KR20020053066A

KR20020053066A - Ａｐｒｉｌ 수용체(ｂｃｍａ) 및 그 용도

Info

Publication number: KR20020053066A
Application number: KR1020027004434A
Authority: KR
Inventors: 슈나이더파스칼; 톰슨제프리; 카체로테레사; 앰브로즈크리스틴; 렌너트폴
Original assignee: 아스트루 마이클 제이; 바이오겐, 인코포레이티드; 베레이, 헨리; 아포테크 알 앤드 디 에스에이
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2002-07-04
Anticipated expiration: 2020-10-05
Also published as: NO20021594L; EP1847273A1; NO331683B1; EP1223964A1; EP2324844A2; HUP0203567A2; EE200200181A; WO2001024811A1; HK1044710B; AU7864500A; MXPA02003393A; KR100759295B1; CA2386463A1; IS6322A; RS51602B; TR200200912T2; CA2386463C; GEP20043375B; YU25302A; BG106670A

Abstract

본 발명은 TNF계 수용체 APRIL-R을 제공한다. 또한, 본 발명은 APRIL-R에 대한 항체 및 키메라 분자, 그리고 그 사용 방법을 제공한다.

Description

ＡＰＲＩＬ 수용체(ＢＣＭＡ) 및 그 용도{APRIL RECEPTOR(BCMA) AND USES THEREOF}

사이토카인의 종양 괴사 인자(TNF)계 일원들은 임계적인 생물학적 기능의 배열(array)을 팽창시키는데 관여한다. TNF계 일원 각각은 수용체 단백질의 평행계 (parallel family)의 일원 1 이상과 결합함으로써 작용한다. 이들 수용체는 차례로 세포내로 신호를 보내서 광범위한 생리학적 또는 발생학적 응답을 유도한다. 많은 수용체는 영향 세포 사멸(influence cell fate)을 신호하고, 종종 터미날 분화를 개시시킨다. 세포 분화의 예에는 증식, 성숙, 이동 및 사멸이 포함된다.

TNF계 일원들은 짧은 세포내 N-터미날 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 및 세포 표면 외부에 위치한 C-터미날 수용체 결합 도메인을 갖는 타입Ⅱ 멤브레인 결합 단백질들이다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 단백질의 세포외 부분은 개열되어 분비형 사이토카인을 생성시킨다. 상기 멤브레인 결합 단백질은, 아마도 그 수용체와의 세포 접촉 매개 상호작용을 통하여, 국소적으로 작용하는 반면, 상기 분비형은 순환 또는 확산될 수 있으므로 원거리 부위에 작용할 수 있다. 멤브레인 결합형 및 분비형 양자 모두는 3량체로 존재하며, 수용체 균주군 형성(clustering)을 촉진함으로써 수용체들에 그 신호를 전달하는 것으로 생각된다.

TNF 수용체 단백질계는 1 이상의 시스테인 리치 세포외 도메인을 보유하는 것을 특징으로 한다. 각 시스테인 리치 영역은 다이설파이드-결합 코어 도메인을 만드는데, 상기 코어 도메인은 리간드 결합 포켓을 형성하는 3차원 구조에 기여한다. 상기 수용체들은, 세포외 도메인이 N-터미날에 의해 암호된 후, 트랜스멤브레인 도메인 및 C-터미날 세포내 도메인으로 이어지는 타입Ⅰ 멤브레인 결합 단백질들이다. 상기 세포내 도메인은 수용체 신호에 책임이 있다. 몇몇 수용체들은 세포 아폽토시스(apoptosis)를 신호할 수 있는 세포내 "사멸 도메인(death domain)"을 포함하는데, 이들은 세포 사멸의 강력한 유도인자(inducer)이다. 다른 부류의 수용체들은 세포 사멸을 약하게 유도할 수 있다; 이들은 사멸 도메인이 결핍되어 있는 것으로 보인다. 세 번째 부류의 수용체들은 세포 사멸을 유도하지 않는다. 모든 부류의 수용체들은 세포 타입 또는 기타 신호의 발생에 따라 세포 사멸 대신 세포 증식 또는 분화를 신호할 수 있다.

TNF계 활성의 다능성(pluripotent nature)의 주지된 예는 노미넌트 일원(nominant member)인 TNF이다. TNF는 멤브레인 결합 사이토카인으로서 존재하거나, 또는 개열 및 분비될 수 있다. 두 가지 형태 모두 두 개의 TNF 수용체, TNF-R55 및 TNF-R75에 결합된다. TNF는 원래 종양 세포를 직접 사멸시키는 그 능력에 기초하여 기술되지만, TNF는 또한 광범위한 배열의 면역 과정, 예를 들어, 급성 면역 반응의 유도 및 림프 조직 항상성의 유지 등도 조절한다. 상기 이중적 역할 때문에, 그러한 사이토카인은 다양한 병리학적 조절(setting)에 역할을 할 수 있으며, 질병 조절인자(modifier)로서 아고니스트 시약 및 안타고니스트 시약 양자 모두로 개발되어 왔다. 예를 들어, TNF 및 LTα(이는 또한 TNF 수용체들을 통하여 신호함)는 암 치료에 이용되어 왔는데, 특히 말초 부위에 있는 암, 예를 들어, 사지 육종과 같은 암의 치료에 이용되어 왔다. 이러한 조절에 있어서, 수용체를 통한 사이토카인의 직접적인 신호에 의하여 종양 세포 사멸이 유도된다(Aggarwal and Natarajan, 1996. Eur Cytokine Netw 7:93-124).

면역학적 조절에 있어서, TNF 수용체 신호를 차단하는 약제(예, 항-TNF mAb, 가용성 TNF-R 융합 단백질)는 류마티스 관절염 및 염증성 장질환과 같은 질병의 치료에 사용되어 왔다. 이러한 병리학에 있어서, TNF는 세포 증식 및 작동인자 (effector) 기능을 유도하는 작용을 함으로써 자가면역 질환을 악화시키므로, 이러한 조절에 있어서 TNF가 그 수용체(들)에 결합하는 것을 차단하는 것은 치료적으로 유익하다(Beutler, 1999. J Rheumatol 26 Suppl 57:16-21).

더욱 최근에 발견된 리간드/수용체 시스템은 유사한 조작을 따르는 것으로 보인다. LTα와 이종3량체를 형성하는 TNF계의 일원 림포톡신 베타(LTβ)는 LTβ-R에 결합한다. LTβ-R을 발현시키는 몇몇 선암종 종양 세포는 아고니스트성 항-LTβ-R mAb로 처리할 때 사멸되거나 분화될 수 있다(Browning 등, 1996. J Exp Med 183: 867-878). 면역학적 조절에 있어서, 항-LTβmAb 또는 가용성 LTβ-R-Ig 융합 단백질은, 아마도 수지상 세포 및 T 세포 상호작용의 영향에 의하여, 염증성 장질환의 발병을 차단할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Mackay 등, 1998. Gastroenterology 115: 1464-1475).

TRAIL 시스템도 암치료 요법으로서의 잠재성을 가지고 있다. TRAIL은 다수의 멤브레인 결합 및 가용성 수용체와 상호작용을 한다. 두 가지의 이들 수용체, TRAIL-R1 및 TRAIL-R2(이는 또한 DR4 및 DR5라고도 불리움)는 종양 세포에 사멸 유도 신호를 보내지만 정상 세포에는 그러한 신호를 보내지 않는데, 이는 사멸을 유도하지 않는 추가의 TRAIL 수용체를 발현시키기 때문이다. 이러한 추가의 수용체는 교란인자(decoy)로서 기능하는 것으로 여겨진다. 가용성 TRAIL의 종양 세포 사멸 용도로의 사용은 정상 조직에 대하여서는 발현되지만 종양 조직에 대해서는 발현되지 않는 교란 수용체(decoy receptor)의 선택적 발현에 따른 것이다(Gura, 1997. Science 277: 768).

종종, 종양 세포 자신이 면역 인식 또는 작동인자 기능을 차단하는 다양한 교란 수용체를 발현시킨다. 실제로, 몇몇 종양은 TRAIL 매개 사멸을 확실히 피하기 위하여 TRAIL 교란 수용체를 과발현시킨다(Sheikh 등, 1999. Oncogene 18: 4153-4159). 이는 몇몇 조절에 있어서 TRAIL을 항-종양제로 사용하는 것을 제한한다. 폐 및 결장암 세포에 의하여 과발현되는 FAS-L에 대한 교란 수용체 및 IL-1 수용체 안타고니스트에 대한 교란 수용체에 대하여서도 상기와 유사한 사실이 관찰되었다(Pitti 등, 1998. Nature 396: 699-703; 및 Mantovani 등, 1998. Ann. N Y Acad. Sci. 840: 338-351). 숙주 방어 기작으로부터 감염 숙주 세포를 보호하는 바이러스 게놈이 교란 수용체를 사용하기도 한다.

APRIL(A ProliferationInducingLigand; 증식 유도 리간드)는 TNF계 단백질의 신규한 일원이다. APRIL 발현 및 기능 연구는 종양 세포가 상기 단백질을 이용하여 신속한 증식을 유도한다는 것을 암시한다. 가용성 APRIL 단백질로 처리하거나 APRIL cDNA로 트랜스펙트(transfect)시킨 종양 세포주는 시험관내에서 신속하게 성장한다. 면역결핍 마우스에 이식한 APRIL 트랜스펙트 세포는 종양으로서 신속하게 성장한다. 결국, 인간 종양 세포(그러나, 정상 조직이 아님)는 고농도의 APRIL 메신저 RNA를 발현시킨다. 이러한 관찰은 APRIL이 종양 세포에 의해서도 발현되는 수용체에 결합되어 자가 분비 또는 측분비 종양 세포 활성화를 일으킨다는 것을 암시한다. 또한, APRIL은 기타 질병의 조절에도 작용할 수 있는데, 예를 들어, APRIL 경로를 활성화시키거나 차단하는 추가의 유용성을 가질 수 있다. 예를 들어, APRIL의 과소발현 또는 과발현은 발달상의 결함에 있어서 역할을 할 수 있는데, 이는 발달이 종종 세포 증식 및 세포 사멸 사이의 주의 깊게 조절된 균형으로 특징지워 지기 때문이다. 유사하게, APRIL은 예를 들어, 세포 집단이 신속하게 팽창하는 염증성 질환(예, 박테리아성 패혈증)과 관련하여, 또는 일부 자가면역 질환(예, 루푸스)과 관련하여 발생하는 것과 같은 세포 증식 질환에 작용할 수 있다.

TNF 및 TNF 수용체계 일원들의 아고니스트 및 안타고니스트들을 질병 조절인자로 사용하는 공지된 용도에 기초할 때, APRIL 경로는 약물 개발에 있어서 그것 자체를 중요한 표적으로 제시한다. 이것은 특히 암 치료 요법에 대하여 진실인데, 왜냐하면 종양 세포는 APRIL을 생성하고 사용하여 그 자신의 성장을 지지하는 것으로 보이고, 따라서 APRIL 경로의 교란 수용체 또는 기타 안타고니스트를 생성할 것 같지 않기 때문이다. 따라서, APRIL 경로는 예를 들어 종양 교란 수용체에 의해서 방해될 수 있는 TRAIL 또는 FAS-L 경로와 독특하게 구별된다.

