JP2005517379A

JP2005517379A - 遺伝的疾病素因

Info

Publication number: JP2005517379A
Application number: JP2000593773A
Authority: JP
Inventors: クスク、フィリップ
Original assignee: Osteometer Biotech AS
Current assignee: Immunodiagnostic Systems Nordic AS
Priority date: 1999-01-18
Filing date: 2000-01-17
Publication date: 2005-06-16
Also published as: WO2000042216A2; WO2000042216A3; AU3149200A; EP1144686A2

Abstract

骨シアロプロテイン遺伝子、マトリックスｇｌａタンパク質遺伝子、オステオポンチン遺伝子、若しくオステオプロテジェリン遺伝子のプロモーター又はこれらの全ての組合せたプロモーターの遺伝子型を決定することによって、例えば骨粗しょう症などの異常な石灰化症状に対する個人の疾病素因を評価判定する方法。各プロモーターに係る特異的対立遺伝子変異が記述されている。

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨シアロプロテイン(sialoprotein)遺伝子、マトリックスｇｌａタンパク質(matrix gla protein)遺伝子、オステオポンチン(osteopontin)遺伝子及び/又はオステオプロテジェリン(osteoprotegerin=OPG)／破骨細胞生成阻害因子(osteoclastogenesis inhibitory factor=OCIF)遺伝子における多形に基ずいた種々の病状に対する疾病素因を評価判定する方法に係わる。更に具体的には、これらの多形の検索することによって骨粗しょう症やアテローム性動脈硬化症を含む種々の病理的石灰化又はカルシウム沈着症状に対する個人の疾病素因を評価判定する方法に係わる。本発明の方法は、ヒト骨シアロプロテイン遺伝子、ヒトマトリックスｇｌａタンパク質遺伝子、ヒトオステオポンチン遺伝子及び/又はオステオプロテジェリン／破骨細胞生成阻害因子(ＯＣＩＦ)遺伝子における対立遺伝子変異を決定して、かくして骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の大小に対する疾病素因を予測するのに特に有用である。本発明はまた、該多形を含有する種々の骨シアロプロテイン（ＢＳＰ）遺伝子、マトリックスｇｌａタンパク質（ＭＧＰ）遺伝子、オステオポンチン（ＯＰＮ）遺伝子及び/又はＯＰＧ／ＯＣＩＦ遺伝子並びにこれらに対するプローブ及びプライマーにも係わる。
【０００２】
【従来の技術】
骨粗しょう症は、今日においては年齢が６０才以上の人において最もよく見られる疾病の一つであり、アメリカだけでもすいて２５００万人が罹患しており、その女対男の比率は５：１である。このことは、年齢６０才以上のほぼ２５ないし３０％に相当する。ヨーロッパにおいては、この疾病に罹患した人の比率は、ほぼ同じである。
【０００３】
目下のところ、骨粗しょう症には治療法は全くない。しかしながら、ホルモン代替療法及びビスホスホネ―トによる治療によれば、骨損失を停止するか又は遅延させることが出来る。従って、かかる骨損失診断の可能性が早くなればなるほど、それだけ治療の効果も一層良くなのであって、可能な限り早期に骨粗しょう症に対する疾病素因を有する人を同定することが出来るならば、特に有利となるはずである。骨粗しょう症の発症に関連した強力な遺伝子成分が存在しているので（以下を参照のこと）、ピーク骨質量及び/又は骨損失速度に影響を及ぼす遺伝子を特定することは、骨粗しょう症の疾病素因を有する遺伝子型の人を若い時期に特定することが出来、それだけ多くの時間を予防方策を講じるために割くことが出来ることになり、大いに役立つであろう。
【０００４】
このような観点から、ピーク骨質量、即ち骨ミネラル密度が相対的に低いか又は骨質量、即ち骨ミネラル密度の損失速度が相対的に速い素因を有する個人又はグループを特定することが、関連し該当することになる。
【０００５】
骨ミネラル密度に対する、従って恐らくは骨粗しょう症に対する遺伝子寄与の程度は、双生児に関する研究から２０年以上も前から明らかとなっている(Smith et al,1973)。ＢＤＭ及び骨幅の分散が、一卵性双生児におけるよりも二卵性双生児において大きいことが見出され、骨質量の調節に対して遺伝子影響が相当大きいことが示された(Smith et al,1973)。また別の双生児に関する研究の結果、種々の遺伝要因が、ＢＭＤ変化に及ぼす統計的に有意な影響が報告された(Kelly et al,1993)。その他のいくつかの研究の結果から、ピーク骨質量の獲得に対して強い遺伝子の影響があることが明らかとなっている(Gueguen et al,1995;Lutz & Tesar,1990)。従って、当該遺伝子成分が、ピーク骨質量及び骨損失速度の双方に一定の影響を及ぼすように思われる。遺伝子隔離解析の結果から、骨質量は何れも中程度の影響であるがいくつかの遺伝子によって制御されることが強く示唆されている(Gueguen et al,1995)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
かかる分子機構及び遺伝学については、骨形成及び骨吸収に影響を及ぼす遺伝子の探索が強力に行われてきたにも拘わらず、殆ど知られていないのである。ここ5年以内において、主として調節タンパク質をコードする遺伝子において同定された多形のうち、ＢＭＤに関連したものは以下のようである：
１）Morrison及び共同研究者(Morrison et al,1994; WO94/03633)によって同定されたビタミンＤレセプター遺伝子多形は、多くの研究報告の主題となっているが、ほぼ半分においてしか、有意であるものの弱い相関性が見出された過ぎず、またかかる相関性も、Riggs(Riggs,1997)によって示唆されているように、骨損失速度に対するよりもピーク骨質量に対して強い関連する可能性がある。
【０００７】
２）Kobayashi及び共同研究者によって同定されたエストロゲンレセプター遺伝子多形は、低いＢＭＤに関連している(Kobayashi et al.,1996, US58 34200)。
【０００８】
３）Grant及び共同研究者によって同定されたＩα１型コラーゲン遺伝子における多形(Grant et al,1996;WO9732041)は、ピーク骨質量よりも骨損失速度に関連している(Uitterliden et al,1998)。
【０００９】
４）インターロイキンー６遺伝子―破骨細胞系の細胞に対して刺激効果を有するインターロイキンーの３‘周辺におけるＡＴリッチなミニサテライト重複における二種の多形が、低いＢＭＤと関連していることが見出されている(Murray et al,1997-WO9743446)。これらの多形は、ピーク骨質量に影響するように思われる。
【００１０】
５）インターロイキンー１レセプターアンタゴニスト遺伝子において最近見出された二つのタンデム重複多形が、骨損失速度に関連している(Keen et al,1998; WO9844150)。この遺伝子に注目する理由は、インターロイキン−１は、破骨細胞による骨吸収の強力な刺激物質であることである。
【００１１】
エストロゲン欠乏状態では、インターロイキンー１は刺激されるが、インターロイキンー1レセプターアンタゴニストは、阻害されるのであって、これに関連した骨損失は、インターロイキンー1レセプターアンタゴニストを用いた治療によって阻止することが可能であり、かかるアンタゴニストは、閉経後骨損失を調節するための優れた候補遺伝子となるものと思われていた(Keen et al,1998)。
【００１２】
６）オステオカルシン遺伝子における多形が最近報告されている(Dohi et al,1998)。しかしこの多形によって、異所対立遺伝子を持つ人達について測定されたＢＭＤを野生型遺伝子型を有する人達について測定したＢＭＤとから充分有意に区別することが出来なかった。
【００１３】
７）低いＢＭＤ、即ち骨粗しょう症に関連した多形は、ＴＧＦ−β１遺伝子において報告されているが、そのタンパク質産生物は、骨中には豊富に存在し、骨吸収と骨形成との重要な調節因子である(Langdahl et al,1997;Yamada et al., 1998; WO97/28280)。
【００１４】
８）アポリポプロテインＥにおける多形が、閉経後の日本人婦人における低いＢＭＤに相関関係を有するものと報告されている(Shiraki et al,1997)。この遺伝子に注目する理由は、γーグルタミルカルボキシラーゼを介してオステオカルシンを活性化するビタミンＫの濃度が、アポリポプロテインＥ表現型に相関ずけられた旨の報告があったからである(Saupe et al,1993)。
【００１５】
９）ＷＯ９７０５２７５は、レチノイン酸レセプター遺伝子における対立遺伝子変異体を解析することによって骨密度を予見する用途を開示している。
【００１６】
ビタミンＤレセプター遺伝子及びＩ型１コラーゲン遺伝子多形だけが、検査したコホートの一部分におけるＢＭＤと相関するように思われた（その他の遺伝子多形は、小規模な、国民的コホートについて検定されているに過ぎず、その大半は、骨代謝にとってはむしろ瑣末である）。骨粗しょう症発症に及ぼす遺伝子の影響は、複数遺伝子の不十分な作用によって惹起されるため、このことは、驚くべきことでもない。一層広大な地理学的エリア内で有効な、より優れた予見能力を獲得・入手するためには、骨形成／吸収に対して影響を持つ更なる遺伝子多形を同定しなければならないことは、明らかである。この点については、骨内に存在する種々のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域に傾注・集中することが重要であると信じるが、その理由は下記のようである：即ち、骨粗しょう症の素因となる突然変異は、50年以上物理的な検出を拒絶してきたものであるか、自然界においては捕らえ難い微妙なものであるからである。ある遺伝子産生物の機能ではなく、その発現に影響を及ぼす突然変異は、このように微妙な効果を示すものと期待されるであろう。遺伝子発現は、遺伝子のコード領域の上流に位置するプロモーターによって制御されるのであり、この領域における突然変異が、変容した遺伝子発現を惹起するはずである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
