DE60125563T2

DE60125563T2 - Verfahren zur verwendung eines humanen il-17 verwandten polypeptids zur behandlung von krankheiten

Info

Publication number: DE60125563T2
Application number: DE60125563T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Andrew Zionsville GLASEBROOK; Ling Carmel LIU; Michelle Christy Indianapolis NEWTON; Jonathan Wendell Indianapolis TETREAULT
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2000-10-13
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2021-09-29
Also published as: WO2002033083A2; EP1326974B1; ATE349523T1; ES2277947T3; US20060083713A1; AU2001296229A1; EP1326974A2; DE60125563D1; WO2002033083A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Behandlung oder Prävention von Säugerstörungen, die mit der Endothelzellapoptose assoziiert sind oder durch Entzündung vermittelt werden. Genauer gesagt betrifft die Erfindung die Behandlung oder Prävention von Sepsis, septischem Schock, systemischem entzündlichem Response Syndrom, akutem Atemstresssyndrom (ARDS), Atherosklerose, Hypertension, kongestivem Herzversagen, primärer pulmonaler Hypertension und Allotransplantatsvaskulopathie.
Hintergrund der Erfindung
Die Endothelzellauskleidungen im vaskulären Lumen spielen eine zentrale Rolle bei der Modulation des vaskulären Tonus, der Koagulation, der Permeabilität, des Blutflusses, der Angiogenese und der Thrombolyse. Die Aufrechterhaltung der Homeostase der vaskulären Endothelzellpopulation umfasst eine Balance der Proliferation, Nekrose und Apoptose.
Der Prozess der Apoptose, oder des programmierten Zelltods ist ein genetisch kontrollierter Prozess des Zelltods, durch den unterschiedliche Stimuli eine Kaskade an zellulären Proteasen aktivieren. Diese Proteasen, als Caspasen bekannt, spalten spezifisch zelluläre Strukturen in Richtung einer Zersetzung einer Zelle in kleine apoptotische Körperchen ohne der Freisetzung von zellulären Bestandteilen oder einer Schädigung der umgebenden Zellen. Die Apoptose von Endothelzellen führt zu einer Veränderung der Endothelfunktion durch die Verformung der Endothelmonoschichtarchitektur als Folge der veränderten Form und der verringerten Größe von apoptotischen Zellen. Die Apoptose von Endothelzellen kann durch jeden einer Anzahl an Umweltstimuli induziert werden; einschließlich Bestrahlung, hoher Glucose, Entfernung von extrazellulärer Matrix und Ablösung von Zellen von der Basalmembran (Fujita et al., Int. Arch. of Allergy und Immunol. 117: 202 (1998)).
Die Apoptose in Endothelzellen kann potentiell entweder direkt oder indirekt durch Lipopolysaccharid ("LPS") stimuliert werden. LPS, ein bekanntes Endotoxin, ist eine Komponente der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien. Zusätzlich setzen pathogene Bakterien, Viren und Pflanzen Lipopolysaccharid-induzierende Substanzen frei. LPS ist der Hauptmediator bei der Entwicklung des durch Endotoxin-induzierten Schocks. Die chemischen Strukturen der LPS Moleküle, die aus unterschiedlichen Bakterien erhalten werden, können in einer speziesspezifischen Weise variieren, wobei jedoch die als Lipid A bezeichnete Region allen LPS Molekülen gemein ist (E. Rietschel et al., in Handbooks of Endotoxins, Elsevier, 1: 187-214 (1984)). Die Lipid A Region vermittelt viele, wenn auch nicht alle LPS-abhängigen pathophysiologischen Veränderungen, die eine Sepsis und Gram-negative Bakteriämie kennzeichnen. LPS ist eine primäre Todesursache beim Menschen, die von einer Gram-negativen Sepsis betroffen sind (van Deventer et al., Lancet, 1: 605 (1988), Ziegler et al., J. Infect. Dis. 136: 19-28 (1987)). LPS, das aus einer Infektion von Gram-negativen Bakterien freigesetzt wird, kann auch eine Rolle bei der Pathologie von Autoimmunzuständen spielen, wie dem Reiter Syndrom, das mit rheumatoider Arthritis assoziiert ist.
Die LPS Provokation veranlasst Endothelzellen, polymorphonukleäre Leukozyten und Zellen der Monozyten/Makrophagenauskleidung, schnell eine Vielzahl von Zellprodukten freizusetzen, einschließlich immunregulatorischer Substanzen, die zur Initiierung, Modulierung oder Vermittlung von humoralen und zellulären Immunreaktionen und -prozessen fähig sind. Studien haben gezeigt, dass LPS Monozyten /Makrophagen induziert, um inflammatorische Cytokine freizusetzen, wie TNF-α, IL-1, IL-6 und IL-12, die eine Hauptrolle bei der Kaskade von Ereignissen spielen, die zum endotoxischen Schock führen.
Der Tumornekrosefaktor (TNF) ist scheinbar ein primärer Mediator des septischen Schocks (Beutler et al., N. Eng. J. Med. 316: 379 (1987)). Die intravenöse Injektion von LPS in Tiere und den Menschen ruft eine schnelle, transiente Freisetzung von TNFα hervor (Beutler et al., Science 229: 869 (1985), Mathison et al. J. Clin. Invest. 81: 1925 (1988)). Eine der vielen zellulären Reaktionen, die nach der Freisetzung von TNFα und dessen anschließende Bindung an TNFα Zellrezeptoren aktiviert wird, ist die Apoptose. Mehrere Studien haben gezeigt, dass TNFα direkt Endothelzellapoptose induziert (Fujita et al., Int. Arch. of Allergy and Immunol. 117: 202 (1998)). In vitro sind viele humanen Endothelzellen gegenüber einer Apoptose durch TNFα nur in Gegenwart von RNA Transkriptionsinhibitoren oder Proteinsyntheseinhibitoren empfindlich (wie Cycloheximid). Das Überleben von humanen Epithelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) nach einer Exposition gegenüber TNFα, IL-1 oder LPS hängt von der Synthese von cytoprotektiven Proteinen ab. Die Proteinsyntheseinhibitoren verhindern die Synthese dieser Proteine nach einer Exposition gegenüber TNFα, IL-1 oder LPS (Zen et al., J. Biol. Chem. 274: 28808 (1999), Polunovsky et al., Exp. Cell Res. 214: 584 (1994)). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass ein TNF-Bindeprotein Mäuse gegen einen LPS-induzierten Tod wie auch eine Endothelzellapoptose schützen kann (Hamimovitz-Friedman et al., J. Exp. Med. 186: 1831 (1977)). Die Induktion von TNFα in Reaktion auf LPS dürfte daher eine zentrale Rolle bei der Apoptose von Endothelzellen spielen.
Zusätzlich zu TNF-α tragen Interferon-γ (IFN-γ) und IL-12 auch zur LPS induzierten Sepsis bei (L.Ozmen et al., J. Exp. Med. 180: 907 (1994)). IFN-γ wird durch T-Zellen und NK Zellen sekretiert. Die immunmodulatorischen Effekte von IFN-γ sind ausgiebig und unterschiedlich. Bei Monozyten/Makrophagen umfassen die Aktivitäten von IFN-γ folgende: Erhöhung der Expression der Klasse I und II MHC Antigene, Erhöhung der Bildung von IL-1, des Blutplättchen-aktivierenden Faktors und H₂O₂, Schutz der Monozyten gegenüber der durch LAK Zellen vermittelten Lyse, Herunterregulation der IL-8 mRNA Expression, die durch IL-2 hochreguliert wird und mit LPS, Induktion der NO Bildung (A. Billiau und R. Dijkmans, Biochem. Pharmacol. 40: 1433 (1990), G.C. Sen und P. Lengyel, J. Biol. Chem. 267: 5017 (1992), G.L. Gusella et al., J. Immunol. 151: 2725 (1993), V. Bulut et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 1134 (1993)). Von IFN-γ wurde auch gezeigt, dass es für Monozyten aber nicht für Neutrophile chemotaktisch ist (A.C. Issekutz und T.B. Issekutz, J. Immunol. 151: 2105 (1993)). IFN-γ erhöht selektiv sowohl die IgG2a Sekretion durch LPS-stimulierte B-Zellen als auch die IgG3 Sekretion bei der T-Zell-unabhängigen Typ 2 Antigen-vermittelten B-Zellaktivierung (C.M. Snapper et al., J. Exp. Med. 175: 1367 (1992), C.M. Snapper et al., J. Immunol. 140: 2121 (1988)). Es wurde ebenfalls berichtet, dass es die eigene Expression induziert (P.F. Halloran et al., J. Immunol. 148: 3837 (1992)). Von IFN-γ wurde auch gezeigt, dass es ICAM-1 hochreguliert, aber nicht die E-Selektin oder VCAM-1 Expression auf Endothelzellen M.H. Thornhill et al., Scand. J. Immunol. 38: 279 (1993)). Darüberhinaus wurde von IFN-γ gezeigt, dass es zur Swan Reaktion beiträgt, die durch Gram-negative Bakterien induziert wird (K. Ogasawara et al., J. Immuno. 160: 3522 (1998)). IFN-γ stimuliert Makrophagen und Monozyten zur Sekretion von TNF-α und reguliert wiederum die TNF-α Rezeptor Expression nach oben.
Im Gegensatz zu IFN-γ wird IL-12 durch Makrophagen und B-Lymphozyten gebildet. Von IL-12 wurde gezeigt, dass es multiple Effekte auf T Zellen und NK Zellen hat (A. D'Andrea et al., J. Exp. Med. 176: 1387 (1992), S.H. Chan et al., J. Exp. Med. 173: 869 (1991)). Diese Effekte umfassen die Stimulierung der Produktion von IFN-γ und TNF durch ruhende und aktivierte T und NK Zellen, die Synergie mit anderen IFN-γ Induktoren sowohl auf transkriptionalen als auch posttranskriptionalen Ebenen, um die IFN-γ Genexpression zu induzieren, die Erhöhung der cytotoxischen Aktivität von ruhenden NK und T Zellen, die Induktion und Synergie mit IL-2 bei der Erzeugung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK), die Wirkung als Co-Mitogen zur Stimulierung der Proliferation von ruhenden T-Zellen und die Induktion der Proliferation von aktivierten T und NK Zellen (D' Andrea et al., (1992)). Eine Evidenz legt nahe, dass IL-12, das durch Makrophagen in Reaktion auf infektiöse Agenzien gebildet wird, ein zentraler Mediator der Zell-vermittelten Immunreaktion durch dessen Wirkungen auf die Entwicklung, Proliferation und Aktivitäten der Th1 Zellen ist (R.M. Locksley, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90: 5879 (1993), G. Trinchieri, Immunol. Today 14: 335 (1993), P. Scott, Science 260: 496 (1993), C.S. Hseih et al., Science 260: 547 (1993)). Diese IL-12 Aktivitäten werden durch Faktoren antagonisiert, die mit der Entwicklung von ungebundenen T Helferzellen in Th2 Zellen und die Vermittlung der humoralen Immunreaktion assoziiert sind (beispielsweise IL-4 und IL-10, R.M. Locksley, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 5879 (1993), G. Trinchieri (1993), P. Scott, Science 260: 496 (1993) und C.S. Hseih et al., Science 260: 547 (1993)).
Zusätzlich zur Sepsis sind sowohl IFN-γ als auch II-12 bei vielen anderen entzündlichen Erkrankungen hochreguliert. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Antikörper gegen IL-12 durch Superantigen induzierte und spontane Rückbildungen der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis (EAE) verhindern können, eine T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems, die als Modell für multiple Sklerose dient (C.S. Constantinescu et al., J. Immunology, 161: 5097 (1998)). Es wurde auch berichtet, dass die Blockierung der IFN-γ Produktion in T-Zellen durch die Verwendung von anti-IL-18 Antikörpern die Entwicklung der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis verhindern kann (S.S. Zamvil et al., Annu. Rev. Immunol. 8: 579 (1990)).
Typ I Diabetes wird auch als Autoimmunerkrankung betrachtet. Genauer gesagt ist er durch eine spontane mononukleäre Infiltration des Pankreas gekennzeichnet. Die Progression der Erkrankung Richtung Intrainsulitis korreliert mit einer Zunahme der Th1 Zellen und dem anschließenden Verlust von β-Zellen, was zu einer Insulindefizienz führt (N.N. Shehedeh et al., J. Autoimmun., 6: 291-300 (1993), H. Rothe et al., Diabetologia, 37: 1154-1158 (1994)). Die destruktiven Effekte von IFN-γ, das durch diese T Zellen gebildet wird, wurden unter Verwendung von neutralisierenden Antikörpern gegenüber IFN-γ oder IL-12 gelindert (M. Debray-Sachs et al., J. Autoimmun., 4: 237-248 (1994)).
Die Synergie zwischen IL-12 und IL-18 ist wichtig für die Bildung von IFN-γ aus T Zellen und NK Zellen, die die Entzündung aufrechterhalten (M. Micallef et al., J. Immunol., 26: 1647-1651 (1996)). Zusätzlich zur Stimulierung der IFN-γ Sekretion erhöht IL-12 auch die Expression des IL-18 Rezeptors auf Th0 Zellen und B Zellen. Es wurde gezeigt, dass IL-18 durch artikuläre Chondrozyten gebildet wird und proinflammatorische und katabolische Reaktionen induziert und es wurde eine erhöhte Bildung an IL-18 im Synovium von Patienten mit rheumatoider Arthritis gefunden (O. Tsaiwei, J. Immunol. 162: 1096-1100 (1999), Arthritis Rheum. 40: 274 (1997)).
IL-17 ist ein weiteres bekanntes proinflammatorisches Molekül. Es wird durch aktivierte T Lymphozyten, primär von Gedächtnis T-Zellen gebildet (E. Rouvier et al., J. Immunol., 150: 5445 (1993), Z. Yao et al., J. Immunol., 155: 5483 (1995), J. Kennedy et al., J. Interferon Cytokine Res., 16: 611 (1996), F. Fossiez et al., J. Exp. Med., 183: 2593 (1996)). IL-17 scheint die Kommunikation zwischen dem Immunsystem und dem hämatopoetischen System zu vermitteln. Von T-Zellen stammendes IL-17 induziert Fibroblasten zur Sekretion von IL-6, IL-8, ICAM-1 und G-CSF scheinbar durch einen NF-κB vermittelten Mechanismus (Z. Yao et al., Immunity 3: 811 (1995)). IL-6 fördert wiederum die Entwicklung von Granulozyten/Makrophagenkolonien und G-CSF steuert die Entwicklung von Neutrophilen (F. Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996), K. Ikebuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84: 9035 (1987), N. Berliner et al., Bloo, 85: 799 (1995), A.W. Roberts und D. Metcalf, Exp. Hematol. 22: 1156(1994), H.E. Broxmeyer, J. Exp. Med., 183: 2411 (1996). IL-17 fördert auch die Proliferation von partiell aktivierten T-Zellen und reguliert die Stickstoffoxidbildung im osteoarthritischen Knorpel nach oben (Z. Yao et al., Immunity 3: 811(1995), M.G. Attur et al., Arthritis Rheum. 40: 1050(1997)).
Im Gegensatz zu den bisher erwähnten Cytokinen ist IL-10 ein antiinflammatorisches Cytokin. IL-10 ist ein pleiotrophes Cytokin, das die Bildung von mehreren Cytokinen (einschließlich IL-1, GM-CSF, TNF, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 und IFN-γ) durch aktivierte Th-1 Zellen, NK Zellen und Monocyten/Makrophagen hemmt. Von IL-10 wurde gezeigt, dass es die cytotoxische Aktivität von Makrophagen hemmt und die Proliferation und Differenzierung von B-Zellen, Mastzellen und Thymus T-Zellen stimuliert (K.W. Moore et al. Annu. Rev. Immunol., 11: 165 (1993), D.F. Fiorentino et al., J. Exp. Med. 170: 2081 (1989), T.R. Mosmann, Adv. Immunol., 56:1 (1994)).
Es wurde ein neuer Vertreter der Interleukinsuperfamilie, nämlich IL-17C, in WO 99 60 127 A und von Li et al., (Li et al., PNAS, 97(2): 773-778) berichtet. Es wurde eine identische Sequenz als IL-21 in WO 99 61 617 A beschrieben. Trotz der in silico Identifizierung der Polypeptidsequenz dieses Cytokins bleibt die therapeutische Brauchbarkeit der exogenen Verabreichung entweder des Polypeptids selbst oder von Agonisten oder Antagonisten hiervon in der Technik ungelöst.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Therapien für die effektive Prävention oder Behandlung von Atherosklerose, Hypertension, kongestivem Herzversagen, primärer pulmonaler Hypertension, Sepsis, Gram-negativer Bakterämie, allergischen Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes, Entzündung, rheumatoider Arthritis, ARDS, Allotransplantatvaskulopathie und Zustände oder Symptome, die hiermit verwandt sind, durch die Verabreichung von funktionellen LP-48 Polypeptiden und hierbei den Eingriff in die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Störungen.
In einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polypeptids, das die Aminosäuren 19 bis 197 des LP-48 umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention einer durch Entzündung vermittelten Störung bei einem Säuger, worin die Störung ausgewählt ist aus Sepsis, septischem Schock, systemisch entzündlichem Response-Syndrom und akutem Atemstresssyndrom (ARDS).
In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polypeptids, das die Aminosäuren 19 bis 197 des LP-48 umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention einer Störung, die mit der Endothelzellapoptose bei einem Säuger assoziiert ist, worin die Störung ausgewählt ist aus Artherosklerose, Hypertension, kongestivem Herzversagen, primärer, pulmonaler Hypertension, akutem Atemstresssyndrom (ARDS) und einer Allotransplantatvaskulopathie.
Bevorzugte Polynukleotide zur Ausführung der Erfindung sind jene, die für das Volllängen LP-48 Polypeptid kodieren, wie dies in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist. Bevorzugtere Polynukleotide sind jene, die das reife LP-48 Polypeptid kodieren, wie dies durch die Aminosäuren 19-197 der SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird. Die am meisten bevorzugten Polynukleotide zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind jene, die die für LP-48 kodierenden Polynukleotide im Leserahmen verbunden zu zusätzlichen Polynukleotidsequenzen umfassen, die für nicht-LP-48 Aminosäuresequenzen kodieren.
Ein bevorzugtes Polypeptid zur Ausführung der vorliegenden Erfindung ist das Vollängen LP-48 Polypeptid, wie dies in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist. Ein bevorzugteres Polypeptid ist das reife LP-48 Polypeptid, wie dies durch die Aminosäuren 19-197 der SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird. Die am meisten bevorzugten Polypeptide zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind LP-48 Fusionsproteine, die ein LP-48 Polypeptid oder ein Fragment hiervon, verbunden mit zusätzlichen Aminosäuresequenzen von nicht-LP48 Polypeptiden umfassen. Insbesondere kann das LP-48 Fusionsprotein zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung die Aminosäuren 19-197 des LP-48, wie dies in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, oder eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, und eine Sequenz der konstanten Immunglobulindomäne umfassen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Der Ausdruck „LP-48" bezieht sich entweder auf die Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 eines Vertreters der Interleukinsuperfamilie. LP-48 wurde als IL-17C beschrieben (WO 99 60 127 A, Li et al., PNAS, 97(2): 773-778) und taucht auch in der GenBank Datenbank als Hinterlegungsnummer AF152099 auf. Eine identische Sequenz taucht auch als IL-21 in WO 99 61 617 A auf.
Das LP-48 Gen (SEQ ID Nr. 1) umfasst einen einzelnen großen offenen Leserahmen, der für ein Polypeptid mit 197 Aminosäuren kodiert (SEQ ID Nr. 2). Es wird erwartet, dass die Expression von SEQ ID Nr. 1 in vivo oder durch Säugerzellen in vitro zu einem reifen Protein mit 179 Aminosäuren führen würde. Ein solches reifes Protein ist innerhalb der Definition von „LP-48" oder „LP-48 Polypeptid" enthalten.
Die LP-48 Sequenzen können aus der Natur isoliert werden oder können durch rekombinante oder synthetische Mittel hergestellt werden. Der Ausdruck "LP-48 Polypeptid", wie er hierin verwendet wird, soll sich unter anderem auf glykosylierte, unglykosylierte und/oder modifizierte Formen des LP-48 Polypeptids beziehen, wie es in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist (oder das reife Polypeptid LP-48), die ferner ein oder mehrere konservative Substitutionen, Additionen oder Deletionen der Aminosäuresequenz umfassen, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, mit der Maßgabe, dass die modifizierten Formen des LP-48 Polypeptids im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie die hierin beschriebenen LP-48 Polypeptide in mindestens einem der hierin beispielhaft dargestellten Tests zeigen. Der Ausdruck "Aktivität" oder der Begriff "biologische Aktivität" bezieht sich im Zusammenhang mit einem LP-48 Polypeptid auf die Fähigkeit eines LP-48 Polypeptids zur in vivo und/oder in vitro Induktion einer oder mehrerer der biologischen Folgen, die LP-48 Polypeptiden durch die vorliegende Beschreibung zugeordnet werden. Demnach kann die Aktivität von LP-48 Polypeptiden durch einen oder mehrere der hierin beispielhaft dargestellten in vitro oder in vivo Tests untersucht werden. Eine bevorzugte biologische Aktivität umfasst beispielsweise die Fähigkeit, gegenüber durch LPS induzierten septischen Schock zu schützen, wie dies durch die in Beispiel 12 beschriebene Methodik bestimmt wird.
Der Ausdruck "LP-48 Polypeptid" soll auch Polypeptide umfassen, die Pro- oder Präprosequenzen enthalten, die bei der Prozessierung zur Bildung eines LP-48 Polypeptids oder Fragments hiervon führen. Die natürliche Leadersequenz von humanem LP-48, wie sie durch die Aminosäuren 1-18 der SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, ist ein Beispiel für eine solche Prosequenz, die bei einer Prozessierung zur Bildung eines LP-48 Polypeptids oder Fragments hiervon führt.
Ähnlich können die LP-48 Polynukleotide oder Polypeptide, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, zusätzlich jeweils andere nicht-LP-48 Polynukleotid- oder Polypeptidsequenzen enthalten, mit der Maßgabe, dass das hierbei kodierte Polypeptid noch eine im wesentlichen funktionelle LP-48 Aktivität behält, wie dies hierin beschrieben ist. Genauer gesagt umfassen LP-48 Polypeptide, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, auch chimäre Proteinmoleküle, die nicht in der Natur vorkommen und eine translationale Fusion oder in einigen Fällen eine enzymatische Fusion umfassen, worin zwei oder mehrere unterschiedliche Proteine oder Fragmente hiervon kovalent an eine einzelne Polypeptidkette gebunden sind. Ein bevorzugtes LP-48 Polypeptid zur Durchführung der vorliegenden Erfindung umfasst zumindest ein funktionelles Fragment des Vollängen LP-48 Polypeptids, wie dies in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist und zumindest eine Effektorfunktion einer konstanten Immunglobulindomäne. Die Fusionsmoleküle sind eine Subklasse der chimären Polypeptidfusionen der LP-48 Polypeptide, die zusätzlich einen Teil einer Immunglobulinsequenz enthalten (hierin als LP-48-Ig bezeichnet). Die chimären LP-48-Ig Fusionen können auch monomere, homo- oder heteromultimere und insbesondere homo- oder heterodimäre oder homo- und heterotetramere Formen umfassen, wobei die Chimären in dimeren Formen oder homodimeren Formen der schweren Kette vorliegen können. Tetramere Formen, die eine vierkettige Struktureinheit umfassen, sind die natürlichen Formen, in denen IgG, IgD und IgE vorkommen Es kann auch eine vierkettige Struktur wiederholt werden. Unterschiedliche chimäre Formen, die ein natives Immunglobulin enthalten, sind in der Technik bekannt (WO 98 25 967 A). Das reife Humanprotein von Beispiel 12 ist für ein "LP-48-Ig" beispielhaft. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck "LP-48-Ig" Antikörper-ähnliche Moleküle, die zumindest eine LP-48 Domäne mit den Effektorfunktionen der konstanten Immunglobulindomäne kombinieren. Die Sequenz der konstanten Immunglobulindomäne kann aus jedem Immunglobulin erhalten werden, wie IgG-1, IgG-2, IgG3 oder IgG4 Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM. Bevorzugte Fusionen enthalten das LP-48 fusioniert an den Aminoterminus der Ig Region. Jedoch werden auch Fusionen eines LP-48 Polypeptids oder Fragments hiervon an den C-Terminus der Ig Region umfasst.
Die LP-48 Fusionspolypeptide können auch zusätzliche Aminosäurereste umfassen, wie Affinitätsanhänge, die bei der Reinigung und Identifizierung des Moleküls helfen oder Bindungsstellen an einen natürlichen Liganden bereitstellen. Diese zusätzlichen Aminosäurereste werden typischerweise aber nicht ausschließlich an den N- oder C-Terminus des LP-48 Polypeptids angebracht.
Der Ausdruck "Epitop Tag" bezieht sich, wenn er hierin verwendet wird, auf ein chimäres Polypeptid, das ein LP-48 Polypeptid oder eine Domänensequenz hiervon fusioniert an ein "Tag Polypeptid" umfasst. Das tag Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann oder das durch ein anderes Mittel identifiziert werden kann, wobei es kurz genug ist, so dass es nicht mit der Aktivität des LP-48 Polypeptids wechselwirkt. Das Tag Polypeptid ist vorzugsweise auch ziemlich einzigartig, so dass der Antikörper nicht wesentlich mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Tag Polypeptide haben im allgemeinen mindestens 6 Aminosäurereste und gewöhnlich etwa 8 bis etwa 50 Aminosäurereste (vorzugsweise etwa 10 bis etwa 20 Reste).
Der Ausdruck "Aminosäure" wird hierin im breitesten Sinn verwendet und umfasst natürlich vorkommende Aminosäuren, wie auch nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, einschließlich Aminosäureanaloga und Derivate. Das Letztere umfasst Moleküle, die einen Aminosäurerest aufweisen. Der Fachmann erkennt, dass in Anbetracht der breiten Definition der Bezug auf Aminosäuren hierin beispielsweise umfasst natürliche proteinogene L-Aminosäuren, D-Aminosäuren, chemisch modifizierte Aminosäuren, wie Aminosäureanaloga und Derivate, natürlich vorkommende nicht-proteinogene Aminosäuren, wie Norleucin, β-Alanin, Ornithin etc. und chemisch synthetisierte Verbindungen mit Eigenschaften, die in der Technik für Aminosäuren charakteristisch sind.
Der Einbau von nicht-natürlichen Aminosäuren, einschließlich synthetischer nicht-nativer Aminosäuren, substituierter Aminosäuren oder einer oder mehrerer D-Aminosäuren in ein LP-48 Analogon ("D-LP-48 Polypeptide") ist auf mehreren unterschiedlichen Wegen vorteilhaft. D-Aminosäure-enthaltende Polypeptide zeigen eine erhöhte Stabilität in vitro oder in vivo im Vergleich zu L-Aminosäure-enthaltenden Gegenstücken. Daher kann die Konstruktion von Polypeptiden, die D-Aminosäuren einbauen, besonders brauchbar sein, wenn eine größere Stabilität in vivo erwünscht oder erforderlich ist. Genauer gesagt sind D-Peptide gegenüber endogenen Peptidasen und Proteasen resistent und stellen daher eine verbesserte Bioverfügbarkeit des Moleküls und längere Haltbarkeiten in vivo bereit, wenn solche Eigenschaften erwünscht sind. Wenn es gewünscht wird, dass das Peptid nur für eine kurze Zeitspanne aktiv ist, erlaubt die Verwendung von L-Aminosäuren hierin endogenen Peptidasen, das Molekül zu verdauen, wobei die Exposition der Zelle gegenüber dem Molekül beschränkt wird. Zusätzlich können D-Peptide nicht effizient für eine auf den Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II beschränkte Präsentation gegenüber T Helferzellen prozessiert werden und rufen daher weniger wahrscheinlich eine humorale Immunantwort im gesamten Organismus hervor.
Zusätzlich zur Verwendung von D-Aminosäuren ist dem Fachmann bekannt, dass Modifikationen in der Aminosäuresequenz eines Peptids, Polypeptids oder Proteins zu einer äquivalenten oder möglicherweise verbesserten zweiten Generation von Peptiden führen können, die äquivalente oder bessere funktionale Eigenschaften zeigen, wenn sie mit den ursprünglichen Aminosäuresequenzen verglichen werden. Veränderungen in den LP-48 Polypeptiden der vorliegenden Erfindung, die zu LP-48 Analoga führen, können eine oder mehrere Aminosäureinsertionen, Deletionen, Substitutionen, Verkürzungen, Fusionen, Neuanordnungen von Untereinheitssequenzen und dergleichen jeweils durch menschliche Manipulation umfassen, mit der Maßgabe, dass die durch solche Modifikationen gebildeten Sequenzen im wesentlichen dieselben (oder verbesserte oder verringerte, wie dies gewünscht wird) Aktivitäten als die hierin beschriebenen LP-48 Polypeptidsequenzen aufweisen. Der Ausdruck "LP-48 Analogon" bezieht sich auf jede modifizierte Form eines LP-48 Polypeptids, das im wesentlichen dieselbe oder eine erhöhte biologische Aktivität in vivo und/oder in vitro im Vergleich zu der entsprechenden unmodifizierten Form zeigt und pharmazeutisch zumindest in einem Aspekt erwünschter ist im Vergleich zum unmodifizierten LP-48 Polypeptid.
Wie hierin verwendet soll der Ausdruck "LP-48 Analogon" die LP-48 Polypeptide umfassen, wie sie hierin definiert sind, worin das LP-48 Polypeptid ferner zumindest eine Modifikation umfasst, die normalerweise nicht für LP-48 Polypeptide nativ ist. Der Ausdruck "Modifikation" umfasst jede Veränderung in der Struktur (das heißt eine qualitative Veränderung) eines Proteins. Solche Modifikationen können unter anderem Veränderungen der Aminosäuresequenz, Transkriptions- oder Translationsspleißvariation, prä- oder posttranslationale Modifikationen der DNA oder RNA Sequenz, Anfügung von Makromolekülen oder kleinen Molekülen an die DNA, RNA oder das Protein, wie Peptide, Ionen, Vitamine, Atome, Zucker-enthaltende Moleküle, Lipid-enthaltende Moleküle, kleine Moleküle und dergleichen umfassen, wie dies in der Technik gut bekannt ist. Ein Typ der Proteinmodifikation ist eine oder mehrere Veränderungen in der Aminosäuresequenz (Substitution, Deletion oder Insertion). Solche Veränderungen können an einer oder mehreren Aminosäuren eine Veränderung von einer geladenen Aminosäure zu einer unterschiedlich geladenen Aminosäure, von einer nicht-geladenen zu einer geladenen Aminosäure umfassen, wie dies vorher oder später diskutiert ist. Ein weiter Typ der Proteinmodifikation erfolgt durch Veränderungen in der Prozessierung des Proteins in der Zelle. Ein nicht beschränkendes Beispiel ist eines, worin einige Proteine eine "Adressenmarkierung" aufweisen, die spezifiziert, ob sie in (oder außerhalb) der Zelle verwendet werden sollten. Eine solche Markierung oder ein Tag kann in Form eines Peptids, eines Zuckers oder eines Lipids vorliegen, der bei der Anbringung oder Entfernung vom Protein bestimmt, wo das Protein in der Zelle lokalisiert ist.
Ein weiterer Typ der Proteinmodifikation erfolgt durch die Anbringung von anderen Makromolekü len an ein Protein. Diese Gruppe kann unter anderem jede Anbringung l Entfernung eines solchen Makromoleküls umfassen. Diese Moleküle können viele Typen umfassen und können entweder permanent oder temporär sein. Beispiele umfassen: (i) Polyribosylierung, (ii) DNA/RNA (Einzel- oder Doppelstrang), (iii) Lipide und Phospholipide (beispielsweise für die Membrananheftung), (iv) Saccharide/Polysaccharide und (v) Glycosylierung (Anbringung von unterschiedlichen Typen von Zucker und Sialinsäuren – in einer Vielzahl an einzelnen und verzweigten Strukturen). Ein weiterer Typ der Proteinmodifikation beruht auf der Anbringung von anderen kleinen Molekülen an Proteine. Beispiele umfassen unter anderem: (i) Phosphorylierung, (ii) Acetylierung, (iii) Uridylierung, (iv) Adenylierung, (v) Methylierung und (vi) Capping (unterschiedlich komplexe Modifizierung des N-Terminus des Proteins aus verschiedenen Gründen). Die meisten dieser Veränderungen werden oft zur Regulierung der Aktivität eines Proteins verwendet. (v) und (vi) werden auch verwendet, um die Halbwertszeit des Proteins selbst zu verändern. Diese Proteinveränderungen können auf einer zweidimensionalen Gelelektrophorese detektiert werden, wobei mehrere Methoden verwendet werden, wie Markierung, Veränderungen im pI, Antikörper oder andere spezifische Techniken, die auf die Moleküle selbst gerichtet sind, wie dies in der Technik bekannt ist. Molekulargewichtsveränderungen können durch 2DGE detektierbar sein, aber normalerweise nicht. MALD (Matrixgestützte Laserdesorption der Flugmassenspektrometrie) ist bevorzugt, um diese Modifikationen zu detektieren und zu charakterisieren. Solche Modifikationen sind allgemein gerichtet auf die Verbesserung der schlechten therapeutischen Eigenschaften eines unmodifizierten LP-48 Polypeptids durch die Verbesserung der Zielspezifität, Löslichkeit, Stabilität, Serumhalbwertszeit, Affinität für Zielrezeptoren, Emp findlichkeit gegenüber Proteolyse, Resistenz gegenüber dem Clearing in vivo, Einfachheit der Reinigung und/oder Verringerung der Antigenität und/oder erforderlichen Häufigkeit der Verabreichung des Moleküls.
Der Ausdruck "Ursache" soll den Beginn der molekularen Ereignisse umfassen, die zu den Symptomen der Apoptose, Immundefizienz, Krebs, Entzündung und/oder Infektionskrankheiten führen oder in der Reaktion des Organismus auf Immundefizienz, Krebs, Entzündung und/oder Infektionskrankheit impliziert sind, der Ausdruck "vermitteln" umfasst alle molekularen Ereignisse, die einen Teil der ursächlichen Kette an Ereignissen bilden, die zu den Symptomen der Apoptose, Immundefizienz, Krebs, Entzündung und/oder Infektionskrankheit führen oder Teil der Reaktion des Organismus auf Immundefizienz, Krebs, Entzündung und/oder Infektionskrankheit sind.
Der Ausdruck "HIS Tag" bezieht sich, wenn er hierin verwendet wird, auf die LP-48 Sequenzen oder einen Teil hiervon, fusioniert an eine Polypeptidsequenz mit einem hohen Gehalt an Histidin. Der HIS Tag hat genug Histidinreste, um ein einzigartiges Reinigungsmittel bereitzustellen, auf die Eigenschaften der wiederholten Histidinreste zu selektieren, ist aber kurz genug, so dass er nicht mit der Aktivität der extrazellulären Domänensequenz von LP-48 wechselwirkt.
Andere beispielhafte Tags umfassen unter anderem einen "HA" Tag, der Aminosäuren von einem Hämagglutininfragment enthält und einen "FLAG" Tag (Immunex Corp., Seattle, WA), einen 6 Aminosäure langen Tag. Diese und andere geeignete Tag Polypeptide haben im allgemeinen mindestens 6 Aminosäurereste und gewöhnlich zwischen etwa 4 und etwa 20 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 4 bis etwa 10 Reste und vor allem 6, wie HHHHHH). Der HA Tag entspricht einem Epitop, das vom Influenza Hämagglutininpolypeptid abgeleitet ist (Wilson et al., Cell 37: 767-778 (1984)). Die Fusion des HA Tags an das Zielpolypeptid erlaubt eine leichte Detektion und Gewinnung des rekombinanten Polypeptids mit einem Antikörper, der das HA Epitop erkennt. Der FLAG Tag wird ähnlich auf die Polypeptiddetektion und Reinigung mit einem Antikörper angewendet, der das FLAG Epitop erkennt.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck "Immunadhäsion", der manchmal Fc Fusion genannt wird, Antikörper-ähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eine "Adhäsion") mit den Effektorfunktionen von kostanten Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell umfassen die Immunadhäsionen eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, die eine andere ist, als die Antigenerkennungs- und -bindungssteile eines Antikörpers (das heißt ist "heterolog") und eine Sequenz der konstanten Immunglobulindomäne. Der Adhäsionsteil eines Immunadhäsionsmoleküls ist typischerweise eine fortlaufende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die Sequenz der konstanten Immunglobulindomäne bei der Immunadhäsion kann von jedem Immunglobulin erhalten werden, wie IgG-1, IgG-2, IgG-3 oder IgG-4 Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM.
Der Ausdruck "Antagonist" wird im breitesten Sinn verwendet und umfasst jedes Molekül, das teilweise oder vollkommen eine biologische Aktivität eines nativen hierin beschriebenen LP-48 Polypeptids blockiert, hemmt oder neutralisiert. Auf ähnliche Weise wird der Ausdruck "Agonist" im breitesten Sinn verwendet und umfasst jedes Molekül, das eine biologische Aktivität eines nativen hierin beschriebenen LP-48 Polypeptids nachahmt. Der Ausdruck "Antagonist" umfasst spezifisch Antagonistantikörper oder Antikörperfragmente, Ribozyme, Antisense Nukleinsäuren, wie auch kleine organische Moleküle. Verfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten eines LP-48 Polypeptids können das Zu sammenbringen eines LP-48 Polypeptids mit einem Kandidatenagonistenmolekül oder -antagonistenmolekül und das Messen einer detektierbaren Veränderung in einer oder mehrerer der biologischen Aktivitäten umfassen, die normalerweise mit dem LP-48 Polypeptid assoziiert sind.
"Antikörper" (Abs) und "Immunglobuline" (Igs) sind Glycoproteine mit denselben strukturellen Eigenschaften. Während Antikörper eine Bindungsspezifität für ein spezifisches Antigen zeigen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als auch andere Antikörper-ähnliche Moleküle, denen eine Antigenspezifität fehlt. Polypeptide der letzteren Art werden beispielsweise vom Lymphsystem in geringen Mengen und in großen Mengen von Myelomen gebildet. Der Ausdruck "Antikörper" wird im breitesten Sinn verwendet und umfasst vor allem ohne Beschränkung intakte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (beispielsweise bispezifische Antikörper), die aus mindestens 2 intakten Antikörpern gebildet werden und Antikörperfragmente solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen.
"Antikörperfragmente" umfassen einen Teil eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die Antigenbindungsregion oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab, Fab', F(ab')₂ und Fv Fragmente, Diabodies, lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Engin. 8 (10): 1057-1062 (1995)), Einzelkettenantikörpermoleküle und multispezifische Antikörper, die aus Antikörperfragmenten gebildet werden.
"Einzelketten Fv" oder "sFv" Antikörperfragmente umfassen die V_H und V_L Domänen des Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette vorkommen. Vorzugsweise umfasst das Fv Polypeptid ferner einen Polypeptidlinker zwischen der V_H und der V_L Domäne, die es dem sFv ermöglicht, die gewünschte Struktur für die Antigenbindung zu bilden. Eine Zusammenfassung über sFv findet sich in Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Band 113, Herausgeber Rosenburg und Moore, Springer-Verlag, New York, Seiten 269-315 (1994).
Der Ausdruck "Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit 2 Antigenbindungstellen, wobei die Fragmente eine variable Domäne der schweren Kette (V_H) verbunden mit einer variablen Domäne der leichten Kette (V_L) in derselben Polypeptidkette umfassen (V_H-V_L). Unter Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den zwei Domänen auf derselben Kette zu bilden, werden die Domänen gezwungen mit den komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren und zwei Antigenbindungsstellen zu bilden. Diabodies sind beispielsweise ausführlicher beschrieben in EP 0 404 097 A , WO 93 11 161 A und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
Ein "isolierter" Antikörper ist einer, der aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und abgetrennt und/oder gewonnen wurde. Kontaminationskomponenten der natürlichen Umgebung sind Materialien, die mit diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen für den Antikörper wechselwirken würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige Solute umfassen. Es ist bevorzugt, dass der Antikörper gereinigt wird (1) zu mehr als 95 Gewichtsprozent des Antikörpers, wie dies durch die Lowry Methode bestimmt wird und vor allem mehr als 99 Gewichtsprozent, (2) in einem Ausmaß, das zur Erhaltung von mindestens 15 Resten einer N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Zentrifugationsröhrchensequenziergeräts oder (3) zur Homogenität durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Isolierter Antikörper umfasst den Antikörper in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist. Normalerweise wird ein isolierter Antikörper zumindest durch einen Reinigungsschritt hergestellt.
Der Ausdruck "Antikörper", wie er hierin verwendet wird, beschreibt Antikörper, Antikörperfragmente (wie unter anderem Fab, Fab', F(ab')₂ und Fv Fragmente) und modifizierte Versionen hiervon, die in der Technik bekannt sind (beispielsweise chimäre, humanisierte, rekombinante, beschichtete, oberflächenerneuerte oder CDR-übertragen). Der Ausdruck "Antikörper" soll polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), chimäre Antikörper, multispezifische (beispielsweise bispezifische, trispezifische, etc.) Antikörper, Einzelkettenpolypeptidbindemoleküle und anti-Idiotyp (anti-Id) Antikörper umfassen.
Der Ausdruck "isoliert" bezieht sich im Zusammenhang mit einem LP-48 Polynukleotid oder Polypeptid auf ein LP-48 Molekül, das identifiziert und von zumindest einer Kontaminante abgetrennt und/oder gewonnen wurde, aus der es produziert wurde. Kontaminantenkomponenten sind Materialien, die zelluläre Komponenten umfassen, wie Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige Solute. Normalerweise werden die isolierten LP-48 Moleküle durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
"Konservative Substitution" oder "konservative Aminosäuresubstitution" bezieht sich auf einen Austausch eines oder mehrerer Aminosäurereste in einem Protein oder Peptid. Konservative Substitutionen von Interesse sind in Tabelle 1 zusammen mit bevorzugten Substitutionen gezeigt. Falls solche Substitutionen die gewünschte Funktion erhalten oder verbessern, dann werden mehrere substanzielle Veränderungen, die dann als beispielhafte Substitutionen in Tabelle 1 oder wie sie weiter unten in Bezug auf die Aminosäureklassen beschrieben sind, eingeführt und die Produkte werden gescreent. Eine Substitution an einer bestimmten Position kann 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 oder 20 Aminosäuren umfassen. Tabelle 1 Konservative Substitutionen
Natürlich vorkommende Reste werden in Gruppen aufgrund ihrer gemeinsamen Seitenketteneigenschaften eingeteilt:

