MXPA00011713A - Vectores recombinantes virales y no virales conteniendo el gen humano del activador de plasminogeno derivado de urocinasa y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica, cardiaca y cicatrices hipe - Google Patents

Abstract

La cirrosis hepatica se considera un grave problema de salud en mexico, ya que es la tercera causa de muerte en personas de edad productiva y no exisite un tratamiento 100% efectivo.La cirrosis esta caracterizada por un aumento exacerbado de deposito de colagena en el parenquima hepatico reemplazando a los hepatocitos produciendo mal funcionamineto del higado. Esta es una de las razones por la que hemos utilizado terapia genica mediante el envio especifico a higados cirroticos del gen del activador del plasminogeno urocinasa humano (huPA), el cual activa mecanismos que inducen a la degradacion del exceso de matriz extracelular y estimula la proliferacion de hepatocitos, logrando en esto un rapido re-establecimiento de la funcionalidad del higado. En el presente trabajo se utilizo el gen humano de uPA modificado e insertado en el vector adeviral (pAd-huPA), que no se secreta y no produce hipocoagulacion ni sangrados espontaneos internos . asi mismo, datos del estudio de bio-distribucion con un vector adenovial con el gen reportero b-gal, nos demostro la especificidad del higado como organo blanco del vector. Se detecto la proteina de huPA por ELISA en homogenados de higado (4500 pg/ml) en animales inyectados con pAd-Hupa y tambien fue detectada intracelularmente por inmunohistoquimica en cortes de higado (80% dse celulas positivas). HuPA indujo una dramatica reduccion de la fibrosis (85% al dia 10 de la administracion del vector , comparado con ratas cirroticas control y una proliferacion de hepatocitos de 55%. Las pruebas funcionales hepaticas (ALT; AST, fosfatasa alcalina y bilirrubina) disminuyeron casi a niveles normales y se verifico la proliferacion de hepatocitos. Debido a las dos cascadas de eventos beneficos, la terapia genica con el huPA modificado puede ser desarrollado como un tratamiento potencial definitivo en pacientes con cirrosis hepatica..

Description

"VECTORES RECOMBINANTES VIRALES Y NO-VIRALES CONTENIENDO EL GEN HUMANO DEL ACTIVADOR DE PLASMINOGENO DERIVADO DE UROCINASA Y SU UTILIDAD EN EL TRATAMIENTO DE DIVERSOS TIPOS DE FIBROSIS HEPÁTICA, RENAL, PULMONAR, PANCREÁTICA, CARDIACA Y CICATRICES HIPERTRÓFICAS" CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la construcción de vectores virales, no virales, plasmídicos y sintéticos recombinantes que contienen clonado el gen humano del Activador de Plasminógeno derivado de la Urocinasa (Urokinase Plasminogen Activator) , de aquí en adelante denominado cDNA (DNA complementario) de huPA. También se relaciona con la utilización del gen del receptor truncado tipo II de TGF-ß. Los vectores virales utilizados pueden ser, pero no estar restringidos a, vectores adenovirales de primera, segunda, tercera y/o cuarta generación, vectores adenovirales "gutless" , vectores retrovirales, vectores adeno-asociados . Los vectores no-virales podrán estar constituidos por componentes fosfolipídicos, liposomas de diferentes estructuras y combinadas con diferentes ligandos para receptores específicos. Los vectores sintéticos consistirán de la construcción y acoplamiento del cDNA de huPA y del cDNA del receptor truncado tipo II de TGF-ß con plásmidos de diferentes orígenes y con promotores regulables. ?íA..

El cDNA de huPA codifica para proteína terapéutica útil en el tratamiento y reversión de la cirrosis hepática y fibrosis generalizadas, como fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis pancreática, fibrosis cardiaca, cicatrices hipertróficas y keloides (cicatrices de la piel) y/o en otros órganos blanco susceptibles de padecerla. Asimismo, esta invención establece un mecanismo de reconocimiento tejido-específico de las células afectadas in vivo mediante el envío del gen terapéutico huPA a los órganos afectados crónicamente por fibrosis. La invención proporciona una vía efectiva para el tratamiento de la fibrosis mediante el empleo de los vectores recombinantes que aquí se reclaman, así como también el proceso para preparar dichos vectores, la composición farmacéutica que los contiene, los métodos de tratamiento y sus usos terapéuticos en el tratamiento de la fibrosis, lo cual tiene una gran expectativa comercial en la industria farmacéutica y también presenta una importante alternativa como terapia génica experimental para el tratamiento de enfermedades crónico-degenerativas que cursan con fibrosis con gran aplicación terapéutica en el campo de la medicina moderna.

INTRODUCCIÓN EPIDEMIOLOGÍA Y FISIOPATOLOGIA DE LA CIRROSIS HEPÁTICA La cirrosis hepática representa un problema de salud mundial al ser una causa importante de mortalidad. Es una enfermedad terminal comúnmente producida por consumo crónico de alcohol e infección con el virus de la hepatitis C y no hay tratamiento disponible que la cure definitivamente cuando afecta a adultos. El alcoholismo afecta a cerca de 14 millones de individuos en E.U. y a un número similar en México (Mariani, S., Birmingham, K. and Novak, K. Knocking out alcohol damage. Nature Med. 1999 : 5 (11) : 1243) . La cirrosis hepática se considera un grave problema de salud en México, ya que es la cuarta causa de muerte en personas en edad productiva y no existe un tratamiento 100% efectivo. Sin embargo, la cirrosis hepática también es causa de muerte en niños debido a las consecuencias de la atresia de vías biliares, aunque en estos casos la incidencia es mucho menor y el tratamiento, en estos casos, mediante cirugía o Derivación de Kasai alivia durante algunos meses el padecimiento. No obstante, el 50% de los niños que son sujetos a esta cirugía mueren dentro de los próximos meses y el resto que responde parcialmente a los efectos de la derivación son canalizados para un posible transplante de hígado. En la actualidad existen protocolos en terapia génica para otras enfermedades crónico-degenerativas, pero hasta ahora no se ha reportado ningún protocolo a nivel mundial en donde se utilice la terapia génica aplicada a cirrosis. Así, en la presente invención se ha desarrollado este protocolo de terapia génica a nivel preclínico. Su posterior aplicación en humanos, dependerá del envío exitoso y seguro de genes que codifiquen para proteínas terapéuticas en hígados con fibrosis extensa, utilizando como principal estrategia de envío, vectores virales, no-virales, plasmídicos y sintéticos. Para esto, previamente se realizó un estudio preclínico para determinar la seguridad, eficiencia de transducción, toxicidad y bio-distribución de un vector adenoviral que lleva como gen reportero el gen de lacZ en ratas cirróticas de la cepa Wistar (Solicitud de Patente Mexicana No. 998515, pendiente). Una vez que se ha demostrado el uso potencial de vectores adenovirales para enviar genes exógenos a hígados dañados sin empeorar significativamente su función, se procedió a evaluar el efecto de genes "terapéuticos" en hígados cirróticos. La cirrosis hepática se caracteriza por un aumento de fibrosis en donde hay una acumulación de proteínas de matriz extracelular (particularmente colágena tipo I, IV y III) sintetizadas por células estelares hepáticas (Arthur, M. J. P. Collagenases and liver fibrosis. J. Hepatology 1995:22:43-48; Kim, T. H., Mars, W. M., Stolz, D. B., Petersen, B. E., and Michalopoulos, GK Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology 1997:26:896-904; y Olaso, E. and Friedman, S. L. Molecular regulation of hepatic fibrogenesis . J. Hepatology 1998:29:836-847) en todo el parénquima hepático, principalmente alrededor de las venas central y portal, formando una barrera que impide el libre intercambio de nutrientes entre el sinusoide y los hepatocitos lo que conduce al deterioro de su función (Fig. ÍA) (Arthur, M.J.P. Collagenases and liver fibrosis. J. Hepatology 1995:22:43-48; y Kim, T.H., Mars, W. M. Stolz D. B., Petersen, B.E., and Michalopoulos, G.K. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat, Hepatology 1997:26:896-904). Por lo tanto, los inventores de la presente invención sugieren como teoría que se podría utilizar vectores virales y no virales recombinantes en la terapia génica para revertir la fibrosis exacerbada, característica cardinal de los hígados cirróticos, y a su vez con la inducción de genes que promuevan la proliferación de las células del hígado, favorecer el rápido reestablecimiento de la masa funcional hepática. Para esto, se ha clonado en dichos vectores el cDNA modificado del activador de plasminógeno urocinasa de humano (huPA) , que activa una cascada de eventos (parte inferior de Figura IB) , en donde por un lado, activa colagenasas ó metaloproteasas de matriz (MMPs) hepáticas latentes para promover la degradación in situ del exceso de matriz extracelular (ECM) en el espacio de Disse o espacio perisinusoidal . El exceso de matriz extracelular depositada bloquea el intercambio de nutrientes entre hepatocitos y sangre circulante y, por lo tanto, se deteriora la funcionalidad hepática. Concomitantemente, huPA restablece la masa hepática funcional al inducir a los hepatocitos remanentes a entrar en replicación y así repoblar el parénquima hepático (Fig. IB) . La razón para usar estos vectores recombinantes reside en la ventaja adicional de que al no secretarse significativamente huPA, no causa hipocoagulación, ni sangrado espontáneo, la cual es la principal desventaja en animales cirróticos. De este modo, induciendo dos diferentes cascadas de eventos benéficos, la terapia con el cDNA de huPA modificado puede ser muy útil para el tratamiento de cirrosis hepática. Es importante hacer notar que hasta el momento aún no se ha descrito ningún agente terapéutico que revierta y/o prevenga con 100% de efectividad la acumulación progesiva de la colágena hepática.

Dichas alteraciones fisiopatológicas que se presentan en la cirrosis hepática de alguna manera son comunes para aquellos otros órganos que son afectados por fibrosis, como son por ejemplo, el pulmón, corazón, riñon, páncreas, piel, entre otros, los cuales no deberán ser considerados como limitativos del alcance de protección de la invención. Por lo que la metodología que aquí se está presentando para el tratamiento de la cirrosis hepática podría aplicarse también a aquellos órganos que son susceptibles a o que se ven afectados por la fibrosis.