かくして、本発明は、選択された一定の石灰化状態に対する個人の疾病素因を評価判定する方法であって、骨シアロプロテイン遺伝子のプロモーター、マトリックスｇｌａタンパク質遺伝子のプロモーター、オステオポンチン遺伝子のプロモーター、若しくはＯＰＧ／ＯＣＩＦ遺伝子のプロモーター、又はこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の任意の組合せたプロモーターの遺伝子型を決定することを含んで成る該評価判定方法を提供するものである。
【００１８】
本発明に従って評価判定される疾病素因の対象である石灰化状態は、骨質量ピークに高低があること（将来、現在又は過去の状態として）又は骨損失速度に大小があること（将来、現在又は過去の状態として）である。即ち、本発明は、骨粗しょう症に対する疾病素因を評価判定するために使用することも可能である。
【００１９】
本発明は第二の局面において、前記プロモーターの一種又はその任意の組合せに対立遺伝子変異に関連したあらゆる状態・症状に対して個人が有する疾病素因を評価判定する方法を提供する。
【００２０】
本発明の方法は典型的には、ある個人が、骨シアロプロテインプロモーター（ＢＳＰ）、マトリックスｇｌａタンパク質プロモーター（ＭＧＰ）、オステオポンチンプロモーター（ＯＰＮ）、ＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーター、又はこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の任意の組合せたプロモーターに対してホモ接合であるか又はヘテロ接合であるかを決定することを含んで成るものである。本方法は、好便には、骨シアロプロテイン、マトリックスｇｌａタンパク質、オステオポンチン若しくはＯＰＧ／ＯＣＩＦ又ははこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の異常産生の相関関係を有する症状又は疾病、例えば骨粗しょう症又はアテローム性動脈硬化症などのリスクに曝されている個人を検査探索するために使用される。
【００２１】
ヒトシアロプロテインプロモーターのＤＮＡは既知であり、Matrix Biol.14:31-40(1994)においてKim, R.H.et al.によって報告されている。このグループによってＧｅｎＢａｎｋに受託番号Ｌ２４７５６号として寄託されたこの配列を以後は野生型配列又は報告済み配列と称することとする。ヒトマトリックスｇｌａタンパク質プロモーターのＤＮＡは既知であり、J.Biol. Chem.265 (25):15040-15048(1990)においてCancel, L. et al.によって報告されている。このグループによってＧｅｎＢａｎｋに受託番号Ｍ５５２７０号として寄託されたこの配列を以後は野生型配列又は報告済み配列と称することとする。ヒトオステオポンチンプロモーターのＤＮＡは既知であり Biochem. J. ,303:255-262 (1994)においてHijiya et al.によって報告されている。このグループによってＧｅｎＢａｎｋに受託番号Ｄ１４８１３号として寄託されたこの配列を以後は野生型配列又は報告済み配列と称することとする。ヒトＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーターのＤＮＡは既知であり、Eur. J. Biochem.254(3): 658-691(1998)においてMorinaga et al.によって報告されている。このグループによってＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＢ００８８２１号として寄託されたこの配列を以後は野生型配列又は報告済み配列と称することとする。かかる用語は、これらの報告済み配列の如何なる配列も、当該母集団においてこれらの変異型よりも優勢であること又はかかる配列のそれぞれの配列若しくは如何なる配列もが病理学上のリスクが最低であることに関連するものであることを意味するものではない。本発明の方法には、検査を受ける個人が、報告済み配列と同一である（又は前記配列の選択された領域と同一である）、骨シアロプロテインプロモーター、マトリックスｇｌａタンパク質プロモーター、オステオポンチンプロモーター、ＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーター、又はこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の任意の組合せたプロモーターを有しているか否か、又は当該個人が、報告済み配列とは異なる（又は前記した選択個所において異なる）、骨シアロプロテインプロモーター、マトリックスｇｌａタンパク質プロモーター、オステオポンチンプロモーター、ＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーター、又はこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の任意の組合せたプロモーターを有しているか否かを、ホモ接合であるかヘテロ接合であるかに係らず決定することを包含するものである。
【００２２】
本発明は、上記した方法において、当該ＢＳＰの塩基対１４９６なる位置における配列、具体的にはこの位置における配列がＡ（報告済み）であるかＧであるかを決定するか、又は塩基対１８６９なる位置における配列、具体的には前記位置における配列がＧ（報告済み）であるか又はＡであるかを決定する方法を包含する。上記において特定した位置は、報告済み配列の開始点から番号を付けたものである。また別の番号付けスキームでは、これらの位置は、当該遺伝子の転写配列の開始点から塩基対−６８３及び塩基対ー３１０である。これ以降は、このような特異的な対立遺伝子変異は、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａなる用語を用いて表示することとする。
【００２３】
同様に、本発明は、かかる方法において、前記対立遺伝子変異が、ＭＧＰの塩基対２４２なる位置（報告済み配列の開始点から番号をつけた場合で又は転写配列の開始点から塩基対―３１５７なる位置）にあり且つ具体的には前記位置における配列がＣであるか（報告済み）又はＡであるかーこれ以後ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａと称するーを決定する方法を包含する。
【００２４】
同様に、本発明は、かかる方法において、前記対立遺伝子変異が、ＯＰＮの塩基対５２０なる位置（報告済み配列の開始点から番号をつけた場合又は転写配列の開始点から塩基対―１７４８なる位置）にあり且つ具体的には前記位置における配列がＧであるか（報告済み）又はＡであるかーこれ以後ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａと称するーを決定する方法を包含する。
【００２５】
同様に、本発明は、かかる方法において、前記対立遺伝子変異が、ＯＰＮの塩基対１８２５なる位置（報告済み配列の開始点から番号をつけた場合又は転写配列の開始点から塩基対―４４３なる位置）にあり且つ具体的には前記位置における配列がＴであるか（報告済み）又はＣであるかーこれ以後ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃと称するーを決定する方法を包含する。
【００２６】
本発明は、上記した方法において、当該ＯＰＧ／ＯＣＩＦの塩基対１６３なる位置における配列、具体的にはこの位置における配列がＡ（報告済み）であるかＧであるかを決定する方法を包含する。上記において特定した位置は、報告済み配列の開始点から番号を付けたものである。また別の番号付けスキームでは、これらの位置は、当該遺伝子の転写配列の開始点から塩基対−９４３である。これ以降は、このような特異的な対立遺伝子変異は、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇなる用語を用いて表示することとする。
【００２７】
本発明者らは、当該個人のＢＳＰ遺伝子の少なくとも一つのコピーが、１４９６なる位置においてＡではなくむしろＧを有しているか又は１８６９なる位置においてＧではなくむしろＡを有している場合、かかる事実は、ピーク骨質量がより大きくなることに関連ずけられる、ということを見出したのである。
【００２８】
同様に、本発明者らは、当該個人のＭＧＰ遺伝子の少なくとも一つのコピーが、２４２なる位置においてＣではなくむしろＡを有している場合、かかる事実は、ピーク骨質量損失速度がより大きくなることに関連ずけられる、ということを見出したのである。
【００２９】
本発明者らは更に、ＯＰＮの塩基対５２０なる位置においてＧではなくＡが存在する少なくとも一つのコピーを有することが、骨質量損失速度がより大きくなることに関連づけられることを見出したのである。
【００３０】
本発明者らは更に、ＯＰＮの塩基対１８２５なる位置においてＣではなくＴが存在する少なくとも一つのコピーを有することが、骨質量がより少なくなることに関連づけられることを見出したのである。
【００３１】
本発明者らは、個人のＯＰＧ／ＯＣＩＦ遺伝子の少なくとも一つのコピーが、塩基対１６３なる位置においてＧではなくむしろＡを有する場合、かかる事実は骨質量がより大きくなることに関連づけられることを見出したのである。
【００３２】
遺伝子プロモーター配列に係る関連した測定は、一般的に前記個人の前記遺伝子プロモーターのうち関連した部分を増幅することを含む、広範に知られている方法で実施される。前記増幅済みの部分配列は、ハイブリダイゼーション測定法又は制限酵素切断断片長分析によって決定することが可能である。
【００３３】
具体的には、増幅は、選別したプロモーターを用いて行えばよいのであるが、かかるプロモーターの選別は、報告済み配列のうちのから選択した配列又は報告済み配列の変異が存在する場合、増幅によって増幅遺伝子において一種の制限酵素によって切断される新たな個所が生じるように行うのである。即ち、当該増幅遺伝子の酵素処理によって、複数の異なる制限酵素切断断片が生成されるのである。本発明は、前記遺伝子プロモーターのうち該当する部分の増幅に使用するオリゴヌクレオチドプライマーを包含する。具体的には、本発明は、選別した変異の有無に依存して異なる制限酵素切断パターンを生成するように選択したプロモーターを包含するのである。本発明に従った適当なプロモーターは、下記する実施例において記載する。