암에 대한 현재의 치료 방법들은 많은 종양 타입 때문에 불충분하다. 그러한 문제로는 불충분한 효능, 생존에 대한 낮은 효과, 심각한 부작용을 초래하는 독성, 또는 그들의 조합 등이 있다. 따라서, 심각한 부작용을 유발시키지 않으면서 효능을 제공할 수 있는 추가의 암 성장 치료 방법의 확인 및 개발에 대한 필요가 있다. 그래서, APRIL 경로의 안타고니스트, 예를 들어, 항-APRIL mAb, 항-APRIL 수용체 mAb, 가용성 APRIL 수용체-Ig 융합 단백질, 자연적 안타고니스트, 소분자(small molecule) 안타고니스트, 및 화학적, 약학적 또는 기타의 안타고니스트가 유용할 것이다.

이 때문에, 본 발명자들은 APRIL에 대한 수용체로서 B 세포 매개 단백질(BCM 또는 BCMA)을 동정하였다.

본 발명은 일반적인 암 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 특정 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF) 안타고니스트의 투여를 포함한다.

도 1은 벡터 pCCM213.10에서 맵핑된 바와 같은 마우스 APRIL에 대한 cDNA의 핵산 서열(서열 번호: 1) 및 그 유도 아미노산 서열(서열 번호: 3)을 나타낸다.FasL에서 유도된 아미노산 및 myc 에피토프는 밑줄로 나타낸다. APRIL 세포외 도메인 코딩 서열의 시작 부위는 화살표로 나타낸다.

도 2는 포유동물 세포 중의 발현을 위한 FLAG-인간 APRIL 작제물의 핵산 서열(서열 번호: 4) 및 그 유도 아미노산 서열(서열 번호: 6)을 나타낸다. 상기 맵은 신호 서열(1-15); FLAG 에피토프(AA 16-23) 및 인간 APRIL 세포외 도메인 코딩 서열의 시작 부분(32-말단)을 나타낸다.

도 3a는 전장 인간 BCMA의 핵산 서열(서열 번호: 7) 및 아미노산 서열(서열 번호: 8)을 나타낸다. 도 3b는 pJST538의 핵산 서열(서열 번호: 11), 인간 APRIL-R-hIgGFc 융합 작제물을 암호하는 플라스미드 및 그 유도 아미노산 서열(서열 번호: 12)을 나타낸다.

도 4는 쥐의 B 세포 림프종 주 A20에 대한 myc-쥐 APRIL의 결합을 나타낸다. 3번의 개별적 실험은 a)비염색 세포 및 R1532 만으로 염색된 세포, b)RANKL-L 및 R1532로 염색된 세포, 및 c)APRIL 및 무관한 토끼 혈청으로 염색된 세포와 비교한, A20 세포에 대한 APRIL의 특이적 결합을 나타낸다.

도 5는 인간 B 세포 림프종 주 RAJI에 대한 myc-쥐 APRIL의 결합을 나타낸다. 2번의 개별적 실험은 a)비염색 세포 및 R1532 만으로 염색된 세포, 및 RANK-1 및 R1532로 염색된 세포, 및 b)APRIL 및 무관한 토끼 혈청으로 염색된 세포와 비교한, RAJI 세포에 대한 APRIL의 특이적 결합을 나타낸다.

도 6은 A20 세포(a) 및 Raji 세포(b)에 결합하는 APRIL이 가용성 BAFF 단백질 또는 가용성 BCMA-Ig 단백질을 이용하여 경합한다는 것을 나타낸다.

도 7은 다양한 세포주에 대한 FLAG-인간 APRIL의 결합을 나타낸다: a)A20 세포, b)HT29 세포, c)NIH3T3 세포. 특이적 결합은, FLAG-APRIL의 첨가 없이 또는 무관한 아이소타입 대조군 mAb를 이용하여 보여지는 결합과 비교한, 비오틴화된 항-FLAG mAb M2 검출을 이용하여 입증된다.

도 8은 BCMA-Fc 융합 단백질을 이용한 myc-mApril의 면역침강 반응을 나타낸다. 왼쪽 위 패널은 오른쪽 위 음성 대조군과 비교한, 특이적인 hBMCA-Fc/myc-mAPRIL 및 양성 대조군 OPG-Fc/Rank-1 면역침강 반응을 나타낸다. 아래 패널은 적하된 단백질의 양이 등가량임을 나타낸다.

도 9는 FLAG-h APRIL이 hBCMA-fc 융합 단백질에 결합하는 것을 입증하는 ELISA 포맷 실험을 나타낸다. 다양한 수용체-Fc 융합 단백질을 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, FLAG-태그 리간드로 결합시킨다. a)결합 리간드의 검출을 통하여 APRIL 단독 및 hBAFF가 hBCMA-Fc에 특이적으로 결합하나, hCD40-Fc에는 결합하지 않는다는 것이 밝혀졌다. b)용량 적정은 hBCMA-Fc 코팅된 플레이트 상에 hAPRIL 또는 hBAFF를 결합시킨 후 검출된 ELISA 신호가 첨가된 단백질의 양에 선형적으로 의존한다는 것을 보여준다.

도 10은 hBMCA-Fc 융합 단백질에 의한 FLAG-hAPRIL 및 FLAG-hBAFF의 면역침강 반응을 나타낸다. 위쪽 4 패널은 각 면역침강 반응에서의 등가 단백질 적하물을 나타내는 한편, 아래쪽 패널은 hAPRIL 및 hBAFF가 hTRAIN-Fc가 아닌 hBCMA-Fc에 의하여 면역침강된다는 것을 보여준다.

도 11은 hBCMA에만 특이적인 결합을 나타내는 블랭크 또는 hTNF-R80, 또는hBMCA, hLT베타 수용체에 대한 myc-mAPRIL, FLAG-hBAFF 및 FLAG-mBAFF의 결합의 바이아코어(BiaCore) 분석을 타나낸다.

도 12는 BCMA 트랜스펙트 세포에 결합하는 APRIL을 나타낸다. 293EBNA 세포는 전장 hBCMA를 발현시키는 플라스미드로 트랜스펙트된다. 5mM EDTA를 이용하여 48시간 후 세포들을 수확하고, myc-nAPRIL로 염색한다. 패널 A는 염색 정도가 용량 의존적이라는 것을 보여준다. 패널 B는 가용성 BCMA-Ig 단백질을 이용하여 상기 염색이 배경 레벨로 감소되었다는 것을 보여준다.

도 13은 대조군 시약 또는 BCMA-Ig 융합 단백질로 처리된 면역결핍(Nu/Nu) 마우스내에 피하 이식된 NIH3T3 세포의 성장을 나타낸다. 이러한 모델에 있어서, NIH3T3 세포는 섬유육종을 형성한다.

도 14는 대조군 시약 또는 hBCMA-Ig 융합 단백질로 처리된 면역결핍(Nu/Nu) 마우스내에 피하 이식된 인간 결장 암종 SW480의 성장을 나타낸다.

도 15a는 대조군 시약 또는 hBCMA-Ig 융합 단백질로 처리된 면역결핍(Nu/Nu) 마우스내에 피하 이식된 인간 결장 암종 HT29의 성장을 나타낸다. 도 15b는 대조군 시약 또는 hBCMA-Ig 융합 단백질로 처리된 면역결핍(Nu/Nu) 마우스내에 피하 이식된 인간 폐 암종 A549의 성장을 나타낸다.

발명의 요약

본 발명자들은 BCMA가 종양 괴사 인자 APRIL에 대한 수용체라는 것을 밝혀내었다. APRIL은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된 WO 99 12965에 이미 기술된 것과 동일한 분자이다. 이하에서, APRIL 수용체를 "APRIL-R"로 언급한다. 본 발명은 암에 걸린 포유동물 종 또는 암에 걸릴 위험이 있는 포유동물 종을 치료하는데 사용하기 위한 약학 제제 및 그러한 치료 방법에 관한 것이다. 상기 피검체들에는이미 암으로 고통받고 있는 피검체 또는 이미 암 치료를 받은 피검체도 포함된다.

본 발명의 방법 및 조성물은, 암 치료에 대한 필요가 있거나 본 명세서에서 정의된 바와 같은 암 발병의 위험이 있는 피검체의 치료에, 본 명세서에서 APRIL-R 안타고니스트(예를 들어, 항-APRIL-R)로 정의한 암 치료제인 특정 약제를 사용할 수 있다는 발견을 일부 이용하고 있다.

본 발명의 암 치료제는 선택된 약제에 적합한 임의의 투여 경로로 투여할 수 있고, 그러한 투여 경로에 적합한 임의의 약학적 허용 담체로 제제화할 수 있다. 비경구 투여, 특히 정맥내, 복강내 및 낭내 투여가 바람직한 투여 경로이다. 또한, 외래환자 기준으로 장기간에 걸쳐서 치료를 수행하는 것이 바람직하다. 암 치료제의 일일 용량은 약 0.01-1000㎍/체중kg의 범위로 예상된다. 약 10-300㎍/ 체중kg의 일일 용량이 더욱 바람직한 용량이다. 그러나, 정확한 용량은 이용되는 특정 암 치료제 및 구체적인 피검체의 의약 증상 및 병력에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 치료 방법은 통상 종양으로 언급되는 콜로니의 성장을 억제 또는 경감시키거나, 포유동물의 신체에서 형질전환(transformation) 세포의 실질적인 클론 집단(콜로니)을 제거하는데 유용하다. 그 자체로서 그들은, 암으로 이미 고통받고 있거나, 암에 걸릴 위험이 있는 피검체의 삶의 질을 유지시켜주고 삶을 연장시켜주는데 유용하다.

상세한 설명

정의

본 발명의 요지를 더욱 명확하고 간결하게 지적하기 위하여, 하기 상세한 설명 및 특허청구범위에서 사용하는 특정 용어에 대한 정의를 다음과 같이 제공한다.

본 발명은 이제 하기 정의를 포함하는 하기 상세한 설명과 관련하여 기술될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "APRIL 수용체" 또는 "APRIL-R"은 미변성 서열의 APRIL-R 및 APRIL-R 변형체를 포함한다. 상기 APRIL-R은 쥐 또는 인간 조직 타입 또는 기타 원 등의 다양한 원(source)으로부터 분리할 수 있고, 재조합 또는 합성 방법에 의하여 제조할 수도 있다. 용어 APRIL-R은 또한 종양 괴사계 일원 APRIL 또는 그 상동체 또는 단편에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. APRIL-R의 예에는 BCMA가 있다.

용어 "BCMA" 또는 "BCM"은 문헌[Gras 등 (1995), International Immunology, 7: 1093-1106, "BCMAp: an integral membrane protein in the golgi apparatus of human mature B lymphocytes"; Y. Laabi 등 (1992), EMBO J., 11, 3897-3904, "A new gene BCM on Chromosome 16 is fused to the interleukin 2 gene by a t(4;16)(q26;p13) translocation in a malignant T cell lymphoma"]에 기술된 바와 같은 B 세포 성숙을 위한 신규 단백질을 의미한다.

"미변성 서열 APRIL-R"은 자연 상태에서 유도된 APRIL-R과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 미변성 서열 APRIL-R은 자연에서 분리할 수 있고, 또는 재조합 또는 합성 수단으로 제조할 수도 있다. 상기 미변성 서열 APRIL-R은 APRIL-R의 자연-발생적인 절두 형태(truncated form) 또는 분비 형태(예, 예를 들어 세포외 도메인 서열을 포함하는 가용성 형태), 자연-발생적인 변형체 형태[예, 교대 스플라이싱 형태(spliced form)] 및 APRIL-R의 자연-발생적인 대립 변형체일 수 있다. 본 발명의 한 실시 태양에 있어서, 미변성 서열 APRIL-R은 서열 번호: 8의 아미노산 1 내지 184를 포함하는 성숙 또는 전장 미변성 서열 APRIL-R 폴리펩티드 또는 그 단편이다.

