DE69837658T2

DE69837658T2 - Zelloberflächenmolekül, das zelladhäsion und signalübertragung vermittelt

Info

Publication number: DE69837658T2
Application number: DE69837658T
Authority: DE
Inventors: Takuya Yokohama-shi TAMATANI; Katsunari Yokohama-shi TEZUKA
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2018-02-28
Also published as: IL131584A; US20030083472A1; AU732378B2; US20120003231A1; CN1618811A; US7247612B2; ID23386A; US20040146506A1; EP0984023B9; ATE360645T1; US8389690B2; US20080248031A1; US7196175B2; NZ337425A; NO994146D0; IL131584A0; SI0984023T1; US7294473B2; CN100400546C; CN1221569C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Zelloberflächenmoleküle von Menschen; Polypeptide und ihre Fragmente, die die Moleküle ausmachen; Gene, die die Polypeptide und die Fragmente codieren; Vektoren, die diese Gene umfassen; Transformanten, in welche die Vektoren eingeführt sind; und Antikörper, die Reaktivität mit den Polypeptiden oder Zelloberflächenmolekülen, welche die Polypeptide umfassen, und Fragmenten davon aufweisen; Arzneimittel, umfassend die Antikörper, und Verwendungen davon und Antikörper-erzeugende Zellen.
Ein lebender Säugerkörper hat Immunantwortsysteme, die pathogene Mikroorganismen (Viren, Bakterien, Parasiten usw.) oder Fremdkörper (beide werden im Folgenden als „Antigen" bezeichnet) entfernen, die in den lebenden Körper eingedrungen sind. Eines davon wird als natürliches Immunantwortsystem bezeichnet, ein anderes als erworbenes Immunantwortsystem. Der Erstere ist ein Ausschlussmechanismus, der Phagocytose durch Phagocyten umfasst (polymorphnucleäre Leukocyten, Monocyten, Makrophagen usw.), Angriff durch natürliche Killer (NK) Zellen und nicht-spezifische Erkennung wie zum Beispiel Opsonisieren von Antigen durch Komplemente. Das Letztere, das erworbene Immunantwortsystem, ist ein Ausschlussmechanismus durch Lymphocyten (hauptsächlich T-Zellen und B-Zellen), welche die Spezifität für das Antigen erworben haben (nämlich aktivierte Lymphocyten). B-Zellen, die Antigenspezifität erworben haben, greifen die Antigene, die außerhalb der Zellen vorkommen, durch Produktion von Antikörpern an, die spezifisch für das Antigen sind. T-Zellen, die Antigenspezifität erworben haben (nämlich aktivierte T-Zellen) werden in Helfer-T-Zellen und cytotoxische T-Zellen (cytotoxische Lymphocyten, CTL) klassifiziert. Die Helfer-T- Zellen regulieren die Differenzierung von B-Zellen und Produktion von Antikörpern und zerstören das Antigen, indem sie mit Phagocyten kooperieren. Die Letzteren, CTLs, greifen mit Virus infizierte Zellen und so weiter alleine an (Experimental Medicine: ERGÄNZUNG, „Bio Science Term Library, Immunity", Yodosha, Seiten 14-17 (1995)).
Dieser Erwerb von Antigenspezifität durch T-Zellen (und zwar die Aktivierung von T-Zellen) wird durch die Erkennung des durch antigenpräsentierende Zellen (APC) wie zum Beispiel Makrophagen, B-Zellen oder dendritische Zellen präsentierten Antigens durch T-Zellen initiiert. Antigenpräsentierende Zellen prozessieren die auf diese Weise einverleibten Antigene und präsentieren diese prozessierten Antigene, indem sie sie an den Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) binden. T-Zellen erhalten ein primäres Signal zur Aktivierung der Zellen (oder zum Erwerb von Spezifität) durch Erkennen der prozessierten Antigene, die durch antigenpräsentierende Zellen durch einen Komplex zwischen T-Zellrezeptor (TcR) und CD3-Antigen, das auf der Oberfläche der Zellmembran existiert (TcR/CD3-Komplex), präsentiert werden.
Das TcR/CD3-Komplex-vermittelte primäre Signal alleine kann T-Zellen jedoch nicht ausreichend aktivieren und führt zu Unresponsiveness oder clonaler Anergie, sodass die Zellen danach nicht mit jeder erhaltenen Stimulation reagieren können. Das Autokrin von Interleukin 2 (IL-2) ist nötig, damit T-Zellen aktiviert werden, damit sie in Antigen-spezifisch T-Zellclone differenziert werden und um zu proliferieren. Bei clonaler Anergie werden T-Zellen inaktiviert, da keine Produktion von IL-2 und keine Zellteilung stattfinden. Die Aktivierung von T-Zellen, begleitet von der Produktion von Cytokinen wie zum Beispiel IL-2, benötigt nämlich das sekundäre Signal nach dem ersten Signal durch den TcR/CD3-Komplex. Dieses sekundäre Signal wird als costimulatorisches Signal bezeichnet.
T-Zellen erhalten dieses sekundäre Signal und übertragen es durch Interaktion (Zelladhäsion) mit anderen Molekülen als MHC oder antigenpräsentierenden Zellen über andere Moleküle als den TcR/CD3-Komplex auf der T-Zelloberfläche in die Zellen. Dieses sekundäre Signal vermeidet Zell-Anergie (clonale Anergie) und aktiviert die Zellen.
Obwohl mancher Teil des Mechanismus der sekundären Signalübertragung zwischen den antigenpräsentierenden Zellen und Lymphocyten wie zum Beispiel der T-Zellen noch nicht im Detail aufgeklärt worden ist, haben Studien bis jetzt offenbart, dass ein wichtiger Faktor für die sekundäre Signalübertragung die Interaktion von CD28 (auch als Tp44, T44 oder 9.3-Antigen bezeichnet), das ein Zelloberflächenmolekül ist, das hauptsächlich auf T-Zellen und Thymuszellen exprimiert wird, mit CD80 (auch als B7-1, B7, BB1 oder B7/BB1 bezeichnet), das ein Zelloberflächenmolekül ist, das auf antigenpräsentierenden Zellen (Makrophagen, Monocyten, dendritischen Zellen usw.) exprimiert wird, und mit CD86 (auch als B7-2 oder B70 bezeichnet) ist, das auch ein Zelloberflächenmolekül auf antigenpräsentierenden Zellen ist (und zwar Zelladhäsion durch die Bindung zwischen diesen Molekülen). Darüber hinaus ist experimentell aufgeklärt worden, dass die Interaktion von cytolytischem T-Lymphocyten-assoziiertem Antigen 4 (CTLA-4), von dessen Expression angenommen wird, dass sie abhängig von dem sekundären Signal erhöht werden kann mit dem CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) (und zwar Zelladhäsion durch die Bindung zwischen diesen Molekülen), auch eine wichtige Rolle in der Regulation der T-Zellaktivierung durch das sekundäre Signal spielt. Mit anderen Worten umfasst die Regulation der T-Zellaktivierung durch die Übertragung des sekundären Signals mindestens die Interaktion zwischen CD28 und CD80/CD86, die Erhöhung der CTLA-4-Expression, von der angenommen wird, dass sie von der Interaktion abhängt, und die Interaktion zwischen CTLA-4 und CD80/CD86.
CD28 ist als ein Co-Stimulatormolekül bekannt, welches das sekundäre Signal (co-stimulatorisches Signal) überträgt, das für die Aktivierung von T-Zellen und für die Vermeidung von Anergie benötigt wird. Das sekundäre Signal, das durch Bindung dieses Moleküls an die co-stimulatorischen Moleküle CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) auf antigenpräsentierenden Zellen übertragen wird (Zelladhäsion durch die Bindung zwischen diesen Molekülen), stabilisiert die mRNA der Th1-Typ-Cytokine und fördert infolgedessen die Produktion von einer großen Menge an Th1-Typ-Cytokinen wie zum Beispiel IL-2, INFγ und TNFα durch T-Zellen. Die Expression von CTLA-4 wird durch das primäre Signal induziert, das über TcR/CD3 übertragen wird, und die Expression wird auch durch das sekundäre Signal verstärkt, das durch Bindung zwischen CD28 und CD80 übertragen wird. Es wird offenbart, dass CTLA-4 diese Signale empfängt, um die T-Zellfunktion zu hemmen, was im Gegensatz zur Aktivierung von T-Zellen durch das sekundäre Signal ist, das durch CD28 übertragen wird.
Menschliches CD28 und CTLA-4 sind Glycoproteine vom Typ I, deren Molekulargewichte 44 kD bzw. 41 bis 43 kD darstellen. Beide haben eine Immunglobulin-ähnliche Domäne, gehören zur Immunglobulin-Superfamilie und weisen sowohl eine Funktion als ein Zelladhäsionsmolekül als auch eine Funktion als ein Signalübertragungsmolekül auf.
Menschliches CD28 bildet ein Homodimer mit einer Disulfidbindung, während CTLA-4 als ein Monomer besteht. Sowohl CD28 als auch CTLA-4-Gene liegen auf dem menschlichen Chromosom „2q33" und auf dem Mauschromosom „1 C" und bestehen aus vier (4) Exons. Menschliches CD28 und CTLA-4 setzen sich auch 220 bzw. 223 Aminosäuren zusammen, einschließlich der Leadersequenzen, und die Aminosäurehomologie zwischen ihnen stellt 20 bis 30% dar.
Die Liganden für CD28 und CTLA-4 sind CD80 (B7-1) und CD86 (B7-2) in Menschen und Mäusen. CTLA-4 hat etwa 20-mal höhere Affinität zu beiden Liganden als CD28. Es wurde herausgefunden, dass die Aminosäuresequenzstrukturen „MYPPPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)", die über Tierarten konserviert sind, für das Binden von CD28 und CTLA-4 an CD80 (B7-1) wichtig sind. Es ist auch berichtet worden, dass, wenn CD28 stimuliert wird, PI3-Kinase (Phosphoinositid 3-Kinase, PI3K) mit dem phosphoryliertem Tyrosinrest in einer partiellen Sequenz „YMNM (Tyr-Met-Asn-Met)" von CD28 assoziiert und dass CD28 eine wichtige Rolle in der intrazellulären Signalübertragung durch diese „YxxM"-Struktur spielt. Darüber hinaus ist berichtet worden, dass CTLA-4 in seiner cytoplasmatischen Region eine Sequenz aufweist, die durch „YxxM" repräsentiert wird, und zwar „YVKM (Tyr-Val-Lys-Met)", und dass, nachdem es stimuliert wurde, SYP mit dieser Sequenz assoziiert.
CD28 wird speziell in Thymocyten und peripheren Blut-T-Zellen exprimiert und CTLA-4 werden spezifisch in aktivierten T-Zellen exprimiert (Cell Engineering: ERGÄNZUNG, „Handbook of Adhesion Molecule", Shujunsha, Seiten 93-102 (1994); a.a.O. Seiten 120-136; Experimental Medicine: ERGÄNZUNG; „BIO SCIENCE Term Library, Immunity", Yodosha, Seiten 94-98 (1995); Experimental Medicine: ERGÄNGZUNG, „BIO SCIENCE Term Library, Intercellular Signal Transduction", Yodosha, Seiten 58-59 (1997); Nihon Rinsho, Bd. 55, Nr. 6, Seiten 215-220 (1997)).
Bei der Regulation der T-Zellfunktion (der Aktivierung und der Hemmung der Funktion der T-Zellen) ist die Bedeutung der Interaktionen zwischen mannigfaltigen Molekülen wie zum Beispiel co-stimulatorischen Molekülen (CD28, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) usw.) und CTLA-4, das mit ihnen kooperiert (mit anderen Worten Zelladhäsion durch das Binden zwischen diesen Molekülen) somit erkannt worden und das hat Aufmerksamkeit auf die Beziehung zwischen diesen Molekülen und Erkrankungen und die Behandlung von Erkrankungen durch Regulation der Funktionen dieser Moleküle gelenkt.
Wie vorstehend beschrieben, hat, obwohl ein lebender Körper sein erworbenes Immunantwortsystem gegen Antigene aktiviert, die Fremdkörper zu dem lebenden Körper (eigen) sind, er auch immunologische Toleranz, indem er keine Immunantwort gegen seine eigenen Komponenten zeigt (Autoantigen). Wenn immunologische Toleranz aus irgendeinem Grund zusammenbricht, tritt eine Immunantwort gegen das Autoantigen auf, Autoantigen-reaktive T-Zellen werden durch den gleichen, vorstehend erwähnten Mechanismus induziert, so dass sie in einen abnormalen Zustand der Immunität fallen, und verschiedene Autoimmunerkrankungen werden hervorgerufen.
Mit anderen Worten, nachdem nicht stimulierte antigenpräsentierende Zellen (APC) in normalen Geweben co-stimulatorische Moleküle nicht exprimieren, wenn das Immunsystem eines lebenden Körpers normal ist, befinden sich T-Zellen im Unresponsiveness-Zustand, um immunologische Toleranz zu bewahren, auch wenn Autoantigen-reaktive T-Zellen, die mit dem Autoantigen reagieren, vorhanden sind. Es ist vorgeschlagen worden, dass im abnormen Immuntätszustand aufgrund eines abnormen Überschusses sowie fortdauernder Expression von co-stimulatorischen Molekülen mehr Autoantigen-reaktive T-Zellen aktiviert werden, so dass dadurch Autoimmunerkrankungen verursacht werden.
Von solchen Gesichtspunkten wurden vor kurzem viele Versuche vorgeschlagen, die verschiedenen Autoimmunerkrankungen durch Modulation der Übertragung der co-stimulatorischen Signale, zum Beispiel des vorstehend erwähnten Übertragungssignals zwischen C28/CTLA-4 und CD80/CD86 zu behandeln.
Es wurde beobachtet, dass CD80, ein co-stimulatorisches Molekül als der Ligand von CD28 und CTLA-4, in den antigenpräsentierenden Zellen am Nidus von Autoimmunerkrankung wie zum Beispiel rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose, autoimmuner Thyroiditis, allergischer Kontakt-Typ-Dermatitis und chronischer entzündlicher Dermatose wie zum Beispiel Lichenplanus und Psoriasis, abnorm exprimiert wird. Aus solchen Beobachtungen sind viele Versuche gemacht worden, die verschiedenen Autoimmunerkrankungen durch Modulation der Funktion von CD80 zu behandeln.
Es wurde vorgeschlagen, die Funktion von CD80 durch Verfahren unter Verwendung eines Antikörpers gegen CD80, von solubilisiertem Protein von CD28, das ein Ligand von CD80 ist, und von solubilisiertem Protein von CTLA-4, das auch ein Ligand von CD80 ist, zu hemmen. Insbesondere basierend auf der Tatsache, dass die Bindungsaffinität von CTLA-4 zu CD80 20-mal oder mehr höher ist als die von CD28, wurden therapeutische Versuche unter Verwendung von „solubilisiertem CTLA-4", insbesondere dem Fusionsprotein (CTLA-4-IgFc), das die extrazelluläre Domäne von „CTLA-4" und die Fc-Region von menschlichem Immunglobulin IgG1 umfasst, in einem Tiermodell sowie klinische Untersuchungen durchgeführt (Nihon Rinsho, Bd. 55, Nr. 6, Seiten 215-220 (1997)).
Wie in 1 bis 5 nachstehend gezeigt, ist in Modelltieren von Autoimmunerkrankungen von therapeutischen Wirkungen von CTLA-4-IgFc berichtet worden.

1. In einer (NZB/NZW)F1-Maus, die ein Modell für menschlichen systemischen Lupus erythematodes (SLE) ist, wurden die Produktion von Autoantikörpern sowie der Beginn der Lupus nephritis durch die Verabreichung von CTLA-4-IgFc vor dem Beginn unterdrückt und die pathologischen Zustände wurden durch Verabreichung des Arzneistoffs sogar nach dem Beginn verbessert (Science, Bd. 125, Seiten 1225-1227 (1994)).
2. Bei experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE), die ein Model für multiple Sklerose (MS) ist, wurde der Beginn durch Kurzzeit-Verabreichung von CTLA-4-IgFc sofort nach der Immunisierung verhindert (J. Clin. Invest., Bd. 95, Seiten 2783-2789 (1995)).
3. In einer NOD („non-obese diabetes") Maus, die ein Modell für Insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM) ist, wurde die Entstehungsrate durch Verabreichung von CTLA-4-IgFc an die 2 oder 3 Wochen alte weibliche Maus für 2 Wochen bemerkenswert verringert (J. Exp. Med., Bd. 181, Seiten 1145-1155 (1995)).
4. Bei Rattennephritis durch Nieren-Glomerulus-Basalmembranimmunität, dem Goodpasture-Nephritismodell, ist die Verbesserung des Symptoms durch die Verabreichung von CTLA-4-IgFc verbessert worden (Eur. J. Immunol., Bd. 24, Nr. 6, Seiten 1249-1254 (1994)).
5. In Kollagen Typ II-induzierter Arthritis (CIA) unter Verwendung einer DBA/1-Maus, die ein Modell für menschliche rheumatoide Arthritis ist, wurde der Beginn der Arthritis durch Verabreichung des Testarzneistoffes zur Zeit der Immunisierung unterdrückt und die Produktion von Autoantikörpern (IgG1 und IgG2) gegen Kollagen wurde gehemmt (Eur. J. Immunol., Bd. 26, Seiten 2320-2328 (1996)).

Die Ergebnisse der Experimente, wie sie vorstehend erwähnt wurden, sind im Detail hinsichtlich des Mechanismus der T-Zellaktivierung durch Interaktion zwischen co-stimulatorischen Molekülen und den verwandten Molekülen (mit anderen Worten die Zelladhäsion durch die Bindung zwischen diesen Molekülen) noch nicht aufgeklärt worden. Andere unbekannte Moleküle könnten an diesem Mechanismus beteiligt sein.
Offenbarung der Erfindung
Pharmazeutika, die zur Behandlung oder Prävention von verschiedenen Erkrankungen wie den vorstehend erwähnten Autoimmunerkrankungen, allergischen Erkrankungen und entzündlichen Erkrankungen nützlich sind, können entwickelt werden, wenn der Mechanismus der Aktivierung von Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen durch Zelladhäsion über die Bindung zwischen Molekülen, die an der Übertragung des sekundären Signals beteiligt sind, das für die Aktivierung von Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen, wie vorstehend erwähnt, essentiell ist und der Mechanismus der Regulation von Lymphocytenfunktion aufgeklärt werden und bekannte oder unbekannte Moleküle, die im Stande sind, Zelladhäsion zu vermitteln, die am Mechanismus und der Übertragung von Signalen beteiligt sind, identifiziert und charakterisiert werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Zelloberflächenmoleküle zu identifizieren, die sowohl die Funktionen des Vermittelns solcher Zelladhäsion als auch der Signalübertragung aufweisen, und ihre strukturellen und biologischen Eigenschaften aufklären. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Pharmazeutika bereitzustellen, die für die Behandlung oder die Prävention von verschiedenen Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen durch Verwendung der neuen Moleküle oder Antikörper gegen diese Moleküle nützlich sind.
Um solche nützlichen Moleküle zu identifizieren, haben sich die Erfinder auf die Tatsache, dass Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen in Autoimmunerkrankungen und allergischen Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen, und die Tatsache konzentriert, dass Zelladhäsion für die Signalübertragung des sekundären Signals (co-stimulatorischen Signals) von antigenpräsentierenden Zellen in Lymphocyten wesentlich sind, und haben geplant, Zelloberflächenmoleküle, die spezifisch auf lymphocytischen Zellen exprimiert werden und die Zelladhäsion vermitteln, zu isolieren und zu identifizieren.
Die hier genannten Erfinder haben monoclonale Antikörper gegen verschiedene Zelloberflächenmoleküle, die auf der Oberfläche von Lymphocytenzellen exprimiert werden, durch Immunisieren von Tieren gegen die lymphocytischen Zellen erhalten und gewünschte Zelloberflächenmoleküle, die Zelladhäsion unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen monoclonalen Antikörper vermitteln, isoliert und identifiziert. Die verwendeten Verfahren werden nachstehend genau beschrieben.
Die hier genannten Erfinder verabreichten zuerst eine Lymphocyten-Zelllinie von Ratte als ein Antigen an Mäuse und erzeugten verschiedene monoclonale Antikörper. Dann wurden die erhaltenen monoclonalen Antikörper mit Lymphocytenzellen von Ratte umgesetzt, die als ein Antigen verwendet wurden, und die Wirkung der an die Zellen verabreichten monoclonalen Antikörper wurde überprüft. Als ein Ergebnis wurde von einem der monoclonalen Antikörper festgestellt, dass er die Ratten-Lymphocytenzellen stark agglutinierte (dieser monoclonale Antikörper wurde als „JTT-1-Antikörper" bezeichnet). Darüber hinaus wurde von einem anderen monoclonalen Antikörper herausgefunden, dass er die Agglutination von Ratten-Lymphocytzellen, die durch den „JTT-1 Antikörper" induziert wurde, stark hemmte (dieser monoclonale Antikörper wurde als „JTT.2-Antikörper" bezeichnet).
Nachdem die Agglutination von Ratten-Lymphocytenzellen durch den „JTT-1 Antikörper" durch Antikörper gegen das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) oder das Lymphocytenfunktions-assoziierte-Antigen-1 (LFA-1) nicht gehemmt war, welche die repräsentativsten, bekannten, auf den Zellen exprimierten Zelladhäsionsmoleküle sind, dachten die hier genannten Erfinder, dass diese Agglutination durch Zelladhäsion durch unbekannte Adhäsionsmoleküle verursacht wurde, welche die Zelladhäsion vermitteln.
Zelloberflächenmoleküle (bezeichnet als „JTT-1-Antigen" und JTT.2-Antigen"), die durch jeden dieser beiden monoclonalen Antikörper erkannt werden, wurden identifiziert, isoliert und charakterisiert.
Zuerst wurden die Analysen der Expressionsmuster des „JTT-1-Antigens" und des JTT.2-Antigens" in verschiedenen Zellen durch Durchfluss-Cytometrie, basierend auf fluoreszierender Antikörpertechnik, unter Verwendung von „JTT-1-Antikörper" und JTT-2-Antikörper" analysiert. Während sowohl „JTT-1-Antigen" und „JTT.2-Antigen" in aktivierten Lymphoblastenzellen (aktivierten T-Lymphoblastenzellen, aktivierten B-Lymphoblastenzellen usw.) stark exprimiert wurden, die durch Stimulierung von Thymocyten und Milzzellen mit Concanavalin A (ConA), einem Mitogen, aktiviert wurden, insbesondere in den aktivierten Lymphoblastenzellen, wurde kaum Expression in Milzzellen festgestellt, die überhaupt nicht stimuliert wurden (diese Zellen werden hierin manchmal als „ruhende Lymphocyten" bezeichnet). Die Expressionsmuster der Moleküle, die sowohl durch den „JTT-1-Antikörper" als auch JTT-2-Antikörper" erkannt wurden, waren fast gleich.
Unter Verwendung einer Affinitätssäule, die durch Binden des „JTT-1-Antikörpers" an Adsorptionsmittel erzeugt wurde, wurden Moleküle, die durch den „JTT-1-Antikörper" gefangen wurden, nämlich „JTT-1-Antigene", aus dem Gemisch an löslichen Zelloberflächenmolekülen gereinigt, das aus den vorstehend beschriebenen Ratten-Lymphocytenzellen hergestellt wurde. Die Molekulargewichte dieser gereinigten „JTT-1-Antigene" wurden durch Immunpräzipitation unter Verwendung von „JTT-1-Antikörper" und JTT-2-Antikörper" und durch SDS-PAGE analysiert. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Moleküle, die sowohl durch den „JTT-1-Antikörper" als auch JTT-2-Antikörper" immunpräzipitiert wurden, die gleichen waren und dass jedes Molekül ein Homodimer war, das unterschiedliche Zuckerketten aufwies. Insbesondere wenn N-gekoppelte Zuckerketten nicht gespalten wurden, wurden die Moleküle als ein Molekül mit etwa 47 kD unter nichtreduzierenden Bedingungen und als zwei Moleküle mit etwa 24 kD und etwa 28 kD unter Reduktionsbedingungen identifiziert; wenn N-gekoppelte Zuckerketten gespalten wurden, wurden die Moleküle als ein Molekül mit etwa 36 kD unter nichtreduzierenden Bedingungen und als ein Molekül mit etwa 20 kD unter reduzierenden Bedingungen identifiziert.
Die Adhäsion von Ratten-Thymocyten an die Platte, die mit dem gereinigten „JTT-1-Antigen" beschichtet war, wurde dann analysiert. Als ein Ergebnis hafteten Thymocyten nur in der Anwesenheit des „JTT-1-Antikörpers" wesentlich an der Platte und die Adhäsion wurde in der gleichzeitigen Anwesenheit des „JTT.2-Antikörpers" erheblich gehemmt, was darauf hindeutet, dass das „JTT-1-Antigen" das die Zelladhäsion vermittelnde Zelloberflächenmolekül ist.
Als Nächstes clonierten die hier genannten Erfinder Gene, die das „JTT-1-Antigen" von Ratte, Mensch und Maus codierten, und analysierten ihre Strukturen.
Als erstes wurde die cDNA, die die gesamte Länge des „Ratten-JTT-1-Antigens" codierte, durch Expressions-Clonierungverfahren unter Verwendung des Panning-Verfahrens unter Verwendung des „JTT-1-Antikörpers" aus der cDNA-Bank isoliert, die aus den Lymphoblasten hergestellt wurde, die aus mit ConA stimulierten Rattenmilzen stammten, und eines ganz neues Rattengen wurde isoliert und durch Bestimmen seiner Nucleotidsequenz durch das Didesoxyverfahren identifiziert. Die cDNA, die die gesamte Länge des „menschlichen JTT-1-Antigens" codierte, wurde durch Plaquehybridisierung unter Verwendung der cDNA, die das so erhaltene „Ratten JTT-1-Antigen" codierte, als eine Sonde auch aus der cDNA-Bank isoliert, die aus ConA-stimulierten menschlichen peripheren Blut-Lymphoblasten stammt, und ein völlig neues menschliches Gen wurde durch Bestimmen seiner Nucleotidsequenz durch das Didesoxyverfahren isoliert und identifiziert. Auf ähnliche Weise wurde die cDNA, die die gesamte Länge des „Maus-JTT-1-Antigens" codiert, aus der cDNA-Bank isoliert, die aus den Lymphoblasten erzeugt wurde, die aus mit ConA stimulierter Mausmilz stammten, und ein völlig neues Mausgen wurde isoliert und durch Bestimmen seiner Nucleotidsequenz durch das Didesoxyverfahren identifiziert. Darüber hinaus wurde die cDNA, die die gesamte Länge der vorstehend erwähnten alternativen Spleiß-Variante des „Ratten-JTT-1-Antigens" codierte, auf ähnliche Weise aus der cDNA-Bank isoliert, die aus der Ratten-Thymom-Zelllinie stammte, und ein anderes völlig neues Rattengen wurde isoliert und durch Bestimmen seiner Nucleotidsequenz durch das Didesoxyverfahren identifiziert.
Es wurde durch Hydrophobie-Plotanalyse der Aminosäuresequenz, die durch die isolierte cDNA des „menschlichen JTT-1-Antigens" codiert wird, festgestellt, dass das „JTT-1-Antigen" ein Transmembranprotein (Zelloberflächenmolekül) ist, das sich aus einer Signalsequenz, einer extrazellulären Region, welche die Glycosylierungsstelle(n) aufweist, einer Transmembranregion und einer intrazellulären Region zusammensetzt. Eine Homologiesuche mit bekannten Molekülen offenbarte, dass die „JTT-1-Antigene" von Ratte, Mensch und Maus keine wesentliche Homologie zu irgendwelchen bekannten Molekülen, einschließlich Zelladhäsionsmolekülen, aufwiesen, was darauf hindeutet, dass sie neue Zelloberflächenmoleküle sind, die Zelladhäsion vermitteln.
Als ein Ergebnis einer Motivsuche, basierend auf der Aminosäuresequenz von „menschlichem JTT-1-Antigen" wurde festgestellt, dass „menschliches JTT-1-Antigen" strukturelle Ähnlichkeit mit dem vorstehend erwähnten „CD28", einem Zelloberflächenmolekül auf Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen, das costimulatorische Signale, die für die T-Zell-Aktivierung wichtig sind, durch Zell-Adhäsion übermittelt und mit „CTLA-4" aufwies, einem Zelloberflächenmolekül auf Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen, welches die Funktionen von aktivierten Lymphocyten wie zum Beispiel aktivierten T-Zellen, die mit dem Signal zusammenarbeiten, regelt.
Die strukturellen Ähnlichkeiten sind wie folgt.

1. 20 oder mehr Aminosäurereste, einschließlich Cysteinreste, sind hoch konserviert.
2. Prolin wiederholende Sequenz „Pro-Pro-Pro (PPP)", wesentlich als die Ligandenbindungsregion, ist in der extrazellulären Region konserviert.
3. Eine Sequenz „Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM)" (Xaa und x stellen irgendeine Aminosäuresequenz dar), die Sequenz, die als die Signalübertragungsregion wesentlich ist, ist in der cytoplasmatischen Region konserviert.

Es wurde unter Verwendung des in situ-Fluoreszenz-Hybridisierungs (FISH) Verfahrens festgestellt, dass der Locus des Gens, das das „Maus-JTT-1-Antigen" codiert, auf dem Mauschromosom „1C3" ist, das die gleiche Stelle wie jene des Maus-„CD28" und „CTLA-4" ist.
Als Nächstes wurde die Wirksamkeit der Therapie von Autoimmunerkrankungen und allergischen Erkrankungen durch Regulation der Funktion von „JTT-1-Antigen" durch Experimente untersucht, in welchen der vorstehend erwähnte „JTT-2-Antikörper" an Modellratten für experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE) und Glomerulus-Basalmembran (GBM)-Nephritis verabreicht wurde. Es wurde festgestellt, dass die pathologischen Zustände in beiden Krankheits-Modelltieren erheblich unterdrückt wurden und dass Autoimmunerkrankungen oder allergische Erkrankungen durch Regulieren der Funktionen des „JTT-1-Antigens" behandelt werden können.
Es wurde auch festgestellt, dass der monoclonale Antikörper gegen „menschliches JTT-1-Antigen" menschliche periphere Lymphocyten erheblich vermehrte und dass die Proliferation in der gleichzeitigen Anwesenheit eines monoclonalen Antikörpers gegen CD3, das einen TcR/CD3-Komplex auf T-Zellen darstellt, der das primäre Signal, das für die T-Zellaktivierung wesentlich ist, von antigenpräsentierenden Zellen erhält, weiter verstärkt wurde, was darauf hinweist, dass das „JTT-1-Antigen" ein Zelloberflächenmolekül ist, das an der Signalübertragung in Lymphocyten beteiligt ist.
Darüber hinaus ist es den hier genannten Erfindern gelungen, ein Fusions-Polypeptid zu erzeugen, das die extrazelluäre Region des „menschlichen JTT-1-Antigens" und die Fc-Region von menschlichem Immunglobulin umfasst. Das Fusions-Polypeptid ist als ein Pharmazeutikum zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, allergischen Erkrankungen und entzündlichen Erkrankungen durch die Regulierung der Funktionen des „JTT-1-Antigens" und/oder von seinem Liganden nützlich.
Darüber hinaus ist es den hier genannten Erfindern gelungen, eine transgene Maus zu erzeugen, in welche ein Gen eingeführt wurde, welches das „JTT-1-Antigen" einer anderen Tierart codiert. Die transgene Maus ist zum Analysieren von genauen Funktionen des „JTT-1-Antigens" und für die Entwicklung von Pharmazeutika zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, allergischen Erkrankungen und entzündlichen Erkrankungen nützlich. Die Erfinder produzierten auch eine Knockout-Maus, in welcher das endogene Gen, welches das „Maus-JTT-1-Antigen" codiert, inaktiviert wurde. Diese Knockout-Maus ist auch für den vorstehen erwähnten Zweck nützlich.
Die vorstehend Erfindung betrifft

(1) ein Nucleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Nucleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, bestehend aus der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz; (b) einem Nucleinsäuremolekül, bestehend aus der Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt; (c) einem Nucleinsäuremolekül, bestehend aus der Nucleotidsequenz von 26 bis 625 von SEQ ID NO:3; und (d) einem Nucleinsäuremolekül, das ein Polypepid codiert, bestehend aus der Aminosäuresequenz von 1 bis 140 der SEQ ID NO: 2.