【００３４】
本発明は、前記した疾病素因の一つを決定し、次いで当該個人に医薬品を投与して、かくして骨粗しょう症を予防若しくは治療するか又は当該個人が低いピーク骨質量又は大きい骨質量損失速度の素因がある場合は骨粗しょう症の発症を遅延せしめることを含んで成る、骨粗しょう症を治療する方法を包含する。
【００３５】
骨シアロプロテインとは、骨組織に特異的な３３−３４ｋＤの新生タンパク質であって、グリコシル化、リン酸化及び硫酸化によって広範に翻訳後修飾されてその結果最終分子量が５７ｋＤとなったものである(Oldberg et al.,1988; Ecarot-Charrier et al.,1989;Fisher et al.,1990; Zhang et al.,1991)。オステオポンチンと共に、ＢＳＰは、骨マトリックスにおいて最も多量に存在する非コラーゲン質タンパク質であり(Nagata et al.,1991)、破骨細胞に見出されたα_Vβ₃インテグリン型の細胞表面レセプターを経由した細胞付着を媒介するＲＧＤモチーフを含有している(Oldberg et al., 1988; Flores et al.1992;Ross et al.,1993)。また、強力なヒドロキシアパタイト核形成領域を創生するポリグルタミン酸からなるセグメントを幾つか有している(Hunter & Goldberg,1993)。ラットを用いた(Chen et al.,1991; Chen et al.,1992)またトランスジェニックマウスを用いた(Chen et al.,1996)内因性ＢＳＰの局在化に関する研究の結果、ＢＳＰの最も高い発現は、新生児骨において生起し、それ以降の成長と発育に伴なって発現は顕著に低下することが判明している。ＢＳＰは、免疫組織化学的手法を用いて、無機化前線より前において局在化させたところ、ＢＳＰが骨無機化の開始に必要であることが示唆されている(Roach,1994)。従って、ｍＲＮＡは、デノーボで無機質化した組織形成部位において分化した骨芽細胞、ぞうげ細胞及びセメント芽細胞において検出されたに過ぎない(Chen et al.,1991;Chen et al.,1992)。導入遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子にラットＢＳＰから得たほぼ２．７ｋｂプロモーター領域を融合させたもである、トランスジェニックマウスにおいて、同一の発現パターンが認められ、その結果ラットプロモーターのほぼ２．７ｋｂ領域が骨組織に特異的な転写を仲介するのに充分であることが明らかとなっている(Chen et al.,1996)。
【００３６】
マトリックスｇｌａタンパク質は、五つのγ―カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）残基を含んだ、分子量がほぼ１４ｋＤａである７９個のアミノ酸残基から成る小型のタンパク質である(Price & Williamson; Loeser & Wallin,1992)。このｇｌａ残基は、恐らくはビタミンＫ依存性酵素であるγ―カルボキシラーゼによる翻訳後修飾の産物であるのであろう。ＭＧＰは、ｇｌａ依存態様でヒドロキシアパタイトに強力に結合する(Dowd et al.,1995)。高濃度のＭＧＰが、骨、ぞうげ質及び軟骨からなる細胞外マトリックス中に見出されている(Hail et al.,1988)。しかしながら、ＭＧＰは多くの組織において発現しており、最も高い濃度のｍＲＮＡが、肺、心臓、腎臓及び軟骨において認められている(Fraser & Price,1988)。骨内部におけるＭＧＰの機能に関する最初の徴候は、γ―カルボキシラーゼ阻害剤であるワーファリンで処置されたラットを用いた実験から得られた。用いた動物は、成長層板が過剰に無機質化しており、骨内におけるＭＧＰの一つの機能は、ヒドロキシアパタイト生成の阻害であり得ることが示された(Price et al.,1982)。このような機能に対する最終的な証拠が、ＭＧＰノックアウトマウスに関する研究から得られている。なおこのノックアウトマウスは、動脈石灰化・カルシウム沈着により血管破裂を起こして生後2ヶ月以内に死亡する。ＭＧＰ欠乏マウスもまた、成長層板の石灰化が不十分となり得るが、この場合石灰化は、健常動物において認められる下部肥厚部位に制限されるのではなく、むしろ増殖している軟骨細胞部にまで拡大するのである。健常な石灰化は、軟骨細胞柱の解体・崩壊に連なり、最終的に短伸長、骨減少症や骨折を起こす原因となる(Luo et al.,1997)。これらの結果から、ＭＧＰは、軟組織において石灰化を阻害し且つ成長板軟骨内部での無機質化を下部肥厚部にのみ限定する機能を果たすものと強く示唆される。なお、後者は恐らくは増殖中の軟骨細胞の基底領域における石灰化を阻害することによるものであろう。
【００３７】
オステオポンチンは、４４ｋＤａのリン酸化され且つグリコシル化されたタンパク質であって(Price et al.,1987)、ＢＳＰと共に、ＯＰＮは、骨マトリックスにおいて最も多量に存在する非コラーゲン質タンパク質であるが(Nagata et al.,1991)、ＢＳＰとは異なって他のいくつかの組織においても発現される(Denhardt & Guo,1993)。オステオポンチンとＢＳＰとは、明らかに関連がある：即ち、１）これらは何れも、α_Vβ₃インテグリン型の細胞表面レセプターを介した細胞付着を媒介するＲＧＤ領域を有している(Ross et al.,1993; Wong et al.,1996);2)これらは何れも、酸性アミノ酸（ＯＰＮは、ポリアスパラギン酸セグメントを有し、またＢＳＰは、ポリグルタミン酸セグメントを有する）及びシアル酸の含有量が高い(Franzen & Heinegard)。
【００３８】
リン酸化オステオポンチンは、強力なヒドロキシアパタイト形成阻害剤であり、他方その脱リン酸化型は、阻害作用は遥かに弱い媒介するＲＧＤモチーフを含有している(Hunter et al., 199)。骨内においては、オステオポンチンは、骨ライニング細胞の基底となる境界板(lamina limitans)において高濃度で見出され、また逆転（セメント）線内では、骨沈着が骨吸収減少に遅れるマトリックス−マトリックス界面で認められる(McKee & Nanci 1996;McKee et al.,1993)。これらの知見は、オステオポンチンの持つヒドロキシアパタイト阻害活性と併せて、オステオポンチンは、Hunter et al.,1994が考察したように、一旦活発な骨形成が終焉すると、成長中のヒドロキシアパタイト表面を密閉・包囲する作用を発揮する可能性があることを示唆するものである。最近、オステオポンチンノックアウトマウスが、健常な発育と骨構造を示すが、破骨細胞形成はインビトロで増進され(Rittling et al.,1998)また破骨細胞の数は、野生型マウスにおけるよりもＯＰＮ−／−において骨端領域において多いことが明らかにされている(Yoshitake et al.,1998)。興味深いことに、Yoshitakeとその共同研究者らもまた、野生型動物の大たい骨で骨髄切除後における新たに形成された過剰骨は、２週間後に吸収されたが、他方ＯＰＮ−／−マウスでの同様の実験においては骨吸収は一切認められなかったことを明らかにしている(Yoshitake et al.,1998)。従って、ＯＰＮ−／−マウスにおける破骨細胞数の増加は、骨吸収能力が低下したことの補償である可能性がある。このことは、上記したHunterとその共同研究者らが提出した、オステオポンチンは、骨形成後における成長ヒドロキシアパタイト表面を制限する作用を有する、という概念を実体化するものである。
【００３９】
マトリックスｇｌａタンパク質及びオステオポンチンとによって促進されることが示唆されてきたもう一つの症状は、アテローム性動脈硬化症である(Shanahan et al.,1994;Sohnma et al.,1994)。Watanabe遺伝性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギの大動脈から誘導したｃＤＮＡライブラリーを検索するために差次ハイブリダイゼーション技法を使用して、Ｓｏｈｍａと共同研究者らは、マトリックスｇｌａタンパク質をコードするクローンを一つ見出した(Sohma et al., 1994)。年齢の異なるＷＨＨＬと健常ウサギの大動脈から作成したＲＮＡのノーザンブロット分析の結果、マトリックスｇｌａタンパク質のｍＲＮＡ発現は、ＷＨＨＬウサギにおけるアテローム性動脈硬化症への進行と比例して増大したことが明らかとなった(Sohma et al.,1994)。さらには、マトリックスｇｌａタンパク質を欠損したマウスは、大動脈石灰化が原因で死亡している(Luo et al., 1997)。これらのマウスにおいてはアテローム性動脈硬化性プラクが一切認められなかったため、マトリックスｇｌａタンパク質は、一旦プラクが形成されると石灰化に影響を及ぼす可能性があるものと示唆される。しかしながら、高濃度のマトリックスｇｌａタンパク質が、アテローム性動脈硬化性プラクの脂質含量の多い部位に局在していた(Shanahan et al.,1994)。また、高濃度のオステオポンチンｍＲＮＡとタンパク質が、ヒトアテロームプラクにおいて壊死性脂質コア―と石灰化領域において認められている(Shanahan et al.,1994)。
【００４０】
オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）／破骨細胞形成阻害因子（ＯＣＩＦ）は、最近独立して二つのグループによって、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリに関連した、分子量がほぼ５５ｋＤａで、長さが３８０個のアミノ酸残基である糖タンパク質であると同定された(Simonet et al.,1997: Yasuda et al.,1997)。他のＴＮＦ−Ｒ様分子とは異なって、このサイトカインレセプターは、膜貫通領域を欠落しており(Simonet et al.,1997)、従ってＯＰＧ／ＯＣＩＦは、分子量がほぼ１１０ｋＤａのダイサルファイド結合ホモダイマーとして現出する分泌型タンパク質である(Simonet et al.,1997)。
【００４１】