"APRIL-R 세포외 도메인" 또는 "APRIL-R ECD"는 본질적으로 APRIL-R의 트랜스멤브레인 도메인 및 세포질 도메인이 없는 APRIL-R의 형태를 의미한다. 통상, APRIL-R 세포외 도메인은 그러한 트랜스멤브레인 및 세포질 도메인을 1% 이하로 포함할 것이며, 바람직하게는 그러한 도메인을 0.5% 이하로 포함할 것이다. 선택적으로, APRIL-R ECD는 서열 번호: 8의 아미노산 잔기 1 내지 51 또는 1 내지 52, 또는 1 내지 53을 포함할 것이다. 바람직한 실시 태양에 있어서, APRIL-ECD는 서열 번호: 8의 아미노산 잔기 4 내지 51을 포함하며, 서열 번호: 8의 아미노산 잔기 8 내지 41을 포함하는 것이 더 바람직하다. 당업자들은 본 발명의 APRIL-R 폴리펩티드에 대하여 동정된 트랜스멤브레인 도메인이 소수성 도메인 타입을 동정하기 위하여 당업계에서 통상 사용하는 표준에 따라 동정된 것임을 이해할 것이다. 트랜스멤브레인 도메인의 정확한 경계는 변할 수 있으나, 본 명세서에서 특히 언급한 도메인의 어느 말단에 위치한 단지 약 5개의 아미노산일 가능성이 가장 높다.

"APRIL-R 변형체"는 APRIL-R ECD 서열, 또는 전장 미변성 서열 APRIL-R에 대하여 서열 번호: 5에서 나타낸 유도 아미노산 서열을 갖는 APRIL-R과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인, 하기에 정의한 바와 같은 활성 APRIL-R을 의미한다. 그러한 APRIL-R 변형체는 예를 들어, 서열 번호: 8의 말단 또는 C-터미날에 1 이상의 아미노산 잔기를 첨가 또는 결실시킨 APRIL-R 폴리펩티드를 포함한다. 통상, APRIL-R 변형체는 서열 번호: 8의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 또는 85% 이상일 것이며, 아미노산 서열 동일성이 약 90% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 약 95% 이상인 것이 더욱 더 바람직할 것이다.

본 명세서에서 APRIL-R 서열과 관련하여 사용한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 어떠한 보존적 치환도 그 서열 동일성의 부분으로 간주하지 않고, 필요에 따라 서열 동일성의 최대 퍼센트를 달성하기 위하여, 서열을 일직선으로 정렬시키거나 갭을 도입한 후의, APRIL-R 서열내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내의 아미노산 잔기의 퍼센트를 의미한다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 측정하는 목적을 위한 일직선 정렬(alignment)은 당업계에 알려진 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, BLAST, ALIGN 또는 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 시판 컴퓨터 소프트웨어를 이용해서 달성할 수 있다. 당업자들은 일직선 정렬을 측정하기 위한 적당한 파라미터, 예를 들어, 비교될 전장 서열에 대한 최대 일직선 정렬을 달성하기에 필요한 임의의 알고리듬 등을 결정할 수 있다.

본 명세서에서 사용한 용어 "태그 에피토프(epitope tagged)"는 "태그 폴리펩티드(tag polypeptide)"에 융합된 APRIL-R 또는 그 도메인 서열을 포함하는 키메라성 폴리펩티드를 의미한다. 상기 태그 폴리펩티드는, 그에 대한 항체가 만들어질 수 있거나, 기타 다른 약제에 의해서 동정될 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 가지나, APRIL-R의 활성을 방해하지 않을 만큼 충분히 짧다. 또한, 상기 태그 폴리펩티드는 그 항체가 다른 에피토프와 거의 교차 반응하지 않도록 매우 독특한 것이 바람직하다. 적당한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 갖는데, 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기를 갖는 것이 일반적이며, 약 10 내지 약 20개의 잔기를 갖는 것이 바람직하다.

본 명세서에 공개된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위하여 사용한 용어 "분리된(isolated)"은 그 자연적 환경의 성분에서 동정 및 분리 및/또는 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 그 자연적 환경의 오염물 성분은 통상 그 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해할 것인데, 그러한 성분으로는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, (1)스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cup sequenator)를 이용하여 내부 아미노산 서열 또는 N-터미날 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (2)쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게 실버 염색을 이용한 비-환원 또는 환원 조건하에서 균일한 SDS-PAGE로 될 정도로 상기 폴리펩티드를 정제한다. 분리된 폴리펩티드는 재조합 세포내의 계내 폴리펩티드를 포함한다. 왜냐하면 APRIL-R의 자연적 환경의 하나 이상의 성분은 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 분리된 폴리펩티드는 1 단계 이상의 정제 단계를 거쳐서 제조될 것이다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되는 것으로서, 구체적으로 단일 APRIL-R 모노클로날 항체(예, 아고니스트, 안타고니스트 및 중화 항체) 및 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-APRIL-R 항체 조성물을 포함한다. 본 명세서에서 사용한 용어 "모노클로날 항체"는 거의 균일한 항체의 군(즉, 이 군에 포함되는 개개의 항체는 소량 존재하는 자연 발생적으로 생길 수 있는 돌연변이를 제외하고는 동일함)에서 얻어지는 항체를 의미한다.

본 명세서에서 사용한 바와 같은 폴리펩티드의 "정제된 제제" 또는 "거의 순수한 제제"는 자연적으로 발생하는 기타 단백질, 지질 및 핵산과 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 상기 폴리펩티드는 그것을 정제하기 위하여 사용하는 기타 물질, 예를 들어, 항체, 매트릭스 등으로부터도 분리되는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "치료함", "치료" 및 "치료법"은 치료적 (curative) 치료, 예방적(prophylactic) 치료 및 방지적(preventative) 치료를 의미한다.

용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.

본 명세서에서 사용한 용어 "생물학적 활성"은 직접 또는 간접적으로 수행될 수 있는 생체내 또는 시험관내 활성을 갖는 것을 의미한다. APRIL-R의 생물학적 활성 단편은 예를 들어, 그 수용체의 활성 부위와 70%의 아미노산 상동성을 가질 수 있으며, 80% 이상의 상동성을 갖는 것이 더욱 바람직하고, 90% 이상의 상동성을 갖는 것이 가장 바람직하다. 본 명세서에서 상기 수용체와 관련한 동일성 또는 상동성은 서열 번호: 8의 APRIL-R 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기 퍼센트로 정의한다.

본 명세서에서 사용한 용어 "포유동물"은 인간, 소, 말, 개, 마우스 및 고양이를 비롯한 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시 태양에서, 상기 포유동물은 인간이다.

본 발명의 실시시에는, 다른 지시가 없는 한, 당업계의 범위 안에 있는 세포 생물학, 세포 배양학, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래 기술을 이용할 것이다. 그러한 기술들은 문헌에 기술되어 있다.

이제 본 발명의 바람직한 실시 태양에 대한 참고 사항을 상세하게 기술할 것이다. 본 발명은 B 세포 및 비-B 세포의 성장 및 성숙(특히 그것이 종양 세포와 관련되기 때문임)을 초래하는 APRIL-R 및 APRIL-R 관련 분자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역-관련 장애에 의하여 필요로 되는 바와 같은 면역계의 응답을 초래하는 APRIL-R 및 APRIL-R 관련 분자의 용도에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 유전자 치료 방법을 통하여 APRIL-R 또는 APRIL-R 관련 유전자를 사용함으로써 암 및 면역 장애를 치료하는 것을 포함한다.

본 발명의 서열을 이용하여 형질전환된 숙주에 의하여 생성된 APRIL-R 및 그 상동체, 및 당업계에 공지된 방법에 따라 정제한 미변성 APRIL-R 또는 공지된 아미노산 서열로부터 제조한 미변성 APRIL-R은 항암, 항종양 및 면역조절 용도를 위한 다양한 방법에 있어서 유용하다. 그들은 또한 기타 질병과 관련한 치료 및 방법에서도 유용하다.

본 발명의 다른 실시 태양은 "안티센스" 치료에 있어서 APRIL-R을 암호하는 분리된 핵산에 의하여 암호되는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용한 용어 "안티센스" 치료는, 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 그 암호된 단백질의 발현을 억제하기 위하여, 당해 리간드를 암호하는 세포 mRNA 및/또는 DNA와 세포 조건하에서 특이적으로 하이브리드화시키는 올리고뉴클레오티드 또는 그 유도체를 투여하거나 계내 생성시키는 것을 의미한다. 결합은 통상적인 염기쌍 상보성에 의하여, 또는 예를 들어, DNA 듀플렉스(duplex)에 결합하는 경우에는 이중 나선 구조의 주 홈(major groove)에서의 특이적 상호작용을 통하여 이루어질 수 있다. 일반적으로, "안티센스" 치료는 당업계에서 일반적으로 사용하는 기술의 범위를 의미하는 것이며, 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 특이적 결합에 의존하는 임의의 치료법을 포함한다.

본 발명의 안티센스 작제물은, 예를 들어, 세포에서 전사될 때, Kay-리간드를 암호하는 세포 mRNA의 적어도 일부분에 상보성인 RNA를 생성하는 발현 플라스미드로서 송달될 수 있다. 대안적으로, 상기 안티센스 작제물은 생체외에서 생성시킨 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있다. 그러한 올리고뉴클레오티드 프로브는 내생적 뉴클레아제에 내성인 개질된 올리고뉴클레오티드여서, 생체내에서 안정한 것이 바람직하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로 사용하기 위한 핵산 분자의 예로는 DNA의 포스포아미데이트, 포스포티오에이트 및 메틸포스포네이트 유사체가 있다(예를 들어, 5,176,996; 5,264,564; 및 5,256,775 참고). 또한, 안티센스 치료법에 유용한 올리고머를 작제하는 일반적인 접근법은 예를 들어 본 명세서에 특히 참고 인용하는 문헌들[Van Der Krol 등, (1998) Biotechniques 6: 958-976; 및 Stein 등 (1988) Cancer Res 48: 2659-2668)에 기술되어 있다.

전술한 바와 같이 본 발명의 APRIL-R은 TNF 수용체 계열의 일원이다. 그 단백질, 단편 또는 상동체는 광범위한 치료학적 및 진단학적 용도를 가질 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 본 명세서에서 참고 인용하는 WO99/12964에 이미 기재되어 있는 폴리펩티드 APRIL과 특이적으로 상호작용한다. 그러나, 본 명세서에 공개되는 펩티드 및 방법을 이용하면, APRIL-R 또는 그 단편과 특이적으로 상호작용하는 분자를 동정할 수 있다.

특정 실시 태양에 있어서, 본 발명은 APRIL과 결합할 수 있는 APRIL-R에서 유도된 펩티드를 사용하는 방법을 포함한다. APRIL-R의 단편은, 예를 들어, 몇몇 재조합 방법, PCR, 단백질 가수분해 소화 또는 화학적 합성에 의하여 제조할 수 있다. 폴리펩티드의 내부 또는 터미날 단편은 폴리펩티드를 암호하는 핵산의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 제거함으로써 생성시킬 수 있다. 상기 변이 유발된 DNA의 발현으로 폴리펩티드 단편을 생성시킨다.