(3) Ein Gen, das die Nucleinsäure von (1) oder (2) umfasst.
(4) Einen Vektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül von (1) oder (2) oder das Gen nach Anspruch 3.
(5) Eine rekombinante Zelle, in welche der Vektor von (4) eingeführt worden ist.
(6) Die rekombinante Zelle von (5), die durch die internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5725 identifiziert ist.
(7) Ein Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt wird.
(8) Einen Antikörper, der für das Polypeptid nach (7) spezifisch ist, wobei dieser Antikörper ein Antikörper ist, der aus der Gruppe, bestehend aus Ratten-Antikörper, Meerschweinchen-Antikörper, Kaninchen-Antikörper, chimärem Antikörper, humanisiertem Antikörper und menschlichem Antikörper ausgewählt ist.
(9) Den Antikörper nach (8), wobei dieser Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist oder ein Teil des monoclonalen Antikörpers ist, wobei der Teil ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus F(ab')2, Fab' und Fab.
(10) Ein Arzneimittel, umfassend den Antikörper nach (8) oder (9) oder einen Teil des monoclonalen Antikörpers, wie in (9) definiert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
(11) Verwendung des Antikörpers nach (8) oder (9) oder eines Teils des monoclonalen Antikörpers, wie in (9) definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von entzündlichen Krankheiten oder zur Verhinderung dieses Krankheitssymptoms und
(12) eine Antikörper-produzierende Zelle, die den monoclonalen Antikörper von (9) produziert.

Die vorliegende Anmeldung beschreibt Polypeptide, Gene, Antikörper, Vektoren, Transformanten, Arzneimittel, transgene Mäuse, Knockout-Mäuse und so weiter, die für ein neues Säuger-„JTT-1-Antigen" relevant sind, das, wie vorstehend erwähnt, isoliert und identifiziert wurde. Insbesondere werden hierin (1) bis (36) nachstehend beschrieben.

(1) Ein Polypeptid, das ein Zelloberflächenmolekül darstellt, welches die nachstehenden Eigenschaften aufweist, (a) dieses Zellobertlächenmolekül wird mindestens in Thymocyten und Mitogen-stimulierten Lymphoblastenzellen exprimiert, (b) ein Antikörper, der mit diesem Zelloberflächenmolekül reaktiv ist, induziert Adhäsion zwischen Mitogen-stimulierten Lymphoblasten Zellen, (c) ein Antikörper, der mit diesem Zelloberflächenmolekül reaktiv ist, induziert in der Anwesenheit von einem Antikörper gegen CD3 die Proliferation von peripheren Blut-Lymphocyten, (d) dieses Zellobertlächenmolekül hat eine partielle Aminosäuresequenz, dargestellt durch Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe in seiner extrazellulären Region und (e) dieses Zelloberflächenmolekül hat eine teilweise Aminosäuresequenz, dargestellt durch Tyr-Met-Phe-Met in seiner cytoplasmatischen Region.
(2) Das Polypeptid von (1), umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, in welcher ein oder mehrere Aminosäurereste substituiert, deletiert oder hinzugefügt sind.
(3) Das Polypeptid von (1), welches durch eine DNA codiert ist, die mit einer DNA unter stringenten Bedingungen hybridisiert, welche die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
(4) Das Polypeptid von (1), umfassend eine Aminosäuresequenz, die 60% oder mehr Homologie mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
(5) Das Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (4), wobei dieses Zelloberflächenmolekül aus Menschen stammt.
(6) Ein Gen, welches das Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (5) codiert.
(7) Das Gen von (6), wobei dieses Gen eine cDNA ist.
(8) Das Gen von (7), wobei diese cDNA eine Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
(9) Das Gen von (7), wobei diese cDNA eine Nucleotidsequenz umfasst, die den Nucleotidresten 26 bis 625 von SEQ ID NO. 3, den Nucleotidresten 35 bis 637 von SEQ ID NO: 4, den Nucleotidresten 1 bis 603 von SEQ ID NO: 5 oder den Nucleotidresten 35 bis 685 von SEQ ID NO: 6 entspricht.
(10) Ein Vektor, umfassend das Gen von irgendeinem von (6) bis (9).
(11) Eine Transformante, in die der Vektor von (10) eingeführt worden ist.
(12) Eine Transformante, die durch die internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5725 identifiziert ist.
(13) Ein Polypeptidfragment, umfassend eine extrazelluläre Region des Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (5).
(14) Das Polypeptidfragment von (13), wobei dieses Polypeptid ein aus dem Menschen stammendes Polypeptid ist, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
(15) Ein Gen, welches das Polypeptidfragment von (13) oder (14) codiert.
(16) Ein Homodimermolekül, umfassend zwei Polypeptidfragmente, wobei jedes der Fragmente eine extrazelluläre Region des Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (5) umfasst und diese beiden Polypeptidfragmente durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind.
(17) Das Homodimermolekül von (16), wobei dieses Polypeptid ein aus dem Menschen stammendes Polypeptid ist, welches eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
(18) Ein Arzneimittel, umfassend entweder das Polypeptidfragment von (14) oder das Homodimermolekül von (17) oder beide davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
(19) Ein Fusions-Polypeptid, umfassend eine extrazelluläre Region des Polypeptids von irgendeinem von (1) bis (5) und eine konstante Region von einer schweren Kette von menschlichem Immunglobulin (Ig) oder einem Teil der konstanten Region.
(20) Das Fusions-Polypeptid von (19), wobei das Immunglobulin IgG ist.
(21) Das Fusions-Polypeptid von (19), wobei der Teil der konstanten Region eine Gelenk-Region, C2-Domäne und C3-Domäne von IgG umfasst.
(22) Das Fusions-Polypeptid von irgendeinem von (19) bis (21), wobei dieses Polypeptid ein vom Menschen stammendes Polypeptid ist, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
(23) Ein Homodimer-Molekül, umfassend zwei Fusions-Polypeptide von irgendeinem von (19) bis (22), wobei die zwei Polypeptide über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind.
(24) Ein Homodimer-Molekül, umfassend zwei Fusions-Polypeptide von (22), wobei die beiden Polypeptide über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind.
(25) Eine Arzneimittel, umfassend entweder das Fusions-Polypeptid von (22) oder das Homodimer-Molekül von (24) oder beide davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
(26) Das Arzneimittel von (25), wobei dieses Arzneimittel zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen oder allergischen Erkrankungen oder zur Prävention dieses Krankheitssymptoms genützt wird.
(27) Ein Antikörper oder ein Teil davon, der mit dem Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (5), dem Polypeptid-Fragment von (13) oder (14) oder dem Zelloberflächenmolekül, umfassend dieses Polypeptid, reaktiv ist.
(28) Der Antikörper von (27) oder ein Teil davon, wobei dieser Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
(29) Ein monoclonaler Antikörper oder ein Teil davon, der mit dem Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, dem Polypeptidfragment von (14) oder dem vom Menschen stammenden Zelloberflächenmolekül, umfassernd dieses Polypeptid, reaktiv ist.
(30) Ein monoclonaler Antikörper oder ein Teil davon, der mit dem Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (5) oder dem Zelloberflächenmolekül, umfassend dieses Polypeptid, reaktiv ist, wobei die Wirkung dieses monoclonalen Antikörpers auf Mitogen-stimulierte Lymphoblastenzellen im Wesentlichen gleich ist wie die Wirkung eines monoclonalen Antikörpers, der durch ein Hybridom produziert wird, das durch die internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5707 identifiziert wird, auf Mitogen-stimulierte Ratten-Lymphoblastenzellen.
(31) Ein monoclonaler Antikörper oder ein Teil davon, der mit dem Polypeptid von irgendeinem von (1) bis (5) oder dem Zelloberflächenmolekül, umfassend dieses Polypeptid, reaktiv ist, wobei die Wirkung dieses monoclonalen Antikörpers auf Mitogen-stimulierte Lymphoblastenzellen im Wesentlichen gleich ist wie die Wirkung eines monoclonalen Antikörpers, der durch ein Hybridom produziert wird, das durch die internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5708 identifiziert wird auf Mitogen-stimulierte Ratten Lymphoblastenzellen.
(32) Ein Arzneimittel, umfassend den monoclonalen Antikörper von (29) oder einen Teil davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
(33) Das Arzneimittel von (32), wobei dieses Arzneimittel zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen oder allergischen Erkrankungen oder zur Prävention von diesem Krankheitssymptom genützt wird.
(34) Ein Hybridom, das den monoclonalen Antikörper von irgendeinem von (28) bis (31) produziert.
(35) Eine transgene Maus, in welcher ein Gen, welches das Polypeptid von (1) codiert, das ein vom Menschen stammendes Gen ist, umfassend eine Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder ein von Ratten stammendes Gen, umfassend eine Nucleotidsequenz, die den Nucleotidresten 35 bis 637 von SEQ ID NO: 4 entspricht, die in ihr endogenes Gen integriert ist.
(36) Eine Knockout-Maus, in der ihr endogenes Gen, welches das Maus-Polypeptid von Anspruch 1 codiert, umfassend die Aminosäuresequenz, die durch das Gen von SEQ ID NO: 5 codiert ist, auf diese Weise inaktiviert ist, dass dieses Maus-Polypeptid nicht erzeugt wird.

Wie vorstehend beschrieben, ist das Zelloberflächenmolekül der vorliegenden Erfindung („JTT-1-Antigen") an der Zelladhäsion, Signalübertragung in Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen und Regulation der Funktion von aktivierten Lymphocyten beteiligt. Allgemeines Wissen über Lymphocytenzellen, Zelladhäsionsmolekülen und die Beziehung zwischen ihnen und Erkrankungen werden nachstehend nur angemessen für das allgemeine Verständnis dieser biologischen Vorgänge beschrieben, aber das folgende allgemeine Verständnis ist nicht dazu gedacht, die vorliegende Erfindung limitierend zu interpretieren.
Lymphocyten werden grob in zwei Arten eingeteilt, T-Zellen und B-Zellen. Nach der Differenzierung aus multipotenten Stammzellen im Knochenmark zu lymphoiden Stammzellen fließen manche von ihnen ins Blut, um den Thymus zu erreichen. Lymphocyten, die im Thymus differenzieren und gereift sind und die T-Zellen genannt werden (aus dem Thymus stammende T-Zellen), kommen wieder ins Blut und zirkulieren durch den ganzen Körper. Gereifte T-Zellen weisen auf der Oberfläche ein Molekül auf, das CD3 genannt wird. Die Existenz des CD3-Moleküls ist ein Marker, um zu bestimmen, ob die Zellen gereifte T-Zellen sind oder nicht. CD3 ist ein überzeugender T-Zellmarker. Außerdem exprimieren T-Zellen CD4 oder CD8. T-Zellen werden in Helfer-T-Zellen (Th-Zellen), die die Antikörperproduktion durch B-Lymphocyten unterstützen, cytotoxische T-Zellen (Tc-Zellen, CTL) oder Killer-T-Zellen, die an Zielzellen gebunden sind, um sie direkt zu zerstören, Suppressor-T-Zellen, die die Antikörperproduktion durch B-Lymphocyten unterdrücken, und Effektor-T-Zellen, die Effektorsubstanzen wie zum Beispiel Lymphokine sezernieren, um verzögerte Allergie auszulösen, klassifiziert.
B-Zellen stammen aus den lymphoiden Stammzellen, die im Knochenmark differenzieren und gereift sind. B-Zellen sind Antikörper-erzeugende Vorläuferzellen, da sie mit einem geeigneten Stimulus Antikörper erzeugen. B-Zellen weisen Immunglobuline auf ihrer Zelloberfläche auf, die in einer Zelle produziert wurden. Solche Immunglobuline wirken als Rezeptoren für Antigene. Gereifte B-Zellen haben sowohl IgM als auch IgD auf ihrer Oberfläche. Wenn B-Zellen durch Antigenstimulation und Signalen von T-Zellen differenzieren, erhöht sich die Produktion von IgM und seine C-terminalen Zellmembran-Bindungsregion wird verändert, um sezerniert zu werden. Bei ausreichender Stimulation wechseln die Oberflächen-Immunglobuline nicht nur zu IgG, IgE und IgA, sondern es werden auch die Immunglobuline jeder Klasse abgesondert. Das Immunglobulin auf der B-Zelloberfläche ist manchmal als slg dargestellt, die Abkürzung von Oberflächen („surface")-Ig, oder mlg, die Abkürzung von Membran-Ig. Alle Igs auf der Oberfläche der gleichen B-Zellen weisen die gleichen Antigenbindungsstellen auf.
Es gibt Lymphocyten, die als große granuläre Lymphocyten (LGL) oder Null-Zellen bezeichnet werden, die weder T-Zellen noch B-Zellen darstellen. Diese Zellen können Tumorzellen und Virus-infizierte Zellen ohne vorherige Stimulation mit einem Antigen zerstören, was mit dem Fall von cytotoxischen T-Zellen vergleichbar ist. Sie werden daher auch natürliche Killerzellen (NK-Zellen) genannt.
Unter den vorstehend erwähnten T-Zellen sezernieren CD4-positive T-Zellen verschiedene Cytokine, exprimieren Rezeptoren für diese Cytokine neu, vergrößern ihre eigene Größe, beginnen die Zellteilung und prolifierieren, wenn sie mit Antigenen reagieren, die durch antigenpräsentierende Zellen präsentiert werden. Vor diesen Reaktionen auf dem Zellniveau bindet der Komplex der Antigenpeptide auf antigenpräsentierenden Zellen und MHC Klasse II-Moleküle an den entsprechenden T-Zell-Antigenrezeptor (TCR). Das verursacht verschiedene biochemische Veränderungen in den Zellen und das Signal wird in den Zellkern übertragen, um die Transkription von spezifischen DNAs zu beginnen und die entsprechenden Proteine zu erzeugen. Als ein Ergebnis werden Reaktionen auf dem Zellniveau erzeugt. Zum Beispiel erzeugen Zellen, die mit einem Virus infiziert sind, Virusproteine und sie werden durch Proteasomen im Cytoplasma in Peptide abgebaut. Ein Teil der Peptide tritt durch TAP in das endoplasmatische Retikulum ein, bildet einen stabilen Komplex mit MHC Klasse I-Molekülen, die gerade erzeugt wurden, und verlagert sich zu der Zelloberfläche. Das zur Zelloberfläche verlagerte Peptid wird speziell durch CD8-positive T-Zellen erkannt, aber die T-Zellen können die infizierten Zellen in diesem Stadium noch nicht zerstören. Diese T-Zellen, die mit dem Antigen reagiert haben, exprimieren den IL-2-Rezeptor (IL-2R), werden nach IL-2-Aktion in zelluläre CTL-Cytotoxizität differenziert und zerstören ihre Zielzellen, um sie das nächste Mal zu töten, wenn sie dem gleichen Antigen-Peptid/MHC Klasse I-Komplex begegnen. Cytokine, die für die Differenzierung in CTL benötigt werden, sind nicht nur IL-2, sondern auch IFNγ oder andere Cytokine, von denen angenommen wird, dass sie ähnliche Wirkungen haben. Lymphokine, die von T-Zellen sezerniert werden, sind daher für die Differenzierung in CTL notwendig. Die Lymphokine werden als das Ergebnis produziert, dass CD4-positive Th1-Zellen (CD4-positive T-Zellen, die IL-2 oder IFNγ sezernieren) die Antigenpeptide, die aus dem gleichen Virus stammen, mit Klasse II-Molekülen erkennen. In manchen Fällen reagieren CD8-positive T-Zellen ohne Hilfe von CD4-positiven T-Zellen mit Antigenen und erzeugen IL-2 und andere Cytokine. Wenn CD8-positive T-Zellen in CTL differenzieren, vermehren sich die Granula im Cytoplasma. Diese Granula enthalten verschiedene Proteine mit hohem Molekulargewicht, die durch Perforin verkörpert werden. Perforin ähnelt einem Membran-Angriffskomplex (MAC), der sich aus fünf bis neun Komponenten von Komplement zusammensetzt und Löcher in die Zellmembran von Zielzellen macht.
Außerdem enthalten die Granula Serin-Proteasen, LT, Proteoglycan usw. Darüber hinaus, wenn CD8-positive Zellen, die in CTL differenziert sind, Antigenstimulation enthalten, sezernieren sie auch Lymphokine wie zum Beispiel IFNγ, LT, TNF oder IL-2. Darüber hinaus zeigen T-Zellen ein Blasten-Transformationsphänomen, wenn sie mit Hämagglutinin (Phytohämagglutinin, PHA) oder ConA reagieren.
Gereifte T-Zellen, die überhaupt nicht stimuliert sind, werden als ruhende T-Zellen bezeichnet und haben eine kleiner Zellgröße und eine kürzere Lebensdauer, ein paar Tage. Wenn sie Stimulation erhalten, vergrößern sich die Zellen, wie schon vorstehend erwähnt, und neigen dazu mit verschiedenen Arten von Stimulation zu reagieren. Solche T-Zellen werden als aktivierte T-Zellen bezeichnet. Ein Teil der aktivierten T-Zellen wird zu Gedächtnis-T-Zellen, die eine sekundäre Immunreaktion hervorrufen, wenn sie mit der gleichen Antigenstimulation reagieren. Von Gedächtnis-T-Zellen wird angenommen, dass sie für einige Jahre oder Jahrzehnte zirkulierend durch den Körper gehalten werden.
B-Zellen, die überhaupt nicht stimuliert sind, werden wie im Falle der T-Zellen als ruhende B-Zellen bezeichnet und proliferierende B-Zellen, die durch multivalente Antigene oder CD40L stimuliert werden, werden als aktivierte B-Zellen bezeichnet. Nachdem ruhende B-Zellen keine co-stimulatorischen Moleküle aufweisen, die T-Zellen mit Signalen durch TCR stimulieren, wie zum Beispiel B7-1 (CD80) oder B7-2 (CD86), wird angenommen, dass das Präsentieren von Antigenen den ruhenden T-Zellen nur TCR stimuliert und nicht im Stande ist, CD40 Liganden (CD40L) zu exprimieren oder Lymphokine zu erzeugen. Daher wird angenommen, dass aktivierte Helfer-T-Zellen, die mit Antigen stimuliert werden, das durch andere antigenpräsentierende Zellen präsentiert wird, mit dem durch ruhende B-Zellen präsentierten Antigen reagiert. Wenn nämlich ein Antigen eindringt, präsentieren zuerst dendritische Zellen (Zellen, die äußerst dendritischen Fortsätze aufweisen), die B7-Moleküle exprimieren, oder Makrophagen, die durch die Reaktion mit Mikroorganismen aktiviert werden, das Antigen und stimulieren ruhende Helfer-T-Zellen, um sie so zu aktivieren, damit sie CD40L exprimieren. Die aktivierten Helfer-T-Zellen binden dann an ruhende B-Zellen, die das gleiche Antigen präsentieren, und stimulieren ihr CD40. Sobald B-Zellen durch Stimulation mit multivalenten Antigenen oder CD40L aktiviert werden, exprimieren sie auch B7-Moleküle, aktivieren Helfer-T-Zellen durch Stimulation von CD28 auf ihrer Oberfläche mit TCR und ermöglichen es den T-Helferzellen CD40L zu exprimieren oder Lymphokine zu produzieren. B-Zellen, die solche Veränderungen wie die Expansion der Zellgröße aufgrund von Stimulation zeigen, aber keine Antikörpersekretion zeigen, werden aktivierte B-Zellen genannt. Wenn auf diese Weise gereifte B-Zellen Antigene treffen, erhöht sich die IgM-Produktion gemeinsam mit der Stimulation von T-Zellen und die auf diese Weise produzierten IgM-Moleküle werden sezerniert, indem sie sich vom Membrantyp in den sekretorischen Typ verwandeln. Darüber hinaus erzeugen sie isotypische Antikörper anders als IgM, wie zum Beispiel aufgrund humoraler Faktoren aus T-Zellen IgG. Das wird Isotyp-Switching oder Klassen-Switching genannt. B-Zellen, die Antikörper sezernieren, werden Antikörper-sezernierende Zellen genannt. Ein Teil von ihnen wird zu morphologisch charakteristischen Zellen und wird als eine Plasmazelle bezeichnet (Knowledge of Immunology, Ohmsha, (1996)).
In verschiedenen Reaktionen des Immunsystems zeigen im Übrigen die Unterpopulationen von weißen Blutzellen, nämlich T-Lymphocyten, B-Lymphocyten, NK, Neutrophile usw., oft unterschiedliche Dynamiken von einander. Sogar die gleichen Lymphocyten, wie vorstehend erwähnt, zeigen unterschiedliche Dynamiken voneinander, abhängig davon, ob die Zellen aktiviert sind oder ruhen. Diese Fakten deuten auf die Existenz eines Erkennungsmechanismus hin, der für die Unterpopulation von weißen Blutzellen spezifisch ist, ferner auf einen Erkennungsmechanismus, spezifisch für das Zellstadium und insbesondere Zelladhäsionsmoleküle (Zelladhäsionsproteine).
Zelladhäsionsmoleküle oder Zelladhäsionsproteine sind im Allgemeinen die Moleküle, die Zellen während der Entwicklung und Differenzierung von Individuen oder in der Migration von Zellen zu einer lokalen Stelle aneinander haften und sind bekannt dafür, wesentliche Moleküle für die organischen und funktionellen Kontakte in einem lebenden Körper zu sein.
Zelladhäsionsmoleküle werden von ihren strukturellen Eigenschaften her grob in fünf (5) Familien eingeteilt, Immunglobulin-Superfamilie, Integrin-Familie, Selektin-Familie, Cadherin-Familie und CD44-Familie. Adhäsionsmoleküle, die zur Immunglobulin-Superfamilie gehören, werden durch das Vorhandensein von wiederholten Schlaufen-ähnlichen Domänen, die durch Disulfidbrücken gebildet werden, charakterisiert. Beispiele davon sind das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 „ICAM-1" und das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 „VCAM-1". Außerdem sind Adhäsionsmoleküle, die zur Integrinfamilie gehören, durch α/β-Heterodimerstruktur gekennzeichnet. Beispiele davon sind sehr spätes Antigen-1 bis 6 „VLA-1 bis 6", mit Lymphocytenfunktionassoziiertes Antigen-1 „LFA-1", „Mac-1" und „p150/90". Moleküle, die zur Selektin-Familie gehören, weisen in dieser Reihenfolge von N-Terminus eine Lectin-ähnliche Domäne, eine EGF-ähnliche Domäne und eine Komplement-Domäne auf. Beispiele davon sind „E-Selektin" und „P-Selektin." Beispiele der Cadherin-Familie sind „E-Cadherin," „N-Cadherin," und „P-Cadherin" und ein Beispiel der CD44-Familie ist "CD44".
Man weiß, dass die spezifische Funktion dieser Adhäsionsmoleküle die Adhäsion von weißen Blutzellen an vaskuläre Endothelzellen oder von Lymphocyten an antigenpräsentierende Zellen ist. Von neuesten verschiedenen Studien ist langsam klar geworden, dass Adhäsionsmoleküle nicht nur an diesen Funktionen beteiligt sind, sondern auch an verschiedenen Erkrankungen.
Insbesondere gibt es viele Berichte über Krankheiten und Expressionsabnormalitäten von Adhäsionsmolekülen. Zum Beispiel bei rheumatoider Arthritis (RA) war die Expression von sowohl „Mac-1" als auch „p150/95" Berichten zufolge in RA-Synoviocyten verstärkt (Allen, C. et al., Arthritis Rheum., Bd. 32, Seite 947 (1989)). Es ist auch berichtet worden, dass verschiedene Zellen „ICAM-1" stark und ektopisch auf RA-Synovialis exprimieren (Haie, L. et al., Arthritis Rheum., Bd. 32, Seite 22 (1989)). In einem anderen Bericht wird angenommen, dass „ELAM-1" auch an der Adhäsion von Neutrophilen an vaskuläre Endothelzellen beteiligt ist und dass die Überexpression von diesen Molekülen an der Infiltration von Neutrophilen (besonders in Gelenksflüssigkeit) beteiligt war, was in der RA-Gelenksflüssigkeit beobachtet wird (Laffon, A. et al., Arthritis Rheum., Bd. 32, Seite 386 (1989)). Von starker Expression von „CD44" in vaskulären Endothelzellen und Synoviocyten vom A-Typ auf Synovialis wurde berichtet (Heynes, B. et al., Arthritis Rheum., Bd. 34, Seite 1434 (1991)).
Es gibt Berichte über die Beziehung zwischen systemischem Lupus erythematodes (SLE) und der Expressionsabnormalität von Adhäsionsmolekülen. Zum Beispiel war die Adhäsionsfähigkeit von T-Lymphocyten an gezüchtete vaskuläre Endothelzellen Berichten zufolge in SLE-Patienten, verglichen mit gesunden Freiwilligen, geringer. In peripheren Lymphocyten von SLE-Patienten wurden die Adhäsionsmoleküle „ICAM-1 ", „VLA-4" und „IFA-1" stark exprimiert (Haskard, D. O. et al., Rheumatol. Int., Bd. 9, Seite 33 (1989)).
In autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen wurde berichtet, dass „ICAM-1" exprimiert wurde, wenn Schildrüsen-Folikelzellen mit Interferon-γ, Interleukin-1 und Tumornekrosefaktor stimuliert wurden, und dass die Bildung von Gruppen an Folikelzellen und mononucleären Zellen durch anti-„ICAM-1 "-Antikörper gehemmt wurde (Weetman, A. P. et al., Eur. J. Immunol., Bd. 20, Seite 271 (1990)).
Bei Hepatitis wird angenommen, dass die Chancen der Adhäsion zwischen Hepatocyten und entzündlichen Zellen zunimmt, da es zwei Adhäsionswege gibt, „ICAM-1" und „LFA-3" und „LFA-1" und CD2", um dadurch die Präsentation der Antigene und die Aktivierung von entzündlichen Zellen zu fördern. Insbesondere werden bei Hepatitis B „LFA-3"-Moleküle in Hepatocyten stark exprimiert, in welchen die Viren sich aktiv vermehren, und „ICAM-1" korreliert gut mit dem Hepatitisgrad. Es wird daher angenommen, dass „LFA-3" am Ausschluss von Viren beteiligt ist und „ICAM-1" T-Zellen fördert, um Antigen zu präsentieren, sowie die Entzündungsreaktion reguliert. In „ICAM-1"-negativen und HBc-Antigen-positiven Hepatocyten bei chronischer Virusinfektion kann eine Art von Immununempfindlichkeit aufgrund fehlender Interaktion zwischen Lymphocyten und Hepatocyten vorkommen. Es ist auch berichtet worden, dass Serum-„ICAM-1" bei chronischen Leberkrankheiten mit dem Grad der Hepatocytenschädigung korrelieren kann, da die Serum-„ICAM-1 "-Konzentrationen bei akuten Hepatitispatienten, chronisch aktiven Hepatitispatienten und Leberzirrhosepatienten höher waren als in gesunden Freiwilligen und Patienten mit chronisch fortdauernder Hepatitis und die Konzentration im Falle des histologischen Fortschreitens von aktiver Hepatitis hoch war (Mod. Phys., Bd. 15, Nr. 1, Seiten 73-76 (1995)).
In einem Tiermodel von Arteriosklerose wurde die Adhäsion und Invasion von Monocyten und Lymphocyten zum vaskulären Endothel in sehr frühen Stadien am Beginn der Krankheit beobachtet. Es wird daher angenommen, dass die Interaktion dieser Hämocyten mit Endothel der erste Schritt des Beginns von Arteriosklerose ist. Verschiedene Berichte zeigen die Expression von Adhäsionsmolekülen im tatsächlichen Arteriosklerosenidus, einschließlich der Expression von „ICAM-1" im menschlichen Arteriosklerosenidus (Poston, R. N. et al., Am. J. Pathol., Bd. 140, Seite 665 (1992)) und der Expression von „VCAM-1" im Arteriosklerosenidus eines Hypercholesterinämie-Kaninchens (Cybulsky, M. I. & Gimbrone, M. A. Jr., Science, Bd. 251, Seite 788 (1991)). Ein neuer Bericht offenbarte, dass die Expression von „VCAM-1" im menschlichen Arteriosklerosenidus und insbesondere eine starke Expression in glatten Muskelzellen, die zur Intima migrieren, und in Monocyten/Makrophagen beobachtet wurden. Außerdem war die Expression von „MCP-1" im Kaninchen- und menschlichen Arteriosklerosenidus erhöht, was darauf hindeutet, dass „MCP-1" die Bildung des Arteriosklerosenidus durch die Migration von Monocyten/Makrophagen fördert (Current Therapy, Bd. 12, Nr. 8, Seiten 1485-1488 (1994)).
Es ist von der Beziehung zwischen Tumormetastasen und Adhäsionsmolekül-Abnormalität berichtet worden. Zum Beispiel zeigten Krebszellen in denen E-Cadherin vermindert war, starke Invasivität, aber die Invasivität wurde durch Einführen der cDNA von E-Cadherin in die Krebszellen gehemmt und die Durchdringungsfähigkeit wurde wieder erlangt, wenn E-Cadherin-Antiserum zu den Zellen hinzugefügt wurde. Das deutet auf die enge Beziehung zwischen der Abnahme in der Expression von E-Cadherin und der Invasivität von Tumorzellen hin (Frixen, U. H. et al., Bd. 113, Seite 173 (1991)). Bei tatsächlichen klinischen Fällen wird auf die Beziehung zwischen der Abnahme der Expression von E-Cadherin und Metastase in verschiedenen Arten von Krebs wie zum Beispiel Hepatom, Ösophaguskrebs, Magenkrebs und Brustkrebs hingewiesen. Es ist auch berichtet worden, dass „VLA-4"-Moleküle, ein Ligand für „VCAM-1 ", in metastatischem Melanom, Magenkrebs und Brustkrebs hoch exprimiert wurden, was darauf hindeutet, dass dieses Molekül für die Implantation in vaskuläre Endothelzellen bei Metastase genutzt werden könnte. Außerdem ist, basierend auf Experimenten unter Verwendung von verschiedenen Tumorzelllinien berichtet worden, dass Epithelkrebs wie zum Beispiel Magenkrebs, Dickdarmkrebs, Lungenkrebs, Hepatom oder Bauchspeicheldrüsenkrebs an den vaskulären Endothelzellen durch E-Selektin anhaftete (Takada, A. et al., Cancer Res., Bd. 53, Seite 354 (1993)).
Andererseits ist ein therapeutischer Ansatz gemacht worden, um diese Erkrankungen dadurch zu behandeln, dass diese Adhäsionsmoleküle in Angriff genommen werden. Zum Beispiel wurde berichtet, dass anti-Ratten-„ICAM-1"-Antikörper entzündliche Reaktionen im Autoimmun-Arthritismodell von Ratten stark hemmen. Es ist auch berichtet worden, dass die Verabreichung von anti-„ICAM-1 "- Antikörper den Beginn der Arthritis in adjuvanter Synovitis in einem der Tiermodelle von RA hemmte (Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi, Bd. 14, Nr. 6, Seiten 571-577 (1991)). Es wurde ferner berichtet, dass die Metastasenbildung von inokuliertem Tumor erheblich gehemmt war, wenn eine große Menge an Peptiden, die REG-Sequenz aufwiesen, was eine Aminosäuresequenz in einem extrazellulären Matrixprotein ist, die durch manche Integrine erkannt und gebunden wird, an eine Maus mit Gallenblasenkrebs verabreicht wurde, und dass im in vitro-System RGD-Peptide und ein anti-β1-Untereinheiten-Antikörper die Bewegung und Infiltration von Tumorzellen hemmten (Yamada, K. M. et al., Cancer Res., Bd. 50, Seite 4485, (1990)).
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung genau durch Klärung der Bedeutungen der hierin verwendeten Begriffe und der allgemeinen Herstellungsverfahren von Polypeptiden, Fusions-Polypeptiden, Genen, Antikörpern, transgenen Mäusen und Knockout-Mäusen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Die Bedeutung der Begriffe soll jedoch natürlich durch die hierin gegebenen Definitionen nicht als limitierend betrachtet werden.
Hierin verwendetes „Mitogen" wird auch als mitogener Faktor bezeichnet und bedeutet eine Substanz, die Zellteilung induziert. Immunologisch bedeutet es eine Substanz, die Blastogenese von Lymphocyten polyclonal induziert und die Zellteilung induziert. Beispiele davon sind Lektine wie zum Beispiel PHA und PWM, Concanavalin A (ConA), Lipopolysaccharide, Streptolysin S und anti-Lymphocyten-Antikörper. Es ist bekannt, dass Concanavalin A und PHA nur auf T-Lymphocyten wirken, dass Lipopolysaccharide nur auf B-Lymphocyten wirken und dass PWM auf beide Lymphocyten wirkt.
Der hierin verwendete Begriff „Lymphoblastenzelle" wird auch als ein großer Lymphocyt, Lymphoblast oder Immunoblast bezeichnet und bedeutet einen Lymphocyt, der zu einem großen Lymphocyt unter Lymphocyten gehört, die in lymphoiden Gewebe (Lymphknoten, Milz, Thymus, Knochenmark, Lymphgängen, Mandel usw.) und Blut vorhanden sind.
Der hierin verwendete Begriff „aktiverter Lymphocyt" bedeutet zum Beispiel einen nachstehend erwähnten Lymphocyt, ist aber nicht darauf beschränkt. Zum Beispiel bedeutet der Begriff einen Lymphocyt, die durch etwas Stimulation aktiviert wird. Wie vorstehend erwähnt, werden Lymphocyten in T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen klassifiziert. T-Zellen werden in CD4-positive Zellen und CD8-positive Zellen klassifiziert. Daher umfassen die „aktivierten Lymphocyten" der vorliegenden Erfindung hauptsächlich aktivierte T-Zellen, aktivierte B-Zellen und aktivierte natürliche Killerzellen und aktivierte T-Zellen umfassen aktivierte CD4-positive Zellen und aktivierte CD8-positive Zellen.
Nach Reagieren mit Antigenen, die durch antigenpräsentierende Zellen präsentiert werden, sezernieren CD4-positive T-Zellen verschiedene Cytokine, exprimieren Rezeptoren für diese Cytokine neu, vergrößern ihre eigene Größe, beginnen mit der Zellteilung, proliferieren und werden aktiviert. Aktivierte CD4-positive T-Zellen umfassen jene in einem solchen Stadium.
CD8-positive T-Zellen exprimieren IL-2R, wenn sie mit Antigenen reagieren. Wenn IL-2 auf IL-2R wirkt, differenzieren sich die Zellen in CTL, die eine zelluläre Cytotoxizität aufweisen. CTL zerstören ihre Zielzellen, um sie zu töten, wenn sie auf den gleichen Antigenpeptid/MHC-Klasse I-Komplex treffen. Wenn CD8-positive T-Zellen in CTL differenzieren, vergrößern sich die Granula im Cytoplasma. Diese Granula umfassen verschiedene Proteine mit hohem Molekulargewicht, dargestellt durch Perforin. Perforin ähnelt MAC, das aus den fünften bis neunten Komponenten von Komplement zusammengesetzt ist, und macht Löcher in die Zellmembran von Zielzellen. Die Granula umfassen auch Serin-Proteasen, LT und Proteoglycan. Wenn CD-8-positive Zellen Antigen-Stimulation erhalten und in CTL differenzieren, sezernieren sie auch Lymphokine wie zum Beispiel IFNγ, LT, TNF oder IL-2. Aktivierte CD8-positive T-Zellen umfassen jene in einem solchen Stadium.
T-Zellen zeigen Blasten-Bildungsphänomen, wenn sie mit Hämagglutinin (Phytohämagglutinin, PHA) oder Concanavalin A (ConA) reagieren. Aktivierte T-Zellen umfassen jene in einem solchen Stadium.
B-Zellen exprimieren B7-Moleküle, aktivieren Helfer T-Zellen durch Stimulation von CD28 auf ihrer Oberfläche mit TCR, erlauben den Helfer-T-Zellen, CD40L zu exprimieren, oder erzeugen Lymphokine. Wenn die Zellen Stimulation erhalten, verändern sie sich, um ihre Größe auszudehnen oder sich zu vermehren. Aktivierte B-Zellen umfassen jene in einem solchen Stadium. In der vorliegenden Erfindung umfassen aktivierte B-Zellen jene, die Antikörper sezernieren (Antikörpersezerniernde Zellen und Plasmazellen).
Aktivierte natürliche Killerzellen bedeuten jene, die, wie vorstehend erwähnt, cytotoxische Wirkung auf Tumorzellen oder Virus-infizierte Zellen zeigen. In der vorliegenden Erfindung umfassen aktivierte Lymphocyten Thymuszellen, die durch Concanavalin A (ConA) stimuliert werden.
Die hierin verwendeten „aktivierten Lymphoblastenzellen" umfassen einen aktivierten „Lymphoblasten", der erzeugt wird, wenn der vorstehend erwähnte Lymphoblast mit einem vorstehend erwähnten „Mitogen" wie zum Beispiel Concanavalin A stimuliert wird.
Der hierin verwendete Begriff „ruhender Lymphocyt" bedeutet in manchen Fällen einen nicht-aktivierten Lymphocyt, der die Stimulation zur Zellaktivierung nicht erhalten hat, im Gegensatz zu einem vorstehend erwähnten aktivierten Lymphocyt.
Das „Gen" der vorliegenden Erfindung umfasst eine genomische DNA und eine cDNA.
Die „vom Menschen stammende" Substanz der vorliegenden Erfindung umfasst eine natürliche Substanz, die aus einer menschlichen Körperkomponente (Organ, Gewebe, Zelle, Körperflüssigkeit usw.) isoliert wurde, und eine rekombinante Substanz, die durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurde. Wenn die Substanz ein Protein oder ein Polypeptid ist, umfasst die Substanz eine künstliches Protein und Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, bei der eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert oder hinzugefügt sind.
Das „Zelloberflächenmolekül" der vorliegenden Erfindung stammt aus einem Menschen.
Insbesondere ist das „Zelloberflächenmolekül" der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet dadurch, dass es mindestens die nachstehend beschriebenen Eigenschaften aufweist.