VECTORES VIRALES Y NO VIRALES EN TERAPIA GENICA HEPÁTICA Los vectores virales utilizados en esta invención para implementar esta tecnología pueden ser, pero no estar restringidos a, vectores adenovirales de primera, segunda, tercera y/o cuarta generación, vectores adenovirales "gutless", vectores retrovirales, vectores adeno-asociados . Los vectores no-virales podrán estar constituidos por plásmidos, componentes fosfolipídicos, liposomas (catiónicos y aniónicos) de diferentes estructuras y combinados con diferentes ligandos para receptores específicos. Los vectores sintéticos consistirán de la construcción y acoplamiento del cDNA de huPA y el cDNA del receptor truncado tipo II de TGF-ß con plásmidos de diferentes orígenes y con promotores regulables y/o inducibles. En un buen número de protocolos se utilizan vectores retrovirales para introducir genes en hepatocitos (Douglas JT, and Curiel DT. Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy. Science and Medicine March/April 1997 44-53). Sin embargo, se debe tener precaución porque estos vectores pueden generar potencialmente virus replicación-competentes . Entre las ventajas que tienen estos vectores, está su habilidad para integrar su genoma de manera estable en el genoma de la célula huésped, lo cual confiere la posibilidad de expresión, de manera indefinida, del transgen terapéutico clonado en el retrovirus. Por otro lado, hasta la fecha, ningún estudio ha .__ _. .. _. . _. _.,....—....... ___ reportado incidencias de mutagénesis por inserción o activación de oncogenes por la integración del retrovirus, siempre y cuando los virus usados no sean replicación-competentes . No obstante estas consideraciones, el uso de vectores retrovirales para transducir genes al hígado se limita por las siguientes consideraciones: 1) Estos vectores infectan solamente células que se dividen activamente y 2) se obtienen títulos de partículas virales muy bajos de las líneas celulares empaquetadoras usadas para amplificar estos virus (Graham FL, and Van Der Eb AJ. A New Teqnique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 DNA. Virology 1973, 52:456-467). Estas dos limitantes han sido exitosamente superadas en otros protocolos de Terapia Génica mediante la inducción de la proliferación de hepatocitos in vivo por el uso de factores de crecimiento hepático y por hepatectomía parcial, procedimiento quirúrgico mediante el cual se remueve el 70% del hígado y de esta manera se estimula la división de las células hepáticas in vivo. El empleo de Vectores Lentivirales ha permitido la superación de manera parcialmente significativa, de estas limitaciones, pues estos pueden transducir células que no se dividen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La cirrosis hepática es una enfermedad crónica del hígado, en donde ocurre la destrucción difusa y la regeneración de las células parenquimatosas hepáticas y que resulta en el incremento difuso del tejido conectivo provocando la distorsión de la arquitectura lobular del hígado e induciendo alteraciones hemodinámicas . Por lo tanto, algunas estrategias para el tratamiento de la cirrosis hepática podría incluir la prevención y/o reversión de la fibrogénesis, estimulación de la mitosis hepática y reorganización de la arquitectura del tejido hepático. Es por eso que se dan a conocer los documentos del estado de la técnica relacionados con la presente invención, los cuales se mencionan a continuación con el propósito de incluirlos tan sólo como referencias. La Patente Norteamericana No. 5,240,846, se refiere al uso de terapia génica para tratar fibrosis quística. Utiliza el envío y la expresión de un gen que se denomina CFTR, el cual induce una corrección estable de la regulación del canal de cloro. Este defecto se encuentra presente en células epiteliales. En dicha invención se utilizan vectores adenovirales recombinantes, así como vectores plasmídicos. Sin embargo, no tiene ninguna relación con los genes terapéuticos de la presente invención. Asimismo, la Patente Norteamericana No. 5,910,487, describe la utilización de vectores plasmídicos para el envío de moléculas terapéuticas, pero no existe ninguna relación con el envío de los genes de huPA silvestre y/o modificado humano o del receptor truncado _s£_-g_is_a tipo II de TGF-ß (Transforming Growth Factor-ß) como aquí se está presentando. La Patente Norteamericana No. 5,827,703 se relaciona con el uso de vectores adenovirales y vectores adenovirales modificados para enviar genes, sin embargo, ninguno de estos vectores contiene los genes utilizados en esta invención para el tratamiento de la fibrosis. La Patente Norteamericana No. 5,770,442 reclama el uso de un adenovirus recombinante que comprende un gen que dirige la expresión de una proteína denominada "fiber" o a una proteína denominada "fiber quimera" , sin embargo, no menciona de manera específica cuál es el gen terapéutico. También hace referencia al método de terapia génica, involucrando el uso de tal adenovirus y un vector de transferencia adenoviral para la generación de tales adenovirus recombinantes. Sin embargo, no se menciona absolutamente nada en relación a la utilización de genes terapéuticos clonados e insertados en vectores adenovirales recombinantes y otros vectores virales y no virales que en la presente invención se utilizan para el envío a hígados con fibrosis, así como a otros órganos como son el riñon, pulmón y cicatrices hipertróficas y otros. Dichos genes terapéuticos son los genes que codifican el activador de plasminógeno humano derivado de la urocinasa huPA silvestre y/o modificado, y el receptor truncado tipo II de TGF-ß, que en la presente se reclaman. Por extensión se incluyen también otros miembros de la familia de genes ... .._,„„a..^_ _. ., , .„.__. , i ,. i _ .. - , f.T t__ _-_ _ _ - -*!^?µ«i^ti representados . La Patente Norteamericana No. 5,166,320, se relaciona con la utilización de un sistema de envío dirigido de genes para introducir genes exógenos en células hepáticas de 5 mamífero. Pero no hay ninguna relación con los genes que se pretenden enviar directamente a hígados cirróticos, ríñones, pulmones u otros órganos fibróticos. La Patente Norteamericana No. 5,872,154, describe un método para reducir la respuesta inmune inducida por un 10 vector adenoviral mediante la co-administración del vector adenoviral recombinante y un modulador inmune seleccionado, que funciona inhibiendo la formación de anticuerpos neutralizantes y/o reduciendo la muerte de las células infectadas viralmente. La Patente Norteamericana No. 15 5,871,982, divulga un vector híbrido, el cual comprende una porción de un adenovirus, junto con una porción de un vector adeno-asociado viral que contiene un transgen seleccionado, también describe un virus híbrido mediante la unión de un conjugado con un policatión a un gen red del adeno-asociado 20 para formar una partícula simple. A diferencia de la presente invención, en la cual no se emplearon virus híbridos, sino solamente vectores adenovirales. Además, en la patente arriba citada no se menciona el gen o transgen o el gen terapéutico utilizado. En la Patente Norteamericana 25 No. 5,856,152, se da a conocer la construcción de un vector J___M_¡__^<tAé^^ ,.. ___. . ..,..._. __._. ...„._ ,. ' . _ _.. ., .. . . . _.. ... . . ._._».,-ih__M_ híbrido, el cual contiene la porción de un vector adenoviral en combinación con un virus adeno-asociado y un gen seleccionado, con lo cual se producen grandes cantidades de vectores recombinantes, pero que no portan genes terapéuticos clonados como se describen en esta invención, en donde se utilizan genes terapéuticos específicos para el tratamiento de fibrosis hepática, renal, pulmonar, pancreática, cardiaca, keloides y cicatrices hipertróficas. La Patente Norteamericana No. 5,547,932, reclama una composición de complejos de ácidos nucleicos para transfectar células eucarióticas. Estos complejos están formados por ácidos nucleicos y otra substancia que tiene una afinidad para el ácido nucleico y opcionalmente un factor internalizador, como puede ser un virus o un componente del virus, que puede estar conjugado. Asimismo, utilizan componentes de determinados vectores adenovirales o determinados virus como el Ad2 o el Ad5, pero no mencionan los genes que internalizan en el citoplasma y eventualmente en el núcleo de estas células eucarióticas. De igual manera, la Patente Norteamericana No. 5,521,291, se relaciona con adenovirus conjugados que están unidos mediante un anticuerpo a una substancia que tiene afinidad por ácidos nucleicos, de esta manera se transportan genes recombinantes al interior de las células eucarióticas. Estos complejos conjugados y ácidos nucleicos son internalizados en la célula, pero no se mencionan de manera específica los genes terapéuticos que pueden ser enviados. En dicha patente tampoco se menciona el uso de tales adenovirus para tratar fibrosis o cirrosis hepática o cualquier otro tipo de fibrosis como se describe en la 5 presente invención. La Patente Norteamericana No. 5,585,362, comprende un vector adenoviral mejorado y métodos para hacer y usar tales vectores. Aún cuando no se divulga el uso de vectores adenovirales en dicha patente, los vectores adenovirales 10 descritos en la presente invención se utilizaron como vectores para el envío de genes terapéuticos. La Patente Norteamericana No. 5,756,086, reclama un adenovirus, el cual está representado por una proteína denominada "fiber", además el adenovirus incluye un ligando, 15 que es específico para un receptor localizado en un tipo celular determinado. Este adenovirus puede tener al menos una porción de esta proteína denominada "fiber" y puede ser removida y reemplazada con un ligando, el cual es específico para un receptor en determinadas células de la economía, como 20 por ejemplo hepatocitos. Estos adenovirus pueden incluir un gen que codifique para un agente terapéutico. En base a lo anterior, la diferencia técnica sobresaliente de la invención propuesta con respecto a lo divulgado en dicha patente, es la especificidad del agente terapéutico como uPA silvestre y/o 25 modificado humano (huPA) , y el receptor truncado tipo II de TGF-ß para el tratamiento de diversas fibrosis. La Patente Norteamericana No. 5,895,759, reclama un vector específico de tejido (hígado) para terapia génica que puede ser usado para enviar genes a un hígado dañado. Dicho 5 vector está acoplado a un promotor de manera química o enzimática y puede estar acoplado también a un anticuerpo empaquetado en una cubierta polipeptídica. Además el vector o el virus para ser ensayado es el virus de la hepatitis B, de manera tal que el envío de genes a hígados dañados que se 10 describen en dicha patente, utiliza un sistema completamente diferente al que se pretende en esta invención y no existe relación con el proceso de fibrosis o cirrosis a tratar. La Patente Nortemericana No. 5,559,099, describe un vector recombinante adenoviral que comprende una proteína quimérica 15 del adenovirus que se denomina pentona, la cual incluye a una secuencia non-pentona y un gen terapéutico para desarrollar un método de terapia génica, el cual involucra el uso de tal adenovirus, vectores adenovirales de transferencia para la recombinación de tales vectores adenovirales conteniendo un 20 gen terapéutico. Asimismo, la Patente Norteamericana No. 5,885,808, reclama también el uso de adenovirus con moléculas de unión del adenovirus a células de la economía, cuyas moléculas han sido modificadas. Al igual que en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,846,782 y 5,712,136, en donde se 25 emplean vectores adenovirales, los cuales han sido __ _teM__fcMM_M_>..„_. . ...A. ,.,.. . , . , ,__..,..___ . . _.__«; modificados para contener diferentes dominios peptídicos. Finalmente, la Patente Norteamericana No. 5,670,488, se relaciona con vectores para terapia génica, los cuales son especialmente útiles para fibrosis quística y también 5 menciona el desarrollo de métodos para usar estos vectores. La posible relación de la invención que aquí se está reclamando, con respecto a lo divulgado en el estado de la técnica citado, radica en el uso de vectores adenovirales, que pueden ser modificados, así como el uso de promotores 10 inducibles para los genes que van a ser insertados en estos vectores adenovirales, sin embargo, las características técnicas de la presente invención están dirigidas a la utilización específica de genes terapéuticos para tratar fibrosis de diferentes tipos como son fibrosis hepática, 15 renal, pulmonar, pancreática, cardiaca, keloides, así como cicatrices hipertróficas. La importancia de la presente invención a diferencia de lo descrito en los documentos del estado de la técnica antes citados, radica en las características técnicas del 20 propio invento, así como en las ventajas adicionales que se derivan del mismo, las cuales se describen con más detalle a continuación. VECTORES ADENOVIRALES En la presente invención se han decidido utilizar 25 vectores adenovirales, aunque es importante enfatizar que los ¡ A___lí____mi__ ___ _* . __ . __. ._ __. ,_.___,... . . _>,_.._. . . '...,__ . . . - ' •'•"-- " vectores virales utilizados para implementar esta tecnología pueden ser, pero no estar restringidos a, vectores adenovirales de primera, segunda, tercera y/o cuarta generación, vectores adenovirales "gutless", vectores retrovirales, vectores adeno-asociados . Los vectores no-virales podrán estar constituidos por plásmidos, componentes fosfolipídicos, liposomas (catiónicos y aniónicos) de diferentes estructuras y combinados con diferentes ligandos para receptores específicos. Los vectores sintéticos consistirán de la construcción y acoplamiento del cDNA de huPA y el receptor truncado tipo II de TGF-ß con plásmidos de diferentes orígenes y con promotores regulables y/o inducibles . Los vectores adenovirales fueron inicialmente seleccionados en base a varias consideraciones: 1) Estos vectores pueden generarse a títulos muy altos de partículas infecciosas por ml : (109-1010); 2) Infectan una gran variedad de células, sin embargo, cuando son administrados por vía endovenosa la mayor parte se localiza en el órgano hepático ; 3) Transfieren eficientemente genes a células que no se encuentran en división y 4) Raramente, se integran en el genoma del huésped, lo que evita el riesgo de transformación celular por mutagénesis insercional (Douglas JT, and Curiel DT. Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy. Science and Medicine March/April 1997 44-53 y Zern AM, And Kresina TF .