(1) hydrophob: Cys, Ser, Thr,
(2) neutral hydrophil: Cys, Ser, Thr,
(3) sauer: Asp, Glu,
(4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg,
(5) Reste, die die Kettenorientierung beeinflussen: Gly, Pro und
(6) aromatische: Trp, Tyr, Phe.

Der Ausdruck "Fragment hiervon", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Fragment, ein Stück oder eine Subregion eines Nukleinsäure- oder eines Proteinmoleküls, dessen Sequenz hierin beschrieben ist, so dass das Fragment 10, 15, 20 oder mehr Aminosäuren oder 15, 30, 45, 60 oder mehr Nukleotide umfasst, die in der ursprünglichen Protein- oder Nukleinsäureverbindung fortlaufend sind. Wenn auf eine Nukleinsäureverbindung Bezug genommen wird, bezieht sich "Fragment hiervon" auf 20, 30, 45, 60 oder mehr aufeinanderfolgende Nukleotide, die von der ursprünglichen Nukleinsäure abgeleitet sind und aufgrund des genetischen Codes auch auf die komplementäre Sequenz. Falls beispielsweise das Fragment die Sequenz 5'-AGCTAG-3' aufweist, dann würde ein "Fragment hiervon" auch die komplementäre Sequenz 3'-TCGATC-5' umfassen.
"Funktionales Fragment" oder "funktionell äquivalentes Fragment" bezieht sich, wie es hierin verwendet wird, auf eine Region oder ein Fragment eines Volllängenproteins oder einer Aminosäuresequenz, die zur Kompetition mit dem endogenen oder nativen LP-48 um die Bindung ein einen natürlich oder rekombinant exprimierten LP-48 Rezeptor fähig ist. Die vorliegende Erfindung liefert auch die Verwendung von Fragmenten der hierin beschriebenen LP-48 Proteine, worin die Fragmente die Fähigkeit zur Bindung an einen natürlichen Liganden behalten. Wie hierin verwendet umfasst "funktionelle Fragmente" Fragmente, die, ob sie an zusätzliche Sequenzen fusioniert sind oder nicht, unter geeigneten Bedingungen eine messbare Bioaktivität zeigen, beispielsweise Schutz gegen eine LPS Provokation in vivo. Funktionelle Fragmente der hierin beschriebenen Proteine können wie hierin beschrieben hergestellt werden, vorzugsweise mittels Klonierungstechniken, um kleinere Versionen des funktionsfähigen LP-48 zu erzeugen, denen eine Sequenz vom 5' Ende, vom 3' Ende, von beiden Seiten oder aus einer internen Stelle fehlt.
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Verwendung von LP-48 Proteinen wie auch von verwandten funktionellen Analoga, die die Fähigkeit behalten, therapeutisch gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden. Modifikationen der Aminosäuresequenz können im allgemeinen gemäß der in Tabelle 1 bereitgestellten Substitutionen ausgeführt werden.
Der Ausdruck "Homolog" bezieht sich auf ein Molekül aus einem gegebenen Organismus, das eine Sequenzähnlichkeit und/oder Identität zeigt und eine im wesentlichen ähnliche biologische Aktivität wie ein Molekül aus einem unterschiedlichen Organismus aufweist. Beispielsweise kann ein Mauspolypeptid, das in der Maus auf eine Weise funktioniert, die zu der äquivalent ist, auf die humanes LP-48 beim Menschen funktioniert, als Maushomolog von LP-48 bezeichnet werden. Der Ausdruck "Homolog" soll auch zwei oder mehr Gene oder Proteine aus unterschiedlichen Organismen oder innerhalb eines einzelnen Organismus umfassen, die eine Sequenzähnlichkeit und/oder -identität zeigen. Der Ausdruck "Homolog", wie er hierin verwendet wird, umfasst allelische Varianten, wie auch Spleißvarianten von einer LP-48 Polynukleotidsequenz.
Wie hierin verwendet hält ein "funktionelles Homolog" von LP-48 die Bindungsfähigkeit aufrecht, so dass es zur Bindung von zumindest einem der natürlichen Liganden fähig ist. Ferner liegt die Bindungsaffinität typischerweise zumindest bei 30 %, 40 % oder 50 % des nativen LP-48 der SEQ ID Nr. 2 und bevorzugter bei mindestens 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % oder mehr als 100 %, 110 %, 120 %, 150 %, 200 % oder 1000 %.
Der Ausdruck "Fusionsprotein" bezeichnet ein Hybridproteinmolekül, das nicht in der Natur gefunden wird, welches eine translationale Fusion oder eine enzymatische Fusion aufweist, worin zwei oder mehr unterschiedliche Proteinsegmente, die nicht natürlich in einer fortlaufenden Sequenz gefunden werden, kovalent miteinander verbunden sind, im allgemeinen auf einer einzelnen Peptidkette.
Wie dies auch verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck "abnormale Apoptose" auf eine übermäßige und/oder unpassende Apoptose. Typischerweise beobachtet man eine abnormale Apoptose bei Zellen und Geweben, die einer physikalischen; chemischen oder biologischen Schädigung unterzogen wurden. Solche Schädigungen sind unter anderem physikalische Verletzung, Virusinfektion, Bakterieninfektion, Ischämie, Bestrahlung, Chemotherapie und dergleichen.
Der Ausdruck "ähnlich" oder "Ähnlichkeit" beschreibt die Beziehung zwischen unterschiedlichen Nukleinsäureverbindungen oder Aminosäuresequenzen, worin die Sequenzen oder Moleküle durch eine partielle Sequenzidentität oder Sequenzähnlichkeit an einem oder mehreren Blöcken oder Regionen innerhalb der Moleküle oder Sequenzen verwandt sind.
In Bezugnahme auf die Aminosäuresequenzen beschreibt der Ausdruck "ähnlich" oder "Ähnlichkeit" Aminosäurereste, die entweder identisch zwischen den unterschiedlichen Aminosäuresequenzen sind oder konservative Aminosäuresubstitutionen zwischen den unterschiedlichen Sequenzen darstellen. Konservative Aminosäuresubstitutionen sind in Tabelle 1 angegeben und werden später diskutiert. Der Ausdruck "Identität" beschreibt Aminosäurereste, die zwischen den unterschiedlichen Aminosäuresequenzen identisch sind. Aminosäuresequenzähnlichkeit oder -identität ist in Bezug auf die hierin identifizierte LP-48 Aminosäuresequenz als Prozentsatz an Aminosäurereste in einer Kandidatensequenz definiert, die innerhalb der Aminosäurereste einer LP Polypeptidsequenz nach der Alignierung der Sequenzen und erforderlichenfalls der Einführung von Lücken ähnlich oder identisch ist, um den maximalen Prozentsatz an Ähnlichkeit oder Identität zu erreichen.
Ein Alignment zum Zweck der Bestimmung der prozentualen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise die Verwendung von öffentlich zugänglicher Computersoftware, wie ALIGN, ALIGN-2, Megalign (DNASTAR) oder BLAST (beispielsweise Blast, Blast-2, WU-Blast-2). Der Fachmann kann geeignete Parameter zur Mes sung des Alignments bestimmen, einschließlich jeden Algorithmus, der erforderlich ist, um ein maximales Alignment über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Beispielsweise werden bei der Erzeugung der prozentualen Identitätswerte, die mittels WU-BLAST-2 erzeugt werden [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)] die WU-BLAST-2 Suchparameter typischerweise auf die voreingestellten Werte eingestellt. Jene, die nicht auf voreingestellte Werte eingestellt werden, das heißt die einstellbaren Parameter, werden typischerweise auf die folgenden Werte eingestellt: Überlappungsspanne = 1, Überlappungsfraktion = 0,125, Wortgrenzwert (T) = 11 und Bewertungsmatrix = BLOSUM 62. Für die Zwecke hierin wird ein prozentualer Aminosäuresequenzidentitätswert bestimmt durch die Division (a) der Anzahl an passenden identischen Aminosäureresten zwischen der Aminosäuresequenz des LP Polypepids von Interesse und der vergleichenden Aminosäuresequenz von Interesse (das heißt die Sequenz, gegen die das LP Polypeptid von Interesse verglichen wird), wie dies durch WU-BLAST-2 bestimmt wird, (b) jeweils der Gesamtzahl an Aminosäureresten des LP Polypeptids von Interesse.
Der Ausdruck "Identität" ist in Bezug auf die Nukleinsäuresequenzen, wie sie hierin verwendet werden, als Prozentsatz an Nukleotiden in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Nukleotiden in einer Testsequenz nach dem Alignment der Sequenzen und erforderlichenfalls Einführung von Lücken identifiziert, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erreichen. Ein Alignment zum Zweck der Bestimmung der prozentualen Nukleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise die Verwendung von öffentlich zugänglicher Computersoftware, wie ALIGN, ALIGN-2, Megalign (DNASTAR) oder BLAST (beispielsweise Blast, Blast-2). Der Fachmann kann geeignete Parameter zur Messung des Alignments bestimmen, einschließlich jeder Algorithmen, die erforderlich sind, um ein maximales Alignment über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die Zwecke hierin werden jedoch die prozentualen Nukleinsäureidentitätswerte unter Verwendung des WU-BLAST-2 (BlastN Modul) Programms erzeugt [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)]. Die meisten der WU-BLAST-2 Suchparameter werden auf die voreingestellten Werte eingestellt. Jene, die nicht auf voreingestellte Werte eingestellt werden, das heißt die einstellbaren Parameter, werden typischerweise auf die folgenden Werte eingestellt: Überlappungsspanne = 1, Überlappungsfraktion = 0,125, Wortgrenzwert (T) = 11 und Bewertungsmatrix = BLOSUM 62. Für die Zwecke hierin wird ein prozentualer Nukleinsäuresequenzidentitätswert bestimmt durch die Division (a) der Anzahl an passenden identischen Nukleotiden zwischen der Nukleinsäuresequenz des für das LP Polypeptid kodierenden Nukleinsäuremoleküls von Interesse und der vergleichenden Nukleinsäuresequenz von Interesse (das heißt die Sequenz, gegen die das LP Polypeptid von Interesse verglichen wird), wie dies durch WU-BLAST-2 bestimmt wird, (b) jeweils der Gesamtzahl an Nukleotiden des für das LP Polypeptid kodierenden Nukleinsäuremoleküls von Interesse.
Zusätzlich zur Berechnung der prozentualen Sequenzidentität führt der BLAST Algorithmus auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe beispielsweise Karlin und Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787). Ein Maß an Ähnlichkeit, das vom BLAST Algorithmus bereitgestellt wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die eine Indikation der Wahrscheinlichkeit bereitstellt, mit der eine Übereinstimmung wuschen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen durch Zufall auftreten würde. Beispielsweise wird eine Nukleinsäure als ähnlich zu einer Referenzsequenz betrachtet, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Testnuk leinsäure zur Referenznukleinsäure weniger als etwa 0,1, bevorzugter weniger als etwa 0,01 und vor allem weniger als etwa 0,001 beträgt.
Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jede eukaryontische oder prokaryontische Zelle, die zu einer Vermehrung und/oder Expression eines klonierten Gens fähig ist, das auf einem Vektor enthalten ist, der in die Wirtszelle beispielsweise durch Transformation oder Transfektion oder dergleichen eingeführt wird.
Der Ausdruck "Hybridisierung" bezieht sich, wie er hierin verwendet wird, auf einen Prozess, worin eine einzelsträngige Nukleinsäureverbindung (oder Sonde) sich mit einem kompelmentären Strang über die Nukleotidbasenpaarung verbindet. Das Maß an Hybridisierung hängt beispielsweise vom Maß der Ähnlichkeit, der Stringenz der Hybridisierung und der Länge der Hybridisierungsstränge ab. "Selektive Hybridisierung" bezieht sich auf eine Hybridisierung unter Bindungen hoher Stringenz.
"Stringenz" der Hybridisierungsreaktion ist leicht durch den Fachmann bestimmbar und ist im allgemeinen eine empirische Berechnung, die von der Sondenlänge, der Waschtemperatur und der Salzkonzentration abhängt. Im allgemeinen erfordern längere Nukleinsäuresonden höhere Temperaturen für eine gute Anelierung, während kürzere Nukleinsäuresonden geringere Temperaturen erfordern. Die Hybridisierung hängt im allgemeinen von der Fähigkeit der denaturierten DNA zur Reanelierung ab, wenn die komplementären Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher das Maß der gewünschten Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierenden Sequenz ist, desto höher ist die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Ergebnis folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu tendieren, die Reaktion stringenter zu machen, während geringere Temperaturen weniger dazu tendieren. Für zusätzliche Details und die Erklärung der Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
"Stringente Bedingungen" oder "hochstringente Bedingungen", wie sie hierin definiert sind, können dadurch identifiziert werden, dass sie (1) eine geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen für das Waschen verwenden, beispielsweise 15 mM Natriumchlorid/1,5 mM Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50°C, (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel verwenden, wie Formamid, beispielsweise 50 % (V/V) Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid/75 mM Natriumcitrat bei 42°C oder (3) 50 % Formamid, 5fach SSC (750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5fach Denhardt's Lösung, ultrabeschallte Lachsspermien DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42°C mit Waschschritten bei 42°C in 0,2 fach SSC (30 mM Natriumchlorid/3 mM Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55°C, gefolgt von einem, hochstringenten Waschschritt, der aus 0,1 fach SSC mit EDTA bei 55°C besteht.
"Moderat stringente Bedingungen" können identifiziert werden, wie sie von Sambrook et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, (1989)] identifiziert werden und umfassen die Verwendung einer Waschlösung und von Hybridisierungsbedingungen (beispielsweise Temperatur, Ionenstärke und % SDS), die weniger stringent sind, als die oben beschriebenen. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen ist eine Inkubation über Nacht bei 37°C in einer Lösung, die umfasst: 20 % Formamid, 5fach SSC (750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat bei pH 7,6, 5fach Denhardt's Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte zerkleinerte Lachsspermien DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in 1fach SSC bei etwa 37 bis 50°C. Der Fach mann erkennt, wie die Temperatur, die Ionenstärke etc. angepasst werden, um Faktoren zu berücksichtigen, wie Sondenlänge und dergleichen.
"Isolierte Nukleinsäureverbindung" bezieht sich auf jede RNA oder DNA Sequenz, wie sie auch immer konstruiert oder synthetisiert wurde, die aus ihrer natürlichen Umgebung herausgelöst wurde.
Der Ausdruck "reifes Protein" oder "reifes Polypeptid", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Formen des Proteins, die durch die Expression in einer Säugerzelle gebildet werden. Es wird allgemein angenommen, dass nachdem ein Export einer wachsenden Proteinkette über das rauhe endoplasmatische Retikulum begonnen wurde, die durch Säugerzellen sekretierten Proteine eine Signalsequenz aufweisen, die vom vollständigen Polypeptid unter Bildung einer "reifen" Form des Proteins abgespalten wird. Oft ist die Abspaltung eines sekretierten Proteins nicht einheitlich und kann zu mehr als einer Art des reifen Proteins führen. Die Spaltstelle eines sekretierten Proteins wird durch die primäre Aminosäuresequenz des vollständigen Proteins bestimmt und kann im allgemeinen nicht mit vollständiger Genauigkeit vorhergesagt werden. Wie in SEQ ID Nr. 2 vorhergesagt, wird das native Signalpeptid von LP-48 etwa von der Aminosäureposition 1 (Methionin 1) bis etwa zum Alanin 18 kodiert. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass die C-terminale Grenze der Signalpeptide variieren kann, aber wahrscheinlich nicht mehr als um etwa 5 Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als etwa 4 Aminosäuren, bevorzugter nicht mehr als etwa 3 Aminosäuren, noch bevorzugter um nicht mehr als etwa 2 Aminosäuren und noch bevorzugter um nicht mehr als etwa 1 Aminosäure. Die Spaltstellen für ein sekretiertes Protein können auch experimentell durch eine aminoterminale Sequenzierung von ein oder mehr Arten der gefundenen reifen Proteine innerhalb einer gereinigten Präparation des Proteins bestimmt werden.
Eine "Nukleinsäuresonde" oder "Sonde", wie sie hierin verwendet wird, ist eine markierte Nukleinsäureverbindung, die mit einer anderen Nukleinsäureverbindung hybridisiert. "Nukleinsäuresonde" meint eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz, die mit einer komplementären oder teilweise komplementären Einzelstrangzielnukleinsäuresequenz unter Bildung eines doppelsträngigen Moleküls hybridisiert. Eine Nukleinsäuresonde kann ein Oligonukleotid oder ein Nukleotidpolymer sein. Eine Sonde enthält gewöhnlich einen detektierbaren Rest, der an die Enden der Sonde angebracht wird oder innerhalb der Sequenz der Sonde liegt.
Der Ausdruck "Plasmid" bezieht sich auf ein extrachromosomales genetisches Element. Die hierin beschriebenen Plasmide sind im Handel erhältlich, öffentlich zugänglich ohne Beschränkung oder können aus leicht verfügbaren Plasmiden gemäß veröffentlichten Verfahren konstruiert werden.
Ein "Primer" ist ein Nukleinsäurefragment, das als Initiationssubstrat für eine enzymatische oder synthetische Verlängerung beispielsweise einer Nukleinsäureverbindung fungiert.
Der Ausdruck "Promotor" bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die die Transkription beispielsweise von DNA zu RNA steuert. Ein induzierbarer Promotor ist einer, der durch Umweltsignale regulierbar ist, wie beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, Hitze oder Metallionen. Ein konstitutiver Promotor arbeitet im allgemeinen auf einem konstanten Niveau und ist nicht regulierbar.
"Rekombinanter DNA Klonierungsvektor" bezieht sind, wie er hierin verwendet wird, auf jedes autonom replizierende Mittel, einschließlich unter anderem Plasmide und Phagen, die ein DNA Molekül umfassen, in das ein oder mehrere zusätzliche DNA Segmente eingebaut werden können oder eingebaut wurden.
Der Ausdruck "rekombinanter DNA Expressionsvektor" oder "Expressionsvektor" bezieht sich, wie er hierin verwendet wird, auf jeden rekombinanten DNA Klonierungsvektor (wie ein Plasmid oder ein Phage), worin ein Promotor oder andere Regulationselemente vorhanden sind, und somit eine Transkription einer eingebauten DNA ermöglicht wird, die für ein Polypeptid kodieren kann.
"Im wesentlichen rein" meint im Zusammenhang mit einem LP-48 Polynukleotid oder Polypeptid, dass das "LP-48" von allen anderen zellulären und nicht-zellulären Molekülen abgetrennt ist, einschließlich anderer Proteine, Lipide, Kohlenhydrate oder anderer Materialien, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist, wenn es rekombinant produziert wird oder ohne allgemeine Reinigungsschritte synthetisiert wird. Ein hierin beschriebenes "im wesentlichen reines" LP-48 Polypeptid kann durch eine Vielzahl an dem Fachmann gut bekannten Techniken hergestellt werden, einschließlich beispielsweise den beschriebenen Verfahren der LP-48 Reinigung, auf die hierin Bezug genommen wird oder die hierin beschrieben sind. In bevorzugten Ausführungsformen wird das LP-48 Polypeptid gereinigt (1) zu mehr als 95 Gewichtsprozent des LP-48 Polypeptids zum Gewicht des Gesamtproteins, wie dies durch das Lowry Verfahren bestimmt wird und vor allem mehr als 99 Gewichtsprozent zum Gewicht des Gesamtproteins (2) in einem Ausmaß, das ausreicht, um mindestens 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz durch die Verwendung eines Zentrifugationsröhrchensequenziergeräts zu erhalten oder (3) zu scheinbarer Homogenität durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie Blau oder vorzugsweise Silberfärbung, so dass die Hauptbande zumindest zu 95 % und bevorzugter 99 % des gefärbten Proteins auf dem Gel besteht.
Der Ausdruck "ausreichende Ähnlichkeit" bezieht sich auf eine erste Aminosäure- oder Nukleotidsequenz, die eine ausreichende oder minimale Anzahl an identischen oder verwandten Aminosäuresubstitutionen (für verwandte Aminosäuren siehe Tabelle 1, für konservative Substitutionen und eine Diskussion der Gruppen siehe später) oder Nukleotiden zu einer zweiten Aminosäure- oder Nukleotidsequenz enthält, so dass die erste und zweite Aminosäure oder Nukleotidsequenzen eine gemeinsame Strukturdomäne und/oder gemeinsame Funktionalität aufweisen. Beispielsweise haben Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen mindestens etwa 85 % Identität, bevorzugter mindestens etwa 90 % Identität, bevorzugter mindestens etwa 95 % identität, vor allem mindestens etwa 99 % Identität und vor allem 100 Identität.
Der Ausdruck "Vektor" bezieht sich, wie er hierin verwendet wird, auf eine Nukleinsäureverbindung, die zur Einführung von exogener oder endogener DNA in Wirtszellen verwendet wird. Ein Vektor umfasst eine Nukleotidsequenz, die für ein oder mehrere Proteinmoleküle kodieren kann. Plasmide, Cosmide, Viren und Bakteriophagen sind im natürlichen Zustand oder solche, die einer rekombinanten Veränderung unterzogen wurden, Beispiele für herkömmlich verwendete Vektoren.
Der Ausdruck "herabregulieren" umfasst, wie er hierin verwendet wird, die Verringerung, Hemmung oder anderweitig verursachte Verringerung der Menge oder Aktivität eines Moleküls in einem Prozess. Beispielsweise kann das LP-48 Polypeptid verwendet werden, um die Menge oder Aktivität eines Cytokins in Zellen herabzuregulieren, so dass die Menge oder Aktivität des Cytokins im Vergleich zur Menge oder Aktivität verringert ist, die in Abwesenheit des LP-48 Polypeptids vorhanden sein würde. Alternativ dazu kann ein LP-48 Polypeptid zur Herabregulierung eines Prozesses verwendet werden, wie einer Entzündung.
Die Ausdrücke "behandeln", "Behandlung" und "Therapie" beziehen sich, wie sie hierin verwendet werden, auf eine heilende Therapie, prophylaktische Therapie und präventive Therapie. Ein Beispiel für eine "präventive Therapie" ist die Prävention oder Linderung einer anvisierten Erkrankung oder eines hiermit verwandten Zustands. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen die, welche die Krankheit oder den Zustand bereits haben wie auch die, bei denen der Krankheit oder der Zustand verhindert werden soll. Die Ausdrücke "behandeln", "Behandlung" und "Therapie", wie sie hierin verwendet werden, beschreiben auch den Umgang und die Sorge für einen Patienten zur Bekämpfung der Behandlung einer Erkrankung oder des verwandten Zustands und umfassen die Verabreichung von LP-48 zur Linderung der Symptome oder Komplikationen der Erkrankung oder des Zustands.
"Chronische" Verabreichung bezieht sich auf die Verabreichung des Mittels in einer kontinuierlichen Weise im Gegensatz zu einem akuten Modus, um den anfänglichen therapeutischen Effekt (Aktivität) für einen ausgedehnten Zeitraum aufrechtzuerhalten. "Intermittierende" Verabreichung ist die Behandlung, die nicht andauernd ohne Unterbrechung ausgeführt wird, sondern von Natur aus cyclisch ist.
Der Ausdruck "Patient", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jeden Säuger, einschließlich dem Menschen, Nutz- und Zuchttiere und Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie Rinder (beispielsweise Kühe), Pferde, Hunde, Schafe, Schweine, Kaninchen, Ziegen, Katzen und nicht-domestizierte Tiere, wie Mäuse und Ratten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Säuger ein Mensch oder eine Maus.
Die Verabreichung "in Kombination mit "einem oder mehreren weiteren therapeutischen Mitteln umfasst eine simultane (gleichzeitige) und aufeinanderfolgende Verabreichung in jeder Reihenfolge.
Eine "therapeutisch wirksame Menge" ist die minimale Menge an LP-48 Polypeptid oder LP-48 erkennendem Antikörper, die zur Ausübung des therapeutischen Nutzens oder gewünschten biologischen Effekts an einen Patienten erforderlich ist. Beispielsweise ist eine "therapeutisch wirksame Menge" eines LP-48 Polypeptids an einen Patienten, der an einer LP-48 assoziierten Erkrankung oder einem solchen Zustand leidet oder dazu neigt, daran zu leiden, eine solche Menge, die eine Verbesserung der pathologischen Symptome, der Krankheitsprogression, der hiermit assoziierten physiologischen Zustände oder eine Resistenz einer Störung zu erliegen, die prinzipiell durch Immundefizienz, Krebs, Entzündung und/oder Infektionskrankheit charakterisiert ist, lindert oder ansonsten verursacht, induziert, wenn das LP-48 Polypeptid und/oder der LP-48 Epitop erkennende Antikörper verabreicht wird. Die genaue Menge an LP-48 Polypeptid oder LP-48 Epitop erkennendem Antikörper, die an einen bestimmten Patienten verabreicht wird, hängt von vielen Faktoren ab, beispielsweise der spezifischen Bindungsaktivität des Moleküls, der verwendeten Abgabevorrichtung, den physikalischen Eigenschaften, der beabsichtigten Verwendung und den Patientenbetrachtungen, und kann leicht vom Fachmann basierend auf der hierin bereitgestellten Information, die auch in der Technik bekannt ist, bestimmt werden.
"Träger" umfassen, wie sie hierin verwendet werden, pharmazeutisch annehmbare Träger, Hilfsstoffe oder Stabilisatoren, die für die Zelle oder den exponierten Säuger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Oft ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer, wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren, Antioxidantien einschließlich Ascorbinsäure, niedermolekulare Polypeptide (weniger als 10 Reste), Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline, hydrophile Polymere, wie Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren, wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine, Chelatbildner, wie EDTA, Zuckeralkohole, wie Mannit oder Sorbit, salzbildende Gegenionen, wie Natrium und/oder nicht-ionische Tenside, wie Tween^®, Polyethylenglycol (PEG) und Pluronics^®.
"Pharmazeutisch annehmbares Salz" umfasst unter anderem Salze, die mit anorganischen Säuren gebildet werden, wie Chlorid, Sulfat, Phosphat, Diphosphat, Hydrobromid und Nitratsalze oder Salze, die mit einer organischen Säure gebildet werden, wie Malat, Maleat, Fumarat, Tartrat, Succinat, Ethylsuccinat, Citrat, Acetat, Lactat, Methansulfonat, Benzoat, Ascorbat, para-Toluolsulfonat, Pamoat, Salicylat und Stearat wie auch Estolat-, Gluceptat- und Lactobionatsalze. Ähnlich umfassen Salze, die pharmazeutisch annehmbare Kationen enthalten, unter anderem Natrium, Kalium, Calcium, Aluminium, Lithium und Ammonium (einschließlich substituiertes Ammonium).
Der Ausdruck "Symptom" soll in Bezug auf Sepsis, Gram-negative Bakteriämie, allergische Reaktionen, allergische Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes, Th1 abhängige Insulitis, Immundefizienzen, Krebsarten, Entzündung, Infektionskrankheiten unter anderem eine oder mehrere der folgenden alleine oder in Kombination umfassen: Erkältung, übermäßiges Schwitzen, Fieber, Schwäche, Hypotension, Leukopenie, intravaskuläre Koagulation, Schock, Respirationsstress, Organversagen, Prostration, Gänsehaut, Durchfall, Augenexudat und Tod.
Diese Liste soll nicht ausschließlich sein, kann aber mit Symptomen oder Kombinationen von Symptomen supplementiert werden, die eine Person mit normalem Fachwissen in Assoziation mit Sepsis, Gramnegativer Bakteriämie, allergischen Reaktionen, allergischen Autoimmunerkankungen, Typ 1 Diabetes, Th1-abhängiger Insulitis, Immundefizienzen, Krebsarten, Entzündung und Infektionskrankheiten erkennt. Ein Symptom, das mit Sepsis, Gram-negativer Bakteriämie, allergischen Reaktionen, allergischen Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes, Th-1 abhängiger Insulitis, Immundefizienzen, Krebsarten, Entzündung und Infektionserkrankungen assoziiert ist, kann auch mit einem anderen Zustand assoziiert sein.
Proteinproduktion
Der Fachmann erkennt, dass die in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendeten LP-48 Polypeptide auf eine Vielzahl an unterschiedlichen Verfahren synthetisiert werden können, wie in der Technik gut bekannten chemischen Verfahren, einschließlich Festphasenpeptidsynthese oder rekombinante Verfahren. Beide Verfahren sind in US 4 617 149 A beschrieben.
Die Prinzipien einer chemischen Festphasensynthese der Polypeptide sind in der Technik gut bekannt und können in allgemeinen Lehrbüchern im Fachgebiet gefunden werden. Siehe beispielsweise H. Dugas und C. Penney, Bioorganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, New York, 54-92. Beispielsweise können Peptide durch eine Festphasenmethodik unter Verwendung eines Applied Biosystems 430A Peptidsynthesegeräts (Applied Biosystems, Foster City, CA) und den von Applied Biosystems bereitgestellten Synthesezyklen synthetisiert werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Proteine können auch durch rekombinante DNA Verfahren mittels der hierin beschriebenen LP-48 Polynukleotidsequenzen hergestellt werden. Rekombinante Verfahren sind bevorzugt, falls eine hohe Ausbeute gewünscht wird. Die Expression des LP-48 kann in einer Vielzahl an geeigneten Wirtszellen ausgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Für diesen Zweck werden die LP-48 Konstrukte in eine Wirtszelle durch geeignete Mittel eingeführt, die dem Fachmann bekannt sind. Die chromosomale Integration von LP-48 Expressionsvektoren kann ver wendet werden, wie auch geeignete extrachromosomal aufrechterhaltene Expressionsvektoren, so dass die kodierende Region von LP-48 operativ an einen konstitutiven oder induzierbaren Promotor gebunden ist.
Die grundlegenden Schritte in der rekombinanten Produktion des LP-48 Proteins sind:

a) Konstruktion einer rekombinanten, synthetischen oder semisynthetischen DNA, die für ein LP-48 Protein kodiert,
b) Integration der DNA in einen Expressionsvektor auf eine Weise, die zur Expression des LP-48 Proteins geeignet ist,
c) Transformation oder sonstige Einführung des Vektors in eine geeignete eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle unter Bildung einer rekombinanten Wirtszelle,
d) Kultivierung der rekombinanten Wirtszelle auf eine Weise, dass das LP-48 Protein exprimiert wird, und
e) Gewinnung und substanzielle Reinigung des LP-48 Proteins durch jedes geeignete Mittel, das dem Fachmann bekannt ist.