(a) das Zelloberflächenmolekül wird mindestens in Thymocyten und Mitogenstimulierten Lymphoblastenzellen exprimiert;
(b) ein Antikörper, der mit dem Zelloberflächenmolekül reaktiv ist, induziert Adhäsion zwischen Mitogen-stimulierten Lymphoblastenzellen;
(c) ein Antikörper, der mit dem Zelloberflächenmolekül reaktiv ist, induziert Proliferation der peripheren Blut-Lymphocyten in der Anwesenheit eines Antikörpers gegen CD3;
(d) das Zelloberflächenmolekül weist eine teilweise Aminosäuresequenz auf, die durch Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe in seiner extrazellulären Region dargestellt wird; und
(e) das Zelloberflächenmolekül weist eine teilweise Aminosäuresequenz auf, die durch Tyr-Met-Phe-Met in seiner cytoplasmatischen Region dargestellt wird. Vorzugsweise umfasst das „Zelloberflächenmolekül" das folgende „Polypeptid" der vorliegenden Erfindung. Das Polypeptid der Erfindung besteht aus der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 2 gezeigt wird.

Ferner wird hierin ein „Polypeptid" beschrieben, welches, wie nachstehend beschrieben, ein „Zelloberflächenmolekül" ausmacht. Beispiele davon sind wie folgt.

(1) Ein Polypeptid, das durch eine DNA codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, die eine Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst;
(2) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die 60% oder mehr Homologie mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist;
(3) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz (nämlich eine Polypeptid, das ein „menschliches JTT-1-Antigen" darstellt, und sein Derivat);
(4) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine Nucleotidsequenz codiert wird, entsprechend den Resten 26 bis 625 von SEQ ID NO: 3 oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen gleich ist wie die Aminosäuresequenz (nämlich ein Polypeptid, das ein „menschliches JTT-1-Antigen" darstellt, und sein Derivat);
(5) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine Nucleotidsequenz entsprechend den Resten 35 bis 637 von SEQ ID NO: 4 codiert wird, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen gleich ist wie die Aminosäuresequenz (nämlich ein Polypeptid, das ein „Ratten-JTT-1-Antigen" darstellt, und sein Derivat);
(6) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine Nucleotidsequenz entsprechend den Resten 1 bis 603 von SEQ ID NO: 5 codiert wird, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen gleich ist wie die Aminosäuresequenz (nämlich ein Polypeptid, welches das „Maus JTT-1-Antigen" darstellt, und sein Derivat);
(7) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine Nucleotidsequenz, entsprechend den Resten 35 bis 685 von SEQ ID NO: 6 codiert wird, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen gleich ist wie die Aminosäuresequenz (nämlich ein Polypeptid, das eine „Mutante des Ratten-JTT-1-Antigens" darstellt, und sein Derivat);
(8) Ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine DNA codiert ist, die ein Polypeptid codiert, das ein Zelloberflächemolekül der vorliegenden Erfindung darstellt, wobei die DNA in die Transformante eingeführt wird, die durch die internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5725 identifiziert ist, oder das eine im Wesentlichen gleiche Aminosäuresequenz aufweist wie die Aminosäuresequenz (nämlich ein Polypeptid, das ein Polypeptid des „menschlichen JTT-1-Antigens" darstellt, und sein Derivat).

Beispiele von „stringenten Bedingungen" sind wie folgt. Wenn einen Sonde mit 50 oder mehr Nucleotiden verwendet wird und Hybridisierung in 0,9% NaCl durchgeführt wird, wird die Standardtemperatur, bei der 50% Dissoziation stattfindet (TM), unter Verwendung der folgenden Formel berechnet und die Temperatur für die Hybridisierung kann gemäß der folgenden Formel berechnet werden. Tm = 82,3°C + 0,41 × (G + C)% – 500/n – 0,61 × (Formamid)%(n bedeutet die Zahl der Nucleotide pro Sonde).
Temperatur = Tm -25°C.
Außerdem, wenn eine Sonde mit 100 oder mehr Nucleotiden (G + C 40 bis 50%) verwendet wird, sollte bedacht werden, dass die Tm, wie in (1) und (2) nachstehend erwähnt, variiert.

(1) Tm senkt sich um etwa 1°C pro 1% Fehlpaarung.
(2) Tm senkt sich um 0,6 bis 0,7°C pro 1% Formamid.

Demgemäß können die Temperaturbedingungen für die Kombination von vollständig komplementären Strängen wie folgt eingestellt werden.

(A) 65 bis 75°C (Formamid nicht hinzugefügt)
(B) 35 bis 45°C (in der Anwesenheit von 50% Formamid)

Die Temperaturbedingungen für die Kombination von unvollständig komplementären Strängen können wie folgt eingestellt werden.

(A) 45 bis 55°C (Formamid nicht hinzugefügt)
(B) 35 bis 42°C (in der Anwesenheit von 30% Formamid)

Die Temperaturbedingungen, wenn eine Sonde mit 23 oder weniger Nucleotiden verwendet wird, können 37°C sein oder können unter Verwendung der folgenden Formel berechnet werden. Temperatur = 2°C × (die Zahl von A + T) + 4°C × (die Zahl von C + G)-5°C.
Hier bedeutet „im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen", ein Polypeptid zu umfassen, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wobei mehrere Aminosäuren, vorzugsweise 1 bis 10 Aminosäuren, insbesondere vorzugsweise 1 bis 5 Aminosäuren, in der im Sequenzprotokoll gezeigten Aminosäuresequenz substituiert, deletiert, und/oder modifiziert sind und ein Polypeptid zu umfassen, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wobei mehrere Aminosäuren, vorzugsweise 1 bis 10 Aminosäuren, insbesondere vorzugsweise 1 bis 5 Aminosäuren, zu der im Sequenzprotokoll gezeigten Aminosäuresequenz hinzugefügt werden, solange das Polypeptid im Wesentlichen die gleichen biologischen Eigenschaften aufweist wie das Polypeptid, welches die im Sequenzprotokoll gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Solche Substitutionen, Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren können durch das übliche Verfahren (Experimental Medicine: ERGÄNZUNG, „Handbook of Genetic Engineering" (1992); usw.) durchgeführt werden.
Beispiele davon sind synthetische Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese (Gapped-Duplex-Verfahren), Punktmutagenese, durch welche eine Punktmutation zufällig durch Behandlung mit Nitrit oder Sulfit eingeführt wird, das Verfahren, durch welches eine Deletionsmutante mit dem BaI31-Enzym und ähnlichem erzeugt wird, Kassetten-Mutagenese, Linker-Scanningverfahren, falsches Einbauverfahren, Fehlpaarungs-Primerverfahren, DNA-Segmentsyntheseverfahren usw.
Die synthetische Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese (Gapped-Duplex-Verfahren) kann zum Beispiel wie folgt durchgeführt werden. Die Region, die mutagenisiert werden soll, wird in den M13-Phagenvektor cloniert, der eine Amber-Mutation aufweist, um die einzelsträngige Phagen-DNA zu erzeugen. Nachdem die RF-I-DNA des M13-Vektors ohne Amber-Mutation durch Restriktionsenzymbehandlung linearisiert wurde, wird die DNA mit der vorstehend erwähnten einzelsträngigen Phagen-DNA gemischt, denaturiert und angelagert, dadurch bildet sich eine „Gapped-Duplex-DNA". Ein synthetisches Oligonucleotid in welches Mutationen eingeführt werden, wird mit der Gapped-Duplex-DNA hybridisiert und die geschlossenen zirkulären doppelsträngigen DNAs werden durch die Reaktionen mit DNA-Polymerase und DNA-Ligase erzeugt. E. coli mutS-Zellen, welchen die Fehlpaarungs-Reparaturaktivität fehlt, werden mit dieser DNA transfiziert. E. coli-Zellen ohne Suppressoraktivität werden mit gezüchteten Phagen infiziert und nur Phagen ohne Amber-Mutation werden durchmustert.
Das Verfahren durch welches eine Punktmutation mit Nitrit eingeführt wird, nützt zum Beispiel das vorstehend erwähnte Prinzip. Wenn DNA mit Nitrit behandelt wird, werden Basen desaminiert und ändern dadurch Adenin zu Hypoxanthin, Cytosin zu Uracil und Guanin zu Xanthin. Wenn desaminierte DNA in Zellen eingeführt wird, werden „A:T" und „G:C" durch „G:C" bzw. „A:T" ersetzt, weil in der DNA-Replikation Hypoxanthin, Uracil und Xanthin ein Basenpaar mit Cytosin, Adenin bzw. Thymin bilden. Tatsächlich werden einzelsträngige DNA-Fragmente, die mit Nitrit behandelt wurden, mit „Gapped-Duplex-DNA" hybridisiert und danach werden Mutantenstämme getrennt, indem sie in der gleichen Weise wie bei synthetischer Oligonuclotid-gerichteter Mutagenese (Gapped-Duplex-Verfahren) manipuliert werden.
Alphabetische dreifache oder einfache Buchstabencodes, die verwendet werden, um Aminosäuren in der vorliegenden Beschreibung oder den Figuren darzustellen, bedeuten die folgenden Aminosäuren. (Gly/G) Glycin, (Ala/A) Alanin, (Val/V) Valin, (Leu/L) Leucin, (Ile/I) Isoleucin, (Ser/S) Serin, (Thr/T) Threonin, (Asp/D) Asparaginsäure, (Glu/E) Glutaminsäure, (Asn/N) Asparagin, (Gln/Q) Glutamin, (Lys/K) Lysine, (Arg/R) Arginin, (Cys/C) Cystein, (Met/M) Methionin, (Phe/F) Phenylalanin, (Tyr/Y) Tyrosin, (Trp/W) Tryptophan, (His/H) Histidin, (Pro/P) Prolin.
Das „ Polypeptid", welches das hierin beschriebene, vorstehend erwähnte „Zelloberflächenmolekül" darstellt, ist ein Transmebranprotein, das die Zellmembran durchdringt, und das „Zelloberflächenmolekül" setzt sich aus ein oder zwei dieser Transmembran-Polypeptide zusammen.
Hier bedeutet ein „Transmembran-Protein" ein Protein, das sich durch die hydrophobe Peptidregion, die die Lipiddoppelschicht der Membran ein- oder mehrmals durchdringt, mit einer Membran verbindet und dessen Struktur als Gesamtes aus drei Hauptregionen aufgebaut ist, das sind die extrazelluäre Region, Transmembran-Region und cytoplasmatische Region, wie sie in vielen Rezeptoren oder Zelloberflächenmolekülen beobachtet wird. Ein solches Transmembranprotein stellt jeden Rezeptor oder jedes Zelloberflächenmolekül in Form eines Monomers, Homodimers, Heteodimers oder Oligomers mit (einer) anderen Kette(n) dar, welches die gleiche oder eine unterschiedliche Aminosäuresequenz aufweist.
Das hierin beschriebene „Polypeptidfragment" ist ein Fragment aus dem vorstehend definierten „Polypeptid" der vorliegenden Erfindung und vorzugsweise der extrazellulären Region des Polypeptids. Eine bis fünf Aminosäuren können, falls erwünscht, zum N-Terminus und/oder C-Terminus dieser Region hinzugefügt werden.
Hier bedeutet eine „extrazelluläre Region" die gesamte oder einen Teil aus der teilweisen Struktur (partielle Region) aus der Gesamtstruktur des vorstehend erwähnten Transmembranproteins, wobei die partielle Struktur außerhalb der Membran besteht. Mit anderen Worten bedeutet sie den gesamten oder einen Teil der Region des Transmembranproteins außer der Region, die in der Membran inkorporiert ist (Transmembranregion), und der Region, die im Cytoplasma nach der Transmembranregion existiert (cytoplasmatische Region).
„Die konstante Region oder ein Teil der konstanten Region der menschlichen schweren Immunglobulin (Ig)-Kette", die hierin verwendet wird, bedeutet die konstante Region oder die Fc-Region der beschriebenen vom Menschen stammenden schweren Immunglobulinkette (H-Kette) oder einen Teil von ihnen. Das Immunglobulin kann jedes Immunglobulin sein, das zu irgendeiner Klasse und irgendeiner Unterklasse gehört. Spezielle Beispiele von Immunglobulin sind IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4), IgM, IgA (IgA1 und IgA2), IgD und IgE. Vorzugsweise ist das Immunglobulin IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4) oder IgM. Beispiele von besonders bevorzugtem Immunglobulin der vorliegenden Erfindung sind jene, die zu aus dem Menschen stammendem IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4) gehören.
Immunglobulin weist eine Y-förmige strukturelle Einheit auf, in welcher vier Ketten, bestehend aus zwei homologen leichten Ketten (L-Ketten) und zwei homologen schweren Ketten (H-Ketten), über Disulfid-Brücken (S-S-Brücken) verbunden sind. Die leichte Kette setzt sich aus der variablen Region (VL) der leichten Kette und der konstanten Region (CL) der leichten Kette zusammen. Die schwere Kette setzt sich aus der variablen Region (VH) der schweren Kette und der konstanten Region (CH) der schweren Kette zusammen.
Die konstante Region der schweren Kette setzt sich aus einigen Domänen zusammen, welche die Aminosäuresequenzen aufweisen, die jeder Klasse (IgG, IgM, IgA, IgD und IgE) und jeder Unterklasse (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4, IgA1 und IgA2) eigen sind.
Die schwere Kette von IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4) setzt sich in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus der VH, CH1-Domäne, Gelenk-Region, CH2-Domäne und CH3-Domäne zusammen.
Auf ähnliche Weise setzt sich die schwere Kette von IgG 1 in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus VH, Cγ₁1-Domäne, Gelenk-Region, Cγ₁2-Domäne und Cγ₁3-Domäne zusammen. Die schwere Kette von IgG2 setzt sich in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus VH, Cγ₂1-Domäne, Gelenk-Region, Cγ₂2-Domäne und Cγ₂3-Domäne zusammen. Die schwere Kette von IgG3 setzt sich in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus VH, Cγ₃1-Domäne, Gelenk-Region, Cγ₃2-Domäne und Cγ₃3-Domäne zusammen. Die schwere Kette von IgG4 setzt sich in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus VH, Cγ₄1-Domäne, Gelenk-Region, Cγ₄2-Domäne und Cγ₄3-Domäne zusammen.
Die schwere Kette von IgA setzt sich in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus VH, Cα1-Domäne, Gelenk-Region, Cα2-Domäne und Cα3-Domäne zusammen.
Auf ähnliche Weise setzt sich die schwere Kette von IgA1 in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus VH, Cα₁1-Domäne, Gelenk-Region, Cα₁2-Domäne und Cα₁3-Domäne zusammen. Die schwere Kette von IgA2 setzt sich in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus VH, Cα₂1-Domäne, Gelenk-Region, Cα₂2-Domäne und Cα₂3-Domäne zusammen.
Die schwere Kette von IgD setzt sich in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus VH, Cδ1-Domäne, Gelenk-Region, Cδ2-Domäne und Cδ3-Domäne zusammen.
Die schwere Kette von IgM setzt sich in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus VH, Cμ1-Domäne, Cμ2-Domäne, Cμ3-Domäne und Cμ4-Domäne zusammen und weist keine Gelenk-Region auf, wie sie in IgG, IgA und IgD beobachtet wird.
Die schwere Kette von IgE setzt sich in dieser Reihenfolge vom N-Terminus aus VH, Cε1-Domäne, Cε2-Domäne, Cε3-Domäne und Cε4-Domäne zusammen und weist keine Gelenk-Region auf, wie sie in IgG, IgA und IgD beobachtet wird.
Wenn zum Beispiel IgG mit Papain behandelt wird, wird es an der etwas N-terminalen Seite nach den Disulfidbrücken gespalten, die in der Gelenk-Region bestehen, wo die Disulfidbrücken die beiden schweren Ketten verbinden, um zwei homologe Fab, in welchen ein schweres Kettenfragment, das sich aus VH und CH1 zusammensetzt, mit einer leichten Kette über eine Disulfidbrücke verbunden ist und ein Fc zu erzeugen, in welchem zwei homolge schwere Kettenfragmente, die aus der Gelenk-Region, CH2-Domäne und CH3-Domäne zusammengesetzt sind, durch Disulfidbrücken verbunden sind (siehe „Immunology Illustrated", 2. Originalauflage, Nankodo, Seiten 65-75 (1992); und „Focus of Newest Medical Science „Recognition Mechanism of Immune System", Nankodo, Seiten 4-7 (1991); usw.).
Wie hierin beschrieben, bedeutet „ein Teil einer konstanten Region der schweren Immunglobulinkette" nämlich einen Teil einer konstanten Region einer schweren Immunglobulinkette, der die vorstehend erwähnten strukturellen Eigenschaften aufweist und ist vorzugsweise die konstante Region ohne C1-Domäne oder die Fc-Region. Insbesondere sind Beispiele davon die Region, die sich jeweils aus Gelenk-Region, C2-Domäne und C3-Domäne von IgG, IgA und IgD zusammensetzt, und die Region, die sich jeweils aus C2-Domäne, C3-Domäne und C4-Domäne von IgM und IgE zusammensetzt. Ein besonders bevorzugtes Beispiel davon ist die Fc-Region des aus dem Menschen stammenden IgG1.
Das hierin beschriebene „Fusions-Polypeptid" ist jenes, das sich aus der extrazellulären Region des „Polypeptids", welches das vorstehend beschriebene „Zelloberflächenmolekül" darstellt, und „einer konstanten Region oder einem Teil einer konstanten Region der schweren Kette des menschlichen Immunglobulins (Ig) zusammensetzt. Vorzugsweise ist es ein Fusions-Polypeptid, bestehend aus einer extrazellulären Region eines hierin beschriebenen Polypeptids und einem Teil einer konstanten Region der menschlichen schweren IgG-Kette, und insbesondere bevorzugt ist es ein Fusions-Polypeptid, bestehend aus einer extrazellulären Region eines hierin beschriebenen Polypeptids und der Region (Fc), bestehend aus einer Gelenk-Region, CH2-Domäne und CH3-Domäne der menschlichen schweren IgG-Kette. Darüber hinaus ist IgG bevorzugt IgG1. Außerdem wird ein aus Mensch, Maus oder Ratte (vorzugsweise Mensch) stammendes Polypeptid als das hierin beschriebene Polypeptid bevorzugt.
Das hierin beschriebene Fusionspolypeptid hat den Vorteil, das das Fusions-Polypeptid äußerst leicht unter Verwendung von Affinitätssäulen-Chromatographie unter Verwendung der Eigenschaft von Protein A gereinigt werden kann, das spezifisch an das Immunglobulin-Fragment bindet, da das Fusions-Polypeptid einen Teil einer konstanten Region (zum Beispiel Fc) eines Immunglobulins wie zum Beispiel vorstehend erwähntes IgG als einen Fusionspartner aufweist. Darüber hinaus kann ein Immuntest für die Fusions-Polypeptide leicht mit Antikörpern gegen Fc durchgeführt werden, da verschiedene Antikörper gegen Fc von verschiedenen Immuglobulinen erhältlich sind.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, Polypeptid-Fragmente und Fusions-Polypeptide, wie sie hierin beschrieben sind, können nicht nur, wie nachstehend erwähnt, durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden, sondern auch durch ein Verfahren, das im Fachgebiet gut bekannt ist, wie zum Beispiel ein chemisches synthetisches Verfahren und ein Zellkulturverfahren oder ein modifiziertes Verfahren davon. Das Polypeptid der Erfindung besteht aus der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 2 gezeigt wird. Das „Gen" umfasst eine DNA, die das vorstehend erwähnte Polypeptid oder Polypeptid-Fragment codiert, und umfasst jedes Gen, welches eine Nucleotidsequenz aufweist, die das hierin beschriebenen Polypeptid oder Polypeptid-Fragment codiert.
Beispiele des Gens, welches das vorstehend beschrieben Polypeptid oder Polypeptid-Fragment codiert, werden nachstehend erwähnt.

(1) Ein Polypeptid, das durch eine DNA codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, die eine Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst;
(2) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die 60% oder mehr Homologie mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist;
(3) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz (nämlich eine Polypeptid, das ein „menschliches JTT-1-Antigen" darstellt, und sein Derivat);
(4) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine Nucleotidsequenz entsprechend den Resten 26-625 von SEQ ID NO: 3 codiert wird, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen gleich ist wie die Aminosäuresequenz (nämlich ein Polypeptid, das ein „menschliches JTT-1-Antigen" darstellt, und sein Derivat);
(5) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine Nucleotidsequenz entsprechend den Resten 35-637 von SEQ ID NO: 4 codiert wird, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen gleich ist wie die Aminosäuresequenz (nämlich ein Polypeptid, das ein „Ratten-JTT-1-Antigen" darstellt und sein Derivat);
(6) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine Nucleotidsequenz entsprechend den Resten 1-603 von SEQ ID NO: 5 codiert wird, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen gleich ist wie die Aminosäuresequenz (nämlich ein Polypeptid, welches das „Maus-JTT-1-Antigen" darstellt, und sein Derivat);
(7) Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine Nucleotidsequenz entsprechend den Resten 35-685 von SEQ ID NO: 6 codiert wird, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen gleich ist wie die Aminosäuresequenz (nämlich ein Polypeptid, das eine „Mutante des Ratten-JTT-1-Antigens" darstellt, und sein Derivat);
(8) Ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz aufweist, die durch eine DNA codiert ist, die ein Polypeptid codiert, das das Zelloberflächemolekül der vorliegenden Erfindung darstellt, wobei die DNA in die Transformante eingeführt wird, die durch die internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5725 identifiziert wird, oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen gleich ist wie diese Aminosäuresequenz (nämlich ein Polypeptid, das das „menschliche JTT-1-Antigen" darstellt, und sein Derivat).

Hier hat „im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz" die Bedeutung, wie sie vorstehend definiert ist.
Spezifische Beispiele des Gens der vorliegenden Erfindung sind Gene, die ein Nucleinsäuremolekül, wie nachstehend erwähnt, umfassen.

(1) Eine DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1;
(2) Eine DNA, bestehend aus der Nucleotidsequenz aus den Nucleotidresten 26 – 625 von SEQ ID NO: 3;
(3) Eine DNA, die ein Polypeptid codiert, das ein Zelloberflächenmolekül der vorliegenden Erfindung darstellt, wobei die DNA in eine Transformante eingeführt wird, die durch die internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5725 identifiziert wird.

Die DNA, die einen Teil einer konstanten Region einer schweren Immunglobulinkette codiert, die ein Teil eines hierin vorstehend beschriebenen Fusions-Polypeptids ist, kann cDNA oder genomische DNA sein, bestehend aus Introns zwischen jedem Exon (die DNA, die zum Beispiel die CH1-Domäne, Gelenk-Domäne, CH2-Domäne, CH3-Domäne, CH4-Domäne usw. codiert).
Die DNA der vorliegenden Erfindung umfasst jede DNA, die sich aus irgendwelchen Codons zusammensetzt, solange diese Codons die gleichen Aminosäuren codieren.
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann eine DNA sein, die durch irgendein Verfahren erhalten wird. Zum Beispiel umfasst die DNA komplementäre DNA (cDNA), die aus mRNA hergestellt wird, DNA, die aus genomischer DNA erzeugt wird, DNA, die durch chemische Synthese erzeugt wird, DNA, die durch PCR-Amplifikation mit RNA oder DNA als eine Matrize erhalten wird, und DNA, die durch geeignetes kombinieren dieser Verfahren konstruiert wird.
Die DNA, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, kann durch das herkömmliche Verfahren wie zum Beispiel ein Verfahren zum Clonieren von cDNA aus mRNA erhalten werden, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, durch ein Verfahren, um genomische DNA zu isolieren und dann zu spleißen, durch chemische Synthese usw.