Hepatic drug delivery and gene therapy (Hepatology 1997 vol. 25, No. 2, 484-491) . Los adenovirus son probablemente los vehículos o vectores más prometedores para el envío de genes en los protocolos de terapia génica en humanos, ya que poseen un atributo único que los provee de gran estabilidad cuando son administrados al torrente sanguíneo. Esta característica les permite ser utilizados de manera eficiente en protocolos clínicos con una administración cómoda para el paciente por vía intravenosa (Douglas JT, and Curiel DT. Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy. Science and Medicine March/April 1997 44-53) . Los adenovirus son virus de ADN de doble cadena, tienen una estructura icosahedral, los cuales infectan a una gran variedad de tipos celulares de mamíferos, lo que puede reflejar la expresión ubicua de un receptor de superficie celular específico y aún no identificado. La unión a las células es mediante el componente proteico de la cápside del adenovirus y el virus enera a la célula por endocitosis mediada por receptor. Han sido identificados más de 40 diferentes serotipos humanos de adenovirus, de los cuales los tipos 2 (Ad2) y 5 (Ad5) han sido más extensamente estudiados y, por lo tanto, más utilizados en la adaptación como vectores para terapia génica. Una característica muy importante de estos 2 serotipos es que jamás se les ha asociado con procesos malignos humanos. La estrategia para la construcción de adenovirus recombinantes se basa en la organización del genoma adenoviral. La expresión de los genes adenovirales ocurre en dos fases, temprana y tardía, que se definen con respecto al tiempo de replicación del genoma adenoviral. Los genes tempranos se codifican en cuatro unidades transcripcionales distintas. El, E2 y E4 codifican para proteínas regulatorias esenciales que inducen la replicación del DNA adenoviral, el gen E3 es un gen no esencial . Los productos de los genes tardíos incluyen las principales proteínas de la cápside, las cuales se transcriben de un promotor único (Graham FL, and Van Der Eb AJ. A New Tecnique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 DNA. Virology 1973, 52:456-467). Los adenovirus recombinantes se generan por la introducción del gen exógeno o secuencia de ADN de interés en sustitución de regiones del genoma adenoviral requeridos para la replicación del virus. Los vectores adenovirales recombinantes sufren deleciones en las regiones El y E3 de su genoma. La generación de adenovirus recombinantes se realiza tanto por el reemplazo de las regiones El, de la E3, o bien por inserción del gen exógeno entre la región E4 y el extremo derecho del genoma viral . Los vectores basados en la inserción del gen exógeno en el extremo derecho del genoma -•"~*»¿*«»* adenoviral o por reemplazo de la región E3 conservan la capacidad de replicación. Por el contrario, el reemplazo de la región temprana El produce un vector defectuoso en su capacidad de replicación que, por lo tanto, se pueden propagar únicamente en una línea celular que abastezca en "trans" a las funciones ausentes de la región adenoviral remplazada o en la presencia de un virus colaborador. De estos, los más utilizados comúnmente como vectores de transferencia de genes son los adenovirus defectuosos en replicación (Douglas JT, and Curiel DT. Adenoviruses as Vectors for Gene Therapy. Science and Medicine March/April 1997 44-53) . La construcción de los vectores recombinantes antes mencionados, así como su aplicación para el tratamiento de la fibrosis se muestran en los ejemplos que posteriormente se describen.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN A continuación se dan a conocer los objetivos y ventajas que se derivan de esta invención. Un objetivo de la presente invención es proporcionar un proceso para preparar vectores adenovirales recombinantes Ad?huPA mediante la clonación del cDNA modificado de huPA en los vectores adenovirales apropiados. Asimismo, la clonación de huPA en vectores "gutless" , adeno-asociados y la formación de complejos con liposomas y componentes fosfolipídicos . Otro objetivo de la invención es proporcionar vectores recombinantes (todos los expuestos anteriormente en la presente invención) , con un gen exógeno o secuencia de DNA 5 de interés que codifica para proteínas terapéuticas útiles en el tratamiento de la fibrosis generalizada en los órganos blancos susceptibles de padecerla. Tal gen es, pero no está limitado a huPA modificado y/o silvestre y el receptor truncado tipo II de TGF-ß. 10 También se proporcionan en la presente invención composiciones farmacéuticas (u otras composiciones) que contienen los vectores virales, no-virales, plasmídicos recombinantes en cantidades terapéuticamente efectivas de partículas virales para tratar la fibrosis generalizada. Así 15 también, como los métodos de tratamiento terapéutico, sus usos y aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de la fibrosis . Una ventaja de mayor relevancia en el tratamiento de la fibrosis generalizada, particularmente el de la cirrosis 20 hepática, es que el envío del gen (es) terapéutico (s) se lleva a cabo mediante el reconocimiento específico de tejido por la vía de administración empleada y por el tropismo natural al hígado cirrótico de los vectores recombinantes empleados. Otra ventaja de los métodos y usos terapéuticos de la 25 invención, la cual está dirigida en principio al tratamiento j^^^gj • •* ' de la cirrosis hepática, es el tratamiento de la fibrosis generalizada en otros órganos blancos susceptibles de padecerla, que incluyen, pero que no quedan limitados al tratamiento de la fibrosis en hígado, pulmón, corazón, piel, 5 riñon, páncreas, cicatrices hipertróficas, entre otros, en animales mamíferos, incluyendo al hombre. Otro objetivo es el diseño de una tecnología para enviar eficientemente genes a hígados primero de animales cirróticos inducida por Tetracloruro de carbono (CC1 ) y 10 ligadura del ducto biliar común. Este tipo de modelos experimentales de cirrosis semejan en mucho a los dos principales tipos de cirrosis hepática que afectan a los humanos, tanto en México como en el resto del mundo (cirrosis por alcohol, infección crónica con el virus de la Hepatitis C 15 y cirrosis biliar secundaria) . Otra ventaja que resulta del tratamiento de la fibrosis es que el vector adenoviral recombinante utilizado (y ninguno de los demás vectores propuestos) no induce toxicidad letal en los animales inyectados con los vectores. 20 Asimismo, otro objetivo de la invención nos permite concluir que la fibrosis en el hígado es completamente resuelta, pero además la proliferación de las células hepáticas es dramáticamente estimulada, lográndose con esto el re-establecimiento de la funcionalidad hepática en los 25 animales cirróticos. __a¿^_AAMa,^_ Otra ventaja del diseño de esta tecnología es el hecho de que podemos detectar la expresión del gen terapéutico humano uPA enviado a los animales cirróticos mediante la expresión de la proteina humana correspondiente por ensayos de ELISA y por inmunohistoquímica. Por lo tanto, podemos discriminar entre la proteína endógena de la rata y la producción de la proteína terapéutica inducida. Así, esto nos permite verificar la transducción in vivo de los diferentes órganos de la ratas para verificar si la administración del vector fue adecuada, y si la expresión permanece solo en el órgano blanco. Finalmente, todo esto nos permite sugerir que nuestro sistema constituye un vehículo eficiente y adecuado para enviar genes terapéuticos como huPA modificado y/o silvestre y el receptor truncado tipo II de TGF-ß, que degraden el exceso de colágenas y/o prevengan su depósito, así como produzcan proteínas estimuladoras de la regeneración hepática, a hígados de ratas con cirrosis con el objeto de restablecer las funciones normales del hígado u otros órganos afectados con la misma patología. Es así, como en la presente invención se dan a conocer el proceso de preparación de los vectores adenovirales recombinantes y otros vectores virales y no virales ya mencionados anteriormente, composiciones farmacéutica, métodos de tratamiento terapéutico, usos y aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de la fibrosis, particularmente en el tratamiento de la cirrosis hepática.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Otras particularidades y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, de los objetivos y modalidades preferidas, de las reivindicaciones anexas y de los dibujos o figuras que se acompañan, en donde: La figura 1, muestra la fisiopatología celular de la cirrosis hepática (A) ; y la prueba de concepto de cómo la Terapia Génica funciona revirtiendo el proceso que cursa con fibrosis, así como la cascada de eventos inducidos por el cDNA de huPA para llevar a la reversión de la fibrosis y la regeneración de las células hepáticas (B) ; La figura 2, muestra el esquema del mapa del vector adenoviral que contiene el gen reportero lacZ (A) usado para determinar dosis-respuesta, seguridad, toxicidad y biodistribución de un gen exógeno en los diferentes órganos de ratas de laboratorio normales y cirróticas (B-I) ; La figura 3, es una representación esquemática que muestra la modificación genética del cDNA de uPA humano y la formación de los vectores adenovirales correspondientes Ad-?N?C-huPA (terapéutico) su administración a través de la vena iliaca (A-D) . Asimismo, se muestra la determinación de a - *- - - - - y-f?n-rffftf*ff* los niveles de expresión de la proteína terapéutica uPA de humano en las ratas cirróticas, mediante ensayos de inmunohistoquímica y ELISA correspondientes (E-G) ; La figura 4, muestra cortes histológicos de hígados 5 de rata tratadas crónicamente con CC14 por 6 semanas obtenidos a diferentes días después de la inyección del vector irrelevante Ad-GFP (A) y el vector terapéutico Ad- ?N?C-huPA (B) , la determinación cuantitativa mediante análisis morfométricos del grado de fibrosis en cada caso, y 10 se muestra además la inducción concomitante de la actividad de la Metaloproteasa 2 (MMP-2) (C y C ) . Se muestra también la expresión de la proteína producto del gen verde fluorescente como control adecuado de la transducción in vivo ,- 15 La figura 5, muestra el análisis semicuantitativo mediante la reacción en cadena de la polimerasa asociada a la transcriptasa reversa (RT-PCR) de los RNA mensajeros para colágenas tipos I, III y IV de los hígados de rata cirróticas tratadas con el vector adenoviral Ad-?N?C-huPA, Ad-GFP o solo 20 con solución salina en la que se muestran productos de PCR amplificados correspondiente a estos genes (A) , y su correspondiente determinación densitometrica comparada con la expresión de un gen de expresión constitutiva (B) ; La figura 6, muestra la tinción inmunohistoquímica de 25 hígados cirróticos de ratas con el anticuerpo anti a-SMA rltr?r ^»afe*¿a^*¿-atAa^ -...t.-.... . -...n.-t . -. . . • . *"«? (smooth muscle actin) después de la administración con el vector terapéutico Ad-?N?C-huPA (A) , así como el cálculo cuantitativo por medio de análisis morfométrico asisitido por computadora del porcentaje de células positivas con a-SMA (B) ; La figura 7, muestra la tinción inmunohistoquímica de secciones de hígados cirróticos de ratas con anticuerpo anti-PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) para evaluar la proliferación de los hepatocitos después de la administración del vector adenoviral Ad-?N?C-huPA, Ad-GFP o solo solución salina (A) , (B y C) muestran el porcentaje de células inmunoteñidas en la región periportal y lobular, respectivamente, mediante un analizador de imágenes automatizado. (D) muestra la determinación por RT-PCR semicuantitativo del Factor de Crecimiento para Hepatocitos (Hepatocyte Growth Factor, HGF) , c-met y huPA después de la administración de los diferentes vectores en la que se muestran los productos de PCR amplificados correspondientes a estos genes; y La figura 8, (A) muestra los tiempos de protrombina de las ratas sacrificadas a los diferentes días después de la administración del vector Ad-?N?C-huPA o tratadas con solución salina solamente. Además (B) muestra la evaluación de la relación peso del hígado/peso corporal X 100 para detectar una posible hiperplasia y/o hipertrofia en estos hígados .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Existe una gran variedad de reportes en los que se demuestra que administrando por vía sistémica los vectores adenovirales recombinantes (AdR) en animales de experimentación sanos, el órgano blanco de predilección a donde migran es el hígado. Los inventores de la presente invención ya han demostrado que también el hígado cirrótico es el blanco predilecto de vectores adenovirales, aún cuando la arquitectura lobular del órgano está alterada debido a la fibrosis establecida en todo el parénquima hepático principalmente alrededor de las venas central y portal . Por lo tanto, en la presente invención se ha establecido la hipótesis de que usando un cDNA modificado del activador de plasminógeno derivado de urocinasa de humano (huPA) , se podría hacer que en los hígados dañados, se promueva la degradación in situ del exceso de colágenas componentes de la matriz extracelular mediante la activación de MMPs latentes, y se restablezca el libre intercambio de macromoléculas entre el sinusoide y los hepatocitos, asi como la funcionalidad de los hepatocitos afectados al inducirlos a proliferar y de esta manera, repoblar el parénquima hepático y lograr la regeneración y cura del hígado enfermo.