Die Herstellung von LP-48 Produkten umfasst auch Wege, worin direkte chemische Syntheseverfahren verwendet werden, wie auch Produkte, die durch rekombinante Techniken aus einem eukaryontischen Wirt gebildet werden, einschließlich beispielsweise Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen. In Abhängigkeit des verwendeten Wirts in einem rekombinanten Herstellverfahren können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glykosyliert oder nicht glykosyliert sein. Zusätzlich kann die Aminosäuresequenz eines LP-48 optional eine konservative Substitution umfassen. Bevorzugte LP-48 Moleküle sind glykosyliert, wie dies in eukariontischen Wirten vorkommen würde. Zusätzlich können die LP-48 Polypeptide auch einen modifizierten Methioninrest am Anfang aufweisen, in einigen Fällen ein Ergebnis von wirtsspezifischen Prozessen. Solche Verfahren sind in vielen Standardlaborhandbüchern beschrieben, wie Sambrook, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 17.37-17.42, Ausubel, siehe obige Literaturstelle, Kapitel 10, 12, 13, 16, 18 und 20.
Der Fachmann erkennt, dass aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes (das heißt 64 Codons, die für 20 Aminosäuren kodieren) mehrere "stille" Substitutionen von Nukleotidbasenpaare in eine LP-48 Polynukleotidsequenz ohne Veränderung der Identität der kodierten Aminosäuren oder des Proteinprodukts eingeführt werden können.
Fragmente der hierin beschriebenen Proteine können durch jede einer Vielzahl von geeigneten Techniken erzeugt werden, einschließlich chemischer Synthese. Beispielsweise können konstante Regionen der Immunglobuline durch einen Papainverdau der Antikörper erhalten werden. Eine solcher proteolytischer Verdau von beispielsweise SEQ ID Nr. 2 kann die konstante Ig Region bilden, die dann kovalent an die extrazelluläre Domäne von LP-48 gebunden wird. Alternativ dazu können rekombinante DNA Mutagenesetechniken LP-48 Moleküle bereitstellen (siehe allgemein beispielsweise K. Struhl, "Reverse biochemistry: methods and applications for synthesizing yeast proteins in vitro", Meth. Enzymol. 194: 520-535). Beispielsweise wird ein ineinander geschachtelter Satz an Deletionsmutanten in ein für LP-48 kodierendes Polynukleotid so eingeführt, dass die verschiedenen Mengen der für Protein kodierenden Region entweder vom aminoterminalen Ende oder vom Carboxylende des Proteinmoleküls deletiert werden. Ferner können zusätzliche Veränderungen oder Anfügungen an das Molekül ausgeführt werden. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um interne Fragmente des intakten Proteins zu erzeugen, worin sowohl die carboxyterminalen und/oder aminoterminalen Enden entfernt werden. Es können mehrere geeignete Nukleasen verwendet werden, um solche Deletionen zu erzeugen, beispielsweise BaI31 oder im Fall einer einzelsträngigen Nukleinsäureverbindung Mungobohnen Nuklease. Der Einfachheit halber ist es bevorzugt, dass das intakte LP-48 Gen in einen einzelsträngigen Klonierungsvektor kloniert wird, wie einen Bakteriophagen M13 oder ein Äquivalent hiervon. Falls gewünscht, können die entstehenden Gendeletionsfragmente in jeden geeigneten Vektor zur Vermehrung und Expression der Fragmente in jeder geeigneten Wirtszelle subkloniert werden.
LP-48 kann zusätzlich an ein Markerprotein oder einen Epitop-Tag fusioniert werden. Solche Fusionen umfassen unter anderem Fusionen an ein Enzym, Fluoreszenzprotein oder Lumineszenzprotein, die eine Markerfunktion bereitstellen oder Fusionen an jede andere Aminosäuresequenz, die zur Reinigung des Polypeptids oder einer Proproteinsequenz verwendet werden kann.
Verfahren zur Konstruktion von Fusionsproteinen (Chimären), die sich aus der Bindedomäne eines Proteins und der konstanten Region eines Immunglobulins zusammensetzen (hierin als "LP-48-Ig" bezeichnet) sind allgemein in der Technik bekannt. Beispielsweise sind Chimären, die den Fc Teil von humanem IgG und die Binderegion von anderen Proteinrezeptoren enthalten, in der Technik für chimäre Antikörper bekannt. Die LP-48-Ig Strukturen der vorliegenden Erfindung können mittels Verfahren konstruiert werden, die zur Konstruktion von chimären Antikörpern ähnlich sind. Bei der chimären Antikörperkonstruktion wird die variable Domäne des Antikörpers einer Spezies durch die variable Domäne einer anderen Spezies ersetzt. (siehe EP 0 125 023 A , EP 0 173 494 A , Munro et al., Nature 312: 597 (1984), Neuberger et al. Nature, 312: 604-608 (1984), Sharon et al., Nature 309: 364-367, Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., 2: 239-256 (1984), Morrison et al., 1985, Boulianne et al., Nature, 312: 643-646 (1984), Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989), Traunecker et al., Nature, 339: 68-70 (1989)). Hier wird eine funktionelle Domäne des LP-48 Polypeptids durch die variable Domäne der Empfängerantikörperstruktur ersetzt.
Im allgemeinen umfassen Verfahren zur Konstruktion der LP-48 Fusionsproteine die Verwendung der rekombinanten DNA Technologie. Die DNA, welche für eine funktionelle Domäne kodiert, kann optional mit zusätzlichen Domänen oder Segmenten des LP-48 Polypeptids oder mit einer konstanten Ig Region fusioniert werden. Ein Polynukleotid, das für eine Domäne eines LP-48 Polypeptids kodiert, kann durch PCR oder durch Restriktionsenzymspaltung erhalten werden. Dieses DNA Fragment wird leicht proximal zur DNA eingesetzt, die für eine leichte oder schwere Kette der konstanten Immunglobulinregion kodiert und erforderlichenfalls wird das entstehende Konstrukt durch Mutagenese zugeschnitten, um die Codonsequenz zu inserieren, entfernen oder verändern. Vorzugsweise ist die ausgewählte Immunglobulinregion eine humane Immunglobulinregion, wenn das chimäre Molekül für eine in vivo Therapie beim Menschen vorgesehen ist. Am bevorzugtesten ist die ausgewählte Immunglobulinregion eine IgG Region. Die für die leichte oder schwere Kette der konstanten Immunglobulinregion kodierende DNA ist bekannt oder leicht aus cDNA Banken erhältlich oder kann synthetisiert werden (siehe beispielsweise Adams et al., Biochemistry, 19: 2711-2719 (1980), Gough et al., Biochemistry, 19: 2702-2710 (1980), Dolby et al., 1980, Rice et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 79: 7862-7865 (1982), Falkner et al., Nature 298: 286-288 (1982) und Morrison et al., Ann. Rev. Immunol., 2: 239-256 (1984)). Andere Beschreibungen zur Herstellung von chimären Molekülen sind aus der Herstellung von Immunadhäsionschimären bekannt, wie CD4-Ig (Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989), Byrn et al., Nature 344: 667 (1990)) und TNFR Chimären, wie TNFR-IgG (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10535-10539 (1991), Peppel et al., J. Cell. Biochem. Supp. 15F-P439: 118 (1991)).
Proteinreinigung
Im allgemeinen werden LP-48 Polypeptide rekombinant hergestellt. Wenn sie einmal exprimiert sind, können sie aus den Zellen durch Anwendung von Standardproteinisolierungstechniken auf die Lysate isoliert oder aus dem Medium gereinigt werden. Die Verfolgung des Reinigungsprozesses kann unter Verwendung von Standardwesternblottechniken oder Radioimmuntests oder anderen Standardimmuntesttechniken erreicht werden.
LP-48 Polypeptide können aus rekombinanten Zellkulturen durch gut bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie, Größenausschlusschromatographie und Lectinchromatographie. Vorzugsweise werden Hochleistungsflüssigchromatographie ("HPLC"), Kationenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie oder Kombinationen hiervon zur Reinigung verwendet. Bestimmte Verfahren zur Verwendung der Protein A oder G Chromatographie zur Reinigung sind in der Technik bekannt und sind vor allem anwendbar, wenn das LP-48 die Immunglobulin Fc Region enthält. Protein A und G binden die Fc Regionen der IgG Antikörper und sind daher ein bequemes Werkzeug zur Reinigung der LP-48 Polypeptide, die die IgG Region enthalten. Die LP-48 Polypeptidreinigung soll gereinigte Teile der Chimäre (die extrazelluläre Region und die konstante Immunglobulinregion) umfassen, die getrennt gereinigt und dann durch Disulfidbindung, Quervernetzung und dergleichen kombiniert werden.
Die Reinigung der LP-48 Polypeptide kann durch eine Vielzahl an speziellen Techniken erreicht werden, die in der Technik bekannt sind (Kwon et al., J. Biol. Chem. 272: 14272-14276 (1997), Kwon et al., Cell, 272: 14272-14276 (1997), J.G. Emery et al., J. Biol. Chem. 273: 14363-14367 (1998), Harrop et al., J. Biol. Chem. 273 (42): 27548-27556 (1998), Harrop et al., J. Immunol., 161: 1786-1794 (1998)), die die strukturellen und funktionellen Merkmale dieser Moleküle ausnutzen. Ferner können mehrere vorteilhafte Proteinsequenzen in das gebildete LP-48 Polypeptid eingearbeitet werden, wie Faktor Xa Spaltstellen oder eine HIS Tag Sequenz oder der Einbau von spezifischen Epitopen, wie dies in der Technik bekannt ist.
Expression von rekombinanten LP-48 Proteinen in Wirtszellen
Prokaryonten können zur Herstellung von rekombinanten LP-48 Proteinen verwendet werden. Beispielsweise ist der Escherichia coli K12 Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) besonders zur prokaryontischen Expression von fremden Proteinen brauchbar. Andere Stämme von E. coli, Bacillen, wie Bacillus subtilis, Enterobakteriaceae, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens, verschiedene Pseudomonadenspezies und andere Bakterien, wie Streptomyces, können auch als Wirtszellen bei der Klonierung und Expression der rekombinanten Proteine der Erfindung verwendet werden.
Promotorseqenzen, die zur Steuerung der Expression von Genen in Prokaryonten geeignet sind, umfassen β-Lactamase (beispielsweise Vektor pGX2907, ATCC 39344, der ein Replikon und ein β-Lactamasegen enthält), Lactosesysteme (Chang et al., Nature (London), 275: 615 (1978), Goeddel et al., Nature (London), 281: 544 (1979)), alkalische Phosphatase und das Triptophanpromotorsystem (trp) (Vektor pATH1 (ATCC 37695)), das zur Erleichterung der Expression eines offenen Leserahmens als trpE Fusionsprotein unter der Kontrolle des trp Promotors entwickelt wurde. Hybridpromotoren, wie der tac Promotor (isolierbar aus Plasmid pDR540, ATCC 37282) sind ebenfalls geeignet. Weitere andere bakterielle Promotoren, deren Nukleotidsequenzen im allgemeinen bekannt sind, können an DNA mittels Linker oder Adaptoren, die die erforderlichen Restriktionsschnittstellen bereitstellen, ligiert werden, die das erfindungsgemäße Protein kodieren. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno Sequenz, die operativ an die für die gewünschten Polypeptide kodierende DNA gebunden sind. Diese Beispiele sind nur erläuternd und nicht beschränkend.
Die LP-48 Proteine, die zur Ausführung der Erfindung erforderlich sind, können entweder synthetisiert werden durch direkte Expression oder als Fusionsprotein des Proteins von Interesse als Translationsfusion mit einem weiteren Protein oder Peptid, das durch enzymatische oder chemische Spaltung entfernt werden kann. Es wird oft bei der Herstellung von bestimmten Peptiden in rekombinanten Systemen beobachtet, dass die Expression mit anderen gewünschten Sequenzen die Lebensdauer verlängert, die Ausbeute des gewünschten Peptids erhöht oder ein bequemes Mittel zur Isolierung des Proteins bereitstellt. Dies ist vor allem relevant, wenn Säugerproteine in prokaryontischen Wirten exprimiert werden. Es ist eine Vielzahl an Peptidasen (beispielsweise Enterokinase und Thrombin), die ein Polypeptid an spezifischen Stellen spalten oder die Peptide vom Amino- oder Carboxyterminus der Peptidkette abspalten (beispielsweise Diaminopeptidasen) bekannt. Ferner spalten bestimmte Chemikalien (beispielsweise Cyanogenbromid) ein Polypeptid an spezifischen Stellen. Der Fachmann erkennt die erforderlichen Modifikationen der Aminosäuresequenz (und einer synthetischen oder semisynthetischen kodierenden Sequenz, falls rekombinante Mittel verwendet werden), um ortsspezifische interne Spaltstellen einzubauen. Siehe beispielsweise P. Carter, "Site Specific Proteolysis of Fusion Proteins", Kapitel 13, in Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes, American Chemical Society, Washington, D.C. (1990).
Zusätzlich zu Prokaryonten kann eine Vielzahl an Amphibienexpressionssystemen verwendet werden, wie Froschoocyten und Säugerzellsysteme. Die Wahl der bestimmten Wirtszelle hängt zu einem gewissen Teil vom im einzelnen verwendeten Expressionsvektor ab. Beispielhafte Säugerwirtszellen umfassen 293 (beispielsweise ATCC CCL 1573), HepG-2 (ATCC HB 8065), CV-1 (ATCC CCL 70), LC-MK2 (ATCC CCL 7.1 ), 3T3 (ATCC CCL 92), CHO-K1 (ATCC CCL 61) HeLa (ATCC CCL 2), RPMI 8226 (ATCC CCL 155), H4IIEC3 (ATCC CCL 1600), C127I (ATCC CCL 1616), NS-Sultan (ATCC CCL 1484) und BHK-21 (ATCC CCL 10).
Es ist eine große Vielzahl an Vektoren zur Transformation von Säugerwirtszellen geeignet. Beispielsweise umfassen die Vektoren vom pSV2-Typ Segmente des Simianvirus 40 (SV 40) Genoms, das zur Transkription und Polyadenylierung erforderlich ist. Es wurde eine große Anzahl an Plasmidvektoren vom pSV-2 Typ konstruiert, wie pSV2-gpt, pSV2-neo, pSV2-dhfr und pSV2-β-Globin, in denen der SV40-Promotor die Transkription eines eingesetzten Gens steuert. Diese Vektoren sind breit verfügbar von Quellen, wie der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 oder dem, National center for Agricultural Utilization Research, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604-39999.
Promotoren, die zur Expression in Säugerzellen geeignet sind, umfassen den späten SV40 Promotor, Promotoren von eukaryontischen Genen, wie beispielsweise dem Östrogen-induzierbaren Hühnerovalbumingen, dem Interferongenen, dem Glucocorticoid-induzierbaren Tyrosinaminotransferasegen, dem Thymidinkinasegenpromotor und Promotoren der hauptsächlichen frühen und späten Adenovirusgene.
Das Plasmid pRSVcat (ATCC 37152) enthält Teile der langen terminalen Sequenzwiederholungen des Rous Sarcoma Virus (RSV), einem Virus, von dem bekannt ist, dass es Hühnerzellen und andere Wirtszellen infizieren kann. Die langen terminalen Sequenzwiederholungen enthalten einen Promotor, der für diese Verwendung geeignet ist. (Gorman et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6777 (1982)). Das Plasmid pMSVi (NRRL B-15929) enthält die langen terminalen Sequenzwiederholungen des Maus Sarcoma Virus (MSV), einem Virus, von dem bekannt ist, dass es Mäusezellen und andere Wirtszellen infizieren kann. Der Metallothioninpromotor der Maus ist auch zur Verwendung in eukaryontischen Wirtszellen gut beschrieben worden. Dieser Promotor kommt auf dem Plasmid pdBPV-MMTneo (ATCC 37224) vor, das als Ausgangsmaterial zur Konstruktion anderer Expressionsplasmide dienen kann, die ebenfalls zur Herstellung der LP-48 Polypeptide brauchbar wären.
Die Transfektion von Säugerzellen mit Vektoren kann durch eine Pluralität von gut bekannten Verfahren ausgeführt werden, einschließlich unter anderem Protoplastenfusion, Calciumphosphatcofällung, Elektroporation und dergleichen. Siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
Einige Viren machen auch geeignete Vektoren. Beispiele umfassen die Adenoviren, die Adenoassoziierten Viren, das Vacciniavirus, die Herpesviren, die Baculoviren und das Rous Sarcoma Virus, wie dies in US 4 775 624 A beschrieben ist.
Eukaryontische Mikrorganismen, wie Hefe und andere Pilze sind auch geeignete Wirtszellen. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist der bevorzugte eukaryontische Mikroorganismus. Andere Hefen, wie Kluyveromyces lactis und Pichia pastoris sind ebenfalls geeignet. Für die Expression in Saccharomyces kann beispielsweise das Plasmid YRp7 (ATCC 40053) verwendet werden. Siehe beispielsweise L. Stinchcomb et al., Nature, 282, 39 (1979), J. Kingsman et al., Gene, 7, 141 (1979), S. Tschemper et al., Gene, 10, 157 (1980). Das Plasmid YRp7 enthält das TRP1 Gen, das einen Selektionsmarker zur Verwendung in einer auxotrophen trp1 Mutante bereitstellt.
Herstellung von Antikörpern
LP-48 Epitop erkennende Antikörper können zur Behandlung von verschiedenen Zuständen verwendet werden, die die allergischen Reaktionen, allergischen Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes, Th1-abhängige Insulitis, Immundefizienzen, Krebsarten, Entzündung und Infektionskrankheiten betreffen. Die Bildung von Antikörpern, einschließlich sowohl monoklonaler als auch polyklonaler, bei Tieren, speziell Mäusen, ist in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise C. Milstein, Handbook of Experimental Immunology, (Blackwell Scientific Pub., 1986), J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (Academic Press, 1983). Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern beginnt der grundlegende Prozess mit der Injektion einer Maus oder einem anderen Tier mit dem Immunogen. Die Maus wird anschließend getötet und die Zellen, die aus der Milz entnommen werden, werden mit Myelomzellen fusioniert, was zu einem Hybridom führt, das sich in vitro reproduziert. Die Population der Hybridome wird gesc reent, um einzelne Klone zu isolieren, die jeweils eine einzelne Antikörperspezies sekretieren, die für das Immunogen spezifisch ist. Jeder auf diesem Weg erhaltene Antikörper ist das klonale Produkt einer einzelnen B Zelle.
Chimäre Antikörper sind in US 4 816 567 A beschrieben. Diese Literatur beschreibt Verfahren und Vektoren zur Herstellung von chimären Antikörpern. Ein alternativer Ansatz wird in US 4 816 397 A bereitgestellt. Das Patent beschreibt die Co-Expression der schweren und leichten Ketten eines Antikörpers in derselben Wirtszelle.
Der Ansatz der US 4 816 397 A wurde in EP 0 239 400 A verfeinert. Die Beschreibungen der europäischen Patentanmeldung sind ein bevorzugtes Format für die gentechnische Veränderung von monoklonalen Antikörpern. In dieser Technologie werden die Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) des humanen Antikörpers mit den CDRs eines monoklonalen Mausantikörpers ersetzt und so die Spezifität des humanen Antikörpers auf die Spezifität eines Mausantikörpers umgewandelt.
Einkettenantikörper und Banken hiervon sind eine weitere Varietät der genetisch veränderten Antikörpertechnologie, die in der Technik gut bekannt ist. (Siehe beispielsweise R.E. Bird et al., Science 242: 423-426 (1988), WO 88 01 649 A, WO 90 14 430 A und WO 91 10 737 A). Die Einkettenantikörpertechnologie umfasst die kovalente Verbindung der Binderegionen der schweren und leichten Ketten unter Bildung einer einzelnen Polypeptidkette. Die Bindungsspezifität des intakten Antikörpermoleküls wird so auf einer einzelnen Polypeptidkette reproduziert.
Die Proteine oder geeigneten Fragmente hiervon, die zur Erzeugung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern erforderlich sind und verschiedene Interspezieshybride oder humanisierte Antikörper oder Antikörperfragmente oder Einkettenantikörper sind hierin beschrieben. Die Techniken zur Herstellung von Antikörpern sind dem Fachmann gut bekannt (siehe beispielsweise A.M. Campbell, Monoklonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1984), Köhler und Milstein, Nature 256, 495-497 (1975), Monoclonal Antibodies: Principles & Applications, Herausgeber J.R. Birch und E.S. Lennox, Wiley-Liss (1995)).
Das am meisten bevorzugte Verfahren zur Erzeugung von mAbs gegenüber den Polypeptiden und Glycopeptiden der vorliegenden Erfindung umfasst die Bildung solcher mAbs in einem transgenen Säuger, der so verändert ist, dass er zur Bildung von vollkommen humanisierten mAbs nach einer antigenen Provokation fähig ist. Humanisierte mAbs und Verfahren zu ihrer Herstellung sind allgemein in der Technik bekannt (siehe beispielsweise US 4 704 362 A , US 4 816 567 A , US 5 434 340 A , US 5 545 806 A , US 5 530 101 A , US 5 569 825 A , US 5 585 089 A , US 5 625 126 A , US 5 633 425 A , US 5 643 763 A , US 5 693 761 A , US 5 693 762 A , US 5 714 350 A , US 5 874 299 A , US 5 877 397 A , US 5 939 598 A , US 6 023 010 A , US 6 054 297 A , WO 96 34 096 A, WO 96 33 735 A und WO 98 24 893 A).
Ein als Immunogen verwendetes Protein kann modifiziert oder in einem Adjuvans durch subkutane oder intraperitoneale Injektion verabreicht werden, beispielsweise einer Maus oder einem Kaninchen. Zur Bildung von monoklonalen Antikörpern werden Milzzellen aus den immunisierten Tieren entfernt, mit Myelomzellen fusioniert, wie SP2/0-Ag14 Zellen und können auf eine Weise zu monoklonalen Antikörperbildenden Hybridomzellen werden, die dem Fachmann bekannt ist. Hybridome, die ein gewünschtes Antikörpermolekül sekretieren, können durch eine Vielzahl an gut bekannten Verfahren gescreent werden, beispielsweise durch ELISA Test, Western Blotanalyse oder Radioimmuntest (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175, 109-124 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles & Applications, Herausgeber J.R. Birch & E.S. Lennox, Wiley-Liss (1995)).
Nukleinsäuren
Die Synthese der LP-48 Polynukleotide (wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt sind) und verwandter Nukleinsäuren, die wie hierin definierte LP-48 Polypeptide oder Fragmente hiervon kodieren, sind in der Technik gut bekannt. Siehe beispielsweise E.L. Brown, R. Belagaje, M.J. Ryan und H.G. Khorana, Methods in Enzymology, 68: 109-151 (1979). Fragmente der DNA Sequenz, die den LP-48 Sequenzen entsprechen, können mittels eines herkömmlichen DNA Synthesegeräts erzeugt werden, wie dem Applied Biosystems Model 380 A oder 380 B DNA Synthesegeräten (Applied Biosystems, Inc. 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 944404) unter Verwendung der Phosphoramiditchemie, wonach die Fragmente ligiert werden, um die vollständige LP-48 Sequenz zu rekonstituieren. Alternativ dazu kann die Phosphotriesterchemie verwendet werden, um LP-48 Nukleinsäuren zu synthetisieren (siehe beispielsweise M.J. Gait, Herausgeber, Oligonukleotide Synthesis, A Practical Approach (1984)).
In einer alternativen Methodik, nämlich der PCR, können die hierin veröffentlichten und beschriebenen DNA Sequenzen, die beispielsweise einen Teil oder die gesamte SEQ ID Nr. 1 umfassen, aus einer Vielzahl an Ausgangsmaterialien hergestellt werden. Beispielsweise werden ausgehend von einer cDNA Präparation (beispielsweise cDNA Bank), die aus einem Gewebe stammt, das das LP-48 Gen exprimiert, geeignete Oligonukleotidprimer, die komplementär zu den Regionen der SEQ ID Nr. 1 oder jede Subregion hiervon komplementär sind, hergestellt, wie dies in US 4 889 818 A beschrieben ist. Andere geeignete Protokolle für die PCR sind in PCR protocols: A Guide to Method and Applications, Herausgeber Michael A. Innis et al., Academic Press Inc. (1990) beschrieben. Unter Verwendung von PCR kann jede Region des LP-48 Gens für eine Amplifizierung ausgewählt werden, so dass Gensequenzen mit der vollen oder einer partiellen Länge hergestellt werden können, die eine funktionelle extrazelluläre Domäne enthalten.
Es kann vorteilhaft sein, Oligonukleotidprimer zu verwenden. Die Sequenz von solchen Primern wird unter Verwendung eines LP-48 Polynukleotids zur Verwendung bei der Detektion, Amplifizierung oder Mutation eines definierten Segments eines Gens oder Polynukleotids mittels PCR entworfen, das für ein LP-48 Polypeptid kodiert.
Die Ionenstärke und Inkubationstemperatur, unter der eine Sonde verwendet wird, sollte ebenfalls in Betracht gezogen werden. Es ist bekannt, das die Hybridisierung zunimmt, wenn die Ionenstärke des Reaktionsgemisches zunimmt und dass die thermische Stabilität der molekularen Hybride mit zunehmender Ionenstärke zunimmt. Auf der anderen Seite erhöhen chemische Reagenzien, wie Formamid, Harnstoff, DMSO und Alkohole, die Wasserstoffbrücken zerstören, die Stringenz der Hybridisierung. Die Destabilisierung von Wasserstoffbindungen durch solche Reagenzien kann stark die Tm (Schmelztemperatur) verringern. Im allgemeinen tritt eine optimale Hybridisierung für synthetische Oligonukleotidsonden mit einer Länge von etwa 10 bis 50 Basen etwa 5°C unter der Schmelztemperatur für einen gegebenen Duplex auf. Die Inkubation bei Temperaturen unter dem Optimum kann es zulassen, dass unpassende Basensequenzen hybridisieren und kann daher zu einer verringerten Spezifität führen.
Die Länge der Zielnukleinsäuresequenz und demnach die Länge der Sondensequenz kann ebenfalls wichtig sein. In einigen Fällen können mehrere Sequenzen aus einer bestimmten Region, die sich in der Lage und Länge unterscheiden, zu Sonden mit den gewünschten Hybridisierungscharakteristiken führen. In anderen Fällen kann eine Sequenz signifikant besser sein als die andere, obwohl die eine Sequenz sich nur durch eine Base unterscheidet. Schließlich können intramolekulare und intermolekulare Hybride innerhalb einer Sonde gebildet werden, falls ausreichend Selbstkomplementarität vorhanden ist. Solche Strukturen können durch sorgfältiges Sondendesign vermieden werden. Es sind auch Computerprogramme zur Suche für diesen Interaktionstyp erhältlich.
Die vorliegende Beschreibung liefert beispielhafte Verfahren zur Konstruktion einer rekombinanten Wirtszelle, die zur Expression von Proteinen fähig ist, die LP-48 Polypeptide umfassen, wobei das Verfahren die Transformation oder anderweitige Einführung eines rekombinanten DNA Vektors in eine Wirtszelle umfasst, der eine isolierte DNA Sequenz umfasst, die für Polypeptide kodiert, welche Sequenzen umfassen, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind. Die bevorzugte Wirtszelle ist jede eukaryontische Zelle, die eine hohe Expressionsmenge eines exogen eingeführten Gens oder Proteins erreichen kann und das Protein in dessen Membranstruktur einbaut. Der Fachmann versteht, dass die Auswahl des geeignetsten Klonierungsvektors und Expressionsvektors von mehreren Faktoren abhängt, einschließlich der Verfügbarkeit von Restriktionsenzymstellen, der Art der Wirtszelle, in die der Vektor transfiziert oder transformiert wird, der Zweck der Transfektion oder Transformation (beispielsweise stabile Transformation als extrachromosomales Element oder Integration in das Wirtschromosom), dem Vorkommen oder der Abwesenheit von leicht zu testenden oder selektierbaren Markern (beispielsweise Antibiotikaresistenz und metabolische Marker des einen oder anderen Typs) und der Anzahl an Kopien des gewünschten Gens in der Wirtszelle.
Bei der Herstellung eines Expressionsvektors versteht der Fachmann, dass hier viele Variablen in Betracht gezogen werden müssen, beispielsweise ob ein konstitutiver oder induzierbarer Promotor verwendet wird. Der Ausführende versteht auch, dass die Menge an zu produzierender Nukleinsäure oder Protein teilweise die Selektion des Expressionssystems diktiert. In Bezug auf Promotorsequenzen sind induzierbare Promotoren bevorzugt, da sie eine hohe, regulierbare Expression eines funktionsfähig gebundenen Gens ermöglichen. Der Fachmann kennt mehrere geeignete Promotoren, die auf Induktoren ansprechen, beispielsweise Kohlenstoffqueile, Metallionen und Hitze. Andere relevente Betrachtungen bezüglich eines Expressionsvektors beinhalten, ob Sequenzen zur Steuerung der Lokalisation eines rekombinanten Proteins einbezogen werden. Beispielsweise ist eine Sequenz, die ein Signalpeptid umfasst, dem eine kodierende Region eines Gens vorausgeht, zur Steuerung des extrazellulären Exports eines entstehenden Polypeptids brauchbar. Transformierte Wirtszellen können unter Bedingungen angezogen werden, die dem Fachmann bekannt sind, so dass eine ein Polypeptid umfassende Sequenz exprimiert wird, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt wird, wobei ein rekombiantes LP-48 Protein in der rekombinanten Wirtszelle gebildet wird.
Transgene und chimäre nicht menschliche Säugetiere
Nukleinsäuren, die ein LP-48 Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder jede andere ihrer modifizierten Formen kodieren können ebenfalls verwendet werden um entweder transgene Tiere oder "Knock-ot" Tiere zu erzeugen, die wiederum zur Entwicklung und dem Screenen der therapeutisch brauchbarer Mittel nützlich sind. Verfahren zur Herstellung der transgenen Tiere, speziell Tiere, wie Mäuse oder Ratten sind im Fachgebiet üblich und werden beispielsweise in US 4 736 866 A und US 4 870 009 A beschrieben. Typischerweise können spezielle Zellen für LP-48 transgene Inkorporation mit Gewebe spezifischen Enhancern als Ziel dienen. Transgene Tiere, die eine Kopie eines Transgens umfassen, das in die Keimzeillinie des Tieres in einem Embryonalstadium eingebracht wurde, können verwendet werden um den Effekt der zunehmenden Expression einer ein LP-48 Polypeptid kodierenden DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, die dazu gedacht sind Schutz vor beispielsweise pathologischen Zuständen zu verleihen, die mit deren Überexpression zusammenhängen. So ein Tier kann mit einem Reagenz behandelt werden und ein verringertes Auftreten des pathologischen Zustands, im Vergleich zu unbehandelten Tieren, die das Transgen in sich tragen kann ein potentielles therapeutisches Eingreifen in den pathologischen Zustand anzeigen.
Alternativ dazu können nicht menschliche Homologe von LP-48 verwendet werden, um ein "Knock out" Tier zu erschaffen, das ein defektes oder verändertes Gen aufweist, das ein spezielles LP-48 Polypeptid als Ergebnis der homologen Rekombination zwischen dem endogenen Gen kodiert und das das LP-48 Polypeptid und die veränderte genomische DNA, die in die Embryonalzelle des Tieres eingeführt ist, kodiert. Beispielsweise kann eine cDNA, die ein LP-48 Polypeptid verschlüsselt, verwendet werden um die genomische DNA, die das LP-48 Polypeptid in Übereinstimmung mit etablierten Techniken kodiert, zu klonieren. Eine Portion der genomischen DNA, die ein LP-48 Polypeptid kodiert, kann zerstört werden oder mit einem anderen Gen ersetzt werden, wie einem Gen das einen selektierbaren Marker kodiert, das verwendet werden kann um die Integration zu verfolgen. Typischerweise sind mehrere Kilobasen der nicht kodierenden flankierenden DNA (sowohl an den 5' als auch 3' Enden) in den Vektor eingeschlossen [siehe beispielsweise Thomas und Cepacchi, Cell 51(3): 503-512 (1987) zur Beschreibung der homologen Rekombinationsvektoren). Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie (beispielsweise durch Elektroporation) eingeführt und die Zellen in denen die eingeführte DNA homolog mit der endogenen DNA rekombiniert hat, werden ausgewählt [siehe beispielsweise Li et al, Cell 69(6): 915-926 (1992)]. Die ausgewählten Zellen werden dann in einen Blastocysten eines Tieres (beispielsweise einer Maus oder Ratte) injiziert um die Aggregationschimäre zu bilden [siehe beispielsweise Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach, E. J. Robertson, Herausgeber (IRL, Oxford, 1987), Seiten 113-152]. Ein chimärer Embryo kann dann in ein geeignetes pseudoschwangeres weibliches Ziehmutter implantiert werden und der Embryo wird einer Schwangerschaft unterzogen, um ein "Knock out" Tier zu schaffen. Die Nachkommenschaft, die die homologe rekombinante DNA in ihren Keimzellen aufweist, kann durch Standardtechniken identifiziert werden und verwendet werden um Tiere zu erzeugen, bei denen alle Zellen der Tiere, die homologe rekombinante DNA enthalten. Knock-out Tiere können beispielsweise charakterisiert werden auf Grund ihrer Fähigkeit sich gegen gewisse pathologische Zustände zu verteidigen und auf Grund ihrer Entwicklung von pathologischen Zuständen Dank der Abwesenheit des nativen LP-48 Polypeptids.
Transgene nicht humane Säugetiere sind als Tiermodelle sowohl in der Grundlagenforschung als auch für Arzneimittelentwicklungsunternehmen nützlich. Transgene Tiere die mindestens ein LP-48 Polypeptid oder eine Nukleinsäure exprimieren, können verwendet werden um Verbindungen oder andere Behandlungsmodalitäten zu testen, die vorbeugen, unterdrücken oder ein Pathologie oder Krankheit, die mit mindestens eine der oben angegeben Aktivitäten assoziiert ist, zu behandeln. Solche transgenen Tiere können ebenfalls als Model zum Testen der diagnostischen Verfahren für diese selben Krankheiten dienen. Weiterhin sind Gewebe, die von solchen transgenen nicht menschlichen Säugetieren abgeleitet sind, als Quelle der Zellen zur Zellkultur bei Anstrengungen zur Entwicklung der in vitro Biotestverfahren nützlich, um Verbindungen zu identifizieren, die die LP-48 Polypeptidaktivität oder das LP-48 Polypeptid abhängige Signal modulieren. Ein Verfahren um Verbindungen effektiv zu identifizieren bei der Behandlung von mindestens einer vorher beschriebenen Krankheit oder Pathologie, die mit einer LP-48 Polypeptid assozierten Aktivität assoziert ist, umfasst:

a) Erzeugung eines transgenen nicht menschlichen Tieres, das ein LP-48 Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimiert und das sich im Vergleich zu einem Wildtyptier pathologisch auf eine detektierbare oder messbare Weise von der Wildtypversion des genannten nicht menschlichen Säugetieres unterscheidet:
b) Aussetzen des genannten transgenen Tieres einer Verbindung, und
c) Bestimmung des Fortschreitens der Pathologie bei dem behandelten transgenen Tier, wobei ein Anhalten, eine Verzögerung oder Umkehr bei dem Fortschreiten der Krankheit bei transgenen Tieren, die mit der genannten Verbindung im Vergleich zum Fortschreiten der Pathologie bei nicht behandelten Kontrolltieren als Indikator dafür dient, dass die Verbindung zur Behandlung genannter Pathologie nützlich ist.

Ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die zur Hemmung der LP-48 Polypeptidaktivität in vivo und/oder in vitro fähig sind, umfasst:

a) Verabreichung einer experimentellen Verbindung an ein LP-48 Polypeptid exprimierendes transgenes Tier oder an Gewebe, die hiervon abgeleitet sind, welche eine oder mehrere physiologische oder pathologische Zustände zeigen, die der Expression eines LP-48 Transgens zuzurechnen sind, und
b) Beobachten oder Testen genannter Tiere und/oder tierischer Gewebe um Veränderungen unter genannter physiologischer oder pathologischer Zustands oder Zuständen nachzuweisen.

Ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die zur Überwindung von Defizienzen bei der LP-48 Polypeptidaktivität in vivo oder in vitro fähig sind, umfasst:

a) Verabreichung einer experimentellen Verbindung an ein LP-48 Polypeptid exprimierendes transgenes Tier oder an Gewebe, die hiervon abgeleitet sind, welche eine oder mehrere physiologische oder pathologische Zustände zeigen, die der Expression eines endogenen LP-48 Polypeptid-kodierenden Gens zuzurechnen sind, und
b) Beobachten oder Testen genannter Tiere und/oder Tiergewebe, um Veränderungen bei einer genannten physiologischen oder pathologischen Zustand oder Zuständen aufzuzeigen.

