren, aber sehr wahrscheinlich um nicht mehr als etwa 5 Aminosäuren an jedem Ende der hierin spezifisch erwähnten Domäne.
„APRIL-R-Variante" meint einen aktiven APRIL-R wie unten definiert mit mindestens 80 % Identität der Aminosäuresequenz mit dem APRIL-R, der die abgeleitete Aminosäuresequenz aufweist, die in SEQ ID NO:5 für eine native Volllängen-Sequenz von APRIL-R gezeigt ist, oder mit einer APRIL-R ECD-Sequenz. Derartige APRIL-R-Varianten umfassen, zum Beispiel, APRIL-R-Polypeptide, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste am Ende oder dem C-Terminus der Sequenz von SEQ ID NO:8 addiert oder deletiert wurden. Gewöhnlich wird eine APRIL-R-Variante mindestens etwa 80 % oder 85 % Sequenzidentität der Aminosäuren aufweisen, mehr bevorzugt mindestens etwa 90 % Sequenzidentität der Aminosäuren und noch mehr bevorzugt mindestens etwa 95 % Sequenzidentität der Aminosäuren mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:8.
„Prozent (%) Sequenzidentität der Aminosäuren" mit Bezug auf die hierin identifizierten APRIL-R-Sequenzen ist definiert als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz, die mit den Aminosäureresten in der APRIL-R-Sequenz identisch sind, nachdem mit den Sequenzen ein Alignment durchgeführt und Lücken eingefügt wurden, sofern notwendig, um den maximalen Prozentsatz an Sequenzidentität zu erreichen, und wobei jegliche konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität berücksichtig wurden. Alignment zum Zwecke der Bestimmung des Prozentsatz an Sequenzidentität der Aminosäuren kann auf verschiedene Wege erreicht werden, die im Fachgebiet bekannt sind, zum Beispiel, unter Verwendung von öffentlich zugänglicher Computersoftware wie beispielsweise BLAST-, ALIGN- oder Megalign(DNASTAR) Software. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann geeignete Parameter zur Messung des Alignments festlegen, einschließlich beliebiger Algorithmen, die für das Erreichen eines maximalen Alignments über die gesamte Länge der zu vergleichenden Sequenzen erforderlich ist.
Der Begriff „Epitop getaggt", wenn hier verwendet, bezieht sich auf ein chimäres Polypeptid, das APRIL-R enthält, oder eine Domänensequenz davon, das an ein „Tag-Polypeptid" fusioniert ist. Das Tag-Polypeptid verfügt über genügend Reste, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, oder das durch ein anderes Mittel identifiziert werden kann, das aber doch kurz genug ist, so dass es die Aktivität des APRIL-R nicht beeinträchtigt. Das Tag-Polypeptid ist auch vorzugsweise recht einzigartig, so dass der Antikörper nicht wesentlich mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Tag-Polypeptide haben im Allgemeinen mindestens 6 Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa 8 bis etwa 50 Aminosäurereste (vorzugsweise etwa 10 bis etwa 20 Reste).
„Isoliert", wenn zur Beschreibung der verschiedenen hier offenbarten Polypeptide verwendet, meint ein Polypeptid, das identifiziert und abgetrennt wurde und/oder aus einem Bestandteil aus seiner natürlichen Umgebung gewonnen wurde. Kontaminierende Bestandteile seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise die diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen dieses Polypeptids stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinöse oder nicht proteinöse gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid gereinigt (1) bis zu einem Grad, der ausreicht, um mindestens 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Rotations-Sequenators zu erhalten, oder (2) bis zur Homogenität SDS-PAGE unter nicht reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung einer Coomassie-Blau- oder vorzugsweise, Silberfärbung. Isoliertes Polypeptid umfasst ein Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da mindestens ein Bestandteil der natürlichen Umgebung von APRIL-R nicht anwesend sein wird. Gewöhnlich wird isoliertes Polypeptid jedoch durch mindestens einen Reinigungsschritt hergestellt.
Der Begriff „Antikörper" wird in seiner breitesten Bedeutung verwendet und umfasst insbesondere monoklonale Antikörper von APRIL-R (einschließlich agonistische, antagonistische und neutralisierende Antikörper) und Zusammensetzungen aus anti-APRIL-R-Antikörpern mit polyepitopischer Spezifizität. Der Begriff „monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wird, d. h. die einzelnen, die Population umfassenden Antikörper sind identisch, außer in Bezug auf natürlich auftretende Mutationen, die in geringen Mengen vorkommen können.
Ein „gereinigtes Präparat" oder ein „im Wesentlichen reines Präparat" eines Polypeptids, wie hierin verwendet, meint ein Polypeptid, das von anderen Proteinen, Lipiden und Nucleinsäuren getrennt wurde, mit denen es natürlich auftritt. Vorzugsweise wird das Polypeptid auch von anderen Substanzen getrennt, z. B. Antikörpern, Matrizes, usw., die zur Reinigung desselben verwendet wurden.
Die Begriffe „behandeln", „Behandlung" und „Therapie", wie hierin verwendet, beziehen sich auf kurative Therapie, prophylaktische Therapie und vorbeugende Therapie.
Die Begriffe „Peptide", „Proteine" und „Polypeptide" werden hierin austauschbar verwendet.
„Biologisch aktiv", wie hierin verwendet, meint, dass es eine Aktivität in vivo oder in vitro gibt, die direkt oder indirekt ausgeführt wird. Biologisch aktive Fragmente von APRIL-R können, zum Beispiel, eine 70 %ige Homologie der Aminosäuren mit der aktiven Stelle des Rezeptors aufweisen, mehr bevorzugt mindestens eine 80 %ige und am meisten bevorzugt mindestens eine 90 %ige Homologie. Identität oder Homologie mit Bezug auf den Rezeptor wird hier definiert als der Prozentsatz an Aminosäureresten in der Kandidatensequenz, die mit den Resten von APRIL-R in SEQ ID NO:8 identisch sind.
Der Begriff „Säuger", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein beliebiges Tier, das als ein Säuger klassifiziert wird, einschließlich Menschen, Kühen, Pferden, Hunden, Mäusen und Katzen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Säuger ein Mensch.
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wird, wenn nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, transgenen Biologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie einsetzen, die innerhalb der Fähigkeiten des Fachgebiets liegen. Derartige Techniken werden in der Literatur beschrieben.
Es wird nun genauer auf die vorliegenden, bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen. Diese Erfindung betrifft die Verwendung von APRIL-R und mit APRIL-R in Beziehung stehenden Molekülen, um das Wachstum und die Reifung von B-Zellen und Nicht-B-Zellen zu bewirken, insbesondere insofern sie mit Tumorzellen im Zusammenhang stehen. Ebenfalls beschrieben ist die Verwendung von APRIL-R und mit APRIL-R in Beziehung stehenden Molekülen, um Reaktionen des Immunsystems zu bewirken, wie durch immunbedingte Störungen erforderlich gemacht. Außerdem wird die Behandlung von Krebs und Immunstörungen durch die Verwendung eines APRIL-R oder eines zu APRIL-R gehörenden Gens durch Verfahren der Gentherapie beschrieben.
Der APRIL-R und dessen Homologe, die durch mit den erfindungsgemäßen Sequenzen transformierte Wirte produziert werden, wie auch nativer APRIL-R, der durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren gereinigt oder aus bekannten Aminosäuresequenzen produziert wurde, sind in einer Vielzahl von Verfahren für Antikrebs-, Antitumor- und immunregulatorische Anwendungen von Nutzen. Sie sind auch bei der Therapie und Verfahren, die auf andere Erkrankungen gerichtet sind, von Nutzen.
Hierin beschrieben wird auch die Verwendung des Polypeptids, das durch die isolierte, für den APRIL-R kodierende Nucleinsäure kodiert wird, in einer „Antisense"-Therapie. Wie hierin verwendet, bezieht sich die „Antisense"-Therapie auf die Verabreichung oder Erzeugung in situ von Oligonucleotiden oder deren Derivaten, die spezifisch unter zellulären Bedingungen mit der zellulären mRNA und/oder DNA hybridisieren, die für den Liganden von Interesse kodieren, um so die Expression des kodierten Proteins zu inhibieren, d. h. durch Inhibierung der Transkription und/oder Translation. Die Bindung kann durch herkömmliche Basenpaar-Komplementarität erfolgen, oder, zum Beispiel, im Falle der Bindung an DNA-Doppelstränge, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Im Allgemeinen bezieht sich die „Antisense"-Therapie auf einen Bereich an Techniken, die im Allgemeinen im Fachgebiet eingesetzt werden, und umfassen jegliche Therapie, die auf der spezifischen Bindung an Oligonucleotidsequenzen beruhen.
Ein hierin beschriebenes Antisense-Konstrukt kann, zum Beispiel, als ein Expressionplasmid geliefert werden, das, wenn in der Zelle transkribiert, RNA produziert, die komplementär ist zu mindestens einem Teil der zellulären mRNA, die für den Kay-Liganden kodiert. Alternativ kann das Antisense-Konstrukt eine Oligonucleotidsonde sein, die ex vivo erzeugt wird. Derartige Oligonucleotidsonden sind vorzugsweise modifizierte Oligonucleotide, die beständig gegenüber endogenen Nucleasen sind und daher in vivo stabil sind. Beispielhafte Nucleinsäuremoleküle für die Verwendung als Antisense-Oligonucleotide sind Phosphoramidat-, Phosphothioat- und Methylphosphonat-Analoga der DNA (siehe z. B., 5,176,996; 5,264,564 und 5,256,775). Außerdem wurde eine Übersicht über allgemeine Ansätze zur Konstruktion von Oligomeren, die in der Antisense-Therapie von Nutzen sind, zum Beispiel, durch Van Der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958-976; und Stein et al. (1988) Cancer Res 48: 2659-2668 gegeben, die hier insbesondere durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Der erfindungsgemäße APRIL-R, wie oben diskutiert, ist ein Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie. Das Protein, dessen Fragmente oder Homologe können breite therapeutische und diagnostische Anwendungen haben.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide Wechselwirken insbesondere mit APRIL, einem Polypeptid, das bereits früher in WO 99/12964 beschrieben wurde, welches durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Die hier offenbarten Peptide und Verfahren ermöglichen jedoch die Identifizierung von Molekülen, die spezifisch mit dem APRIL-R oder dessen Fragmenten Wechselwirken.
Es werden auch Verfahren zur Verwendung der von APRIL-R abstammenden Peptide beschrieben, welche die Fähigkeit haben, an APRIL zu binden. Fragmente der APRIL-Rs können auf verschiedenen Wegen produziert werden, z. B. rekombinant, durch PCR, proteolytischen Verdau oder durch chemische Synthese. Innere oder terminale Fragmente eines Polypeptids können erzeugt werden, indem ein oder mehrere Nucleotide von einem Ende oder beiden Enden einer Nucleinsäure entfernt werden, die für das Polypeptid kodiert. Expression der mutagenisierten DNA produziert Fragmente des Polypeptids.
Polypeptidfragmente können auch chemisch synthetisiert werden, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken wie herkömmlicher f-moc- oder t-boc-Chemie an der Merrifield-Festphase. Zum Beispiel können Peptide und DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung willkürlich in Fragmente von gewünschter Länge ohne Überlappung der Fragmente unterteilt werden, oder in überlappende Fragmente von einer gewünschten Länge unterteilt werden. Verfahren wie diese werden im Folgenden genauer beschrieben.
Erzeugung von löslichen Formen von APRIL-R