(1) cDNA kann zum Beispiel durch das nachstehend beschriebene Verfahren aus der mRNA cloniert werden, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.

Zuerst wird die mRNA, die ein Zellobertlächenmolekül (Polypeptid) der vorliegenden Erfindung codiert, aus Geweben oder Zellen (zum Beispiel Thymuszellen oder aus der Milz stammenden Lymphoblasten Zellen, die mit ConA stimuliert werden) präpariert, die ein Zellobertlächenmolekül (Polypeptid) der vorliegenden Erfindung exprimieren und herstellen. mRNA kann durch Isolieren von Gesamt-RNA durch ein bekanntes Verfahren wie zum Beispiel das Guanidin-Thiocyanat-Verfahren (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry, Bd. 18, Seite 5294, 1979), das heiße Phenol-Verfahren oder AGPC-Verfahren und durch Durchführung einer Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Oligo-dT-Cellulose oder Poly-U-Sepharose hergestellt werden.
Dann wird mit der als eine Matrize erhaltenen mRNA cDNA synthetisiert, zum Beispiel durch ein gut bekanntes Verfahren unter Verwendung von reverser Transkriptase, wie zum Beispiel das Verfahren von Okayama et al., (Mol. Cell. Biol. Bd. 2, Seite 161 (1982); a.a.O. Bd. 3, Seite 280 (1983)) oder das Verfahren von Hoffman et al., (Gene Bd. 25, Seite 263 (1983)) und in doppelsträngige cDNA umgewandelt. Eine cDNA-Bank wird durch Transformieren von E. coli mit Plasmid-Vektoren, Phagen-Vektoren oder Cosmid-Vektoren, die diese cDNA aufweisen oder durch Transfektion von E. coli nach in vitro-Verpackung erzeugt.
Die in dieser Erfindung verwendeten Plasmid-Vektoren sind nicht beschränkt, solange sie in den Wirten repliziert und beibehalten werden. Alle Phagenvektoren, die in Wirten repliziert werden können, können auch verwendet werden. Beispiele von normalerweise verwendeten Clonierungsvektoren sind pME18s, λZAPII (IZAPII), pUC19, λ gt10, λ gt11 usw. Wenn der Vektor, wie nachstehend erwähnt, für eine immunologische Durchmusterung angewandt wird, wird der Vektor, der einen Promotor aufweist, der ein das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codierendes Gen in einem Wirt exprimieren kann, vorzugsweise verwendet.
cDNA kann in ein Plasmid zum Beispiel durch das Verfahren von Maniatis et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 1.53, 1989) inseriert werden. cDNA kann in einen Phagen-Vektor zum Beispiel durch das Verfahren von Hyunh et al., (DNA Cloning, a practical approach, Bd. 1, Seite 49 (1985)) inseriert werden. Diese Verfahren können einfach unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Clonierungskits (zum Beispiel eines Produkts von Takara Shuzo) durchgeführt werden. Das/Der auf diese Weise erhaltene rekombinante Plasmid oder Phagen-Vektor wird in geeignete Wirtszellen wie zum Beispiel einen Prokaryont eingeführt (zum Beispiel E. coli: XL1Blue MRF', DH5α, HB101, MC1061/P3 usw.).
Beispiele eines Verfahrens zum Einführen eines Plasmids in einen Wirt sind das Calcium-Chloridverfahren, Calcium-Chlorid/Rubidium-Chloridverfahren, beschrieben in Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 1.74 (1989)), und das Elektroporationsverfahren. Phagen-Vektoren können in Wirtszellen zum Beispiel durch ein Verfahren eingeführt werden, in welchem die Phagen-DNAs in gezüchtete Wirte nach in vitro-Verpackung eingeführt werden. In vitro Verpackung kann leicht mit im Handel erhältlichen in vitro-Verpackungskits (zum Beispiel einem Produkt von Stratagene oder Amersham) durchgeführt werden.
Die cDNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann aus der cDNA-Bank isoliert werden, die so gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren durch Kombination von allgemeinen cDNA-Durchmusterungsverfahren erzeugt wurde.
Zum Beispiel kann ein Clon, umfassend die gewünschte cDNA, durch ein bekanntes Kolonie-Hybridisierungsverfahren (Crunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 72, Seite 3961 (1975)) oder ein Plaque-Hybridisierungsverfahren (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 2.108 (1989)) unter Verwendung von ³²P-markierten, chemisch synthetisierten Oligonucleotiden als Sonde durchmustert werden, die der Aminosäuresequenz des Polypeptids der vorliegenden Erfindung entsprechen. Alternativ kann ein Clon, der ein DNA-Fragment aufweist, das eine spezifische Region innerhalb des Polypeptids der vorliegenden Erfindung codiert, durch Amplifizierung der Region durch PCR mit synthetischen PCR-Primern durchmustert werden.
Wenn eine cDNA-Bank, die unter Verwendung eines cDNA-Expressionsvektors (zum Beispiel λZAPII-Phagen-Vektor erzeugt wurde, verwendet wird, kann der gewünschte Clon durch die Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung durchmustert werden. Ein Durchmusterungsverfahren unter Verwendung des PCR-Verfahrens wird vorzugsweise verwendet, wenn viele Clone einer Durchmusterung unterzogen werden.
Die Nucleotidsequenz der auf diese Weise erhaltenen DNA kann durch das Maxam-Gilbert-Verfahren (Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74, Seite 560 (1977)) oder das synthetische Didesoxynucleotid-Ketten-Abbruchverfahren unter Verwendung des M13-Phagen (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74, Seiten 5463-5467 (1977)) bestimmt werden. Das gesamte oder ein Teil des Gens, welches das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann durch Ausschneiden des vorstehend erwähnten Clons mit einem Restriktionsenzym usw. erhalten werden.

(2) Die DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann durch die folgenden Verfahren aus der genomischen DNA isoliert werden, die aus den Zellen stammt, die, wie vorstehend erwähnt, das Polypeptid der vorliegenden Erfindung exprimieren.

Solche Zellen werden vorzugsweise durch SDS oder Proteinase K solubilisiert und die DNAs werden durch wiederholte Phenolextraktionen entproteinisiert. RNAs werden vorzugsweise mit Ribonuclease gespalten. Die erhaltenen DNAs werden partiell mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten und die erhaltenen DNA-Fragmente werden mit einem geeigneten Phagen oder Cosmid amplifiziert, um eine Bank zu erzeugen. Dann werden Clone, die die gewünschte Sequenz aufweisen, zum Beispiel unter Verwendung von radioaktiv markierten DNA-Sonden nachgewiesen und das gesamte oder ein Teil des Gens, welches das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, wird aus den Clonen durch Ausschneiden mit Restriktionsenzymen usw. erhalten.
cDNA, die ein aus dem Menschen stammendes Polypeptid codiert, kann wie folgt erhalten werden. Nachdem eine Cosmidbank, in welche menschliche genomische DNA (chromosomale DNA) eingeführt wird, hergestellt wurde („Laboratory Manual: Human Genome Mapping", Maruzen Press), werden positive Clone, welche die DNA der codierenden Region des gewünschten Proteins umfassen, durch Durchmusterung der Cosmidbank erhalten. Dann wird die vorstehend erwähnte cDNA-Bank mit der codierenden DNA durchmustert, die aus dem positiven Clon als eine Sonde ausgeschnitten wurde, um die menschliche cDNA zu erzeugen.

(3) Die DNA der vorliegenden Erfindung kann auch chemisch durch das übliche Verfahren, basierend auf der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder 3, synthetisiert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Vektor, umfassend die DNA, die ein vorstehend erwähntes Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert. Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung ist nicht beschränkt, solange er repliziert und beibehalten werden kann oder autonom in verschiedenen prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirten replizieren kann. Der Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst Plasmidvektoren und Phagen-Vektoren.
Der rekombinante Vektor kann leicht durch Ligierung der DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, mit einem im Fachgebiet erhältlichen Vektor zur Rekombination (Plasmid-DNA und Bacteriophagen-DNA) durch das übliche Verfahren hergestellt werden. Spezifische Beispiele der verwendeten Vektoren für die Rekombination sind Plasmide, die aus E. coli stammen, wie zum Beispiel pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 und pUC19, aus Hefe stammende Plasmide wie zum Beispiel pSH19 und pSH15 und aus Bacillus subtilis stammende Plasmide wie zum Beispiel pUB110, pTP5 und pC194. Beispiele von Phagen sind ein Bakteriophage wie zum Beispiel der λ-Phage und ein Tier- oder Insektenvirus (pVL1393, Invitrogen) wie zum Beispiel ein Retrovirus, Vaccinavirus und Kernpolyedervirus.
Ein Expressionsvektor ist für die Expression der DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, und zur Herstellung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung nützlich. Der Expressionsvektor ist nicht eingeschränkt, solange er das Gen, welches das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, in verschiedenen prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert und dieses Protein herstellt. Beispiele davon sind pEFneo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 91, Seiten 158-162 (1994)), pEF-BOS (Nucleic Acids Res. Bd. 18, Seite 5322 (1990)), pME18S (Experimental Medicine: ERGÄNZUNG, „Handbook of Genetic Engineering," (1992)), pMAL C2 usw.
Wenn Bakterien, insbesondere E. coli, als Wirtszellen verwendet werden, besteht ein Expressionsvektor im Allgemeinen mindestens aus einer Promotor/Operator-Region, einem Initiationscodon, der DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einem Terminationscodon, einer Terminatorregion und einem Replicon.
Wenn Hefe, tierische Zellen oder Insektenzellen als Wirte verwendet werden, besteht ein Expressionsvektor vorzugsweise aus mindestens einem Promotor, einem Initiationscodon, der DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, und einem Terminationscodon. Er kann auch die DNA umfassen, die ein Signalpeptid, eine Enhancer-Sequenz, nicht translatierte 5'- und 3'-Region des Gens, welches das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, Spleiß-Übergänge, eine Polyadenylierungsstelle, auswählbare Markerregion und ein Replicon codiert. Der Expressionsvektor kann auch, falls benötigt, ein Gen für die Genamplifikation (Marker) enthalten, das normalerweise verwendet wird.
Eine Promotor/Operatorregion zur Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in Bakterien umfasst einen Promotor, einen Operator und eine Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz (zum Beispiel AAGG). Wenn der Wirt zum Beispiel Escherichia ist, umfasst sie vorzugsweise einen Trp-Promotor, Iac-Promotor, recA-Promotor, λ-PL-Promotor, Ipp-Promotor, tac-Promotor oder ähnliches. Beispiele eines Promotors zur Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in Hefe sind der PH05-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor, ADH-Promotor usw. Wenn der Wirt Bacillus ist, sind Beispiele davon der SL01-Promotor, SP02-Promotor, penP-Promotor usw. Wenn der Wirt eine eukaryontische Zelle wie zum Beispiel eine Säugerzelle ist, sind Beispiele davon der von SV40 stammende Promotor, Retroviruspromotor, Hitzeschock-Promotor, EF-Promotor usw. und vorzugsweise SV40, SRα und ein aus einem Retrovirus stammender. Selbstverständlich wird der Promotor nicht durch die vorstehenden Beispiele eingeschränkt. Zusätzlich ist die Verwendung eines Enhancers wirksam für die Expression.
Ein bevorzugtes Initiationscodon ist zum Beispiel ein Methionin-Codon (ATG).
Das üblicherweise verwendete Terminationscodon (zum Beispiel TAG, TGA, TAA usw.) wird als ein Terminationscodon dargestellt.
Normalerweise verwendete, natürliche oder synthetische Terminatoren werden als eine Terminatorregion verwendet.
Ein Replicon bedeutet eine DNA, die im Stande ist, die gesamte DNA-Sequenz in einer Wirtszelle zu replizieren, und umfasst ein natürliches Plasmid, ein künstlich modifiziertes Plasmid (DNA-Fragment, erzeugt aus einem natürlichen Plasmid) ein synthetisches Plasmid usw. Beispiele eines bevorzugten Plasmids sind pBR322 oder seine künstlichen Derivate (DNA-Fragment, erhalten durch Behandlung von pBR322 mit entsprechenden Restriktionsenzymen) für E. coli, Hefe-2 μ-Plasmid oder chromosomale Hefe-DNA für Hefe und pEFneo, pME18S, pRSVneo ATCC 37198, pSV2dhfr ATCC 37145, pdBPV-MMTneo ATCC 37224, pSV2neo ATCC 37149 usw. für Säugerzellen.
Eine Enhancer-Sequenz, Polyadenylierungsstelle und ein Spleißübergang, die normalerweise im Fachgebiet verwendet werden, wie jene, die von SV40 stammen, können auch verwendet werden.
Ein auswählbarer Marker kann üblicherweise gemäß dem normalen Verfahren verwendet werden. Beispiele davon sind Resistenzgene für Antibiotika wie zum Beispiel Tetracyclin, Neomycin, Ampicillin oder Kanamycin und das Thymidinkinasegen.
Beispiele von einem Gen für die Genamplifikation sind Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-Gen, Thymidinkinasegen, Neomycin-Resistenzgen, Glutamat-Synthasegen, Adenosin-Desaminasegen, Ornithin-Decarboxylasegen, Hygromycin-B-Phospotransferasegen, Asparatat-Transcarbamylasegen usw.
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung kann durch fortlaufendes und zirkuläres Verbinden von mindestens dem vorstehend erwähnten Promotor, Initiationscodon, der DNA (Gen), die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, dem Terminationscodon und der Terminatorregion zu einem geeigneten Replicon erzeugt werden. Falls erwünscht können geeignete DNA-Fragmente (zum Beispiel Linker, Restriktionsstellen, die mit anderen Restriktionsenzymen erzeugt werden) durch das übliche Verfahren wie zum Beispiel Spaltung mit einem Restriktionsenzym oder Ligierung unter Verwendung von T4-DNA-Ligase verwendet werden.
Transformanten der vorliegenden Erfindung können durch Einführen des vorstehend erwähnten Expressionsvektors in Wirtszellen erzeugt werden.
Wirtszellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind nicht beschränkt, solange sie mit einem vorstehend erwähnten Expressionsvektor kompatibel sind und transformiert werden können. Beispiel davon sind verschiedene Zellen wie zum Beispiel natürliche Zellen oder künstlich etablierte, rekombinante Zellen, die normalerweise im technischen Gebiet der vorliegenden Erfindung verwendet werden (zum Beispiel Bakterien (Escherichia und Bacillus), Hefe (Saccharomyces, Pichia usw.), tierische Zellen oder Insektenzellen).
E. coli oder tierische Zellen werden vorzugsweise verwendet. Spezifische Beispiele sind E. coli (DH5α, XL1Blue MRF', TB1, HB101 usw.), aus der Maus stammende Zellen (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH 3T3 usw.), aus der Ratte stammende Zellen, aus dem Hamster stammende Zellen (BHK, CHO-K1, CHO usw.), aus Affen stammende Zellen (COS1, COS3, COS7, CV1, Velo usw.) und aus dem Menschen stammende Zellen (HEK293, HeLa, aus diploiden Fibroblasten stammende Zellen, Myelom, Namalwa usw.).
Ein Expressionsvektor kann in Wirtszellen durch ein bekanntes Verfahren eingeführt werden (transformiert (transduziert)).
Transformation kann zum Beispiel gemäß dem Verfahren von Cohen et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 69, Seite 2110 (1972)), dem Protoplasten-Verfahren (Mol. Gen. Genet., Bd. 168, Seite 111 (1979)) oder dem Kompetent-Verfahren (J. Mol. Biol. Bd. 56, Seite 209 (1971)), wenn die Wirte Bakterien sind (E. coli, Bacillus subtilis usw.), dem Verfahren von Hinnen et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75, Seite 1927 (1978)) oder dem Lithium-Verfahren (J. Bacteriol., Bd. 153, Seite 163 (1983)), wenn der Wirt Saccharomyces cerevisiae ist, dem Verfahren von Graham (Virology, Bd. 52, Seite 456 (1973)), wenn die Wirte tierische Zellen sind, und dem Verfahren von Summers et al., (Mol. Cell. Biol., Bd. 3, Seiten 2156-2165 (1983)), wenn die Wirte Insektenzellen sind, durchgeführt werden.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch Züchten der Transformanten erzeugt werden (im Folgenden umfasst dieser Begriff Transductanten), umfassend einen Expressionsvektor, der, wie vorstehend erwähnt, in Nährmedien erzeugt wurde.
Die Nährmedien umfassen vorzugsweise eine Kohlenstoffquelle, anorganische Stickstoffquelle oder ein organische Stickstoffquelle, die für das Wachstum von Wirtszellen (Transformanten) notwendig ist. Beispiele solcher Kohlenstoffquellen sind Glucose, Dextran, lösliche Stärke und Saccharose und Beispiele von anorganischen oder organischen Stickstoffquellen sind Ammoniumsalze, Nitrate, Aminosäuren, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenkuchen und Kartoffelextrakt. Falls erwünscht können sie andere Nährstoffe umfassen (zum Beispiel ein anorganisches Salz (zum Beispiel Calcium-Chlorid, Natrium-Dihydrogenphosphat und Magnesium-Chlorid), Vitamine, Antibiotika (zum Beispiel Tetracyclin, Neomycin, Ampicillin, Kanamycin usw.).
Züchtung wird durch ein im Fachgebiet bekanntes Verfahren durchgeführt. Züchtungsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert des Medium und Züchtungszeit werden in passender Weise ausgewählt, sodass das Polypeptid der vorliegenden Erfindung überproduziert wird.
Spezifische Medien und Kultivierungsbedingungen, die abhängig von den Wirtszellen verwendet werden, werden nachstehend dargestellt, sind aber nicht darauf beschränkt.
Wenn die Wirte Bakterien, Actinomyceten, Hefen, filamentöse Pilze sind, sind flüssige Medien geeignet, welche die vorstehend erwähnte Nährstoffquelle aufweisen. Die Medien mit pH-Wert 5 bis 8 werden bevorzugt verwendet.
Wenn der Wirt ein E. coli ist, sind Beispiele von bevorzugten Medien LB-Medien und M9-Medien (Miller et al., Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 431 (1972)). Unter Verwendung dieser Medien kann die Züchtung normalerweise bei 14 bis 43°C für etwa 3 bis 24 Stunden ggf. mit Belüftung und Rühen durchgeführt werden.
Wenn der Wirt Bacillus ist, kann die Züchtung normalerweise bei 30 bis 40°C für etwa 16 bis 96 Stunden ggf. mit Belüftung und Rühren durchgeführt werden. Wenn der Wirt Hefe ist, sind Beispiele für Medien Brukholder-Minimalmedium (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77, Seite 4505 (1980)). Der pH-Wert des Mediums ist vorzugsweise 5 bis 8. Die Züchtung kann normalerweise bei 20 bis 35°C für etwa 14 bis 144 Stunden ggf. mit Belüftung und Rühren durchgeführt werden.
Wenn der Wirt eine Tierzelle ist, sind Beispiele von Medien MEM-Medien, die etwa 5 bis 20% fötales Rinderserum enthalten (Science, Bd. 122, Seite 501 (1952)), DMEM-Medium (Virology, Bd. 8, Seite 396 (1959)), RPMI1640 Medium (J. Am. Med. Assoc., Bd. 199, Seite 519 (1967)) und 199-Medium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Bd. 73, Seite 1 (1950)). Der pH-Wert der Medien liegt vorzugsweise zwischen 6 bis 8. Züchtung kann normalerweise bei etwa 30 bis 40°C für etwa 15 bis 72 Stunden ggf. mit Belüftung und Rühren durchgeführt werden.
Wenn der Wirt eine Insektenzelle ist, ist ein Beispiel von Medium Grace-Medium, das fötales Rinderserum enthält (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82, Seite 8404 (1985)). Der pH-Wert davon ist vorzugsweise etwa 5 bis 8. Züchtung kann normalerweise bei etwa 20 bis 40°C für 15 bis 100 Stunden ggf. mit Belüftung und Rühren durchgeführt werden.
Bei der Züchtung von den vorstehend erwähnten Transformanten können insbesondere tierische Zellen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung auf der Oberfläche der Zellen überexprimieren.
Das hierin beschriebene Polypeptid kann als ein lösliches Polypeptidfragment wie zum Beispiel ein Fragment der extrazellulären Region durch Herstellung der Transformanten, wie vorstehend erwähnt, unter Verwendung der DNA, welche die extrazelluläre Region oder jede Domäne codiert, und durch Züchtung der Transformanten hergestellt werden, um ihnen zu ermöglichen, das lösliche Polypeptid in den Kulturüberstand zu sezernieren. Zusätzlich kann ein hierin beschriebenes Polypeptid auf ähnliche Weise erzeugt werden.
Es wird nämlich ein Kulturfiltrat (Überstand) durch ein Verfahren wie zum Beispiel Filtration oder Zentrifugation der erhaltenen Kultur erhalten und das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Polypeptid-Fragment, wie hierin beschrieben, wird aus dem Kulturfiltrat durch das übliche Verfahren, das allgemein verwendet wird, gereinigt und isoliert, um ein natürliches oder synthetisches Protein zu reinigen und zu isolieren.
Beispiele der Isolations- und Reinigungsverfahren sind ein Verfahren zur Ausnutzung der Löslichkeit wie Aussalzen und Lösungsmittelausfällungsverfahren, ein Verfahren, das den Unterschied im Molekulargewicht ausnutzt, wie zum Beispiel Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese, ein Verfahren, das Ladungen ausnützt, wie zum Beispiel Ionenaustausch-Chromatographie und Hydroxylapatit-Chromatographie, ein Verfahren, das spezifische Affinität ausnützt, wie zum Beispiel Affinitätschromatographie, ein Verfahren, das die Unterschiede in der Hydrophobie ausnützt, wie Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie und ein Verfahren, das den Unterschied im isoelektrischen Punkt ausnützt, wie zum Beispiel isoelektrische Fokussierung.
Wenn die Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder ein vorstehend beschriebenes Polypeptid-Fragment im Periplasma oder Cytoplasma von gezüchteten Transformanten vorkommen, werden zuerst die Pilzköper oder Zellen durch das übliche Verfahren wie zum Beispiel Filtration oder Zentrifugation geerntet und in einem geeigneten Puffer suspendiert. Danach wird die Zellwand und/oder Zellmembran der Zellen und so weiter durch ein Verfahren wie Lyse mit Ultraschall, Lysozym und Einfrieren-Auftauen aufgebrochen, die Membranfraktion, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält, wird durch ein Verfahren wie zum Beispiel Zentrifugation oder Filtration erhalten. Die Membranfraktion wird mit einem Detergens wie zum Beispiel Triton-X100 solubilisiert, um einen Rohextrakt zu erhalten. Schließlich wird das Polypeptid oder das Polypeptid-Fragment aus dem Rohextrakt durch das übliche Verfahren, wie vorstehend dargestellt, isoliert und gereinigt.
Die „transgene Maus" ist eine transgene Maus, wobei die, wie vorstehend erwähnt, erzeugte DNA (cDNA oder genomische DNA), die das vorstehend beschriebene aus Tieren, außer Mäusen (nicht-selbst-Polypeptid), stammende Polypeptid codiert, in seinen endogenen Ort bei der Maus integriert worden ist. Die transgene Maus exprimiert das nicht-Selbst-Polypeptid und sezerniert das Polypeptid in ihren Körper ab.
Die transgene Maus kann gemäß dem Verfahren zur Herstellung eines transgenen Tieres, das üblicherweise verwendet wird, erzeugt werden (zum Beispiel siehe „Newest Manual of Animal Cell Experiment", LIC Press, Kapitel 7, Seiten 361-408, (1990)).
Insbesondere werden zum Beispiel embryonale Stammzellen (ES-Zellen), die von normalen Maus-Blastocysten erhalten werden, mit einem Expressionsvektor transformiert, in welchen das Gen, welches das aus dem Menschen stammende Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert (d.h. „menschliches JTT-1-Antigen"), operativ inseriert wurde. ES-Zellen, in welchen das Gen, welches das aus dem Menschen stammende Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, in das endogene Gen integriert wurde, werden durch das übliche Verfahren durchmustert. Dann werden die durchmusterten ES-Zellen in ein fertilisiertes Ei mikroinjiziiert, das aus einer anderen normalen Maus (Blastocyste) erhalten wurde (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77, Nr. 12, Seiten 7380-7384 (1980); US-Patentnr. 4,873,191). Die Blastocyste wird in den Uterus einer anderen normalen Maus als der Nährmutter transplantiert. Dann werden Gründermäuse (Nachkommen-Mäuse) von der Nährmutter-Maus geboren. Durch Paaren der Gründermaus mit normalen Mäusen werden heterogene transgene Mäuse erhalten. Durch Paaren der heterogenen transgenen Mäuse miteinander werden gemäß dem Mendelschen Gesetz homogene transgene Mäuse erhalten.
Eine „Knockout-Maus" ist eine Maus, worin das endogene Gen, welches das vorstehend beschriebene aus der Maus stammende Polypeptid codiert (d.h. „Maus-JTT-1-Antigen"), einem „Knock-out" unterzogen wurde (inaktiviert wurde) wurde. Es kann zum Beispiel durch das positive-negative Selektionsverfahren hergestellt werden, in welchem homologe Rekombination angewandt wird (US-Patentnr. 5,464,764; Nr. 5,487,992; Nr. 5,627,059; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86, Seiten 8932-8935 (1989); Nature, Bd. 342, Seiten 435-438 (1989); usw.).
Der „Antikörper" der vorliegenden Erfindung kann ein polyclonaler Antikörper (Antiserum) oder ein monoclonaler Antikörper sein und ist vorzugsweise ein monoclonaler Antikörper.
Insbesondere ist ein Antikörper reaktiv mit (gegen, der bindet an das) dem vorstehend erwähnten Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder den hierin beschriebenen Polypeptid-Fragmenten.
Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann natürliche Antikörper darstellen, die durch Immunisierung von Säugern wie Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen mit dem Antigen erhalten wurden, wie zum Beispiel Zellen (natürliche Zellen, Zelllinien, Tumorzellen usw.), die menschliche „Zelloberflächenmoleküle" der vorliegende Erfindung exprimieren, Transformanten, die das Polypeptid oder menschliche Zelloberflächenmoleküle der vorliegenden Erfindung auf der Oberfläche davon überexprimieren und die unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie auf der Zelloberfläche erzeugt wurden, oder „Polypeptid-Fragmente" oder „Fusions-Polypeptide", wie hierin beschrieben. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst auch chimäre Antikörper und humanisierte Antikörper (CDR-grafted Antikörper), die durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden können, und menschliche Antikörper, die unter Verwendung von Antikörpererzeugenden, transgenen Tieren erzeugt werden können.
Der monoclonale Antikörper umfasst jene, die irgendeinen Isotyp von IgG, IgM, IgA, IgD oder IgE aufweisen. IgG oder IgM wird bevorzugt.
Der polyclonale Antikörper (Antiserum) oder monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann durch die bekannten Verfahren hergestellt werden. Es wird nämlich ein Säuger, vorzugsweise eine Ratte, ein Meerschweinchen oder Kaninchen, zum Beispiel mit einem vorstehend erwähnten Antigen ggf. mit Freudschem Adjuvans immunisiert wurden.
Der polyclonale Antikörper kann aus dem Antiserum erhalten werden, das aus dem auf diese Weise immunisierten Tier erhalten wird. Außerdem werden die monoclonalen Antikörper wie folgt hergestellt. Hybridome werden aus den Antikörper-erzeugenden Zellen, die aus dem auf diese Weise immunisierten Tier erhalten werden, und Myelom-Zellen hergestellt, die nicht im Stande sind, Autoantikörper zu erzeugen. Die Hybridome werden cloniert und die Clone, welche die monoclonalen Antikörper erzeugen, welche die spezifische Affinität zu dem für die Immunisierung des Säugers verwendeten Antigens zeigen, werden durchmustert.
Genau gesagt kann der monoclonale Antikörper wie folgt produziert werden. Immunisierungen werden durch einmalige oder mehrmalige Injektion oder Implantation des vorstehend erwähnten Antigens als ein Immunogen durchgeführt, ggf. mit Freudschem Adjuvans, subkutan, intramuskulär, intravenös, durch die Fußballen oder intraperitoneal in einen nicht-menschlichen Säuger, insbesondere eine Ratte, ein Meerschweinchen oder Kaninchen, vorzugsweise eine Ratte (einschließlich einem transgenen Tier, das so erzeugt wurde, dass es Antikörper erzeugt, die von einem anderen Tier stammen, wie zum Beispiel die transgene Maus, die den nachstehend erwähnten menschlichen Antikörper produziert). Üblicherweise werden Immunisierungen ein- bis viermal alle ein bis vierzehn Tage nach der ersten Immunisierung durchgeführt. Antikörpererzeugende Zellen werden aus dem auf diese Weise immunisierten Säuger etwa ein bis fünf Tage nach der letzten Immunisierung erhalten. Die Frequenz und das Intervall der Immunisierungen kann abhängig von der Eigenschaft des verwendeten Immunogens entsprechend angepasst werden. Hybridome, die einen monoclonalen Antikörper sezernieren, können durch das Verfahren von Köhler und Milstein (Nature, Bd. 256, Seiten 495-497 (1975)) und durch ein verändertes Verfahren hergestellt werden. Und zwar werden Hybridome durch Fusionieren von antikörpererzeugenden Zellen, die in Milz, Lymphknoten, Knochenmark oder Mandeln vorhanden sind, die aus dem nichtmenschlichen Säuger erhalten wurden, der, wie vorstehend erwähnt, immunisiert wurde, vorzugsweise eine Milz, mit Myelomen ohne Autoantikörper-erzeugende Fähigkeit erzeugt, die aus einem solchen Säuger stammen wie zum Beispiel einer Ratte, einem Meerschweinchen, Kaninchen oder Menschen oder mehr bevorzugt Ratte oder Mensch.
Zum Beispiel kann das aus der Maus stammende Myelom P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), PAI, F0 oder BW5147, aus der Ratte stammende Myelom 210RCY3-Ag.2.3. oder aus dem Menschen stammende Myelom U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 oder CEM-T15 als ein Myelom für die Zellfusion verwendet werden.
Hybridomclone, die monoclonale Antikörper erzeugen, können durch Züchtung der Hybridome zum Beispiel in Mikrotiterplatten und durch Messen der Reaktivität des Kulturüberstands in der Vertiefung, in welcher das Hybridomwachstum beobachtet wird, mit dem für die vorstehend erwähnte Immunisierung verwendeten Immunogens zum Beispiel durch Enzym-Immuntest wie RIA und ELISA durchmustert werden.
Die monoclonalen Antikörper können aus Hybridomen durch Züchtung der Hybridome in vitro oder in vivo zum Beispiel in der Ascitesflüssigkeit einer Ratte, eines Meerschweinchen oder Kaninchens, vorzugsweise einer Ratte, und Isolieren der Antikörper aus dem/der daraus resultierenden Kulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit eines Säugers erzeugt werden.
Züchtung von Hybridomen in vitro kann abhängig von der Eigenschaft der zu züchtenden Zellen, dem Gegenstand einer Teststudie und der verschiedenen Bedingungen des Züchtungsverfahrens unter Verwendung von bekannten Nährstoffmedien oder von Nährstoffmedien, die von bekannten Basalmedien zum Züchten, Aufrechterhalten und Lagern der Hybridome abstammen, durchgeführt werden, um monoclonale Antikörper im Kulturüberstand zu erzeugen.
Beispiele von Basalmedien sind Medien mit niedrigen Calciumkonzentrationen wie zum Beispiel Ham-F12-Medium, MCDB153-Medium oder MEM-Medium mit niedriger Calciumkonzentration und Medien mit hoher Calciumkonzentration wie zum Beispiel MCDB104-Medium, MEM-Medium, D-MEM-Medium, RPMI1640-Medium, ASF104-Medium oder RD-Medium. Das Basalmedium kann zum Beispiel Seren, Hormone, Cytokine und/oder verschiedene anorganische oder organische Substanzen, abhängig von der Zielvorstellung, enthalten.
Monoclonale Antikörper können aus dem/der vorstehend erwähnten Kulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit durch gesättigte Ammoniumsulfatausfällung, Euglobulin-Ausfällverfahren, Capronsäureverfahren, Caprylsäureverfahren, Ionenaustausch-Chromatographie (DEAE oder DE52), Affinitätschromatographie unter Verwendung einer anti-Immunglobulinsäule oder einer Protein A-Säule isoliert und gereinigt werden.
Bevorzugte Beispiele von monoclonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung sind wie folgt.