Die Fähigkeit einer Verbindung die Aktivität eines LP-48 Polypeptids in den Körper eines transgenen Tieres zu modulieren, kann durch verschiedene Mittel bestimmt werden. Das Beobachten der Umkehr eines pathologischen Zustands bei dem LP-48 Polypeptid exprimierenden transgenen Tiers nach der Verabreichung einer Verbindung ist ein solches Mittel. Eine weitere bevorzugte Bedeutung umfasst ein Testverfahren für Marker der LP-48 Aktivität im Blut von transgenen Tieren, vor und nach der Verabreichung einer Testverbindung an das Tier. Das Niveau des Könnens eines Fachmanns in dem relevanten Fachgebiet beliefert den Praktiker mit verschiedenen Verfahren zum Testen der physiologischen Veränderungen, die mit der therapeutischen Modulierung der LP-48 Aktivität zusammenhängen.
"Gentherapie" schließt sowohl konventionelle Gentherapien, wobei ein langanhaltender Effekt durch Einzelbehandlung erreicht wird, als auch die Verabreichung von gentherapeutischen Mitteln mit ein, die die Einmalgabe oder wiederholte Verabreichung von therapeutisch effektiver DNA oder mRNA umfassen. Anti-sense RNAs und DNAs können als therapeutische Mittel zur Blockade der Expression von gewissen Genen in vivo verwendet werden. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass kurze Antisinn Oligonukleotide in Zellen eingebracht werden können, wo sie als Inhibitoren trotz ihrer niedrigen intrazellulären Konzentrationen wirken, die durch restriktive Aufnahme durch die Zellmembran verursacht werden [Zemecnik et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83(12): 4243-4146 (1986)] wirken. Die Oligonukleotide können modifiziert werden um ihre Aufnahme beispielsweise durch Substitution ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen mit nicht geladenen Gruppen zu hemmen.
Es gibt eine Vielzahl von Techniken, die zur Einführung der Nukleinsäuren in lebensfähige Zellen fähig sind. Die Techniken variieren in Abhängigkeit davon, ob die Nukleinsäure in die Kulturzelle in vitro oder in vivo in die Zellen des angestrebten Wirts überführt wird. Geeignete Techniken für den Transfer der Nukleinsäure in die Säugerzellen in vitro umfassen die Verwendung der Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphatfällungsverfahren usw. Die derzeit bevorzugt in vivo Gentransfertechniken schließen die Transfektion mit viralen Vektoren (typischerweise retroviral) und die Virushüllproteinliposomen vermittelte Transfektion mit ein [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11(5): 205-210 (1993)]. Bei einigen Situationen ist es wünschenswert die Nukleinsäurequelle mit einem Mittel zu erzeugen, das die Zielzellen anzielt, wie einem Antikörper der spezifisch für das Zelloberflächenprotein oder die Zielzelle ist, einem Liganden für den Rezeptor auf den Zielzellen, usw. Wo Liposomen verwendet werden, können Proteine, die an ein Zelloberflächenmembranprotein durch Endocytose assoziert sind, verwendet werden zum Zielen und/oder die Erleichterung der Aufnahme, beispielsweise Kapsidproteine oder Fragmente hiervon, die trophisch für einen speziellen Zelltyp sind, Antikörper für Proteine, die in ihrem Zyklus aufgenommen werden, Proteine die auf die intrazelluläre Lokalisation abzielen und die intrazelluläre Halbwertszeiten erhöhen. Die Technik der Rezeptor vermittelten Endocytose wird beschrieben, beispielsweise von Wu et al., J. Biol. Chem. 262 (10): 4429-4432 (1987) und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (9): 3410-3414 (1990). Bezüglich einer Überprüfung der Genmarkierung und Gentherapieprotokolle, siehe Anderson, Science 256 (5058): 808-813 (1992).
Verfahren zur Behandlung unter Verwendung der LP-48 Polypeptide
Wie in den Beispielen 15 und 16 gezeigt, können die LP-48 Polypeptide signifikant die Apoptose bei humanen Endothelzellen verringern. In Bezug auf die Reduzierung der Endothelzapoptose wurde gezeigt, dass die LP-48 Polypeptide an die humanen Endothelzellen (Beispiel 7) binden. Es wurde gefunden, dass die Endothelzellapoptose bei einer Anzahl von Krankheiten auftritt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Atherosklerose, Bluthochdruck, kongestives Herzversagen, primären pulmonalen Bluthochdruck, Sepsis, systemisches Entzündungsantwortsyndrom, ARDS, multiples Organversagen und Allotransplantatvaskulopathie. Die Fähigkeit von LP-48 die humane Endothelzellapoptose zu verringern, ebenso wie an humane Endothelzellen zu binden zeigt dass LP-48 sich nützlich bei der Blockade der Destruktion des Endothelgewebes erweist, das durch die Apoptose auftritt. In Übereinstimmung dazu kann LP-48 dazu verwendet werden, um Atherosklerose, Bluthochdruck, kongestives Herzversagen, primären pulmonalen Bluthochdruck, Sepsis, systemisches Entzündungsantwortsyndrom, ARDS, multip les Organversagen, Allotransplantatvaskulopathie und zusätzliche Bedingungen und Erkrankungen zu behandeln, wo die Endothelzellapoptose auftritt.
Das Beispiel 14 zeigt, dass die LP-48 Polypeptide nützlich bei der Hemmung der IFN-γ, IL-12, TNF-α, IL-6 und GM-CSF Sekretion sind, wobei alle wichtig bei der Pathogenese der Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Sepsis, gram negative Bacteriämie, allergische Reaktionen, allergische Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes, Th1 abhängige Insulitis, Entzündung, Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Leberversagen, ARDS und Bedingungen oder Symptome in Bezug hierzu. Weiterhin scheinen die LP-48 Polypeptide an sowohl Maus- als auch humane Pankreaszellen zu binden (siehe Beispiel 18). Weil die LP-48 Polypeptide sinnvoll bei der Hemmung der IFN-γ und IL-12 Produktion sind (siehe Beispiel 14), können LP-48 Polypeptide zur Blockade der destruktiven Effekte von IFN-γ, IL-12, IL-6, TNF α und/oder IL-1β in den Pankreas und zur Vorbeugung der Pankreasinselzellapoptose verwendet werden. In Übereinstimmung dazu kann LP-48 dazu verwendet werden um Diabetes zu behandeln (Beispiel 20).
Die in den Beispielen 12 und 13 gezeigten Daten zeigen, dass Sepsis, gram negative Bakteriämie, akute Entzündung und Bedingungen oder Symptome hierzu, die damit zusammenhängen, behandelt oder vorgebeugt werden können durch Anwendung effektiver Mengen an LP-48 Polypeptiden. Die Verabreichung von gereinigtem, rekombinantem LP-48 Protein hemmt die Effekte, die während akutem endotoxischem Schock auftreten und schützt vor dem Tod. Wie allgemein charakterisiert, nimmt die Erfindung ebenfalls Bezug auf Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Zuständen, die durch chronische Entzündung verursacht oder verschlimmert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf allergische Reaktionen, allergische Autoimmunerkrankungen; Typ 1 Diabetes, Th1 abhängige Insulitis, Entzündung, Multiple Sklerose, rheumatoide Arthrites, entzündliche Darmerkrankung, Leberversagen, ARDS und Zustände oder Symptome die hiervon abgeleitet sind durch Verabreichung einer effektiven Menge der LP-48 Polypeptide. Die vorliegende Erfindung liefert weiter Verfahren zur Vorbeugung oder zur Behandlung zusätzlicher Entzündungs-bedingter Störungen durch Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge an LP-48 Polypeptiden. Diese Entzündungs-bedingten Störungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Akne, akute Bronchitis, Bronchiolitis, akute Lungenverletzung, allergische Konjunktivitis, allergische Rhinitis, Allotransplantatabstoßung, Alzheimersche Erkrankung, Angina, Apoptose, respiratorisches Atemstresssyndrom des Erwachsenen (ARDS), Asthma, atopisches Ekzem, Verbrennungen, Bursitis, Cerebritis, Cholecystitis, chronische Bronchitis, einschließlich akuter Exacerbationen der chronischen Bronchitis, Zirrhose, Kontaktdermatitis, Morbus Crohn, Cystitis, Dermatose, Ekzem, erosiver Gastritis, Ösophagitis, Gastritis, Glomerulonephritis, Graft-versus-Host Erkrankung (GVHD), Hepatitis, Bluthochdruck, interstitielle Lungenfibrose, Iritis, irritables Darmsyndrom, Mastocystose, Migräne, Myasthenia gravis, myocardiale Ischämie, Osteoarthritis, Osteomyelitis, Pankreatitis, Pharyngitis, Prostatitis, Reperfusionsverletzung, Sarcoidose, Sepsis, septischer Schock, systemisches inflammatorisches Antwortsyndrom, Sjögren Syndrom, systemischer Lupus erythematosus, Tendonitis, Tonsillitis, tubulointerstitielle Nephritis, ulcerative Colitis, Uveitis, chronische Entzündung und Bedingungen oder Symptome die hiervon abgeleitet sind. Wie in Beispiel 21 gezeigt, können die LP-48 Polypeptide bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der Lebererkrankung verwendet werden. LP-48 schützt vor LPS und D-Galactosamin verursachtem Leberversagen und schützt 100 % der Mäuse vor Leberversagen und Tod.
Das Beispiel 14 zeigt, dass LP-48 die IFNγ, TNFα, IL-1β und IL-6 Sekretion hemmt. Diese proinflammatorischen Cytokine spielen wichtige Rollen bei der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis. In Übereinstimmung dazu kann LP-48 dazu verwendet werden um rheumatoide Arthritis wie in Beispiel 22 gezeigt, zu behandeln.
Multiple Sklerose ist eine Autoimmunerkrankung. IFNγ und IL-12 spielen kritische Rollen bei der Krankheitsentwicklung und dem Rückfall. Es ist ebenfalls eingeführt, dass die Blockade von IL-12 und IFNγ mittels Antikörpern der EAE Entwicklung in Mäusen vorbeugt. LP-48 hemmt sowohl IFNγ als auch IL-12 (Beispiel 14) und kann daher zur Behandlung der multiplen Sklerose wie in Beispiel 23 gezeigt, verwendet werden.
Zusätzlich zur Behandlung der multiplen Sklerose können die LP-48 Polypeptide bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Vorbeugung von autoimmunen Erkrankungen allgemein verwendet werden. Demnach können die LP-48 Polypeptide zur Behandlung der autoimmunen Störungen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf GVHD, rheumatoide Arthritis, Asthma, Ekzem, Atopie, entzündliche Darmerkrankung, Vaskulitis, Psoriasis, Insulin abhängigen Diabetes mellitus, Pancreatitis, Psoriasis, Krebs, multiple Sklerose, Hashimoto Thyreoiditis, Graves Erkrankung, Transplantatabstoßung, systemischen Lupus erythematodes, autoimmune Nephropathie, autoimmune Hämatopathie, idiopathische interstitielle Pneumonie, Hypersensitivitätspneumonitis, autoimmune Dermatose, autoimmune Kardiopathie, autoimmune Infertilität, Behcet Erkrankung, autoimmune Gastritis, fibröse Lungenerkrankung, fulminante virale Hepatitis B, fulminante virale Hepatitis C, autoimmune Hepatitis, chronische Hepatitis, chronische Zirrhose, chronische Glumerulonephritis, thrombotisch thrombocytopenische Purpura (TTP) und hämolytisch urämisches Syndrom (HUS), aplastische Anämie, Myelodysplasie, multiples Organversagen Syndrom (MODS), Atemstresssyndrom bei Erwachsenen (ARDS) und Bedingungen oder Symptomen die hiervon abgeleitet sind.
Wie in Beispiel 14 gezeigt, hemmen die LP-48 Polypeptide die IFNγ, TNFα, IL-12 und IL-6 Sekretion. In Übereinstimmung mit der Fähigkeit von LP-48 diese Faktoren zu hemmen, kann ein Antagonist von LP-48 zur Behandlung oder Prävention eines T Zell vermittelten Zustands verwendet werden. Solche T-Zell vermittelten Zustände, schließen mit ein, sind aber nicht beschränkt auf Immundefizienz, HIV, HIV induziertes Lymphom, HIV induziertes AIDS, fulminante virale Hepatitis B, fulminante virale Hepatitis C, chronische Hepatitis, chronische Zirrhose, Zellschutz während einer Krebsbehandlung, Erholung von der Chemotherapie, Erholung von einer Strahlentherapie und Zustände oder Symptome, die hiermit zusammenhängen.
IL-12 ist ein zentraler Mediator der Zell vermittelten Immunantwort während der Aktivität der Entwicklung, Proliferation und Aktivität der Th 1 Zellen (R. M. Locksley, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90:5879 (1993), G. Trinchieri, Immunol, Today, 14:335 (1993), P. Scott, Science, 260:496 (1993), C. S. Hseih et al, Science, 260:547 (1993)). Diesen IL-12 Aktivitäten wird durch Faktoren entgegengewirkt, die mit der Entwicklung von nicht differenzierten T-Helferzellen in die Th2 Zellen und der Übermittlung der humoralen Immunantwort (beispielsweise IL-4 und IL-10, R. M. Locksley, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:5879, (1993), G. Trinchieri (1993), P. Scott, Science, 260:496 (1993) und C. S. Hseih et al, Science, 260:547 (1993)) assoziiert sind. Wie in Beispiel 14 gezeigt ist LP-48 nützlich bei der Hemmung der IL-12 Sekretion. In Übereinstimmung damit, kann LP-48 bei der Behandlung oder Prävention eines Th2 Zell vermittelten Zustands verwendet werden. Im Gegensatz dazu liefert die Verabreichung eines Antagonisten von LP-48 die Verstärkung der durch Th2 Zellen vermittelten Immunität.
Apoptotische Endothelzellen sind offensichtlich bei sowohl menschlichen als tierischen Tiermodellen den Atherosklerose (Stefanec, Chest, 117:841 (2000)) beteiligt. Risikofaktoren, die mit Atherosklerose zusammenhängen wurden typicherweise dabei beobachtet eine endotheliale Apoptose in vitro oder eine Zunahme der Anzahl der zirkulierenden Endothelzellen in vivo zu erhöhen. Oxidiertes Low-Density Lipoprotein, das zahlreiche Veränderungen in den frühen Stadien der Atherosklerose induziert, wurde dabei beobachtet, dass es die endotheliale Zellapoptose der Endothelzellen aus der menschlichen Nabelschnurvene in vitro induziert (Harada-Shiba et al., J. Biol. Chem., 273:9681 (1998)). Von zahlreichen Therapien wurde gezeigt, dass sie nützliche Effekte auf die Atherosklerose haben oder einen antiapoptotischen Effekt haben dürften. Da die Fähigkeit der LP-48 Polypeptide zur Hemmung der Endothelialzellapoptose gegeben ist, liefert eine Ausfürhungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung von LP-48 bei der Behandlung der Atherosklerose.
Ein Merkmal des Bluthochdrucks ist die kapilläre Verringerung, wobei da eine Verringerung der Anzahl der Kapillaren pro Volumen an Gewebe gemeint ist. Gemäß dem Goldblatt Model des Bluthochdrucks trägt die endotheliale Apoptose in großem Umfang zur mikrovaskularen Verringerung bei (Stefanec, Chest, 117:841 (2000)). Im Wechsel dazu wurde gedacht, daß Bluthochdruck proapoptotisch auf einige Zelltypen wirkt, basierend auf in vitro Studien. Weiterhin dienen die endotheliale Dysfunktion und die vermehrte Superoxidproduktion die durch Bluthochdruck verursacht sind, als Indikator für die endotheliale Apoptose. Mehrere Bedeutungen zur Behandlung des Bluthochdrucks können einen antiapoptotischen Effekt aufweisen. Während der antiapoptotischen Effekte von LP-48 dient ein Umfang der Erfindung zur Verwendung eines LP-48 Polypeptids bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Bluthochdruck und Umständen, die mit Bluthochdruck assoziiert sind.
Studien mit Tiermodellen die auf das kongestive Herzversagen gerichtet sind, zeigen, dass die endotheliale Apoptose zu dieser Erkrankung beiträgt. Beispielsweise wird in einem Tiermodel der Aorteninsuffizienz, bei dem eine hämodynamische Abnormalität erzeugt wurde eine Zunahme der zirkulierenden endothelialen Zellen (die als Indikator zur Apoptose dienen) 28 Tage nach der Induktion beobachtet (Stefanec, Chest, 117:841 (2000)). In einem weiteren Beispiel zeigt ein Rattenmodel von einem Monokrotalin-induzierten Rechtsherzversagen über einen Zeitraum von 30 Tagen eine fortschreitende und signifikante Zunahme der Anzahl der apoptotischen endothelialen Zellen im Skelettmuskel (Stefanec, Chest, 117:841 (2000)). Diese Zunahme bei apoptotischen Endothelzellen wird von einer Zunahme in TNF und dem atrialen natriuretischen Peptid begleitet, das zusammen mit Angiotensin II zur endothelialen Zellapoptose bei kongestivem Herzversagen beiträgt. Daher liefert eine Ausführungsform der Erfindung die Verwendung eines LP-48 Polypeptids bei der Behandlung von angeborenem Herzversagen durch die Verringerung der endothelialen Apoptose.
Mehrere Beobachtungen, die mit dem primären pulmonalen Bluthochdruck assoziiert sind, legen nahe, dass die endotheliale Zellapoptose zur Pathogenese dieser Krankheit beitragen kann. In einem Rattenmodel des pulmonalen Bluthochdruckes, wurde gezeigt, daß die Apoptose in der endothelialen Zellschicht einer Pulmonalarterie einer erwachsenen Ratte vor dem Auftreten eines fortschreitenden pulmonalen Bluthochdrucks (Jones und Rabinovitch, Circ. Res., 79:1131 (1996)) auftreten kann. Bei dem menschlichen primären pulmonalen Bluthochdruck wurden erhöhte Serumspiegel an IL-1β, die die endo theliale Zellapoptose hemmen, nachgewiesen (Stefanec, Chest, 117:841 (2000)). Gemeinsam mit diesen Linien wurde beobachtet, dass die Entwicklung eines primären pulmonalen Bluthochdrucks durch die Behandlung mit einem IL-1 Rezeptorantagonist in einem Rattenmodel (Voelkel et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 11:664 (1994)) verringert werden kann. Mehrere Behandlungen des primären pulmonalen Bluthochdrucks, einschließlich Prostacyclin, Calciumkanalblockern und Angiotensin-Konverting-Enzym haben antiapoptotische Effekte auf das Endothel (Stefaney, Chest, 117:841 (2000)). Die Fähigkeit von LP-48 die Apoptose bei endothelialen Zellen zu verringern oder vorzubeugen, liefert eine Ausführungsform der Erfindung, in welcher LP-48 zur Behandlung des primären pulmonalen Bluthochdrucks verwendet wird.
Im wesentlichen gereinigte, oder reine Präparationen von LP-48 Polypeptiden und / oder LP-48 Epitopen, die Antikörper erkennen können in einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung formuliert werden. Beispielsweise kann eine pharmazeutische Formulierung die an die Behandlung einer Entzündungs vermittelten Störung angepasst ist, die ein LP-48 Polypeptid oder ein Fragment hiervon enthält, analog und/oder homolog hiervon durch die vorliegende Erfindung umfasst werden. Zusätzlich ist eine pharmazeutische Formulierung, die an die Behandlung der Immundefizienz, die einen LP-48 Antikörper enthält, angepasst ist, mitumfasst. Solche pharmazeutischen Formulierungen können auf eine Weise dosiert werden, die mit den bekannten medizinischen Praktiken übereinstimmt, wobei der klinische Zustand des individuellen Patienten berücksichtigt wird (speziell die Nebenwirkungen der Behandlung mit LP-48 Polypeptiden und/oder LP-48 Epitopen die die Antikörper alleine erkennen), der Ort der Abgabe der LP-48 Polypeptide und/oder LP-48 Antikörper erkennende Zusammensetzungen, das Verfahren der Verabreichung, der Verabreichungsplan und dem Anwender bekannte andere Faktoren.
Eine effektive Menge an LP-48 Polypeptiden oder LP-48 Epitop erkennendem Antikörper kann zur Vorbeugung oder Behandlung von mindestens einem Symptom der allergischen Antworten, allergischen Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes, Th1 abhängiger Insulitis, Immundefekten, Krebs, Entzündung, Infektionskrankheiten dienen oder kann zur Modulierung der biologischen Aktivität von mindestens einem natürlichen Liganden dienen. Eine effektive Menge eines LP-48 Polypeptids und/oder LP-48 erkennenden Antikörpers zur Vorbeugung oder Behandlung von einem Symptom kann durch die Vorbeugung oder Verbesserung der schädlichen Zustände oder Symptome der behandelten Krankheiten bestimmt werden. Die therapeutisch effektive Menge von LP-48 Polypeptid und/oder LP-48 erkennendem Antikörper für die Zwecke hierin wird durch solche Überlegungen bestimmt. Durch die Freisetzung von schrittweisen Levels von LP-48 Polypeptid und/oder LP-48 erkennendem Antikörper innerhalb einer pharmazeutischen Zusammensetzung, kann ein klinischer Fachmann die therapeutisch effektive Dosis eines LP-48 Polypeptids und/oder LP-48 Epitop erkennenden Antikörpers zur Behandlung oder Vorbeugung der Atherosklerose, des Bluthochdrucks, kongestiven Herzversagens, primären pulmonalen Bluthochdrucks, Sepsis, gramnegativer Bakteriämie, allergischen Reaktionen, allergischen Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes, Th1 abhängiger Insulitis, Immundefizienz, Krebs, Entzündung und infektiösen Erkrankungen bestimmen. Solche Bestimmungen sind im Fachgebiet gut bekannt und liegen innerhalb des Bereichs des Klinikers, der eine therapeutisch effektive Menge an LP-48 Polypeptid und/ oder LP-48 erkennendem Antikörper in einer pharmazeutischen Zusammensetzung demgemäß einstellt. Eine therapeutisch effektive Menge an LP-48 Polypeptid und/oder LP-48 erkennendem Antikörper ergibt eine messbare Modulierung der biologischen Aktivität, die mit dem LP-48 Polypeptid assoziiert ist.
Als allgemeine Verabreichung liegt die gesamte therapeutisch effektive Menge an LP-48 Polypeptid und/oder LP-48 erkennendem Antikörper, welche parenteral pro Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht wird im Bereich von etwa 1 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag in Bezug auf das Körpergewicht des Patienten. Jedoch, wie dies oben angegeben ist, soll dies einer therapeutischen Freiheit unterliegen. Vorzugsweise beträgt diese Dosis mindestens 0,001 mg/kg/Tag oder mindestens 0,01 mg/kg/Tag oder mindestens 0,10 mg/kg Tag oder mindestens 1,0 mg/kg/Tag.
Als weitere Möglichkeit, bei kontinuierlicher Verabreichung, wird das LP-48 Polypeptid und/oder der LP-48 erkennende Antikörper typischerweise mit einer Dosisrate von etwa 0,1 μg/kg/Stunde bis etwa 50 μg/kg/Stunde, entweder durch 1-4 Injektionen pro Tag oder durch kontinuierliche subkutane Infusionen beispielsweise mittels einer Minipumpe, verabreicht. Eine intravenöse Beutellösung kann ebenfalls verwendet werden. Die Länge der Behandlung die nötig ist um Veränderungen zu beobachten und der Zeitraum der auf die Behandlung folgt bis Antworten auftreten scheint in Abhängigkeit des gewünschten Effekts zu variieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die das LP-48 Polypeptid und/oder den LP-48 erkennenden Antikörper enthalten, können mittels einer Vielzahl an Arten verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf oral, rectal, intracranial, parenteral, intracisternal, intrathekal, intravaginal, intraperitoneal, intratracheal, intrabroncho-pulmonal, topisch, transdermal (wie als Pulver, Salben, Tropfen oder Transdermalpflaster), buccal oder als orales oder nasales Spray. Mit "pharmazeutisch annehmbarer Träger" ist ein nicht toxischer, halbfester oder flüssiger Füllstoff, Verdünnungsmittel, Verkapselungsmaterial oder Hilfsformulierung jedes Typs gemeint. Der Ausdruck "parenteral" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Arten der Verabreichung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, intrasternale, subcutane und intraartikuläre Injektion und Infusion. Implantate, die das LP-48 Polypeptid und/oder den LP-48 erkennenden Antikörper enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