Lösliche Formen von APRIL-R können oftmals effizient Signale übermitteln und können so als ein Wirkstoff verabreicht werden, der nun die natürliche Membranform nachahmt. Es ist möglich, dass die hier beanspruchten APRIL-R natürlich als lösliche Cytokine sezerniert werden, falls nicht, kann das Gen jedoch auch gentechnisch verändert werden, um Sekretion zu erzwingen. Um eine lösliche sezernierte Form von APRIL-R zu erzeugen, würde man auf DNA-Niveau die N-terminalen Transmembranregionen entfernen, und einen Teil der „Stalk"-Region, und diese durch eine Leadersequenz vom Typ I oder alternativ eine Leadersequenz vom Typ II ersetzen, die eine effiziente proteolytische Spaltung in dem gewählten Expressionssystem ermöglicht. Ein Fachmann könnte die Menge der „Stalk"-Region, die in dem Sekrektion-Expressions-Konstrukt bewahrt wird, variieren, um sowohl Ligandenbindungseigenschaften wie auch Sekretionseffizienz zu optimieren. Zum Beispiel könnten die Konstrukte, die alle möglichen „Stalk"-längen enthalten, d. h. N-terminale Trunkierungen, hergestellt werden, so dass Proteine, die bei den Aminosäuren 1 bis 52 starten, resultieren würden. Die optimale Länge der „Stalk"-sequenz wäre eine Folge dieser Art von Analyse.
Erzeugung von Antikörpern, die mit dem APRIL-R reagieren
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von Antikörpern, die spezifisch mit dem beanspruchten APRIL-R reagieren. Anti-Protein-/anti-Peptid-Antiseren oder monoklonale Antikörper können durch Standardprotokolle hergestellt werden (Siehe, zum Beispiel, Antibodies: A Laboratory Manual Hrg. von Harlow und Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Ein Säuger wie beispielsweise eine Maus, ein Hamster oder ein Kaninchen können mit einer immunogenen Form des Peptids immunisiert werden. Techniken für die Übertragung von Immunisierungskraft auf ein Protein oder Peptid umfassen die Konjugation an Träger oder andere Techniken, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind.
Ein immunogener Teil von APRIL-R kann in der Gegenwart eines Adjuvans verabreicht werden. Der Fortschritt der Immunisierung kann durch Nachweis der Antikörpertiter im Plasma oder Serum verfolgt werden. Standard-ELISA oder andere Immunassays können mit dem Immungen als Antigen verwendet werden, um die Spiegel an Antikörpern zu bestimmen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper des Subjekts für antigenische Determinanten von APRIL-R oder seinen Co-Rezeptoren immunspezifisch, z. B. antigenische Determinanten eines Polypeptids von SEQ ID NO:8, oder einem nahe verwandten humanem oder nicht humanen Sängerhomolog (z. B. 70, 80 oder 90 Prozent Homologie, mehr bevorzugt mindestens 95 Prozent Homologie). In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kreuzreagieren die anti-APRIL-R-Antikörper nicht wesentlich (d. h. reagieren spezifisch) mit einem Protein, das zu weniger, z. B., als 80 Prozent homolog zu SEQ ID NO:8 ist; vorzugsweise zu weniger als 90 Prozent homolog ist mit SEQ ID NO:8; und, am meisten bevorzugt weniger als 95 Prozent homolog ist mit SEQ ID NO:8. Mit „kreuzreagieren im Wesentlichen nicht" ist gemeint, dass der Antikörper eine Bindungsaffinität für ein nicht homologes Protein aufweist, die weniger als 10 Prozent, mehr bevorzugt weniger als 5 Prozent und noch mehr bevorzugt weniger als 1 Prozent der Bindungsaffinität für ein Protein von SEQ ID NO:8 beträgt.
Der Begriff Antikörper, wie er hier verwendet wird, soll Fragmente davon einschließen, die ebenfalls spezifisch mit APRIL-R reagieren. Antikörper können unter Verwendung von herkömmlichen Techniken fragmentiert werden und die Fragmente können auf ihre Nützlichkeit auf die gleiche Weise wie oben für ganze Antikörper beschrieben gescreent werden. Zum Beispiel können F(ab')₂-Fragmente durch Behandlung des Antikörpers mit Pepsin erzeugt werden. Das resultierende F(ab')₂-Fragment kann behandelt werden, um Disulfidbrücken zu reduzieren, um Fab'-Fragmente herzustellen. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sollen des Weiteren biologisch spezifische und chimäre Moleküle mit anti-APRIL-R-Aktivität umfassen. So können sowohl monoklonale wie auch polyklonale Antikörper (Ab), die gegen APRIL-R gerichtet sind, sowie Antikörperfragmente wie beispielsweise Fab' und F(ab')₂ verwendet werden, um die Wirkung des APRIL-R zu blockieren.
Es können auch verschiedene Formen von Antikörpern unter Verwendung von standardmäßigen rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden. (Winter und Milstein, Nature 349: 293-299 (1991), insbesondere durch Bezugnahme hierin aufgenommen). Zum Beispiel können chimäre Antikörper konstruiert werden, in denen die Antigen bindende Domäne aus einem tierischen Antikörper mit einer humanen konstanten Domäne verknüpft wird (z. B. Cabilly et al., U.S. 4,816,567 , durch Bezugnahme hierin aufgenommen). Chimäre Antikörper können die beobachteten immunogenen Reaktionen vermindern, die durch tierische Antikörper hervorgerufen werden, wenn sie in humanen, klinischen Behandlungen verwendet werden.
Außerdem können rekombinante „humanisierte Antikörper", die APRIL-R erkennen, synthetisiert werden. Humanisierte Antikörper sind Chimären, die im Wesentlichen humane IgG-Sequenzen enthalten, in welche die für spezifische Antigenbindung verantwortlichen Regionen insertiert wurden. Tiere werden mit dem gewünschten Antigen immunisiert, die entsprechenden Antikörper werden isoliert und der Teil der Sequenzen der variablen Region, der für spezifische Antigenbindung verantwortlich ist, wird entfernt. Die aus Tieren gewonnenen Antikörperbindungsregionen werden dann in die geeignete Position von humanen Antikörpergenen einkloniert, in denen die Antigenbindungsregionen deletiert wurden. Humanisierte Antikörper minimieren die Verwendung von heterologen (d. h. Interspezies-) Sequenzen in humanen Antikörpern und rufen daher weniger wahrscheinlich Immunreaktionen in dem behandelten Subjekt hervor.
Konstruktion von verschiedenen Klassen an rekombinanten Antikörpern können auch erreicht werden, in dem chimäre oder humanisierte Antikörper hergestellt werden, die variable Domänen und humane konstante Regionen (CH1, CH2, CH3) isoliert von verschiedenen Klassen an Immunglobulinen enthalten. Zum Beispiel können Antikörper mit vermehrten Valenzen der Antigenbindungsstelle rekombinant durch das Einklonieren der Antigenbindungsstelle in Vektoren hergestellt werden, welche die humane : konstante Kettenregion tragen. (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177: 1439-1450 (1993), durch Bezugnahme hierin aufgenommen).
Außerdem können standardmäßige rekombinante DNA-Techniken verwendet werden, um die Bindungsaffinitäten der rekombinanten Antikörper mit deren Antigenen durch Veränderung der Aminosäurereste in der Nachbarschaft der Antigenbindungsstellen zu verändern. Die Antigenbindungsaffinität eines humanisierten Antikörpers kann durch Mutagenese auf der Grundlage von auf Molecular Modeling erhöht werden. (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 10029-33 (1989)) durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
Erzeugung von Analoga: Herstellung von veränderten DNA- und Peptidsequenzen
Analoga des APRIL-R können sich von dem natürlich vorkommenden APRIL-R in der Aminosäuresequenz oder auf Wegen, die die Sequenz nicht betreffen, oder beiden unterscheiden. Nicht-Sequenzmodifizierungen umfassen chemische Derivatisierung des APRIL-R in vivo oder in vitro. Nicht-Sequenzmodifizierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Veränderung in der Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Carboxylierung oder Glykosylierung.
Bevorzugte Analoga umfassen biologisch aktive Fragmente von APRIL-R, deren Sequenzen sich von der in SEQ ID NO:8 gegebenen Sequenz unterscheiden durch eine oder mehrere konservative Aminosäure-Substitutionen oder durch eine oder mehrere nicht konservative Aminosäure-Substitutionen, Deletionen oder Insertionen, welche die Aktivität des APRIL-Liganden nicht beseitigen. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise die Substitution einer Aminosäure durch eine andere mit ähnlichen Eigenschaften, z. B. Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Valin, Glycin; Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; sowie Phenylalanin, Tyrosin.
Verwendungen
Das Volllängen-Gen für APRIL-R (SEQ ID NO:8) oder Teile davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek verwendet werden, um, zum Beispiel, noch andere Gene zu isolieren, die eine gewünschte Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 6 offenbarten APRIL-R-Sequenz aufweisen. Nucleotidsequenzen, die für APRIL-R kodieren, können auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden für das Kartieren des Gens zu konstruieren, das für den APRIL-R kodiert, und für die genetische Analyse von Individuen mit genetischen Störungen. Screeningassays können entworfen werden, um Leitverbindungen zu finden, welche die biologische Aktivität von APRIL-R nachahmen. Derartige Screeningassays werden Assays umfassen, die für Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken geeignet sind, was sie insbesondere für die Identifizierung von kleinen Molekülen als Wirkstoffkandidaten geeignet macht. Die in Betracht gezogenen kleinen Moleküle umfassen synthetische organische oder anorganische Verbindungen. Nucleinsäuren, die für APRIL-R oder seine modifizierten Formen kodieren, können auch verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder „Knock out"-Tiere zu erzeugen, die ihrerseits bei der Entwicklung und dem Screening von therapeutisch nützlichen Reagenzien, einschließlich zum Beispiel Krebsreagenzien, von Nutzen sind.
Der APRIL-R und dessen Homologe, die von mit den erfindungsgemäßen Sequenzen transformierten Wirten hergestellt werden, wie auch nativer APRIL-R, der durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren gereinigt wurde, oder aus bekannten Aminosäuresequenzen hergestellt wurde, sind in einer Vielzahl an Antikrebs-Anwendungen von Nutzen.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung, die einen APRIL-R-Antagonisten enthält, wobei der APRIL-R-Antagonist ein Polypeptid umfasst, das die Wechselwirkung zwischen APRIL und seinem verwandten Rezeptor antagonistisch beeinflusst, mit einem pharmazeutisch zulässigem Hilfsstoff.
Der verwandte Rezeptor von APRIL auf der Zelloberfläche ist BCMA.
Die Verwendungen setzen einen APRIL-R-Antagonisten ein, der ein Polypeptid aufweist, der die Wechselwirkung zwischen APRIL und seinem verwandten Rezeptor antagonistisch beeinflusst. Beispiele für APRIL-R-Antagonisten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf lösliches APRIL-R-Polypeptid, einschließlich, aber nicht beschränkt auf lösliches BCMA; lösliche chimäre APRIL-R-Moleküle, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf BCMA-lgG-Fc und Homologe des anti-APRIL-R-Antikörpers, einschließlich, aber nicht beschränkt auf monoklonale anti-BCMA-Antikörper.
Die Verwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen die Behandlung von Tumorzellen, die APRIL und/oder APRIL-R (d. h. BCMA) exprimieren.
Beispiele von Krebsarten, deren Zellproliferation durch APRIL moduliert wird, können durch Messung des in-vitro-Spiegels der APRIL- und/oder der APRIL-R- (d. h. BCMA-) Botschaft gescreent werden, die in Bibliotheken aus Tumorgewebe exprimiert werden. Bibliotheken von Tumorgewebe, in denen die APRIL- und/oder APRIL-R- (d. h. BCMA-) Botschaft hoch exprimiert wird, wären Kandidaten. Alternativ kann nach Kandidaten gescreent werden, indem die öffentlichen und privaten Datenbanken (d. h.