(1) Ein Antikörper spezifisch für das Polypeptid, das aus der in SEQ ID NO: gezeigten Aminosäuresequenz besteht, wobei dieser Antikörper der Antikörper ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ratten-Antikörper, Meerschweinchen-Antikörper, Kaninchen-Antikörper, chimärem Antikörper, humanisiertem Antikörper und menschlichem Antikörper.
(2) Der Antikörper von (1), wobei dieser Antikörper ein monoclonaler Antikörper oder ein Teil des monoclonalen Antikörpers ist, wobei der Teil ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus F(ab')2, Fab', und Fab.
(3) Ein Arzneimittel, umfassend den Antikörper von (1) oder (2) oder einen Teil des wie in (2) definierten monoclonalen Antikörpers und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

Ferner werden hierin monoclonale Antikörper wie folgt beschrieben.

(1) Ein monoclonaler Antikörper, der mit einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, einem Polypeptidfragment, das von dem Polypeptid stammt, oder einem aus dem Menschen stammenden Zelloberflächenmolekül, das sich aus dem Polypeptid zusammensetzt, reaktiv ist;
(2) Ein monoclonaler Antikörper, der mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung, einem Polypeptid-Fragment, das aus dem Polypeptid stammt, oder einem Zelloberfächenmolekül, zusammengesetzt aus dem Polypeptid, reaktiv ist, wobei die Wirkung des monoclonalen Antikörpers auf Mitogen-stimulierte Lymphoblasten-Zellen im Wesentlichen die gleiche ist wie die Wirkung eines monoclonalen Antikörpers, der durch ein Hybridom produziert wird, das durch die internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5707 identifiziert ist, auf Mitogen-stimulierte Ratten-Lymphoblastenzellen; und
(3) Ein monoclonaler Antikörper, der mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung, mit einem Polypeptid-Fragment, das aus dem Polypeptid stammt, oder einem Zelloberflächenmolekül, das aus dem Polypeptid zusammengesetzt ist, reaktiv ist, wobei die Wirkung des monoclonalen Antikörpers auf Mitogen-stimulierte Lymphoblasten Zellen im Wesentlichen die gleiche ist wie die Wirkung eines monoclonalen Antikörpers, der durch ein Hybridom produziert wird, das durch die internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5708 identifiziert ist, auf Mitogen-stimulierte Ratten-Lymphoblastenzellen.