Con el desarrollo de la invención que se reclama en la presente, se inicia una línea de investigación para realizar Terapia Génica como una alternativa para el tratamiento de enfermedades crónico-degenerativas, específicamente de la cirrosis hepática en humanos, al establecer un vehículo eficiente para enviar genes al hígado que produzcan proteínas terapéuticas que ayuden a restablecer las funciones normales del hígado (ver las figuras 1 y 4) , en donde se muestra como enviando de manera eficiente y dirigida el gen de huPA se puede lograr la degradación de las colágenas depositadas en exceso a través de la sobre-expresión de la proteína huPA. En el panel izquierdo de la figura 2B se muestran cortes por congelación a los cuales se les realizó la tinción con X-gal. En el panel de la derecha de la figura 2B se muestran tejidos de los mismos hígados a los que se les realizó la determinación con el X-gal pero éstos fueron embebidos en parafina antes de ser cortados y se tiñeron con Rojo Sirio para poder visualizar el grado de fibrosis. El grado de transducción fue de aproximadamente 40% en ratas con cirrosis, comparadas con 84% en ratas normales (figura 2C) . Debido a que en el ensayo de dosis respuesta se estableció la dosis a utilizar de 3x1o11 partículas virales totales (figura 2D, E y F) , en la figura 2H se muestra la bio-distribución del vector adenoviral y en la gráfica se observa que el órgano blanco principal es el hígado, tanto en ratas sanas como en ratas con administración crónica de CC14. El bazo y el riñon presentan un grado de transducción menor al 1%. La bio-distribución del vector adenoviral se corroboró 5 con la realización de PCR, los iniciadores utilizados amplifican una región del adenovirus y otra del gen reportero Lac-Z y las bandas obtenidas (figura 2-1) en los diferentes órganos concuerdan con la distribución encontrada con la reacción de X-gal. Finalmente, utilizando la dosis de 3xl012 10 partículas virales encontramos que aproximadamente el 50% de los animales murieron por coagulopatía intravascular diseminada.

El huPA modificado producido se localiza intracelularmente 15 En vista del papel bien conocido de uPA como uno de los principales iniciadores de la cascada de la proteólisis de matriz extracelular (ECM) y como un activador de plasminógeno y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) 20 (Kim, T. H., Mars, W. M., Stolz, D. B., Peterson, P. E., and Michalopoulos, G.K. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology 1997:26:896-904; Mars, W.M. Zarnegar, R., Michalopoulos, G.K. Activation of hepatocyte growth factor by the plasminogen 25 activators uPA and tPA. Am. J. Pathol. 1993:143:949- 958.(35); y Roselli, HT., Su, M. , Washington, K. , Kerins, D.M., Vaughan, D. E. and Russel W. E. Liver regeneration is transiently impaired in urokinase-deficient mice. Am. J. Physiol. 1998 : 275 :G1472-G1479) , se decidió usar el gen de uPA 5 humano para inducir la actividad enzimática específicamente en los hígados cirróticos y probar su efecto en la reversión de la fibrosis. Sin embargo, para evitar el riesgo de sangrado como consecuencia de la secreción de huPA, usamos una forma no secretada de huPA con modificación en el extremo 10 amino-terminal y carboxi-terminal para evitar al máximo su secreción en torrente circulatorio (Figura 3A y 3B) . Para inducir la cirrosis, a las ratas se les administró intraperitonealmente CC14 tres veces a la semana durante 6 a 8 semanas (Fig. 3D) . Después de 6 semanas de 15 administración con el CC14, se analizaron varias secciones de hígado de animales cirróticos inyectados con pAd-GFP y solución salina que fueron usados como controles observándose nodulos de tamaño variable que semejan la cirrosis en humanos. Se observaron bandas de fibrosis 20 gruesas y delgadas rodeando los nodulos con evidente colapso del parénquima y el típico patrón de puentes de colágena que une los tractos portales y venas centrales. Los hepatocitos necróticos e hinchados comúnmente se asociaron con las bandas de fibrósis (Fig. 4A) . Fue por eso que se utilizó el 25 pAd. PGK-?N?C-huPA para tratar a los animales y revertir la aiM^_J_3liaiiaaii,^^^t.... ... .... ,_.__,,„ ._ . ___^ .^.., „„ , „„ ;, ?m ?, ., , ¡ ,, .„„ j , ^JHJW tttli severa fibrosis así como estimular la regeneración de hepatocitos. Basados en las observaciones previas (García-Bañuelos J, Siller López, F, Aguilar-Córdova, E and Armendáriz-Borunda J. Adenovirus-mediated gene delivery to cirrhotic rat livers: Potential tool for gene therapy. Gene Ther. and Mol. Biol. Aceptado 2000), se estableció la dosis de 6x1o11 partículas virales/kg del vector adenoviral pAd. PGK-?N?C-huPA administrándose por vena iliaca en una sola dosis al final de la 6 a semana de intoxicación crónica con CC14 (Armendáriz-Borunda, J. , Katai H., Jones, C.M., Seyer J.M. , Kang J.M. and Ragliow R. Transforming growth factor ß is transiently enhanced at a critical stage during liver regeneration following CC14 treatment. Lab. Invest. 1993:69:283-294). Es muy importante remarcar que se continuó el daño con CC1 en aquellas ratas que se sacrificaron después de los 2 días de administrado el vector adenoviral (Fig. 3D) . En otras palabras, las ratas sacrificadas a los 8 y 10 días recibieron 3 inyecciones más del hepatotóxico comparado con el resto de los animales. Después de una sola inyección de pAd. PGK-?N?C-huPA se realizó un ensayo de ELISA para determinar la presencia de la proteína huPA en el homogenado del hígado y en el suero (Fig. 3G) . Los resultados mostraron que se detectó una gran cantidad de proteína de huPA modificado en los extractos de tejido, en comparación con la concentración detectada en los sueros, lo cual puede ser explicado debido a que la proteína producida se escapa de los hepatocitos dañados. De manera importante, los niveles de huPA producidos en estos experimentos se encontraron muy elevados (~5 ng/ml) [100 veces más comparado con otros 5 sistemas de inducción de proteínas en modelos experimentales similares (Schirmacher, P., Geerts, A., Jung., W. , Pietrangelo, A., Rogler, C. E., Dienes, H. P. The role of Ito cells in the biosynthesis of HGF-SF in the liver. EXS 1993:65:285-299. (43)]. Los niveles de huPA se elevaron a 10 los 2 días disminuyendo posteriormente pero mostrando niveles detectables a través de los días, comparados con la nula expresión en los animales controles inyectados con el adenovirus irrelevante, pAd-GFP (Fig. 3G) . Además de esto, mostramos evidencias de que el huPA modificado estaba 15 localizado intracelularmente cuando se hizo la detección por inmunohistoquímica de huPA con anticuerpos específicos, revelando y confirmando la inducción de esta proteína en hígado cirróticos (Fig. 3E y F) . Los tejidos de hígados de ratas normales y cirróticas utilizadas como controles 20 mostraron hepatocitos teñidos con el anticuerpo huPA ocasionalmente (~3.5%). En contraste, los animales tratados con pAd. PGK-?N?C-huPA a los 2 días mostraron un incremento significativo de hepatocitos inmunoteñidos con huPA (46%) (Fig. 3E y F) , alcanzando un pico después de los 6 días donde 25 más del 80% de células fueron positivas. Además, células de Kupffer y del epitelio biliar mostraron también inmunoreactividad.

Aunque la aplicación del vector indujo una apariencia histológica de hepatocitos degenerados y hubo un notable incremento de las transaminasas en suero en los primeros días después del tratamiento con pAd-?N?C-huPA (Tabla 1) , esto fue transitorio y ninguno de los animales murió de insuficiencia hepática como consecuencia de la hepatitis adenoviral sobrepuesta. Comparado con los animales controles cirróticos inyectados con solución salina (n=5) y una preparación de adenovirus irrelevante (pAd-GFP) (n=5) , los animales inyectados con pAd. PGK-?N?C-huPA mostraron una notable mejoría en las pruebas funcionales hepáticas (Tabla 1) . Conjuntamente, las ratas sacrificadas en los últimos días mostraron tiempos de protrombina (PT) de 14 seg (muy cercanos a los valores normales) después de 8 y 10 días de la administración del adenovirus comparado con 24 seg en los días 2, 4 y 6 (Fig. 8A) . Importantemente, no se observó anemia, pero sí una pequeña disminución transitoria de plaquetas (Tabla 2) en los animales inyectados con pAd. PGK-?N?C-huPA. A este respecto, ha sido reportado previamente que inyección de vectores adenovirales en animales normales, induce una disminución transitoria de plaquetas (Brann, T., Kayda, D., Lyons , R.M., Shirley, P., Ruy, S., Kaleko, M. , and Smith, T. Adenoviral vector-mediated expression of physiologic levéis of human factor VIII nonhuman primates. Hum. Gene Ther. 1999:10:2999-3011).