Incyte-Datenbank) mit, zum Beispiel, der humanen Volllängensequenz der cDNA von APRIL durchsucht werden. Bei Anwendung dieser Techniken wurde gefunden, dass, zum Beispiel, die Expression von APRIL-mRNA in einer großen Anzahl an Tumorarten nachgewiesen wurde, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die in der unten folgenden Tabelle 1 gefundenen. TABELLE 1 Bibliotheksbeschreibung

Prostatatumorlinie, LNCaP, CA, 50M, unbehandelt, TIGR

T-Lymphocyt-Tumor, Lymphom, TIGR

Ovarialtumor, papilläres seröses ZysteadenoCA

Lunge, mw/AdenoCA, COPD, 47M

Brusttumor, AdenoCA, 46F, SUB, m/BRSTNOT33

Ganglion, Dorsalwurzel-, zervikal, aw/Lymphom, 32M, NORM

Hirntumor, frontal, neuronal Neoplasma, 32M

Prostatatumor, Adeno-CA, 59M, SUB, m/PROSNOST19

Kolontumor, rechte Kolonflexur, Adeno-CA, 55M, SUB, m/COLATMT01

Pankreastumor, TIGR

Paragangliontumor, Paraganglioma, aw/Nierenzell-CA, 46M

Brust, mw/Milchgangs-CA 43F, m/BRSTTUT16

Nierentumor, Nierenzell-CA, 51 F

Blase, mw/TC CA, CA in situ, 60M, m/BLADTUT04

Uterustumor, Endometrium, F, TIGR

Prostata, BPH, mw/Aden-CA, PIN, 59M

Lunge, mw/Aden-CA, 53M, m/LUNGTUT17

Knochentumor/Linie, MG-63. Osten-SAR/Riesenzell, M/F, pool, RP

Hirn, frontaler Kortex, aw/Lungen-CA, 77M

Kolontumor, Adeno-CA, NORM, SUB, CGAP

Lungentumor, Plattenepithel-CA, 57M

Lunge, mw/Adeno-CA, 63M

Prostata, AH, mw/Adeno-CA, 50M, m/PROSTUT01

periphäres Blut, B-Lymphozyten, CLL, Pool, NORM, 3' CGAP

Kolontumor, Adeno-CA, Pool, NORM, 375' CGAP

Niere, mw/ Nierenzell-CA, 8,53F, Pool, NORM

Ovar, Dermoidzyste, 22F

Kolontumor, Adeno-CA, NORM, 3' CGAP

Kolontumor, Adeno-CA, 3' CGAP

Prostata, BPH, mw/Adeno-CA, 70M SUB

Ovarialtumor, mets Kolon Adeno-CA, 58F

Uterus, Myometrium, mw/Leinmyom, 43F

Dünndarm, Ileum, mw/CUC, 25F

Lymphknoten, peripankreatisch, aw/pankreatisches Adeno-CA, 65M

Ovar, aw/Leinmyome, 36F, NORM

Lunge, mw/spindelzelliges Karzinoid, 62F

Lungentumor, Plattenepithel-CA, 50M

Hirntumor, Meningiom, 36M

Tumor, Adeno-CA. 65F, m/PANCNOT08

Lunge, mw/endobronchiales Karzinoid, 33M

Nebenniere, mw/Phäochromozytom, 43F, m/ADRETUT07

Hirntumor, frontal, Meningiom, 50M

Nierentumor, klarzelliger Krebstyp, Pool, NORM, 3' CGAP

Brust, mw/lobuläres CA, 67F

Lunge, mw/mets Osten-SAR, aw/Pleura mets. 58M, NORM

Prostatatumor, Adeno-CA, 59M, SUB, m/PROSNOT19

Dünndarmtumor, Ileum, mets Endometrium-Adeno-CA, 64F

Ovarialtumor, Adeno-CA, 58F

Brust, NF Brusterkrankung, 46F

Hirntumor, frontal, mets Hypernephrom, 58M

Nierentumor, Wilms, Pool, WM/WN

Lunge, mw/mets Thyroid-CA, 79M, m/LUNGTUT02

Lungentumor, mets Thyroid-CA, 79M, m/LUNGNOT03

Nebenschilddrüsentumor, Adenom, M/F, NORM, WM

Pankreastumor, anaplastisch CA, 45F

Ovar, mw/muzinöses Zystadeno-CA, 43F, m/OVARTUT01

Lungentumor, Plattenepithel-CA, pooled, NORM, CGAP

Brusttumor, Adeno-CA, 46F, m/BRSTNOT17

Uterus, mw/Leinmyom, aw/Kolon-Adeno-CA, 45F

Lunge, mw/Adeno-CA, aw/Knoten, Zwerchfell mets, 63F

Brusttumor, Adeno-CA, 46F, m/BRSTNOT33

Prostatatumor, Adeno-CA, 66M, m/PROSNOT15, PROSDIN01

Brusttumor, Adeno-CA, 54F, m/BRSTNOT03

Keimzelltumor, Pool, SUB, 3'CGAP

Knochenmark, Tibia, aw/mets alveoläres RhabdomyoSAR, 16M

Prostata, AH, mw/Adeno-CA, 57M, m/PROSTUT04

Brust, PF Veränderungen, mw/Adeno-CA, 55F, mBRSTTUT01

Uterustumor, papilläres seröses CA, F, pooled, 3' CGAP

Ovartumor, muzinöses Zystadeno-CA, 43F, m/OVARNOT03

Brust, PF Veränderungen, mw/Adeno-CA, intraduktal CA, 43F

Brust, mw/Milchgangs-CA, CA in situ, aw/Knoten mets, 62F

Gangliontumor, Ganglioneurom, 9M

Pankreastumor, Adeno-CA, 3' CGAP

Uterustumor, Endometrium-Adeno-CA, F, pooled, 3' CGAP

Lungentumor, neuroendokrines Karzinoid, Pool, NORM, 3' CGAP

Die APRIL-R-Antagonisten der vorliegenden Erfindung, die zur Behandlung von Zuständen verwendet werden, die mit einer unerwünschten Zellproliferation einhergehen, insbesondere Tumortherapie, inhibieren vorteilhaft das Tumorzellwachstum um mehr als 10 %, 20 %, 30 % oder 40 % und am meisten bevorzugt um mehr als 50 %. Die APRIL-R-Antagonisten werden durch Screening erhalten (siehe, zum Beispiel, die Diskussion in Beispiel 6). Zum Beispiel können APRIL-R-Antagonisten auf der Grundlage der Wachstum inhibierenden Aktivität (d. h. mehr als 10 %, 20 %, 30 %, 40 % oder 50 %) gegen das humane Kolonkarzinom HT29 oder humanes Lungenkarzinom A549 (siehe, zum Beispiel, die Diskussion in 15) ausgewählt werden, die jeweils von einem Kolon- und einem Lungentumor gewonnen wurden.
Hierin werden auch Verfahren zur Inhibierung von B-Zell- und nicht-B-Zellwachstum, durch dendritische Zellen induziertes B-Zellwachstum und Reifung oder Immunglobulinproduktion in einem Tier unter Verwendung von APRIL-R-Polypeptid beschrieben.
Ebenfalls hierin beschrieben, sind Verfahren zur Verwendung von APRIL-R bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Hypertonie, kardiovaskulären Störungen, Nierenstörungen, lymphoproliferativen B-Zell-Störungen, immunsuppressiven Erkrankungen, Organtransplantation, Entzündung und HIV. Ebenfalls beschrieben sind Verfahren zur Verwendung von Mitteln zur Behandlung, Unterdrückung oder Veränderung einer Immunreaktion, an der ein Signalübertragungsweg zwischen APRIL-R und seinem Liganden beteiligt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein APRIL-R-Polypeptid und einen pharmazeutisch zulässigen Hilfsstoff enthalten.
Geeignete Trägersubstanzen für ein APRIL-R-Polypeptid, zum Beispiel, und deren Formulierungen werden beschrieben in Remington' Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., 1980, Mack Publishing Co., herausgegeben von Oslo et al. Typischerweise wird eine geeignete Menge eines pharmazeutisch zulässigen Salzes in der Formulierung verwendet, um die Formulierung isotonisch zu machen. Beispiele für die Trägersubstanz umfassen Puffer wie Kochsalzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung. Der pH-Wert der Lösung beträgt vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 8, und mehr bevorzugt von etwa 7,4 bis etwa 7,8. Weitere Trägersubstanzen umfassen Präparate mit verlängerter Freisetzung wie semipermeable Matrizes aus festen, hydrophoben Polymeren, wobei die Matrizes in der Form von geformten Elementen vorliegen, wie z. B. Liposomen, Filmen oder Mikropartikeln. Es ist für einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich, dass bestimmte Trägersubstanzen mehr bevorzugt sein können, in Abhängigkeit zum Beispiel vom Verabreichungsweg und der Konzentration des verabreichten APRIL-R-Polypeptids.
Die Verabreichung kann durch Injektion erreicht werden (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) oder durch andere Verfahren wie beispielsweise Infusion, die eine Lieferung in den Blutstrom in einer wirksamen Form gewährleisten.
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wird, wenn nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA, Proteinchemie und Immunologie einsetzen, die innerhalb der Fähigkeiten des Fachgebiets liegen. Derartige Techniken werden in der Literatur beschrieben. Siehe, zum Beispiel, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage. (Sambrook, Fritsch und Maniatis, Hrgs.), Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989; DNA Cloning, Volumen I und II (D.N. Glover, ed), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent Nr. 4,683,195 (Mullis et al.,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames und S.J. Higgins,Hrgs.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Harnes und S.J. Higgins, Hrgs.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, Hrg). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumen 154 und 155 (Wu et al., Hrgs.), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller und M.P. Calos, Hrgs.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer und Walker, Hrgs.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumen I-IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrgs.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Die folgenden Beispiele werden gegeben, um die vorliegende Erfindung zu erläutern und sollten nicht als diese einschränkend ausgelegt werden.