当初、ラットＯＰＧ／ＯＣＩＦに対してトランスジェニックであるマウスは、骨粗しょう症を発症することが見出され、その結果ＯＰＧ／ＯＣＩＦは、骨芽細胞―介在骨形成を増大させるか又は破骨細胞―介在骨形成を減少させるか機能を発揮する可能性が明らかとなった(Simonet et al.,1997)インビトロでの破骨細胞形成測定試験において、組換え型のＯＰＧ／ＯＣＩＦが、強力な破骨細胞形成阻害剤であることが見出された(Simonet et al.,1997)。かかる知見と一致して、ＯＰＧ／ＯＣＩＦノックアウトマウスが、骨粗しょう症を発症し、ＯＰＧ／ＯＣＩＦが生後の骨質量の重要な調節因子であることが強調されることとなった(Bucay et al.,1998)。
【００４２】
マウスの胚形成過程において、ＯＰＧ／ＯＣＩＦは、発達中の骨の軟骨においてまたいくつかの主要な動脈、胃腸管や皮膚において高度に発現されている(Simonet et al.,1997)。成体動物において、ＯＰＧ／ＯＣＩＦ発現は、心臓、脳、肺や肝臓を含むいくつかの組織において見出されており、このことは、ヒト組織ではＯＰＧ／ＯＣＩＦ発現は脳や肝臓では認められず、腎臓において高度に発現され且つ種々の造血器官や免疫器官において検出可能であるのと異なる(Simonet et al.,1997)。このような異なる観察結果に関しては、真の種特異的発現相異によるものであり得るとする以外、一切説明がなされていない。
【００４３】
ＯＰＧ／ＯＣＩＦに対するリガンドもまた、ＯＰＧ／ＯＣＩＦを同定した同じ二つのグループによって独立して同定された。このリガンドは、ＯＰＧリガンド（ＯＰＧＬ）(Lacey et al.,1998)又は破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）(Yasuda et al.,1998)とも称されるが、TNF―関連サイトカインであって、これは、破骨細胞系統にコミットした造血祖先細胞に結合する(Lacey et al.,1998)。インビトロＯＰＧＬ／ＯＤＦもまた、骨吸収を行うよう破骨細胞を刺激し、また皮下注入した組換え型ＯＰＧＬ／ＯＤＦは、マウスにおいて骨吸収を刺激する(Lacey et al.,1998)。ＯＰＧＬ／ＯＤＦは，４５ｋDaの膜結合タンパク質としてか又は３１ｋＤａの可溶性分泌型C―末端断片として産生される(Lacey et al.,1998)。
OPGL／ODFは、以前に同定された二種のサイトカイン、即ちT細胞活性化に必須であるTNF-関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）(Wing et al.,1997)及び樹状細胞活性化に必須であるNF−ｋBリガンドのレセプター活性化因子（ＲＡＮＫＬ）(Anderson et al.,1997)と同一であり、リンパ組織及び海綿質において高度に発現される(Lacey et al.,1998;Yasuda et al.,1998)。
【００４４】
ＯＰＧ／ＯＣＩＦは、ＯＰＧＬ／ＯＤＦに結合し且つその作用を阻害するものであるので、これら二種のタンパク質は、破骨細胞発達、従って最終的には骨吸収の重要な細胞外調節因子であるようである。
【００４５】
骨粗しょう症の表現型は別にして、ＯＰＧ／ＯＣＩＦノックアウトマウスもまた、２月齢までに大動脈と腎臓動脈の石灰化が顕著であった(Bucay et al., 1998)。即ち、ＯＰＧ／ＯＣＩＦは、骨格の脱石灰化を阻害しまた同時にいくつかの血管石灰化を阻害するのである。同様の減少が、マトリックスｇｌａタンパク質（ＭＧＰ）ノックアウト動物(Luo et al.,1997)において以前に観察されていた。しかしながら、このような動脈石灰化は、ＭＧＰノックアウト動物においては、更に広く散在し且つ明白となっており、他方骨損失は、ＯＰＧ／ＯＣＩＦノックアウト動物では重篤である。血管の石灰化を予防・防止するのに関与するタンパク質類の異常発現は、理論的にはアテローム性動脈硬化症プラクの生成に関連したものであり得るであろう。しかしながら、ＯＰＧ／ＯＣＩＦノックアウトマウスにおいては(Bucay et al.,1998)、アテローム性動脈硬化症発症における直接的な役割を除いては、アテローム性動脈硬化性プラクは一切認められなかった。尤もこうであるとっても、ＯＰＧ／ＯＣＩＦの異常発現は、始原病変が一旦生起すると、アテローム性動脈硬化プラクの形成を促進する二次的な要因となり得る、ということを排斥するものではないであろう。
【００４６】
上記したような骨粗しょう症又はその他の石灰化状態に関連した疾病に対する個人の疾病素因を判定評価する方法は、全身又は選定した身体部位を基準としたの骨質量測定方法と組み合わせてもよい。これら測定方法としては、Ｘ線又は超音波ＢＭＤ測定法が挙げられる。本明細書において記載する方法はまた、血清や血液など体液中の化学的骨吸収マーカーの測定、例えばＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド断片のＣｒｏｓｓｌａｐｓ^TMによる測定又はＩ型コラーゲンのＮ−テロペプチドの測定などと組み合わせてもよい。
【００４７】
これら異なる種類の測定法はそれぞれ、リスクファクターとして取り扱い、加重態様でその他の方法（一つは当然ながら、本発明に従った遺伝子疾病素因測定法である）の一つ以上と組み合わせてもよい。
【００４８】
【実施例】
本発明の本質を更に明瞭に理解してもらうために、以下に添付した図面に示す図を参照して、実施例を記載する。
【００４９】
実施例１（18年間の研究）
方法
被験者―百三十三人の女性をＢＭＤ、生化学的マーカー、身長及び体重について18年間（１９７７−１９９５年）追跡し、これを本研究に用いた。このコホート二間する詳細な記載は、以前に報告済みである(Joergensen et al.,1996)。
ＤＮＡ分析。ＢＳＰ−Ｇ１４９６ＡとＯＰＧ−Ｇ１８６９Ａ多形（ＧｅｎＢａｎｋに寄託番号第Ｍ５５２７０号として寄託済みであるＢＳＰプロモーター配列の番号付けに従った塩基対番号付け）、ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形（ＧｅｎＢａｎｋに寄託番号代Ｌ２４７５６号として寄託済みであるＭＧＰプロモーター配列の番号付けに従った塩基対番号付け）及びＯＰＮ−Ｇ５２０ＡとＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形（ＧｅｎＢａｎｋに寄託番号代Ｄ１４８１３号として寄託済みであるオステオポンチンプロモーター配列の番号付けに従った塩基対番号付け）についての検索を以下のように行った：
【００５０】
ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を使用して、ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ，ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ，ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ及びＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形性塩基対を含むＢＳＰ，ＭＧＰ及びＯＰＮプロモーターから得たほぼ２５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ技法は、当該技術分野では充分公知であり、ＢＳＰプロモーター内の１４９６ｂｐとｐ１８６９ｂｐなる位置、ＭＧＰプロモーター内の２４２ｂｐ及びオステオポンチンプロモーター内の５２０ｂｐと１８２５ｂｐなる位置を包含するＢＳＰ、ＭＧＰ及びＯＰＮ遺伝子の適当なセクションを増幅するために必要なプライマーを特定することは、当該技術分野で通常の技術知識を有する者の範囲に属するものであろう。ＰＣＲ技法は、例えば特許公報ＵＳ４６８３２０２号やＥＰ０２００３６２号において記述されている。２００ｎｇのゲノムＤＮＡを１．５ｍＭＭｇＣｌ₂の１ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液(Perkin Elmer)、５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの前向き及び逆向きプライマー及び１．２５ｕｎｉｔｓのAmpliTaq Gold(Perkin Elmer)を含む２５μｌの反応液に添加した。この反応液を9分間で９５℃にまで加熱し、続いて９５℃で３０秒間、４６℃（ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形）若しくは４９℃（ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形）若しくは４６℃（ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形）又は4８℃（ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ）で３０秒間及び７２度で３０秒間から成るサイクルを３５回行ったが、最後のインキュベーションは各サイクルに付き５秒時間延長して行った。この反応液を最終的に７２℃で７分間インキュベートして鎖延長反応を完了した。ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ，ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ，ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ及びＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形性配列を含むＤＮＡ断片のＰＣＲによる増幅を行うためのライマーは、以下の通りであった：
ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＧＡＡＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．１)
逆向きプライマー：５‘−ＴＡＡＴＡＴＣＡＴＴＴＧＡＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．２)
ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＴＴＣＴＴＴＣＧＡＣＡＴＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＧＴ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．３)
逆向きプライマー：５‘−ＣＧＴＧＧＡＴＴＣＴＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＣ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．４)
ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＣＡＧＴＧＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＣ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．５)
逆向きプライマー：５‘−ＡＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡＴＣＣＡＴＣＣＡＴＧＣＡ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．６)
ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＣＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧＴＡＧＡ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．７)
逆向きプライマー：５‘−ＧＴＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＧＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＴＣ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．８)
ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｄ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＧＡＧＴＡＧＴＡＡＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＴ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．９)
逆向きプライマー：５‘−ＣＴＡＧＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＧＧＧＡＴＧＧＧ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．１０)
【００５１】
上記したＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の多形性遺伝子型の有無を決定するために、制限酵素分析を以下のように行った：
ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘｂｕｆｆｅｒＨ (Amersham Pharmacia)、４単位のＥｃｏＴ１４Ｉ (Amersham Pharmacia)と５μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液を含む２０μｌの反応液中でＥｃｏＴ１４Ｉを用いて制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＥｃｏＴ１４Ｉ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＢＳＰ配列に対してホモ接合体である場合は、２７０ｂｐの一つのバンドが認められるであろう。分析したＤＮＡ試料が、多形に対して異型接合体であれば、２７０ｂｐ及び２４５ｂｐの二つのバンドが観察されるであろう。
【００５２】
ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌｂｕｆｆｅｒ (Straragene)、４単位のEco 72 I (Stratagene)及び5μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液とを含む２０μｌの反応液でＥｃｏ 72 Ｉで制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＥｃｏ７２Ｉ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＢＳＰ配列に対して異型接合体である場合は、２５３ｂｐ及び２３０ｂｐの二つのバンドが認められるであろう。分析したＤＮＡ試料が、多形に対してホモ接合体であれば、２３０ｂｐの一つのバンドが観察されるであろう。
【００５３】
ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘｂｕｆｆｅｒＨ (Amersham Pharmacia)、４単位のＥｃｏＴ２２Ｉ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）及び5μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液とを含む２０μｌの反応液でＥｃｏＴ２2 Ｉで制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＥｃｏＴ２２Ｉ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＭＧＰ配列に対して異型接合体である場合は、２６６ｂｐ及び２４１ｂｐの二つのバンドが認められるであろう。ＤＮＡ試料が、多形に対してホモ接合体であれば、２４１ｂｐの一つのバンドが観察されるであろう。
【００５４】
ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘｂｕｆｆｅｒＨ(Amersham Pharmacia)、４単位のＢｇｌＩＩ(Amersham Pharmacia)及び5μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液とを含む２０μｌの反応液でＢｇｌＩＩで制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＢｇｌＩＩ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＯＰＮ配列に対してホモ接合体である場合は、２７８ｂｐの一つのバンドが認められるであろう。ＤＮＡ試料が、異型接合体であれば、２７８ｂｐ及び２５７ｂｐの二つのバンドが観察されるであろう。ＤＮＡ試料が、多形に対してホモ接合体である場合は、２５７ｂｐの一つのバンドが認められるであろう。
【００５５】
ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘｂｕｆｆｅｒＨ(Amersham Pharmacia)、４単位のＳａｃＩ(Amersham Pharmacia)及び5μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液とを含む２０μｌの反応液でＳａｃＩで制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＳａｃＩ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＯＰＮ配列に対してホモ接合体である場合は、２５６ｂｐの一つのバンドが認められるであろう。分析したＤＮＡ試料が、異型接合体であれば、２５６ｂｐ及び２３５ｂｐの二つのバンドが観察されるであろう。ＤＮＡ試料が、多形に対してホモ接合体である場合は、２３５ｂｐの一つのバンドが認められるであろう。
【００５６】
統計的方法。二つの遺伝子型の平均ＢＭＤｓの間における差異が統計的に有意であるか否かを決定するために、二元配置不対ｔ−検定を適用した。
【００５７】
結果
健康な女性から採取した40個のＤＮＡ試料についてＰＣＲ増幅を行った後、ヒトＢＳＰ遺伝子プロモーター、ヒトＭＧＰ遺伝子プロモーター及びヒトＯＰＮ遺伝子プロモーターから特異的プロモーター領域について配列決定を行うことによって、従来知られていなかった五つの多形を同定した。ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ，ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ，ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ及びＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形を、それぞれＸｘ、Ｙｙ、Ｚｚ、Ｂｂ及びＳｓと符号化することとしたが、ここにおいて大文字は、特定の多形位置における野生型塩基対の存在を意味し、また小文字は、特定の多形位置における野生型塩基対とは異なる塩基対の存在を意味するものである。
【００５８】
１8年間の本研究から得た１３３のＤＮＡ試料を検索し、これら五つの多形の内の何れかの存在を調べた。
【００５９】
表1は、同定した全ての多形部位、即ちＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ，ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ，ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ及びＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃに関して18年間の本研究で採取したDNA試料に係る遺伝子型分布を示す。左の表は、三つの同定多形部位に関して三つの遺伝子型に分類した試料の実数を示し、また右の表には、左の表と同じ分析結果を示す。但し数字は、各多形部位に関して分析した試料全ての百分率を表す。
ｗｔ＝ＸＸ、ＹＹ、ＺＺ、ＢＢ又はＳＳ
ｈｚ＝Ｘｘ、Ｙｙ、Ｚｚ、Ｂｂ又はＳｓ
ｐｍ＝ｘｘ、ｙｙ、ｚｚ、ｂｂ又はｓｓ
【００６０】
【表１】

【００６１】