LP-48 Polypeptide und/oder LP-48 erkennende Antikörper werden ebenfalls passend verabreicht durch verzögerte Freisetzungssysteme. Geeignete Beispiele für verzögerte Freisetzungssysteme schließen semi-permeable Polymermatrizen, beispielsweise Filme oder Mikrokapseln mit ein. Verzögert freisetzende Matrizen schließen Polylactide ( US 3 773 919 A , EP 0 058 481 A ), Copolymere der L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymere 22:547-556 (1983)), Poly-(2-hydroxyethylmethacrylate (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981))), Ethylenvinylacetat (R. Langer et al., 1982) oder Poly-D-3-hydroxybuttersäure ( EP 0 133 988 A ) mit ein.
Verzögert freisetzende LP-48 Polypeptide und/oder LP-48 erkennende Antikörperzusammensetzungen schließen ebenfalls liposomal eingeschlossene LP-48 Polypeptide mit ein. Liposomen, die LP-48 Polypeptide enthalten, werden gemäß Verfahren die an sich bekannt sind hergestellt ( DE 3 218 121 , Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 3688-3692 (1985), Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4030-4034 (1980)), EP 0 052 322 A , EP 0 036 676 A , EP 0 088 046 A , EP 0 143 949 A , EP 0 142 641 A , Japanische Patentanmeldung 83-118008, US 4 485 045 A und US 4 544 545 A und EP 0 102 324 A . Im allgemeinen sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200-800 Angström) unilammellären Typ, wobei der Lipidgehalt größer als etwa 30 Molprozent Cholesterin beträgt und das ausgewählte Verhältnis für die optimale LP-48 Polypeptidtherapie eingestellt wird.
Zur parenteralen Verabreichung kann das LP-48 Polypeptid und/oder der LP-48 erkennende Antikörper allgemein formuliert werden durch Mixen bei dem gewünschten Reinheitsgrad in einer injizierbaren Einheitsdosierungsform (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, beispielsweise einem der nicht toxisch für den Empfänger der Dosis und der verwendeten Konzentrationen ist und der mit anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel ist. Beispielsweise schließt die Formulierung vorzugsweise oxidierende Mittel und andere Verbindungen die dafür bekannt sind, dass sie Polypeptide zerstören, nicht mit ein.
Im allgemeinen werden die Formulierungen durch Inkontaktbringen des LP-48 Polypeptids gleichmäßig und eng mit Flüssigträgern oder fein verteilten festen Trägern oder beidem hergestellt. Dann wird das Produkt, wenn es nötig ist, in die gewünschte Formulierung verwandelt. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, noch bevorzugter eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isoton ist. Beispiele für solche Trägervehikel sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringer Lösung und Dextroselösung. Nicht wässrige Vehikel, wie fixierte Öle und Ethyloleate sind hierbei ebenfalls nützlich, ebenso wie Liposomen.
Das geeignete Transportmittel enthält kleinere Mengen an Zusatzstoffen, wie Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität hemmen. Solche Materialien nicht nicht toxisch für den Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen und schließen Puffer wie Phophat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder ihre Salze, Antioxidantien wie Ascorbinsäure, bezüglich des Gewichts nieder molekulare Polypeptide, beispielsweise Polyarginine oder Tripeptide, Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline, hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidin, Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure, Arsparaginsäure oder Arninin, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlnehydrate, einschließlich Cellulose oder dessen Derivate, Glucose, Manose oder Dextrine, Chelatbildner wie EDTA, Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit, Gegenionen wie Natrium und/oder nicht ionische oberflächenaktive Mittel wie Polysorbate, Poloxamere oder PEG mit ein.
Das LP-48 Polypeptid und/oder der LP-48 erkennende Antikörper werden typischerweise in solchen Trägern bei einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1-10 mg/ml bei einem pH von etwa 3 bis 8 formuliert. Es ist selbstverständlich, dass die Verwendung von bestimmten der vorhergehenden Hilfsstoffen, Trägern oder Stabilisatoren zur Bildung von LP-48 Polypeptidsalzen führt. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die LP-48 Polypeptide und/oder LP-48 erkennende Antikörper zur therapeutischen Verwendung beobachtet, müssen steril sein. Die Sterilität wird schnell durch die Filtration durch sterile Filtrationsmembranen (beispielsweise, 0,2 Micron Membranen) erhalten. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die LP-48 Polypeptide und/oder LP-48 Epitop erkennende Antikörper enthalten, werden im allgemeinen in einen Behälter mit einem sterilen Einlaß gegeben, beispielsweise in einem intravenösen Lösungsbeutel oder in ein Gefäß, das einen mit einer hypodermen Injektionsnadel durchstechbaren Verschluss enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die LP-48 Polypeptide und/oder LP-48 erkennende Antikörper enthalten, können in Einmal- oder Mehrfachdosenbehältern, beispielsweise, verschlossenen Ampullen oder Gefäßen, wie einer wässrigen Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstitution, gelagert werden. Als Beispiel für eine lyophilisierte Formulierung werden 10 ml Gefäße mit 5 ml einer steril filtrierten 1 % (G/V) wässrigen LP-48 Polypeptidlösung befüllt und das entstehende Gemisch wird lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstitution des lyophilisierten LP-48 Polypeptids, mittel eines bakteriostatischen Wassers für Injektionszwecke, hergestellt.
Zusätzlich können pharmazeutische Zusammensetzungen, die LP-48 Polypeptide und/oder LP-48 Epitop erkennende Antikörper enthalten, bei der Behandlung oder Vorbeugung von Sepsis, gram negativer Bakteriämie, allergischen Antworten, allergischen Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes, Th1 abhängiger Insulitis, Immundefekten, Krebs, Entzündung, infektiösen Erkrankungen und Zuständen oder hiervon abgeleiteten Symptomen, worin diese Verbindung weitere andere therapeutischen Verbindungen umfasst, verwendet werden.
Wenn nicht anders angegeben, haben alle technischen und wissenschaftlichen hierin verwendeten Ausdrücke dieselbe Bedeutung wie sie allgemein von dem Fachmann, dem diese Erfindung gilt, verstanden werden. Die Verfahren und Materialien die ähnlich oder äquivalent zu denen sind, die hierin beschrieben sind, können bei der Ausführung oder dem Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden und geeignete Verfahren und Materialien sind unten beschrieben. Im Falle eines Konflikts wird die vorliegende Verabreichung, einschließlich der Definitionen kontrolliert. Zusätzlich sind die Materialien, Verfahren und hierin beschriebenen Beispiele nur beschreibend und sollen nicht beschränken.
Die folgenden Beispiele beschreiben die vorliegende Erfindung weiter:
Beispiel 1: Klonierung von LP-48 kodierenden Polynukleotiden
Die partielle LP-48 DNA Sequenz wird aus einer einzelnen EST Sequenz in der Incyte Datenbank einer humanen Prostata cDNA Bank identifiziert. Der Vollängen cDNA Klon wird aus einer humanen Leukozytenbank durch PCR isoliert. LP-48 enthält 179 Aminosäuren und wurde anfänglich so charakterisiert, dass es eine Ähnlichkeit zu IL-17 aufweist, da es zu 20 % identisch zu IL-17 ist.
Beispiel 2: Northern Blot und RT-PCR Analyse der LP-48 Expression
Die Northern Blot Analyse wird ausgeführt, um die IL-17 Genexpression in Humangewebe mittels Verfahren zu untersuchen, die in Current Protocols in Molecular Biology beschrieben sind. Es wird eine cDNA Sonde, die die gesamte Nukleotidsequenz des LP-48 Polypeptids enthält mit ³²P mittels des Random Prime^® DNA Markierungssystems (Amersham Life Science) gemäß den Anleitungen des Herstellers markiert. Nach der Markierung wird die Sonde mittels einer Chroma Spin 100^® Säule (Clontech Laboratories Inc.) gemäß dem Protokoll PT1200-1 des Herstellers gereinigt. Die gereinigte, markierte Sonde wird dann verwendet, um verschiedene Humangewebe auf IL-17 mRNA zu untersuchen.
Es werden Multiple Tissue Northern Blots (MTN), die verschiedene Humangewebe (H) oder humane Immunsystemgewebe (IM) enthalten von Clontech erhalten und mit der markierten Sonde mittels ExpressHyb Hybridisierungslösung (Clontech) gemäß dem Protokoll Nummer PT1190-1 untersucht. Nach der Hybridisierung und dem Waschen werden die Blots auf Film aufgebracht und bei -70°C über Nacht exponiert und die Filme werden gemäß Standardverfahren entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass die LP-48 Expression sehr niedrig ist und nicht im Humangehirn, der Plazenta, der Lunge, der Leber, der Niere, der Milz, des Thymus, der Prostata, den Ovarien, dem Dünndarm, dem Kolon, dem Magen, der Schilddrüse, dem Rückenmark, dem Lymphknoten, der Luftröhre und der Nebenniere detektiert wird. Mittels der dem Fachmann bekannten Techniken detektiert die RT-PCR eine LP-48 Expression im Hoden und den Leukozyten, wie auch in der fetalen Leber und der Niere.
Beispiel 3: Expression von LP-48 Polypeptiden in Säugerzellen
Ein typischer Säugerexpressionsvektor enthält zumindest ein Promotorelement, das die Initiation der Transkription der mRNA, der für das Polypeptid kodierenden Sequenz und der für die Termination der Transkription und Polyadenylierung des Transkripts erforderlichen Signale vermittelt. Zusätzlich kann jeder Säugerexpressionsvektor Enhancer, Kozaksequenzen und intervenierende Sequenzen, die durch Donor- und Akzeptorstellen für ein RNA Spleißen flankiert sind, aufweisen.
Eine hoch effiziente Transkription kann mit den frühen und späten Promotoren von SV40 und den langen terminalen Wiederholungen (LTRS) von Retroviren, beispielsweise RSV, HTLV1, HIV1 und dem frühen Promotor des Cytomegalievirus (CMV) erreicht werden. Jedoch können zelluläre Elemente auch verwendet werden (beispielsweise der humane Actinpromotor). Geeignete Expressionsvektoren zur Verwendung bei der Bereitstellung von LP-48 umfassen beispielsweise Vektoren, wie pIRES1 neo, pRetro-Off, pRetro-on, PLXSN oder pLNCX (Clontech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) oder pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL und PMSG (Pharmacia, Uppsala, Schweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) und pBC12Ml (ATCC 67109). Säugerwirtszellen, die verwendet werden können, umfassen HeLa, 293, H9 und Jurcat Zellen, Maus NIH3T3 und C127 Zellen, Cos 1, Cos 7 und CV1, Quail QC1-3 Zellen, Maus L Zellen und Ovarzellen (CHO) vom Chinesischen Hamster. Alternativ dazu können die gewünschten LP-48 kodierenden DNA Sequenzen in stabilen Zelllinien exprimiert werden, die DNA Sequenzen zur Expression jeder Untereinheit enthalten, wenn sie in das Chromosom integriert sind. Die Co-Transfektion mit einem Selektionsmarker, wie dhfr, gpt, Neomycin oder Hygromycin erlaubt die Identifizierung und Isolierung der transfizierten Zellen, wie dies in der Technik bekannt ist.
Die für das transfizierte LP-48 Polypeptid kodierenden DNA Sequenzen können auch zur Expression von großen Mengen des kodierten Polypeptids amplifiziert werden. Der DHFR (Dihydrofolatreduktase) Marker ist zur Entwicklung von Zelllinien brauchbar, die mehrere hundert oder sogar mehrere tausend Kopien der DNA Sequenzen von Interesse tragen. Ein weiterer brauchbarer Selektionsmarker ist das Enzym Glutaminsynthase (GS) (Murphy et al., Biochem. J. 227: 277-279 (1991), Bebbington et al., Bio/Technology 10: 169-175 (1992)). Unter Verwendung dieser Marker werden die Säugerzellen in Selektivmedium angezogen und die Zellen mit der höchsten Resistenz werden ausgewählt. Diese Zelllinien enthalten die amplifizierten Gene integriert in ein Chromosom. Ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) und NSO Zellen werden oft zur Herstellung von Proteinen und Polypeptiden verwendet.
Die Expressionsvektoren pC1 und pC4 enthalten den starken Promotor (LTR) des Rous Sarcomavirus (Cullen et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)) plus ein Fragment des CMV-Enhancers (Boshart et al., Cell: 41: 521-530 (1985)). Mehrfache Klonierungsstellen, beispielsweise mit den Restriktionsenzymspaltstellen BamHI, XbaI und Asp718 erleichtern die Klonierung der sTNRF6 DNA Sequenzen. Die Vektoren enthalten zusätzlich zum 3' Intron das Polyadenylierungs- und Terminationssignal des Präproinsulingens der Ratte.
293T Zellen können mit einem PvuI linearisierten Expressionsplasmid mittels der Calciumphosphat Co-Fällungsmethode transfiziert werden. Neomycinklone können in 400 μg/ml G418 selektiert werden und die selektierten Klone werden vermehrt. Produzierende Klone können mittels eines Enzymgebundenen Immunosorbenttest mit anti-human IgG1 und Northern Analyse mit einer ³²P-markierten für LP-48 spezifischen DNA Sonde ausgewählt werden. Ähnlich können Klone, die das LP-48-Fc Produkt bilden, in COS oder CHO Zellen gebildet werden.
Beispiel 4: Klonierung und Expression von LP-48 Polypeptiden in COS oder CHO Zellen
Es wird ein Plasmid zur Expression von LP-48 Polypeptiden durch die Klonierung einer cDNA, die für LP-48 Polypeptid kodiert, in den Expressionsvektor pcDNAI/Amp oder pcDNAIII (der von Invitrogen, Inc. erhalten werden kann) hergestellt. Die Expressionsvektoren pcDNAI/amp und pcDNAIII enthalten (1): Einen E. coli Replikationsursprung, der zur Vermehrung in E. coli und anderen prokaryontischen Zellen wirksam ist, (2) ein Ampicillinresistenzgen zur Selektion von Plasmid-enthaltenden prokaryontischen Zellen, (3) einen SV40 Replikationsursprung zur Vermehrung in eukaryontischen Zellen, (4) einen CMV Promotor, einen Polylinker, ein SV40 Intron, (5) mehrere Codons, die ein Hämagglutininfragment kodieren (das heißt einen "HA" Tag zur Erleichterung der Reinigung) oder HIS Tag (siehe beispielsweise Ausubel et al., Herausgeber, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY (1987-1999)), gefolgt von einem Terminationscodon und einem Polyadenylierungssignal, das so angeordnet ist, dass eine cDNA bequem unter die Expressionskontrolle des CMV Promotors gestellt und funktionsfähig an das SV40 Intron und das Poyladenylierungssignal durch Restriktionsschnittstellen im Polylinker gebunden werden kann. Der HA Tag entspricht einem Epitop, das aus dem Influenza Hämagglutininpolypeptid abgeleitet ist, wie dies vorher beschrieben wurde (Wilson et al., Cell 37: 767-778 (1984)). Die Fusion des HA Tags an das LP-48 erlaubt eine leichte Detektion und Gewinnung des rekombinanten Polypeptids mit einem Antikörper, der das HA Epitop erkennt. Der Vektor pcDNAIII enthält zusätzlich den Neomycinselektionsmarker.
Ein DNA Fragment, das für ein LP-48 Polypeptid kodiert, wird separat in die Polylinkerregion des Vektors kloniert, so dass die rekombinante Polypeptidexpression durch den CMV Promotor gesteuert wird. Die Insertion in den Vektor wird optional mit oder ohne dem HA Epitop ausgeführt. Die Plasmidkonstruktionsstrategie ist folgendermaßen. Eine das LP-48 Polypeptid kodierende DNA kann mittels Primer amplifiziert werden, die bequeme Restriktionsstellen enthalten. Das durch PCR amplifizierte LP-48 kodierende DNA Fragment und der pcDNAI/Amp Vektor werden mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und dann wird das LP-48 kodierende DNA Fragment an einen verdauten Vektor ligiert. Jedes Ligationsgemisch wird in den E. coli Stamm SURE (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) transformiert und die transformierte Kultur wird auf Ampicillinplatten plattiert, die dann inkubiert werden, um das Wachstum von Ampicillin resistenten Kolonien zu erlauben. Die Plasmid DNA für jede Untereinheit wird aus resistenten Kolonien isoliert und durch eine Restriktionsanalyse oder andere Mittel auf das Vorkommen eines für LP-48 kodierenden Fragments untersucht.
Zur Expression der LP-48 Polypeptide werden die COS Zellen mit einem Expressionsvektor transfiziert, wie dies oben beschrieben ist, unter Verwendung von DEAE-Dextran, wie dies beispielsweise in Sambrook et al., Molekular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) beschrieben ist. Die Zellen werden unter Bedingungen inkubiert, die zur Expression von LP-48 geeignet sind.
Das LP-48-HA Polypeptid wird durch radioaktive Markierung und Immunfällung mittels hierin beschriebener Verfahren, beispielsweise Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Narbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988) detektiert. Danach werden zwei Tage nach der Transfektion die Zellen durch die Inkubation in Medium für 8 Stunden markiert, die 35S-Cystein enthalten. Die Zellen und die Medien werden gewonnen und die Zellen werden gewaschen und mit Detergenz-enthaltendem RIPA Puffer lysiert: 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,1 % SDS, 0,5 % DOC, 50 mM Tris, pH 7,5, wie dies von Wilson et al., Cell 37: 767-778 (1984) beschrieben ist. Die Proteine werden aus dem Zelllysat und aus dem Kulturmedium mittels eines HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers gefällt. Das gefällte Protein wird dann durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Man beobachtet ein Expressionsprodukt der erwarteten Größe im Zelllysat, das nicht in Negativkontrollen beobachtet wird.
Der Vektor pC4 kann für die Expression von LP-48 verwendet werden. Das Plasmid pC4 ist ein Derivat des Plasmids pSV2-dhfr (ATCC Hinterlegungsnummer Nr. 37146). Das Plasmid enthält das Maus DHFR Gen unter der Kontrolle des frühen SV40 Promotors. Zellen aus dem Ovar des chinesischen Hamsters (dhfr-) oder andere Zellen, denen die Dihydrofolataktivität fehlt, die mit LP-48 Plasmiden co-transfiziert sind, können durch Anziehen der Zellen in einem Selektionsmedium (alpha minus MEM, Life Technologies) angezogen werden, das mit dem chemotherapeutischen Mittel Methotrexat (MTX) versetzt ist. Die Amplifikation der DHFR Gene in Zellen, die gegenüber Methotrexat resistent sind, ist gut dokumentiert. (siehe beispielsweise Alt et al., J. Biol. Chem. 253: 1357-1370 (1978), Hamlin et al., Biophys. Acta 1097: 107-143 (1990) und Page et al., Biotechnology 9: 64-68 (1991)). Die Zellen, die in ansteigenden Konzentrationen an MTX angezogen werden, entwickeln eine Resistenz gegenüber dem Arzneimittel durch die Überproduktion des Zielenzyms DHFR als Ergebnis der Amplifikation des DHFR Gens. Falls DNA Sequenzen an das DHFR Gen gebunden sind, werden sie gewöhnlich co-amplifiziert und überexprimiert. Es ist in der Technik bekannt, dass dieser Ansatz verwendet werden kann, um Zelllinien zu entwickeln, die mehr als 1000 Kopien des amplifizierten Gens aufweisen. Anschließend werden nach dem Entzug des Methotrexats Zelllinien erhalten, die die amplifizierten DNA Sequenzen integriert in eines oder mehrere Chromosome der Wirtszelle aufweisen.
Das Plasmid pC4 enthält den starken Promotor der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous Sarcoma Virus (Cullen et al., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985) zur Expression der inserierten Gensequenzen. PC4 enthält zusätzlich ein vom Enhancer isoliertes Fragment des unmittelbar frühen Gens des humanen Cytomegalievirus (CMV) (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)). Stromabwärts des Promotors sind BamHI, XbaI und Asp718 Restriktionsschnittstellen, die eine Integration der DNA Sequenzen erlauben. Hinter diesen Klonierungsstellen enthält das Plasmid das 3' Intron und die Polyadenylierungsstelle des Rattenpräproinsulingens. Es können auch andere hoch effiziente Promotoren für die Expression verwendet werden, beispielsweise der humane β-Actinpromotor, der frühe oder späte Promotor von SV40 oder die langen terminalen Wiederholungen von anderen Retroviren, beispielsweise HIV und HTLVI. Clontech's tet-Off und Tet-On Genexpressionssystem und ähnliche Systeme können zur Expression von LP-48 auf einem regulierten Weg in Säugerzellen verwendet werden (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 89: 5547-5551 (1982)). Für die Polyadenylierung der mRNA können andere Signale, beispielsweise aus den Genen des humanen Wachstumshormons oder Globins ebenfalls verwendet werden. Stabile Zelllinien die DNA Sequenzen von LP-48 integriert in die Chromosome aufweisen, können ebenfalls nach einer Co-Transfektion mit einem Selektionsmarker ausgewählt werden, wie gpt, G418 oder Hygromycin. Es ist vorteilhaft, mehr als einen Selektionsmarker zu Beginn zu verwenden, beispielsweise G418 plus Methothrexat.
Das Plasmid pC4 wird mit Restriktionsenzymen verdaut und dann mittels Phosphatase von dem Kälberdarm durch in der Technik bekannte Verfahren dephosphoryliert. Der Vektor wird dann aus einem 1 % Agarosegel isoliert. Die für die vollständige LP-48 kodierende DNA Sequenz wird mittels PCR Oligonukleotidprimern amplifiziert, die die 5' und 3' Sequenzen des Gens kodieren. Nicht beschränkende Beispiele umfassen 5' und 3' Primer mit Nukleotiden, die einem Teil des kodierenden LP-48 gemäß den in der Technik bekannten Verfahren entsprechen oder hierzu komplementär sind.
Die amplifizierten Fragmente werden mit geeigneten Endonukleasen verdaut und dann erneut auf einem 1 % Agarosegel gereinigt. Die isolierten Fragmente für jede Untereinheit und der dephosphorylierte Vektor werden dann getrennt mit T4 DNA Ligase ligiert. E. coli HB101 oder XL-1 Blue Zellen werden dann getrennt transformiert und es werden Bakterien identifiziert, die das Fragment (oder die Fragmente, falls der Vektor zur Expression sowohl von alpha als auch beta Untereinheiten angepasst ist) inseriert in das Plasmid pC4 mittels beispielsweise Restriktionsenzymanalyse enthalten.
Zellen vom chinesischen Hamsterovar (CHO), denen ein aktives DHFR Gen fehlt, werden zur Transfektion verwendet. 5 μg des Expressionsplasmids pC4 werden mit 0,5 μg des Plasmids pSV2-neo mittels Lipofectin kotransfiziert. Das Plasmid pSV2neo enthält einen dominanten Selektionsmarker, das neo Gen von Tn5 kodiert für ein Enzym, das eine Resistenz gegenüber einer Gruppe an Antibiotika verleiht, einschließlich G418. Die Zellen werden in alpha minus MEM angeimpft, das mit 1 μg/ml G418 supplementiert ist. Nach 2 Tagen werden die Zellen mit Trypsin behandelt und in Hybridomklonierungsplatten (Greiner, Deutschland) in alpha minus MEM angeimpft, das mit 10, 25 oder 50 ng/ml Methotrexat plus 1 μg/ml G418 supplementiert ist. Nach etwa 10 bis 14 Tagen werden einzelne Klone mit Trypsin behandelt und dann in Petrischalen mit 6 Vertiefungen oder 10 ml Kolben mittels unterschiedlichen Konzentrationen an Methotrexat (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) angeimpft. Klone, die bei der höchsten Konzentration an Methotrexat wachsen, werden dann in neue Platten mit 6 Vertiefungen überführt, die sogar noch höhere Konzentrationen an Methotrexat enthalten (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Dasselbe Verfahren wird wiederholt, bis die Klone erhalten werden, die bei einer Konzentration von 100 bis 200 mM wachsen. Die Expression des gewünschten Produkts wird beispielsweise durch SDS-PAGE und Western Blot oder durch Umkehrphasen HPLC Analyse analysiert.