BEISPIELE:
Die folgenden Verfahren werden in den hier im folgenden beschriebenen Beispielen verwendet.
Verfahren:
Klonierung und Expression von myc-getaggtem murinem APRIL (CCM776) in Pichia pastoris.
Der Expressionsvektor pCCM213.10 wurde konstruiert, indem PDR004 genommen wurde (H98 muAPRIL mit superFAS-Liganden „Stalk"- gebunden an den N-Terminus zusammen mit einem FLAG-Epitop-Tag) und die kodierenden Sequenzen des mu APRIL von SacI bis NotI ausgeschnitten wurden. Synthetische Oligonucleotide LTB-559 und 560 bilden einen Xho-1-SacI-Linker, der eine Leadersequenz für einen alpha-Paarungsfaktor, ein myc-Epitop-Tag sowie die KEL-Einheit aus dem FAS-Liganden enthält. Sowohl das muAPRIL-Fragment wie auch der Linker wurden in die Xho-1-NotI-Stellen von pccm211 ligiert, einem Expressionsplasmid von Pichia pastoris.
PCCM213.10 wurde mit StuI linearisiert, mittels Elektroporation in den GS115-Stamm (his4-) eingeführt und auf Dextrose enthaltendem Minimalmedium ausplattiert. HIS4-Transformanden wurden auf ihre Proteinexpression hin untersucht, indem man eine einzelne repräsentative Kolonie in ein energiereiches Medium impfte (BMGY: gepuffertes Komplexmedium mit Glycerin) und zu einem dichten Wachstum für 48 Stunden bei 30 °C stehen ließ. Die Kulturen wurden zentrifugiert und Zellpellets in (1:5) einem reichen Induktionsmedium, das 1,5 % Methanol enthielt (BMMY: gepuffertes Komplexmedium mit Methanol) resuspendiert. Nach zwei Tagen Induktion bei 30 °C wurden die Überstände auf SDS-PAGE separiert und auf die Gegenwart von muAPRIL hin bewertet. Coomassie-Färbung und Western Blot (mit dem anti-myc mAb 9E10) zeigten, dass ein Stamm, CCM776, hinreichende Mengen der glykosylierten Form des mit myc getaggten H98 muAPRIL-Proteins produzierten.
Reinigung von myc-mAPRIL
Myc-mApril, ein Protein mit 149 Aminosäuren, wurde in pichia exprimiert. Dieses Protein hat einen isoelektrischen Punkt von 7,45. 175 ml Überstand von pichia wurde dialysiert und über Nacht wurde der Puffer zu 10 mM Tris mit pH 6,8 ausgetauscht und anschließend über eine 20 ml SP-Säule geschickt. Die Säule wurde ausgiebig mit 10 mM Tris-HCI, pH 6,8, gewaschen und mit 250 n mM NaCl in PBS eluiert. Ein zweiter Reinigungsschritt wurde erreicht, indem eine Gelfiltrationssäule (S300) verwendet wurde. Fraktionen aus der 20 ml SP-Säule, die myc-APRIL enthielten, wurden mittels Zentrifugieren auf ein Volumen von 7 ml eingeengt. Nach Gelfiltration erhielten wir 8 mg myc-APRIL, nachgewiesen durch OD und Coomassie-Gel. Wir führten auch eine Western Blot-Analyse unter Verwendung von monoklonalen 9E10-Antikörpern der Maus aus (anti-myc), was zeigte, dass das myc-Tag nach den Reinigungsschritten intakt ist. Die N-terminale Sequenz bestätigte, dass das gereinigte Protein myc-mApril entspricht.
Reinigung von FLAG-humanem April.
Plasmid ps429 (im Folgenden mit p1448 bezeichnet) wurde verwendet, um 293 T-Zellen transient unter Verwendung von Lipofectamin-Reagenz (Gibco-Brl) und serumfreiem Medium zu transfizieren. Das Plasmid, das in den Säuger-Expressionsvektor PCR3 (Invitrogen) konstruiert wurde, kodiert für die Rezeptorbindungsdomäne von humanem APRIL, mit einem N-terminalen Protein in den Zellkulturmedien. Das FLAG-APRIL-Protein wurde von dem serumfreien Medium unter Verwendung einer anti-FLAG mAb M2-Säule und überschüssigem, gereinigtem FLAG-Peptid gereinigt, wobei den Anweisungen des Herstellers (Kodak) Folge geleistet wurde.
Reinigung von HBMCA-Fc
HBMCA-Fc wurde transient in 293-Zellen transfiziert. Konditioniertes Medium aus 293-Zellen, die hBCM-Fc überexprimieren, wurde in eine Protein A-Säule geladen. Protein wurde unter Verwendung von 25 mM Phosphat, 100nM NaCl pH 2,8 eluiert und anschließend mit einem 1/20 Volumen 0,5 M NaPO₄, pH 8,6 neutralisiert. Ausgewählte Fraktionen wurden auf der Grundlage von OD 280 reduzierenden und nicht reduzierenden SDS-PAGE-Gelen und Western Blots unterworfen, um das gereinigte Protein zu identifizieren. Es wurden 3 mg Protein aus 500 ml des konditionierten Mediums gewonnen.
Myc-mAPRIL bindet in der FACS-Analyse an verschiedene Zelllinien.
450 ng/ml gereinigtes myc-mAPRIL wurde in 100 μl PBS/2 % FBS + Fc-Blockierungsreagenzien (FcBlock @ 20μg/ml (Pharmingen) und an gereinigtes humanes IgG@10μg/ml(Sandoz) auf Eis für 1 Stunde an Zelllinien gebunden. Positive Bindung wurde unter Verwendung von spezifischen anti-murinen APRIL-Antiseren aus Kaninchen (1:500) und anti-Kaninchen-IgG-FITC vom Esel (Jackson) nachgewiesen. Zelllinien A20, Raji, NIH3T3 und HT29 wurden im Medium gehalten, wie vom Lieferanten (ATCC Bethesda, MD) vorgeschlagen. BJAB-Zellen wurden in HEPES gepuffertem RPMI, ergänzt mit 10 % FBS und L-Glutamin, kultiviert. In Kompetitionsassays wurde zu 450 ng/ml myc-murines APRIL 1 μg/ml des konkurrierenden Proteins gegeben.
Beispiel 1: Nachweis von APRIL-Bindung an APRIL-R unter Verwendung eines Plattenassays
In diesem Beispiel wurde die BCMA-Assoziation mit April untersucht.
Um zu untersuchen, ob BCMA mit April assoziiert, führten wir ein Co-Immunpräzipitationsexperiment aus. In diesem Experiment wurden sowohl lösliche Proteine von hBCMA-Fc wie auch von myc-mApril verwendet.
HBCMA-Fc und LTbR-Fc wurden mit unterschiedlichen TNF-Liganden zugegeben:
myc-mApril; myc-CD40L und myc-RANKL in Medium, das 10 % FBS enthielt, für % Stunde bei Raumtemperatur. Fc-Proteine wurden 1-2 Stunden lang an Protein A-Beads gebunden, dreimal mit 1 ml PBS gewaschen, mittels Immunblotting mit monoklonalem Antikörper 9E10 (anti-myc) von der Maus analysiert und unter Verwendung von verstärkter Chemilumineszenz entwickelt.
Wir wiesen myc-APRIL in hBCMA-Fc-Immunpräzipitaten nach, was darauf hinweist, dass BCMA mit April auf eine spezifische Weise wechselwirkt, da andere TNF-Liganden, myc-CD40L und myc-RANKL keine Fähigkeit aufwiesen, an BCMA zu binden. Myc-April assoziiert nicht mit LTbR-Fc.
Die gleiche Membran wurde gestrippt und mit anti-hlG-HRP erneut geblottet, um zu zeigen, dass die gleiche Menge an LTbR-Fc mit BCMA-Fc in den Immunpräzipitaten verwendet wurde.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt, dass hBCMA-FC mit FLAG-hAPRIL wechselwirkt.
ELISA-Analyse: Beschichtete Platten mit Rezeptor-Fc-Fusionsproteinen (hBCMA-Fc-739 oder hTNFR2-Fc-492) mit 1 μg/ml in Carbonat, pH 9,6, über Nacht, 4 °C. Blockierung für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Verwendung von PBS/5 % nicht fettiger Trockenmilch/05 % Tween-20. Es wurde eine 2fache serielle Verdünnung der Liganden in 100 μl des Blockierungspuffers durchgeführt (TNFa-197 von 1000 ng/ml, muBAFF-657 von 1000 ng/ml, hApril-507 von 2000 ng/ml (inaktiv), hApril-429 von 5fach konzentriertem Medium). Nach Inkubation mit Liganden wurde die Platte in PBS/0,5 % Tween-20 gewaschen und mit 0,5 μg/ml anti-FLAG mAb M2 in Verdünnungspuffer als Sonde versehen. Der Antikörper wurde dann unter Verwendung von anti-Maus-PO 1/2000 mit enzymatischer Entwicklung (OPD) nachgewiesen.