TABLA 1. RESUMEN DE LOS PROMEDIOS POR GRUPO DE LOS RESULTADOS DE PRUEBAS FUNCIONALES HEPÁTICAS TABLA 2. RESUMEN DE LOS PROMEDIOS POR GRUPO DE RESULTADOS DE HEMATOLOGÍA. 10 15 La sobre-expresión de huPA en el hígado induce la reversión 20 de la fibrosis. Además de su papel en la activación del plasminógeno, uPA es considerado uno de los principales iniciadores que conducen a la activación de la cascada de las metaloproteasas asociadas con la degradación de la matriz extracelular (Kim, 25 ,,j_aJ;_«^_a>?J»_te-_iJ: T.H., Mars, W.M. , Stolz, D.B., Petersen, B.E., and Michalopoulos, G.K. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology 1997:26:896-904). Después de que uPA activa plasminógeno en plasmina, activa también procolagenasas y posiblemente otras metaloproteasas (MMPs) convirtiéndolas en su forma activa en etapas tempranas (Steler-Stevenson, .G. Dynamics of matrix turnover during pathologic remodeling of the extracellar matrix. Am. J. Pathol. 1996-148:1345-1350.(33)). Por lo tanto, primero determinamos el grado de fibrosis en los hígados cirróticos teñidos con Masson. El análisis morfométrico asistido con computadora de múltiples campos, demostró que las ratas tratadas con pAd. PGK-?N?C-huPA tenían una reducción dramática de la fibrosis a los 10 días (85%) (Fig. 4B y B' ) , comparada con la fibrosis al inicio del tratamiento así como con los animales cirróticos inyectados con pAd-GFP (Fig. 4A y A' ) y solo con solución salina. Estos hallazgos son consistentes con los datos mostrados en las figuras 4C y C donde se determinó cuantitativamente la actividad de la metaloproteasa-2 (MMP-2) en homogenados de hígado evaluadas por un ensayo de ELISA específico. Este ensayo detecta niveles de MMP-2 activa (Verheijen, JH, Nieuwenbroe , NM, Beekman B, Hanemaijer, R, Verspaget HW, Ronday HK, Bakker AH. Modified proenzymes as artificial substrates for proteolytic enzymes: colorimetric assay of bacterial collagenase and matrix metalloproteinase activity using modified pro-urokinase. Biochem. J. 1997:323 (Pt 3):603-609), la cual específicamente degrada colágena tipo IV y otras colágenas en menor grado (Corcoran, ML, Hewitt, RE, 5 Kleiner, DE Jr., Stetler-Stevenson, G. MMP-2: expression, activation and inhibition. Enzyme Protein 1996 : 49 (1-3) : 7-19; Nogase, H., Ogata, Y, Suzuki, K, Enghild, JJ, Salvensen G. Substrate specificit and activation mechanisms of matrix metalloproteinases . Biochem. Soc. Trans. 1991 (3) : 715-8) . Se 10 encontró un incremento de 6 veces de la MMP-2 (arriba de 11.5 ng/ml) 4 días después de la administración de huPA comparado con rata normal y 3 veces comparado con los animales cirróticos controles. Por otro lado, e independientemente de la inducción de colagenasas específicas por huPA y su 15 significancia fisiológica de la actividad de degradación de las colágenas, se evaluó la expresión de los genes de colágenas endógenas tipo I, III y IV por RT-PCR semicuantitativo, lo cual permitió detectar cambios específicos en los niveles básales de estos genes. La 20 expresión del gen de colágena tipo IV disminuyó ~5 veces al día 6 y la colágena tipo I disminuyó 4 veces al día 10 en las ratas que fueron inyectadas con pAd-?N?C-huPA comparados con las ratas inyectadas con el adenovirus irrelevante pAd-GFP. La expresión de colágena tipo III disminuyó ~2 veces al día 25 10 de inyectado el vector adenoviral huPA comparado con pAd- GFP (Fig. 5A y B) . Estos datos sugieren fuertemente que la sobreexpresión de uPA humano induce el apagado de estos genes que codifican para proteínas de ECM. En los hígados cirróticos con fibrosis severa, las células estelares 5 hepáticas (HSC, principales células productoras de colágena) están incrementadas en las áreas fibróticas, y la mayoría cambia su fenotipo a HSC activadas que específicamente expresan alfa-actina de músculo liso (a-SMA) (Nyberg-Hoffman, C, Shabram, P., Li, W. , Giroux, D. and Aguilar-Cordova, E. 10 Sensitivity and reproducibility in adenoviral infectious titer determination. Nature Med. 1997 : 3 (7) : 808-11) . Se examinó la expresión de a-SMA en hígados de ratas por inmunohistoquímica y se encontró correlacionada con la distribución de ECM depositada en exceso a través del 15 parénquima hepático, resultados consistentes con el % de tejido fibrótico. Hay una reducción significativa en el número de células positivas para a-SMA (8.9% al día 10 comparado con 43.2% al día 2 después del tratamiento) (Fig. 6A y B) . Además, se muestra una magnificación de una área con 20 fibrosis representativa donde las HSC son claramente distinguidas (Fig. 6C) . huPA induce una regeneración vigorosa en células de hígados cirróticos 25 Estando resuelta la primera mitad del proceso, se ;,«.,.;._-__-_.- mm^^g^ * "»••»- - - procedió a determinar el nivel de regeneración hepática "necesario para rellenar los espacios vacíos" después de llevarse a cabo la degradación de la matriz extracelular (ECM) . La figura 7 representa la cinética de la mitosis en 5 los hígados, presumiblemente estimulada por la activación in situ de HGF (Locaputo, S,, Carrick, T.L. and Bezerra, J.A. Zona regulation of gene expression during liver regeration of urokinase transgenic mice. Hepatology 1999:29:1106-1113). La proliferación de hepatocitos fue medida como porcentaje de 10 células teñidas con un anticuerpo específico contra el antígeno de proliferación celular nuclear (PCNA) . El número de hepatocitos positivos a PCNA fue dramáticamente más alto (10 veces más) en los hígados de ratas tratadas con pAd.PGK- ?N?C-huPA que en los hígados de ratas con pAd-GFP y normales 15 (Fig. 7A) . El índice de mareaje demostró que aproximadamente el 55% de hepatocitos fueron teñidos positivamente con anticuerpos anti-PCNA tanto en áreas periportales (Fig. 7B) como en centrilobulares (Fig. 7C) ( Hattori, N. , Sisson, T.H., Xu, Y., and Simón R.H. Upregulation of fibrinolysis by 20 adenovirus-mediated transfer of urokinase-type plasminogen activator genes to lung cells in vi tro and in vivo . Hum. Gene Ther. 1999:10:215-222) a los 2 días después de la inyección con pAd. PGK-?N?C-huPA en coexistencia con numerosas figuras mitóticas y hepatocitos binucleados (Fig. 7A) . 25 Notablemente, se detectaron índices de mareaje del 40% aún -?rli_1^?lin___tÍÍrtrt-ril _rrt ' ' ' - __?_____ --' _» i _ - » "*» * -—<« -' < » *tffa? después de 8 días de administrado el vector adenoviral (Fig. 7B y C) . Las células positivas detectadas a los 10 días indican un re-establecimiento de la masa funcional hepática, lo cual fue confirmado por la clara tendencia de las pruebas 5 funcionales hepáticas (AST, ALT, Bilirrubma y Tiempos de Protrombina) a normalizarse (Tabla 1 y Fig. 8A) . HGF es uno de los mitógenos para hepatocitos más potentes (Michalopoulos, G.K. HGF in liver regeneration and tumor promotion. Prog. Clin. Biol. Res. 1995:391:179.185) y 10 c-met es su correspondiente receptor tirosin-kinasa que traduce su señal . La figura 7D indica una sobreexpresión del gen HGF en animales tratados con huPA y solo una menor expresión en animales controles cirróticos y tratados pAd- GFP . Esta sobreexpresión del gen es más notable en c-met 15 después de 2 días de la administración de huPA sugiriendo que la proliferación de células hepáticas es controlada por este mecanismo. Finalmente, el peso relativo del hígado con el peso corporal de los animales fue medido al momento del 20 sacrificio para determinar un posible crecimiento descontrolado (Fig. 8B) . Como se aprecia, hubo solamente un incremento muy pequeño del peso del órgano a los 10 días, sugiriendo que no están involucrados mecanismos "anormales" reguladores del crecimiento celular. 25 La manera preferida de aplicar la presente invención, es mediante el suministro vía endovenosa de los vectores adenovirales recombinantes (o cualquier vector anteriormente mencionados conteniendo los genes terapéuticos) de la invención o de la composición farmacéutica que los contiene, en donde se proporciona una cantidad terapéuticamente efectiva con un régimen de dosis unitaria conveniente a un individuo que padece de fibrosis, dicho régimen se puede ajustar de conformidad con el grado de aflicción. Generalmente, se emplea una dosis unitaria de aproximadamente 107-1014 partículas virales por individuo. La preparación de una composición farmacéutica que incluya a los vectores adenovirales recombinantes de la invención, se puede llevar a cabo mediante el empleo de técnicas estándares bien conocidas por los expertos en la materia en combinación con cualesquiera de los portadores farmacéuticamente aceptables descritos en el estado de la técnica, incluyendo pero no limitando el almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina de trigo, tiza, sílica-gel, estearato de magnesio, estearato de sodio, talco de monoestearato de glicerilo, cloruro de sodio, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Estas composiciones toman la forma farmacéutica de soluciones, suspensiones, tabletas, pastillas, cápsulas, polvos y formulación de liberación prolongada y los similares. La descripción anterior y los siguientes ejemplos tienen como propósito el ilustrar modos particulares de llevar a cabo la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de protección de la misma.

EJEMPLOS METODOLOGÍA para demostrar la actividad de huPA sobre la reversión de la fibrosis y la estimulación de la regeneración hepática. a) Modelos animales experimentales mimetizando cirrosis hepática en humanos El modelo consistió de animales que sufrieron intoxicación crónica con CC1 (Armendáriz-Borunda, J. Seyes, J.M., Kang, A.H. and Ranghow, R. Regulation of TGF gene expression in rat liver intoxicated with carbón tetrachloride. FASEB J. 1990:4:215-221) en el que se establece la cirrosis hepática a partir de la sexta semana de administración intraperitoneal con CC14 (Fig. 3D) y que semeja la cirrosis hepática en humanos inducida por abuso de alcohol o infección crónica con el virus de la Hepatitis C. En resumen, los animales de 80g de peso recibieron 3 dosis semanales vía intraperitoneal de una mezcla de CCl4-aceite mineral 1:6 para la Ia semana, a la 2a semana se hizo una mezcla de 1:5, a la 3 a semana 1:4 y la 4a- 8a semana una mezcla 1:3. Se parearon ratas para utilizarlas como controles inyectándolas similarmente solo con el vehículo. Todos los métodos experimentales han sido descritos previamente (García-Bañuelos J. , Siller-López, F, Aguilar-Córdova, E. and Armendáriz-Borunda J. Adenovirus-mediated gene delivery to cirrhotic rat livers: Potential tool for gene therapy. Gene Ther. and Mol. Biol. Aceptado 2000), y todas las aplicaciones de los adenovirus se desarrollaron a través de vena iliaca (Fig. 3C) . b) Vectores de expresión conteniendo genes reporteros El vector adenoviral Ad5-ßGal (figura 2A) , proviene del vector p?ElsplB, al cual se le insertó el gen de la ß-galactosidasa bacteriana (lac-Z) . La visualización de la actividad de la ß-Gal se verificó con el reactivo X-gal, el cual en presencia de la enzima ß-galactosidasa cambia de incoloro a adquirir una coloración azul. Al mismo tiempo se administró con el mismo lote de Ad5-ßgal a ratas sanas (n=5) y cirróticas (n=5) , a las 5 y 8 semanas de intoxicación con CC14, se sacrificaron a las 72 hrs de la administración del Ad5-ßgal. Para el análisis histológico y determinación de la expresión de la proteína ß-galactosidasa (ß-gal) codificada por el adenovirus recombinante, se extrajeron diferentes órganos: hígado, bazo, corazón, pulmones, ríñones, cerebro, testículos e íleon, se congelaron a -30°C y se cortaron con un crióstato para obtener secciones de 8 µm. Los cortes se expusieron al reactivo X-gal por 16-18 hrs. contratiñéndose con el colorante rojo neutro. El porcentaje 5 de células transducidas fue determinado por análisis de imágenes computarizado en múltiples campos. También se realizaron cortes de los hígados de las ratas con cirrosis, se embebieron en parafina, se cortaron y tiñeron con rojo sirio, el cual tiñe específicamente colágena. 10 c) Vectores Adenovirales conteniendo el gen terapéutico de huPA Se construyó un vector adenoviral que tiene insertado el cDNA que codifica para el activador de plasminógeno 15 urocinasa de humano no secretado completamente funcional (pAd. PGK-?N?C-huPA) al cual se le adicionaron a la proteína señales de retención en retículo endoplásmico (RE) en el extremo amino-terminal y carboxi-terminal con el fin de evitar el riesgo de hemorragia secundario a la secreción de 20 huPA. Generalmente, las proteínas secretadas son primero translocadas a través de la membrana del retículo endoplásmico, además, son transportadas en vesículas al aparato de Golgi . En el caso de uPA, la translocación a través de la membrana del ER es activada por una señal 25 característica en el amino-terminal de la proteína precursora. Este péptido señal es cortado por peptidasas de señales durante la transferencia del polipéptido a través de la membrana. Para inhibir o disminuir la secreción de uPA en la circulación sistémica, la proteína se modificó en tal forma que se tenía que evitar su exportación del retículo endoplásmico. El cDNA de uPA humano (1,326 pb) clonado en pGEM3 en los sitios Xba I/Asp 718 (Fig. 3A) , se modificó en el extremo carboxi-terminal adicionándole una secuencia que codifica para la señal KDEL (secuencia altamente conservada característica de proteínas solubles que residen en la luz del RE) además de residuos upstream "corriente arriba" mediante la clonación de 75 nucleótidos generados por PCR (Fig. 3B) . Para la modificación del amino-terminal , los 25 aminoácidos amino-terminal que incluyen la señal peptídica pre-uPA, fueron sustituidos por la señal de retención amino-terminal (RR) junto con el "ancla" en la región transmembranal (TM) separadas por un péptido espaciador (31 a. a.) que provienen de la proteína de transmembrana II Iip33 obtenido por PCR (Fig. 3B) . La secuencia RR esta constituida por residuos de arginina MHRRRSR localizados junto a la región del ancla de transmembrana (TM) y están presentes en proteínas transmembranales tipo II como la proteína de cadena invariable Iip33. Este gen de huPA modificado resultante se clonó en el plásmido adenoviral pAd. PGK-?N?C-huPA, para la posterior producción de vectores ai_«_tá__ adenovirales recombinantes. La preparación de este vector adenoviral se monitoreo para descartar la contaminación con endotoxinas y micoplasmas. La razón para usar este vector reside en la ventaja de que al no secretarse huPA no causa 5 hipocoagulación, ni sangrado espontáneo, la cual es la principal desventaja en animales cirróticos. El vector pAd- GFP utilizado aquí es un vector adenoviral deletado en la región El y E3 deficiente en replicación previamente descrito (Nyberg-Hoffman, C, Shabram, P., Li, W. , Giroux, D. and 10 Aguilar-Cordova, E. Sensivity and reproducibility in adenoviral infectious titer determination. Nature Med. 1997:3 (7) :808-ll) . Los dos vectores fueron producidos bajo condiciones de laboratorio estériles implementadas para obtener vectores completamente caracterizados. Los vectores 15 se titularon y caracterizaron (Nyberg-Hoffman, C, Shabram, P., Li, W., Giroux, D. and Aguilar-Cordova, E. Sensivity and reproducibility in adenoviral infectious titer determination. Nature Med. 1997 : 3 (7) : 808-11) y se obtuvieron lotes con titulación de partículas virales (vp) a unidades de 20 infección (IU) con radio >30. d) Preparación de homogenados de hígado para detección de la producción de la proteína terapéutica huPA y la actividad de metaloproteasas 25 Las ratas fueron sacrificadas como se indica en la --.^----l-fc-*--*»-*------* figura 3D y los homogenados de hígados fueron preparados de 150 mg de tejido como se describió (Gao, C, Jokers , R., Gondipalli, P., Cai, S. H. , Kennedy S. and Ponder K. P. Intramuscular of an hepatic transduction with a retroviral 5 vector in mice. Hum. Gene Ther. 1999:10:911-922) y conservados a -70°C. Al mismo tiempo, se obtuvieron muestras de suero y se conservaron a -20°C. En resumen, para huPA y en presencia de inhibidores de proteasas se obtuvieron 150 mg de hígado y fueron macerados en 400µl de buffer para 10 homogenado (Tris-HCl 0.05 M, NaCl 0.15 M, HEPES 0.01M, CaCl2 2mM, Tween 80 0.01%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) lmM, pH 8.5). El homogenado fue centrifugado a 12,000 X g por 15 min y se determinaron los niveles de huPA por ELISA en el sobrenadante usando un kit disponible comercialmente 15 (Biopool, Suecia) que consiste de un inmunoensayo enzimático específico para determinación cuantitativa de uPA de humano. La sensibilidad del ensayo detecta niveles básales del antígeno uPA en un rango linear de 0-5 ng/mL. Los niveles de proteína total fueron determinados usando la técnica de 20 Bradford para cuantificación de proteínas (Bradford, M.M- A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976:72:248-54). Para el ensayo de MMP-2, las muestras fueron homogeneizadas usando un 25 ho ogenizador (Politron PT 3000, Kinematíca AG, Brinkmann, tt^st^¡ 7 Switzerland) por 5 min a 8,000 X g en 4 ml de NaCl 0.15 M a 4°C. Después de 3 ciclos de congelamiento-descongelamiento fueron sonicados 2 veces a 21 kilociclos por seg durante 1 min a 4°C y centrifugados a 8,000 X g por 10 min a 4°C, 5 alicuotadas y conservadas a -70°C. Se determinaron en estos sobrenadantes los niveles de MMP-2 por ELISA usando un kit comercial (Biotrak de Amersham) . e) Evaluación bioquímica de pruebas funcionales hepáticas y 10 hematológicas Se obtuvo sangre de los animales en tiempos específicos y se determinaron en el suero pruebas funcionales hepáticas (ALT, AST, Fosfatasa alcalina y bilirrubina) en un aparato automatizado (Synchron Cx7) . Los tiempos de 15 protrombina fueron analizados en plasma con un equipo automatizado (ACL-3000) y los análisis hematológicos en otro equipo automatizado (Cell-Dyn 3500R) . f) Evaluación histológica e inmunohistoquímica de secciones 20 de hígado Las ratas fueron sacrificadas a los 2, 4, 6, 8 y 10 días después de la administración con pAd. PGK-?N?C-huPA (Fig. 3D) . Se utilizaron como controles un grupo de animales cirróticos inyectados con pAd-GFP (adenovirus irrelevante) y 25 un grupo con solución salina. Se incluyó un mínimo de 5 gUm ratas por cada grupo. Para el estudio histológico, los hígados obtenidos se fijaron inmediatamente por immersión en formaldehído al 10% diluido en buffer de fosfatos (PBS) , deshidratados en alcohol etílico y embebidos en parafina. Se 5 tiñeron los cortes de 5 µm de grosor con Hematoxilina/Eosina, Rojo Sirio y tinción tricrómica de Masson y en esta última se determinó el porcentaje de fibrosis en los hígados afectados usando un analizador de imágenes computarizado (Qwin Leica) analizando 10 campos al azar por laminilla y calculando el 10 radio de tejido conectivo por área total del hígado. Para la inmunohistoquímica, las secciones de hígado se montaron en laminillas silanizadas, desparafinadas, y se bloqueó la actividad de la peroxidasa endógena con H02 al 0.03% en metanol absoluto. Se incubaron toda la noche a temperatura 15 ambiente con anticuerpos monoclonales contra PCNA (Antígeno nuclear de proliferación celular) y a-actina de músculo liso (Boehringer Mangheim, Ger) diluidas con PBS 1/20 y 1/50, respectivamente, y con anticuerpo policlonal de cabra contra uPA de humano (Chemicon International, USA) diluido en PBS 20 1/400. La reacción fue detectada con anticuerpos policlonales de conejo o cabra marcados con peroxidasa, revelados con diaminobenzidina, y contrateñidos con hematoxilina. Se evaluaron para la cuantificación 4 campos al azar de áreas intralobulares y periportales . Se contaron 25 las células positivas y negativas con una analizador de *. ,fc^Aa_„^a_¿. .. -. „ ~t.* ~ ... _ . i imágenes automatizado (Qwin, Leica) y se expresaron los datos como porcentaje de células positivas. El análisis histopatológico fue interpretado por 2 patólogos independientes certificados con un margen de diferencia del 5%. g) Extracción de RNA y RT-PCR semicuantitativo El RNA total se aisló inmediatamente después de obtener los hígados en los tiempos definidos; según el Método de Chomczynski y Sacchi (Chomczynski, P. and Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987:162:156-159). El tejido hepático se homogenizó mediante un politrón en presencia de Trizol y posteriormente se agregó cloroformo obteniendo una fase acuosa y precipitando el RNA con isopropanol. La cantidad de RNA se determinó por espectrofotometría a 260/280nm. La calidad se verificó por electroforesis al 1% en geles de agarosa y formaldehido. Análisis de la expresión génica de HGF (Hepatocyte Growth Factor) , c-met (receptor celular para HGF) y colágenas fueron realizados por RT-PCR semicuantitativo. Realizamos la metodología desarrollada en nuestro laboratorio y descrita en Delgado-Rizo et al, (Delgado-Rizo, V., Salazar, A. Panduro, A. , Armendáriz-Borunda, J. Treatment with anti-transforming grown factor ß antibodies influences an altered pattern of cytokines gene expression in injured rat liver. Biochim. . ,. * . _.. . . _ _. , ._, » , _Á______»At___-f Biophys, Acta 1998:1442:20-27). Brevemente, los hígados de por lo menos 3 animales en cada grupo fueron procesados . De igual manera, en cada hígado se realizaron 3 diferentes reacciones de RT-PCR de cuyos promedios se muestran los resultados densiométricos cuantivativos . Los genes amplificados fueron: GEN P R I E R S FRAGMENTO AMPLIFICADO HGF (sentido) 5?TGCTCATGGACCCTGGT3' 700 pb (antisentido) 5'GCCTGGCAAGCTTCATTA3' c-met (sentido) 5'CAGTGATGATCTCAATGGGCAAT3' 726 pb (antisentido) 5?ATGCCCTCTTCCTATGACTTC3' Colágena I (sentido) 5'CAAGAATGGCGACCGTGGTGA 3' 1043 pb (antisentido) 5'GGTGTGACTCGTGCAGCCATC 3' Colágena III (sentido) 5'AGATGGATCAAGTGGACATC 3' 449 pb (antisentido) 5OATGTTTCTCCGGTTTCCAT3' El RNA previamente aislado fue reversamente transcrito mediante la enzima (M-MLV) y los cDNAs obtenidos se sometieron a amplificación en un termociclador con las siguientes condiciones: 5min a 94°C, lmin a 60°C y 1.5min a 72°C por 30 ciclos. Los niveles de expresión de todos los transcritos fueron normalizados con un gen de expresión constitutiva HPRT .

El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) tiene actividades multifuncionales que incluyen proliferación, migración y diferenciación celular (Kim, T.H., Mars, W.M., Stolz, D.B., Petersen, B.E., and Michalopoulos, G.K. 5 Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology 1997:26:896-904; y Michalopoulos, G.K., DeFrances M.C. Liver regeneration. Science 1997:276:60-66). En el hígado normal, el HGF es producido por células estelares hepáticas (HSC) (Schirmacher , 10 P., Geerts, A., Jung, , , Pietrangelo, A., Rogler, CE., Dienes, H.P. The role of Ito cells in the biosynthesis of HGF-SF in the liver. EXS 1993:65:285-299) y es secuestrado en la matrix extracelular (ECM) (Liu, M.L., Mars, .M., Zarnegar, R., Michalopoulos, G.K., Uptake and distribution of 15 hepatocyte growth factor in normal and regenerating adult rat liver. Am. J. Pathol. 1994:144:129-140). Además del hígado, el HGF es producido por placenta, pulmón y cerebro (Schirmacher, P., Geerts, A., Jung, , Pietrangelo, A., Rogler, CE., Dienes, H.P. The role of Ito cells in the 20 biosynthesis of HGF-SF in the liver. EXS 1993:65:285-299 y Wolf, H.K., Zarnegar, R. , Michalopoulos, G.K. Localization of hepatocyte growth factor in human and rat tissues: an immunohistochemical study. Hepatology 1991:14:488-494). Se ha reportado que uPA puede activar HGF de una sola cadena 25 (forma inactiva scHGF) , a doble cadena HGF (forma activa _> _...8. *.a_____ *i .__í_¡*M. tcHGF) (Schirmacher, P., Geerts, A., Jung, W, Pietrangelo, A., Rogler, CE., Dienes, H.P. The role of Ito cells in the biosynthesis of HGF-SF in the liver. EXS 1993:65:285-299 y Wolf, H.K., Zarnegar, R. , Michalopoulos, G. K. Localization of hepatocyte growth factor in human and rat tissues: an immunohistochemical study. Hepatology 1991:14:488-494). De este modo, en nuestro modelo experimental la producción impresionante de uPA de humano modificado en los hepatocitos funcionales remanentes, conducen fuertemente la activación in situ de HGF el cual se une a su receptor c-met e induce proliferación celular temprana en el hígado tanto en el parénquima total como en áreas periportales (Figs. 7A, B, C Y D) . Además, se concoce que la aplicación de HGF en hígado de ratas normales estimula la proliferación de hepatocitos sólo en los hepatocitos periportales (Liu, M.L., Mars, W.M., Zarnegar, R., Michalopoulos, G.K. Collagenase pretreatment and the mitogenic effects of hepatocyte growth factor and transforming growth factor-alpha in adult rat liver. Hepatology 1994:19:1521-152 y Liu, M.L., Mars, W.M., Zarnegar, R., Michalopoulos, G.K., Uptake and distribution of hepatocyte growth factor in normal and regenerating adult rat liver. Am. J. Pathol. 1994:144:129-140), pero se ha observado un incrementado dramático en la síntesis de DNA en los hepatocitos en las áreas lobulares, cuando los hígados normales fueron pre-tratados con colagenasas (Liu, M.L., Mars, W.M. , Zarnegar, R. , Michalopoulos, G.K. Collagenase pretreatment and the mitogenic effects of hepatocyte growth factor and transforming growth factor-alpha in adult rat liver. Hepatology 1994:19:1521-152). Recapitulando, todas las evidencias combinadas presentadas aquí sugieren que la degradación activa de ECM junto con la regulación incrementada de c-met y la activación y unión sincrónica de HGF a su receptor correspondiente, activa la proliferación de hepatocitos. La fuerte respuesta proliferativa vista en los animales cirróticos inyectados con uPA (aproximadamente 60%) , podría reflejar el efecto aditivo de una acción directa de HGF inducible sobre los hepatocitos y el efecto de MMPs en preparar a los hepatocitos de tal forma que puedan responder más efectivamente a factores de crecimiento (Kim, T.H., Mars, W.M., Stolz, D.B., Petersen, B.E., and Michalopoulos, G.K. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology 1997:26:896-904). Además de su papel en la activación del plasminógeno, se considera que uPA es uno de los principales iniciadores que conducen a la activación de la cascada de metaloproteasas asociada con una degradación de matriz (Kim, T.H., Mars, W.M., Stolz, D.B., Petersen, B.E., and Michalopoulos, G.K. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology 1997:26:896-904).

Después de que uPA activa plasminógeno en plasmina, esta a su vez activa a procolagenasas y posiblemente otras metaloproteasas (MMPs) a su forma activa en etapas tempranas (Kim, T.H., Mars, W.M., Stolz, D.B., Petersen, B.E., and Michalopoulos, G.K. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology 1997:26:896-904) . La acción in situ de tales enzimas dio como resultado la degradación de componentes específicos de ECM, remodelando la arquitectura del órgano alterado y la aparición de nuevos vasos sanguíneos formados (angiogénesis) (datos no mostrados) . Aunque es claro que la sobreproducción de uPA modificado activa la rápida reorganización de ECM vista aquí, esto puede ser estrechamente regulado por mecanismos todavía no elucidados, pero que la inducción específica de MMP-2 forma parte de estos mecanismos. Por lo tanto, además del sistema uPA/plasmina que inicia la remodelación de la matriz, las metaloproteasas de matriz de tipo membrana (MT-MMPs) serían otras proteinasas inducibles que deben ser identificadas en la remodelación de ECM en nuestro sistema, toda vez que ha sido reportado que la MTl-MMPs podría iniciar la activación de pro-MMP2. Consecuentemente, los esfuerzos en nuestro laboratorio tienen como objetivo colateral elucidar el papel de MMPs y en la reversión de fibrosis hepática inducida por huPA. Finalmente, la aplicación de este tipo de estrategias terapéuticas está siendo evaluada para ser utilizada en humanos con cirrosis previa determinación y valoración en animales superiores a la rata. Estamos en el proceso de integrar el protocolo respectivo para su evaluación en perros 5 beagle y/o primates no humanos. Debe ser evidente para aquellas personas expertas en la técnica que otras variaciones no dadas a conocer específicamente en la presente invención, pero que, sin embargo, se proponen mediante la presente y que se consideran 10 que quedan dentro del alcance y espíritu de este invento. Por lo que la invención no debe quedar limitada mediante la descripción de las modalidades específicas dadas a conocer, sino únicamente mediante las siguientes: 15 20 25 . «,.____«__»__»_, &_^M_S* ;__;___

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. - Un proceso para preparar vectores recombinantes virales y no virales que consiste en la clonación de genes reporteros y el cDNA modificado de un gen terapéutico que codifica para proteínas terapéuticas para el tratamiento de la fibrosis hepática, pulmonar, renal, cardiaca, pancreática, keloides y cicatrices hipertróficas, en animales mamíferos incluyendo al hombre. 2. - El proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el gen reportero se selecciona del gen de la ß-galactosidasa bacteriana (lac-Z) . 3. - El proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el gen terapéutico se selecciona del cDNA modificado del gen humano del activador de plasminógeno derivado de urocinasa huPA silvestre y/o modificado; y del gen del receptor truncado tipo II de TGF-ß, que codifican para proteínas terapéuticas que degradan y/o previenen la síntesis y depósito en exceso de proteínas colagénicas depositadas en los orgánicos cirróticos. 4. - El proceso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la proteína codificada por el cDNA modificado del gen humano del activador de plasminógeno derivado de urocinasa huPA activa colagenasas o metaloproteasas de matriz (MMPs) hepáticas latentes para promover la degradación in situ del exceso de colágenas componentes de la matriz extracelular (ECM) en el espacio de Disse o espacio perisinusioidal . 5. - El proceso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la proteína codificada por el cDNA del gen humano del activador de plasminógeno derivado de urocinasa huPA, además restablece la masa hepática funcional al inducir a los hepatocitos remanentes a entrar en replicación y así repoblar el parénquima hepático para lograr la regeneración y cura del hígado enfermo. 6. - El proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el gen terapéutico es una secuencia de cDNA que se selecciona del gen del factor de crecimiento para hepatocitos HGF, que codifica para proteínas estimuladoras de regeneración hepática con la finalidad de restablecer las funciones normales del hígado u otros órganos afectados con la misma patología. 7.- El proceso de conformidad con la reivindicación 6, en donde la regeneración hepática, después de llevarse a cabo la degradación extracelular (ECM) estimulada por la activación in situ del gen del factor de crecimiento para hepatocitos HGF fue medida como porcentaje de células teñidas con un anticuerpo específico contra el antígeno de proliferación celular nuclear (PCNA) . 8. - El proceso de conformidad con la reivindicación 7, en donde el número de hepatocitos positivos a PCNA fue 10 ..., ,. _.„_ ._ . ... _._.. „._-^.-... , . , ._ ,..... _ -__ .*_______ _ veces más alto en los hígados de ratas tratadas con el vector adenoviral recombinante pAd. PGK-?N?-huPA que en los hígados de ratas tratadas con pAd-GFP y normales . 9.- El proceso de conformidad con la reivindicación 7 , en donde el mareaje demostró que aproximadamente el 55% de hepatocitos fueron teñidos positivamente con anticuerpos anti-PCNA, tanto en áreas periportales como en centrilobulares a los dos días después de la inyección con el vector adenoviral recombinante pAd. PGK-?N?C-huPA. 10.- El proceso de conformidad con la reivindicación 7, en donde las células positivas detectadas a los 10 días indican un re-establecimiento de la masa funcional hepática, lo cual fue confirmado por la clara tendencia de las pruebas funcionales hepáticas AST, ALT, Bilirrubina y Tiempos de Protrombina. 11.- El proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde los vectores recominantes virales se seleccionan de vectores adenovirales de primera, segunda, tercera y/o cuarta generación, vectores adenovirales "gutless" , vectores retrovirales y vectores adeno-asociados . 12.- El proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde los vectores recombinantes no virales están constituidos por componentes fosfolipídicos , liposomas de diferentes estructuras y combinados con diferentes ligandos para receptores específicos. 13. - El proceso de conformidad con la reivindicación 12, en donde los vectores no virales se seleccionan de plásmidos y liposomas catiónicos y aniónicos. 14. - El proceso de conformidad con la reivindicación 5 1, en donde los vectores recombinantes virales y no virales se preparan mediante la construcción y acoplamiento del cDNA del gen humano del activador de plasminógeno derivado de urocinasa huPA silvestre y/o modificado, del cDNA del gen del receptor truncado tipo II de TGF-ß y del cDNA del gen del 10 factor de crecimiento para hepatocitos HGF con plásmidos de diferentes orígenes y con promotores regulables y/o inducibles . 15.- El proceso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el vector adenoviral recombinante es pAd.PGK- 15 ?N?C-huPA. 16.- El proceso de conformidad con la reivindicación 1, que comprende además el envío de los genes terapéuticos o secuencias de DNA que codifican para proteínas terapéuticas para el tratamiento de fibrosis en los hígados con cirrosis. 20 17.- El proceso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el envío de los genes terapéuticos se lleva a cabo en otros órganos con fibrosis generalizada. 18.- El proceso de conformidad con la reivindicación 16, en donde además el envío de los genes terapéuticos se 25 lleva a cabo mediante el reconocimiento tejido-específico de -**£»"** los genes terapéuticos a los órganos con fibrosis por la vía de administración empleada y por el tropismo natural al hígado cirrótico de los vectores recombinantes empleados. 19.- El proceso de conformidad con la reivindicación 18, en donde la vía de administración es endovenosa. 20.- El proceso de conformidad con la reivindicación 17, en donde los órganos con fibrosis se seleccionan de hígado, pulmón, corazón, riñon, páncreas, piel y cicatrices hipertróficas, en animales mamíferos incluyendo al hombre. 21.- El proceso de conformidad con la reivindicación 20, en donde el principal órgano blanco es el hígado. 22. - El proceso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el envío de genes terapéuticos se lleva a cabo mediante el uso de vectores virales o no virales . 23.- El proceso de conformidad con la reivindicación 22, en donde los vectores virales se seleccionan de vectores adenovirales de primera, segunda, tercera y/o cuarta generación, vectores adenovirales "gutless" , vectores retrovirales y vectores adenosociados . 24. - El proceso de conformidad con la reivindicación 22, en donde los vectores no virales podrán estar constituidos por componentes fosfolipídicos, liposomas de diferentes estructuras y combinados con diferentes ligandos para receptores específicos. 25.- El proceso de conformidad con la reivindicación . ,. . -..->...->.-. , . '.. . . . ___ - . ... ...-_*»>*______ 22, en donde los vectores virales y no virales se preparan mediante la construcción y acoplamiento del cDNA del gen humano del activador de plasminógeno derivado de urocinasa huPA silvestre y/o modificado y del cDNA del gen del receptor 5 truncado tipo II de TFG-ß con plásmidos de diferentes orígenes y con promotores regulables y/o inducibles . 26.- El proceso de conformidad con la reivindicación 24, en donde los vectores no virales se seleccionan de plásmidos y liposomas catiónicos y aniónicos. 10 27.- El proceso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el envío eficiente del gen humano del activador de plasminógeno derivado de urocinasa huPA al hígado cirrótico puede lograr la degradación de la colágena a través de la sobre-expresión de metaloproteasas. 15 28.- El proceso de conformidad con la reivindicación 16 a 27, caracterizado porque se utiliza para el tratamiento de la fibrosis hepática, pulmonar, renal, cardiaca, pancreática, keloides y cicatrices hipertróficas. 29.- El proceso de conformidad con la reivindicación 20 1, en donde se puede detectar la expresión del gen terapéutico humano huPA enviado a los animales cirróticos mediante la expresión de la proteína humana correspondiente por ensayos de ELISA y por inmunohistoquímica. 30.- El proceso de conformidad con la reivindicación 25 1, en donde se evaluó la expresión de los genes de colágenas endógenas tipo I, III y IV por RT-PCR semicuantitativo, lo cual permitió detectar cambios específicos en los niveles básales de estos genes. 31.- El proceso de conformidad con la reivindicación 5 30, en donde la expresión de colágena tipo I disminuyó 4 veces al día 10, la colágena tipo III disminuyó aproximadamente 2 veces al día 10 y la colágena tipo IV disminuyó aproximadamente 5 veces al día 6, en las ratas que fueron inyectadas con el vector adenoviral recombinante 10 pAd. PGK-?N?C-huPA comparados con las ratas inyectadas con el adenovirus irrelevante pAd-GFP. 32.- El proceso de conformidad con la reivindicación 31, en donde la sobre-expresión de huPA induce el apagado de los genes de colágenas endógenas tipo I, III y IV que 15 codifican para proteínas de ECM. 33.- Un vector adenoviral recombinante obtenido mediante el proceso de conformidad con la reivindicación 1, que comprende un genoma adenoviral del cual se han deletado los marcos de lectura abiertos El y/o E3 , pero que retiene la 20 secuencia suficiente para que dicho vector adenoviral sea capaz de replicarse in vitro. caracterizado además en que dicho vector contiene un gen terapéutico o una secuencia de DNA de interés regulada por promotores ubicuos y/o promotores específicos de tejido,, o promotores inducibles y/o 25 regulables, que codifica para proteínas terapéuticas para el É_AßglHáÍ láHaa_iiiÉ_i tratamiento de la fibrosis. 34. - El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 33, en donde el promotor es el promotor proveniente del virus citomegalovirus (CMV) . 35.-- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 33, en donde el gen terapéutico o la secuencia de DNA clonada en dicho vector adenoviral se selecciona del gen humano del activador de plasminógeno derivado de urocinasa huPA silvestre y/o modificado y del gen del receptor truncado tipo II de TGF-ß que codifican para proteínas terapéuticas que degradan y/o previenen la síntesis y depósito en exceso de proteínas colagénicas depositadas en los órganos cirróticos. 36.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 33, en donde el gen terapéutico es una secuencia de DNA que se selecciona del gen del factor de crecimiento para hepatocitos HGF, que codifica para proteínas estimuladoras de regeneración hepática con la finalidad de restablecer las funciones normales del hígado. 37.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 33, en donde las proteínas terapéuticas para el tratamiento de la fibrosis son la proteína humana del activador de plasminógeno derivado de urocinasa huPA silvestre y/o modificada; el receptor truncado tipo II de TGF-ß y el factor de crecimiento para hepatocitos HGF. 38.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 33, que comprende además el envío de los genes terapéuticos o secuencias de DNA que codifican para proteínas terapéuticas para el tratamiento de fibrosis en los hígados con cirrosis. 39.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 38, en donde el envío de los genes terapéuticos se lleva a cabo en otros órganos con fibrosis generalizada. 40.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 38, en donde además el envío de los genes terapéuticos se lleva a cabo mediante el reconocimiento tejido-específico de los genes terapéuticos a los órganos con fibrosis por la vía de administración empleada y por el tropismo natural al hígado cirrótico de los vectores recombinantes empleados. 41.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 40, en donde la vía de administración es endovenosa . 42.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 39, en donde los órganos con fibrosis se seleccionan de hígado, pulmón, corazón, riñon, páncreas, piel y cicatrices hipertróficas, en animales mamíferos incluyendo al hombre. 43. - El vector adenoviral recombinante de conformidad ...atat con la reivindicación 42, en donde el principal órgano blanco es el hígado. 44. - El vector adenoviral recombinante de conformidad con las reivindicaciones 33 a 43, el cual es pAd. PGK-?N?C-huPA . 45.- El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 38, en donde el envío de genes terapéuticos se lleva a cabo mediante el uso de vectores virales o no virales . 46.- El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 45, en donde los vectores virales se seleccionan de vectores adenovirales de primera, segunda, tercera y/o cuarta generación, vectores adenovirales "gutless", vectores retrovirales y vectores adeno-asociados . 47.- El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 45, en donde los vectores no virales podrán estar constituidos por componentes fosfolipídicos, liposomas de diferentes estructuras y combinados con diferentes ligandos para receptores específicos. 48.- El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 45, en donde los vectores virales y no virales se preparan mediante la construcción y acoplamiento del cDNA del gen humano del activador de plasminógeno derivado de urocinasa huPA silvestre y/o modificado y del cDNA del gen del receptor truncado tipo II de TGF-ß con plásmidos de diferentes orígenes y con promotores regulables y/o inducibles . 49.- El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 47, en donde los vectores no virales se 5 seleccionan de plásmidos y liposomas catiónicos y aniónicos. 50.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 38, en donde el envío eficiente del gen humano del activador de plasminogen derivado de urocinasa huPA al hígado cirrótico puede lograr la degradación de la 10 colágena a través de la sobre-expresión de metaloproteasas. 51.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con las reivindicaciones 33 a 50, caracterizado porque se utiliza para el tratamiento de la fibrosis hepática, pulmonar, renal, cardiaca, pancreática, keloides y cicatrices 15 hipertróficas, el cual no induce toxicidad letal, en animales mamíferos incluyendo al hombre. 52. - El vector adenoviral recombinante de conformidad con las reivindicaciones 33 a 51, en donde la ventaja adicional de utilizar estos vectores recombinantes es de que 20 al no secretarse significativamente huPA no causa hipocoagulación, ni sangrado espontáneo, la cual es la principal desventaja en animales cirróticos. 53.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 52, en donde se utiliza una forma no 25 secretada de huPA con modificación de señales de retención en g^^^ü retículo endoplásmico (RE) en el extremo amino-terminal y carboxi -terminal para evitar al máximo su secreción al torrente circulatorio. 54. - El vector adenoviral recombinante de conformidad 5 con la reivindicación 53, en donde el cDNA de huPA clonado en pGEM3 en los sitios Xba I/Asp 718 se modificó en el extremo carboxi-terminal adicionándole una secuencia que codifica para la señal KDEL, además de residuos upstream mediante la clonación de 75 nucleótidos generados por PCR. 10 55.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 54, en donde los 25 aminoácidos amino- terminales que incluyen la señal peptídica pre-uPA fueron sustituidos por la señal de retención amino-terminal (RR) junto con el ancla en la región transmembranal (TM) separadas 15 por un péptido espaciador de 31 aminoácidos que provienen de la proteína de transmembrana II Iip33 obtenido por PCR. 56.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 55, en donde la secuencia RR está constituida por residuos de arginina MHRRRSR localizados 20 junto a la región del ancla de transmembrana (TM) y están presentes en proteínas transmembranales tipo II como la proteína de cadena invariable Iip33. 57.- El vector adenoviral recombinante de conformidad con la reivindicación 53, en donde el gen de huPA modificado 25 se clonó en el plásmido adenoviral pAd. PGF-?N?C-huPA para la ..í.^^-t__A__¡¡Áií At___. producción de los vectores adenovirales recombinantes. 58. - Una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva con un régimen de dosis unitaria de partículas virales de los vectores adenovirales 5 recombinantes de conformidad con las reivindicaciones 33 a 57, para el tratamiento de la fibrosis hepática, pulmonar, renal, cardiaca, pancreática, keloides y cicatrices hipertróficas, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. 10 59.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 58, en donde la dosis unitaria es de aproximadamente 107-1014 partículas virales por individuo que padece de fibrosis. 60.- El uso de vectores adenovirales recombinantes, y 15 otros vectores virales y no virales de conformidad con las reivindicaciones 33 a 57, para la elaboración de un medicamento que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva con un régimen de dosis unitaria de partículas virales para el tratamiento de la fibrosis hepática, 20 pulmonar, renal, cardiaca, pancreática, keloides y cicatrices hipertróficas, en animales mamíferos incluyendo al hombre. 61.- El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde la dosis unitaria es de aproximadamente 107-1014 partículas virales por individuo que padece de fibrosis. 25 62.- Un método para el tratamiento de la fibrosis ._____?r^^S?t____, ^^J_____, .. . . .. .......... . j. ^ • i ; .__. . . _t *i _t_v_i_¿ hepática, pulmonar, renal, cardiaca, pancreática, keloides y cicatrices hipertróficas en animales mamíferos incluyendo al hombre, que consiste en la administración de un vector adenoviral recombinante de conformidad con las reivindicaciones 33 a 57. 63.- Un método para el tratamiento de la fibrosis hepática, pulmonar, renal, cardiaca, pancreática, keloides y cicatrices hipertróficas en animales mamíferos incluyendo al hombre, que consiste en la administración de la composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 58 a 59. 64.- El método de conformidad con la reivindicación 62 ó 63, en donde la vía de administración es endovenosa. 65.- El método de conformidad con la reivindicación 62 ó 63, en donde la dosis unitaria es de aproximadamente 107-1014 partículas virales por individuo que padece de fibrosis . . . i . A. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La cirrosis hepática se considera un grave problema de salud en México, ya que es la tercera causa de muerte en personas en edad productiva y no existe un tratamiento 100% 5 efectivo. La cirrosis está caracterizada por un aumento exacerbado de depósito de colágena en el parénquima hepático reemplazando a los hepatocitos produciendo mal funcionamiento del hígado. Esta es una de las razones por la que hemos utilizado terapia génica mediante el envío 10 específico a hígados cirróticos del gen del activador del plasminógeno urocinasa humano (huPA) , el cual activa mecanismos que inducen a la degradación del exceso de matriz extracelular y estimula la proliferación de hepatocitos, logrando con esto un rápido re-establecimiento de la 15 funcionalidad del hígado. En el presente trabajo se utilizó el gen humano de uPA modificado e insertado en el vector adenoviral (pAd-?huPA) , que no se secreta y no produce hipocoagulación ni sangrados espontáneos internos. Así mismo, datos del estudio de bio-distribución con un vector 20 adenoviral con el gen reportero ß-gal, nos demostró la especificidad del hígado como órgano blanco del vector. Se detectó la proteína de huPA por ELISA en homogenados de hígado (4500 pg/ml) en animales inyectados con pAd-?huPA y también fue detectada intracelularmente por 25 inmunohistoquímica en cortes de hígado (80% de células M?__ _ _*í________*__ __ u_*. positivas) . HuPA indujo una dramática reducción de la fibrosis (85%) al día 10 de la administración del vector, comparado con ratas cirróticas control y una proliferación de hepatocitos de 55%. Las pruebas funcionales hepáticas (ALT, 5 AST, fosfatasa alcalina y bilirrubina) disminuyeron casi a niveles normales y se verificó la proliferación de hepatocitos. Debido a las dos cascadas de eventos benéficos, la terapia génica con el huPA modificado puede ser desarrollado como un tratamiento potencial definitivo en 10 pacientes con cirrosis hepática. 15 20 25 ^^^Ji XtJ^Mi?U*