Beispiel 5: Prokaryontische Expression und Reinigung von LP-48 Protein
Ein Expressionsvektor, der zu einer Expression von LP-48 Polypeptiden oder Fragmenten hiervon in einer Vielzahl an prokaryontischen Wirtszellen, wie E. coli geeignet ist, wird leicht hergestellt. Der Vektor enthält einen Replikationsurspung (ori), ein Ampicillinresistenzgen (Amp), das zur Selektion von Zellen brauchbar ist, die den Vektor nach einem Transformationsverfahren enthalten und ferner den T7 Promotor und die T7 Terminatorsequenzen in einer funktionsfähigen Verbindung an eine für ein LP-48 Polypeptid kodierende Region. Das Plasmid pET11A (erhältlich von Novogen, Madison WI) ist ein geeignetes Ausgangsplasmid. pET11A wird durch Restriktion mit Endonukleasen NdeI und BamHI linearisiert. Linearisiertes pET11A wird an ein DNA Fragment ligiert, das klebrige NdeI und BamHI Enden trägt und die Region des LP-48 Gens umfasst, wie dies durch SEQ ID Nr. 1 oder einem Fragment hiervon beschrieben ist.
Die für das LP-48 Polypeptid kodierende DNA, die in dieser Konstruktion verwendet wird, kann leicht am 5' Ende (Aminoterminus des kodierten Proteins) modifiziert werden, um die Reinigung des kodierten Proteinprodukts zu vereinfachen. Für diesen Zweck wird ein Oligonukleotid, das 8 Histidinreste enthält, nach dem ATG Startcodon inseriert. Die Plazierung der Histidinreste am Aminoterminus des kodierten Proteins dient dazu, das IMAC Einschrittproteinreinigungsverfahren zu ermöglichen.
Ein Expressionsvektor, der einen offenen Leserahmen (ORF) trägt, welcher ein LP-48 Polypeptid oder ein Fragment hiervon enthält und wobei der ORF operativ an einen Expressionspromotor gebunden ist, wird in E. coli BL21 (DE3) (hsdS gaI λclts857 ind1Sam7nin5lacUV5-T7gen 1) mittels Standardverfahren transformiert. Transformanden, die auf Resistenz gegenüber Ampicillin selektiert sind, werden zufällig gewählt und auf das Vorkommen des Vektors durch Agarosegelelektrophorese mittels Quick Plasmidpräparationen getestet. Kolonien, die den Vektor enthalten, werden in L Medium angezogen und das durch den auf dem Vektor vorhandenen ORF kodierte Proteinprodukt wird durch immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) gereinigt, wie dies im wesentlichen in US 4 569 794 A beschrieben ist.
Kurz gesagt wird die IMAC Säule folgendermaßen hergestellt. Ein Metall-freies Chelatharz (beispielsweise Sepharose 6B IDA, Pharmacia) wird in destilliertem Wasser zur Entfernung von konservierenden Substanzen gewaschen und mit einem geeigneten Metallion [beispielsweise Na(II), Co(II) oder Cu(II)] durch die Zugabe von wässriger 50 mM Metallchlorid- oder Metallsulfatlösung infundiert, bis etwa 75 % des Zwischenraums des Harzes mit gefärbtem Metallionen gesättigt ist. Die Säule ist dann bereit, einen rohen zellulären Extrakt zu erhalten, der das rekombinante Proteinprodukt enthält. Nach der Entfernung von ungebundenen Proteinen und anderen Materialien durch Waschen der Säule mit einem geeigneten Puffer mit pH 7,5 wird das gebundene Protein in einem geeigneten Puffer bei pH 4,3 oder vorzugsweise mit einem Imidazol-enthaltenden Puffer bei pH 7,5 eluiert.
Beispiel 6: Herstellung eines Antikörpers gegenüber LP-48 Polypeptiden oder Fragmenten hiervon
Ein im wesentlichen reines LP-48 Polypeptid oder Fragment hiervon wird aus transfizierten oder tranformierten Zellen mittels eines der in der Technik gut bekannten Verfahren oder durch ein Verfahren, das hierin spezifisch beschrieben ist. Die Konzentration eines Proteins in einer Endpräparation wird beispielsweise durch Filtration durch eine Amiconfiltervorrichtung filtriert, so dass die Menge etwa 1 bis 5 μg/ml beträgt. Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper kann wie folgt hergestellt werden.
Monoklonale Antikörper können aus Maushybridomen gemäß dem Verfahren von Köhler und Milstein (Köhler und Milstein, Nature 256, 495 (1975)) oder einem modifizierten Verfahren hiervon hergestellt werden. Kurz gesagt werden einer Maus wiederholt wenige Mikrogramm des Peptids, Polypeptids oder Fusionspolypeptids über einen zeitraum von wenigen Wochen gespritzt. Die aus wird dann getötet und die Antikörper-bildenden Zellen der Milz werden isoliert. Die Milzzellen werden durch Polyethylenglycol mit Mausmyelomzellen fusioniert. Fusionierte Zellen, die Antikörper bilden, werden durch jeden geeigneten Immuntest, beispielsweise ELISA identifiziert, wie dies in E. Engvall (Meth. Enzymol. 70: 419 (1980)) beschrieben ist.
Polyklonales Antiserum kann durch gut bekannte Verfahren (siehe beispielsweise J. Vaitukaitis et al., Clin. Endocrinol. Metab. 33: 988 (1971)) hergestellt werden, das die Immunisierung von geeigneten Tieren mit einem oder mehreren der LP-48 Fusionspolypeptide oder Fragmenten hiervon, wie dies hierin beschrieben ist, umfasst. Kleine Dosen (beispielsweise Nanogrammmengen) an Antigen, das an mehreren intradermalen Stellen verabreicht wird, scheint die verlässlichste Methode zu sein.
Beispiel 7: Konstruktion des LP-48-Flag Expressionsvektors
Um die Bestätigung der LP-48 Polypeptidexpression zu erleichtern (ohne die Verwendung von LP-48 Epitop-erkennenden Antikörpern) wird ein bicistronischer Expressionsvektor (pIG1-LP-48F) durch die Insertion einer "internen Ribosomeneintrittstelle"/verbessertes grün fluoreszierendes Protein (IHRES/eGFP) PCR Fragment in den Säugerexpressionsvektor pGTD (B. Gerlitz et al., Biochemical Journal 295: 131 (1993)) konstruiert. Der neue Vektor, als pIG1 bezeichnet, enthält die folgenden Sequenzkennzeichen: Den E1a-reaktiven GBMT Promotor (D.T. Berg et al., BioTechniques 14: 972 (1993), D.T. Berg et al. Nucleic Acids Research 20: 5485 (1992)), eine einzelne BcII cDNA Klonierungsstelle, die IHRES Sequenz vom Encephalomyokarditisvirus (EMCV), die eGFP (Clontech) kodierende Sequenz (Cormack et al., Gene 173: 33 (1996), die kleinen "t" Antigenspleißstellen/Polyadenylierungssequenzen von SV40, ^der frühe Promotor und der Replikationsurspung von SV40, die für das Dihydrofolatreduktasegen (dhfr) der Maus kodierende Sequenz und der pBR322 Ampicillinresistenzmarker/Replikationsursprung.
Ein Primerpaar, das die DNA Sequenz enthält, die durch das Restriktionsenzym BclI an ihren 5' Enden gespalten wird, wird so synthetisiert, dass sie bei einer Verwendung zur Amplifizierung der für das LP-48 Polypeptid kodierenden DNA die DNA Sequenz einbaut, die für das 8 Aminosäuren lange Flag Epitop im Leserahmen mit den DNA Sequenzen, die für LP-48 kodieren, am 3' Terminus des amplifizierten Produkts kodiert (R.M. Micele, et al., J. Immunol. Methods 167: 279 (1994)). Diese Primer werden zur PCR Amplifizierung der für das LP-48 Polypeptid kodierenden DNA verwendet. Das entstehende PCR Produkt (LP-48F) wird dann mit BclI (Restriktionsschnittstellen sind in die Primer eingebaut) und in die BclI Einzelschnittstelle von pIG1 zur Erzeugung des Plasmids pIG1-LP-48F ligiert. Die humane LP-48 cDNA Orientierung und die Nukleotidsequenz können durch Restriktionsverdau und Doppelstrangsequenzierung des Inserts bestätigt werden.
Auf diese Weise wird ein Expressionsvektor, der für ein LP-48 Fusionsprotein kodiert, das das FLAG Polypeptid (SEQ ID Nr. 3) direkt an den C-Terminus des reifen LP-48 Polypeptids fusioniert enthält, erzeugt. Die SEQ ID Nr. 4 zeigt beispielsweise die Aminosäuren 19-197 der SEQ ID Nr. 2 fusioniert an das acht Aminosäuren lange FLAG Tag-Polypeptidepitop (SEQ ID Nr. 3).
Beispiel 8: Konstruktion des LP-48 nicht-Flag Expressionsvektors
Um einen nicht-Flag Expressionsvektor (pIG1-LP-48) zu erzeugen, wird die 24 Basen lange DNA Sequenz, die für das 8 Aminosäuren lange FLAG Epitop kodiert, vom pIG1-LP-48F Konstrukt mittels des Quik Change Mutagenesekits (Stratagene) deletiert. Ein 35 Basenpaare langer Primer und dessen Komplement mit einer Identität zu den 19 Basen langen Sequenzen, die die FLAG Sequenz flankieren, wird synthetisiert und verwendet, um die PCR unter Verwendung des Plasmids als Template zu primen. Das PCR Produkt wird mit der DpnI Restriktionsendonuklease verdaut, um die parenterale DNA zu eliminieren und das verdaute Produkt wird in Epicurean XLI-Blue E. coli Zellen transformiert. Es werden Ampicillin-resistente Transformanden gepickt und die Plasmid DNA wird durch Restriktionsverdau analysiert. Eine präzise Deletion der 24 Basen langen Sequenz wird durch DNA Sequenzierung des pIG1-LP-48 bestätigt. Gemäß der Deletion kodiert die für FLAG kodierende Sequenz pIG1-LP-48 für die Expression des reifen, 179 Aminosäure langen LP-48 Polypeptids (Aminosäuren 19-197 der SEQ ID Nr. 2).
Beispiel 9: Konstruktion von LP-48 Immunglobulinfusionsproteinen
A. Expression von LP-48-FC-Fusion
Das LP-48 wird als Fusionsprotein gekuppelt an eine konstante Immunglobulinregion hergestellt. Die konstante Immunglobulinregion kann genetische Modifikationen enthalten, einschließlich der, die die Effektoraktivität verringern oder eliminieren, die in der Immunglobulinstruktur inhärent ist. (Siehe beispielsweise WO 88 07 089 A, veröffentlicht am 22. September 1988). Kurz gesagt wird die PCR Überlappungsverlängerung angewendet, um die DNA, die für das LP-48 kodiert, mit der DNA zu verbinden, die die Scharnier-, CH2 und CH3 Regionen von humanem IgG1 kodiert. Dies wird erreicht, wie dies in den folgenden Unterabschnitten beschrieben ist.
Ein DNA Fragment, das den DNA Sequenzen entspricht, die das Volllängen LP-48 oder einen Teil hiervon kodieren, wird durch Polymerasekettenreaktion (PCR) mittels Primerpaaren hergestellt, die so entworfen sind, dass Sequenzen amplifizieren, die für LP-48 kodieren, die eine DNA Sequenz 5' zum ATG aufweisen, die angefügt wurde, um eine NdeI Schnittstelle und eine EcoR47III Schnittstelle einzubauen. Eine cDNA, die für die volle Länge kodiert, dient als Matrize zur Amplifizierung von LP-48. Eine PCR Amplifikation mit diesen Primern erzeugt ein DNA Fragment, das eine volle Länge oder einen Teil von LP-48 kodiert. Die Sequenz von humanem IgG1 erhält man über Genbank (Hinterlegungsnummer: HUMIGCC4, Takahashi et al., Cell 29: 671-679, 1982). Diese wird in Exons und eine Region stromaufwärts der natürlichen Scharnierregion eingeteilt, welche als Fusionsstelle gewählt wird. Der 5' Primer wird so entworfen, dass er eine Überlappung für das LP-48 Amplikon umfasst. Der 3' Primer ist zur Fc Region komplementär und umfasst das Translationsstopcodon.
Es werden PCR Reaktionen in 100 μl Endvolumen hergestellt, die sich aus Pfu Polymerase und Puffer (Stratagene) zusammensetzt, die die Primer (jeweils 1 μM), dNTPs (200 jeweils 200 μM) und 1 ng Matritzen DNA zusammensetzt.
Das entstehende Fragment wird dann mit NheI und Eco47II gespalten, die die Einzelschnittstellen erkennen, die in den Vorwärts PCR Primer der ersten PCR Reaktion und den Rückwärts PCR Primer der zweiten PCR Reaktion eingebaut wurden. Das verdaute Fragment wird dann in einen Expressionsvektor pJB02 kloniert, der auch mit diesen Restriktionsenzymen behandelt wurde.
Die Klonierung resultiert in Klonen, die die LP-48-Fc Fusion enthalten. Die Sequenz kann durch DNA Sequenzierung bestätigt werden.
B. Isolierung von stabilen Klonen
Zuerst werden 293 T Zellen angezogen und es wird eine transiente Transfektion mittels Lipofectamin (Gibco-BRL) ausgeführt. Die Charakterisierung des Überstands führt zu einem Protein der Größe, die man für ein Dimer von LP-48-Fc erwarten würde, wobei die Integrität des Konstrukts bestätigt wird. Die Expression des Proteins wird durch einen Western Blot mittels eines Antikörpers gegen humanes IgG1 bestätigt.
Beispiel 10: Reinigung von LP-48 Polypeptiden im großen Maßstab
Es wird eine Reinigung im großen Maßstab von LP-48 Polypeptiden bewirkt, indem man zuerst stabil LP-48 exprimierende Klone in mehreren 10 Liter Rollflaschen anzieht. Nach dem Erreichen der Konfluenz werden die Zellen weitere 2 bis 3 Tage inkubiert, um die maximale Menge an LP-48 in das Medium zu sekretieren. Medium, das LP-48 Polypeptid enthält, wird auf 0,1 % CHAPS eingestellt und in einem Amicon ProFlux M12 Tangentialfiltrationssystem auf 350 ml konzentriert. Das konzentrierte Medium wird bei 19 000 Upm (43 000 × g) für 15 Minuten zentrifugiert und mit einer Flussrate von 8 ml/min über eine SP-5PW TSK-Gel Säule (21,5 mm × 15 cm TosoHaas) gegeben. Die Säule wird mit Puffer A 820 mM MOPS, 0,1 % CHAPS, pH 6,5) gewaschen, bis die Absorption (280 nm) auf die Grundlinie zurückkommt und die gebundenen Proteine werden in einem linearen Gradienten von 0,1 M bis 0,3 M NaCl (in Puffer A) eluiert, der über 85 Minuten entwickelt wird. Fraktionen, die LP-48 Polypeptid enthalten, werden vereinigt und über eine Heparin-5 PW TSK-Gel Säule (7,5 mm × 7,5 cm) gegeben, die in Puffer B (50 mM Tris, 0,1 % CHAPS, 0,3 M NaCl, pH 7,0) äquilibriert ist. Das gebundene Protein wird mit einem linearen Gradienten von 0,3 M bis 1,0 M NaCl (in Puffer B) eluiert, der über 60 Minuten entwickelt. Fraktionen, die LP-48 enthalten, werden vereinigt und über eine 1 cm × 15 cm Vydac C4 Säule gegeben, die mit 0,1 % TFA/H₂O äquilibriert ist. Das gebundene LP-48 Polypeptid wird mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % CH₃CN/0,1 % TFA eluiert. Fraktionen, die das LP-48 Polypeptid enthalten, werden durch SDS-PAGE analysiert und werden zu mehr als 95 % rein befunden und gegen 8 mM NaPO₄, 0,5 M NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,4 dialysiert.
Beispiel 11: Herstellung von transgenen Mäusen, die LP-48 exprimieren
Das LP-48 Genfragment wird aus einem DHFR Vektor durch Asc I und Sal I Verdau ausgeschnitten und im Gel gereinigt. Dieses Fragment wird dann in die MluI und XhoI Schnittstellen von Plasmid pLIV.7 ligiert (bereitgestellt von John Taylor, The J. David Gladstone Institutes), wodurch das Plasmid pLIV7-LP48 erzeugt wird. Das Plasmid pLIV.7 wird von J. Fan et al. beschrieben, wo es zur Herstellung von Plasmid pLivhHL1 verwendet wird (J. Fan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8724, (1994)). pLIV.7 ist zu pLivhHL 1 identisch, wobei die HL (hepatische Lipase) Sequenz entfernt wurde und es die flankierende Region des apo E Genpromotors/5' flankierende Region und eine hepatische Enhancersequenz enthält, die als hepatische Kontrollregion (HCR) bezeichnet wird. Zur Mikroinjektion in Embryos wird ein 6,5 kb DNA Fragment, das das Fusionsgen Apo E Genpromotor – LP-48-hepatische Kontrollregion enthält, aus dem Plasmid pLIV7-LP48 durch einen Verdau mit SalI und SpeI ausgeschnitten und durch Gelelektrophorese und Glaskugelextraktion gereinigt.
Es werden transgene Mäuse mittels etablierter Techniken erzeugt (B. Hogan et al., (1986) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY) wie dies von Fox und Solter (Fox and Solter, Mol. Cell. Biol. 8: 5470 (1988) modifiziert ist). Kurz gesagt wird das 6,5 kb DNA Fragment, das das Fusionsgen Apo E Genpromotor – LP-48-HCR enthält, in die männlichen Pronuklei von frisch fertilisierten Embryos im Einzellstadium (Zygoten) des FVB/N Stamms mikroinjiziert. Die Embryos werden in vitro über Nacht kultiviert, um eine Entwicklung zum Zweizellstadium zu erlauben. Zweizellembryos werden dann in die Eileiter pseudoschwangeren Mäusen vom CD-1 Stamm transplantiert, um eine Entwicklung bis zum Ende zu erlauben. Um auf das Vorkommen des Transgens in den neugeborenen Mäusen zu testen wird ein kleines Stück Zehe von jedem Tier entfernt und mit Proteinase K zur Freisetzung der Nukleinsäuren verdaut. Eine Probe des Zehextrakts wird anschließend einer PCR Analyse mittels humaner LP-48-spezifischer Primer unterzogen, um Transgen-enthaltende "Gründermäuse" zu identifizieren. Transgene Gründermäuse werden gezüchtet, um stabile Linien an Transgenen herzustellen, die Plasmaspiegel von LP-48 Polypeptiden von 2 ng/ml bis 100 μg/ml in Abhängigkeit der Linie aufweisen.
Beispiel 12: LP-48 schützt gegen den LPS-induzierten septischen Schock bei Mäusen
Dieses Beispiel zeigt, dass LP-48 Polypeptide gegen einen durch LPS induzierten septischen Schock bei Mäusen schützen können. Diese Daten zeigen, dass LP-48 Polypeptide bei der Prävention und Behandlung solcher Zustände brauchbar sind.
10 Wochen alten BALB/c Mäuse (Harlan, Indianapolis) werden 175 μg/Maus an LPS durch intravenöse Injektion (die laterale Schwanzvene) verabreicht, um eine Sepsis zu induzieren, wobei 1 Stunde später humanes LP-48 Polypeptid (50 μg) oder (2) 50 μg BSA Kontrolle jeweils intravenös verabreicht werden. Die Überlebensraten der Mäuse werden 24, 48 und 72 Stunden nach der LPS Injektion bestimmt. Das LP-48 Polypeptid zeigt eine relative Überlebensrate von 100 % in einem Experiment und 80 % in einem anderen Experiment. Eine Injektion von BSA zeigt keinen signifikanten Schutz in diesem Modell. Das LP-48 Polypeptid zeigt einen ähnlichen Schutz, wenn das LP-48 Polypeptid subkutan Mäusen 2 Stunden vor der LPS Provokation injiziert wird.
Beispiel 13: Transgene LP-48 Mäuse werden vor LPS-induziertem Tod geschützt
Humanes LP-48 wird in FVB Mäusen gemäß Beispiel 11 exprimiert und LP-48 Protein ist durch ELISA in LP-48 Mausplasma detektierbar. 175 μg an LPS werden intravenös in transgene LP-48 Mäuse oder gleichaltrige FVB Wildtypmäuse injiziert. Die Überlebensraten der Mäuse werden 24, 48 und 72 Stunden nach der LPS Injektion bestimmt. Die transgene LP-48 Maus zeigt eine relative Überlebensrate von 100 % in zwei getrennten Experimenten.
Beispiel 14: LP-48 Polypeptide hemmen die LPS-induzierten Erhöhungen von IFN-γ, IL-12, TNF-α und IL-6 Sekretion
Während der Endotoxämie sind Cytokine zentrale Spieler im Krankheitsprozess (C.A. Dinarello (1996), Curr. Top. Microbiol. Immunol.). Die proinflammatorischen Cytokine IL-12, IFN-γ und TNF-α sind Schlüsselcytokine der generalisierten Shwatzman Reaktion (L.M. Ozmen et al, 1994, J. Exp. Med. 180: 907). TNF-α, IL-12 und IFN-γ werden schnell nach einer LPS Verabreichung induziert und diese Faktoren tragen alle zur Endotoxin-induzierten Letalität bei (J.C. Gutierrez-Ramos et al., 1997, Immunol. 135: 3972). TNF-α ist der primäre Mediator der Mortalität (K. Pfeffer, Cell 73: 457). IFN-γ scheint durch die Förderung der erhöhten Reaktion auf TNF zu wirken, teilweise durch die Verstärkung der Synthese sowohl von TNF als auch seiner Rezeptoren (G.M. Doherty et al., 1992, J. Immunol. 149: 1666). IL-12 kann auch eine kritische Rolle während des Endotoxinschocks spielen, vor allem über die Funktion als Induktor von IFN-γ (Eur. J. Immunol. 25: 672, 1995). 175 μg/Maus an LPS werden gleichaltrigen FVB Wildtypmäusen oder transgenen LP-48 FVB Mäusen intravenös injiziert. Eine solche Dosis an LPS verursacht eine akute Entzündung bei Mäusen und 90 % bis 100 % Todesrate basierend auf den Experimenten. In Reaktion auf die LPS Behandlung werden viele proinflammatorische Cytokine während der ersten mehreren Stunden synthetisiert. Es wird Plasma 0, 1, 3, 6 und 9 Stunden nach der LPS Injektion gewonnen. TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-6, IL-1β, GM-CSF, IL-10 und IL-18 Spiegel werden mittels traditioneller ELISA Verfahren analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die LP-48 Polypeptide IFN-γ, IL-12 und GM-CSF signifikant im Mausplasma verringern. Darüberhinaus werden die TNF-α und IL-6 Spiegel moderat in LP-48 Mäusen im Vergleich zu WT Mäusen 6 und/oder 9 Stunden nach der Behandlung mit LP-48 Polypeptid verringert. Als Schlussfolgerung hemmt LP-48 die Sekretion von IL-12, IFN-γ und GM-CSF und verringert auch TNF-α und IL-6 Spiegel im LPS Modell. Die hierin bereitgestellte Evidenz zeigt, dass die Verabreichung von LP-48 Polypeptiden die Entzündung hemmen kann und eine effektive Therapie bei der Behandlung von humanen entzündlichen Erkrankungen sein kann, einschließlich unter anderem Typ I Diabetes, multiple Sklerose, Leberversagen, septischer Schock, Sepsis, systemischem Entzündungsreaktionssyndrom (SIRS), Ischämie-Reperfusionsverletzung, Endotoxinletalität, Arthritis, Lungenverletzung, entzündliche Darmerkrankung, Morbus Crohn, ARDS oder jeder Erkrankung, die mit der Überproduktion von proinflammatorischen Cytokinen assoziiert ist, einschließlich IL-12, IFN-γ, GM-CSF, IL-6 und TNFα.
Beispiel 15: LP-48 verringert die Apoptose in humanen Endothelzellen
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, können die Effekte von LP-48 Polypeptid bei der Prävention von LPS-induziertem, septischem Schock (Beispiel 12) und Tod (Beispiel 13) teilweise durch die Hemmung von Endothelzellapoptose aufgetreten sein. Studien medizinischer Zustände, die mit Sepsis und einer akuten Lungenverletzung konsistent sind, deuten an, dass eine Exposition gegenüber LPS zu einer Endothelzellapoptose in vivo führen kann (Stefanec Chest 117: 841 (2000)).
Die Effekte von LP-48 Polypeptid auf die Apoptose von Endothelzellen werden in einem Apoptosetest mit humanen Nabelschnurvenenepithelzellen (HUVEC) untersucht. In vitro sind viele humane Endothelzellen gegenüber einer Apoptose durch TNFα nur in Gegenwart von RNA Transkriptionsinhibitoren oder Proteinsyntheseinhibitoren (wie Cycloheximid) gegenüber der Apoptose empfindlich. Das Überleben der HUVEC nach einer Exposition gegenüber TNFα hängt von der Synthese cytoprotektiver Proteine ab. Die Proteinsyntheseinhibitoren verhindern die Synthese dieser Proteine nach der Exposition gegenüber IL-1, LPS oder TNFα (Zen et al., J. Biol. Chem. 274: 28808 (1999), Polunovsky et al., Exp. Cell Res. 214: 584 (1994).
Um Zellen für einen Apoptosetest herzustellen werden gepoolte humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) (Pool P180, Lot Nr. 9F2003) (Clonetics, San Diego, CA) in Endothelzellwachstumsmedium (EGM) mit 2 % FBS (Clonetics) angezogen und bei 37°C und 5 % CO₂, 95 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Nach 2 bis 6 Zellpassagen werden HUVEC mit 1 × 105 Zellen/Vertiefung in Gewebekultur-behandelten Platten mit 6 Vertiefungen mit komplettem EGM (3 ml/Vertiefung) gegeben.
Nach 24 Stunden Inkubation wird das Medium in allen Vertiefungen (3 ml/Vertiefung) gewechselt und es wird LP-48-FLAG Fusionspolypeptid (enthält das FLAG Epitop fusioniert an den nativen C-Terminus von LP-48, wie dies in Beispiel 7 beschrieben wurde) zu den geeigneten Vertiefungen mit 100 oder 200 ng/ml für eine 16 Stunden dauernde Inkubation gegeben, bevor die Apoptose induziert wird.