Immunpräzipitationsexperimente: 293T-Zellen wurden mit dem angegebenen Expressionsplasmid (Rec-Fc oder Flag-Ligand) in 9 cm Platten transfiziert. Transfizierte Zellen wurde für 5 d in 8 ml Optimem-Medium (Gibco-BRL) stehen gelassen. Die Immunpräzipitation wurde ausgeführt, indem 200 μl von jedem mit Rezeptor konditioniertem Medium mit 200 μl von jedem mit Ligand konditioniertem Medium + 400 μl PBS + 10 μl ProtG-Sepharose vermischt wurde. Diese wurden 1 h auf einem Rad rotiert, 4 mal mit 1 ml PBS gewaschen, dann in 50 μl Probenpuffer (+DTT) gekocht. Pro Spur wurden 20 μl von jeder Immunpräzipitation geladen. Nachweisblotting wurde mit 1 μg/m1 anti-FLAG M2-mAb (Sigma, St Louis MO) und anti-Maus-PO (1/2000) ausgeführt. Ein erneuter Sondierungsblot mit anti-humanem PO wurde ebenfalls überprüft: 100 μl konditioniertes Medium wurde mit MeOH/CHCl₃/Lysozym gefällt. Diese Mischung wurde in 50 μl Probenpuffer (+DTT) gekocht und es wurden 20 μl geladen. Es wurde ein Nachweisblotting mit anti-FLAG-mAb M2 (1 μg/ml) und anti-Maus-PO (1/2000) ausgeführt.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Bindung von myc-mAPRIL, hKayL-440 (hBAFF) und Flag-mBAFF an hBCMA-lg, hLT-R-lg oder hp80 TNFR-lg. Alle Experimente wurden bei 25 °C mit einer minütlichen Durchflussgeschwindigkeit von 10 μl/ml durchgeführt.
Jedes Experiment wurde unter Verwendung von HBS-Puffer durchgeführt (10mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005 % P20 Tensid bei pH 7,4). Die gleiche Lösung wurde sowohl als Laufpuffer und als Verdünnungsmittel für die Probe verwendet.
Die Oberfläche des CM5-Chips (BIAcore, Inc.) wurde zunächst mit N-Hydroxysuccinimid/N-Ethyl-N'-(3-diethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid (BIAcore) aktiviert. Zwanzig μl hBCMA-lg; fünfzehn μl hLT-R05-lg und 10 μl hp80-TNFR, verdünnt auf 30 g/ml in 10 mM Essigsäure wurden dann einmal mit 30 μl und noch einmal mit 15 μl Ethanolamin-HCl (pH 8,5) blockiert. Dies führte zu einer Oberflächendichte von 1600-3700 Resonanzeinheiten (RU). Der Chip wurde mit 20 μl lmM Ameisensäure regeneriert. Diese Verwerfungen wurden fünfmal wiederholt, um eine reproduzierbare und stabile Grundlinie festzulegen.
Für das Experiment wurden 100 μl myc-mApril, hKayL-440 und FLAG-mBAFF jeweils auf 30 μg/ml in Verdünnungspuffern verdünnt und wurden über die Oberfläche des Chips injiziert. Direkt nach jeder Injektion wurde der Chip mit 500 μl des Verdünnungspuffers gewaschen. Die Oberfläche wurde zwischen den Experimenten regeneriert, indem 20 μl 1 mM Ameisensäure injiziert wurde; danach wurden weitere 15 μl Ameisensäure injiziert. Nach der Regeneration wurde der Chip mit dem Verdünnungspuffer äquilibriert.
Beispiel 4: Erzeugung von löslichen Rezeptorformen:
Um einen Rezeptorinhibitor für die Verwendung in Menschen zu bilden, wird die cDNA-Sequenz der extrazellulären Domäne des humanen Rezeptors benötigt. Wenn die Mausform bekannt ist, können humane cDNA-Bibliotheken ohne Weiteres unter Verwendung der cDNA-Sequenzen der Maus gescreent werden und solche Manipulationen werden auf diesem Fachgebiet routinemäßig ausgeführt. Mit einer humanen cDNA-Sequenz kann man Oligonucleotid-Primer entwerfen, um die extrazelluläre Domäne des Rezeptors in der Abwesenheit der Transmembran- und intrazellulären Domänen mittels PCR zu amplifizieren. Typischerweise werden die meisten der Aminosäuren zwischen der letzten über Disulfid verknüpften „TNF-Domäne" und der Transmembran-Domäne eingeschlossen. Man könnte die Menge an „Stalk"-Region, die für eine Optimierung der Wirksamkeit des resultierenden, löslichen Rezeptors eingeschlossen werden, variieren. Dieses amplifizierte Stück würde gentechnisch so hergestellt, dass es geeignete Restriktionsstellen enthält, um das Einklonieren in verschiedene chimäre C-terminale Ig-Fusionsvektoren zu ermöglichen. Alternativ könnte man ein Stoppsignal an das 3'-Ende einfügen und eine lösliche Form des Rezeptors herstellen, ohne auf die Verwendung eines chimären Ig-Fusionsansatzes zurückzugreifen. Die resultierenden Vektoren können in den meisten Systemen exprimiert werden, die in der Biotechnologie verwendet werden, einschließlich Hefe, Insektenzellen, Bakterien und Säugerzellen, und es existieren Beispiele für alle Arten von Expression. Es können verschiedene humane Fc-Domänen angebunden werden, um FcR zu optimieren oder zu entfernen und Wechselwirkungen zu komplementieren, je nach Wunsch. Alternativ können mutierte Formen dieser Fe-Domänen verwendet werden, um FcR selektiv zu entfernen oder Wechselwirkungen zu komplementieren oder die Bindung von N-verknüpften Sacchariden an die Fc-Domäne, was bestimmte Vorteile mit sich bringt.
Beispiel 5: Erzeugung von agonistischen oder antagonistischen Antikörpern:
Die oben beschriebenen löslichen Rezeptorformen können verwendet werden, um Mäuse zu immunisieren und durch herkömmliche Verfahren monoklonale Antikörper herzustellen. Die resultierenden mAbs, die mittels ELISA-Verfahren identifiziert werden, können des Weiteren nach agonistischer Aktivität entweder als lösliche Antikörper oder immobilisiert auf Kunststoff in verschiedenen zellulären in-vitro-Assays gescreent werden. Oftmals ist der Tod der HT29-Zelllinie ein bequemes System, dass auf die Signalgebung durch viele TNF-Rezeptoren empfindlich reagiert. Wenn diese Linie den Rezeptor von Interesse nicht besitzt, kann dieser Volllängenrezeptor stabil in die the HT29-Linie transfiziert werden, um nun dem Cytotoxizitätsassay das Funktionieren zu ermöglichen. Alternativ können derartige Zellen im Cytosensor-Gerät verwendet werden, um zu bewerten, ob die Aktivierung des Rezeptors eine pH-Wertveränderung hervorrufen kann, die auf ein Signalgebungsereignis hinweist. Die Signale der TNF-Rezeptorfamilie in einem derartigen Format und dieses Verfahren erfordern nicht, dass die tatsächlichen biologischen Ereignisse bekannt sind, die von dem Rezeptor ausgelöst werden. Die agonistischen mAbs würden für klinische Verwendung „humanisiert" werden. Dieser Vorgang kann auch verwendet werden, um antagonistische mAbs zu definieren. Derartige mAbs würden durch das Fehlen der agonistischen Aktivität definiert werden und durch die Fähigkeit, Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen zu inhibieren, wie mittels ELISA, klassischer Eindungs- oder BIAcore-Techniken überwacht. Schließlich kann die Induktion der Chemokin-Sekretion durch verschiedene Zellen als Reaktion auf einen agonistischen Antikörper ein Screening-Assay bilden.
Beispiel 6: Screening nach Inhibitoren der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung:
Durch die Verwendung des Rezeptor-Ig-Fusionsproteins können entweder kombinatorische Bibliotheken nach Molekülen gescreent werden, die den Rezeptor direkt binden. Diese Moleküle können anschließend in einem Assay mit ELISA-Format auf die Fähigkeit, die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zu inhibieren, untersucht werden, wobei das Rezeptor-Ig-Fusionsprotein und eine lösliche Form des Liganden verwendet werden. Dieses ELISA kann verwendet werden, um direkt verschiedene Naturprodukt-Bibliotheken usw. nach inhibitorischen Verbindungen zu screenen. Der Rezeptor kann in eine Zelllinie wie beispielsweise die HT29-Linie transfiziert werden, um ein biologisches Assay zu bilden (in diesem Fall Cytotoxizität), das dann das Screening-Assay bilden kann.
Beispiel 7: In vivo-Inhibierung von Tumorwachstum
Die Wirksamkeit von BCMA-lg als ein Antagonist für Tumorwachstum wurden unter Verwendung einer Anzahl an verschiedenen Tumorzelllinien untersucht, die in vivo gezüchtet wurden. Es wurden athymische (Nu/Nu), immundefiziente Mäuse für diese Untersuchungen verwendet, und die Tumorzellen wurden subkutan implantiert. Für die SW480-Tumorlinie, die sehr aggressiv wächst, implantierten wir 8 × 10⁵ Zellen in 100 μl Pyrogen freier, steriler PBS. Eine Kontrollgruppe wurde unbehandelt gelassen (n = 5), während die anderen Gruppen mit 100 μgs Kontroll-Ig (n = 6) oder 100 μgs BCMA-lg (n = 6) Proteinen dosiert wurden. Die Dosierung begann gerade vor der Implantation, mit nachfolgenden Dosen im Anschluss daran alle 7 Tagen. Der Durchmesser des Tumors wurde unter Verwendung einer Messschraube gemessen und das Volumen unter Verwendung der Formel Vol = 4/3πr³ berechnet.