５つの多形に対する遺伝子型分布を表１に示す。ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ多形については、ホモ接合体野生型遺伝子型が、最も存在度が高く、次いでヘテロ接合とホモ接合体多形遺伝子型の順番で続くが、ホモ接合体多形群は極めて少数である。ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａの場合は、野生型遺伝子型は、ＧｅｎＢａｎｋから入手したＢＳＰ遺伝子プロモーター配列で定義されているように、極めて稀であり、ヘテロ接合体多形遺伝子型は、10倍以上頻度が高く、またホモ接合体多形遺伝子型は、ヘテロ接合体より二倍頻度が高い。ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形については、ヘテロ接合体遺伝子型が、最も存在度が高く、次いでホモ接合体野生型とホモ接合体多形遺伝子型の順番で続く。ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形の場合、ホモ接合体多形遺伝子型が、最も存在度が高く、ヘテロ接合体遺伝子型と野生型ホモ接合体遺伝子型が続く。ＯＰＮ−Ｇ１８２５Ａ武井の遺伝子型分布は、全体的にＭＧＰ−２４２Ａ多形の場合と同一であった。
【００６２】
同定された5つの多形部位が、遠位腕におけるＢＭＣ及びＢＭＤ測定値及び経時的なＢＭＣ／ＢＭＤ変化で代表される骨質量に及ぼす影響について解析を行った。
【００６３】
表2は、18年間の本研究により得たＤＮＡ試料を5つの同定多形のいずれかの有無につき検索して得られた結果の統計学的解析結果をまとめたもので示す。表Ａ：数字は、異なる遺伝子型（ホモ接合体野生型又はヘテロ接合体／ホモ接合体多形性遺伝子型）群の間における平均ＢＭＤの差異が同一である可能性・蓋然性を示す。検定は、遠位腕において測定したＢＭＣ（ｂｏｎｅｍｉｎｅｒａｌｃｏｎｔｅｎｔ＝骨ミネラル含量）及びＢＭＤを含むものである。括弧内の数字は、ＢＭＣ／ＢＭＤ測定した年を表す。表Ｂ：二つの遺伝子型（ホモ接合体野生型群から抽出したヘテロ接合体／ホモ接合体多形性群）の平均ＢＭＤ値における差異を当該多形部位についての最大ＢＭＤ値のパーセントとして示す。
【００６４】
【表２】

【００６５】
この表から明らかなように、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形部位は、特にこれらを合体させた場合、ある個人がＢＭＣ／ＢＭＤの高低に対して遺伝学的に素因を有するか否かを予測するうえで良好な部位となるのである。しかしながら、ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形をＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形とを合体させた場合、遺伝子型のパーセント分離は、何れかの多形単独の場合よりもより良好となる（表2）。他方、ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ及びＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形は、一見するとこのような予見を行うには適した部位では無いように見える。これら同定された多形の何れも、経時的骨質量変化に対して統計学的に有意な影響を及ぼさないように思われていた（データは示さない）。18年間の本研究に参加した個人の年齢、伸長及び体重は、遺伝子型群の何れの間においても有意に相異することはなかった（データは示さない）。
【００６６】
これらの観察結果から、ＢＳＰ多形は、骨損失速度に対するよりもピーク骨質量に対して影響を及ぼす、ということが強く示された。このことを実体化するために、1977年から１９９５年に渉って異なる遺伝子型毎に同一個人について4回測定したＢＭＤの変動を解析してみた。1977年には、この18年間の研究に参加した個人の平均年齢は、５１．１才であったが、１９９５年には６９．１才で終了した。これら二つのＢＳＰ多形のうちの一つについて得られたＢＭＤ平均値を時間に対してプロットして得られる曲線に対して期待された結果は、二つの平行曲線であるはずであって、各々の曲線が、野生型遺伝子型の個人で測定したＢＭＤ値と多形遺伝子型の個人で測定したＢＭＤ値を表すものである。図２及び図３から判るように、このことは現実にＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形部位について当てはまる。更には、これら二つのプロモーター多形は、協働してピーク骨質量に作用して、遺伝子型間の平均ＢＭＤ相異をそれぞれの多形が孤立して寄与する場合よりもさらに大きく増大させるのである（図4）。
【００６７】
ＭＧＰ及びＯＰＮプロモーターにおけるＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ及びＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形が骨代謝に及ぼす影響・役割は、―仮にあったとしても―表2にまとめた第一回目の解析からは明瞭とはならなかった。しかしながら、遺伝子型に従って分類したＢＭＣ値を時間に対してプロットしたところ、一群の曲線が現れ、ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ（図５）及びＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ（図６）多形部位の双方とも、骨損失速度の決定因子であることが示唆された。特に注目すべきことは、ＺＺ及びＺｚ＋ｚｚ曲線並びにＢＢ＋Ｂｂ及びｂｂ曲線が、平均年齢が５３．１才及び６３．１才であるのに従って１９７９年と１９９５年との間で分離し、その結果一定の遺伝学的減少が閉経に関連することが示されたことである。ＢＳＰ多形と同様に、これらＭＧＰ−Ｃ２４２ＡとＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形との作用が合体した結果、やはり遺伝子型間での相異が単独の場合よりも大きくなるのである（図7）。
【００６８】
表２にまとめた結果によれば、ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形がＢＭＣ／ＢＭＤに及ぼす影響は、この多形をＢＳＰ−１８６９Ａ多形と合体させて初めて認められたに過ぎない。ＢＭＣ値を遺伝子型に従って分類し、時間に対してプロットして得られたグラフからは、二本の曲線が近接しているため、かかる多形が、骨損失速度又はピーク骨質量に対して影響を及ぼすか否かを見極めることは困難である。しかしながら、この多形をＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形と合体させることによって、一群の経時的曲線が得られ、その結果これら二つの多形が加成的に協働すること及びそのためにＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形が、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形と同じように骨損失速度に対してよりもむしろピーク骨質量に対して影響を及ぼす可能性があることとが明瞭に示された（図９）。
【００６９】
最後に、遺伝子型と尿中オステオカルシン値（Ｎ−ＭＩＤR、Osteometer Biotech A/S）及び異なる尿中Ｉ型コラーゲンＣ−末端架橋値（CrossLaps^(R)、Osteometer Biotech A/S）との関連性を調べた。期待したように、ＢＳＰ−Ｇ１４９６ＧとＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａの多形部位について得られた何れの生化学的骨代謝マーカーの平均値の間においても有意の差異は一切なかった（データは示さない）。また、ＭＧＰ−Ｃ２４２ＡとＯＰＮ−Ｇ５２０Ａの多形部位について得られた生化学的骨代謝マーカーの何れの平均値の間においても有意の差異は一切認められなかった。このことは、図５及び図６によってＮ−ＭＩＤRとCrosslaps^(R)測定時において（１９９５）ＺＺ及びＺｚ＋ｚｚ遺伝子型群並びにＢＢ＋Ｂｂ及びｂｂ遺伝子型群との骨損失の速度が等しかったことによる可能性がある。
【００７０】
実施例２(18年間の研究)
方法
被験者―百三十三人の女性を骨ミネラル含量（ＢＭＣ）又は骨ミネラル密度（ＢＭＤ）、生化学的マーカー、身長及び体重について18年間（１９７７−１９９５年）追跡し、これを本研究に用いた。このコホート二間する詳細な記載は、以前に報告済みである(Joergensen et al.,1996)。
【００７１】
ＤＮＡ分析。ＯＰＧ−Ｇ１６３Ｇ多形（ＧｅｎＢａｎｋに寄託番号第ＡＢ００８８２１号として寄託済みであるＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーター配列の番号付けに従った塩基対番号付け）についての検索を以下のように行った：
ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を使用して、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形性塩基対を含むＯＰＧ／ＯＣＩＦプロモーターから得たほぼ２５３ｂｐ長のＤＮＡ断片を増幅した。２００ｎｇのゲノムＤＮＡを１ｘＰＣＲＧｏｌｄｂｕｆｆｅｒ(Perkin Elmer)、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ、２０ｐｍｏｌの前向き及び逆向きプライマー及び１．２５ｕｎｉｔｓのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ(Perkin Elmer)を含む２５μｌの反応液に添加した。この反応液を9分間で９５℃にまで加熱し、続いて９５℃で３０秒間、４６℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間から成るサイクルを３５回行ったが、最後のインキュベーションは各サイクルに付き５秒間延長して行った。この反応液を最終的に７２℃で７分間インキュベートして鎖延長反応を完了した。このＰＣＲによる増幅を行うためのライマー配列は、以下の通りであった：
ＯＰＧ―Ａ１６３Ｇ多形プライマーセット：
前向きプライマー：５‘−ＡＧＴＣＴＡＡＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＧＣＡＡＴＴ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．１１)
逆向きプライマー：５‘−ＡＧＴＴＡＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＴＧ−３’(ＳＥＱＩＤＮｏ．１２)
【００７２】
上記したＰＣＲプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の多形性遺伝子型の有無を決定するために制限酵素分析を以下のように行った：