또한, 종래의 메리필드(Merrifield) 고상 f-moc 또는 t-boc 화학과 같이 당업계에 공지된 기술을 이용하여 폴리펩티드 단편을 화학적으로 합성할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 및 DNA 서열을, 그 단편과 중첩되지 않는 소정 길이의 단편으로 임의로 분할하거나, 소정 길이의 단편을 중첩시키도록 임의로 분할할 수 있다. 이하에서 이러한 방법을 더욱 상세하게 기술한다.

APRIL-R의 가용성 형태의 생성

상기 APRIL-R의 가용성 형태는 종종 효과적으로 신호를 보낼 수 있으며, 따라서 이제 자연적 멤브레인 형태를 모방한 약물로서 투여할 수 있다. 그러나, 본원에서 청구하는 APRIL-R은 가용성 사이토카인으로서 자연적으로 분비되고, 그렇지 않다면 유전자를 재조작하여 분비시킬 수 있다. APRIL-R의 가용성 분비 형태를 형성시키기 위해서, DNA 수준에서 N-터미날 트랜스멤브레인 영역 및 일부 줄기영역(stalk region) 부분을 제거하고, 선택된 발현 시스템에서 충분히 단백질 가수분해적 개열이 일어날 수 있도록 하는 타입 Ⅰ 리더 또는 대안적으로 타입 Ⅱ 리더 서열로 상기 제거 부분을 치환할 수 있다. 당업자는 분비 발현 작제물에 존속되는 줄기 영역의 양을 조절함으로써 리간드 결합성 및 분비 효율성 모두를 최적화할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 1 내지 52에서 출발하는 단백질을 생성시키도록, 모든 가능한 줄기 길이, 즉, N-터미날 절두를 포함하는 작제물을 제조할 수 있다. 최적 길이 줄기 서열은 이러한 타입의 분석에서 얻어질 것이다.

APRIL-R과 반응성인 항체의 생성

본 발명은 또한 청구되는 APRIL-R 또는 그 공수용체와 특이적으로 반응하는 항체를 포함한다. 표준 프로토콜을 이용하여 항-단백질/항-펩티드 항혈청 또는 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manualed., Harlow 및 Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)]을 참고하라. 상기 펩티드의 면역원성 형태를 이용하여 마우스, 햄스터 또는 토끼와 같은 포유 동물을 면역시킬 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성을 부여하는 기술로는 담체와 접합시키는 기술 또는 당업계에 주지된 기타 기술이 있다.

APRIL-R 또는 그 공수용체의 면역원성 부분은 보조제의 존재하에 투여할 수 있다. 혈장 또는 혈청 중에서 항체 역가를 검출함으로써 면역화의 진행을 모니터할 수 있다. 항원으로서 면역원을 사용한 표준 ELISA 또는 기타 면역분석법을 이용하여 항체의 농도를 평가할 수 있다.

바람직한 실시 태양에 있어서, 당해 항체는 APRIL-R 또는 그 공수용체의 항원 결정기, 예를 들어 서열 번호: 8의 폴리펩티드의 항원 결정기 또는 밀접한 관련이 있는 인간 또는 인간이 아닌 포유동물 상동체(예를 들어, 70, 80 또는 90 퍼센트의 상동성, 더욱 바람직하게 95 퍼센트 이상의 상동성)의 항원 결정기에 대하여 면역 특이적이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 항-APRIL-R 또는 항-APRIL-공수용체 항체는, 예를 들어, 서열 번호: 8과 80 퍼센트 미만의 상동성이 있고; 바람직하게는 서열 번호: 8과 90 퍼센트 미만의 상동성이 있으며; 가장 바람직하게는 서열 번호: 8과 95 퍼센트 미만의 상동성이 있는 단백질과 거의 교차 반응하지 않는다(즉, 특이적으로 반응한다). "거의 교차 반응하지 않는"이란 상기 항체가, 서열 번호: 8의 단백질에 대하여 10 퍼센트 미만, 더욱 바람직하게는 5 퍼센트 미만, 더욱 더 바람직하게는 1 퍼센트 미만의 결합 친화성을 갖는 비-상동성 단백질에 대하여 결합 친화성을 갖는다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어 항체는 또한 APRIL-R 또는 그 수용체와 특이적으로 반응하는 그 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 항체들은 통상의 기술을 이용하여 단편화시킬 수 있고, 그 단편들은 전체 항체에 대하여 전술한 바와 동일한 방법에서 이용하기 위하여 스크리닝하였다. 예를 들어, 펩신으로 항체를 처리하여 F(ab')₂단편을 생성시킬 수 있다. 생성된 F(ab')₂단편을 처리하여 다이설파이드 브릿지를 분해함으로써 Fab' 단편을 생성시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 항체들은 항-APRIL-R 또는 항-APRIL-공수용체 활성을 갖는 생특이적 및 키메라성 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, APRIL-R 및 그 공수용체에 대한 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체(Ab), 및 Fab' 및 F(ab')₂와 같은 항체 단편을 사용하여 APRIL-R 및 그 각각의 공수용체의 작용을 차단할 수 있다.

또한, 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 다양한 형태의 항체를 제조할 수 있다. 본 명세서에서 특히 참고 인용한 문헌[Winter and Milstein, Nature 349: 293-299 (1991)]을 참고하라. 예를 들어, 동물 항체에서 유래한 항원 결합 도메인이 인간 불변 도메인에 결합되는 키메라성 항체를 작제할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 참고 인용한 문헌[Cabilly 등, U.S.4,816,567]을 참고하라. 키메라성 항체들은 인간 임상 치료에 사용될 때 동물 항체들에 의하여 유도되는, 관찰되는 면역원성 반응을 감소시킬 수 있다.

또한, APRIL-R 또는 그 공수용체를 인식하는 재조합 "인간 적용성 항체 (humanized antibody)"를 합성할 수 있다. 인간 적용성 항체는 특이적 항원-결합에 대한 반응성 영역이 삽입된 거의 인간 IgG 서열을 포함하는 키메라체이다. 소정 항원을 사용하여 동물들을 면역시키고, 상응하는 항체들을 분리하고, 특이적 항원 결합에 대하여 반응성이 있는 가변 영역 서열 부분을 제거한다. 그 다음, 상기 항원 결합 영역이 결실된 인간 항체 유전자의 적당한 위치에 동물-유도 항원 결합 부위를 클로닝한다. 인간 적용성 항체는 인간 항체의 이종성(즉, 종간) 서열의 사용을 최소화하며, 따라서 처리된 피검체에 있어서의 면역 반응 유도 가능성을 감소시킨다.

상이한 군의 면역 글로불린에서 분리된 인간 불변 도메인(CH1, CH2, CH3) 및가변 도메인을 포함하는 키메라성 및 인간 적용성 항체를 제조함으로써 상이한 군의 재조합 항체들의 작제물을 또한 달성할 수 있다. 예를 들어, 인간 : 사슬 불변 영역을 갖는 벡터내로 항원 결합 부위를 클로닝함으로써 항원 결합 부위 결합가 (valence)가 증가된 항체들을 재조합법으로 제조할 수 있다. 본 명세서에서 참고 인용한 문헌[Arulanandam 등, J. Exp. Med., 177: 1439-1450 (1993)]을 참고하라.

또한, 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 항원 결합 부위 부근의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 재조합 항체와 그 항원의 결합 친화성을 변경시킬 수 있다. 분자 모델링에 기초한 돌연변이 유발에 의하여 인간 적용성 항체의 항원 결합 친화성을 증대시킬 수 있다. 본 명세서에 참고 인용되는 문헌[Queen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 10029-33 (1989)]을 참고하라.

유사체의 생성: 변경된 DNA 및 펩티드 서열의 생성

APRIL-R의 유사체는 아미노산 서열에 있어서 또는 서열을 포함하지 않는 방법에 있어서, 또는 양자 모두에 있어서, 자연 발생적인 APRIL-R과 구별될 수 있다. 비-서열 개질은 생체내 또는 시험관내 APRIL-R의 화학적 유도를 포함한다. 비-서열 개질은 아세틸화, 메틸화, 포스포릴화, 카복실화 또는 글리코실화에 있어서의 변화를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 유사체는 APRIL-R 생물학적 활성 단편을 포함하는데, 이들의 서열은, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의하여, 또는 APRIL-리간드의 활성을 없애지 않는 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의하여 서열 번호: 8로 주어진 서열과 구분된다. 보존적 치환은 통상 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는데, 예를 들어, 다음과 같은 기 내의 치환이 가능하다: 발린, 글리신; 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 타이로신.

용도

전장 APRIL-R 유전자(서열 번호: 8) 또는 그 부분은, 예를 들어, 서열 번호: 6에 공개된 APRIL-R 서열과 소정 서열 동일성을 갖는 다른 유전자를 분리하기 위한 cDNA 라이브러리용 하이브리드화 프로브로 사용할 수 있다. 또한, APRIL-R을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 이용하여, APRIL-R을 암호하는 유전자 맵핑(mapping)용 및 유전병이 있는 개체의 유전학적 분석용 하이브리드화 프로브를 작제할 수 있다. APRIL-R의 생물학적 활성을 모방한 리드 화합물(lead compound)을 밝혀내기 위한 스크리닝 분석을 설계할 수 있다. 그러한 스크리닝 분석은 화학적 라이브러리를 소분자(small molecule) 약물 후보군을 동정하기에 특히 적당하게 함으로써 그 화학적 라이브러리를 고-처리량 스크리닝할 수 있는 분석을 포함할 것이다. 고려되는 소분자로는 합성 유기 또는 무기 화합물 등이 있다. 또한, APRIL-R을 암호하는 핵산 또는 그 개질형을 사용하여, 예컨대 암 시약을 비롯한 치료적으로 유용한 시약의 개발 및 스크리닝에 유용한 트랜스제닉(transgenic) 동물 또는 "넉 아웃 (knock out)" 동물을 형성시킬 수 있다.

본 발명의 서열로 형질전환된 숙주에 의하여 생성시킨 APRIL-R 및 그 상동체, 및 당업계에 공지된 방법에 따라 정제한 미변성 APRIL-R 또는 공지된 아미노산서열로부터 제조한 미변성 APRIL-R은 항암 적용을 위한 다양한 방법에 유용하다.

본 발명의 한 실시 태양에 있어서, 본 발명은 약학적 허용 레시피언트 (recipient)와 함께, APRIL 및 그 동족(cognate) 수용체 또는 수용체들 사이의 상호작용을 길항하는 폴리펩티드를 포함하는 APRIL-R 안타고니스트를 함유하는 조성물 치료 유효량을 포유동물에게 투여함으로써, 원치 않는 세포 증식과 관련된 증상을 나타내는 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.

바람직한 실시 태양에 있어서, 세포 표면상의 APRIL의 동족 수용체는 BCMA이다.

상기 방법은 APRIL 및 그 동족 수용체 또는 수용체들 사이의 상호작용을 길항하는 폴리펩티드를 갖는 임의의 APRIL-R 안타고니스트를 이용하여 실시할 수 있다. APRIL-R 안타고니스트의 예에는 가용성 BCMA를 비롯한 가용성 APRIL-R 폴리펩티드, BCMA-IgG-Fc를 비롯한 가용성 키메라성 APRIL-R 분자, 및 항-BCMA 모노클로날 항체를 비롯한 항-APRIL-R 항체 상동체 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법은 원치 않는 세포 증식과 관련한 임의의 증상에 이용할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 APRIL 및/또는 APRIL-R(즉, BCMA)을 발현시키는 종양 세포를 치료하는데 사용할 수 있다.