SW480-Kolonkarzinomtumore wachsen bei Verwendung eines Nu/Nu-Mausmodells sehr schnell, und tastbare Tumore wurden innerhalb von 10 Tagen nachgewiesen. Nach 24 Tagen betrug das durchschnittliche Volumen des Kontrolltumors 0,3 cm³, während das durchschnittliche Volumen der mit BCMA-lg behandelten Tumore 0,19 cm³ betrug, eine Verminderung der Tumorlast um 46 %. Das Kolonkarzinom HT29 wächst ebenfalls im dem Nu/Nu-Modell sehr aggressiv. Für diese Experimente wurden 1 × 10⁶ Zellen in 100 μI Pyrogen freier, steriler PBS subkutan implantiert und der Dosierungsplan war wie für SW480 beschrieben. Tastbare Tumore wurden nach 7 Tagen nachgewiesen, und in den Kontrollgruppen wuchsen die meisten Tumore sehr rasch. Nach 42 Tagen betrug das durchschnittliche Tumorvolumen in den Kontrollgruppen (unbehandelt und mit Kontroll-Ig behandelt, n = 12) 0,485 cm³, während die durchschnittliche Tumorgröße in der mit BCMA-lg behandelten Gruppe (n = 5) 0,095 cm³ betrug, eine Verminderung der Tumorlast um 80 %. Nach 50 Tagen wurden 30 % der Mäuse in der Kontrollgruppe als terminal bewertet, aufgrund von Tumorgrößen, die größer als 1,5 cm³ waren, und das Experiment wurde gestoppt. Im Gegensatz zu der Kontrollgruppe wurden 0 % der Mäuse in der mit BCMA-lg behandelten Gruppe als terminal bewertet. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2. Tumorvolumina und Letalität im HT29-Modell nach 50-tägiger Behandlung.
Kontrolltiere (unbehandelt und mit Kontroll-Ig behandelt) mit BCMA-lg behandelt
Tumorvolumen	terminal terminal	Tumorvolumen
0,22	-	0,11	-
0,22	-	0,32	-
0,35	-	0,13	-
0,61	-	0,56	-
0,73	-	0,33	-
1,74	+
2,53	+
1,51	+
0,90	-
0,44	-
0,32	-
1,92	±
Durchschnitt: 0,96	%:30	Durchschnitt:	0,29
	%:0