ＢＳＰ―Ａ１４９６Ｇ多形プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ４(New England Biolabs)、４単位のＭｆｅＩ(New England Biolabs)と５μｌのサイクル処理したＰＣＲ反応液を含む２０μｌの反応液中でＭｆｅＩを用いて制限酵素処理した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。４μｌの６ｘゲル負荷性緩衝液（０．２５％ブロモフェノール、０．２５％キシレンシアノ―ルＦＦ、３０％グリセリン水溶液）を２０μｌのＭｆｅＩ消化液に添加し、２．５％のアガロースゲルに負荷した。次いでＤＮＡ断片をブロモフェノールブルーマーカーが２／３だけゲル中を貫流するまで電気泳導で分離した。分析したＤＮＡ試料が、野生型ＢＳＰ配列に対してホモ接合体である場合は、２５３ｂｐと２３２ｂｐの二つのバンドが認められるであろう。分析したＤＮＡ試料が、多形に対して異型接合体であれば、２３２ｂｐの一つのバンドが観察されるであろう。
【００７３】
統計的方法。二つの遺伝子型の平均ＢＭＤ値の間における差異が統計的に有意であるか否かを決定するために、二元配置不対ｔ−検定を適用した。
【００７４】
結果
健康な女性から採取した40個のＤＮＡ試料についてＰＣＲ増幅を行った後、ヒトＯＰＧ／ＯＣＩＦ遺伝子プロモーターから特異的プロモーター領域について配列決定を行うことによって、従来知られていなかった一つの多形、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ、を同定した。このＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形をＭｍと符号化することとしたが、ここにおいて大文字は、特定の多形位置における野生型塩基対の存在を意味し、また小文字は、特定の多形位置における野生型塩基対とは異なる塩基対の存在を意味するものである。この多形の位置を図１０に示す。
【００７５】
１8年間の本研究から得た１３３のＤＮＡ試料を検索し、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇなるの多形の存在を調べた。
【００７６】
18年間の本研究で採取したDNA試料に係る遺伝子型分布は、以下の通りであった：ホモ接合体野生型（ＭＭ）＝７１．３％（ｎ＝９２）、ヘテロ接合体（Ｍｍ）＝２５．６％（ｎ＝３３）、及びホモ接合体多形（ｍｍ）＝３．１％（ｎ＝４）。遺伝子型は、１３３個のＤＮＡ試料のうち４個の試料において決定することが出来なかった。
【００７７】
今回同定された多形部位が、それぞれ１９７７年及び１９９５年に行った遠位腕における骨ミネラル含量（ＢＭＣ）及び骨ミネラル密度（ＢＭＤ）測定値で代表される骨質量に及ぼす影響について解析を行った（表３）。遺伝子型群の間におけるパーセント差異は、１９７７年から１９９５年に掛けては有意に変化しなかったが、このことは、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形が、ピーク骨質量に一定の影響を及ぼしたことを意味している。ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａと称される上記した二つの多形もまた、ペーク骨質量に影響を及ぼすのである。従って、ＯＰＧ多形と二つのＢＳＰ多形の何れかとの間において何らかの協働・協力が存在しているのか否かを検討することは、興味あることであった。ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ／ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ／ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａなる組合せ・合体を行ったところ、これらの多形が確実に、ゼロ仮説のｔ−検定ｐ−値（即ち、遺伝子型の間での差異は全くない）が、統計学的に有意な値にまで低下し、一方二つの遺伝子型群について平均ＢＭＣ／ＢＭＤ値が増加したという意味において、協働態様で作用することが明らかとなった（表３）。
【００７８】
【表３】

【００７９】
即ち、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形が、特にＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形と合体・組合わせた場合、ある個人がＢＭＣ／ＢＭＤの高低に遺伝的に素因があるが否かを予見するための良好な部位であることは、明らかである。
【００８０】
18年間の本研究に参加した個人の年齢、伸長及び体重は、遺伝子型群の何れの間においても有意に相異することはなかった（データは示さない）。
【００８１】
ＯＰＧ／ＯＣＩＦ多形がピーク骨質量に影響を及ぼすという、当初の観察結果を実体化するために、１９７７年から１９９５年に渉って異なる遺伝子型毎に同一個人について4回測定したＢＭＤの変動を解析してみた。1９７７年には、この18年間の研究に参加した個人の平均年齢は、５１．１才であったが、１９９５年には６９．１才で終了した。ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形について得られたＢＭＤ平均値を時間に対してプロットして得られる曲線ついて期待された結果は、二つの平行曲線であるはずであって、各々の曲線が、野生型遺伝子型の個人で測定したＢＭＤ値とヘテロ接合体又は多形ホモ接合体遺伝子型の個人で測定したＢＭＤ値をそれぞれ表すものである。図１１は、このことが間違いなく該当することを示している。更には、ＯＰＧ−Ａ１６３ＧとＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ多形を合体・組合わせることによって、これら二つの多形が、協働してピーク骨質量に作用して、遺伝子型間の平均ＢＭＤ差異をそれぞれの多形が孤立して寄与する場合よりもさらに大きく増大させることが判ったのである（図１２）。事実、このような協働は、完全に加成的である（表４）。表４におけるＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形の数は、図２及び図３に示した結果から抽出したものである。また、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形を合体・組合わせると、プラスの協働作用が得られるが（図１３）、この作用は殆ど加成的である（表４）。
【００８２】
【表４】

【００８３】
最後に、遺伝子型と尿中オステオカルシン値（Ｎ−ＭＩＤ^(R)、Osteometer Biotech A/S）及び異なる尿中Ｉ型コラーゲンＣ−末端架橋値（Crosslaps^(R)、Osteometer Biotech A/S）との関連性を調べた。ピーク骨質量に到達年齢を経過した後、尿試料を採取した。期待したように、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形について得られた何れの生化学的骨代謝マーカーの平均値の間においても有意の差異は一切なかった（データは示さない）。このような結果は、Ｎ−ＭＩＤ^(R)とCrossLaps^(R)測定時において（１９９５）ＭＭ及びＭｍ＋ｍｍ遺伝子型群の骨損失の速度が等しかったことによるものであって、ピーク骨質量に影響を及ぼす多形については驚くべきことではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】パネルＡは、骨シアロプロテイン遺伝子プロモーターにおける、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＰＳ−Ｇ１８６９Ａと称される二つの多形の位置を示す。パネルＢは、マトリックスｇｌａタンパク質遺伝子プロモーターにおける、ＭＧＰ−Ｃ２４２と称される多形の位置を示す．パネルＣは、オステオポンチン遺伝子プロモーターにおける、ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ及びＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃと称される多形の位置を示す。前記した三種のプロモーターの全てに係る四つの多形部位を含む野生型配列を、太字で示された多形位置におけるヌクレオチド及び当該多形位置の上方に配置した置換配列―やはり太字で示されている−と共に示す。ヌクレオチドの全ての番号付けは、塩基配列１を基準としたものであるが、塩基配列１は、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチドデータベースにおいて公表されているプロモーター配列の各々の５‘ヌクレオチドである。
【図２】ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図３】ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図４】ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ及びＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａの多形部位の組合せについて二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。上方の曲線は、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ａへテロ接合体／ホモ接合体多形位置とＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ野生型位置なる組合せを表し、また下方の曲線は、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ野生型位置とＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａヘテロ接合体／ホモ接合体多形位置なる組合せを示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図５】ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図６】ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図７】ＭＧＰ−Ｃ２４２Ａ及びＯＰＮ−Ｇ５２０Ａの多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図８】ＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図９】ＢＳＰ−Ｇ１８６９ＡとＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃ多形部位の組合せについて二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図１０】ＯＰＧ／ＯＣＩＦ遺伝子プロモーターにおけるＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形の位置を示す。前記したプロモーターの多形部位を含む野生型配列を、太字で示された多形位置におけるヌクレオチド及び当該多形位置の上方に配置した置換配列―やはり太字で示されているーと共の示す。ヌクレオチドの全ての番号付けは、塩基配列１を基準としたものであるが、塩基配列１は、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチドデータベースにおいて公表されているプロモーター配列の各々の５‘ヌクレオチドである。
【図１１】ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ多形部位について二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図１２】ＢＳＰ−Ｇ１４９６ＧとＯＰＧ−Ａ１６３Ｇの多形部位の組合せについて二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。上方の曲線は、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇへテロ接合体／ホモ接合体多形位置とＯＰＧ−Ａ１６３Ｇ野生型位置なる組合せを表し、また下方の曲線は、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ野生型位置とＯＰＧ−Ａ１６３Ｇヘテロ接合体／ホモ接合体多形位置なる組合せを示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
【図１３】ＢＳＰ−Ｇ１８６９ＡとＯＰＧ−Ａ１６３Ｇの多形部位の組合せについて二つの遺伝子型に分類した場合の遠位腕において測定した平均ＢＭＣｓの時間依存性を示す。上方の曲線は、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａへテロ接合体／ホモ接合体多形位置とＯＰＧ−Ｇ１８６９Ａ野生型位置なる組合せを表し、また下方の曲線は、ＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａ野生型位置とＯＰＧ−Ａ１６３Ｇヘテロ接合体／ホモ接合体多形位置なる組合せを示す。これらのＢＭＣｓは、18年間の研究において１３３人の内から各個人について１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年なる四つの時点で測定したものである。曲線上の各点は、該当年及び該当遺伝子型に係る平均ＢＭＣであり、ＳＥＭ誤差を棒線で示す。グラフの下に示す表には、二つの遺伝子型グループについて１９７７、１９７９、１９８９及び１９９５年に測定した実測のＢＭＣ値及び四つのサンプル採取年のそれぞれについて二つの遺伝子型の間における差異をパーセント単位で掲げてある。
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【配列表】

Claims

選択された一定の石灰化症状状態に対する個人の疾病素因を評価判定する方法であって、骨シアロプロテイン遺伝子のプロモーター、マトリックスｇｌａタンパク質遺伝子のプロモーター、オステオポンチン遺伝子のプロモーター、若しくは破骨細胞生成阻害因子遺伝子としても知られている、オステオプロテジェリン遺伝子のプロモーター、又はこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の任意の組合せたプロモーターの遺伝子型を決定することを含んで成る該評価判定方法。
前記石灰化症状状態が、骨質量ピークに高低があること又は骨損失速度に大小があることである、請求項１において記載された方法。
該個人が、骨シアロプロテイン遺伝子のプロモーター、マトリックスｇｌａタンパク質遺伝子のプロモーター、オステオポンチン遺伝子のプロモーター、若しくは破骨細胞生成阻害因子遺伝子としても知られている、オステオプロテジェリン遺伝子のプロモーター、又はこれら四種のプロモーターの全て若しくはその二種以上の任意の組合せたプロモーターの対立遺伝子変異に対してホモ接合であるか又はヘテロ接合であるかを決定する、請求項１又は請求項２において記載された方法。
骨シアロプロテイン遺伝子プロモーターの前記対立遺伝子変異が、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ又はＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａである、請求項３において記載された方法。
マトリックスｇｌａタンパク質遺伝子プロモーターの前記対立遺伝子変異が、ＭＧＰ―Ｃ２４２Ａである、請求項３において記載された方法。
オステオポンチン遺伝子プロモーターの前記対立遺伝子変異が、ＯＰＮ−Ｇ５２０Ａ又はＯＰＮ−Ｔ１８２５Ｃである、請求項３において記載された方法。
破骨細胞生成阻害因子遺伝子としても知られている、オステオプロテジェリン遺伝子プロモーターの前記対立遺伝子変異が、ＯＰＧ−Ａ１６３Ｇである、請求項３において記載された方法。
該個人が、骨シアロプロテイン遺伝子のプロモーターの対立遺伝子変異に対してホモ接合であるか又はヘテロ接合であるかを更に決定することを含んで成る、請求項７において記載された方法。
骨シアロプロテイン遺伝子プロモーターの前記対立遺伝子変異が、ＢＳＰ−Ａ１４９６Ｇ又はＢＳＰ−Ｇ１８６９Ａである、請求項８において記載された方法。
該個人の骨シアロプロテイン遺伝子プロモーターの少なくとも一種のコピーが、塩基対１４９６なる位置又は塩基対１８６９なる位置においてアデニン又はグアニンを有するかを決定することを含んで成る方法において、アデニンが、より低い骨質量ピークに関連づけられるものである、請求項３において記載された方法。
該個人のマトリックスｇｌａタンパク質遺伝子プロモーターの少なくとも一種のコピーが、塩基対２４２なる位置においてシトシン又はグアニンを有するかを決定することを含んで成る方法において、アデニンが、より大きい骨質量損失速度に関連づけられるものである、請求項３において記載された方法。
該個人のオステオポンチン遺伝子プロモーターの少なくとも一種のコピーが、塩基対５２０なる位置においてグアニン若しくはアデニン又は塩基対１８２５なる位置においてチミン若しくはシトシンを有するかを決定することを含んで成る方法において、塩基対５２０なる位置におけるアデニンが、より大きい骨質量損失速度に関連づけられ且つ塩基対１８２５なる位置におけるチミンが、より低い骨質量に関連づけられるものである、請求項３において記載された方法。
該個人のオステオプロテジェリン／破骨細胞生成阻害因子遺伝子プロモーターの少なくとも一種のコピーが、塩基対１６３なる位置においてアデニン又はグアニンを有するかを決定することを含んで成る方法において、塩基対１６３なる位置におけるグアニンが、より低いピーク骨質量に関連づけられるものである、請求項３において記載された方法。
前記個人の前記遺伝子プロモーターＤＮＡの内の関連部分を増幅することを含んで成る、上記請求項の内の何れかに記載された方法。
前記増幅遺伝子部位の配列をハイブリダイゼーション測定法又は制限酵素切断断片長解析によって決定する、請求項１４において記載された方法。
前記遺伝子プロモーターの関連部分を増幅するために使用するオリゴヌクレオチドプライマー。
骨シアロプロテイン遺伝子を含んで成るＤＮＡ、若しくは塩基対１４９６なる位置におけるアデニンがグアニンで置換されている、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであるその断片又はこれらに対して相補的であるＤＮＡ。
骨シアロプロテイン遺伝子を含んで成るＤＮＡ、若しくは塩基対１８６９なる位置におけるグアニンがアデニンで置換されている、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであるその断片又はこれらに対して相補的であるＤＮＡ。
マトリックスｇｌａタンパク質遺伝子を含んで成るＤＮＡ、若しくは塩基対２４２なる位置におけるシトシンがアデニンで置換されている、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであるその断片又はこれらに対して相補的であるＤＮＡ。
オステオポンチン遺伝子を含んで成るＤＮＡ、若しくは塩基対５２０なる位置におけるグアニンがアデニンで置換されている、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであるその断片又はこれらに対して相補的であるＤＮＡ。
骨シアロプロテイン遺伝子を含んで成るＤＮＡ、若しくは塩基対１４９６なる位置におけるアデニンがグアニンで置換されている、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであるその断片又はこれらに対して相補的であるＤＮＡ。
オステオプロテジェリン／破骨細胞生成阻害因子遺伝子を含んで成るＤＮＡ、若しくは塩基対１６３なる位置におけるアデニンがグアニンで置換されている、長さが少なくとも１５ヌクレオチドであるその断片又はこれらに対して相補的であるＤＮＡ。
請求項１乃至２２の内の何れか一項において記載された疾病素因の一つを決定し、次いで当該個人に医薬品を投与して、かくして骨粗しょう症を予防若しくは治療するか又は当該個人が低いピーク骨質量又は大きい骨質量損失速度の素因がある場合は骨粗しょう症の発症を遅延せしめることを含んで成る、骨粗しょう症を治療する方法。
請求項１乃至２２の内の何れか一項において記載された疾病素因の一つを決定し、次いで当該個人に医薬品を投与して、かくしてアテローム性動脈硬化症を予防若しくは治療するか又は当該個人が病理的動脈石灰化の素因がある場合はアテローム性動脈硬化症の発症を遅延せしめることを含んで成る、アテローム性動脈硬化症を治療する方法。