APRIL로 세포 증식을 조절할 수 있는 암의 예는 종양 조직 라이브러리에서 발현된 APRIL 및/또는 APRIL-R(즉, BCMA) 메시지의 시험관내 레벨을 측정함으로써 스크리닝할 수 있다. APRIL 및/또는 APRIL-R(즉, BCMA) 메시지가 고발현되는 종양조직 라이브러리가 후보군이 될 것이다. 대안적으로, 예를 들어, 전장 인간 APRIL cDNA 서열을 가지고 공적이고 개인적인 데이터베이스[즉, 인사이트(Incyte) 데이터베이스]를 조사하여 후보군에 대하여 스크리닝할 수 있다. 이러한 기술을 적용함으로써, 예를 들어, APRIL mRNA 발현이 하기 표 1a 내지 1e에 밝혀진 것들(단, 이에 한정되는 것은 아님)을 비롯하여 다수의 종양 타입에서 검출되었음이 밝혀졌다:

[표 1a]

라이브러리 설명

전립선 종양 주, LNCaP, CA, 50M, 미처리, TIGR

T-림프구 종양, 림프종, TIGR

난소 종양, 유두상 장액성 낭선암종(papillary serous cystadenoCA)

폐, mw/선암종(adenoCA), COPD, 47M

유방 종양, 선암종(adenoCA), 46F, SUB, m/BRSTNOT33

신경절, 후근, 경부(cervical) aw/림프종, 32M, NORM

뇌 종양, 전두, 신경 신생물, 32M

전립선 종양, 선암종(adenoCA), 59M, SUB, m/PROSNOST19

결장 종양, 간 만곡, 선암종(adenoCA), 55M, SUB, m/COLATMT01

췌장 종양, TIGR

부신경절 종양, 부신경절종, aw/신장 세포 CA, 46M

유방, mw/관의 CA, 43F, m/BRSTTUT16

[표 1b]

신장 종양, 신장 세포 CA, 51F

방광, mw/TC CA, CA 계내, 60M, m/BLADTUT04

자궁 종양, 자궁내막, F, TIGR

전립선, BPH, mw/아데노CA, PIN, 59M

폐, mw/선암종(adenoCA), 53M, m/LUNGTUT17

골 종양/주, MG-63, 유골육종(osteoSAR)/거대 세포, M/F, 풀(pool), RP

뇌, 전두 피질, aw/폐 CA, 77M

결장 종양, 선암종(adenoCA), NORM, SUB, CGAP

폐 종양, 편평 세포 CA, 57M

폐, mw/선암종(adenoCA), 63M

전립선, AH, mw/선암종(adenoCA), 50M, m/PROSTUT01

말초 혈액(Periph blood), B-림프구, CLL, 풀, NORM, 3'CGAP

결장 종양, 선암종(adenoCA), 풀, NORM, 3'/5'CGAP

신장, mw/신장 세포 CA, 8,53F, 풀, NORM

난소, 유피 낭포, 22F

결장 종양, 선암종(adenoCA), NORM, 3'CGAP

[표 1c]

결장 종양, 선암종(adenoCA), 3'.CGAP

전립선, BPH, mw/선암종(adenoCA), 70M, SUB

난소 종양, 메츠(mets) 결장 선암종, 58F

자궁, 자궁근, mw/평활근종, 43F

소장(Sm intestine), 회장, mw/CUC, 25F

림프절, 췌장주위, aw/췌장 선암종, 65M

난소, aw/평활근종, 36F, NORM

폐, mw/방추세포 암종, 62F

폐 종양, 비늘 CA, 50M

뇌 종양, 수막종, 36M

종양, 선암종(adenoCA), 65F, m/PANCNOT08

폐, mw/기관지내 암종, 33M

부신, mw/크롬친화세포종, 43F, m/ADRETUT07

뇌 종양, 전두, 수막종, 50M

신장 종양, 투명세포 타입 암, 풀, NORM, 3'CGAP

유방, mw/소엽 CA, 67F

폐, mw/메츠 유골육종(osteoSAR), aw/흉막 메츠, 58M, NORM

[표 1d]

전립선 종양, 선암종(adenoCA), 59M, SUB, m/PROSNOT19

소장 종양, 회장, 메츠 자궁내막 선암종, 64F

난소 종양, 선암종(adenoCA), 58F

유방, NF 유방 질병, 46F

뇌 종양, 전두, 메츠 신선암, 58M

신장 종양, 윌름즈(Wilm's), 풀, WM/WN

폐, mw/메츠 갑상선 CA, 79M, m/LUNGTUT02

폐 종양, 메츠 갑상선 CA, 79M, m/LUNGNOT03

부갑상선 종양, 선암종, M/F, NORM, WM

췌장 종양, 역형성 CA, 45F

난소, mw/점액성 낭선암종(cystadenoCA), 43F, m/OVARTUT01

폐 종양, 비늘 세포 CA, 풀, NORM, CGAP

유방 종양, 선암종(adenoCA), 46F, m/BRSTNOT17

자궁, mw/평활근종, aw/결장 선암종, 45F

폐, mw/선암종(adenoCA), aw/결절, 횡경막 메츠, 63F

유방 종양, 선암종(adenoCA), 46F, m/BRSTNOT33

[표 1e]

전립선 종양, 선암종(adenoCA), 66M, m/PROSNOT15, PROSDIN01

유방 종양, 선암종(adenoCA), 54F, m/BRSTNOT03

생식 세포 종양, 풀, SUB, 3'CGAP

골수, 경골, aw/메츠 폐포모양 횡문근육종(alveolar rhabdomyoSAR), 16M

전립선, AH, mw/선암종(adenoCA), 57M, m/PROSTUT04

유방, PF 변화, mw/선암종(adenoCA), 55F, m/BRSTTUT01

자궁 종양, 장액성 유두상 암종(papillaryCA), F, 풀, 3'CGAP

난소 종양, 점액성 낭선암종(cystadenoCA), 43F, m/OVARNOT03

유방, PF 변화, mw/선암종(adenoCA), 관내 CA, 43F

유방, mw/관 CA, 계내 CA, aw/결절 메츠, 62F

신경절 종양, 신경절신경종, 9M

췌장 종양, 선암종(adenoCA), 3'CGAP

자궁 종양, 자궁내막 선암종, F, 풀, 3'CGAP

폐 종양, 신경내분비성 암종, 풀, NORM, 3'CGAP

원치 않는 세포 증식과 관련된 증상의 치료, 특히 종양 치료에 사용하는 본 발명의 APRIL-R 안타고니스트는 종양 세포 성장을 10%, 20%, 30% 또는 40% 이상 억제하는 것이 유익하며, 50% 이상 억제하는 것이 가장 유익하다. 그러한 APRIL-R 안타고니스트는 스크리닝을 통하여 수득한다. 예를 들어, 실시예 6에서 논의한 사항을 참조하라. 예를 들어, APRIL-R 안타고니스트는 결장 및 폐 종양 각각에서 유도되는 인간 결장 암종 HT29 또는 인간 폐 암종 A549에 대한 성장 억제 활성(즉, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상)에 기초하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 도 15에 나타낸 사항을 참조하라.

본 발명의 다른 실시 태양에 있어서, 본 발명은 APRIL-R 폴리펩티드를 이용한, 동물내 B 세포 성장, 비-B 세포 성장, 수지상 세포-유도 B 세포 성장 및 성숙 또는 면역글로불린 생성의 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시 태양에 있어서, 본 발명은 자가면역 질환, 고혈압, 심혈관 장애, 신장 장애, B 세포 림프증식 장애, 면역억제 질환, 기관 이식, 염증 및 HIV의 치료에 APRIL-R을 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 방법에는 APRIL-R 및 그 리간드 사이의 신호 경로와 연관된 면역 반응을 치료, 억제 또는 변경시키는 약제를 사용하는 방법이 포함된다.

본 발명은 또한 APRIL-R 폴리펩티드 및 약학적 허용 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. APRIL-R 폴리펩티드, 예를 들어, 그 제제를 위한 적당한 담체는 문헌[Remington' Pharmaceutical Sciences, 16판, 1980, Mack Publishing Co., Oslo 등 편집]에 기재되어 있다. 통상적으로, 상기 제제에 약학적 허용염 적당량을 사용함으로써 제제를 등장화시킨다. 담체의 예로는 완충액, 예를 들어, 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액 등이 있다. 상기 용액의 pH는 약 5 내지 약 8인 것이 바람직하고, 약 7.4 내지 약 7.8인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 담체는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스와 같은 서방형 제제를 포함하는데, 상기 매트릭스는 예를 들어, 리포좀, 필름 또는 마이크로입자와 같은 성형된 물품의 형태이다. 당업자들은, 예를 들어, 투여하는 APRIL-R 폴리펩티드의 농도 및 투여 경로에 따라 더욱 바람직한 특정 담체가 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

투여는 정맥 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 근육내 주사 등과 같은 주사를통하여 또는 유효한 형태로 혈류에 송달할 수 있는 주입과 같은 기타 방법을 통하여 이루어질 수 있다.

다른 지시가 없는 한, 본 발명의 실시에는 당업계에 공지되어 있는 세포 생물학, 세포 배양학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 단백질 화학 및 면역학의 통상적 기술을 이용할 것이다. 그러한 기술들은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌들[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판 (Sambrook, Fritsch 및 Maniatis 편집), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989;DNA Cloning, I권 및 II권 (D.N. Glover 편집), 1985;Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait 편집), 1984; 미국 특허 제4,683,195호 (Mullis 등);Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames 및 S.J. Higgins 편집), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames 및 S.J. Higgins 편집), 1984;Culture of Animal Cells(R.I. Freshney 편집). Alan R. Liss, Inc. 1987;Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986;A Practical Guide to Molecular Cloning(B. Perbal), 1984;Methods in Enzymology, 154권 및 155권 (Wu 등, 편집), Academic Press, New York;Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H. Miller 및 M.P. Calos 편집), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory;Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer 및 Walker 편집), Academic Press, London, 1987;Handbook of Experiment Immunology, I권 내지 IV권 (D.M. Weir 및 C.C. Blackwell 편집), 1986;Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986]을 참고하라.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 제공되는 것인 바, 그에 의하여 본 발명이 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예

하기 공개되는 실시예들에서는 이하의 방법을 사용하였다.

방법:

피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 내 myc-태그 쥐 APRIL(CCM776)의 클로닝 및 발현

PDR004(FLAG 에피토프 태그와 함께 N 터미날에 부착된 수퍼FAS-리간드 줄기를 갖는 H98 muAPRIL)를 취한 후, Sac I 내지 Not1로부터 muAPRIL 코딩 서열을 절단함으로써 발현 벡터 pCCM213.10을 작제하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 LTB-559 및 560은 FAS 리간드에서 유래한 KEL 모티프(motif)뿐만 아니라, myc 에피토프 태그, 알파 메이팅 팩터 리더 서열을 함유하는 Xho-1-Sac1 링커를 형성시킨다. muAPRIL 단편 및 링커 양자 모두를피치아 파스토리스발현 플라스미드 pccm211의 Xho-1-Not1 부위에 결합시켰다.