Dies zeigt eine 70 %ige Verminderung des durchschnittlichen Tumorvolumens und eine deutliche Auswirkung auf die Mortalität im HT29-Modell für Tumorwachstum bei Verwendung von Behandlung mit BCMA-Ig.
Die Lungenkarzinom-Tumorlinie A549 wächst langsamer als die oben beschriebenen Kolonkarzinomlinien. Für diese Zelllinie implantierten wir 1 × 10⁶ Zellen in 100 μl Pyrogen freier, steriler PBS und behandelten unter Verwendung des vorher beschriebenen Plans. Tastbare Tumore wurden etwa 20 Tage nach der Implantation nachgewiesen. 50 Tage nach der Tumorimplantation betrug das durchschnittliche Tumorvolumen in den Kontrollgruppen (unbehandelt und mit Kontroll-Ig behandelt, n = 16) 0,2 cm³, während die durchschnittliche Tumorgröße in der mit BCMA-lg behandelten Gruppe (n = 7) 0,1 cm³ betrug, eine Verminderung des Tumorvolumens um 50 %. In der mit BCMA-lg behandelten Gruppen hatten 57 % der Mäuse einen Tumor mit weniger als 0,1 cm³ nach 50 Tagen, während nur 6 % der mit Kontrolle behandelten Mäuse eine solch kleine Tumorlast bewahrten. 60 Tage nach der Tumorimplantation war das durchschnittliche Tumorvolumen in den Kontrollgruppen auf 0,3 cm³ gestiegen. Im Gegensatz dazu betrug das durchschnittliche Tumorvolumen in der mit BCMA-lg behandelten Gruppe immer noch weniger als 0,2 cm³ (0,188).
Für die murine NIH3T3-Linie, die ebenfalls langsamer wächst als die Kolonkarzinomlinien, implantierten wir 5 × 10⁶ Zellen in 100 μl Pyrogen freier, steriler PBS und behandelten wie oben beschrieben. Die NIH3T3-Zellen bilden einen Fibrosarkomtumor, wenn sie subkutan in Nu/Nu-Mäuse implantiert werden. Nach 4 Wochen wurden tastbare Tumore nachgewiesen und in den Kontrollgruppen (n = 11) dehnten diese Tumore ihr Volumen innerhalb der folgenden 10 Tage aus, um eine durchschnittliche Größe von 0,136 cm³ zu erreichen. Im Gegensatz dazu erreicht das Tumorvolumen in der mit BCMA-lg behandelten Gruppe (n = 5) nur eine Größe von 0,03 cm³, eine 78 %ige Verminderung der Tumorlast. Am Tag 48 nach der Tumorimplantation hatte das durchschnittliche Tumorvolumen in den Kontrollgruppen 1,6 cm³ erreicht, während die durchschnittliche Tumorgröße in der mit BCMA-lg behandelten Gruppe nur 0,8 cm³ betrug, eine Verminderung des Tumorvolumens um 50 %. An Tag 52, wurden 82 % (9/11) der Tieren in den Kontrollgruppen als terminal bewertet, basierend auf einem Tumorvolumen von mehr als 1,5 cm³, und es blieben nur 18 % der Tiere noch am Leben. Im Gegensatz dazu hatten 40 % (2/5) der Tiere in der mit BCMA-lg behandelten Gruppe einen Tumor mit einem solchen Volumen, dass sie geopfert werden mussten, und es blieben 60 % der Tiere noch am Leben. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3. Überlebensdaten im NIH3T3-Modell.