Außerdem umfasst der hierin beschriebene monoclonale Antikörper jenen, der durch das Hybridom produziert wird, das durch die internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5707 oder FERM BP-5708 identifiziert ist.
Der „chimäre monoclonale Antikörper" der vorliegenden Erfindung ist ein monoclonaler Antikörper, der durch Gentechnik erzeugt wird, und bedeutet insbesondere einen chimären Antikörper wie zum Beispiel einen Maus/menschlichen chimären Antikörper, dessen variable Regionen aus Immunglobulin eines nichtmenschlichen Säugers stammen (Maus, Ratte, Hamster usw.) und dessen konstante Regionen aus menschlichem Immunglobulin stammen.
Die konstante Region, die aus menschlichem Immunglobulin stammt, hat die Aminosäuresequenz, die in jedem Isotyp wie zum Beispiel IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD und IgE inhärent vorhanden ist. Die konstante Region des rekombinanten chimären monoclonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung kann die von einem menschlichen Immunglobulin sein, das irgendeinem Isotyp angehört. Vorzugsweise stammt die konstante Region aus menschlichem IgG.
Der chimäre monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel wie folgt erzeugt werden. Natürlich ist das Herstellungsverfahren nicht darauf beschränkt.
Ein Maus/menschlicher chimärer monoclonaler Antikörper kann unter Bezugnahme auf Experimental Medicine: ERGÄNZUNG, Bd. 1.6, Nr. 10 (1988) und die geprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldung (JP-B) Nr. Hei 3-73280 erzeugt werden. Er kann nämlich durch funktionsfähige Insertion des CH-Gens (C-Gen, das die konstante Region der H-Kette codiert), das aus der DNA erhalten wird, die das menschliche Immunglobulin codiert, stromabwärts von den aktiven VH-Genen (umgelagertes VDJ-Gen, das die variable Region der N-Kette codiert), erhalten aus der DNA, die einen monoclonalen Maus-Antikörper codiert, der aus dem Hybridom isoliert wurde, welches den monoclonalen Maus-Antikörper erzeugt, und des CL-Gens (C-Gen, das die konstante Region der L-Kette codiert), erhalten aus der DNA, die das menschliche Immunglobulin codiert, stromabwärts der aktiven VL-Gene (umgelagertes VJ-Gen, das die variable Region der leichten Kette codiert), erhalten aus der DNA, die den monoclonalen Maus-Antikörper codiert, der aus dem Hybridom isoliert wurde, in die gleichen oder unterschiedliche Vektoren, so dass sie exprimiert werden, gefolgt von der Transformation der Wirtszellen mit dem Expressionsvektor und dann Züchten der Transformanten hergestellt werden.
Genau gesagt werden DNAs zuerst aus monoclonale Maus-Antikörpererzeugenden Hybridomen durch das übliche Verfahren extrahiert, mit den entsprechenden Restriktionsenzymen gespalten (zum Beispiel EcoRI und HindiII), einer Elektoophorese unterzogen (zum Beispiel unter Verwendung eines 0,7% Agarosegels) und durch Southern-Blot-Verfahren analysiert. Nachdem ein Gel nach der Elektrophorese zum Beispiel mit Ethidium-Bromid gefärbt und photographiert wurde, wird das Gel mit Markerpositionen versehen, zweimal mit Wasser gewaschen und in 0,25 M HCl für 15 Minuten eingeweicht. Dann wird das Gel für 10 Minuten in 0,4 N NaON-Lösung unter vorsichtigem Rühren eingeweicht. Die DNAs werden für 4 Stunden durch das übliche Verfahren auf einen Filter übertragen. Der Filter wird entnommen und zweimal mit 2 × SCC gewaschen. Nachdem der Filter ausreichend getrocknet wurde, wird er bei 75°C für 3 Stunden gebacken. Nach dem Backen wird der Filter mit 0,1 × SCC/0,1% SDS bei 65°C für 30 Minuten behandelt. Dann wird er in 3 × SSC/0,1% SDS eingeweicht. Der erhaltene Filter wird mit Vorhybridisierungslösung in einem Plastikbeutel bei 65°C für 3 bis 4 Stunden behandelt.
Als Nächstes werden die ³²P-markierte Sonden-DNA und Hybridierungslösung zu dem Beutel hinzugefügt und bei 65°C etwa 12 Stunden umgesetzt. Nach der Hybridisierung wird der Filter unter geeigneter Salzkonzentration, Reaktionstemperatur und Zeit gewaschen (zum Beispiel 2 × SSC-0,1% SDS, Raumtemperatur, 10 Minuten). Der Filter wird dann mit ein wenig 2 × SSC in einen Plastikbeutel gegeben und, nachdem der Beutel verschlossen wurde, einer Autoradiographie unterzogen.
Umgelagertes VDJ-Gen und VJ-Gen, die die H-Kette und L-Kette eines monoclonalen Maus-Antikörpers codieren, werden durch das vorstehend erwähnte Southern-Blot-Verfahren identifiziert. Die Region, die das identifizierte DNA-Fragment umfasst, wird durch eine Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation fraktioniert und in einen Phagenvektor inseriert (zum Beispiel Charon 4A, Charon 28, λEMBL3, λEMBL4 usw.). E. coli (zum Beispiel LE392, NM539 usw.) wird mit dem Phagenvektor transformiert, um eine genomische Bank zu erzeugen. Die genomische Bank wird durch Plaque-Hybridisierung wie zum Beispiel das Benton- Davis-Verfahren (Science, Bd. 196. Seiten 180-182 (1977)) unter Verwendung von geeigneten Sonden (H-Ketten-J-Gen, L-Ketten (κ)-J-Gen usw.) durchmustert, um positive Clone zu erhalten, die ein umgelagertes VDJ-Gen oder VJ-Gen umfassen. Durch Erstellen einer Restriktionskarte und Bestimmen der Nucleotidsequenz der erhaltenen Clone wird bestätigt, dass Gene, umfassend das gewünschte, umgelagerte VH (VDJ)-Gen oder VL (VJ)-Gen, erhalten wurden.
Getrennt werden das für die Chimärisierung verwendete menschliche CH-Gen und das menschliche CL-Gen isoliert. Zum Beispiel werden, wenn ein chimärer Antikörper mit dem menschlichen IgG1 erzeugt wird, das Cγ1-Gen als ein CH-Gen und das Cκ-Gen als ein CL-Gen isoliert. Diese Gene können aus der menschlichen genomischen Bank mit dem Maus-Cγ1-Gen und dem Maus-Cκ-Gen, entsprechend dem menschlichen Cγ1-Gen bzw. dem menschlichen Cκ-Gen, als Sonden isoliert werden, indem sich die hohe Homologie zwischen den Nucleotidsequenzen des Maus-Immunoglobingens und des menschlichen Immunoglobingens zu Nutzen gemacht wird.
Genau gesagt werden DNA-Fragmente, die das menschliche Cκ-Gen und eine Enhancer-Region umfassen, aus der menschlichen genomischen λ Charon 4A HaeIII-AluI-Bank (Cell, Bd. 15, Seiten 1157-1174 (1978)) isoliert, zum Beispiel mit einem 3 kb-HindIII-BamHI-Fragment des Clons Ig146 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75. Seiten 4709-4713 (1978)) und einem 6,8 kb-EcoRI-Frament des Clons MEP 10 (Proc. Natl Acad. Sci. USA, Bd. 78, Seiten 474-478 (1981)) als Sonden. Außerdem wird zum Beispiel, nachdem menschliche fötale Hepatocyten-DNA mit HindIII gespalten wurde und durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert wurde, ein 5,9 kb-Fragment in λ788 inseriert und dann wird das menschliche Cγ1-Gen mit den vorstehend erwähnten Sonden isoliert.
Unter Verwendung des so erhaltenen Maus-VH-Gens, Maus-VL-Gens, menschlichen CH-Gens und menschlichen CL-Gens und unter Berücksichtung der Promotorregion und Enhancer-Region wird das menschliche CH-Gen stromabwärts vom Maus-VH-Gen und das menschliche CL-Gen stromabwärts vom Maus-VL-Gen in einen Expressionsvektor wie zum Beispiel pSV2gpt oder pSV2neo mit geeigneten Restriktionsenzymen und DNA-Ligase durch das übliche Verfahren inseriert. In diesem Fall können chimäre Gene des Maus-VH-Gens/menschlichen CH-Gens und des Maus-VL-Gens/menschlichen CL-Gens jeweils in den gleichen Expressionsvektor oder in unterschiedliche Expressionsvektoren inseriert werden.
Auf diese Weise erzeugte(r) Expressionsvektor(en) mit inseriertem chimäre(m) Gen wird (werden) durch Protoplasten-Fusionsverfahren, DEAE-Dextran-Verfahren, Calcium-Phosphat-Verfahren oder Elektroporationsverfahren in Myelome eingeführt, die keine Antikörper erzeugen, zum Beispiel P3X63.Ag8.653-Zellen oder SP210-Zellen. Die Transformanten werden durch Züchten in Medien durchmustert, die einen Wirkstoff, entsprechend dem in den Expressionsvektor inserierten Wirkstoffresistenzgen, enthalten, und dann werden die Zellen, welche die gewünschten chimären monoclonalen Antikörper produzieren, erhalten.
Erwünschte chimäre monoclonale Antikörper werden aus dem Kulturüberstand von antikörperproduzierenden Zellen auf diese Weise durchmustert.
Der „humanisierte monoclonale Antikörper (CDR-grafted Antikörper)" der vorliegenden Erfindung ist ein durch Gentechnik erzeugter monoclonaler Antikörper und bedeutet insbesondere einen humanisierten monoclonalen Antikörper, wobei ein Teil oder die gesamten komplementaritätsbestimmenden Regionen der hypervariablen Region aus den komplementaritätsbestimmenden Regionen der hypervariablen Region eines monoclonalen Antikörpers eines nicht-menschlichen Säugers (Maus, Ratte, Hamster usw.) stammen, die Gerüstregionen der variablen Region stammen aus den Gerüstregionen der variablen Region von menschlichem Immunglobulin und die konstante Region stammt aus einer menschlichen konstanten Region von Immunglobulin.
Die komplementaritätsbestimmenden Regionen der hypervariablen Region kommen in der hypervariablen Region in der variablen Region eines Antikörpers vor und sie bedeuten drei Regionen, die direkt und komplementär an ein Antigen binden (komplementaritätsbestimmende Reste, CDR1, CDR2 und CDR3). Die Gerüstregionen der variablen Region bedeuten vier relativ konservierte Regionen, die stromaufwärts, stromabwärts und zwischen den drei komplementaritätsbestimmenden Regionen liegen (Gerüstregion, FR1, FR2, FR3 und FR4).
Mit anderen Worten bedeutet ein humanisierter monoclonaler Antikörper einen, in dem die gesamte Region außer einem Teil oder die Gesamtheit der komplementaritätsbestimmenden Regionen der hypervariablen Region aus einem nicht-menschlichen, von einem Säuger stammenden monoclonalen Antikörper durch ihre entsprechenden, aus menschlichem Immunglobulin stammenden Regionen ersetzt worden sind.
Die konstante, vom menschlichen Immunglobulin stammende Region hat die Aminosäuresequenz, die in jedem Isotyp inhärent vorhanden ist, wie IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD und IgE. Die konstante Region eines humanisierten monoclonalen Antikörpers in der vorliegenden Erfindung kann die aus menschlichem Immunglobulin sein, das zu irgendeinem Isotyp gehört. Vorzugsweise ist die konstante Region aus menschlichem IgG. Die Gerüstregionen der konstanten Region, die aus menschlichem Immunglobulin stammen, sind nicht besonders eingeschränkt.
Der humanisierte monoclonale Antikörper der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel wie folgt produziert werden. Natürlich ist das Produktionsverfahren nicht darauf beschränkt.
Zum Beispiel kann ein rekombinanter humanisierter monoclonaler Antikörper, der aus einem monoclonalen Maus-Antikörper stammt, durch Gentechnologie, unter Bezugnahme auf die nicht geprüfte Japanische Patentveröffentlichung (JP-WA) Nr. Hei 4-506458 und die nicht geprüfte Japanische Patentveröffentlichung (JP-A) Nr. Sho 62-296890 erzeugt werden. Aus Hybridomen, die monoclonalen Maus-Antikörper erzeugen, werden nämlich mindestens ein Maus-H-Ketten-CDR-Gen und mindestens ein Maus-L-Ketten-CDR-Gen, das dem Maus-H-Ketten-CDR-Gen entspricht, isoliert, und menschliches H-Ketten-Gen, das die gesamten Regionen mit der Ausnahme des menschlichen H-Ketten-CDR codiert, entsprechend dem vorstehend erwähnten Maus-H-Ketten-CDR, und menschliches L-Ketten-Gen, das die gesamte Region, mit der Ausnahme des menschlichen L-Ketten-CDR codiert, das dem vorstehend erwähnten Maus-L-Ketten-CDR entspricht, werden aus menschlichen Immunglobulingenen isoliert.
Das (die) Maus-H-Ketten-CDR-Gen(e) und das (die) auf diese Weise isolierte(n) menschliche(n) H-Ketten-Gen(e) werden operativ in einen geeigneten Vektor inseriert, sodass sie exprimiert werden können. Auf ähnliche Weise werden das (die) Maus-L-Ketten-CDR-Gen(e) und das (die) menschliche(n) L-Ketten-Gen(e) operativ in einen anderen geeigneten Vektor inseriert, sodass sie exprimiert werden können. Alternativ können das (die) Maus-H-Ketten-CDR-Gen(e)/menschliche(s) H- Ketten-Gen(e) und das (die) Maus-L-Ketten-CDR-Gen(e)/menschliches) L-ketten-Gen(e) operativ in den gleichen Expressionsvektor inseriert werden, sodass sie exprimiert werden können. Wirtszellen werden mit dem auf diese Weise hergestellten Expressionsvektor transformiert, um Transformanten zu erhalten, die den humanisierten monoclonalen Antikörper erzeugen. Durch Züchten der Transformanten wird der erwünschte humanisierte monoclonale Antikörper aus dem Kulturüberstand erhalten.
Der „menschliche monoclonale Antikörper" der vorliegenden Erfindung ist ein Immunglobulin, in welchem die gesamten Regionen, umfassend die variable und konstante Region der H-Kette und die variable und konstante Region der L-Kette, die das Immunglobulin darstellen, aus dem Gen stammt, welches das menschliche Immunglobulin codiert.
Der menschliche Antikörper kann in der gleichen Weise wie das vorstehend erwähnte Herstellungsverfahren von polyclonalen oder monoclonalen Antikörpern durch Immunisieren eines transgenen Tiers mit einem Antigen produziert werden, in welches durch das übliche Verfahren mindestens (ein) menschliches) Immunglobulin-Gen(e) in den Genort eines nicht-menschlichen Säugers wie zum Beispiel einer Maus integriert wurde.
Zum Beispiel wird eine transgene Maus, die menschliche Antikörper produziert, durch die in Nature Genetics, Bd. 7, Seiten 13-21 (1994); Nature Genetics, Bd. 15, Seiten 146-156 (1997); JP-WA Nr. Hei 4-504365 und Hei 7-509137; Nikkei Science, Nr. 6, Seiten 40-50 (1995); Internationale Patentanmeldungsnr. WO 94/25585; Nature, Bd. 368, Seiten 856-859 (1994); und JP-WA Nr. Hei 6-500233, beschriebenen Verfahren erzeugt.
Außerdem kann auch eine vor kurzem entwickelte Technik zur Produktion eines vom Menschen stammenden Proteins aus der Milch einer/einem transgenen Kuh oder Schwein angewendet werden (Nikkei Science, Seiten 78-84 (April, 1997)).
Der „Teil eines Antikörpers", der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet eine partielle Region des vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörpers und insbesondere bedeutet er F(ab')₂, Fab' oder Fab (Exp. Opin. Ther. Patents, Bd. 6, Nr. 5, Seiten 441-456 (1996)).
„F(ab')₂" und „Fab'" können durch Behandlung von Immunglobulin (monoclonalem Antikörper) mit einer Protease wie zum Beispiel Pepsin und Papain hergestellt werden und bedeuten ein Antikörperfragment, das durch Spaltung von Immunglobulin nahe der Disulfidbrücke erzeugt wird, die zwischen den Gelenk-Regionen in jeder der beiden H-Ketten bestehen. Zum Beispiel spaltet Papain IgG stromaufwärts von den Disulfidbrücken, die zwischen den Gelenk-Regionen in jeder der beiden H-Ketten bestehen, um zwei homologe Antikörperfragmente zu erzeugen, in welchen eine L-Kette, die aus VL (variable L-Ketten-Region) und CL (konstante L-Ketten-Region) besteht, und ein H-Kettenfragment, das aus VH (variable H-Ketten-Region) und CHγ1 (γ1-Region der konstanten Region der H-Kette) besteht, an ihren C-terminalen Regionen über eine Disulfidbrücke verbunden sind. Jedes von solchen zwei homologen Antikörperfragmenten wird als Fab' bezeichnet. Pepsin spaltet auch IgG stromabwärts von den Disulfidbrücken, die zwischen den Gelenk-Regionen in jedem der beiden H-Ketten bestehen, um ein Antikörper-Fragment zu erzeugen, das etwas größer ist als das Fragment, in welchem die beiden vorstehend erwähnten Fab' an der Gelenk-Region verbunden sind. Dieses Antikörper-Fragment wird als F(ab')₂ bezeichnet.
Das „Arzneimittel" der vorliegenden Erfindung umfasst einen „Antikörper" oder einen „Teil eines Antikörpers" und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Der „pharmazeutisch verträgliche Träger" umfasst einen Excipienten, ein Verdünnungsmittel, einen Expander, ein Zersetzungsmittel, ein Stabilisator, ein Konservierungsmittel, einen Puffer, einen Emulgator, einen Aromastoff, einen Farbstoff, einen Süßstoff, ein Mittel, das die Viskosität erhöht, einen Geschmackstoff, eine die Löslichkeit erhöhendes Mittel oder andere Zusatzstoffe. Unter Verwendung von einem oder mehreren solchen Trägern kann ein Arzneimittel in Tabletten, Pillen, Pulver, Granulat, Injektionen, Lösungen, Kapseln, Pastillen, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen oder Sirupe gestaltet werden. Das Arzneimittel kann oral oder parenteral verabreicht werden. Andere Formen der parenteralen Verabreichung umfassen eine Lösung zur externen Anwendung, Zäpfchen zur rektalen Verabreichung und Pessare, wie durch das übliche Verfahren vorgeschrieben, die ein oder mehrere aktive Bestandteile enthalten.
Die Dosierung kann vom Alter, Geschlecht, Gewicht und dem Symptom des Patienten, der Wirkung der Behandlung, dem Verabreichungsweg, der Dauer der Behandlung oder der Art des aktiven Bestandteils (vorstehend erwähntes/r Polypeptid oder Antikörper), der im Arzneimittel vorhanden ist, variieren.
Üblicherweise kann das Arzneimittel einem Erwachsenen pro Verabreichung in einer Dosis von 10 μg bis 1000 mg (oder 10 μg bis 500 mg) verabreicht werden. Abhängig von verschiedenen Bedingungen kann eine geringere als die vorstehend erwähnte Dosis in manchen Fällen ausreichend sein und in anderen Fällen eine höhere Dosis als die vorstehend erwähnte nötig sein.
Insbesondere kann die Injektion durch Auflösen oder Suspendieren des Antikörpers in einem nicht-giftigen, pharmazeutisch verträglichen Träger wie zum Beispiel physiologische Kochsalzlösung oder im Handel erhältliches destilliertes Wasser für die Injektion mit Einstellen einer Konzentration auf 0,1 μg Antikörper/ml Träger bis 10 mg Antikörper/ml Träger produziert werden. Die auf diese Weise hergestellte Injektion kann einem menschlichen Patienten, der eine Behandlung braucht, mit einer Dosis von 1 μg bis 100 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 50 μg bis 50 mg/kg Körpergewicht, ein oder mehrmals pro Tag verabreicht werden. Beispiele von Verabreichungswegen sind medizinisch geeignete Verabreichungswege wie zum Beispiel intravenöse Injektion, subkutane Injektion, intradermale Injektion, intramuskuläre Injektion oder intraperitoneale Injektion, vorzugsweise intravenöse Injektion.
Die Injektion kann auch in einem nicht-wässrigen Verdünnungsmittel (zum Beispiel Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöl wie zum Beispiel Olivenöl und Alkohol wie zum Beispiel Ethanol), einer Suspension oder Emulsion erzeugt werden.
Die Injektion kann durch Filtration mit einem bakterienundurchlässigen Filter, durch Mischen mit Bakterizid oder durch Bestrahlung sterilisiert werden. Die Injektion kann in einer Form erzeugt werden, die erst bei der Verwendung hergestellt wird. Und zwar wird sie gefriergetrocknet, um eine sterile, feste Zusammensetzung darzustellen, und kann in sterilem destilliertem Wasser für die Injektion oder in einem anderen Lösungsmittel vor der Verwendung aufgelöst werden.
Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung kann angewandt werden, um verschiedene entzündliche Krankheiten zu behandeln oder zu verhindern, die durch die Aktivierung von Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen und die Regulation von aktivierten Lymphocytenfunktionen verursacht werden. Beispiele von Krankheiten sind chronische entzündliche Dermatose wie zum Beispiel Lichenplanus.
Die therapeutische Wirkung des Arzneimittels der vorliegenden Erfindung für Symptome von verschiedenen Krankheiten kann durch das übliche Verfahren durch seine Verabreichung an ein bekanntes Tier-Krankheitsmodell untersucht werden.
Beispiele des Tiermodells umfassen (1) eine (NZB/NZW) F1-Maus, ein Modell für menschlichen systemischen Lupus erythematodes (SLE) (Science, Bd. 125, Seite 1225-1227 (1994)), (2) experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE), ein Modell für multiple Sklerose (MS) (J. Clin. Invest., Bd. 95, Seiten 2783-2789 (1995)), (3) eine NOD (non-obese Diabetes)-Maus, ein Modell für Insulin-abhängigen Diabetes mellitus (IDDM) (J. Exp. Med., Bd. 181, Seiten 1145-1155 (1995)), (4) Ratten-Nephritis-Modell durch Nieren-Glomerulus-Basalmembran-Immunität, Goodpasture-Nephritis-Modell (Eur. J. Immunol., Bd. 24, Nr. 6, Seiten 1249-1254 (1994)) und (5) eine DBA/1-Maus, ein Modell für menschliche rheumatoide Arthritis (Eur. J. Immunol., Bd. 26, Seiten 2320-2328 (1996)).
Kurze Beschreibung der Darstellungen
1 sind mikroskopische Aufnahmen, die den Aggregationszustand von FTL435-Zellen, der durch den „JTT-1-Antikörper" induziert wird, und den Hemmungszustand der Zellaggregation durch den „JTT.2-Antikörper" zeigen.
Unterfigur (a) zeigt den Zustand der Zellen in der Abwesenheit von irgendeinem Hybridom-Überstand, Unterfigur (b) zeigt den Zustand der Zellaggregation, die durch den „JTT-1-Antikörper" induziert wird, Unterfigur (c) zeigt den Zustand der Zellaggregation in der Anwesenheit von „anti-ICAM-1-Antikörper" gemeinsam mit „JTT-1-Antikörper" und Unterfigur (d) zeigt den Zellaggregationszustand in der Anwesenheit des „JTT-2-Antikörpers" gemeinsam mit dem „JTT-1-Antikörper".
2 sind mikroskopische Aufnahmen, die den Aggregationszustand von FTL435-Zellen und aktivierten Ratten-Lymphoblasten zeigen, die durch „JTT-1-Antikörper" aktiviert werden, und den Zustand der Hemmung der Zellaggregation durch den „JTT.2-Antikörper".
Unterfigur (a) zeigt den Zustand von FTL435-Zellen in der Abwesenheit von jeglichem Antikörper, Unterfigur (b) zeigt den Zustand von FTL435-Zellen in der Anwesenheit von PMA, Unterfigur (c) zeigt den Zustand von FTL435-Zellen in der Anwesenheit des „JTT-1-Antikörpers", Unterfigur (d) zeigt den Zustand von FTL435-Zellen in der Anwesenheit von anti-LFA-1-Antikörper gemeinsam mit „JTT-1-Antikörper", Unterfigur (e) zeigt den Zustand von FTL435-Zellen in der Anwesenheit von anti-CD18-Antikörper gemeinsam mit „JTT-1-Antikörper", Unterfigur (f) zeigt den Zustand von FTL435-Zellen in der Anwesenheit von anti-ICAM-1-Antikörper gemeinsam mit „JTT-1-Antikörper", Unterfigur (g) zeigt den Zustand von aktivierten Lymphoblasten in der Abwesenheit von jeglichem Antikörper, Unterfigur (h) zeigt den Zustand von aktivierten Lymphoblasten in der Anwesenheit von PMA, Unterfigur (i) zeigt den Zustand von aktivierten Lymphoblasten in der Anwesenheit von „JTT-1-Antikörper", Unterfigur(j) zeigt den Zustand von aktivierten Lymphoblasten in der Anwesenheit von anti-LFA-1-Antikörper gemeinsam mit „JTT-1-Antikörper", Unterfigur (k) zeigt den Zustand von aktivierten Lymphoblasten in der Anwesenheit von anti-CD18-Antikörper gemeinsam mit „JTT-1-Antikörper' und Unterfigur (I) zeigt den Zustand von aktivierten Lymphoblasten in der Anwesenheit von anti-ICAM-1-Antikörper gemeinsam mit dem „JTT-1-Antikörper".
3 zeigt den Expressionszustand von „JTT-1-Antigen" und „JTT-2-Antigen" in verschiedenen Zellen, die mit einem Durchfluss-Cytometer gemessen werden.
4 zeigt den Expressionszustand des „JTT-1-Antigens" in verschiedenen Lymphocyten-Zellen, gemessen mit einem Durchfluss-Cytometer.
5 ist ein Photo, das ein Elektrophoretogramm des „JTT-1-Antigens" zeigt, das durch SDS-PAGE analysiert wurde.
6 sind mikroskopische Aufnahmen, die den Adhäsionszustand von Ratten-Thymocyten an der Mikrotiterplatte zeigen, die mit gereinigtem „JTT-1-Antigen" beschichtet ist, wobei die Adhäsion durch die Anwesenheit von „JTT-1-Antikörper" und der Hemmungszustand der Zelladhäsion durch „JTT-2-Antikörper" induziert wurde.
Unterfigur (a) zeigt das Adhäsionsstadium der Zellen an der Platte, die nicht mit „JTT-1-Antigen" beschichtet worden ist, Unterfigur (b) zeigt das Adhäsionsstadium der Zellen an der Platte, die mit „JTT-1-Antigen" beschichtet ist, in der Abwesenheit von jeglichem Antikörper, Unterfigur (c) zeigt das Adhäsionsstadium der Zellen an der Platte, die mit „JTT-1-Antikörper" beschichtet war, in der Anwesenheit von Fab-Fragmenten des „JTT-1-Antikörpers" und Unterfigur (d) zeigt das Adhäsionsstadium der Zellen an der Platte, die mit „JTT-1-Antikörper" beschichtet ist, in der Anwesenheit von „JTT-2-Antikörper" gemeinsam mit den Fab-Fragmenten des „JTT-1-Antikörpers".
7 zeigt die relative Zellzahl von Thymocyten, die an der Platte haften, die mit gereinigtem „JTT-1-Antigen" beschichtet ist, gemessen als Fluoreszenzintensität. „Ag(-)" zeigt die relative Zellzahl in der Platte, die nicht mit dem „JTT-1-Antigen" beschichtet ist, „Ag(+)" zeigt die relative Zellzahl in der Platte, die mit „JTT-1-Antigen" beschichtet ist, in der Abwesenheit von jeglichem Antikörper, „Ag(+) + JTT-1-Fab" zeigt die relative Zellzahl in der Platte, die mit „JTT-1-Antigen" beschichtet ist, in der Anwesenheit der Fab-Fragmente von „JTT-1-Antikörper", und „Ag(+) + JTT-1-Fab + JTT-2" zeigt die relative Zellzahl in der Platte, die mit „JTT-1-Antigen" beschichtet ist, in der Anwesenheit von „JTT-2-Antikörper" gemeinsam mit dem Fab-Fragmenten des „JTT-1-Antikörpers".
8 zeigt den Expressionszustand von „Ratten JTT-1-Antigen" und „Ratten JTT-2-Antigen" in COS-Zellen mit einem Durchfluss-Cytometer, die mit cDNA transformiert sind, die „Ratten JTT-1-Antigen" codiert.
9 zeigt die strukturellen Eigenschaften der Aminosäuresequenz des „JTT-1-Antigens", aufgedeckt durch Hydropathie-Blotanalyse.
10 zeigt die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen von Mensch-, Ratten- und Maus-„JTT-1-Antigen" und der „Ratten-JTT-1-Antigen"-Mutante.
11 zeigt die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen und dem Konservierungszustand von Motiven in „menschlichem JTT-1-Antigen", „menschlichem CD28-Molekül" und „menschlichem CTLA-4-Molekül".
12 zeigt schematisch die Protein-Sekundärstruktur und ihre Ähnlichkeiten zwischen dem „menschlichen JTT-1-Anitgen", dem „menschlichen CD28-Molekül" und dem „menschlichen CTLA-4-Molekül".
13 zeigt schematisch die Struktur der genomischen DNA, die das „Maus JTT-1-Antigen" codiert.
14 zeigt den Unterschied in den Aminosäuresequenzen zwischen „Ratten-JTT-1-Antigen" und seiner alternativen Spleißmutante.
15 zeigt den Grad des Wachstums von menschlichen peripheren Blut-Lymphocyten, die durch den monoclonalen Antikörper gegen „menschliches JTT-1- Antigen" induziert wurden, wobei der Wachstumsgrad durch [³H]-Tymidinaufnahme gemessen wurde.
Die Ordinate zeigt die Menge der Aufnahme (ZpM, „dpM" für „Zerfälle pro Minute") an [³H]-Tymidin in die Zellen.
16 zeigt den therapeutischen Effekt des monoclonalen Antikörpers gegen „JTT-1-Antigen" auf experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE) in einem Ratten-Krankheitsmodell.
Die Ordinate zeigt den Wertungsgrad der Krankheitssymptome und die Abszisse zeigt die für die Induktion von EAE benötigten Tage nach der Immunisierung.
17 zeigt den therapeutischen Effekt des monoclonalen Antikörpers gegen „JTT-1-Antigen" auf Glomerulonephritis in einem Ratten-Krankheitsmodell. Die Ordinate zeigt die Menge der Proteinausscheidung im Harn und die Abszisse zeigt den Zeitverlauf (Woche) nach der Immunisierung bis zur Induktion von Glomerulonephritis.
18 zeigt ein Säulenhistogramm in der Reinigung von Fusionspolypeptiden zwischen „Ratten JTT-1-Antigen", extrazelluläre Region, und menschlichem IgFc (rJTT-1-IgFc) mit einer Protein A-Sepharosesäule.
19 ist ein Photo, welches das Elektrophoretogramm von rJTT-1-IgFc zeigt, das durch SDS-PAGE analysiert wird.
20 zeigt ein Säulenhistogramm in der Reinigung des Fusionspolypeptids zwischen der extrazellulären Region des „menschlichen JTT-1-Antigens" und menschlichem IgFc (hJTT-1-IgFc) mit einer Protein A-Sepharosesäule.
21 ist ein Photo, das ein Elektrophoretogramm von hJTT-1-IgFc zeigt, analysiert durch SDS-PAGE.
22 zeigt die Struktur des Gentransfer (Targeting)-Vektors, der zur Erzeugung von transgenen Mäusen verwendet wird, in welchen die cDNA eingeführt worden ist, die „Ratten-JTT-1-Antigen" codiert.
Beste Ausführungsmethode der Erfindung
Die vorliegenden Erfindungen werden genauer mit Bezugnahme auf die nachstehenden Beispielen beschrieben, sollten aber nicht so interpretiert werden, dass sie darauf beschränkt sind.
Beispiel 1 Erzeugung von monoclonalen Antikörpern
Antikörper-erzeugende Hybridome wurden gemäß dem Verfahren von Köhler et al., erzeugt (Omori et al., Blood, Bd. 81, Seiten 101-111 (1993)) und monoclonale Antikörper wurden gemäß dem Verfahren von Kannagi et al. erzeugt (Handbook of Experimental Immunology, Bd. 4, 117.21-117.21 (1986)).
Zuerst wurden FTL435-Zellen der Ratten-Thymom-Zelllinie als ein immunisierendes Antigen an BALB/c-Mäuse in einer Menge von 10' Zellen/Maus in Intervallen von 0, 7, 14 und 28 Tagen in ihren Fußballen verabreicht. Das Gemisch des Antigens mit komplettem Freudschem Adjuvans wurde nur bei der ersten Immunisierung verabreicht. Zwei Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Lymphknoten der Mäuse herausgenommen und mit Maus-Myelomzellen PAI (JCR Nr. B0113; Stocker, J.W. et al., Res. Disclosure, Bd. 217, Seite 155 (1982)) durch das übliche Verfahren fusioniert, um viele Hybridome zu erhalten, die monoclonale Antikörper produzieren.
Beisgiel 2 Durchmusterung von Hybridomen und Charakterisierung von monoclonalen Antikörpern
Die in Beispiel 1 erzeugten Hybridome wurden durch Analysieren der Wirkung der im Kulturüberstand erzeugten Antikörper der Hybridome von FTL435-Zellen, die als Immunogen verwendet wurden, durchmustert. FTL435-Zellen (5 × 10⁶ Zellen/ml, 0,1 ml) wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96-Vertiefungen ausgesät und bei 37°C für eine Stunde in der Anwesenheit von Kulturüberstand von jedem Hybridom (jeweils 10 μg/ml) gezüchtet. Die für die Hybridomclone „JTT-1" und „JTT-2" erhaltenen Ergebnisse werden in 1 und 2 gezeigt.
Es wurde aufgedeckt, dass ein monoclonaler Antikörper, der durch den Hybridomclon „JTT-1" („JTT-1-Antikörper) produziert wurde, FLT435-Zellen stark agglutinierte (1(b) und 2(c)) und dass die Zugabe von „JTT-2-Antikörper die Aggregation von FTL435-Zellen stark hemmte, die durch die „JTT-1-Antikörper"-Stimulation induziert wurde (1(d)). Die Tests, in welchen kein Hybridomüberstand hinzugefügt wurde, wurden als Kontrollen verwendet (1(a) und 2(a)).
Um zu bestimmen, ob die durch die „JTT-1-Antikörper"-Stimulation induzierte FTL435-Zellaggregation, durch die Zelladhäsion zwischen dem interzellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) und dem Lymphocyten-Funktion-assoziierten Antigen-1 (LFA-1) verursacht war, welches ein repräsentativer bekannter Weg der Zelladhäsion ist, wurden FTL435-Zellen bei 37°C für eine Stunde in der Anwesenheit von anti-Ratten-ICAM-1-Antikörper 1A29 (10 μg/ml; IgG1) oder anti-Ratten-LFA-1-Antikörper (10 μg/ml; IgG2a) gemeinsam mit „JTT-1-Antikörper gezüchtet.
Die Aggregation von FTL435-Zellen durch „JTT-1-Antikörper"-Stimulation wurde weder durch den anti-ICAM-1-Antikörper noch durch den anti-LFA-1-Antikörper (anti-ICAM-1-Antikörper, 1(c) und 2(f); anti-LFA-1-Antikörper, 2(d)) gehemmt.
Um die Zellagglutinationsfähigkeit des „JTT-1-Antikörpers" weiter zu analysieren, wurde die Fähigkeit, Ratten-Lymphoblastenzellen zu agglutinieren, die mit Concanavalin A-Stimulation aktiviert wurden, in der gleichen Weise, wie vorstehend erwähnt, analysiert. Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt.
Ähnlich zu dem Effekt auf FTL435-Zellen wurde die Aggregation von aktivierten Lymphoblastenzellen durch „JTT-1-Antikörper"-Stimulation induziert (2(i)). Die Aggregation von aktivierten Lymphoblastenzellen durch „JTT-1-Antikörper"-Stimulation wurde hauptsächlich durch den anti-LFA-1-Antikörper (2(j)) und den anti-ICAM-1-Antikörper (2(1)) gehemmt. (Partielle Aggregation fand jedoch statt).
Wie aus dem Kontrolltest verstanden (2(g), in welchem kein Antikörper hinzugefügt wurde, zeigten aktivierte Lymphocyten wie zum Beispiel aktivierte Lymphoblasten keine Aggregation durch Zelladhäsion, wenn sie nicht die Stimulation mit Phorbolmyristatacetat (PMA, das LFA-1 aktiviert) (2(h)) oder „JTT-1-Antikörper" (2(I)) erhielten. Daher deutet die Tatsache, dass anti-LFA-1-Antikörper die Zellaggregation durch „JTT-1-Antikörper"-Stimulation teilweise hemmte, darauf hin, dass LFA-1 in aktivierten Lymphoblastenzellen durch „JTT-1-Antikörper"-Stimulation aktiviert wurde. Das deutet auch darauf hin, dass Moleküle, die durch den „JTT-1-Antikörper" erkannt werden, in einigen Signalübertragungen beteiligt sind.
Die Hybridomclone „JTT-1" und „JTT-2" sind unter dem Budapester Vertrag bei der internationalen Hinterlegungsbehörde, dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) seit dem 11. Oktober 1996 mit den internationalen Zugangsnummern FERM BP-5707 bzw. FERM BP-5708 hinterlegt worden.
Analyse unter Verwendung des monoclonalen Maus-Antikörper-Isotypen-Identifikationskits (Amersham) ergab, dass die Isotypen der monoclonalen Antikörper, die von jedem Hybridom produziert wurden (JTT-1-Antikörper und JTT-2-Antikörper) beide IgG1 waren.
Beispiel 3 Reaktivität des „JTT-1-Antikörpers" und „JTT-2-Antikörpers" mit verschiedenen Zellen
Um die Expressionsmuster der Moleküle, die durch den „JTT-1-Antikörper" und „JTT-2-Antikörper" erkannt werden, in verschiedenen Zellen zu analysieren, wurden die Reaktivitäten der Antikörper mit verschiedenen Zellen untersucht. Moleküle, die durch den „JTT-1-Antikörper" oder „JTT-2-Antikörper" erkannt werden, wurden als „JTT-1-Antigen" bzw. „JTT-2-Antigen" bezeichnet.
Eine 5 bis 10 Wochen alte Wistar-Ratte (150 bis 250 g) wurde durch Anästhesie mit Diethylether getötet. Der Thymus und die Milz wurden aus dem Thorax bzw. Abdomen durch Celiotomie entnommen und homogenisiert, um eine Zellsuspension zu erzeugen. Die daraus resultieren Milzzellen wurden in RPMI1640-Medium, das 2 μg/ml Concanavalin A und 10% FKS enthielt, für 3 Tage bei 37°C gezüchtet, um aktivierte Lymphoblasten zu produzieren.
FTL435-Zellen, Thymocyten, Milzzellen und aktivierte Lymphoblasten (jeweils 5 × 10⁵ Zellen) wurden mit „JTT-1-Antikörper" oder „JTT-2-Antikörper" und dann mit FITC-markiertem anti-Maus-IgG (Cappel) umgesetzt. Die Fluoreszenzintensität der gefärbten Zellen wurde mit einem EPICS-Elite-Durchfluss-Cytometer gemessen.
Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. In FTL435-Zelllen wurde sowohl die starke Expression von „JTT-1-Antigen" als auch von „JTT-2-Antigen" beobachtet. Während die Antigene in Thymocyten exprimiert wurden, wurden sie in Milzzellen nur wenig exprimiert. In aktivierten Lymphoblasten jedoch, die durch Stimulation von Milzzellen mit Concanavalin A erhalten wurden, wurden „JTT-1-Antigen" und JTT-2- Antigen" stark exprimiert. Außerdem stimmte das Expressionsmuster des „JTT-1-Antigens" und JTT-2-Antigens" in jeder Art von Zellen miteinander überein. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das „JTT-1-Antigen" und JTT-2-Antigen" die gleichen Moleküle sind.
Beispiel 4 Reaktivität des „JTT-1-Antikörpers" mit verschiedenen Lymphocyten-Zellen
Um die Expressionsmuster von Molekülen („JTT-1-Antigen"), die durch den „JTT-1-Antikörper" erkannt werden, in verschiedenen Lymphocyten-Zellen zu analysieren wurde die Reaktivität des „JTT-1-Antikörpers" mit Lymphknoten, T-Lymphoblasten, die aus der Milz stammten, und B-Lymphoblasten, die aus der Milz von zwei Arten von Ratten stammten (Wistar-Ratte und F344-Ratte), analysiert.
Eine fünf bis zehn Wochen alte Wistar-Ratte und F344-Ratte (150 bis 250 g) wurden durch Anästhesie mit Diethylether getötet. Die Lymphknoten und Milz wurden aus jeder Ratte durch Celiotomie entfernt und homogenisiert, um eine Zellsuspension zu erzeugen. Die resultierende Zellsuspension aus der Milz wurde für 3 Tage bei 37°C in RPMI1640-Medium gezüchtet, welches 2 μg/ml Concanavalin A (ConA) und 10% FKS enthielt. Aktivierte T-Lymphoblasten und aktivierte B-Lymphoblasten wurden aus jeder Ratte nach einer Züchtung von einem Tag und drei Tagen erhalten. Außerdem wurden aus der Milz stammende T-Lymphoblasten und B-Lymphoblasten als Kontrolle verwendet, die erhalten wurden, bevor Lymphknotenzellen und ConA hinzugefügt wurden.
Alle Zellen (jeweils 5 × 10⁵ Zellen) wurden mit Biotin-markierten anti-Ratten-T-Zellantikörper oder Biotin-markierten anti-Ratten B-Zell-Antikörper (10 μg/ml Seikagaku Corporation) und anschließend mit Phycoerythrin-markiertem Streptavidin umgesetzt. Die Zellen wurden dann mit 10 μg/ml FITC-markiertem „JTT-1-Antikörper" umgesetzt. Die Fluoreszenzintensität der gefärbten Zellen wurde mit einem EPICS-Elite-Durchfluss-Cytometer gemessen.
Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt. Sowohl in aktivierten T-Lymphoblasten als auch in aktivierten B-Lymphoblasten aus Wistar-Ratte und F344-Ratte wurde die starke Expression des „JTT-1-Antigens" von Tag 1 der Aktivierung mit ConA-Stimulation beobachtet. Außerdem stimmte das Expressionsmuster des „JTT-1-Antigens" in jeder Art von Zellen fast perfekt miteinander überein.
Beispiel 5 Charakterisierung von „JTT-1-Antigen" und „JTT-2-Antigen" durch Immunpräzipitation
„JTT-1-Antigen" und „JTT-2-Antigen" wurden durch Immunpräzipitation unter Verwendung von FTL435-Zellen charakterisiert.
(1) Erzeugung von biotinylierten löslichen Zelloberflächenmolekülen
FTL435-Zellen wurden mit PBS gewaschen, in physiologischer Salzlösung suspendiert, die 100 μg/ml NHS-Biotin und 0,1 HEPES (pH-Wert 8,0) enthielt, um 1 × 10⁷ Zellen/ml zu enthalten, und bei Raumtemperatur für 40 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, Lysepuffer (1% NP-40, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 0,15 M NaCl) wurde hinzu gefügt, um auf 5 × 10⁷ Zellen/ml einzustellen, und dem Gemisch wurde ermöglicht, bei 4°C für 30 Minuten zu reagieren, um die Zellen zu lysieren. Das erhaltene Zelllysat wurde zentrifugiert und der Überstand, der biotinylierte lösliche Zelloberflächenmoleküle enthielt, wurde bei -80°C gelagert.
(2) Immunpräzipitation und SDS-PAGE-Analyse
Die gereinigte, in Beispiel 1 erzeugte Probe des „JTT-1-Antikörpers", der durch das übliche Verfahren aus dem Kulturüberstand des Hybridomclons „JTT-1" gereinigt wurde, wurde mit Protein G-Sepharoseperlen gemischt, um auf 2 mg/ml einzustellen, und ihr wurde ermöglicht, bei 4°C für 1 Stunde zu reagieren, um den Antikörper an die Perlen zu binden. Nachdem die Perlen gewaschen waren, wurden 500 μl des biotinylierten FTL435-Zelllysats zu 10 μl der Perlen hinzugefügt und dem Gemisch wurde ermöglicht, bei 4°C für 2 Stunden zu reagieren. Nachdem die Perlen mit Lysepuffer dreimal gewaschen wurden, wurden 50 μl Glycanasepuffer (Natrium-Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0), der 0,15% SDS enthält) zu den Perlen hinzugefügt und das Gemisch wurde gekocht, um die gebundenen Moleküle, die durch die Antikörper-gebundenen Perlen gefangen waren, zu eluieren. 1,25% NP-40 und 20 E/ml N-Glycanase wurden zu einer Fraktion der auf diese Weise eluierten Probe hinzugefügt und dem Gemisch wurde ermöglicht, über Nacht zu reagieren, um N-gekoppelte Zuckerketten zu spalten.
Ein gleiches Volumen an Probenpuffer (Enprotech) für SDS-PAGE wurde zu 5 μl der eluierten Probe in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 2-Mercaptoethanol hinzugefügt und das Gemisch wurde gekocht. Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membran wurde mit 3% BSA-PBS blockiert und mit Peroxidase-markiertem Streptavidin umgesetzt, um mit dem ECL-System (Amersham), wie im Handbuch beschrieben, biotinylierte, lösliche, durch den „JTT-1-Antikörper" gefangene Zelloberflächenmoleküle nachzuweisen.
Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt. Das durch „JTT-1-Antikörper" erkannte Molekül („JTT-1-Antigen") auf FTL435-Zellen zeigte das Molekulargewicht von etwa 47 kDa unter den nicht reduzierten Bedingungen („(-)" in 5) und etwa 24 kD und 28 kD unter den reduzierten Bedingungen („(+)" in 5). Als Folge der Spaltung der N-gekoppelten Zuckerketten („+N-gly" in 5) wurde das „JTT-1-Antigen" auf eine einzelne Bande von etwa 36 kD unter den nicht reduzierten Bedingungen und etwa 20 kD unter den reduzierten Bedingungen konvergiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das „JTT-1-Antigen" ein Dimer bildet, in welchem die gleichen Kernproteine unterschiedliche Zuckerketten aufweisen. Vollkommen die gleichen Ergebnisse wurden in dem Experiment erhalten, das, wie vorstehend erwähnt, unter Verwendung des „JTT-2-Antikörpers" durchgeführt wurde. Betrachtet man diese Ergebnisse gemeinsam mit den Ergebnissen von Beispiel 3 und Beispiel 7 nachstehend, wird angenommen, dass das „JTT-1-Antigen" (Molekül, das durch den „JTT-1-Antikörper" erkannt wird) und das „JTT-2-Antigen" (Molekül, das durch den „JTT-1-Antikörper" erkannt wird) miteinander identisch sind.
Beispiel 6 Adhäsionsexperiment von Ratten-Thymocyten an gereinigtes „JTT-1-Antigen" und N-terminale Aminosäureanalyse
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um zu analysieren, ob das Molekül, das der „JTT-1-Antikörper" erkennt („JTT-1-Antigen"), als ein Adhäsionsmolekül wirkt. N-terminate Aminosäureanalyse wurde auch durchgeführt.
(1) Erzeugung der „JTT-1-Antikörper"- Affinitätssäule
Die gereinigte Probe (2 mg in 2 ml) des „JTT-1-Antikörpers", der durch das übliche Verfahren aus dem in Beispiel 1 erzeugten Kulturüberstand des Hybridomclons „JTT-1" gereinigt wurde, wurde mit 1 ml an Protein G-Sepharoseharz gemischt und dem Gemisch wurde ermöglicht, bei 4°C für eine Stunde zu reagieren. Das Harz wurde dreimal mit 200 mM Triethanolamin (pH-Wert 8,2) gewaschen. Das Harz wurde dann in Triethanolamin (pH-Wert 8,2), das 10 mM Dimethyl-Pimelimidat (DMP) enthielt bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert, um den „JTT-1-Antikörper" kovalent an das Harz zu binden.
(2) Reinigung des „JTT-1-Antigens"
FTL435-Zellen wurden in RPMI1640-Medium gezüchtet, das 10% FKS enthielt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, um ein Pellet zu erhalten, und mit PBS dreimal gewaschen. Lysepufter (1% NP-40, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 0,15 M NaCl) wurde zu dem gewaschenen Pellet hinzugefügt, um auf 5 × 10⁷ Zellen/ml einzustellen, und dem Gemisch wurde ermöglicht, bei 4°C für 30 Minuten zu reagieren, um die Zellen zu lysieren. Das erhaltene Zelllysat wurde zentrifugiert und der die löslichen Zelloberflächenmoleküle enthaltende Überstand wurde bei – 80°C gelagert.
Das Lysat (400 ml) wurde auf eine „JTT-1-Antikörper"-Affinitätssäule geladen. Danach wurde die Säule mit 50 ml des Lysepufters und 20 ml PBS gewaschen, „JTT-1-Antigen" wurde mit 0,2 M Glycinpuffer (pH-Wert 2,8) eluiert. 1 M Tris-Puffer wurde zu dem auf diese Weise eluierten „JTT-1-Antigen" zur Neutralisierung hinzugefügt. Das erhaltene „JTT-1-Antigen" wurde bei -80°C gelagert.
(3) Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz
Nachdem das gereinigte „JTT-1-Antigen" einer SDS-PAGE unterzogen worden war, wurde die N-terminate Aminosäuresequenz durch das übliche Verfahren bestimmt. Das Ergebnis offenbarte, dass das „JTT-1-Antigen" die Aminosäuresequenz Glu-Leu-Asn-Asp-Leu-Ala-Asn-His-Arg enthielt.
(4) Adhäsionsexperiment
Eine fünf bis zehn Wochen alte Wistar-Ratte (150 bis 250 g) wurde durch Anästhesie mit Diethylether getötet. Der Thymus wurde durch Celiotomie aus ihrem Thorax entnommen und homogenisiert, um eine Thymocytensuspension zu erzeugen. 10 μM 2',7'-Bis(carboxyethyl)carboxyfluorescein-tetraacetoxy-methylester (BCECF-AM; Molecular Probes) wurden zu der Suspension hinzugefügt und das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, um die Thymocyten fluoreszierend zu markieren. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in RPMI1640-Medium suspendiert, das 10% FKS enthielt, um auf 2 × 10⁷ Zellen/ml einzustellen.
Eine ELISA-Platte mit 96-Vertiefungen wurde mit dem gereinigten, in (2) erhaltenen „JTT-1-Antigen" bei einer Konzentration von 10 μl/Vertiefung über Nacht beschichtet. Danach wurde die Platte mit PBS gewaschen, 200 μl/Vertiefung an PBS, das 3% Rinderserumalbumin enthielt, wurden zu der Platte hinzugefügt und eine Blockierung wurde für 2 Stunden durchgeführt. Nachdem die Platte mit PBS gewaschen worden war, wurden (1) nur fluoreszenzmarkierte Thymocyten (2 × 10⁷ Zellen/ml, 0,1 ml), (2) fluoreszenzmarkierte Thymocyten (gleiche Konzentration) und „JTT-1-Antikörper"-Fab-Fragmente, die durch das übliche Verfahren erzeugt wurden (5 μg/ml), oder (3) fluoreszenzmarkierte Thymocyten (gleiche Konzentration), die „JTT-1-Antikörper"-Fab-Fragmente (gleiche Konzentration) und „JTT-2-Antikörper" (10 μg/ml) zu jeder Vertiefung hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde gezüchtet. Um nicht gebundene Zellen zu entfernen, wurde jede Vertiefung einmal mit RPMI1640-Medium, das 10% FKS enthielt, gewaschen. Jede Vertiefung wurde mit dem Lichtmikroskop betrachtet. Dann wurden zu jeder Vertiefung 100 μl 0,1% NP-40 hinzugefügt und die an der Platte angehafteten Zellen wurden lysiert. Die relative Zellzahl an fluoreszenzmarkierten Thymocyten, die an jeder Vertiefung anhafteten, wurden durch Messung der Fluoreszenzintensität bei 538 nm (angeregt bei 485 nm) mit einem Fluoroscan II Mikroplate Fluorometer (Flow Laboratories) gezählt. Der Test, bei welchem eine Platte nicht mit gereinigtem „JTT-1-Antigen" beschichtet war, wurde als eine Kontrolle verwendet.
Die Ergebnisse der lichtmikroskopischen Betrachtung werden in 6 gezeigt.
Thymocyten hafteten nur in der Anwesenheit von „JTT-1-Antikörper"-Fab-Fragmenten (6(c)) in beträchtlichem Ausmaß an dem gereinigten „JTT-1-Antigen". Die Adhäsion wurde durch den „JTT-2-Antikörper" erheblich gehemmt (6(d)).
7 zeigt die relative Zellzahl der Thymocyten, die an „JTT-1-Antigen" anhafteten, mit dem jede Vertiefung beschichtet ist, ausgedrückt als Fluoreszenzintensität.
Anhand dieser Ergebnisse wurde aufgedeckt, dass „JTT-1-Antigen" als ein Adhäsionsmolekül wirkt.
Beispiel 7 Clonierung der cDNA, die das Ratten-„JTT-1-Antigen" codiert.
1. Erzeugung einer cDNA-Bank
1-(1) Extraktion von Poly(A)⁺-RNA aus ConA-stimulierten Ratten-Lymphoblasten
ConA-stimulierte Lymphoblasten (ConA-blast), die aus Rattenmilz stammten (etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml) wurden bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert (2,000 × g). Die ausgefällten Zellen wurden mit ISOGEN (Nippon Gene) suspendiert und mit Chloroform unter Schütteln extrahiert, um den Überstand zu gewinnen. Danach wurde Isopropanol zu dem erhaltenen Überstand hinzugefügt, dem Gemisch wurde ermöglicht, bei Raumtemperatur für 10 Minuten zu stehen, und es wurde bei 12.000 × g bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert, um die RNA auszufällen. Die ausgefällte RNA wurde mit Ethanol gewaschen und in TE-Puffer aufgelöst. Poly(A)⁺-RNA wurde aus der auf diese Weise erhaltenen Gesamt-RNA mit „mRNA Purification Kit" (Pharmacia) gereinigt.
1-(2) Präparation von cDNA
Mit 5 μg Poly(A)⁺-RNA, die vorstehend erzeugt wurde als eine Matrize, wurde cDNA mit dem „Time Saver cDNA Synthesis Kit" (Pharmacia) synthetisiert. „Oligo dT-Primer" (Pharmacia), der eine NotI-Stelle aufwies, wurde verwendet, um die Durchmusterungseffizienz zu erhöhen. EcoRI-Adapter wurde hinzugefügt und die Spaltung mit NotI wurde durchgeführt, um cDNA mit einmaliger Orientierung zu erhalten. Größenfraktionierung wurde dann mit einer Spun Column (Pharmacia) durchgeführt.
1-(3) Insertion in einen Vektor
Die erhaltene cDNA, die EcoRI- und NotI-Enden aufwies, wurde mit pME18S (Hara, T. & Miyajima, A., EMBO J., Bd. 11, Seiten 1875-1884 (1992)) ligiert, das mit EcoRI und NotI gespalten war. „DNA Ligation Kit" (Takara Shuzo) wurde für die Ligierung verwendet. E. coli DH5-Zellen (Toyobo) wurden mit dem auf diese Weise erhaltenen Reaktionsprodukt transformiert. Transformanten wurden kultiviert, bis der O.D.-Wert (bei 600 nm) 0,6 erreichte, und geerntet, um Plasmid-DNAs in einer Bank zu gewinnen. QUIAGEN-Tip (QUIAGEN) wurde zur Reinigung der Plasmid-DNAs verwendet.
2. Durchmusterung der cDNA-Bank
Durchmusterung wurde gemäß dem Panning-Verfahren (Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84, Seiten 3365-3369 (1987)) durchgeführt.
2-(1) Gentransfer in COS-Zellen
Die auf diese Weise erhaltene Bank wurde durch Elektroporation in COS7-Zellen eingeführt (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85, Seiten 2288-2292). Die Transformanten wurden für 60 Stunden nach dem Einführen gezüchtet, der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde mit PBS dreimal gewaschen. Nachdem das Pellet bei 37°C für 30 Minuten mit PBS (das 0,5 mM EDTA enthielt) behandelt worden war, wurden die Zellen durch Pipettieren entfernt. Nur lebende Zellen wurden dann mit „Lymphprep" (NYCOMED) gewonnen.
2-(2) Konzentration der genexprimierenden Zellen durch Panning
Die vorstehend erhaltenen, lebenden Zellen wurden in PBS suspendiert (enthaltend 5% FKS und 0,5 mM EDTA). Die Zellsuspension wurde auf eine Kulturplatte transferiert, die mit „JTT-1-Antikörper" beschichtet war, und bei Raumtemperatur für 3 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen entfernt, die nicht an die Kulturschale banden, und die Kulturschale wurde dreimal mit PBS gewaschen, Plasmid-DNAs wurden aus den Zellen die an die Kulturschale banden, durch das Hirt-Verfahren (Hirt, B., J. Mol. Biol., Bd. 26, Seiten 365-369) gesammelt. E. coli DH10B (GIBCO BRL) wurden mit der so erhaltenen Plasmid-DNA transformiert. Die Plasmid-DNAs wurden mit dem vorstehend in 1-(3) erwähnten Transformanten amplifiziert und gereinigt. Die in (1) und (2) beschriebenen Verfahren wurden dann zweimal wiederholt.
2-(3) Isolation des positiven Clons
Nach dem dritten Panning wurden transformierte E. coli DH10B-Zellen über Nacht auf LB-Platten gezüchtet, die Ampicillin enthielten, um Kolonien zu erhalten. 20 Wirkstoff-resistente Kolonien wurden gezüchtet, Plasmid-DNAs wurden durch das alkalische Miniprep-Verfahen gesammelt (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) und die Insertions-DNA wurde analysiert. Agarose-Gelelektrophorese offenbarte, dass der Clon, der etwa 0,9 kb cDNA enthielt (bezeichnet als „T132A7"), konzentriert war.
„T132A7" wurde in COS7-Zellen, wieder mit dem in (1) beschriebenen Verfahren, transient exprimiert. Danach wurden Zellen in die „T132A7"-eingeführt worden war, mit dem „JTT-1-Antikörper" oder dem „JTT-2-Antikörper" und dann mit FITC-markiertem anti-Maus-IgG (Cappel) umgesetzt, die Fluoreszenzintensität der gefärbten Zellen wurde mit einem EPICS-Elite-Durchflusscytometer (Coulter) gemessen. „JTT-1-Antikörper" und „JTT-2-Antikörper" erkannte das „T132A7"-Genprodukt sehr gut. Die Ergebnisse werden in 8 gezeigt.
3. Bestimmung der Nucleotidsequenz und der Aminosäuresequenz
Die Nucleotidsequenz von Clon „T132A7" wurde durch das Didesoxyverfahren mit „Auto Read Sequencing Kit" (Pharmacia) und dem „A.L.F. DNA Sequencer" (Pharmacia) bestimmt. Außerdem wurde die abgeleitete Aminosäuresequenz des „Ratten JTT-1-Antigens", das durch die Nucleotidsequenz codiert war, mit der Genanalysesoftware „GENEWORKS" (InteIliGenetics) analysiert. Die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz wurden in SEQ ID NO: 4 gezeigt.
Die Aminosäuresequenz (bestehend aus 200 Aminosäureresten), abgeleitet aus dem clonierten Gen, umfasst die gleiche Aminosäuresequenz wie die N-terminale Aminosäuresequenz, die in Beispiel 6-(3) bestimmt wird. Wenn man bedenkt, dass Zellen, in die der Clon „T132A7" eingeführt worden war, mit dem „JTT-1-Antikörper" stark reagierten, kann man daraus folgern, dass der Clon „T132A7" die cDNA umfasst, die das „Ratten-JTT-1-Antigen" codiert.
4. Computeranalyse
Hydropathieanalyse der primären Struktur der abgeleiteten Aminosäuresequenz des „JTT-1-Antigens" wurde gemäß dem Verfahren von Kite und Doolittle (Kite, J. & Doolittle, R.F., J. Mol. Biol., Bd. 157, Seiten 105-132 (1982)) (9) durchgeführt. Die Ergebnisse deckten auf, dass das „JTT-1-Antigen" ein Transmembranprotein ist, das eine Signalsequenz am N-Terminus aufweist. Außerdem deckten die Ergebnisse der Motivanalyse auf, dass das „JTT-1-Antigen" zwei Asn-gekoppelte Zuckerketten-Bindungsstellen in der extrazellulären Domäne und zwei Caseinkinase-Phosphorylierungsstellen und eine Protein-Kinase C Phosphorylierungsstelle in der cytoplasmatischen Domäne aufweist. In 9 bedeutet „CHO" N-gekoppelte-Zuckerketten-Bindungsstelle; „P", Phosphorylierungsstelle; „CKII", Casein-Kinase II; und „PKC", Protein-Kinase C.
Beispiel 8 Clonierung von cDNA, die „menschliches JTT-Antigen" codiert.
1. Herstellung einer Sonde
Die das „Ratten-JTT-1-Antigen" codierende cDNA (etwa 0,9 kb) wurde durch Spalten des in Beispiel 7 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI erhaltenen Clons „T132A7" erzeugt und durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die aufgetrennten DNA-Fragmente wurden mit dem „QUIAEX-Gelextraktionskit" (QUIAGEN) gereinigt und die erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit ³²P unter Verwendung des „Ready-To-Go DNA-Markierungskits" (Pharmacia) markiert. Diese markierten DNA-Fragmente wurden als Sonden für die Plaque-Hybridisierung verwendet.
2. Erzeugung einer cDNA-Bank
2-(1) Extraktion von Poly(A)⁺-RNA
Poly(A)⁺-RNA wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 7-1-(1) aus ConAstimulierten Lymphoblasten (ConA blast) extrahiert, die aus menschlichem peripherem Blut stammten.
2-(2) Erzeugung von cDNA
Mit 5 μg der auf diese Weise erzeugten Poly(A)⁺-RNA als eine Matrize wurden cDNAs mit „Oligo-dT-Primer" (Pharmacia) und dem „TimeSaver cDNA-Synthesis Kit" (Pharmacia) synthetisiert. EcoRI-Adapter wurde dann hinzugefügt und eine Größenfraktionierung wurde mit der Spun Column (Pharmacia) durchgeführt.
2-(3) Insertion in einen Vektor und Verpackung
Die auf diese Weise erhaltenen cDNAs, die EcoRI-Enden aufwiesen, wurden mit dem mit EcoRI gespaltenen Vektor „λZAPII" (Stratagene) ligiert. „DNA-Ligation Kit" (Takara Shuzo) wurde für die Ligierung verwendet. Danach wurde die in vitro-Verpackung der ligierten DNA mit „GIGA PACK II GOLD" (Stratagene) durchgeführt, E. coli XL1Blue MRF'-Zellen (Stratagene) wurden mit dem erhaltenen Phagenpartikel transfiziert, um eine cDNA-Bank zu erhalten, die sich aus Plaques zusammensetzte, die rekombinante Phagen umfassten.
3. Durchmusterung der cDNA-Bank
Die cDNA-Bank wurde durch das Plaque-Hybridisierungsverfahren (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) mit „Rapid-Hybridisierungspuffer" (Amersham) durchmustert. Zuerst wurde die so erhaltene cDNA-Bank (1 × 10⁴) auf Agar-Platten ausplattiert und die Replika wurden mit „Hybond-N-Nylonmembran" (Amersham) hergestellt. Plaque-Hybridisierung wurde in „Rapid-Hybridisierungspuffer" (Amersham) unter Verwendung der Replika und der in Beispiel 8-1 hergestellten ³²P-markierten Sonde durchgeführt. Erste und zweite Durchmusterungen wurden durchgeführt, um acht positive Clone zu erhalten. Einzelne Plaques von jedem Clon wurden isoliert und in Übereinstimmung mit dem Handbuch (Stratagene) in vivo einem Ausschneiden unterzogen und sieben positive Clone wurden als Plasmid-DNA gewonnen.
4. Bestimmung der Nucleotidsequenz
Die Nucleotidsequenzen der sieben Clone wurden durch das Didesoxyverfahren mit dem „Auto-Read Sequencing Kit" (Pharmacia) und dem „A.L.F. DNA Sequencer" (Pharmacia) bestimmt. Die sieben Clone umfassen die gleiche Nucleotidsequenz. Es wurde festgestellt, dass Clon „pBSh41" die gesamte Länge des „menschlichen JTT-1-Antigens" codiert. Die cDNA-Sequenz, die dem offenen Leserahmen (ORF) des „menschlichen JTT-1-Antigens" entspricht, wird in SEQ ID NO: 1 gezeigt, die gesamte Länge der abgeleiteten Aminosäuresequenz des „menschlichen JTT-1-Antigens" wird in SEQ ID NO: 2 gezeigt und die Nucleotidsequenz, umfassend die 5'- und 3'-Sequenzen, wird in SEQ ID NO: 3 gezeigt (ORF entspricht den Nucleotidresten 26 bis 625). Offenbar codiert die Nucleotidsequenz, die in dem Clon enthalten ist, die gesamte Länge des „menschlichen JTT-1-Antigens", da die Aminosäuresequenz (bestehend aus 199 Aminosäureresten), abgeleitet von der Nucleotidsequenz, wesentliche Homologie mit der Aminosäuresequenz des „Ratten-JTT-1-Antigens" (10) aufweist. Wie in 10 gezeigt, ist die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen des Menschen- und des Ratten-„JTT-1-Antigens" 60% oder mehr.
Mit dem Clon „pBSh41" transformierter E. coli DH10B (GIBCO BRL) ist unter dem Budapester Vertrag bei der internationalen Hinterlegungsbehörde, dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) seit dem 25. Oktober 1996 hinterlegt worden (internationale Hinterlegungs-Zugangsnummer FERM BP-5725).
5. Strukturelle Eigenschaften und biologische Funktion des „JTT-1-Antigens"
Die Ergebnisse der Motivsuche für die abgeleitete Aminosäuresequenz des „menschlichen JTT-1-Antigens" unter bekannten menschlichen Proteinen deckten auf, dass das „menschliche JTT-1-Antigen" strukturelle Ähnlichkeit mit „CD28" und „CTLA-4" hat, vom Menschen stammenden Zellmembranproteinen, die zur Immunglobulin-Überfamilie gehören und vorstehend genau erwähnt wurden (11 und 12). Wie vorstehend erwähnt, sind „CD28" und „CTLA-4" sehr wichtige Moleküle, welche die Aktivierung und Hemmung von T-Zellen im Immunsystem regulieren.
Die strukturelle Ähnlichkeit ist wie folgt

1. 20 oder mehr Aminosäurereste, einschließlich Cysteinreste, sind hoch konserviert.
2. Prolin-Wiederholungssequenz, „Pro-Pro-Pro (PPP)", die als Liganden-Bindungsregion in CD28 und CTLA-4 unerlässlich ist, ist konserviert.
3. „Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM)" (Xaa und × stellen irgendeine Aminosäure dar) eine Sequenz, die als die Signalübertragungsregion in CD28 und CTLA-4 unerlässlich ist, ist in der cytoplasmatischen Region konserviert.

Von der Tatsache, dass die gleiche Struktur mit der spezifischen Struktur von „CD28" und „CTLA-4", welche in der Regulation der Aktivierung von T-Zellen, welche die Hauptdarsteller im Immunmechanismus sind, eine wichtige Rolle spielen, wird gefolgert, dass das „JTT-1-Antigen" der vorliegenden Erfindung wie diese Moleküle eine wichtige Rolle in der Regulation der Aktivierung von Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen spielt, die ein Hauptdarsteller in der Immunantwort sind.
Beispiel 9 Clonierung von cDNA, die das Maus JTT-1-Antigen" codiert
1. Herstellung einer Sonde
Die das „Ratten JTT-1-Antigen" codierende cDNA (etwa 0,9 kb) wurde durch Spalten des in Beispiel 7 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI erhaltenen Clons „T132A7" erzeugt und durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die auf diese Weise aufgetrennten DNA-Fragmente wurden mit dem „QUIAEX-Gelextraktionskit" (QUIAGEN) gereinigt und die DNA-Fragmente wurden mit ³²P unter Verwendung des „Ready-To-Go DNA-Markierungskits" (Pharmacia) markiert.
Diese markierten DNA-Fragmente wurden als Sonden für die Plaque-Hybridisierung verwendet.
2. Herstellung einer cDNA-Bank
2-(1) Extraktion von Poly(A)⁺-RNA
Wie in Beispiel 7-1-(1) wurde Poly(A)⁺-RNA aus ConA-stimulierten Lymphoblasten (ConA blast) extrahiert, die aus einer Mausmilz stammten (etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml).
2-(2) Herstellung einer cDNA-Bank
Mit 5 mg der vorstehend erzeugten Poly(A)⁺-RNAs als eine Matrize wurden cDNAs mit Oligo-dT-Primer (Pharmacia) und „Time Saver cDNA Synthesis Kit" (Pharmacia) synthetisiert. Danach wurde ein EcoRI-Adapter zu der cDNA hinzugefügt, eine Größenfraktionierung wurde mit der Spun Column (Pharmacia) durchgeführt.
2-(3) Insertion der cDNA in einen Vektor und Verpackung
Die auf diese Weise erhaltene cDNA, die EcoRI-Enden aufwies, wurde mit dem mit EcoRI gespaltenen Vektor IZAPII (Stratagene) ligiert. „DNA Ligation Kit" (Takara Shuzo) wurde für die Ligierung verwendet. Danach wurde die in vitro-Verpackung der ligierten DNA mit GIGA PACK II GOLD (Stratagene) durchgeführt, E. coli XL1Blue MRF'-Zellen (Stratagene) wurden mit dem so erhaltenen Phagenpartikel transfiziert, um eine cDNA-Bank zu erzeugen, die sich aus Plaques zusammensetzte, die rekombinanten Phagen umfassten.
3. Durchmusterung der cDNA-Bank
Die Durchmusterung wurde durch das Plaque-Hybridisierungsverfahren (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) unter Verwendung von Rapid-Hybridisierungspufter (Amersham) durchgeführt.
Die vorstehend erhaltene cDNA-Bank (1 × 10⁴) wurde auf Agar-Platten ausplattiert und die Replika wurden mit Hybond-N-Nylonmembran (Amersham) hergestellt. Plaque-Hybridisierung wurde in Rapid-Hybridisierungspuffer (Amersham) unter Verwendung der Replika und der in Beispiel 9-1 hergestellten ³²P-markierten Sonde durchgeführt. Erste und zweite Durchmusterungen wurden durchgeführt, um fünf positive Clone zu erhalten. Danach wurden einzelne Plaques von jedem Clon isoliert, in vivo-Ausschneiden wurde in Übereinstimmung mit dem Anleitungshandbuch (Stratagene) durchgeführt und fünf positive Clone wurden als Plasmid-DNA gewonnen.
4. Bestimmung der Nucleotidsequenz
Die Nucleotidsequenzen von jedem der fünf Clone wurden durch das Didesoxyverfahren mit dem „Auto Read-Sequencing Kit" (Pharmacia) und dem „A.L.F. DNA-Sequencer" (Pharmacia) bestimmt. Vier der fünf Clone umfassen die gleiche Nucleotidsequenz. Die Nucleotidsequenz der cDNA, welche die gesamte Länge des „Maus-JTT-1-Antigens" codiert und die abgeleitete Aminosäuresequenz werden in der SEQ DI NO: 5 gezeigt.
Wie von 10 verstanden, setzt sich das „Maus-JTT-1-Antigen", wie das „Ratten-JTT-1-Antigen" aus 200 Aminosäureresten zusammen. Die Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen des Maus-, Ratten- und menschlichen „JTT-1-Antigens" ist erheblich (60% oder mehr).
5. Analyse des Locus des „Maus-JTT-1-Antigen"-Gens
Der Locus des Gens, welches das „Maus-JTT-1-Antigen" codiert, wurde durch das in situ-Fluoreszenz-Hybridisierungsverfahren analysiert.
Die aus diese Weise erhaltene cDNA, welche das „Maus-JTT-1-Antigen" codiert, wurde durch das übliche Verfahren mit ³²P markiert, um Hybridisierungssonden zu erzeugen. Unter Verwendung dieser Sonden wurde die genomische 129 SVJ-Maus-DNA-Bank (Stratagene) durchmustert, um genomische Maus-DNA-Clone zu erhalten, welche die das „Maus-JTT-1-Antigen" codierenden Exons enthielten. Die Struktur der genomischen DNA wird schematisch in 13 gezeigt.
Die vorstehend erhaltenen genomischen DNA-Clone wurden mit DigoxigenindUTP durch Nick-Translation markiert, um Sonden zu erzeugen. Die markierten Sonden wurden an gespaltene Maus-DNA gebunden und in der Lösung, die 50% Formaldehyd, 10% Dextran-Sulfat und 2 × SSC enthielt, mit normalen Metaphase-Chromosomen hybridisiert, die von embryonalen Maus-Fibroblasten stammten. Danach wurde ein Objektträger aus Glas für die Hybridisierung mit fluoreszenzmarkiertem anti-Digoxigenin-Antikörper inkubiert, ein spezifisches Hybridisierungssignal wurde durch Färben mit DAPI nachgewiesen. In dem ersten Test wurde der Teil nahe dem größten Chromosom, von dem der DNA-Größe und der aufgetauchten Bande nach angenommen wurde, dass es Chromosom 1 war, spezifisch markiert. Basierend auf dieser Information wurde der vorstehend beschriebene genomische DNA-Clon gleichzeitig mit Sonden hybridisiert, die für die Centromerregion von Chromosom 1 spezifisch waren. Als Folge wurden die Centromerregion von Chromosom 1 und die Regionen nahe davon spezifisch markiert. Zehn Proben von Chromosom 1, die spezifische Hybridisierung zeigten, wurden analysiert und es wurde aufgedeckt, dass der vorstehend erwähnte genomische DNA-Clon an der Position lag, die 33% der Entfernung von der Grenze zwischen Heterochromatin und Euchromatin zum Telomer des Chromosoms 1 ausmachte, nämlich auf der gleichen Bande „1C3" wie der Ort der Maus-„CD28"- und -„CTLA-4"-Gene. Als Folge der Analyse von 80 Metaphasenzellen wurde spezifische Markierung an dieser Position für 79 Zellen identifiziert.
Diese Ergebnisse sowie die in Beispiel 8 erhaltenen Ergebnisse, welche die strukturellen Ähnlichkeiten von „JTT-1-Antigen" zu „CD28" und „CTLA-4" aufzeigen, deuten darauf hin, dass das „JTT-1-Antigen" wie „CD28" und „CTLA-4" ein wichtiges Molekül ist, das an der Regulation der Übertragung eines co-stimulatorischen Signals und/oder der Aktivierung von Lymphocyten beteiligt ist.
Beispiel 10 Clonierung der cDNA, die eine Mutante des „Ratten-JTT-1-Antigens" codiert
Eine andere cDNA, von der angenommen wird, dass sie eine alternative Spleißvariante des in Beispiel 7 clonierten „Ratten-JTT-1-Antigens" codiert, wurde wie folgt cloniert.
1. Herstellung einer Sonde
Die das „Ratten-JTT-1-Antigen" codierende cDNA (etwa 0,9 kb) wurde durch Spalten des in Beispiel 7 erhaltenen Clons „T132A7" mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI erzeugt und durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die aufgetrennten DNA-Fragmente wurden mit dem „QUIAEX-Gelextraktionskit" (QUIAGEN) gereinigt und die erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit ³²P unter Verwendung des „Ready-To-Go-DNA-Markierungskits" (Pharmacia) markiert. Diese markierten DNA-Fragmente wurden als Sonden für die Plaque-Hybridisierung verwendet.
2. Herstellung einer cDNA-Bank
2-(1) Extraktion von Poly(A)⁺-RNA
Wie in Beispiel 7-1-(1) wurde Poly(A)⁺-RNA aus der Ratten-Thymom-Zelllinie FTL435 (etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml) extrahiert.
2-(2) Herstellung einer cDNA-Bank
Mit 5 mg der wie vorstehend erwähnt erzeugten Poly(A)⁺-RNA als eine Matrize wurden unter Verwendung von Oligo-dT-Primer (Pharmacia) und „Time Saver cDNA-Synthesis Kit" (Pharmacia) cDNAs synthetisiert. Danach wurde ein EcoRI-Adapter zu der cDNA hinzugefügt, eine Größenfraktionierung wurde mit der Spun Column (Pharmacia) durchgeführt.
2-(3) Insertion der cDNA in einen Vektor und Verpackung
Die vorstehend erhaltene cDNA, die EcoRI-Enden aufwies, wurde mit dem mit EcoRI gespaltenen Vektor IZAPII (Stratagene) ligiert. „DNA Ligation Kit" (Takara Shuzo) wurde für die Ligierung verwendet. Danach wurde die in vitro-Verpackung der ligierten DNA mit GIGA PACK II GOLD (Stratagene) durchgeführt, E. coli XL1Blue MRF' (Stratagene) wurden mit dem erhaltenen Phagenpartikel transfiziert, um eine cDNA-Bank zu erhalten, die sich aus Plaques zusammensetzte, die rekombinante Phagen umfassten.
3. Durchmusterung der cDNA-Bank
Die Durchmusterung wurde durch das Plaque-HybridisierungsverFahren (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) mit Rapid-Hybridisierungspuffer (Amersham) durchgeführt.
Die vorstehend hergestellte cDNA-Bank (1 × 10⁴) wurde auf Agar-Platten ausplattiert und die Replika wurden mit Hybond-N-Nylonmembran (Amersham) hergestellt. Plaque-Hybridisierung wurde in Rapid-Hybridisierungspuffer (Amersham) unter Verwendung der Replika und der in Beispiel 10-1 hergestellten ³²P-markierten Sonde durchgeführt. Erste und zweite Durchmusterungen wurden durchgeführt, um zwei positive Clone zu erhalten. Danach wurden einzelne Plaques von jedem Clon isoliert, in vivo-Ausschneiden wurde in Übereinstimmung mit dem Anleitungshandbuch (Stratagene) durchgeführt und zwei positive Clone wurde als Plasmid-DNA gewonnen.
4. Bestimmung der Nucleotidsequenz
Die Nucleotidsequenz der beiden Clone wurde durch das Didesoxyverfahren mit dem „Auto-Read-Sequencing Kit" (Pharmacia) und dem „A.L.F. DNA Sequencer" (Pharmacia) bestimmt. Die beiden Clone umfassen die gleiche Nucleotidsequenz. Die Nucleotidsequenz der cDNA, welche die gesamte Länge des erhaltenen „Ratten-JTT-1-Antigens" codiert, und die abgeleitete Aminosäuresequenz, werden in SEQ ID NO: 6 gezeigt. Die von der erhaltenen cDNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) wurde mit der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) verglichen, die von der erhaltenen cDNA-Sequenz abgeleitet wurde, die in Beispiel 7 cloniert wurde und das „Ratten-JTT-1-Antigen" codiert (14). Wie in 14 gezeigt, war die Aminosäuresequenz, die durch die in diesem Test clonierte cDNA codiert wird, genau die gleiche wie die durch die cDNA codierte, die das in Beispiel 7 erhaltene „Ratten-JTT-1-Antigen" codiert, außer dass (1) sich C-terminal drei fortlaufende Aminosäurereste (Met-Thr-Ser) in Thr-Ala-Pro verwandeln und dass (2) nach dem Thr-Ala-Pro 16 fortlaufende Aminosäurereste (Leu-Arg-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly-Glu-His-Ser-Ser-Cys-Gln-Asp-Arg-Asn) angefügt sind. Das deutet darauf hin, dass die in diesem Test clonierte cDNA die alternative Spleißvariante des in Beispiel 7 erhaltenen „Ratten-JTT-1-Antigens" codiert.
Beispiel 11 Herstellung von rekombinanten, „menschliches JTT-1-Antigen"exprimierenden Zellen
Der in Beispiel 8 erhaltene Plasmidclon pBSh41 wurde mit einem EcoRI-Restriktionsenzym gespalten und ein DNA-Fragment, umfassend die cDNA, welche die gesamte Länge des „menschlichen JTT-1-Antigens" codiert, wurde herausgeschnitten. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem DNA-Ligation Kit (Takara Shuzo) in das Plasmid pEFneo inseriert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 91, Seiten 158-162 (1994)), das mit dem gleichen EcoRI-Restriktionsenzym behandelt wurde, um den Expressionsvektor zu erzeugen. CHO-K1-Zellen (ATCC: CCL-61) wurden mit dem Vektor durch Elektroporation transformiert. Durch Züchten der Zellen für etwa zwei Wochen in RPMI1640-Medium, das 0,8 mg/ml Geneticin (GIBCO BRL) und 10% fötales Kälberserum enthielt, wurden Geneticin-resistente Transformanten selektiert. Die Expression des rekombinanten „menschlichen JTT-1-Antigens" wurde durch Northern-Blot-Verfahren durch das übliche Verfahren bestätigt.
Beispiel 12 Herstellung von monoclonalen Antikörpern gegen „menschliches JTT-1-Antigen"
Die rekombinanten, in Beispiel 11 erzeugten, das „menschliche JTT-1-Antigen" exprimierenden Transformanten wurden homogenisiert und ultrazentrifugiert (100.000 × g). Das die Zellmembranfraktion enthaltende Pellet wurde gewonnen und in PBS suspendiert. Die daraus resultierende Suspension, umfassend die Zellmembranfraktion, wurde für die erste Immunisierung (Tag 0) mit komplettem Freudschem Adjuvans in den Fußballen einer BALB/c-Maus injiziert. Das Zellmembranfraktion-Antigen wurde in Intervallen von 7, 14 und 28 Tagen in ihren Fußballen verabreicht. Zwei Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Lymphknotenzellen herausgenommen. Die Lymphknotenzellen und Maus-Myelomzellen PAI (JCR Nr. B0113; Res. Disclosure, Bd. 217, Seite 155 (1982)) wurden bei einem Verhältnis von 5:1 gemischt und unter Verwendung von Polyethylenglycol 4000 (GIBCO) als ein Fusionsmittel fusioniert, um monoclonale, Antikörper-erzeugende Hybridome zu erzeugen. Die Hybridome wurden durch Züchtung in HAT-enthaltendem ASF104-Medium (Ajinomoto) durchmustert, das mit 10% fötalem Kälberserum und Aminopterin ergänzt war. Der Kulturüberstand von jedem Hybridom wurde mit dem in Beispiel 11 erzeugten, rekombinanten, „menschliches JTT-1-Antigen"-exprimierenden Transformanten umgesetzt und die Fluoreszenzintensität der Zellen, die durch die Umsetzung mit FITC-markiertem anti-Maus-IgG (Cappel) gefärbt waren, wurde mit einem EPICS-ELITE-Durchflusscytometer gemessen, um die Reaktivität des monoclonalen Antikörpers zu bestätigen, der in jedem Kulturüberstand gegen das „menschliche JTT-1-Antigen" erzeugt wurde. Es ist bestätigt worden, dass 10 oder mehr Arten an Hybridomen erhalten wurden, die monoclonale Antikörper erzeugen, die mit dem „menschlichen JTT-1-Antigen" reaktiv sind.
Jede von zwei Arten (bezeichnet als Clon SA12 und SG430) unter diesen Hybridomen (10⁶ bis 10⁷ Zellen/0,5 ml/Maus) wurden in eine ICR nu/nu-Maus (weiblich, 7-8 Wochen alt) intraperitoneal injiziert. Nach 10 bis 20 Tagen wurde an den Mäusen Celiotomie unter Anästhesie durchgeführt und die beiden Arten an monoclonalen Antikörpern (SA12 und SG430), die mit dem „menschlichen JTT-1-Antigen" reaktiv waren, wurden durch das übliche Verfahren in einer großen Menge aus der Ascites-Flüssigkeit extrahiert.
Beispiel 13 Effekt der monoclonalen Antikörper gegen „menschliches JTT-1-Antigen" aus menschlichen peripheren Blut-Lymphocyten
Wie in Beispiel 8 erwähnt, wird angenommen, dass das „JTT-1-Antigen" wie „CD28" und „CTLA-4" an der Regulation der Aktivierung von Lymphocyten bei einer Immunreaktion beteiligt sein kann. Um das zu beweisen, wurde der Effekt der monoclonalen Antikörper gegen „menschliches JTT-1-Antigen" auf menschlichen Lymphocyten im Lichte des Zellwachstums als eine Indikation analysiert.
Zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden hinzugefügt (1) entweder SA12 oder SG430 (1 μg/ml), der in Beispiel 12 erzeugte monoclonale Antikörper gegen „menschliches JTT-1-Antigen" oder (2) ein Gemisch von einem der beiden monolconalen Antikörper SA12 oder SG430 (1 μg/ml) mit monoclonalem anti-CD3-Antikörper OKT-3 (1 μg/ml, Orthodiagnostic System), der verwendet wird, um das primäre Signal bei der Aktivierung von Lymphocyten beizusteuern. Die Platte wurde bei 37°C für 1 Stunde inkubiert, um jede Vertiefung mit dem Antikörper zu beschichten. Danach wird die Platte mit RPMI1640-Medium gewaschen, normale menschliche periphere Blut-Lymphocyten (1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt und in RPMI1640-Medium für 3 Tage inkubiert, das 10% fötales Kälberserum enthielt. Falls nötig wurde 1 ng/ml Phorbolmyristatacetat (PMA) hinzugefügt. Dann wurde [³H]-Thymidin (3,7 μkBq/Vertiefung) zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde bei 37°C für 6 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden geerntet und die Menge von in die DNA eingebautem [³H]-Thymidin wurde mit einem Flüssigkeits-Szintillationszähler (Beckman) gemessen. Der Test ohne jeden Antikörper wurde als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse werden in 15 gezeigt.
In dem Test unter Verwendung der Platten, die mit einem der beiden monoclonalen Antikörper SA12 oder SG430 beschichtet waren, erhöhte sich die Zahl der Lymphocyten etwa zehnfach verglichen mit der Kontrolle. In der gleichzeitigen Anwesenheit von OKT3 erhöhte sich die Zahl der Lymphocyten etwa 100-fach, wenn einer der beiden monoclonalen Antikörper SA12 oder SG430 verwendet wurde.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das „JTT-1-Antigen" bei der Regulation der Lymphocyten-Aktivierung wirkt. Die Tatsache, dass sich die Zellwachstumsrate durch die gemeinsame Verwendung mit OKT3 erhöhte, deutet darauf hin, dass das „JTT-1-Antigen wie „CD28" und „CTLA-4" an der Übertragung des co-stimulatorischen Signals beteiligt ist.
Beispiel 14 Effekt des „JTT-2-Antikörpers" auf experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE)
Wie vorstehend genau erwähnt, wurden in letzter Zeit viele Versuche unternommen, die verschiedenen Autoimmunkrankheiten (rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, autoimmune Thyroiditis, allergische Kontaktdermatitis, chronische entzündliche Dermatose wie zum Beispiel Lichenplanus, systemischen Lupus erythematodes, Insulin-abhängigen Diabetes mellitus, Psoriasis usw.) zu behandeln, indem die Übertragung zwischen CD28/CTLA-4 und CD80/CD86 reguliert wurde. Die Wirkung ist schon in verschiedenen Tiermodellen von Autoimmunerkrankungen ((1) ein Modell für menschlichen systemischen Lupus erythematodes (SLE), (2) experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE), ein Modell für multiple Sklerose (MS), (3) ein Modell für Insulin-abhängigen Diabetes mellitus (IDDM), (4) Goodpasture-Nephritismodell und (5) menschliche rheumatoide Arthritis) bestätigt worden.
Um zu bestimmen, ob das „JTT-1-Antigen" der vorliegenden Erfindung ein Molekül ist, das an der Aktivierung oder Hemmung von Lymphocyten beteiligt ist, wie zum Beispiel „CD28" und „CTLA-4", wurden Modellratten für experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE), ein Modell für multiple Sklerose (MS), erzeugt und der Effekt des im Titel benannten monoclonalen Antikörpers auf das „JTT-1-Antigen" in dem Modell wurde analysiert.
Eine Emulsion, die als Immunogen verwendet werden sollte, wurde durch Mischen von cerebrospinalem Hartley-Homogenisat von Meerschweinchen (800 mg/ml physiologische Salzlösung) mit der gleichen Menge an komplettem Freudschem Adjuvans hergestellt. Die Immunisierung wurde durch intradermale Injektion der Emulsion in die linken und rechten Fußballen von 15 Lewis-Ratten (weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 0,25 ml pro Fußballen durchgeführt. Die Verabreichung (Immunisierung) wurde so eingestellt, dass die Dosierungen des hergestellten Homogenisats auf 200 mg pro Ratte eingestellt waren. Diese Immunisierung induziert so experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE).
Die auf diese Weise immunisierten Ratten wurden in drei Gruppen von jeweils fünf Ratten eingeteilt und irgendein Mittel von (1) bis (3) nachstehend wurden sofort nach der Immunisierung (Tag 0) und 3, 6, 9 und 12 Tage nach der Immunisierung intravenös in Mäuse jeder Gruppe injiziert.

(1) Monoclonaler Antikörper „JTT-2-Antikörper" gegen „Ratten-JTT-1-Antigen", der in Beispiel 2 erzeugt wurde (Dosierung: 2 mg/ml PBS, 5 mg/kg)
(2) Prednisolon, Steroidmittel (Dosierung: 4 mg/ml PBS, 10 mg/kg)
(3) Kontrollantikörper nicht reaktiv mit „Ratten-JTT-1-Antigen" (Dosierung: 2 mg/ml PBS, 5 mg/kg)

Ein Symptom wurde im Laufe der Zeit nach der Immunisierung beobachtet. Nachdem der Beginn von EAE festgestellt wurde, wurde der Grad der Symptome durch Einteilen der Symptome, basierend auf den folgenden Kriterien, geschätzt.

(Note 1) Verschwinden der Spannung eines Schwanzes
(Note 2) Nachschleppen der Hinterextremitäten und leicht Paralyse
(Note 3) Nachschleppen der Hinterextremitäten und schwere Paralyse
(Note 4) Paralyse des gesamten Körpers oder Tod.

Die Resultate werden in 16 gezeigt. In der Gruppe, welcher der Kontrollantikörper verabreicht wurde, erreichten die Symptome von EAE den Peak (maximale Punkte) bei Tag 11 bis 15 nach der Immunisierung und dann erholten sie sich allmählich. Im Gegensatz dazu waren in der Gruppe, der „JTT-2-Antikörper" verabreicht wurde, die Symptome von EAE bei Tag 11 nach der Immunisierung erheblich gehemmt. Dieser hemmende Effekt war signifikant höher als der in der Gruppe, der Prednisolon verabreicht wurde.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass „JTT-1-Antigen" ein Molekül ist, das bei der Induktion der Immunantwort wie zum Beispiel Lymphocytenaktivierungen, induziert durch Immunisierung, durch Fremdantigene wirkt und dass die Regulation der Funktion des „JTT-1-Antigens" oder seiner Liganden die Symptome von verschiedenen Autoimmunkrankheiten hemmen kann.
Beispiel 15 Effekt des „JTT-2-Antikörpers" auf Glomerulonephritis
Zum gleichen Zweck wie Beispiel 14 wurde ein Glomerulus-Basalmembran (GBM)-Nephritismodell in Ratten erzeugt und der Effekt des im Titel benannten monoclonalen Antikörpers auf das „JTT-1-Antigen" in dem Modell wurde analysiert.
Danach wurde Rinder-Glomerulus-Basalmembran (Shigei Medical Institute), die mit Collagenase gespalten wurde, mit physiologischer Salzlösung auf 200 μg/ml verdünnt, die Verdünnung wurde mit komplettem Freudschem Adjuvas gemischt, um eine Emulsion zu erzeugen, die als ein Immunogen verwendet wurde. Immunisierung wurde durch intradermale Injektion der Emulsion in beide Hintersolen von 48 Wister Kyoto-Ratten (ungefähr 200 g) unter Anästhesie in einer Menge von etwa 0,2 ml pro Fußballen durchgeführt (Dosierung: etwa 15 μg). Diese Immunisierung induziert auf diese Weise Glomerulus-Basalmembran (GBM)-Nephritis.
Die immunisierten Ratten wurden in acht Gruppen von jeweils sechs Ratten aufgeteilt und jedes Mittel von (1) bis (3) nachstehend wurde in Ratten von jeder Gruppe sofort nach der Immunisierung (Tag 0) und dreimal in einer Woche für 5 aufeinander folgende Wochen injiziert.

(1) Monoclonaler Antikörper „JTT-2-Antikörper" gegen „Ratten-JTT-1-Antigen", erzeugt in Beispiel 2 (Dosierung: 3 mg/kg (2 ml PBS/kg), intravenöse Injektion)
(2) Prednisolon, Steroidmittel als eine positive Kontrolle (aufgelöst in 0,5% Carboxymethylcellulose (CMC) (Dosierung: 3 mg/kg (5 ml/kg), orale Verabreichung)
(3) 0,5% CMC als eine negative Kontrolle (Dosierung: 5 ml/kg, orale Verabreichung)

Nach der Verabreichung eines Testsubstrats wurde sterilisiertes Wasser (25 ml/kg) oral in jede Ratte zwangsverabreicht und Harn wurde über 5 Stunden von jeder Ratte gesammelt, die in einem Stoffwechselkäfig ohne Essen und Trinken gehalten wurde. Danach wurde das Volumen des gesammelten Urins gemessen und die Konzentration der Harnproteine unter Verwendung von Tonein TP-II (Otuka) gemessen und die Harnexkretion von Protein pro fünf Stunden wurde berechnet (Einheit: mg Protein/5 Stunden). Die vorstehend erwähnte Harnsammlung und Messung der Harnproteine wurde in der gleichen Weise 1, 2, 3 und 4 Wochen nach der Impfung (Tag 0) durchgeführt.
Die Ergebnisse werden in 17 gezeigt. Verglichen mit der Kontrollgruppe war die Exkretion von Harnproteinen 3 Wochen nach der Immunisierung in der Gruppe, der „JTT-2-Antikörper" verabreicht wurde, signifikant reduziert.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass „JTT-1-Antigen" ein Molekül ist, das eine Immunantwort wie zum Beispiel Lymphocyten-Aktivierung, induziert durch Immunisierung, durch Fremdantigene induziert und dass die Regulation der Funktion von „JTT-1-Antigen" oder seiner Liganden die Symptome von verschiedenen Autoimmunerkrankungen hemmen kann.
Beispiel 16 Herstellung des Fusionsproteins zwischen „JTT-1-Antigen" und IgFc
Wie in den Beispielen 8 und 13 bis 15 erwähnt, wird vom „JTT-1-Antigen" der vorliegenden Erfindung angenommen, dass es ein Molekül wie „CD28" und „CTLA-4" ist, das an der Übertragung eines co-stimulatorischen Signals beteiligt ist, das an der Regulation der Aktivierung von Lymphocyten beteiligt ist. Wie in Beispiel 14 erwähnt, weist ein Fusionsprotein (CTLA-4-IgFc), zusammengesetzt aus der extrazellulären Domäne von „CTLA-4" und der Fc-Region von menschlichen Immunglobulin IgG1, außerdem Berichten zufolge therapeutische Wirkungen auf verschiedene Autoimmunerkrankungen auf. In diesem Beispiel wurde ein Fusionsprotein, zusammengesetzt aus der extrazellulären Region des „JTT-1-Antigens" und menschlichem IgGFc, wie folgt erzeugt, um zu untersuchen, ob lösliches JTT-1-Antigen wie CTLA-4-IgFc für die Therapie von verschiedenen Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden kann.
(1) Erzeugung des Fusionsproteins zwischen „Ratten-JTT-1-Antigen" und menschlichem IgG1-Fc (rJTT-1-IgFc)
Um die cDNA durch PCR, die die extrazelluläre Region des „Ratten-JTT-1-Antigens" codiert, zu amplifizieren, wurden ein 5'-Primer mit einer XhoI-Restriktionsstelle (5'-CTGCTCGAGATGAAGCCCTACTTCTCG-3', SEQ ID NO: 7) und ein 3'-Primer mit einer BamHI-Restriktionsstelle an ihren Termini aufweist (5'-ACCCTACGGGTAACGGATCCTTCAGCGGCAA-3', SEQ ID NO: 8) entworfen und synthetisiert. Unter Verwendung des in Beispiel 7 erhaltenen cDNA-Clons „T132A7" als, der die gesamte Länge des „Ratten-JTT-1-Antigens" codiert, eine Matrize, wurde PCR mit den Primern durchgeführt, um die cDNA zu erzeugen, welche die cDNA enthält, die die extrazelluläre Region des „Ratten-JTT-1-Antigens" codiert, und die XhoI- und BamHI-Restriktionsstellen an ihren beiden Enden aufweist. Die auf diese Weise erhaltenen PCR-Produkte wurden mit XhoI und BamHI gespalten und durch Agarose-Gelelektorphorese aufgetrennt, um eine etwa 450 by lange Bande zu isolieren, von der vorausgesagt wurde, dass sie ein cDNA-Fragment ist, das eine gewünschte extrazelluläre Region codiert. Das isolierte cDNA-Fragment wurde in pBlueskript II SK (+) (Stratagene) subcloniert, der mit XhoI und BamHI gespalten war. Sequenzanalyse mit einem automatisierten Fluoreszenz-DNA-Sequenziergerät (Applied Biosystem) deckte auf, dass das cDNA-Fragment die Region umfasst, welche die Aminosäuresequenz codiert, die den Aminosäureresten 1 bis 141 des „Ratten-JTT-1-Antigens" (SEQ ID NO: 4) entspricht.
Andererseits wurde die DNA, die Fc von menschlichem IgG1 codiert, als der Fusionspartner als ein etwa 1,3 kb-BamHI-XbaI-DNA-Fragment durch Spalten des Plasmids herausgeschnitten (siehe Cell, Bd. 61, Seiten 1303-1313 (1990)). Erzeugt durch B. Seed et al. (Massachusetts General Hospital)) mit BamHI und XbaI. Dieses Fragment umfasst Exons, welche die menschliche IgG1-Gelenk-Region, Cγ₁2 und Cγ₁3 codieren.
Das XhoI-BamHI-Fragment, das die extrazelluläre Region des „Ratten-JTT-1-Antigens" codiert und das BamHI-XbaI-Fragment, das die Exons umfasst, welche das Fc des menschlichen IgG1 („IgFc") codieren, beide, wie vorstehend erwähnt, erzeugt, wurden in pBluescript II SK (+) (Stratagene) subcloniert, der mit XhoI und XbaI gespalten war.
Dann wurde das Plasmid mit XhoI und XbaI gespalten und ein etwa 1,8 kb-DNA-Fragment herausgeschnitten, das die Fusions-DNA beinhaltet, umfassend die extrazelluläre Region des „Ratten-JTT-1-Antigens" und menschliches IgFc. Dieses Fusions-DNA-Fragment wurde in die XhoI- und XbaI-Stellen des Expressionsvektors pME18S (Medical Immunology, Bd. 20, Nr. 1, Seiten 27-32 (1990); Experimental Medicine: ERGÄNZUNG, „Handbook of Genetic Engineering," Yodosha, Seiten 101-107 (1992)) mit T4 DNA-Ligase inseriert, um das Plasmid prJTT-1-IgFc zu konstruieren.
HEK293-Zellen (ATCC CRL1573), die als Einzelzellschicht subkonfluent in DMEM-Medium gezüchtet wurden, das 10% fötales Kälberserum und Ampicillin enthielt, wurden mit prJTT-1-IgFc durch Elektroporation transformiert, um Transformanten zu erhalten.
Die Transformanten wurden in serumfreien ASF104-Medium für 72 Stunden gezüchtet, um rJTT-1-IgFc zu exprimieren.
Unter Verwendung einer Protein-G-Sepharose-Affinitätssäule (Pharmacia) wurde rJTT-1-IgFc wie folgt gereinigt.
Der Überstand, der durch Zentrifugation des vorstehend erwähnten Kulturmediums erhalten wurde, wurde auf eine vorher in Bindungspuffer äquilibrierte Protein-G-Sepharose-Affinitätssäule geladen. Nachdem die Säule mit Bindungspuffer gewaschen worden war, wurde die Elution mit Elutionspuffer durchgeführt. Das Eluat wurde gewonnen und gegen Phosphatpuffer mit zweimaligem oder mehrmaligem Austausch der externen Lösung dialysiert, um reinen rJTT-1-IgFc zu erhalten.
Das Resultat der Affinitätschromatographie wird in 18 gezeigt und das Resultat der SDS-PAGE des reinen auf diese Weise erhaltenen rJTT-1-IgFc in 19.
(2) Herstellung von Fusionsprotein zwischen „menschlichem JTT-1-Antigen" und menschlichem IgG1-Fc (hJTT-1-IgFc)
hJTT-1-IgFc wurde, wie vorstehend in (1) erwähnt, hergestellt, außer der als eine Matrize verwendeten cDNA und der Primer für die PCR. In diesem Test wurde der Clon „pBSh41 ", der die cDNA umfasst, die das in Beispiel 8 erzeugte „menschliche JTT-1-Antigen" voller Länge codiert, als eine Matrize verwendet und 5'-TAACTGTTTCTCGAGAACATGAAGTCAGGC-3' (SEQ ID NO: 9) und 5'-ATCCTATGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGC-3' (SEQ ID NO: 10) wurden als Primer verwendet.
Das Ergebnis der Affinitätschromatographie wird in 20 gezeigt und das Ergebnis der SDS-PAGE des so erhaltenen reinen hJTT-1-IgFc in 21.
Beispiel 17 Herstellung einer transgenen Maus, in welche die cDNA, die das „Ratten-JTT-1-Antigen" codiert, integriert worden ist.
Die cDNA, welche die gesamte Länge des in Beispiel 7 erhaltenen „Ratten-JTT-1-Antigens" codiert, wurde unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara) in den Expressionsvektor pCAGGS (Gene, Bd. 108, Seiten 193-200 (1991)) inseriert, welcher den Hühner-β-Actin-Promotor aufweist, um Plasmid prJTT-1 zu erhalten. Um eine transgene Maus zu erzeugen, wurde prJTT-1 durch Restriktionsenzymbehandlung linearisiert.
Eine weibliche ICR-Maus, die einen Vaginalstöpsel aufweist und die durch Paaren einer weißen ICR-Maus (Nihon LSC) mit einer männlichen vasoligierten weißen ICR-Maus (Nihon SLC) erhalten wurde, wurde als eine Nährmuttermaus verwendet. Eine Maus zum Erhalten von fertilisierten Eiern zum Einführen eines „Ratten-JTT-1-Antigen"-Gens dorthinein wurde durch Paaren einer weiblichen BDF- 1-Maus (Nihon SLC), bei der durch Verabreichung von PEAMEX (5 Einheiten, Sankyo Zoki) und Pregnil (5 Einheiten, Organon) Superovulation hervorgerufen worden war, mit einer männlichen BDF-1-Maus (Nihon SLC) vorbereitet. Nach der Paarung wurde das Oviduct aus der weiblichen BDF-1-Maus herausgeschnitten und nur fertilisierte Eier wurden durch Hyaluronidasebehandlung erhalten und in einem Medium gelagert.
Das „Ratten-JTT-1-Antigen"-Gen wurde unter dem Mikroskop unter Verwendung eines Manipulators in das fertilisierte Ei gemäß dem üblichen Verfahren eingeführt. Das fertilisierte Ei wurde mit einer Rückhaltenadel fixiert. Eine Lösung, die das vorstehend erwähnte linearisierte Gen enthielt, welches das „Ratten-JTT-1-Antigen" codiert, das mit Tris-EDTA-Puffer verdünnt war, wurde in einen männlichen Pronucleus der fertilisierten Eier mit einer DNA-Einführnadel bei 37°C mikroinjiziert.
Nach der Einführung des Gens wurden nur fertilisierte Eier ausgewählt, die einen normalen Zustand beibehielten, und dann wurde das auf diese Weise fertilisierte Ei, in welches die „Ratten-JTT-1-Antigen"-Gene eingeführt worden waren, in die Ovar-Fimbria im Eierstock einer Pflegemuttermaus (weiße ICR-Maus) inseriert.
Der Schwanz einer Nachkommenmaus (Gründermaus), die von der Nährmuttermaus geboren wurde, wurde abgeschnitten und das genomische Gen wurde daraus gewonnen. Es wurde durch PCR bestätigt, dass das „Ratten-JTT-1-Antigen"-Gen in das Mausgenom integriert war. Dann wurden heterozygote transgene Mäuse, die das „Ratten-JTT-1-Antigen" stark exprimierten, durch Paaren dieser Gründermaus mit einer normalen Maus hergestellt. Homozygote transgene Mäuse können durch Paaren der heterozygoten Mäuse miteinander hergestellt werden.
Das mikroinjizierte Konstrukt, umfassend das „Ratten-JTT-1-Antigen"-Gen, wird schematisch in 22 dargestellt.
Beispiel 18 Herstellung einer Knockout-Maus, deren endogenes Gen, welches das „Maus-JTT-1-Antigen" codiert, inaktiviert worden ist
(1) Konstruktion eines Targeting-Vektors
Ein Targeting-Vektor zur Inaktivierung (knocking out) des endogenen Gens, welches das „Maus-JTT-1-Antigen" codiert durch homologe Rekombination (Nikkei Science, Seiten 52-62 Mai 1994), wurde wie folgt erzeugt.
Das PstI-HindIII-Fragment („homologe DNA (1)"), erhalten durch Spalten des genomischen Maus-DNA-Clons, der die „Maus-JTT-1-Antigen"-codierende Region umfasst, die in Beispiel 9-5 mit PstI und HindIII cloniert wurde, wurde in pGEM-3 (Promega) subcloniert. Dann wurde pGEM-3 mit XhoI linearisiert und das Neomycin-Resistenzgen („neo"), das aus dem pMC1-neo-polyA (Stratagene) herausgeschnitten wurde, indem es mit XhoI und SalI behandelt wurde, stromaufwärts der „homologen DNA (1)" inseriert und dann erfolgte die Ligierung. Der vorstehend erwähnte genomische Maus-DNA-Clon wurde mit XhoI und NotI gespalten, um ein etwa 5,5 kb-Gen („homologe DNA (2)"), das stromaufwärts der vorstehend erwähnten „homologen DNA (1)" liegt, abzuschneiden. Davongetrennt wurde der vorstehend erwähnte pGEM-3, in welchen „neo-homologe-DNA (1)" inseriert worden ist, mit XhoI und HindIII getrennt gespalten, um „neo-homologe DNA (1)" abzuspalten. Auf diese Weise erhaltene „Homologe-DNA (2)" und „neo-homologe DNA (1)" wurden in mit NotI und HindIII linearisierten pSEAP2-CONT (Clontech) subcloniert.
Nachdem das erhaltene Plasmid, in welches die „homologe (2)-neo-homologe (1)" inseriert worden ist, mit NruI stromabwärts der „homologen DNA (1)" gespalten und linearisiert worden war, wurde das Thymidinkinasegen („TK"), das durch Spalten von pMC1-TK (Stratagene) mit PvuII erhalten wurde, stromabwärts der „homologen DNA (1)" inseriert, um einen Targeting-Vektor zu erhalten, in welchem „homologe DNA (2)-neo-homologe (1)" inseriert war.
(2) Einführung des Targeting-Vektors in ES-Zellen
Embryonale Maus-Stammzellen (Nature, Bd. 362, Seiten 255-258 (1993); Nature, Bd. 326, Seiten 292-295 (1987)), die in DMEM-Medium gezüchtet wurden, das 15% fötales Kälberserum enthielt, wurden mit Trypsin behandelt, um als Einzelzellen vorzuliegen, und die Zellen wurden dreimal gewaschen, gefolgt vom Hinzufügen von Phosphatpuffer, um auf 1 × 10⁷ Zellen/ml einzustellen. Der vorstehend erwähnte Targeting-Vektor (25 μg pro 1 ml der Zellsuspension) wurde zu der Zellsuspension hinzugefügt und ein elektrischer Impuls wurde einmal unter den Bedingungen von 350 V/cm (25 μF) verabreicht. Dann wurden 1 × 10⁷ ES-Zellen auf eine 10-cm-Schale ausplattiert und im Beibehaltungsmedium für einen Tag gezüchtet und das Medium wurde gegen Auswahlmedium (das 250 μl/ml G418 und 2 μM Ganciclovir enthält) ausgetauscht. Die Zellen wurden gezüchtet, wobei das Medium alle 2 Tage gewechselt wurde. Am 10. Tag nach der Einführung des Targeting-Vektors wurden 573 Neomycin-resistente ES-Zellclone unter dem Mikroskop mit einer Mikropipette erhalten. Jeder der auf diese Weise erhaltenen ES-Zellclone wurde getrennt auf einer Platte mit 24 Vertiefungen gezüchtet, die mit Feeder-Zellen beschichtet war, um 768 Neomycin-resistente ES-Zellreplika zu erhalten.
(3) Durchmusterung von Knockout-ES-Zellen
Es wurde durch PCR bestätigt, ob das endogene Gen, welches das „Maus-JTT-1-Antigen" codiert, über homologe Rekombination in jedem der Neomycinresistenten ES-Zellen aufgebrochen war (ein Knock-out erfahren hatte).
Für die PCR wurden (1) Primer, die basierend auf der Sequenz des vorstehend-erwähnten Neomycin-resistenten Gens („neo") entworfen und synthetisiert wurden (5'-CGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGC-3', SEQ ID NO: 11), und (2) Primer verwendet, die basierend auf der Sequenz der vorstehend erwähnten „homologen DNA (1)" entworfen und synthetisiert wurden (5'-CATTCAAGTTTCAGGGAACTAGTCCATGCGTTTC-3', SEQ ID NO: 12)
Jede genomische DNA wurde aus jeder der Neomycin-resistenten ES-Zellen extrahiert und PCRs wurden unter Verwendung der Primer mit der genomischen DNA als eine Matrize durchgeführt. PCR wurde mit 1 Reaktionszyklus bei 94°C für 3 Minuten, 30 Reaktionszyklen bei 94°C für 1 Minute, bei 60°C für 1 Minute und bei 72°C für 3,5 Minuten und 1 Reaktionszyklus bei 72°C für 10 Minuten durchgeführt und die daraus resultierenden Produkte wurden bei 4°C gelagert. Wenn ein Fragment mit weniger als etwa 4 kb durch diese PCR amplifiziert wurde, konnte beurteilt werden, ob das endogene Gen, welches das „Maus-JTT-1-Antigen" codiert, durch homologe Rekombination in dem ES-Zellclon aufgebrochen war (ein Knock-out erfahren hatte) war.
Ein erwünschtes PCR-Produkt wurde aus drei von 768 ES-Zellclonen getestet. Genomische Southern-Blots wurden für diese drei Clone für weitere Durchmusterung und Bestätigung erstellt. Nachdem die genomische DNA aus den drei Clonen extrahiert und mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten worden war, wurden die gespaltenen Produkte einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Die daraus resultierenden DNAs wurden auf eine Nylonmembran übertragen und Hybridisierung wurde mit einer Sonde durchgeführt, die aus der genomischen DNA-Sequenz erzeugt wurde, die das „Maus-JTT-1" umfasste. Die Sonde wurde basierend auf der Sequenz außerhalb der Stelle, wo die homologe Rekombination auftrat, entworfen, was es ermöglicht, das Genom des Mutantentyps vom normalen Genomtyp der Größe nach zu unterscheiden.
Als Folge wurden zwei Banden in einem der drei Clone beobachtet, die einem Mutantentyp und normalem Typ entsprachen. Dieser ES-Zellclon wurde für die Herstellung einer nachstehend beschriebenen Knockout-Maus verwendet.
(4) Erzeugung einer Knockout-Maus
Die vorstehend erhaltenen ES-Zellen (15 ES-Zellen pro Blastocyste), deren endogenes Gen, welches das „Maus-JTT-1-Antigen" codiert, durch homologe Rekombination inaktiviert worden ist (ein knock-out erfahren hatte), wurden in Blastocysten mikroinjiziert, die durch Paaren einer weiblichen C57BL6-Maus (Nihon Charles River) mit einer männlichen erhalten wurden. Sofort nach der Mikroinjektion wurden die Blastocysten (etwa 10 Blastocysten pro eine Uterusseite) in den Uterus einer Nährmutter-ICR-Maus (CLEA Japan) transplantiert, welche von der Pseudo-Schwangerschaftsbehandlung eine 2,5-Tage-Maus war. Als Folge wurden insgesamt 38 Nachkommen erhalten und 18 von ihnen waren die erwünschten chimären Mäuse. 11 der chimären Mäuse waren die chimären Mäuse, in welchen der Beitrag zur Haarfarbe mehr als 80% oder mehr darstellte.
Die so erhaltenen chimären Mäuse wurden dann mit normalen C57BL6-Mäusen gepaart, um Agouti-Mäuse zu erhalten, deren Farbe von dem Haarfarbengen der ES-Zellen stammt.
Beispiel 19 Herstellung eines Arzneimittels, das Antikörper umfasst
Jeder der monoclonalen Antikörper (50-150 μg/ml), „JTT-1-Antikörper" und „JTT-2-Antikörper" gegen „Ratten-JTT-1-Antigen", das in Beispiel 1 erzeugt wurde, und monoclonale Antikörper, „SA12" und SG430" gegen „menschliches JTT-1-Antigen", das in Beispiel 12 erzeugt wurde, wurden zu injizierbarem destillierten Wasser (10 ml) hinzugefügt, um eine Injektion herzustellen.
Industrielle Anwendbarkeit
Neue hierin beschriebene und aus Säugern wie zum Beispiel Menschen, Maus und Ratte stammende Zelloberflächenmoleküle (bezeichnet als „JTT-1-Antigen") werden wie folgt charakterisiert.

(1) „JTT-1-Antigen" hat die folgende Ähnlichkeit mit „CD28", einem Zelloberflächenmolekül auf Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen, das ein costimulatorisches Signal, das für die T-Zellaktivierung wichtig ist, durch Zelladhäsion überträgt und „CTLA-4", einem Zelloberflächenmolekül auf Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen, welches die Funktion von aktivierten Lymphocyten wie zum Beispiel aktivierten T-Zellen reguliert, die mit dem Signal kooperieren. (i) 20 oder mehr Aminosäurereste, einschließlich Cysteinreste, sind hoch konserviert; (ii) Prolin-Wiederholungssequenz „Pro-Pro-Pro (PPP)", die als eine Ligandenbindungsregion wesentlich ist, ist in der extrazellulären Region konserviert; (iii) „Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM)" (Xaa und x stellen irgendeine Aminosäure dar), eine Sequenz, die als die Signal-Übertragungsregion wesentlich ist, ist in der cytoplasmatischen Region konserviert; und (iv) Der Ort des Gens, welches das „"Maus-JTT-1-Antigen" auf dem Maus-Chromosom codiert, ist „1C3", wie „CD28" und „CTLA-4".
(2) „JTT-1-Antigen" kann Zelladhäsion von Thymocyten, Lymphoblasten, die mit einem Mitogen wie zum Beispiel ConA stimuliert wurden, Thymomen wie „CD28" und „CTLA-4", die die Zelladhäsion vermitteln, vermitteln.
(3) „JTT-1-Antigen" wird mindestens in Thymocyten, Lymphoblastenzellen, die mit einem Mitogen wie zum Beispiel ConA stimuliert wurden (aktivierten T-Lymphoblastenzellen und aktivierten B-Lymphoblastenzellen usw.), peripheren Blut-Lymphocyten und Thymomen stark exprimiert.
(4) Der Antikörper gegen das „JTT-1-Antigen" vermehrt menschliche periphere Blut-Lymphocyten erheblich und die Proliferation wird in der Anwesenheit eines monoclonalen Antikörpers gegen CD3 verstärkt, der aus einem TcR/CD3-Komplex auf den T-Zellen besteht, die das primäre Signal, das für die T-Zellaktivierung wesentlich ist, von antigenpräsentierenden Zellen erhalten.
(5) Die Verabreichung des Antikörpers gegen das „JTT-1-Antigen" hemmt die Symptome von experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE) signifikant.
(6) Die Verabreichung des Antikörpers gegen das „JTT-1-Antigen" an eine Modellratte für Glomerulus-Basalmembran (GBM)-Nephritis hemmt die Symptome dieser Erkrankung signifikant.

Von dem hierin beschriebenen „JTT-1-Antigen" wird angenommen, dass es wie „CD28" und „CTLA-4" ein Molekül ist, welches das sekundäre Signal (costimulatorische Signal) überträgt, das für die Aktivierung von Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen wesentlich ist, und die Funktion von aktivierten Lymphocyten wie zum Beispiel aktivierten T-Zellen, die mit dem Signal, reguliert.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung, die solche menschlichen Zelloberflächenmoleküle darstellen, ihr Polypeptidfragment und Fusions-Polypeptide davon und vorstehend beschriebene Antikörper dagegen können daher extrem nützliche Arzneimittel zur Therapie oder Prävention von verschiedenen entzündlichen Krankheiten darstellen, insbesondere chronischer entzündlicher Dermatose wie zum Beispiel Lichenplanus, die durch die Aktivierung von Lymphocyten wie zum Beispiel T-Zellen und die Abnormalität der Regulation von aktivierten lymphocytären Funktionen verursacht wird.
Auf ähnliche Weise können die Gene, welche die Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder vorstehend beschriebene Polypeptidfragmente codieren, nicht nur, wie vorstehend erwähnt, für die Gentherapie von verschiedenen Erkrankungen verwendet werden, sondern auch für die Erzeugung von Antisense-Pharmazeutika.
Unter den Antikörpern der vorliegenden Erfindung haben menschliche monoclonale Antikörper und ihre Arzneimittel den pharmazeutischen Wert von Antikörper-Arzneistoffen dramatisch erhöht, da sie keine Antigenität gegen Menschen aufweisen, was ein schwerwiegendes Problem (Nebeneffekt) von Antikörper-Pharmazeutika war, die nicht-menschliche, von Säugern stammende Antikörper wie zum Beispiel aus der Maus stammende Antikörper enthielten.
Die Gene (DNA), Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung und die hierin beschriebenen Polypeptidfragmente sind nicht nur als Pharmazeutika nützlich, sondern auch als Reagenzien zum Suchen nach Molekülen (Liganden), die mit den hierin beschriebenen Zelloberflächenmolekülen interagieren, um die Funktion der Liganden zu klären und Arzneistoffe zu entwickeln, die auf die Liganden abzielen.
Darüber hinaus ist die hierin beschriebene transgene Maus nicht nur als ein Tiermodell zum Studium von physiologischen Funktionen des „JTT-1-Antigens", das ein hierin beschriebenes Zelloberflächenmolekül ist, äußerst nützlich, sondern auch als ein Werkzeug für die Durchmusterung von verschiedenen Arzneistoffen (Verbindungen mit geringem Molekulargewicht, Antikörpern, Antisense-Substanzen, Polypeptiden usw.), die eine die Funktion des „JTT-1-Antigens" regulierende Aktivität (Hemmung, Unterdrückung, Aktivierung, Stimulierung usw.) aufweisen. Genau gesagt können solche Testsubstanzen der transgenen Maus verabreicht werden, um verschiedene physiologische, biologische oder pharmakologische, in der Maus erzeugte Parameter zu messen und zu analysieren und dadurch die Aktivität der verabreichten Testsubstanzen zu beurteilen.
Außerdem kann die hierin beschriebene Knockout-Maus die Funktion der hierin beschriebenen Zelloberflächenmoleküle durch Analysieren der Eigenschaften der Maus von verschiedenen Gesichtspunkten aus klären (physiologische, biologische, pharmakologische, pathologische und genetische Gesichtspunkte). SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nucleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, bestehend aus der in SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenz; (b) einem Nucleinsäuremolekül bestehend aus der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NO:1 gezeigt; (c) einem Nucleinsäuremolekül bestehend aus der Nucleotidsequenz von 26 bis 625 von SEQ ID NO:3; und (d) einem Nucleinsäuremolekül, das ein Polypetpid codiert, bestehend aus der Aminosäuresequenz von 1 bis 140 von SEQ ID NO:2.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das eine cDNA ist.
Gen, das die Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Vektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder das Gen nach Anspruch 3.
Rekombinante Zelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 4.
Rekombinante Zelle nach Anspruch 5, die durch die internationale Hinterlegung mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5725 identifiziert ist.
Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:2 gezeigt.
Antikörper, der für das Polypeptid nach Anspruch 7 spezifisch ist, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ratten-Antikörper, Meerschweinchen-Antikörper, Kaninchen-Antikörper, chimärem Antikörper, humanisiertem Antikörper und menschlichem Antikörper.
Antikörper nach Anspruch 8, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper oder ein Teil des monoclonalen Antikörpers ist, wobei der Teil ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus F(ab')2, Fab' und Fab.
Arzneimittel, umfassend den Antikörper nach Anspruch 8 oder 9 oder einen Teil des monoclonalen Antikörpers wie in Anspruch 9 definiert und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 8 oder 9 oder eines Teils des monoclonalen Antikörpers wie in Anspruch 9 definiert für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen oder zur Verhinderung dieses Krankheitssymptoms.
Antikörper-produzierende Zelle, die den monoclonalen Antikörper nach Anspruch 9 produziert.