PCCM213.10을 Stu1로 선형화하고, GS115 균주(his4-) 내로 일렉트로포레이트 (electroporate)한 후, 덱스트로스를 함유하는 최소 배지에 도말하였다. 리치 배지[BMGY: 완충화 글리세롤 복합 배지(Buffered glycerol complex medium)]에서 단일의 대표 콜로니를 항온처리하고, 30 ℃에서 48 시간 동안 그것을 고밀도로 성장시켜 단백질 발현에 대하여 HIS4 형질전환체(transformant)를 분석하였다. 배양물을 스핀(spin)시키고, 1.5 % 메탄올을 함유하는 리치 유도 배지[BMMY: 완충화 메탄올 복합 배지(Buffered methanol complex medium)]에 세포 펠릿들을 재현탁(1:5)시켰다. 30 ℃에서 2 일 동안 항온처리한 후, 상청액을 SDS-PAGE 상에서 실행시키고, muAPRIL의 존재에 대하여 평가하였다. 쿠마시(Coomassie) 염색 및 웨스턴 블롯(Western blot)(항-myc mAb 9E10)을 통하여, 하나의 균주 CCM776이 적당한 양의 글리코실화형 myc-태그-H98 muAPRIL 단백질을 생성시켰다는 것이 밝혀졌다.

myc-mAPRIL 정제

myc-mApril, 149 아미노산의 단백질을피치아(pichia)에서 발현시켰다. 상기 단백질은 등전점(isoelectric point)이 7.45이다. 피치아 상청액 175 ㎖를 10 mM 트리스 pH 6.8로 밤새도록 투석 및 완충교환시킨 후, 20 ㎖ SP 컬럼을 통하여 통과시켰다. 상기 컬럼을 10 mM 트리스-HCl pH 6.8로 광범위하게 세척하고, PBS 중의 250n mM NaCl로 용출시켰다. 겔 여과 컬럼(S300)을 이용하여 두 번째 정제 단계를 수행하였다. 20 ㎖ SP 컬럼에서 유래한 myc-April를 함유하는 분획물을 원심분리하여 농축시켜 부피 7 ㎖로 만들었다. 겔 여과 후, 본 발명자들은 OD 및 쿠마시 겔로 검출하여 myc-APRIL 8 mg을 회수하였다. 또한, 본 발명자들은 마우스 모노클로날 9E10 항체(항-myc)를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였는데, 이를 통하여 정제 단계 이후 myc 태그가 손상되지 않은 상태임이 나타났다. N 터미날 서열은 상기 정제된 단백질이 myc-mApril에 상응한다는 것을 입증한다.

FLAG-인간 April 정제

플라스미드 ps429(이어진 이름 p1448)를 사용하고, 리포펙타민 시약(Gibco-Brl) 및 혈청(serum) 없는 배지를 이용하여 293 T 세포를 일시적으로 트랜스펙트시켰다. 포유동물 발현 벡터 PCR3(Invitrogen)에서 작제된 상기 플라스미드는, 상기 세포 배양 배지내로 N-터미날 단백질을 이용하여, 인간 APRIL의 수용체-결합 도메인을 암호한다. 제조자(Kodak)의 지시에 따라, 항-FLAG mAb M2 컬럼 및 과량의 정제된 FLAG 펩티드를 이용하여 혈청 없는 배지에서 FLAG-APRIL 단백질을 정제하였다.

HBMCA-Fc 정제

293 세포내로 HBMCA-Fc를 일시적으로 트랜스펙트시켰다. 293 세포 과발현 hBCM-Fc으로부터의 조절 배지(conditioned media)를 단백질 A 커럼내로 적하하였다. 25 mM 포스페이트 100 nM NaCl pH 2.8을 사용하여 단백질을 용출시킨 후, 1/20 부피의 0.5 M MaPO4 pH 8.6으로 중화시켰다. OD 280에 기초하여 선택된 분획물을 환원 및 비환원 SDS-PAGE 겔 처리하고, 웨스턴 블롯 처리하여 정제 단백질을 동정하였다. 조절 배지 500 ㎖로부터 단백질 3 mg을 회수하였다.

FACS 분석에 있어서 myc-mAPRIL은 다양한 세포주에 결합함.

1 시간 동안, 얼음 상의, 100 ㎕ PBS/2 % FBS + Fc 차단제(FcBlock@ 20 ㎕/㎖(Pharmingen) 및 정제된 인간 IgG@ 10 ㎕/㎖(Sandoz) 중의 세포주에 정제된 myc-mAPRIL 450 ng/㎖를 결합시켰다. 특이적 토끼 항-쥐 APRIL 항혈청(1:500) 및 당나귀 항-토끼 IgG-FITC(Jackson)을 사용하여 포지티브 결합이 드러났다. 공급자 (ATCC Bethesda, MD)가 제안한 바대로, 세포주 A20, Raji, NIH3T3 및 HT29를 배지 중에 유지시켰다. 10 % FBS 및 L-글루타민으로 보충된 HEPES-완충 RPMI 중에서 BJAB 세포들을 배양시켰다. 경쟁 분석에 있어서, myc-쥐 APRIL 450 ng/㎖을 경쟁단백질 1 ㎍/㎖ 와 함께 첨가하였다.

실시예 1: 플레이트 분석을 이용한 APRIL-R에 결합한 APRIL의 검출

본 실시예에서는 April과 회합하는 BCMA를 시험하였다.

BCMA가 April과 회합하는지 여부를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 공-면역침전 실험을 수행하였다. 이 실험에서 가용성 단백질 hBCMA-Fc 및 myc-mApril 양자 모두를 사용하였다.

실온에서, 1/2 시간 동안, 10% FBS를 함유하는 배지내로 상이한 TNF 리간드: myc-mApril; myc-CD40L 및 myc-RANKL와 함께 HBCMA-Fc 및 LTbR-Fc를 첨가하였다. 1 내지 2 시간 동안, Fc 단백질을 단백질 A 비드(bead)에 결합시키고, PBS 1㎖로 세 번 세척한 후, 마우스 모노클로날 9E10(항-myc) 항체로 면역블롯팅 (immunoblotting)하여 분석한 후, 증강된 화학발광(chemiluminescence)을 이용하여 현상하였다.

본 발명자들은 기타 TNF 리간드인 myc-CD40L 및 myc-RANKL이 BCMA와 결합할 수 없었기 때문에 BCMA가 특이한 방식으로 April과 상호작용한다는 것을 지시하는 hBCMA-Fc 면역침전물 중의 myc-APRIL을 검출하였다. myc-April은 LTbR-Fc와 회합하지 않는다.

상기 동일한 멤브레인을 제거하고, 항-hIG-HRP로 재블롯팅함으로써, 동일한 양의 LTbR-Fc와 BCMA-Fc가 면역침전물 중에 사용되었다는 것이 나타났다.

실시예 2:

본 실시예에서는 hBCMA-FC가 FLAG-hAPRIL과 상호작용한다는 것을 기술한다.

ELISA 분석: 4 C에서 카보네이트 pH 9.6 중의 수용체-Fc 융합 단백질(hBCMA-Fc-739 또는 hTNFR2-Fc-492) 1 ㎍/㎖로 플레이트들을 밤새도록 코팅하였다. PBS/5 % 건조 탈지유/05 % 트윈-20을 이용하여 실온에서 2 시간 동안 블록킹(blocking)하였다. 블록킹 완충제[5 x 농축 배지로부터 hApril-429, 2000 ng/㎖(불활성)으로부터 hApril-507, 1000 ng/㎖로부터 muBAFF-657, 1000 ng/㎖로부터 TNFa-197) 100 ㎕ 중에서 2 x 일련의 리간드 희석물을 제조하였다. 리간드를 항온처리한 후, 상기 플레이트를 5 % 트윈-20 중(PBS)에서 세척하고, 희석 완충제 중의 0.5 ㎍/㎖ 항-FLAG mAb M2로 프로브조사(probing)하였다. 그 후, 효소 발달(enzymatic development) (OPD)을 이용하는 항-마우스-PO 1/2000을 사용하여 상기 항체를 검출하였다.

면역침전 실험: 9 cm 플레이트 내에서 293T 세포들을 지시된 발현 플라스미드(Rec-Fc 또는 플래그 리간드)로 트랜스펙트시켰다. 트랜스펙트된 세포들을 최적 배지(Gibco-BRL) 8 ㎖ 중에서 5 일 동안 방치하였다. 200 ㎕의 각 수용체-조절 배지와 200 ㎕의 각 리간드-조절 배지 + 400 ㎕ PBS + 10 ㎕ 프로트G-세파로스를 혼합함으로써 면역침전을 수행하였다. 이들을 휠(wheel)에서 1 시간 동안 회전시키고, PBS 1 ㎖로 4 번 세척한 후, 샘플 완충제(+ DTT) 50 ㎕ 중에서 비등시켰다. 레인 당 각 면멱침전물 20 ㎕를 적하하였다. 1 ㎕/㎖ 항-FLAG M2 mAb (Sigma, St Louis MO) 및 항-마우스 PO (1/2000)를 이용하여 표시 블롯팅(reveal blotting)을 수행하였다. 또한, 항-인간-PO를 갖는 리프로브 블롯(reprobe blot)을 체크하였다: MeOH/CHCl3/라이소자임으로 조절 배지 100 ㎕를 침전시켰다. 상기 혼합물을샘플 완충제(+ DTT) 50 ㎕ 중에서 비등시키고, 20 ㎕를 적하하였다. 항-FLAG mAb M2(1 ㎕/㎖) 및 항-마우스-PO(1/2000)를 이용하여 표시 블롯을 수행하였다.

실시예 3:

본 실시예에서는 hBCMA-Ig, hLT-R-Ig 또는 hp80 TNFR-Ig에 대한 myc-mAPRIL, hKayL-440(hBAFF) 및 Flag-mBAFF의 결합을 기술한다. 모든 실험은 10 ㎕/㎖ 미소 유속 및 25C에서 수행하였다.

HBS 완충제(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005 % P20 계면활성제, pH 7.4)를 사용하여 각 실험을 수행하였다. 동일한 용액을 런닝 완충제(running buffer) 및 샘플 희석제로 사용하였다.

N-하이드록시숙신이미드/N-에틸-N'-(3-디에틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(BIAcore)로 CM5 칩(BIAcore, Inc.) 표면을 먼저 활성화시켰다. hBCMA-Ig 20 ㎕, hLT-R05-Ig 15 ㎕ 및 hp80TNFR 10 ㎕를 아세트산 10 mM 중의 30 g/㎖로 희석시킨 후, 일단 에탄올아민-HCL(pH 8.5) 30 ㎕로 블록킹하고, 에탄올아민-HCL(pH 8.5) 15 ㎕로 다시 블록킹하였다. 이는 1600 내지 3700 공명 단위(RU)의 표면 밀도로 되었다. 상기 칩을 1 mM 포름산 20 ㎕로 재생시켰다. 이러한 리젝션(rejection)을 5 번 반복하여 재생산성 및 안정성의 기준선을 평가하였다.

상기 실험에 있어서, 100 ㎕의 myc-mApril, hKayL-440 및 FLAG-mBAFF 각각을 희석 완충제 중에서 30 ㎕/㎖로 희석시키고, 상기 칩의 표면에 주사하였다. 각 주사 후에 즉시, 상기 칩을 희석 완충제 500 ㎕로 세척하였다. 1 mM 포름산 20 ㎕을 주사한 후, 다른 포름산 15 ㎕를 주사함으로써 실험들 사이에 상기 표면을 재생하였다. 재생 후에, 상기 칩을 희석 완충제로 평형화시켰다.

실시예 4: 가용성 수용체 형태의 생성:

인간에 사용하기 위한 수용체 억제제를 형성시키기 위하여, 세포외 도메인의 인간 수용체 cDNA 서열이 필요하다. 마우스 형태가 공지되어 있다면, 마우스 cDNA 서열을 이용하여 인간 cDNA 라이브러리를 용이하게 스크리닝할 수 있으며, 그러한 조작은 당업계에서 통상적인 실시에 해당한다. 인간 cDNA 서열을 사용하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계함으로써, 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인이 없는 수용체의 세포외 도메인을 PCR 증폭시킬 수 있다. 통상, 마직막 다이설파이드 결합 "TNF 도메인" 및 트랜스멤브레인 도메인 사이의 대부분의 아미노산을 포함한다. 생성되는 가용성 수용체의 효능을 최대화하기 위하여 포함되는 "줄기(stalk)" 영역의 양을 변화시킬 수 있다. 이러한 증폭된 조각을 조작하여 적당한 제한 부위를 다양한 C-터미날 Ig 융합 키메라 벡터내로 클로닝할 수 있다. 대안적으로, 3' 말단에 정지 신호를 삽입함으로써, Ig 융합 키메라 접근법을 사용하지 않고도 수용체의 가용성 형태를 제조할 수 있다. 상기 생성된 벡터는 효모, 곤충 세포, 박테리아 및 포유동물 세포를 비롯한 생물공학에서 사용하는 대부분의 시스템에서 발현시킬 수 있으며, 모든 타입의 발현에 대한 예들이 존재한다. 다양한 인간 Fc 도메인들을 부착하여, 필요에 따라, FcR 및 상보성 상호작용을 최적화하거나 제거할 수 있다. 대안적으로, 이러한 Fc 도메인들의 변이 형태를 이용함으로써, 특정한 이점을 갖는 Fc 도메인에 N-결합 당을 부착시키거나, FcR 또는 상보성 상호작용을 선택적으로 제거할 수 있다.

실시예 5: 아고니스트 또는 안타고니트 항체의 생성:

상기 기술된 가용성 수용체 형태를 이용하여, 종래의 방법에 따라 마우스를 면역화하고 모노클로날 항체를 만들 수 있다. 생성된 mAb(이것은 ELISA로 동정함)를, 다양한 시험관내 세포질 분석에서 플라스틱 상에 고정하거나 가용성 항체로서 아고니스트 활성에 대하여 추가로 스크리닝할 수 있다. 종종, HT29 세포주의 사멸은 많은 TNF 수용체들을 통한 신호에 민감한 편리한 시스템이다. 이러한 주가 당해 수용체를 포함하지 않는다면, 전장 수용체를 HT29 주내로 안정적으로 트랜스펙트시킴으로써 이제 세포독성 분석을 수행할 수 있다. 대안적으로, 사이토센서 (Cytosensor) 장치에 그러한 세포들을 사용함으로써, 상기 수용체의 활성화가 신호 사건을 지시하는 pH 변화를 유도할 수 있는지 여부를 평가할 수 있다. TNF계 수용체들은 그러한 포맷에서 잘 신호하며, 이러한 방법은 실행자가 상기 수용체에 의하여 개시되는 실질적인 생물학적 사건을 알 것을 요하지 않는다. 아고니스트 mAb는 임상 용도를 위하여 "인간 적용성(humanized)"일 것이다. 이러한 과정은 또한 안타고니스트 mAb를 정의하는데 사용할 수도 있다. 상기 mAb는 ELISA, 고전적인 결합 기법 또는 바이아코어(BIAcore) 기술로 모니터링한 수용체-리간드 상호작용의 억제능 및 아고니스트 활성의 결핍에 의하여 정의될 것이다. 마지막으로, 아고니스트 항체에 대한 응답에 있어서 다양한 세포들에 의한 케모카인 분비의 유도는 스크리닝 분석을 형성시킬 수 있다.

실시예 6: 수용체-리간드 상호작용의 억제자에 대한 스크리닝

수용체-Ig 융합 단백질을 사용하여, 상기 수용체에 직접 결합할 수 있는 분자에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 그 후, 리간드의 가용성 형태 및 상기 수용체-Ig 융합 단백질을 사용하는 ELISA 포맷 분석에서, 상기 수용체-리간드 상호작용을 억제하는 능력에 대하여 상기 분자들을 시험할 수 있다. 억제 화합물에 대한 다양한 자연 생성물 라이브러리 등을 스크리닝하기 위하여 상기 ELISA를 직접 사용할 수 있다. 상기 수용체를 HT29 주와 같은 세포주에 트랜스펙트시켜 생물학적 분석물(세포독성 분석에 있어서의 생물학적 분석물)을 형성할 수 있고, 이것은 그 후 스크리닝 분석물을 형성할 수 있다.

실시예 7: 생체내 종양 성장 억제

생체내에서 성장하는 다수의 상이한 종양 세포주를 이용하여 종양 성장 안타고니스트로서의 BCMA-Ig의 효능을 시험하였다. 본 연구를 위하여 흉선없는 (Nu/Nu) 면역결핍 마우스를 이용하였고, 종양 세포들을 피하 이식하였다. 본 발명자들은 공격적으로 성장하는 SW480 종양 주에 대하여 100 ㎕ 발열원(pyrogen) 없는 멸균 PBS중의 8 x 10⁵세포를 이식하였다. 하나의 대조군을 미처리 상태로 남겨두었고(n=5), 다른 군들에는 100 ㎍ 대조군-Ig(n=6) 또는 100 ㎍ BCMA-Ig(n=6) 단백질을 투여하였다. 투여는 이식 직전에 시작하였고, 그 다음의 투여는 그 후 매 7일 마다 시행하였다. 마이크로미터를 사용하여 종양 직경을 측정하였고, 식 vol=4/3Пr³을 이용하여 그 부피를 계산한다.

Nu/Nu 마우스 모델을 사용한 경우에 SW480 결장 암종 종양은 매우 빠르게 성장하며, 10일 이내에 촉지성 종양이 검출되었다. 24 일 후, 평균 대조군 종양 부피는 0.3 ㎤ 인 반면, BCMA-Ig 처리 종양의 평균 부피는 0.19 ㎤ 였던 바, 46 % 의 종양이 감소되었다. 결장 암종 HT29도 Nu/Nu 모델에서 공격적으로 성장한다. 이들 실험에 있어서, 100 ㎕ 발열원 없는 멸균 PBS 중의 1 x 10⁶세포를 피하 주입하였고, 섭생 용량은 SW480에 대하여 기술한 바와 같았다. 7일 후에 촉지성 종양이 검출되었고, 대조군에 있어서 상기 종양들은 매우 신속하게 성장하였다. 42 일 후, 대조군(미처리 및 대조군-Ig 처리, n=12)에 있어서의 평균 종양 부피는 0.485 ㎤ 인 반면, BCMA-Ig 처리군(n=5)에 있어서의 평균 종양 크기는 0.095 ㎤ 였던 바, 80 % 의 종양이 감소되었다. 50 일 후, 대조군 마우스의 30 %는 종양 크기가 1.5 ㎤ 이상으로 되었기 때문에 터미날(terminal)로 기록하였고, 상기 실험을 중단하였다. 상기 대조군과 달리, BCMA-Ig 처리군의 마우스는 0 %가 터미날로 기록되었다. 이러한 결과는 표 2에 나타낸다.

[표 2] 처리 5일 후, HT29 모델 중의 종양 부피 및 치사율

대조군 동물(미처리 및 대조군-Ig 처리) BCMA-Ig 처리 종양 부피 터미날 종양 부피 터미날0.22 - 0.11 -0.22 - 0.32 -0.35 - 0.13 -0.61 - 0.56 -0.73 - 0.33 -1.74 +2.53 +1.51 +0.90 -0.44 -0.32 -1.92 + 평균:0.96 %:30 평균:0.29 %:0

상기는 BCMA-Ig 처리를 이용한 종양 성장의 HT29 모델에 있어서의 사망률에 대한 유의적 효과 및 평균 종양 부피의 70% 감소를 입증한다.

폐 암종 종양 주 A549는 전술한 결장 암종 주보다 더욱 느리게 성장한다. 본 발명자들은 이러한 세포주에 대하여 100 ㎕ 발열원 없는 멸균 PBS 중의 1 x 10⁶세포들을 이식하였고, 전술한 바와 같은 섭생을 이용하여 처리하였다. 이식 후 약 20 일 후에, 촉지성 종양이 검출되었다. 종양 이식 50 일 후에, 대조군(미처리 및 대조군-Ig 처리; n=16)의 평균 종양 부피는 0.2 ㎤인 반면, BCMA-Ig 처리군(n=7)의 평균 종양 부피는 0.1 ㎤ 였던 바, 종양 부피가 50 % 감소하였다. BCMA-Ig 처리군에 있어서, 50 일 후, 마우스의 57 %가 0.1 ㎤ 이하의 종양을 나타낸 반면, 대조군처리 마우스는 6 % 만이 그러한 소형 종양을 유지하였다. 종양 이식 60 일 후에, 대조군의 평균 종양 부피는 0.3 ㎤로 증가되었다. 이에 반하여, BCMA-Ig 처리군의 평균 종양 부피는 여전히 0.2 ㎤ (0.188) 이하였다.

본 발명자들은, 상기 결장 암종 주보다 더욱 느리게 성장하는 쥐 NIH3T3에 대하여도 100 ㎕ 발열원 없는 멸균 PBS 중의 5 x 10⁶세포들을 이식하고, 전술한 바와 같이 처리하였다. Nu/Nu 마우스에 피하 이식하였을 때, 상기 NIH3T3 세포들은 섬유육종을 형성한다. 4 주 후, 촉지성 종양이 검출되었고, 대조군(n=11)에 있어서 이들 종양은 그 다음 10 일 이상 부피가 팽창하여 평균 크기가 0.136 ㎤ 까지 도달하였다. 반면에, BCMA-Ig 처리군(n=5)의 종양 부피는 단지 0.03 ㎤의 크기까지만 팽창되어 78 %의 종양 감소가 나타났다. 종양 이식 48 일 후, 대조군의 평균종양 부피는 1.6 ㎤까지 도달한 반면, BCMA-Ig 처리군의 평균 종양 부피는 단지 0.8 ㎤를 나타내어, 50 %의 종양이 감소되었다. 52 일까지, 대조군 동물의 82 % (9/11)가 1.5 ㎤ 이상의 종양 부피에 기초하여 터미날로 기록되었는 바, 대조군 동물의 단지 18 % 만이 살아남았다. 반면에, BCMA-Ig 처리군의 동물은 40 %(2/5)만이 그러한 종양 부피를 나타내어 희생되었고, 처리군 동물의 60 % 는 살아남았다. 이러한 결과는 표 3에 나타낸다.

[표 3] NIH3T3 모델의 생존율 데이터

이식 후의 일 수38 42 48 52생존 %대조군 100 90 64 18BCMA-Ig 100 100 80 60

시간에 대한 NIH3T3 종양의 성장을 나타내는 결과는 도 13에 도시한다. 시간에 대한 SW480 종양의 성장을 나타내는 결과는 도 14에 도시한다. 시간에 대한 HT29 종양의 성장을 나타내는 결과, 및 종양 이식 후 42 일째의 개개 동물을 나타내는 산포도는 도 15a에 도시한다. 종양 이식 후 50 일 및 60 일째에 개개 동물에 있어서의 A549 종양 성장을 나타내는 결과는 도 15b에 도시한다.

NIH3T3 종양 세포주에 대한 종양 성장 억제 결과는 도 13에 나타낸다. SW480 종양 세포주에 대한 종양 성장 억제 결과는 도 14에 나타낸다. HT29 및 A549 종양 세포주에 대한 종양 성장 억제 결과는 도 15에 나타낸다.

실시예 8: BCMA-IgG는 정상 마우스의 B 세포 숫자를 감소시킨다.

잭슨 실험실(Jackson Laboratory)(Bar Harbor, ME)에서 8주된 암컷 BALB/c 마우스를 구입하였다.

-8, -5, -1 및 +2일에, 마우스(3/군)에게 PBS, 인간 BCMA-huIgG1(hBCMA-Ig) 융합 단백질(Teresa Cachero, Biogen 공급) 400㎍, 또는 정제된 인간 IgG(HuIgG) (Sandoz, Basel, Switzerland) 400㎍을 복강내 투여하였다. 0일에, 마우스에게 10% 면양 적혈구(SRBC)(Colorado Serum Company, Denver, CO) 100㎕를 투여하였다.

희생 시에, EDT를 함유하는 튜브내로의 심장 천공을 통하여 혈액을 수집하고, 적혈구 세포를 저장성 완충액(hypotonic buffer) 중에서 세포용해시켰다. 또한, 혈청 제제를 위하여 EDTA 없이 혈액을 수집하였다. 지라 및 장간막 림프절 (MLN)로부터 단일 세포 현탁액을 제조하였고, 적혈구 세포를 저장성 완충액 중에서 세포용해시켰다. PE-접합 항-CD45R/B220, 항-신데칸/CD138 및 항-B7.2, 및 FITC-접합 항-IgM 및 항-CD45R/B220을 이용하여 유동 세포 계측을 수행하였다. 모든 mAb는 Pharmingen(San Siego, CA)에서 구입하였다. 간략하게, 얼음 위에서 15분 동안 10 ㎕/㎖ Fc 블록(Block)(Pharmingen)으로 Fc 수용체를 차단시킨 후, PE-접합 mAb 및 FITC-접합 mAb를 첨가하고, 얼음 위에서 20 내지 30 분 동안 항온처리하였다. 세포들을 1회 세척하고, 0.5% 파라포름알데히드에 현탁시켰다. FACSalibur^TM유동 세포 계측기(Becton Dickinson, San Jose, CA) 상에서 세포 형광 데이터를 얻고, CELLQuest^TM소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용하여 분석하였다.

hBCMA-Ig로 처리한 후, 조사된 말초 혈액 및 말초 림프 기관내의 B 세포의갯수가 약 50% 감소하였다. B220^고IgM^저B 세포는 PBS-처리 및 HuIgG-처리 마우스 각각에서 세포의 23.4% 및 21.5%로 나타난 반면, hBCMA-Ig-처리 마우스에서는 이러한 군이 세포의 단지 9.9%로 나타났다. 혈장 세포(신데칸/CD138+)는 PBS-처리 및 HuIgG-처리 마우스의 혈액에 각각 5.7% 및 4.8%로 존재하여, hBCMA-Ig-처리 마우스의 3.9%와 비교할 때, 약간만 감소된 것으로 나타났다. B7.2 분자는 hBCMA-Ig-처리 마우스의 1.9%와 비교할 때, PBS-처리 및 HuIgG-처리 마우스에서 B220+ 세포의 3.1% 및 4.5%로 상승 조절되었다.

지라 B220^고에서, B 세포는 hBCMA-Ig-처리 마우스에서 18.8%를 나타내어, PBS-처리 및 HuIgG-처리 마우스에서의 36.7% 및 40% 각각과 비교할 때, 현저하게 감소되었다. 이러한 감소는 IgM^고및 IgM^저부집단 양자 모두에서 관찰되었다(표 4 참조). 지라에서 새롭게 형성된 B 세포 구획, B220^저IgM^고에서 관찰된 변화는 없었다(데이터로 나타내지 않음). 혈장 세포(신데칸/CD138+)는 PBS-처리 및 HuIgG-처리 마우스의 지라에 각각 3.3% 및 3.4%로 존재하여, hBCMA-Ig-처리 마우스의 2.4%와 비교할 때, 약간만 감소한 것으로 나타났다.

MLN은, PBS-처리 및 HuIgG-처리 마우스에서의 26.7% 및 35.8% 각각과 비교할 때, hBCMA-Ig-처리 마우스에서는 14.1%로 존재하여 B220+ B 세포의 감소를 나타냈다. 상기 데이터를 표 4에 요약한다.

[표 4] hBCMA-Ig, PBS 및 HuIgG-처리 마우스의 B 세포군 ¹

혈액 B220 ^고 신데칸 B7.2/B220 ^저 IgM ^저PBS 23.4 ±5.7 5.7 ±1.5 3.1 ±0.5HuIgG 21.5 ±4.5 4.8 ±0.9 4.5 ±1.0HBCMA-Ig 9.9 ±1.8 3.9 ±0.6 1.9 ±0.5

지라 B220 ^고 B220 ^고 IgM+ 신데칸 IgM ^저PBS27.8 ±1.611.9 ±1.6 3.3 ±0.8HuIgG 30.5 ±2 11.8 ±1.0 3.4 ±0.7HBCMA-Ig 10.6 ±0.2 8.4 ±0.2 2.4 ±0.2

MLN B220+PBS 26.7HuIgG 35.8 ±3.3HBCMA-Ig 14.1 ±5.9

¹마우스는 재료 및 방법 섹션에 기술되어 있는 바와 같이 처리하였고, 그 데이터는 퍼센트 ± 표준 편차로 나타낸다.

SRBC로 면역화한 후, hBCMA-Ig-처리 마우스의 지라 및 혈중 혈액 및 혈장 세포 중의 B7.2 + B 세포 퍼센트의 감소는 B 세포 활성화 및/또는 성숙의 억제, 및 활성화된 B 세포 제거의 잠재적 증가가 있음을 암시한다. 이러한 SRBC의 경우에, 극소량 퍼센트의 항원-특이적 B 세포는 활성화되어 임의의 항원과 반응할 것이다. hBCMA-Ig 처리는 조사된 모든 조직에 있어서 B 세포 퍼센트의 그러한 상당한 감소(∼50%)를 초래하였으므로, hBCMA-Ig의 활성은 또한 휴면 성숙 B 세포를 표적화하는것으로 보인다.

따라서, B 세포-매개 질환의 임상적 적용의 치료 약물로 BCMA 융합 단백질을 사용할 수 있는 것으로 생각된다. 질환으로는 자가면역 질환, 예를 들어, 전신성 홍반성 루프스, 중증 근무력증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반병, 항지질 증후군, 샤가병(Chaga's disease), 그레이브병(Grave's disease), 베게너 육아종증(Wegener's Granulomatosis), 결절성 다발성 동맥염 및 급속 진행성 사구체신염 등이 있다. 또한, 치료제는 혈장 세포 장애, 예를 들어, 다발성 골수종, 발덴스트룀 마이크로글로불린혈증, 중쇄병(Heavey-chain disease), 원발성 또는 면역 세포 관련 아밀로이드증 및 부정 유의성의 모노클로날 감마글로블린 장애(Monoclonal gammopathy of undetermined significance: MGUS)와 같은 장애에 있어서의 용도를 갖는다. 종양학적 표적으로는 B 세포 암종, 백혈병 및 림프종이 포함될 것이다.

본 발명의 정신 또는 범위를 벗어남 없이, 본 발명의 폴리펩티드, 조성물 및 방법에 다양한 수정 및 변형이 가해질 수 있다는 것은 당업자들에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 수정 및 변형이 첨부되는 청구범위 및 그 균등의 범위에 포함되는 것이라면, 본 발명은 그러한 수정 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.

Claims

원치 않는 세포 증식과 관련된 증상을 나타내는 포유동물을 치료하는 방법으로서, 약학적 허용 레시피언트(recipient)와 함께, APRIL 및 그 동족(cognate) 수용체 또는 수용체들 사이의 상호작용을 길항하는 폴리펩티드를 포함하는 APRIL-R 안타고니스트를 함유하는 조성물 치료 유효량을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 APRIL-R 안타고니스트가 a) 가용성 APRIL-R 폴리펩티드; b) 이종성 아미노산 서열에 융합된 가용성 APRIL-R 폴리펩티드를 포함하는 가용성 키메라 분자(chimeric molecule); 및 c) 항-APRIL-R 항체 상동체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 가용성 APRIL-R 폴리펩티드가 a) 서열 번호: 8(도 3a)의 아미노산 잔기 1 내지 184를 포함하는 미변성 서열 APRIL-R 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일성이 80% 이상인 분리된 APRIL-R 폴리펩티드 변형체 또는 그 단편; b) 서열 번호: 8(도 3a)의 아미노산 잔기 1 내지 52와의 아미노산 서열 동일성이 80% 이상인 분리된 APRIL-R 폴리펩티드 변형체 또는 그 단편; 및 c) 서열 번호: 8(도 3a)의 아미노산 잔기 8 내지 41을 포함하는 분리된 APRIL-R 폴리펩티드 또는 그 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 가용성 키메라 분자가 a) ⅰ. 서열 번호: 8(도 3a)의 아미노산 잔기 1 내지 184를 포함하는 미변성 서열 APRIL-R 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일성이 80% 이상인 분리된 APRIL-R 폴리펩티드 변형체 또는 그 단편; ⅱ. 서열 번호: 8(도 3a)의 아미노산 잔기 1 내지 52와의 아미노산 서열 동일성이 80% 이상인 분리된 APRIL-R 폴리펩티드 변형체 또는 그 단편; 및 ⅲ. 서열 번호: 8(도 3a)의 아미노산 잔기 8 내지 41을 포함하는 분리된 APRIL-R 폴리펩티드 또는 그 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 가용성 APRIL-R 폴리펩티드로서, b) 이종성 아미노산 서열에 융합된 가용성 APRIL-R 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 면역글로불린의 IgG Fc 도메인에서 유래한 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 이종성 아미노산 서열이 분비 단백질의 신호 서열에서 유래한 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 항-APRIL-R 항체 상동체가 a) 서열 번호: 8(도 3a)의 아미노산 잔기 1 내지 184를 포함하는 미변성 서열 APRIL-R 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일성이 80% 이상인 분리된 APRIL-R 폴리펩티드 변형체 또는 그 단편; b) 서열 번호: 8(도 3a)의 아미노산 잔기 1 내지 52와의 아미노산 서열 동일성이 80%이상인 분리된 APRIL-R 폴리펩티드 변형체 또는 그 단편; 및 c) 서열 번호: 8(도 3a)의 아미노산 잔기 8 내지 41을 포함하는 분리된 APRIL-R 폴리펩티드 또는 그 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 APRIL-R 폴리펩티드에 결합하는 항체를 포함하는 것인 방법.
원치 않는 세포 증식과 관련된 증상을 나타내는 포유동물에게 2종 이상의 안타고니스트 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 포유동물의 상기 증상을 치료하는 방법으로서, 상기 2종 이상의 안타고니스트는 APRIL과 BCMA 사이의 상호작용을 길항하는 제1 APRIL-R 안타고니스트, 및 APRIL과 BCMA가 아닌 기타 동족 APRIL 수용체 또는 수용체들 사이의 상호작용을 길항하는 제2 APRIL-R 안타고니스트를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원치 않는 세포 증식이 암종(carcinoma)인 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원치 않는 세포 증식과 관련된 증상이 암(cancer)인 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
암종의 증식이 APRIL에 의하여 조절되는 암종이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, APRIL 및 APRIL-R 사이의 상호작용을 길항하는 폴리펩티드를 포함하는 APRIL-R 안타고니스트를 함유하는 조성물 치료 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 암종이 폐 암종, 결장 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 및 암종의 증식이 APRIL에 의하여 조절되는 기타 암종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.