Tage nach der Implantation

% Überleben 38 42 48 52

Kontrolle 100 90 64 18

BCMA-lg 100 100 80 60
Die Ergebnisse, die das Wachstum der NIH3T3-Tumore mit der Zeit zeigen, sind in 13 dargestellt. Die Ergebnisse, die das Wachstum der SW480-Tumore mit der Zeit zeigen, sind in 14 dargestellt. Die Ergebnisse, die das Wachstum der HT29- Tumore mit der Zeit zeigen, und ein Streuungsdiagramm, das individuelle Tiere an Tag 42 nach der Tumorimplantation zeigt, sind in 15A dargestellt. Die Ergebnisse, die das Wachstum der A549-Tumore in individuellen Tieren an den Tagen 50 und 60 nach der Tumorimplantation zeigen, sind in 15B dargestellt.
Die Ergebnisse für die Inhibierung des Tumorwachstums der NIH3T3-Tumorzelllinie werden in 13 gezeigt. Die Ergebnisse für die Inhibierung des Tumorwachstums der SW480-Tumorzelllinie werden in 14 gezeigt. Die Ergebnisse für die Inhibierung des Tumorwachstums für die HT29- und der A549-Tumorzelllinien werden in 15 gezeigt.
Beispiel 8: BCMA-IgG verursacht eine Verminderung in der Anzahl der B-Zellen in normalen Mäusen
Es wurden acht Wochen alte, weibliche BALG/c-Mäuse von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erworben.
Mäuse (3/Gruppe) erhielten i.p. entweder PBS, 400 μg humanes BCMA-hulgG1-(hBCMA-lg) Fusionsprotein (bereitgestellt von Teresa Cachero, Biogen), oder 400 μg gereinigtes humanes IgG (HulgG) (Sandoz, Basel, Switzerland) an Tagen –8, –5, –1 und +2. Mäuse erhielten 100 μl 10 %iger roter Blutzellen vom Schaf (SRBC) (Colorado Serum Company, Denver, CO) an Tag 0.
Zum Zeitpunkt der Opferung wurde Blut über Kardiopunktur in EDTA enthaltende Röhrchen abgenommen und die roten Blutzellen wurden in einem hypotonen Puffer lysiert. Es wurde auch Blut ohne EDTA für Serumherstellung abgenommen. Einzelzellsuspensionen wurden aus Milzen und mesenterialen Lymphknoten hergestellt (MLN) und rote Blutzellen wurden in einem hypotonen Puffer lysiert. Durchflußcytometrie wurde unter Verwendung von PE-konjugierten anti-CD45R/B220, anti-syndecan/CD138 und anti-B7.2, und FITC-konjuigierten anti-IgM und anti-CD45R/B220 ausgeführt. Alle mAbs wurden von Pharmingen (San Diego, CA) erworben. Kurz gesagt wurden Fe-Rezeptoren mit 10 μg/ml Fc-Block (Pharmingen) für 15 min auf Eis blockiert, gefolgt von Zugabe von PE- und FITC-konjugierten mAbs und Inkubation auf Eis für 20-30 min. Die Zellen wurden 1-mal gewaschen und in 0,5 %igem Paraformaldehyd suspendiert.
Zellfluoreszenzdaten wurden auf einem FACSCalibur^TM Durchflußcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) gesammelt und unter Verwendung der CELLQuest^TM Software (Becton Dickinson) analysiert.
Nach Behandlung mit hBCMA-lg gab es eine etwa 50 %ige Verminderung der Anzahl an B-Zellen in peripherem Blut und in den untersuchten peripheren lymphoiden Organen. B220^highlgM^low B-Zellen entfallen auf 23,4 % und 21,5 % der Zellen in mit PBS behandelten bzw. mit HulgG behandelten Mäusen, wohingegen diese Population nur 9,9 % der Zellen in den mit hBCMA-Ig behandelten Mäuse repräsentierte. Plasmazellen (syndecan/CD138+) schienen mit 5,7 % und 4,8 % Anwesenheit im Blut der mit PBS behandelten bzw. mit HulgG behandelten Mäuse ebenfalls geringfügig vermindert zu sein, verglichen mit 3,9 % in mit hBCMA-lg behandelten Mäusen. Das B7.2-Molekül war auf 3,1 % und 4,5 % an B220+-Zellen in mit PBS behandelten bzw. mit HulgG behandelten Mäusen hochreguliert, verglichen mit 1,9 % in mit hBCMA-lg behandelten Mäusen.
In der Milz waren B220^high B-Zellen deutlich vermindert in mit hBCMA-lg behandelten Mäusen, was 18,8 % entspricht, verglichen mit 36,7 % und 40 % in mit PBS behandelten bzw. mit HulgG behandelten Mäusen. Diese Abnahme wurde sowohl in 1gM^high wie auch in 1gM^low-Subpopulationen beobachtet (siehe Tabelle 3). Es wurde keine Veränderung in dem neu gebildeten B-Zellkompartment in der Milz beobachtet, B220^low 1gM^high (Daten nicht gezeigt). Plasmazellen (syndecan/CD138+) schienen mit 3,3 % und 3,4 % Anwesenheit in der Milz der mit PBS behandelten bzw. mit HulgG behandelten Mäuse ebenfalls geringfügig vermindert zu sein, verglichen mit 2,4 % in mit hBCMA-lg behandelten Mäusen.

Das MLN zeigte eine Abnahme in B220+ B-Zellen mit einer Anwesenheit von 14,1 % in mit hBCMA-lg behandelten Mäusen verglichen mit 26,7 % und 35,8 % in mit PBS behandelten bzw. mit HulgG behandelten Mäusen. Die Daten sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3. B-Zellpopulationen in mit hBCMA-lg, PBS und HulgG behandelten Mäusen¹.

Blut	B220^highlgM^low	Syndecan	B7.2/B220^low
PBS	23,4 ± 5,7	5,7 ± 1,5	3,1 ± 0,5
HulgG HBCMA-lg	21,5 ± 4,5 9,9 ± 1,8	4,8 ± 0,9 3,9 ± 0,6	4,5 ± 1,0 1,9 ± 0,5
Milz	220^highlgM^low	220^highlgM⁺	Syndecan
PBS	27,8 ± 1,6	11,9 ± 1,6	3,3 ± 0,8
HulgG	30,5 ± 2	11,8 ± 1,0	3,4 ± 0,7
HBCMA-lg	10,6 ± 0,2	8,4 ± 0,2	2,4 ± 0,2
MLN	B220+
PBS	26,7
HulgG	35,8 ± 3,3
HBCMA-lg	14,1 ± 5,9

¹Die Mäuse wurde behandelt wie in dem Abschnitt über Materialien und Verfahren beschrieben, und die Daten sind als Prozent angegeben ± Standard.

Abweichung
Der verminderte Prozentsatz von B7.2 + B-Zellen in dem Blut und den Plasmazellen im Blut und den Milzen der mit hBCMA-Ig behandelten Mäuse nach Immunisierung mit SRBCs deutet darauf hin, dass eine Inhibierung der B-Zellaktivierung und/oder -Reifung vorliegt und eine möglicherweise verminderte Eliminierung von aktivierten B-Zellen. Ein sehr kleiner Anteil an antigen-spezifischen B-Zellen würde aktiviert werden und auf ein beliebiges Antigen reagieren, in diesem Fall SRBC. Da die Behandlung mit hBCMA-lg eine derartig dramatische Verminderung des Anteils an B-Zellen in allen untersuchten Geweben zur Folge hatte, –50 %, scheint die Aktivität von hBCMA-lg auch ruhende, reife B-Zellen anzugreifen.
Es wird daher in Betracht gezogen, dass das BCMA-Fusionsprotein als ein therapeutischer Wirkstoff mit klinischer Anwendung bei B-Zell-vermittelten Erkrankungen verwendet werden kann. Erkrankungen würden solche umfassen, die autoimmuner Natur sind, wie beispielsweise systemischer Lupus erythematodes, Myasthenia gravis, autoimmune hämolytische Anämie, idiopathische Thrombozytopenia Purpura, Anti- Phospholipid-Syndrom, Chagas-Krankheit, Morbus Basedow, Wegener-Granulomatose, Polyarteriitis nodosa und rasch progrediente Glomerulonephritis. Das therapeutische Mittel würde auch Anwendung bei Plasmazellerkrankungen finden, wie beispielsweise Multiples Myelom, Morbus Waldenström, Franklin-Syndrom, primäre oder Immunozyt vermittelte Amyloidose und monoklonale Gammopathie unklarer Signifikanz (MGUS). Onkologische Targets würden B-Zell-Karzinome, Leukämien und Lymphome umfassen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung a) eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die (i) zumindest zu 80% identisch mit der Sequenz ist, die durch Aminosäure 1 bis Aminosäure 184 von SEQ ID NO:8 dargestellt ist; und (ii) zur Bindung an APRIL imstande ist; b) eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die (i) zumindest zu 80% identisch mit der Sequenz ist, die durch Aminosäure 1 bis Aminosäure 52 von SEQ ID NO:8 dargestellt ist; und (ii) zur Bindung an APRIL imstande ist; c) eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch Aminosäure 8 bis Aminosäure 41 von SEQ ID NO:8 dargestellt ist; oder d) eines Antikörpers, der gegen SEQ ID NO:8 gerichtet ist; zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Tumorzelle, die „A Proliferation Inducing Ligand" (APRIL) exprimiert.
Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid aus (a), (b) oder (c) weiterhin eine Fc-Domäne eines sekretierten Proteins umfaßt.
Die Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Polypeptid aus (a), (b) oder (c) weiterhin eine Fc-Domäne eines Immunglobulins umfaßt.
Die Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Immunglobulin IgG ist.
Die Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Immunglobulin ein menschliches ist.
Die Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid weiterhin SEQ ID NO:12 umfaßt.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1-6, wobei die Tumorzelle ein Karzinom ist.
Die Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Karzinom ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lungenkarzinom, Kolonkarzinom, Prostatakarzinom und Brustkarzinom.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die Tumorzelle in einem Säugetier ist.
Die Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Säugetier ein Mensch ist.