Die Apoptose wird durch die Zugabe von Cycloheximid (CHX) und TNFα induziert. CHX (ICN Biomedicals) wird als Stammlösung von 5 mg/ml in MeOH an Zellen mit 10 μg/ml verabreicht, wonach eine Inkubation für 30 Minuten erfolgt. Nach der Inkubation in CHX wird den Zellen rekombinantes huma nes TNFα (R+D Systems, Minneapolis, MN) mit 100 ng/ml für eine 24 Stunden Inkubation verabreicht. Es wird eine Apoptose in Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von LP-48 induziert. Negativkontrollen umfassen unbehandelte Zellen, CHX alleine und TNFα alleine.
Nach einer Inkubation mit TNFα wird das Zellmedium (enthält abgelöste Zellen) in 12 × 75 mm Falcon Polypropylenrundbodenröhrchen gesammelt. Um angeheftete Zellen zu ernten wird 1 ml an vorgewärmtem Trypsin/EDTA (0,25 %/1 mM Gibco BRL Life Technologies) zu Monoschichten für eine 3 Minuten dauernde Inkubation bei Raumtemperatur gegeben. Trypsin wird durch die Zugabe von 0,5 ml einer vorgewärmten Trypsinneutralisierungslösung (TNS, Clonetics) inaktiviert. Trypsinierte Zellen werden durch auf- und abpipettieren dispergiert und werden dann mit dem Medium, das die abgelösten Zellen enthält, vereinigt. Die Zellen werden bei 1000 Upm für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Eine Apoptose in den Zellen wird durch Flusscytometrie analysiert. Die Zellpellets werden gewaschen und in 400 μl kaltem Dulbecco's PBS (kein Calcium, kein Magnesium) (Life Technologies) gevortext, worin 0,1 % BSA enthalten sind. Die Zellen werden wie oben pelletiert und durch die Zugabe (und guten Mischung) von 400 μl an Cytofix/Cytoperm (BD Pharmingen) pelletiert. Die Fixierung wird auf Eis bei 4°C für mindestens 45 Minuten ausgeführt. Nach der Fixierung werden die Zellen pelletiert und in 300 μl an 1 × PERMWASH (BD Pharmingen) gewaschen (mit Vortexen). Die Zellen werden erneut zentrifugiert und der Überstand wird entfernt. Anti-aktiv Caspase 3 Antikörperlösung (40 μl) (BD Pharmingen FITC-konjugiertes Kaninchen-anti-aktiv Caspase 3, monoklonal, verdünnt 1:2 in 1 × PERMWASH) wird auf die Zellpellets angewendet. Die Zellen werden mit Antikörper bei 4°C im Dunkeln für 30 Minuten bis 2 Stunden inkubiert. Kaltes PBS/BSA wird dann für einen letzten Waschschritt zugegeben (1 ml). Nach der Zentrifugation werden die Zellen in 0,5 ml an PBS/BSA resuspendiert und gut vor einer Analyse durch einen Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) gevortext. Dann wird eine FACS Analyse auf einem COULTER^® EPICS XL-MCL Flusscytometer (Coulter) ausgeführt. Tote Zellen werden ausgeschlossen und es werden 10 000 Ereignisse aufgezeichnet.
Die Ergebnisse der FACS Analyse sind in Tabelle 2 gezeigt. Der mittlere Prozentsatz der anti-aktiv Caspase 3 Färbung (das heißt der mittlere Prozentsatz der grünen Fluoreszenz an doppelten Proben minus Hintergrund, die aus unbehandelten, gefärbten Zellen erhalten wurden) wird zusammen mit der Standardabweichung gezeigt. Statistische Vergleiche werden (mittels eines t-Tests) zwischen apoptotischen Zellen mit oder ohne LP-48 Vorbehandlung ausgeführt. HUVEC, das mit LP-48 vorbehandelt ist, zeigt eine signifikante Reduktion der Apoptose im Vergleich zu HUVEC, die entweder nicht mit Protein behandelt wurden oder HUVEC, die mit einem nicht-verwandten Kontrollprotein (VEGF oder LP111) behandelt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass LP-48 die Apoptose in Endothelzellen reduzieren kann. Tabelle 2 LP-48 verringert die TNF alpha + CHX induzierte Apoptose in HUVEC
Beispiel 16: LP-48 verringert die durch Staurosporin induzierte Apoptose in Endothelzellen
Wie in Beispiel 15 beschrieben, kann die Apoptose von Endothelzellen in vitro mittels Cycloheximid und TNFα induziert werden. Alternativ dazu kann die Endothelzellapoptose in vitro durch andere Mitel induziert werden, einschließlich unter anderem der Verwendung von Staurosporin, oxidiertem Low Density Lipoprotein und/oder ionisierender Strahlung. Beispielsweise wird oxidiertes Low Density Lipoprotein verwendet, das die frühen Veränderungen induziert, die mit Artherosklerose assoziiert sind, um die Apoptose in HUVEC zu induzieren (Harada-Shiba et al., J. Biol. Chem. 273: 9681 (1998)). Die ionisierende Bestrahlung induziert die Apoptose in vitro in humanen mikrovaskulären und makrovaskulären Zellen auf eine Weise, die in Gegenwart von LPS erhöht ist (Eissner et al., Blood, 86: 4184 (1995)). Die ionisierende Bestrahlung kann auch zur Induktion der Apoptose in vivo verwendet werden. In Studien der intestinalen Bestrahlung beobachtet man bei bestrahlten Mäusen, dass sie eine Apoptose in mikrovaskulären Endothelzellen in Reaktion auf die ionisierende Bestrahlung durchmachen (Paris et al., Science 293: 293 (2001)).
Um die Fähigkeit von LP-48 weiter zu untersuchen, die Apoptose in Endothelzellen zu hemmen, wird das LP-48 Polypeptid in einem Test getestet, worin die Apoptose mit Staurosporin induziert wurde und mittels des APOPercentage^® Apoptosetests (Biocolor Ltd., Belfast, Nordirland) analysiert. In diesem Test werden HUVEC wie oben in Beispiel 15 beschrieben angezogen und in 3 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen angeimpft. Das LP-48-FLAG Fusionspolypeptid (das das FLAG Epitop fusioniert an den nativen C-Terminus von LP-48 enthält, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist) wird zu geeigneten Vertiefungen mit 100 oder 200 ng/ml für eine Inkubation von 16 Stunden gegeben, bevor die Apoptose induziert wird. Die Apoptose wird durch die Behandlung der Zellen mit 1 μg/ml Staurosporin (Sigma) für 1 Stunde induziert. Die Zellen werden gemäß dem APOPercentage^® Apoptosetest gemäß den Anleitungen des Herstellers (Biocolor Ltd., Belfast, Northern Ireland) präpariert und gefärbt.
Wie in Tabelle 3 gezeigt machen HUVEC, die mit LP-48 Protein und Staurosporin behandelt werden, eine weniger signifikante Apoptose durch, als HUVEC, die mit Staurosporin in Abwesenheit des LP-48 Proteins behandelt wurden. Die Ergebnisse dieses Staurosporinapoptosetests zeigen ferner, dass LP-48 die Endothelzellapoptose hemmen kann. Diese Ergebnisse zeigen mit den Ergebnissen des TNFα und CHX Apoptosetests von Beispiel 15 zusammengenommen, dass das LP-48 Protein allgemein die Endothelzellapoptose unabhängig von der Art der Apoptoseinduktion hemmen kann.
Die Fähigkeit des LP-48 Proteins zur Hemmung der Endothelzellapoptose legt nahe, dass die Fähigkeit von LP-48 Protein zum Schützen der Mäuse gegenüber einem durch LPS induzierten septischen Schock auf die Fähigkeit von LP-48 zur Reduktion oder Prävention der Endothelzellapoptose zugerechnet werden kann. Die Verabreichung von LP-48 Polypeptid kann daher eine wirksame Therapie bei der Behandlung von medizinischen Störungen sein, die durch eine Endothelzellapoptose gekennzeichnet sind, einschließlich unter anderem Atherosklerose, Hypertension, kongestives Herzversagen, primärer pulmonaler Bluthochdruck, Sepsis, gram negative Bakteriämie, allergische Reaktionen, allergische Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes, Th1-abhängige Insulitis, Entzündung, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Leberversagen, ARDS, Allotransplantatvaskulpathie und Zustände oder Symptome, die hiermit verwandt sind. Tabelle 3 LP-48 verringert die Staurosporin induzierte Apoptose in HUVEC
Tabelle 4 Bindung von LP-48 an HUVEC
Beispiel 17: LP-48 bindet an die Zelloberfläche von Endothelzellen
HUVEC werden auf die Fähigkeit zur Bindung von LP-48 Polypeptiden in einem Bindungstest mittels LP-48 Polypeptiden und anti-LP-48 Antikörpern untersucht. Das LP-48 Protein wird gemäß den Beispielen 7 und 10 gereinigt. HUVEC werden wie in Beispiel 15 beschrieben angezogen und werden mit 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen angeimpft. Die Zellen werden mit 4 % Pferdeserum in PBS, gefolgt von einer Inkubation mit 5 μg/ml LP-48 für 2 Stunden blockiert. Die Zellen werden als nächstes dreimal gewaschen und dann mit anti-LP-48 Antikörpern oder mit Kontrollantikör pern gegen ein Protein ohne Bezug für 1 Stunde inkubiert. Die Zellen werden dann ausgiebig gewaschen und die Antikörperbindung wird durch einen Radioimmuntest mittels ¹²⁵I-Protein A detektiert.
Wie in Tabelle 4 gezeigt, werden die Antikörper gegen LP-48 als spezifisch an HUVEC bindend detektiert, die mit LP-48 Protein inkubiert wurden, während eine geringe oder keine Bindung für Antikörper gegen LP-48 beobachtet wurde, die auf HUVEC angewendet werden, die nicht mit LP-48 Protein inkubiert wurden. Ebenfalls zeigen Kontrollantikörper eine geringe oder keine Bindung an HUVEC in Gegenwart oder Abwesenheit von LP-48 Protein. Diese Ergebnisse zeigen, dass LP-48 spezifisch an die Zelloberfläche von HUVEC binden kann.
Beispiel 18: Gewebespezifische Bindung des LP-48 Polypeptids
LP-48 Polypeptide werden zum Screenen auf das Vorkommen des Rezeptors in Humangeweben verwendet. Das LP-48 Protein wird jeweils gemäß den Beispielen 7 und 10 exprimiert und gereinigt. Humangewebeschnitte werden mit Paraformaldehyd fixiert. Für die Bindungstests werden die Gewebe mit 2 % Pferdeserum blockiert und mit 2, 10 oder 20 μg/ml humanem LP-48 Polypeptid für 2 Stunden inkubiert. Die Objektträger werden dann dreimal mit PBS gewaschen und als nächstes mit anti-LP-48 oder anti-Flag-Antikörper inkubiert. Die Objektträger werden dreimal mit PBS gewaschen und mit Fluoreszenzkonjugierten sekundären Antikörpern inkubiert. Die spezifische Fluoreszenzintensität wird nach der Subtraktion des für IgG Negativkontrolle erhaltenen Werts dargestellt. Das LP-48 Polypeptid bindet spezifisch an Pankreas, Leber, Milz, Thymus, Lunge, Magen, Plazenta, Blase, Fettgewebe, Nebenniere, Schilddrüse, Blinddarm und Lymphknoten.
Beispiel 19: Identifizierung von LP-48 bindenden Proteinen, einschließlich natürlicher LP-48 Rezeptoren
Die LP-48 Polypeptide können zum Screenen auf Moleküle verwendet werden, die an LP-48 binden oder Moleküle, an die LP-48 bindet. Die Moleküle, die an LP-48 binden, können Agonisten oder Antagonisten von LP-48 sein. Sie umfassen Antikörper, Oligonukleotide, Protein (Rezeptor) oder kleine Moleküle.
Beispielsweise kann ein LP-48 mit einem Flag-Tag mit Zelllysaten von Zellen, die LP-48 Rezeptoren exprimieren dürften, in 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5 % NP-40 und Proteinaseinhibitoren (eine Pille pro 50 ml Puffer, Boehringer Mannheim) bei 4°C für 4 Stunden inkubiert werden. Anti-Flag-Kügelchen (Sigma) können zugegeben werden und das Gemisch wird für weitere 4 Stunden inkubiert. Komplexe können durch Zentrifugation, Waschen mit dem zwanzigfachen Kügelchenvolumen an Bindepuffer und Elution in Fraktionen mit Tris-Glycin Puffer (pH 2,5) gewonnen werden. Ein Teil jeder Fraktion kann durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt werden. Das Gel kann gemäß den Anleitungen des Herstellers mit Silber gefärbt werden (Silberfärbungskit von Novex, San Diego, CA). Pools, die positive Banden aufweisen, können zusammen gepoolt und konzentriert werden. Die gepoolten Proben können erneut auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine PVDF Membran überführt werden. Proteine, die an LP-48 Polypeptide spezifisch binden, können dann durch Mikrosequenzierung gemäß den dem Fachmann bekannten Verfahren identifiziert werden.
Alternativ dazu können LP-48 Rezeptoren mittels Expressionsklonierung identifiziert werden (Kitamura, Intl. J. of Hematology, 67: 351-359 (1998)).
Beispiel 20: Verwendung von LP-48 Polypeptiden zur Behandlung von Typ I Diabetes
Weibliche NOD/Bom Mäuse können von Jackson Lab (Maine) in einem Alter von 9 Wochen bezogen werden und in der Tieranstalt unter herkömmlichen Bedingungen mit einer Standarddiät gehalten werden. Um die Diabetesentwicklung zu beschleunigen werden die Mäuse mit Cyclophosphamid (250 mg/kg i.p.) in einem Alter von 70 Tagen behandelt. Eine Gruppe an Mäusen erhält 50 μg/Maus/Tag an LP-48 durch subkutane Injektion und eine weitere Gruppe an Mäusen erhält 50 μg/Maus/Tag an BSA. Es wird die Uringlucose täglich analysiert und die Hyperglykämie wird durch Blutglucosebestimmungen detektiert. Die Tiere werden im allgemeinen als diabetisch betrachtet, wenn die Blutglucosespiegel über 16,7 mmol/Liter liegen, wie dies durch das Hexokinaseverfahren bestimmt wird. Mit BSA behandelte Mäuse werden nach 10 bis 11 Tagen nach der Cyclophosphamidinjektion mit Diabetes diagnostiziert. Die Mäuse werden am Tag 1, 3, 6 und 9 nach der Cyclophosphamidinjektion für eine Pankreas- und Milzanalyse getötet.
Beispiel 21: Verwendung von LP-48 Polypeptiden zur Behandlung der Lebererkrankung
BALB/c Mäusen (Harlan, Indianapolis) werden in jeder Experimentalgruppe (6 oder 12 Tiere) intravenöse Injektionen (in die laterale Schwanzvene) an 6 mg D-(+)-Galaktosamin (Sigma, 39F-0539) in 100 μl an PBS (GIBCO BRL) und 3 μg an Lipopolysaccharid β von E. coli 026:B6 (LPS) (Difco, 3920-252) in 100 μl PBS verabreicht. Eine Stunde später werden den Tieren intravenöse Injektionen von jeweils entweder (1) LP-48 (50 μg) oder (2) BSA (50 μg) Kontrolle verabreicht. Die Überlebensraten der verschieden behandelten Mäuse werden 24 Stunden nach der LPS Injektion bestimmt. LP-48 Polypeptide schützen 100 % der Mäuse vor einem durch LPS und D-Galactosamin induziertem Tod. Im selben Experiment haben die altersgleichen Wildtypmäuse eine Todesrate von 71 %. Die Behandlung mit BSA zeigt keinen signifikanten Schutz in diesem Modell.
Beispiel 22: Verwendung von LP-48 Polypeptiden zur Behandlung der rheumatoiden Arthritis (RA)
Gemäß der durch Kollagen induzierten Arthritis (CIA) Modell von RA können DBA/1 Mäuse mit Rinderkollagen Typ II im Adjuvans immunisiert und täglich nach dem Einsetzen der Krankheit entweder mit rekombinanten humanen LP-48 Polypeptiden oder mit Kochsalzlösung behandelt werden. Die Mäuse werden auf Pfotenschwellung analysiert und klinisch bewertet. Es wird eine Histologieanalyse ausgeführt. Die Behandlung von etablierter CIA mit LP-48 Polypeptiden kann bei der Hemmung der Pfotenschwellung wie auch der Krankheitsprogression wirksam sein, wie dies durch eine klinische Knorpelbewertung definiert ist.
Beispiel 23: Verwendung von LP-48 Polypeptiden zur Behandlung der Autoimmunerkrankungen, die multiple Sklerose umfassen
Ratten werden durch eine subkutane Injektion in die Hinterfüße mit 0,1 ml MBP Epitop in PBS (1,5 mg/ml) und emulgiert mit einem gleichen Volumen an CFA immunisiert. Eine Gruppe der Tiere erhält 2 mg/kg/Tag LP-48 durch subkutane Injektion und die andere Gruppe erhält eine BSA Kontrolle. Die Ratten werden dann täglich auf klinische Zeichen durch einen Beobachter verfolgt, der das Behandlungsprotokoll nicht kennt. Die EAE wird folgendermaßen bewertet: 0 = klinisch normal, 1 = schlaffer Schwanz, 2 = Paralyse der hinteren Gliedmaße und 3 = Paralyse der vorderen und hinteren Gliedmaße.
Beispiel 24: Verwendung von LP-48 Polypeptiden zur Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen
Spezifische pathogenfreie 5 bis 6 Wochen alte männliche SJL/J Mäuse werden von Jackson Lab bezogen. Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) wird von Sigma Aldrich erhalten. Die TNBS Kolitis wird wie vorher beschrieben induziert (M.F. Neurath et al., 1995, J. Exp. Med. 182: 1281-1290, A, Kitani et al. 2000, J. Exp. Med. 192: 41-52). Kurz gesagt werden 1,5 mg bis 2,0 mg an TNBS in 50 % Ethanol gelöst per rektum verabreicht. Sieben Tage später verlieren die Mäuse kontinuierlich Gewicht und zeigen andere klinische Merkmale der chronischen Kolitis. Für die Studie zur Prävention der Induktion der TNBS Kolitis wird LP-48 durch sc Injektion mit 2 mg/kg/Tag 7 Tage später für 1 Woche verabreicht. Eine Kontrollgruppe besteht aus Mäusen, die Ethanol ohne TNBS erhalten. Das Gewicht jeder Maus wird alle 24 Stunden aufgezeichnet und die Mäuse werden zu multiplen Zeitpunkten zur Untersuchung der histologischen Feststellungen und der Cytokinproduktion getötet.
Beispiel 25: In vitro Test von LP-48 zur Behandlung oder Prävention von ARDS
Eine außer Kontrolle geratene Apoptose und Entzündung können zu einem akuten Atemstressyndrom (ARDS) führen oder, falls mehrere Organe involviert sind, zu einer Sepsis. ARDS wird oft mit anderen schweren Erkrankungen angetroffen. Achtunddreißig Prozent (38 %) an ARDS Fällen treten bei Sepsispatienten auf. Die ARDS Forschungsanstrengungen haben sich auf die proinflammatorischen Cytokine, spezifisch TNF-α, IL-1, IL-6 und IL-8 fokussiert, von denen einige während der ARDS erhöht sind. Experimentelle Behandlungen, die sich um den Cytokinantagonismus drehen, haben Prostaglandin E1, anti-TNF, Antioxidantien und Antiproteasen miteinbezogen. Experimentelle Therapien umfassen eine Verabreichung von Corticosteroiden, Ventilatortherapie (PEEP), Oberflächenersatztherapie und inhalativer Stickstoffoxidtherapie. Unglücklicherweise wurde kein oder nur ein geringer Nutzen bisher klinisch von experimentellen Behandlungen beobachtet. Derzeit gibt es keine von der FDA zugelassene pharmakologische Behandlung von ARDS.
ARDS und Sepsis sind durch eine Überaktivierung von Cytokinwegen charakterisiert, wo eine massive Apoptose und/oder Entzündung der Zellen jeweils in Lungen und multiplen Organen besteht. Kaninchen, die einer Hyperoxie (100 % O₂) für 64 Stunden ausgesetzt sind, entwickeln klinische Symptome, die als sehr ähnlich zu humaner ARDS erkannt wurden. Beispielsweise ist ein molekularer Endpunkt des Hyperoxiemodells eine erhöhte Alveolarpermeabilität gegenüber einem Solut, die quantifiziert werden kann. Um daher die Brauchbarkeit von LP-48 Polypeptiden als Prophylaxe (vor der Provokation) und/oder Behandlung (vor, während und/oder nach der Provokation) zu bestimmen, können die Kaninchen mit Hyperoxie provoziert werden, um die ARDS Symptomatik zu induzieren, die demnach mit LP-48 Polypeptiden behandelt wurde und dann kann die Solutpermeabilität über das Alveolarepithel gemessen werden. LP-48 Polypeptide mit verschiedenen Konzentrationen werden im allgemeinen zu verschiedenen Zeiten verabreicht. Daher können gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung LP-48 Polypeptide bei der Verbesserung der Lungenfunktion bei Sepsis und/oder ARDS Patienten brauchbar sein und die Messungen der Lungenfunktion kann unter anderem den Flüssigkeitstransport über die Alveoli umfassen.
Beispiel 26: Tests für die T Zellproliferation und Aktivität
Die funktionelle Aktivität von LP-48 Polypeptiden und/oder Effekte der LP-48 erkennenden Antikörper können in einem geeignet modifizierten T-Zellproliferations- und Cytokinsekretionstest gemessen werden. Im wesentlichen werden gereinigte T Zellen aus der Milz oder den Lymphknoten (4 × 105) in 200 μl RPMI und 10 % FBS Medien dreifach in Platten mit 96 Vertiefungen angeimpft, die mit unterschiedlichen Konzentrationen an anti-CD 3/anti-CD 28, ConA, PHA oder PMA Ionomycin in Gegenwart und Abwesenheit von LP-48 beschichtet sind. Nach 24, 48 oder 72 Stunden werden die Überstände zur Cytokinanalyse gewonnen und die Zellen werden für 12 Stunden mit 1 μCi an [3H] Thymidin gepulst. Ein Thymidineinbau wird mittels eines Scintillationszählers quantifiziert.
Beispiel 27: Tests für Makrophagenproliferation und Cytokinsekretion
Die funktionelle Aktivität von LP-48 Polypeptiden und/oder Effekte der LP-48 erkennenden Antikörper können in einer geeignet modifizierten Makrophagenproliferation und einem Cytokinsekretionstest gemessen werden. Im wesentlichen gereinigte Makrophagen aus dem Peritoneum, der Milz oder der Leber (i × 10⁵) in 200 μl RPMI und 10 % FBS Medium werden dreifach in Platten mit 96 Vertiefungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an LPS in Gegenwart oder Abwesenheit von LP-48 angeimpft. Nach 24, 48 oder 72 Stunden werden die Überstände für eine Cytokinanalyse gewonnen und die Zellen werden für 12 Stunden mit 1 μCi an [3H] Thymidin gepulst. Der Thymidineinbau wird mittels eines Scintillationszählers quantifiziert.
Beispiel 28: Effekt von LP-48 Polypeptiden auf die T-Zellprimung und die Cytokinbildung in Wildtyp und transgenen LP-48 Mäusen
Die funktionelle Aktivität von LP-48 Polypeptiden und/oder Effekten auf die LP-48 erkennenden Antikörper kann in einem geeignet modifizierten T Zellpriming- und Cytokinbildungstest gemessen werden. Im wesentlichen werden 6 Wochen alte WT und transgene LP-48 Mäuse (4 Mäuse in jeder Gruppe) mit 100 μg KLH oder HEL in komplettem Freundschen Adjuvans (CFA) in die hinteren Fußpfoten immunisiert. CD4 + T Zellen werden aus den ableitenden Lymphknoten gereinigt und in Gegenwart von Antigenpräsentierenden Zellen (APC), unterschiedlichen Konzentrationen an KLH oder HEL und der Gegenwart oder Abwesenheit von LP-48 kultiviert. Die APCs werden aus der Milz von 6 Wochen alten WT und transgenen LP-48 Mäusen isoliert und bestrahlt (3000 rad). Hierdurch werden die T Zellerinnerungsreaktionen getestet. Die Cytokinsekretion durch CD4⁺ T-Zellen von KLH immunisierten Mäusen werden durch ELISA getestet.
Um zu bestimmen, ob der Mechanismus der Reaktion, der mit der LP-48 Behandlung auf der Ebene der APC oder der intrinsischen hyperproliferativen Reaktion der CD4⁺ T-Zellen auftritt, werden KLH-geprimte CD⁴⁺ T-Zellen, die aus transgenen LP-48 und Wildtypmäusen gereinigt werden, auf ihre Erinnerungsreaktion in Gegenwart von Wildtyp oder transgenen LP-48 APC untersucht.
Die Kulturüberstände für die T-Zellerinnerungsreaktionen werden durch ELISA auf die Cytokinbildung getestet. Die Produktionsmengen von Th1 und Th2 Cytokinen werden beobachtet, um zu bestimmen, ob LP-48 entscheidend sowohl in der Th1 als auch Th2 Differenzierung während der Erinnerungsreaktionen involviert ist. Sequenzliste

Claims

Verwendung eines Polypeptids, das die Aminosäuren 19 bis 197 des LP-48 umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention einer durch Entzündung vermittelten Störung bei einem Säuger, worin die Störung ausgewählt ist aus Sepsis, septischem Schock, systemisch entzündlichem Response-Syndrom und akutem Atemstresssyndrom (ARDS).
Verwendung eines Polypeptids, das die Aminosäuren 19 bis 197 des LP-48 umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention einer Störung, die mit der Endothelzellapoptose bei einem Säuger assoziiert ist, worin die Störung ausgewählt ist aus Artherosklerose, Hypertension, kongestivem Herzversagen, primärer, pulmonaler Hypertension, akutem Atemstresssyndrom (ARDS) und einer Allotransplantatvaskulopathie.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Polypeptid eine LP-48 Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Polypeptid ein Fusionsprotein ist, das die Aminosäuren 19 bis 197 des LP-48, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind, und eine Sequenz der konstanten Domäne des Immunglobulins umfasst.
Verwendung nach Anspruch 4, worin das LP-48 Polypeptid die Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist.